TWI706958B - 活化「干擾素基因刺激因子」依賴性訊息傳導之組合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供高活性環狀二核苷酸(CDN)免疫刺激劑，其經由新近發現的稱為STING(干擾素基因刺激因子)之細胞質受體活化DC。特定言之，本發明之CDN係以包含一或多種環狀嘌呤二核苷酸之組合物形式提供，其誘導人類STING依賴性I型干擾素產生，其中該組合物中存在之環狀嘌呤二核苷酸為經2'-氟取代的雙-3',5' CDN，且最佳為一或多種2',2"-二氟-Rp,Rp雙3',5' CDN。
Description
本申請案主張2015年3月10日申請之美國臨時申請案62/131,235之優先權，其以全文引用的方式併入本文中。
提供以下背景技術之論述僅用於幫助閱讀者理解本發明且不視為描述本發明或承認先前技術組成本發明。
對潛在免疫逃避機制及經由與免疫檢查點抑制劑或其他療法之組合強化治療性疫苗接種(直接或間接)之效能的組合治療方案的新發現已用作疫苗或免疫調節劑之研發基礎，該等疫苗或免疫調節劑可引發或增強有效適應性免疫反應，其由對靶向惡性腫瘤具有特異性之腫瘤特異性CD4+及CD8+ T細胞組成，引起抗腫瘤反應及臨床益處。先天性免疫系統如何由靶向配位體接合決定了適應性反應之發展且使其適用於疫苗及免疫調節劑之設計(Reed等人，Trends Immunol.,30：23-32,2009；Dubensky及Reed,Semin.Immunol.,22：155-61,2010；Kastenmuller等人，J.Clin.Invest.,121：1782-1796,2011；Coffman等人，Immunity,33：492-503,2010)。
環狀二核苷酸CDN環狀二-AMP(由單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)及其他細菌產生)以及其類似物環狀二-GMP及環狀
GMP-AMP(cGAMP)由宿主細胞識別為病原體相關分子模式(PAMP)，其結合於稱為干擾素基因刺激因子(STING)之病原體識別受體(PRR)。STING為宿主哺乳動物細胞之細胞質中之接附蛋白質，其活化TANK結合激酶(TBK1)-IRF3及NF-κB訊息傳導軸，引起IFN-β及其他強烈活化先天性免疫性之基因產物之誘導。現發現STING為宿主胞漿監督路徑之組分(Vance等人，2009)，宿主胞漿監督路徑感測細胞內病原體之感染且作為回應而誘導IFN-β之產生，引起由抗原特異性CD4及CD8 T細胞以及病原體特異性抗體組成之適應性保護性病原體特異性免疫反應之產生。環狀嘌呤二核苷酸之實例詳細描述於例如：美國專利第7,709458號及第7,592,326號；專利申請案WO2007/054279、WO2014/093936及WO2014/189805；以及Yan等人，Bioorg.Med.Chem Lett.18：5631(2008)中。
與人類寡腺苷酸合成酶環狀GMP-AMP合成酶之催化域具有顯著結構同源性之未表徵之小鼠基因報導為負責產生哺乳動物細胞中之STING結合CDN的酶。Sun等人，Science 339(6121)：786-91,2013。稱為環狀GMP-AMP合成酶(cGAS)，此酶催化在DNA存在下由ATP及GTP合成cGAMP。此cGAMP接著充當第二信使，其結合且活化STING。此等cGAS產生之CDN與細菌產生之CDN在結構上的不同之處在於其具有不尋常的磷酸二酯鍵。因此，儘管細菌產生之CDN含有兩個核苷酸之間的雙-3',5'鍵，但哺乳動物CDN含有一個2',5'鍵及一個3',5'鍵，或所謂的「混合鍵」(ML)或非典型CDN。此等2',5'-3',5'分子以奈米級親和力結合STING，比細菌c-二-GMP好約300倍。
人類STING(hSTING)亦具有已知多形性，包括編碼位置232處之組胺酸的對偶基因，該組胺酸對雙-3',5'(典型)CDN但非2',5'-3',5'(非典型、混合鍵)CDN具有抗性(Diner等人，Cell Reports3,1355-61,2013；Jin等人，Genes and Immunity,12：263-9,2011)。已報導hSTING基因中
之單核苷酸多形現象可影響對細菌衍生之典型CDN之反應(Diner等人，2013；Gao等人，Cell 154,748-762,2013；Conlon等人，J.Immunol.190：5216-5225,2013)。已報導hSTING之五種單倍型(WT、REF、HAQ、AQ及Q對偶基因)，其在胺基酸位置71、230、232及293處不同(Jin等人，2011；Yi等人，PLOS One 8：e77846,2013)。據報導，表現hSTING之細胞對具有雙-(3',5')鍵之細菌CDN cGAMP、c-二-AMP及c-二-GMP之刺激反應較弱，但對內源性產生之cGAS產物ML cGAMP起反應(Diner等人，2013)。因此，已提出在hSTING靶向方面，2',5'-3',5'分子代表顯著更強效之生理學配位體(Zhang等人，Mol.Cell.51：226-35,2013；Xiao及Fitzgerald,Mol.Cell 51：135-39,2013)。
本發明之一個目標為提供可調節對疾病之免疫反應的組合物及方法。本發明之另一目標為提供可提供環狀嘌呤二核苷酸類似物之組合物及方法，該環狀嘌呤二核苷酸類似物在用於活化哺乳動物且較佳人類STING時呈現改良之特徵。本發明之另一目標為提供用於治療癌症之組合物及方法。
在第一態樣中，本發明提供組合物，其包含：一或多種經氟單或雙取代之雙-3',5'環狀嘌呤二核苷酸(「單-F-CDN化合物或二-F-CDN化合物」)或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其結合於干擾素基因刺激因子(「STING」)且當使用至少一種人類(h)STING對偶基因量測時，在比雙-3',5' c-二-GMP(亦即3'3'-(G)(G))、雙-3',5' c-二-AMP(亦即3'3'-(A)(A)或CDA)或雙-3',5' c-GMP-AMP(亦即3'3'-(G)(A)或cGAMP)中之一或多者(且較佳其中之每一者)低至少10倍的濃度下刺激STING依賴性I型干擾素產生。此較佳使用Ishikawa,H.及Barber,G.N.(2008).Nature 455,674-678中所描述之hSTING(REF)對偶基因量測，其蛋白
質序列為NCBI參考序列NP_938023(SEQ ID NO：1；圖6)。此最佳使用哺乳動物細胞株(例如HEK293T細胞)活體外量測，該哺乳動物細胞株不內源性表現功能性STING，但已經修飾以穩定表現hSTING(REF)對偶基因，如下文中所描述(例如參見實例12)。
在相關態樣中，本發明提供組合物，其包含：一或多種單-F-CDN化合物或二-F-CDN化合物，當使用至少一種人類STING蛋白質量測時，其以比雙-3',5' c-二-GMP((亦即3'3'-(G)(G))、雙-3',5' c-二-AMP(亦即3'3'-(A)(A)或CDA)或雙-3',5' c-GMP-AMP(亦即3'3'-(G)(A)或cGAMP)中之一或多者高至少10倍之親和力結合至少一種人類螯針對偶基因蛋白質產物。此較佳使用諸如差示掃描螢光測定法之方法，使用由所描述之hSTING(REF)對偶基因編碼之經分離之蛋白質量測(Ishikawa,H.及Barber,G.N.(2008).Nature 455,674-678)，其蛋白質序列為NCBI參考序列NP_938023，如下文中所描述(例如參見實例11)。
如下文中所描述，本發明之雙-3',5'環狀嘌呤二核苷酸上之一個或兩個游離2'-羥基經氟之取代可實質上改良其與人類STING之結合。許多經2'-氟取代之CDN可用於本發明中。較佳經2'-氟取代之CDN包括(但不限於)由c-二-AMP、c-二-GMP、c-二-IMP、c-AMP-GMP、c-AMP-IMP、c-GMP-IMP及其類似物或前藥或醫藥學上可接受之鹽上一個或兩個2'-羥基之取代衍生之CDN。此清單不意欲為限制性。單-F-CDN化合物或二-F-CDN化合物之其他態樣及實施例描述於下文中。
在第二態樣中，本發明提供式I之經氟單或雙取代之3',5'-3',5'環狀嘌呤二核苷酸(單-F-CDN化合物或二-F-CDN)化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中各R1及R2獨立地為嘌呤；各R3及R4獨立地為H、OH或F，其限制條件為R3及R4中之一者或兩者為F；且各R5及R6獨立地為OH或SH。
在第二態樣之某些實施例中，各R5及R6為SH。在較佳實施例中，當各R5及R6為SH時，組合物包含一或多種實質上純的Sp,Sp、Rp,Rp、Sp,Rp或Rp,Sp立體異構體。在一些實施例中，組合物包含一或多種實質上純的Rp,Rp立體異構體。
本文中所描述之化合物中可使用之嘌呤R1及R2具有以下一般結構：
其中：各R7或R11獨立地為-CR-或-N-；R8為-C(R)2-、-O-或-NR；各R9、R10、R12、R13或R14獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、-CN、-OR、-SR、-N(R)2、-C(O)R、-CO2R、-S(O)R、-S(O)2R、
-C(O)N(R)2、-SO2N(R)2、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、-N(R)N(R)2、-C=NOR、-N(R)C(O)N(R)2、-N(R)SO2N(R)2、-N(R)SO2R、-OC(O)N(R)2或視情況經取代之選自由以下組成之群的取代基：C1-12脂族基、苯基、3-7員飽和或部分不飽和單環碳環、7-10員飽和或部分不飽和雙環碳環、具有1-2個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的3-7員飽和或部分不飽和雜環、具有1-3個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的7-10員飽和或部分不飽和雙環雜環及具有1-3個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的5-6員雜芳基環，其中各R獨立地為視情況經取代之選自由以下組成之群的取代基：C1-12脂族基、苯基、3-7員飽和或部分不飽和單環碳環、7-10員飽和或部分不飽和雙環碳環、具有1-2個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的3-7員飽和或部分不飽和雜環、具有1-3個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的7-10員飽和或部分不飽和雙環雜環及具有1-3個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的5-6員雜芳基環，或同一個氮上之兩個R基團與其介入原子共同形成視情況經取代之具有1-4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的3-7員飽和、部分不飽和或雜芳基環。各C1-12脂族基、苯基、3-7員飽和或部分不飽和單環碳環、7-10員飽和或部分不飽和雙環碳環、3-7員飽和或部分不飽和雜環、7-10員飽和或部分不飽和雙環雜環及5-6員雜芳基環，或同一個氮上之兩個R基團共同形成視情況經1至5個、1至4個、1至3個、1至2個或1個選自由以下組成之群的獨立選擇的取代基取代的3-7員飽和、部分不飽和或雜芳基環：鹵素、-CN、-NO2、-OH、=O、-NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷基胺基及C1-6二烷基胺基。
在第二態樣及其實施例之某些實施例中，R1及R2中之每一者獨立地選自由以下組成之群：腺嘌呤、鳥嘌呤、異鳥嘌呤、次黃嘌呤及黃嘌呤或其類似物。在一些實施例中，R1及R2中之每一者獨立地為腺嘌呤或鳥嘌呤。在一些實施例中，R1或R2中之一者為腺嘌呤，且
R1或R2中之另一者為鳥嘌呤；或在各種情況下，各R1及R2為腺嘌呤；或各R1及R2為鳥嘌呤，或其類似物。在一個較佳實施例中，R1及R2獨立地為腺嘌呤或鳥嘌呤，其限制條件為R1及R2不皆為鳥嘌呤，或其類似物。
在第二態樣及其實施例之一些實施例中，各R5及R6為SH且R1及R2獨立地為：
其中R15及R16獨立地為H或-C(O)R'，其中R'為C1-6烷基或苯基。在一些實施例中，R15為H或-C(O)-異丙基且R16為H或-C(O)-苯基。
在第二態樣及其實施例之一些實施例中，式I化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第二態樣及其實施例之較佳實施例中，各R3及R4為F。此在本文中稱為2',2"-diF或二-2'F。
在一些實施例中，一或多種化合物為2',2"-diF-Rp,Rp環狀嘌呤二核苷酸(因此其中各R5及R6為SH)，包括(但不限於)2',2"-diF-Rp,Rp-c-二-AMP(在本文中亦稱為2',2"-diF-R,R-CDA或3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A))、2',2"-diF-Rp,Rp-c-二-GMP(在本文中亦稱為2',2"-diF-R,R-CDG或3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-G))、2',2"-diF-Rp,Rp-c-二-IMP(在本文中亦稱為2',2"-diF-R,R-CDI或3'3'-RR-(2'F-I)(2'F-I))、2',2"-diF-Rp,Rp-c-AMP-GMP(在本文中亦稱為2',2"-diF-R,R-cGAMP或3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A))、2',2"-diF-Rp,Rp-c-AMP-IMP(在本文中亦稱為2',2"-diF-R,R-
cIAMP或3'3'-RR-(2'F-I)(2'F-A))、2',2"-diF-Rp,Rp-c-GMP-IMP(在本文中亦稱為2',2"-diF-R,R-cGIMP或3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-I))，及其類似物。
在第二態樣及其任何實施例之一個較佳實施例中，所述化合物不為以下中之一者：
在第三態樣中，本發明提供式II之單-F-CDN或二-F-CDN化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中：R17及R18獨立地為鳥嘌呤或腺嘌呤，其經由N9位置結合於該結構，其中腺嘌呤之6號位置處的胺視情況經苯甲醯基取代且其中鳥嘌呤之2號位置處的胺視情況經異丁醯基取代；R19及R20獨立地為OH或F，其限制條件為R19及R20中之至少一者為F。
在第三態樣之第一實施例中，式II化合物為式IIa化合物、式IIb化合物或式IIc化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中R17、R18、R19及R20如關於式II所定義。
在第三態樣之第二實施例或其第一實施例中，R17及R18獨立地為腺嘌呤或鳥嘌呤。在一些實施例中，R17及R18獨立地為腺嘌呤或鳥嘌呤，其限制條件為R17及R18不皆為鳥嘌呤。在一些實施例中，R17及R18皆為腺嘌呤。在一些實施例中，R17及R18皆為鳥嘌呤。在一些實施例中，R17及R18中之一者為腺嘌呤且R17及R18中之另一者為鳥嘌呤。
在第三態樣之一些實施例及其第一或第二實施例中，R19及R20中之一者為F且R19及R20中之另一者為OH。在一些實施例中，R19及R20皆為F。在一些實施例中，R19及R20皆為F且化合物為式IIa化合物。
在第三態樣之一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第三態樣之一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物
或醫藥學上可接受之水合物。
在第四態樣中，本發明提供式III之二-F-CDN化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中R21及R22獨立地為鳥嘌呤或腺嘌呤，其經由N9位置結合於該結構。
在第四態樣之第一實施例中，式III化合物為式IIIa化合物或式IIIb化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中R21及R22如關於式III所定義。
在第四態樣之第二實施例或其第一實施例中，R21及R22獨立地為鳥嘌呤或腺嘌呤，其限制條件為R21及R22不皆為鳥嘌呤。在一些實施例中，R21及R22皆為腺嘌呤。在一些實施例中，R21為腺嘌呤且R22為鳥嘌呤。
在第四態樣之一些實施例或其第一或第二實施例中，化合物為式IIIa化合物。
在第四態樣之一些實施例中，二-F-CDN化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第四態樣之一些實施例中，二-F-CDN化合物係選自由以下組
成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第四態樣之一些實施例中，二-F-CDN化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第四態樣之一些實施例中，二-F-CDN化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第五態樣中，本發明提供式IV之單-F-CDN化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中：R23及R24獨立地為鳥嘌呤或腺嘌呤，其經由N9位置結合於該結構；及R25及R26中之一者為OH且R25及R26中之另一者為F。
在第五態樣之第一實施例中，式IV化合物為式IVa化合物、式IVb化合物或式IVc化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中R23、R24、R25及R26如關於式IV所定義。
在第五態樣之第二實施例或其第一實施例中，R23及R24獨立地為腺嘌呤或鳥嘌呤，其限制條件為R23及R24不皆為鳥嘌呤。在一些
實施例中，R23及R24皆為腺嘌呤。在一些實施例中，R23及R24中之一者為腺嘌呤且R23及R24中之另一者為鳥嘌呤。
在第五態樣之一些實施例或其第一或第二實施例中，化合物為式IVa化合物。
在第五態樣之一些實施例中，單-F-CDN化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物
或醫藥學上可接受之水合物。
在第六態樣中，本發明提供式V之單-F環狀二-腺嘌呤或二-F環狀二-腺嘌呤化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中：R27及R28獨立地為OH或F，其限制條件為R27及R28中之至少一者為F；及R29及R30獨立地為H或苯甲醯基。
在第六態樣之第一實施例中，式V化合物為式Va化合物或式Vb化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中R27、R28、R29及R30如關於式V所定義。
在第六態樣之第二實施例或其第一實施例中，R29及R30皆為H。在一些實施例中，R29及R30皆為苯甲醯基。在一些實施例中，R29及R30中之一者為苯甲醯基且R29及R30中之另一者為H。
在第六態樣之一些實施例及其第一或第二實施例中，R27及R28皆為F。在一些實施例中，R27及R28中之一者為F且R27及R28中之另一者為OH。
在第六態樣之一些實施例中，R27及R28皆為F，且R29及R30皆為H。在一些實施例中，化合物為式Va化合物，R27及R28皆為F，且R29及R30皆為H。
在第六態樣之一些實施例中，單-F環狀二-腺嘌呤或二-F環狀二-腺嘌呤化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第六態樣之一些實施例中，單-F環狀二-腺嘌呤或二-F環狀二-腺嘌呤化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第七態樣中，本發明提供式VI之單-F環狀二-鳥嘌呤或二-F環狀二-鳥嘌呤化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中：R31及R32獨立地為OH或F，其限制條件為R31及R32中之至少一者為F；R33及R34獨立地為H或丁醯基。
在第七態樣之第一實施例中，式VI化合物為式VIa化合物或式VIb化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中R31、R32、R33及R34如關於式VI
所定義。
在第七態樣之第二實施例或其第一實施例中，R33及R34皆為H。在一些實施例中，R33及R34皆為丁醯基。在一些實施例中，R33及R34中之一者為丁醯基且R33及R34中之另一者為H。
在第七態樣之一些實施例及其第一或第二實施例中，R31及R32皆為F。在一些實施例中，R31及R32中之一者為F且R31及R32中之另一者OH。
在第六態樣之一些實施例中，R31及R32皆為F，且R33及R34皆為H。在一些實施例中，化合物為式VIa化合物，R31及R32皆為F，且R33及R34皆為H。
在第七態樣之一些實施例中，單-F環狀二-鳥嘌呤或二-F環狀二-鳥嘌呤化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第八態樣中，本發明提供式VII之單-F環狀鳥嘌呤及腺嘌呤二核苷酸或二-F環狀鳥嘌呤及腺嘌呤二核苷酸化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中：R35及R36獨立地為OH或F，其限制條件為R35及R36中之至少一者為F；R37為H或苯甲醯基；及R38為H或丁醯基。
在第八態樣之第一實施例中，式VII化合物為式VIIa化合物、式VIIb化合物或式VIIc化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，其中R35、R36、R37及R38如關於式VII所定義。
在第八態樣之第二實施例或其第一實施例中，R37及R38皆為H。在一些實施例中，R37為苯甲醯基且R38為丁醯基。在一些實施例中，R37為H且R38為丁醯基。在一些實施例中，R37為苯甲醯基且R38為H。
在第八態樣之一些實施例及其第一或第二實施例中，R35及R36皆為F。在一些實施例中，R35及R36中之一者為F且R35及R36中之另一者為OH。在一些實施例中，R35及R36皆為F，且化合物為式VIIa之化合物。
在第八態樣之一些實施例及其第一實施例中，R35及R36皆為F且R37及R38皆為H。在一些實施例中，R35及R36皆為F，R37為H且R38為丁醯基。在一些實施例中，R35及R36皆為F，R37為苯甲醯基且R38為H。在一些實施例中，R35及R36皆為F，R37為苯甲醯基且R38
為丁醯基。在一些實施例中，R35及R36皆為F，R37及R38皆為H，且化合物為式VIIa化合物。
在第八態樣之一些實施例及其第一實施例中，R35為F，R36為OH且R37及R38皆為H。在一些實施例中，R35為F，R36為OH，R37為H且R38為丁醯基。在一些實施例中，R35為F，R36為OH，R37為苯甲醯基且R38為H。在一些實施例中，R35為F，R36為OH，R37為苯甲醯基且R38為丁醯基。在一些實施例中，R35為F，R36為OH，R37及R38皆為H，且化合物為式VIIa化合物。
在第八態樣之一些實施例及其第一實施例中，R35為OH，R36為F且R37及R38皆為H。在一些實施例中，R35為OH，R36為F，R37為H且R38為丁醯基。在一些實施例中，R35為OH，R36為F，R37為苯甲醯基且R38為H。在一些實施例中，R35為OH，R36為F，R37為苯甲醯基且R38為丁醯基。在一些實施例中，R35為OH，R36為F，R37及R38皆為H，且化合物為式VIIa化合物。
在第八態樣之一些實施例中，單-F環狀鳥嘌呤及腺嘌呤二核苷酸或二-F環狀鳥嘌呤及腺嘌呤二核苷酸化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第八態樣之一些實施例中，單-F環狀鳥嘌呤及腺嘌呤二核苷酸或二-F環狀鳥嘌呤及腺嘌呤二核苷酸化合物係選自由以下組成之群：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第九態樣中，提供化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)，其具有以下
結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第十態樣中，提供化合物3'3'-RS-(2'F-A)(2'F-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第十一態樣中，提供化合物3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第十二態樣中，提供化合物3'3'-RS-(2'F-G)(2'F-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第十三態樣中，提供化合物3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-G)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第十四態樣中，提供化合物3'3'-RS-(2'F-G)(2'F-G)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第十五態樣中，提供化合物3'3'-RR-(2'F-iBuG)(2'F-BzA)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第十六態樣中，提供化合物3'3'-RS-(2'F-iBuG)(2'F-BzA)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第十七態樣中，提供化合物3'3'-RR-(2'F-BzA)(2'F-BzA)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第十八態樣中，提供化合物3'3'-RR-(2'F-iBuG)(2'F-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第十九態樣中，提供化合物3'3'-RR-(A)(2'F-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第二十態樣中，提供化合物3'3'-RS-(A)(2'F-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第二十一態樣中，提供化合物3'3'-RR-(2'F-G)(A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第二十二態樣中，提供化合物3'3'-SR-(2'F-G)(A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第二十三態樣中，提供化合物3'3'-RR-(G)(2'F-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第二十四態樣中，提供化合物3'3'-RS-(G)(2'F-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第二十五態樣中，提供化合物3'3'-(2'F-G)(2'F-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第二十六態樣中，提供化合物3'3'-RR-(2'βF-A)(2'βF-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在第二十七態樣中，提供化合物3'3'-RS-(2'βF-A)(2'βF-A)，其具有以下結構：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
在以上態樣及其實施例中之任一者之單-F-CDN或二-F-CDN化合物中之任一者中，磷酸酯基連接子中之每一者處之結構較佳為硫代磷酸酯基(例如式I中之R5及R6皆為SH)，更優選其中各磷處之立體化學為R，且化合物為實質上純的。
在以上態樣及其實施例中之任一者之一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物包括其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，包括其任何前藥之醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，且包括其任何醫藥學上可接受之鹽之任何醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。在一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物包括其醫藥學上可接受之溶劑合物、醫藥學上可接受之水合物或醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物為其醫藥學上可接受之鹽或醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。在一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物為其醫藥學上可接受之鹽。
在以上態樣及其實施例中之任一者之一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物包括其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，醫藥學上可接受之鹽係選自由以下組成之群：鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鋁、銨、二乙胺、異丙胺、乙醇胺(olamine)、二苯甲基乙二胺(benzathine)、苯甲基苯乙胺(benethamine)、緩血酸胺(2-胺基-2-(羥基甲基)丙-1,3-二醇)、嗎啉、依泊胺(epolamine)、哌啶、哌嗪、甲基吡啶、二環己胺、N,N'-二苯甲基乙二胺、2-羥乙胺、三-(2-羥基乙基)胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、丹醇(deanol)、咪唑、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、普魯卡因(procaine)、二苯甲
基哌啶、去氫松香胺(dehydroabietylamine)、葡糖胺、三甲基吡啶、奎寧(quinine)、喹諾酮、第三丁胺(erbumine)、離胺酸及精胺酸鹽。
在以上態樣或其實施例中之任一者之一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物係以其二鈉鹽形式提供。在一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物係以其二鈉鹽或其醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物形式提供。
在以上態樣及其實施例中之任一者之一些實施例中，在量測人類STING依賴性IFN-β產生之誘導的細胞分析法中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與一或多種參考化合物相比具有更高活性。在一些實施例中，該一或多種參考化合物係選自由以下組成之群：3'3'-(G)(G)(亦即環狀-[G(3',5')p-G(3',5')p])、3'3'-(A)(A)((亦即環狀-[A(3',5')p-A(3',5')p])、3'3'-(G)(A)((亦即環狀-[G(3',5')p-A(3',5')p])、3'3'-RR-(A)(A)((亦即二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[A(3',5')p-A(3',5')p])、3'3'-RR-(G)(G)((亦即二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[G(3',5')p-G(3',5')p])及3'3'-RR-(G)(A)((亦即二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[G(3',5')p-A(3',5')p])。在一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物為單-F-RR-CDN或二-F-RR-CDN化合物，且該一或多種參考化合物係選自由以下組成之群：3'3'-RR-(A)(A)、3'3'-RR-(G)(G)及3'3'-RR-(G)(A)。在一些實施例中，參考化合物為二-OH參考化合物。在一些實施例中，細胞分析法為hPBMC分析法，例如實例13中所描述之分析法。在一些實施例中，細胞分析法為THPI分析法。例如實例14中所描述之分析法。在一個較佳實施例中，在不添加可促進分析細胞對單-F-CDN或二-F-CDN化合物或參考化合物之吸收之試劑或可促進單-F-CDN或二-F-CDN化合物或參考化合物對分析細胞之滲透性之試劑的情況下進行細胞分析法。在一些實施例中，細胞分析法為在不添加可促進分析細胞對單-F-CDN或二-F-CDN化合物或參考化合物之吸收之試劑或可促進單-F-CDN或二-F-
CDN化合物或參考化合物對分析細胞之滲透性之試劑的情況下進行的THP1細胞分析法，其中單-F-CDN或二-F-CDN化合物具有小於40μM、小於30μM、小於20μM、小於15μM或小於10μM之EC50。在一些實施例中，在量測人類STING依賴性IFN-β產生之誘導的細胞分析法中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物具有小於40μM、小於30μM、小於20μM、小於15μM或小於10μM之EC50，其中在不添加可促進分析細胞對單-F-CDN或二-F-CDN化合物之吸收之試劑或可促進單-F-CDN或二-F-CDN化合物對分析細胞之滲透性之試劑的情況下進行細胞分析法。在一個實施例中，細胞分析法為如實例14中所描述之THP1細胞分析法，其中分析法在不添加毛地黃皂苷(digitonin)之情況下進行。在一些實施例中，在量測人類STING依賴性IFN-β產生之誘導的細胞分析法中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物之EC50小於選自由以下組成之群的一或多種參考化合物之EC50：3'3'-(G)(G)((亦即環狀-[G(3',5')p-G(3',5')p])、3'3'-(A)(A)((亦即環狀-[A(3',5')p-A(3',5')p])、3'3'-(G)(A)((亦即環狀-[G(3',5')p-A(3',5')p])、3'3'-RR-(A)(A)((亦即二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[A(3',5')p-A(3',5')p])、3'3'-RR-(G)(G)((亦即二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[G(3',5')p-G(3',5')p])及3'3'-RR-(G)(A)((亦即二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[G(3',5')p-A(3',5')p])。較佳其中細胞分析法在不添加可促進分析細胞對單-F-CDN或二-F-CDN化合物或參考化合物之吸收之試劑或可促進單-F-CDN或二-F-CDN化合物或參考化合物對分析細胞之滲透性之試劑的情況下進行。在一些實施例中，在如實例14中所描述之THP1細胞分析法中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物之EC50小於二-OH參考化合物之EC50，較佳其中分析法在不添加毛地黃皂苷之情況下進行。在一些實施例中，在如實例14中所描述之THP1細胞分析法中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物之EC50比二-OH參考化合物之EC50低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍
或至少8倍，其中分析法係在不添加毛地黃皂苷之情況下進行。
如下文所描述，本發明之環狀嘌呤二核苷酸組合物，其中組合物中之一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物可在比以下中之一或多者低至少10倍、50倍或100倍之濃度下誘導高至少2倍且更佳5倍或10倍或10倍以上之STING依賴性I型干擾素產生：雙-3',5' c-二-GMP((亦即3'3'-(G)(G))、雙-3',5' c-二-AMP((亦即3'3'-(A)(A)或CDA)或雙-3',5' c-GMP-AMP((亦即3'3'-(G)(A)或cGAMP)(意謂不含2'-F取代)。如本文中所指出，STING最佳為人類STING。在較佳實施例中，本發明之包含單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合物活化人類STING而非相應的雙-3',5'環狀嘌呤二核苷酸(具有相同嘌呤但不含2'-F取代)。
下文中亦描述本發明之包含單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合物，其中組合物中之一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物以比以下中之一或多者高至少10倍、50倍或100倍之親和力結合STING：雙-3',5'c-二-GMP((亦即3'3'-(G)(G))、雙-3',5'c-二-AMP((亦即3'3'-(A)(A)或CDA)或雙-3',5'c-GMP-AMP((亦即3'3'-(G)(A)或cGAMP)(意謂不含2'-F取代)。如本文中所指出，STING最佳為人類STING。在較佳實施例中，本發明之環狀嘌呤二核苷酸組合物以比相應的雙-(3',5')環狀嘌呤二核苷酸(具有相同嘌呤且不含2'-F取代)高至少10倍、50倍或100倍之親和力結合STING。
在以上態樣及其實施例中之任一者之一些實施例中，當使用至少一種人類STING蛋白質量測時，單-F-CDN或二-F-CDN化合物以比一或多種選自由以下組成之群的參考化合物更大的親和力結合至少一種人類STING對偶基因蛋白質產物(包括WT、REF、HAQ、AQ及Q對偶基因中之任一者)：3'3'-(G)(G)((亦即環狀-[G(3',5')p-G(3',5')p])、3'3'-(A)(A)((亦即環狀-[A(3',5')p-A(3',5')p])、3'3'-(G)(A)((亦即環狀-[G(3',5')p-A(3',5')p])、3'3'-RR-(A)(A)((亦即二硫基-(Rp,Rp)-環狀-
[A(3',5')p-A(3',5')p])、3'3'-RR-(G)(G)((亦即二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[G(3',5')p-G(3',5')p])及3'3'-RR-(G)(A)((亦即二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[G(3',5')p-A(3',5')p])。在以上態樣及其實施例中之任一者之一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物以比二-OH參考化合物更大的親和力結合至少一種人類STING對偶基因蛋白質產物。此較佳係使用諸如差示掃描螢光測定法(DSF)之方法，使用由hSTING(WT)、hSTING(HAQ)或hSTING(REF)對偶基因編碼之經分離之蛋白質量測(Ishikawa,H.及Barber,G.N.(2008).Nature 455,674-678；Yi等人，2013,PLos One 2013年10月21日，8(10)：e77846；REF對偶基因之蛋白質序列為NCBI參考序列NP_938023)，如下文及實例11中所描述。
在第二十八態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含一或多種如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，及可促進化合物之細胞吸收及/或穩定性的傳遞媒劑。在一些實施例中，傳遞媒劑包含一或多種選自由以下組成之群的試劑：佐劑、脂質、脂質體、雙層間交聯多層微脂粒、基於生物可降解聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)[PLGA]或基於聚酐之奈米粒子或微米粒子，及奈米多孔粒子負載型脂質雙層。
在第二十九態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含一或多種如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，及醫藥學上可接受之賦形劑。
在第二十九態樣之第一實施例中，醫藥組合物不包括可促進一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物之細胞滲透性的試劑。
在第二十九態樣之第二實施例中，醫藥組合物不包括可促進一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物之細胞吸收的試劑。
在第二十九態樣之第三實施例中，醫藥組合物進一步包含傳遞媒劑，其促進化合物之細胞吸收及/或穩定性。在一些實施例中，傳遞媒劑包含一或多種選自由以下組成之群的試劑：佐劑、脂質、脂質體、雙層間交聯多層微脂粒、基於生物可降解聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)[PLGA]或基於聚酐之奈米粒子或微米粒子，及奈米多孔粒子負載型脂質雙層。
在第二十八態樣及其實施例或第二十九態樣及其第一、第二或第三實施例之一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種選自由以下組成之群的其他醫藥活性組分：免疫檢查點抑制劑(例如CTLA-4、PD-1、Tim-3、Vista、BTLA、LAG-3及TIGIT路徑拮抗劑；PD-1路徑阻斷劑；PD-L1抑制劑；包括(但不限於)抗PD-1抗體尼沃單抗(nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)或皮立珠單抗(pidilizumab)；PD-1抑制劑AMP-224；抗CTLA-4抗體伊派利單抗(ipilimumab)；及抗PD-L1抗體BMS-936559、MPDL3280A、MEDI4736或艾維路單抗(avelumab))；TLR促效劑(例如CpG或單磷醯基脂質A)；不活化或滅毒細菌，其誘導先天性免疫性(例如不活化或滅毒單核球增多性李氏菌)；經由Toll樣受體(TLR)、經由(NOD)樣受體(NLR)、經由基於視黃酸可誘導之基因(RIG)-I樣受體(RLR)、經由C型凝集素受體(CLR)或經由病原體相關分子模式(PAMP)介導先天性免疫活化之組合物；及化學治療劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係選自由以下組成之群：CTLA-4路徑拮抗劑、PD-1路徑拮抗劑、Tim-3路徑拮抗劑、Vista路徑拮抗劑、BTLA路徑拮抗劑、LAG-3路徑拮抗劑及TIGIT路徑拮抗劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM-3抗體、抗
BTLA抗體或抗LAG-3抗體。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係選自由以下組成之群：尼沃單抗、派立珠單抗、皮立珠單抗、AMP-224、伊派利單抗、BMS-936559、MPDL3280A、MEDI4736及艾維路單抗。在一些實施例中，TLR促效劑為CpG或單磷醯基脂質A。
在第二十八態樣或第二十九態樣及其以上實施例中之任一者之一些實施例中，醫藥組合物進一步包含不活化腫瘤細胞，其表現及分泌可刺激樹突狀細胞誘導、補充及/或成熟之一或多種細胞激素，或表現及分泌一或多種熱休克蛋白質，包括gp96-Ig融合蛋白質。在一些實施例中，一或多種細胞激素係選自由以下組成之群：GM-CSF、CCL20、CCL3、IL-12p70及FLT-3配位體。在一些實施例中，腫瘤細胞藉由用輻射處理來不活化。在一些實施例中，一或多種細胞激素係選自由以下組成之群：GM-CSF、CCL20、CCL3、IL-12p70及FLT-3配位體，且腫瘤細胞藉由用輻射處理來不活化。在一些實施例中，不活化腫瘤細胞表現及分泌gp96-Ig融合蛋白質。
在第二十八態樣或第二十九態樣及其以上實施例中之任一者之一些實施例中，醫藥組合物進一步包含一或多種抗原，其經選擇以用於在組合物投與個體時誘導針對該一或多種抗原之免疫反應之目的。在一些實施例中，抗原為重組型蛋白質抗原。在一些實施例中，抗原為與感染性疾病、惡性腫瘤或碘苷相關之重組型蛋白質抗原。在一些實施例中，該一或多種抗原為表1中之一或多種抗原。
在第二十八態樣或第二十九態樣及其以上實施例中之任一者之一些實施例中，醫藥組合物調配為水性或水包油乳液。
在第三十態樣中，本發明提供用於治療患有癌症之個體之方法，其中該方法包含投與有需要之個體有效量之一或多種如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可
接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，或其如上文所描述之第二十八及第二十九態樣及其任何實施例中所描述之組合物。在一些實施例中，該一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物係經腸或非經腸投與。在一些實施例中，投藥係以皮下、肌肉內、皮內、經黏膜、經陰道、經子宮頸、腫瘤周圍、腫瘤內或直接進入腫瘤引流淋巴結之方式進行。在一些實施例中，投藥係以經黏膜，較佳經口方式進行。
在第三十態樣之第一實施例中，接受此類治療之個體可患有選自由以下組成之群的癌症：結腸直腸癌、上呼吸消化道鱗狀癌、肺癌、腦癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、胃腸道癌、口咽癌、食道癌、頭頸癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、乳癌、黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤。
在第三十態樣之第二實施例及其第一實施例中，用於治療患有癌症之個體的方法進一步包含投與一或多種其他癌症療法。在一些實施例中，該一或多種其他癌症療法包含放射療法、手術、化學療法或免疫療法(例如(但不限於)免疫調節劑、免疫檢查點抑制劑、細胞免疫療法或癌症疫苗)。在一些實施例中，該一或多種其他癌症療法包含可表現及分泌一或多種細胞激素或一或多種熱休克蛋白質之不活化腫瘤細胞。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：GM-CSF、CCL20、CCL3、IL-12p70及FLT-3配位體。在一些實施例中，熱休克蛋白質為gp96-Ig蛋白質。在一些實施例中，該方法包含投與一或多種選自由以下組成之群的其他癌症療法：化學治療劑；免疫檢查點抑制劑；TLR促效劑；經選擇以刺激針對一或多種癌症抗原之免疫反應的疫苗、誘導抗體依賴性細胞毒性之治療性抗體；免疫調節細胞株；誘導先天性免疫性之不活化或滅毒細菌；經選擇以用於誘導免
疫反應之目的之抗原，及經由Toll樣受體(TLR)、(NOD)樣受體(NLR)、基於視黃酸可誘導之基因(RIG)-I樣受體(RLR)、C型凝集素受體(CLR)或病原體相關分子模式(「PAMP」)介導先天性免疫活化之組合物。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗TIM-3抗體、抗BTLA抗體或抗LAG-3抗體。在一些實施例中，TLR促效劑為CpG或單磷醯基脂質A。在一些實施例中，誘導抗體依賴性細胞毒性之治療性抗體為利妥昔單抗(rituximab)、異貝莫單抗(ibritumomab)、托西莫單抗(tositumomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、阿侖單抗(alemtuzumab)、奧科立姆(oncolym)、易必利單抗(ibilimumab)、維他欣(vitaxin)或貝伐單抗(bevacizumab)。
在第三十態樣及其第一及第二實施例之一些實施例中，個體患有表現癌症抗原之癌症，且用於治療該個體之方法進一步包含投與個體基本療法以移除或殺死表現癌症抗原之癌細胞，其中基本療法之投藥係與單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物之投藥同時、在其之前或在其之後進行。在一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物係作為基本療法之新輔助療法投與。在較佳實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物係在基本療法之後投與。在一些實施例中，基本療法包含用於自哺乳動物移除癌細胞之手術、用於殺死哺乳動物中之癌細胞的放射療法或同時包含手術及放射療法。
在第三十一態樣中，本發明提供治療個體中之疾病之方法，其包含投與有需要之個體i)有效量之一或多種如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，或其如上文所描述之第二十八及第
二十九態樣及其任何實施例中所描述之組合物；及ii)有效量之一或多種治療性抗體，其誘導抗體依賴性細胞毒性，其中該疾病係選自由以下組成之群：癌症、急性器官移植排斥、I型糖尿病、類風濕性關節炎、牛皮癬、克羅恩氏病(Crohn's disease)、再狹窄及過敏性哮喘。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：淋巴瘤(例如B細胞淋巴瘤)、乳癌、慢性淋巴球性白血病、結腸直腸癌、黑素瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌及其他實體腫瘤。在一些實施例中，治療性抗體係選自由以下組成之群：莫羅單抗-CD3(muromonab-CD3)、英利昔單抗(infliximab)、達利珠單抗(daclizumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、阿昔單抗(abciximab)、利妥昔單抗(rituximab)、異貝莫單抗(ibritumomab)、托西莫單抗(tositumomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、阿侖單抗(alemtuzumab)、奧科立姆、易必利單抗、維他欣及貝伐單抗。
在第三十二態樣中，本發明提供用於治療其中Th1免疫性轉變成Th2免疫性可提供臨床益處之病症的方法，其中該方法包含投與有需要之個體一或多種如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，或其如上文所描述之第二十八及第二十九態樣及其任何實施例中所描述之組合物。細胞介導之免疫性(CMI)與產生細胞激素IL-2、干擾素(IFN)-γ及腫瘤壞死因子(TNF)-α之TH1 CD4+ T淋巴球相關。相比之下，體液免疫性與產生IL-4、IL-6及IL-10之TH2 CD4+ T淋巴球相關。針對TH1反應之免疫偏差通常引起細胞毒性T細胞淋巴球(CTL)、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞及單核細胞之活化。通常，Th1反應在針對細胞內病原體(位於宿主細胞內部之病毒及細菌)及腫
瘤方面更有效，而Th2反應在針對細胞外細菌、寄生蟲(包括蠕蟲)及毒素方面更有效。此外，預期先天性免疫性之活化可校正1及2型T輔助細胞(Th1/Th2)免疫系統平衡及抑制可引起免疫球蛋白(Ig)E依賴性過敏及過敏性哮喘之Th2類型反應之過度反應。
如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，或其如上文所描述之第二十八及第二十九態樣及其任何實施例中所描述之組合物，可在含有醫藥學上可接受之賦形劑(例如載劑、佐劑、媒劑及其類似物)之配方中藉由多種非經腸及經腸途徑投與有需要之個體，如上文所描述之第三十至第三十二態樣及其任何實施例之方法中所描述。較佳經腸途徑包括經黏膜(例如經口、經陰道、經鼻、經子宮頸等)途徑。較佳非經腸途徑包括(但不限於)皮下、靜脈內、肌肉內、動脈內、皮內、鞘內及硬膜外投藥中之一或多者。較佳投藥係經由皮下、腫瘤內或腫瘤周圍途徑，更佳為皮下投藥。
如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，或其如本文中所描述之第二十八及第二十九態樣及其任何實施例中所描述之組合物可與一或多種其他醫藥活性組分共同投與有需要之個體，如上文所描述之第三十至第三十二態樣及其任何實施例之方法中所描述，該一或多種其他醫藥活性組分為諸如佐劑、脂質、雙層間交聯多層微脂粒、基於生物可降解聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)[PLGA]或基於聚酐之奈米粒子或微米粒子，及奈米多孔粒子負載型脂質雙層、免疫檢查點抑制劑(例如CTLA-4、PD-1、Tim-3、Vista、BTLA、LAG-3及TIGIT路徑拮抗劑；PD-1路徑阻斷劑；PD-L1抑制劑；包括(但不限於)
抗PD-1抗體尼沃單抗、派立珠單抗或皮立珠單抗；PD-1抑制劑AMP-224；抗CTLA-4抗體伊派利單抗；及抗PD-L1抗體BMS-936559、MPDL3280A、MEDI4736或艾維路單抗)、誘導先天性免疫性之不活化或滅毒細菌(例如不活化或滅毒單核球增多性李氏菌)、經由Toll樣受體(TLR)、(NOD)樣受體(NLR)、基於視黃酸誘導性基因(RIG)之I樣受體(RLR)、C型凝集素受體(CLR)或病原體相關分子模式(「PAMP」)介導先天性免疫活化之組合物，或化學治療劑。
在第三十三態樣中，本發明提供一或多種如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，或其如上文所描述之第二十八及第二十九態樣及其任何實施例中所描述之組合物，其係與治療性或預防性疫苗組合用作佐劑。在一些實施例中，疫苗經選擇以刺激針對一或多種預定抗原之免疫反應。在一些實施例中，疫苗包含一或多種抗原，包括與感染性疾病、惡性腫瘤或碘苷有關之重組型蛋白質抗原。在一些實施例中，該一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物與疫苗同時、在疫苗之前或在疫苗之後使用。在一些實施例中，該一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物與疫苗在相同組合物中調配。
在第三十三態樣之第一實施例中，疫苗包含不活化或滅毒細菌或病毒(其包含一或多種相關抗原、一或多種純化抗原、以重組方式經工程改造以表現及/或分泌一或多種抗原之活病毒或細菌傳遞載體)、抗原呈現細胞(APC)載體(其包含負載有一或多種抗原或經包含編碼該一或多種抗原之核酸之組合物轉染的細胞)、脂質抗原傳遞媒劑或編碼一或多種抗原之裸核酸載體。在一些實施例中，疫苗為抗細菌、抗病毒或抗癌治療性或預防性疫苗。在一些實施例中，一或多種
抗原為一或多種選自由以下組成之群的抗原：病毒抗原、細菌抗原及癌症抗原。
在第三十三態樣及其第一實施例之一些實施例中，疫苗包含表現及分泌一或多種細胞激素之不活化腫瘤細胞。在一些實施例中，細胞激素選自由以下組成之群：GM-CSF、CCL20、CCL3、IL-12p70及FLT-3配位體。
在第三十三態樣及其第一實施例之一些實施例中，疫苗包含表現及分泌一或多種熱休克蛋白質之不活化腫瘤細胞。在一些實施例中，熱休克蛋白質為gp96-Ig融合蛋白質。
在第三十四態樣中，本發明提供用於治療患有慢性感染性疾病之個體之方法，其中該方法包含投與有需要之個體有效量之一或多種如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，或其如上文所描述之第二十八及第二十九態樣及其任何實施例中所描述之組合物。在一些實施例中，一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物與另一種試劑組合投與以用於治療慢性感染性疾病。在一些實施例中，慢性感染性疾病係選自由以下組成之群：HBV感染、HCV感染、HPV感染、HSV感染及肝細胞癌症。
在第三十五態樣中，本發明提供一或多種如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，或其如上文所描述之第二十八及第二十九態樣及其任何實施例中所描述之組合物，其係用於治療如上文所描述之第三十至第三十四態樣及其任何實施例中之任一者中所描述的疾病或適應症。在一個較佳實施例中，一或多種單-F-CDN或二-
F-CDN化合物係用於治療癌症。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：結腸直腸癌、上呼吸消化道鱗狀癌、肺癌、腦癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、胃腸道癌症、口咽癌、食道癌、頭頸癌、卵巢癌、子宮癌症、子宮頸癌、子宮內膜癌、乳癌、黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤。
在第三十六態樣中，本發明提供一或多種如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，或其如上文所描述之第二十八及第二十九態樣及其任何實施例中所描述之組合物，其係用於製備用以治療如上文所描述之第三十至第三十四態樣及其任何實施例中之任一者中所描述之疾病或適應症的藥劑。在一個較佳實施例中，一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物係用於製備用以治療癌症之藥劑。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：結腸直腸癌、上呼吸消化道鱗狀癌、肺癌、腦癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、胃腸道癌症、口咽癌、食道癌、頭頸癌、卵巢癌、子宮癌症、子宮頸癌、子宮內膜癌、乳癌、黑素瘤、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤。
在第三十七態樣中，本發明提供一種套組，其包括一或多種如上文所描述之第二至第二十七態樣及其任何實施例中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物，包括其任何前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物，或其如上文所描述之第二十八及第二十九態樣及其任何實施例中所描述之組合物。在一些實施例中，一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物封裝於例如小瓶、瓶子或類似容器中，其可進一步封裝於例如盒
子、包膜或類似容器內。在一些實施例中，一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物由美國食品藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration)或類似監管機構批准用於投與哺乳動物，例如人類。在一個實施例中，此類套組包括書面使用說明書及/或其他指示，其說明該一或多種單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物適於或批准用於投與哺乳動物(例如人類)以用於適合的疾病或病狀。在一些實施例中，化合物或組合物以單位劑量或單次劑量形式封裝，例如單次劑量藥丸、膠囊或其類似物。
在如上文所描述之第二十八及第二十九態樣之醫藥組合物及其任何實施例之一些實施例，及如上文所描述之第三十至第三十四態樣及其任何實施例中之任一者中所描述之用於治療疾病或適應症之方法，及用於治療如第三十五態樣中所描述之疾病或用於製備如上文所描述之第三十六態樣中所描述之藥劑的化合物中，化合物為選自由以下組成之群的化合物：
或其前藥、醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物。
圖1A-B描繪3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)(二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-G(3',5')p-2'F-A(3',5')p])之分析資料NMR(1A)及LC(1B)。
圖2描繪單-F CDN或二-F CDN與人類STING REF蛋白質之結合。
圖3描繪單-F CDN或二-F CDN與人類STING WT蛋白質之結合。
圖4描繪hSTING(REF)之蛋白質序列。
圖5A-B描繪在某一劑量範圍(5A)及6.25μM CDN(5B)下，HEK293T細胞中由hSTING(WT)進行之摺疊IFNβ螢光素酶報導子誘導。
圖6A-B描繪在某一範圍(6A)及6.25μM CDN(6B)下，HEK293T細胞中由hSTING(REF)進行之摺疊IFNβ螢光素酶報導子誘導。
圖7A-B描繪在某一劑量範圍(7A)及6.25μM CDN(7B)下，由STINGWT/WT hPBMC進行之相關IFNβ表現。
圖8A-B描繪在某一劑量範圍(8A)及6.25μM CDN(8B)下，由STINGREF/REF hPBMC進行之相關IFNβ表現。
圖9A-B描繪hPBMC中由經CDN處理之hSTING(WT)(9A)或REF hSTING(REF)(9B)進行之正規化IFNβ表現。
圖10A-B描繪hPBMC中由經CDN處理之hSTING(WT)(10A)或REF hSTING(REF)(10B)進行之正規化TNFα表現。
圖11A-B描繪hPBMC中由經CDN處理之hSTING(WT)(11A)或REF hSTING(REF)(11B)進行之正規化IL-6表現。
圖12A-B描繪hPBMC中由經CDN處理之hSTING(WT)(12A)或REF hSTING(REF)(12B)進行之正規化IFNγ表現。
圖13A-B描繪hPBMC中由經CDN處理之hSTING(WT)(13A)或REF hSTING(REF)(13B)進行之正規化IL-12p40表現。
圖14A-B描繪在CDN之腫瘤內注射後，B16-SIY黑素瘤小鼠模型中之腫瘤體積(14A)及SIY+ CD8+ T細胞(14B)之百分比。
圖15A-B描繪在CDN之腫瘤內注射後，B16黑素瘤(15A)或MC38結腸癌瘤(15B)小鼠模型中之腫瘤體積。
圖16A-B描繪在注射CDN及HIVgag p55蛋白質之小鼠中之HIVgag p55抗原特異性CD4+ T細胞反應(15A)或CD8+ T細胞反應(15B)。
本發明係關於經氟單取代或雙取代之雙-3',5'環狀-二-核苷酸(單-F-CDN或二-F-CDN)免疫刺激劑之製備及用途，該等免疫刺激劑經由稱為STING(干擾素基因刺激因子)之細胞質受體活化DC。特定言之，本發明之CDN係以包含一或多種單-F-CDN或二-F-CDN且最佳一或多種二硫基Rp,Rp二-F-CDN之組合物的形式提供。
稱為病原體相關分子模式(PAMP)之保存性微生物結構由宿主細胞模式識別受體(具有生殖系編碼特異性之PRR)感測，觸發可引起細胞激素及趨化激素之誘導的下游信號級聯，及特異性適應性免疫反應之起始(Iwasaki及Medzhitov,Science 327,291-5,2010)。由感染劑呈現之PAMP如何參與先天性免疫系統決定了適於對抗可引起疾病之入侵病原體之適應性反應的發展。
免疫調節劑及佐劑之設計中的一個目標為選擇可活化指定PRR及起始所需反應之既定PAMP或合成分子。諸如單磷醯基脂質A(MPL)及CpG之佐劑為由Toll樣受體(TLR)識別之微生物衍生之PAMP，其為經由MyD88及TRIF銜接子分子進行訊息傳導且介導NF-κB依賴性促炎性細胞激素之誘導的一類PRR(Pandey等人，Cold Spring Harb Perspect Biol 2015；7：a016246)。MPL(TLR-4促效劑)及CpG(TLR-9促效劑)為臨床上最高級的佐劑，且為由FDA批准或正在申請批准之疫苗組分(Einstein等人，Human Vaccines,5：705-19,2009；Ahmed等人，Nature Immunol.12：509-17,2011)。儘管TLR呈現於細胞表面(例如TLR-4)及內體(例如TLR-9)有義細胞外及液泡病原體上，但胞溶質中存在包括病毒及細胞內細菌之多重病原體之生產性生長循環。細胞外、液泡及胞漿PRR之區室化引起先天性免疫系統可藉由監測胞溶質來感測生產性複製病原性微生物之假設(Vance等人，Cell Host & Microbe 6：10-21,2009)。此提供使用可活化PRR(包含胞漿監督路徑)之促效劑之基本原理且可為用於設計用以引發細胞免疫(與針對細胞內病原體之保護及癌症中之治療效益相關的免疫)之有效疫苗的有效策略。
I型干擾素(IFN-α、IFN-β)為由兩種不同TLR非依賴性胞漿訊息傳導路徑誘導之特徵細胞激素。在第一路徑中，單股及雙股(ds)RNA之多種形式由RNA解螺旋酶感測，包括視黃酸誘導性基因I(RIG-I)及黑素瘤分化相關基因5(MDA-5)，且經由IFN-β啟動子刺激因子1(IPS-1)銜接蛋白質介導IRF-3轉錄因子之磷酸化，引起IFN-β之誘導(Ireton及Gale,Viruses 3：906-19,2011)。IPS-1-/-缺失型小鼠具有增加之感染RNA病毒之敏感性。經由IPS-1路徑進行訊息傳導之感測子經多種病毒蛋白質直接靶向以用於不活化，表明需要此胞漿宿主防禦路徑以控制生產性病毒感染。合成dsRNA(諸如聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚(I：C)及聚ICLC，一種用聚L離胺酸調配以對抗RNase消化之類似物)為TLR3
及MDA5路徑之促效劑、IFN-β之強力誘導劑且當前正在若干種不同臨床環境中進行評估(Caskey等人，J.Exp.Med.208：2357-77,2011)。
STING(干擾素基因刺激因子)為第二胞漿路徑之中心介體，其回應於來自感染性病原體或異常宿主細胞(危險相關分子模式(Danger Associated Molecular Patterns；DAMPS))之感測胞漿雙股(ds)DNA而觸發1型干擾素(Barber,Immunol.Rev 243：99-108,2011)。替代性地稱為TMEM173、MITA、ERIS及MPYS，STING係使用cDNA表現選殖方法(如表現於巨噬細胞中之MyD88非依賴性宿主細胞防禦因子)發現，發現樹突狀細胞(DC)及纖維母細胞回應於單純疱疹病毒感染而誘導對感測細胞質DNA起反應之IFN-β及NF-κB依賴性促炎性細胞激素之表現(Ishikawa及Barber,Nature 455：674-79,2008)。
已研究環狀二核苷酸(CDN)作為由細菌合成之廣泛小分子第二信使，其調節不同過程，包括生物膜之動力及形成(Romling等人，Micrb.Mol.Biol.Rev.,77：1-52,2013)。CDN亦為STING之配位體(Burdette等人，Nature 478：515-18,2011)。回應於結合CDNs，STING經由TBK-1/IRF-3軸及NF-κB軸活化訊息傳導且誘導IFN-β及其他共調節之基因之表現(Burdette及Vance,Nat Immunol.14：19-26,2013；McWhirter等人，J.Exp.Med.206：1899-1911,2009)。環狀(c)-二-AMP自細胞內細菌單核球增多性李氏菌藉由多藥抗性流出泵分泌至受感染之宿主抗原呈現細胞之胞溶質中，且在小鼠李氏菌病模型中與CD4+及CD8+ T細胞介導之保護相關(Woodward等人，Science 328,1703-05,2010；Crimmins等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105：10191-10196,2008)。受Lm感染之巨噬細胞中IFN-β之誘導取決於STING訊息傳導路徑之活化，且來自MyD88-/-Trif-/-或C57BL/6親本小鼠之巨噬細胞中由c-二-AMP誘導之I型IFN之含量不可區分(Leber等人，PLoS Pathog 4(1)：e6.doi：10.1371,2008：Witte等人，mBio 4：e00282-13,2012)。相比之
下，在來源於金券(goldenticket；gt)小鼠之編碼非功能性突變型STING蛋白質之巨噬細胞中，IFN-β不由CDN誘導(Sauer等人，Infect.Immun.79：688-94,2011)。細胞外細菌，霍亂弧菌(Vibrio cholera)，產生雜交c-GMP-AMP(cGAMP)分子，其亦誘導STING路徑(Davies等人，Cell 149：358-70,2012)。由此等廣泛第二信使進行之先天性免疫性之活化表明感測CDN可與針對細菌感染之宿主防禦整合成一體。
儘管發現STING為誘導回應於單純疱疹病毒感染而產生IFN-β之關鍵感測子，但仍未知細胞質中如何最初偵測來自此病毒病原體之DNA。此難題由發現環狀GMP-AMP合成酶(cGAS)解決，環狀GMP-AMP合成酶為一種直接結合dsDNA且作為回應，合成第二信使環狀GMP-AMP(cGAMP)之宿主細胞核苷酸基轉移酶，該第二信使活化STING路徑且誘導IFN-β表現(Sun等人，Science 339：786-91,2013；Wu等人，Science 339：826-30,2013)。不含功能性cGAS之細胞不能回應於胞漿DNA之刺激而表現IFN-β。隨後證實表現特定STING對偶基因之細胞不對CDN刺激起反應，但以cGAS依賴性及TLR9(MyD88)非依賴性方式對dsDNA刺激起反應(Diner等人，2013)。此觀測結果與由cGAS回應於傳感胞漿dsDNA而合成STING活化CDN配位體定義之機制不相容。此明顯衝突由若干位獨立的研究者解決，其證明cGAS產生一種非典型CDN(c-GMP-AMP；cGAMP)，其活化不對典型CDN起反應之STING對偶基因(Civril等人，Nature 498：332-37,2013，Diner等人，2013,Gao等人，2013,Ablasser等人，Nature 498：380-84,2013，Kranzusch等人，Cell Reports 3：1362-68,2013，Zhang等人，Mol.Cell.51：226-35,2013)。因此，cGAMP充當第二信使，其結合且活化STING。與由細菌產生之CDN第二信使(其中兩個嘌呤核苷由具有雙(3',5')鍵之磷酸橋接合)不同，由cGAS合成之環狀-GMP-AMP中之核苷酸間磷酸橋由非典型2',5'及3',5'鍵(或者稱為「混合」鍵或ML)接合，
表示為c[G(2',5')pA(3',5')p]。此等2',5'-3',5'分子以奈米級親和力結合STING，比細菌c-二-GMP好約300倍。因此，已提出在STING靶向方面，2',5'-3',5'分子代表顯著更強的生理學配位體。Zhang等人，2013；亦參見Xiao及Fitzgerald,Mol.Cell 51：135-39,2013。由細菌[典型雙(3',5')鍵]產生之CDN與由宿主細胞cGAS(非典型2',5'及3',5'鍵)產生之CDN之間的核苷酸間磷酸橋結構的差異表明STING受體經演進以區分由細菌產生之CDN或由宿主細胞cGAS產生之CDN。
人類STING具有已知多形性，包括編碼位置232處之組胺酸的對偶基因，其對典型CDN而非非典型CDN具有抗性(Diner等人，2013，Jin等人，2011)。已證實hSTING基因中之單核苷酸多態性可影響對細菌衍生之典型CDN之反應(Diner等人，2013；Gao等人，2013；Conlon等人，2013)。已鑑別hSTING之五種單倍型(WT、REF、HAQ、AQ及Q對偶基因)，其在位置71、230、232及293處之胺基酸處不同(Jin等人，2011；Yi等人，2013)。表現hSTING之細胞對具有雙-(3',5')鍵之細菌CDN cGAMP、c-二-AMP及c-二-GMP之刺激反應較弱，但對內源性產生之cGAS產物ML cGAMP起反應(Diner等人，2013)。意外的是，本發明之經氟單或雙取代之雙-3',5'連接之CDN，尤其二-F-CDN與內源性產生之ML cGAMP類似地刺激hSTING REF對偶基因。環狀嘌呤二核苷酸之實例詳細描述於例如美國專利第7,709458號及第7,592,326號；WO2007/054279、WO2014/093936及WO2014/189805；及Yan等人，Bioorg.Med.Chem Lett.18：5631(2008)中。
原生CDN分子對由宿主細胞(例如抗原呈現細胞)中之磷酸二酯酶引起之降解敏感，該等宿主細胞吸收含有該等原生CDN分子之疫苗調配物。既定佐劑之效能可由此類降解減弱，因為佐劑將不能結合及活化其既定PRR目標。可例如藉由與較弱疫苗效能相關之先天性免疫性之特徵分子(例如IFN-β)之誘導表現量降低來量測佐劑效能降低，如
由所量測之抗原特異性免疫反應之量值定義。
在本發明中，提供實質上純的單-氟CDN或二-氟CDN，且尤其單-氟CDN或二-氟CDN之二硫基-二磷酸衍生物。該等c-二-AMP、c-GAMP及c-二-GMP分子之二硫基-二磷酸衍生物之合成過程產生非對映異構體(包括Rp,Rp、Sp,Sp、SpRp及Rp,Sp二硫基-二磷酸分子)之混合物。可分離此等個別物質，且在其醫藥學特徵方面呈現實質性差異，其中較佳為Rp,Rp非對映異構體。
「投藥」在其於本文中關於人類、哺乳動物、哺乳動物個體、動物、獸醫學個體、安慰劑個體、研究個體、實驗個體、細胞、組織、器官或生物流體使用時係指(但不限於)使外源性配體、試劑、安慰劑、小分子、藥劑、治療劑、診斷劑或組合物與個體、細胞、組織、器官或生物流體及其類似物接觸。「投藥」可指例如治療、藥物動力學、診斷、研究、安慰劑以及實驗方法。細胞處理涵蓋使試劑接觸細胞，以及使試劑接觸流體，其中該流體與細胞接觸。「投藥」亦涵蓋藉由試劑、診斷劑、結合化合物或藉由另一細胞進行之例如細胞之活體外及離體治療。「一起投與」或「共同投與」不意謂暗示兩種或兩種以上藥劑以單一組合物形式投與。儘管本發明涵蓋以單一組合物形式投藥，但此類藥劑可以單獨投藥形式傳遞至單一個體，該等單獨投藥可在相同或不同時間且可藉由相同投藥途徑或不同投藥途徑進行。「同時投與」意謂暗示兩種或兩種以上藥劑在實質上相同時間投與，但未必以單一組合物形式或藉由相同投藥途徑投與。
「促效劑」，如其係關於配位體及受體，包含可刺激受體之分子、分子之組合、複合物或試劑之組合。舉例而言，粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)受體之促效劑可涵蓋GM-CSF、GM-CSF之突變蛋白質或衍生物、GM-CSF之肽模擬劑、模擬GM-CSF之生物功
能的小分子或刺激GM-CSF受體之抗體。
「拮抗劑」，如其係關於配位體及受體，包含可抑制、抵消、下調受體及/或使受體去敏之分子、分子之組合或複合物。「拮抗劑」涵蓋任何可抑制受體之組成性活性的試劑。組成性活性為在不存在配位體/受體相互相用之情況下顯現之活性。「拮抗劑」亦涵蓋任何抑制或阻止受體之經刺激(或調節)之活性的試劑。作為實例，GM-CSF受體之拮抗劑包括(但不限於)結合於配位體(GM-CSF)且阻止其結合於受體之抗體，或結合於受體且阻止配位體結合於受體之抗體，或其中抗體以非活性構形封鎖受體。
如本文所使用之術語「抗體」係指能夠特異性結合抗原或抗原決定基之肽或多肽，其來源於免疫球蛋白基因或或其片段、在免疫球蛋白基因或其片段之後模型化或實質上由免疫球蛋白基因或其片段編碼。參見例如Fundamental Immunology，第3版，W.E.Paul編，Raven Press,N.Y.(1993)；Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175：267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25：85-97。術語抗體包括保留結合抗原之能力的抗原結合部分，亦即「抗原結合位點」(例如片段、子序列、互補決定區(CDR))，包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含兩個由鉸鏈區處之二硫橋鍵連接之Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂之VL及VH域組成之Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH域組成；及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。對術語「抗體」之參考亦包括單鏈抗體。
如本文所使用，術語「二-OH參考化合物」係指不含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之任何2'及/或2"氟取代基，但在此等位置處具有-OH取代基之已知CDN化合物。較佳的是，如本文中
所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之已知二-OH參考化合物與單-F-CDN或二-F-CDN化合物具有相同鹼基，且具有相同磷酸二酯鍵(例如磷酸二酯或硫代磷酸酯類似物)。舉例而言，3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)、3'3'-RR-(2'F-A)(A)、3'3'-RR-(A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'βF-A)(2'βF-A)之二-參考化合物為3'3'-RR-(A)(A)；3'3'-RR-(G)(2'F-A)、3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(A)之二-OH參考化合物為3'3'-RR-(G)(A)；且3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-G)之二-OH參考化合物為3'3'-RR-(G)(G)。二-OH參考化合物3'3'-RR-(A)(A)、3'3'-RR-(G)(A)及3'3'-RR-(G)(G)描述於例如PCT公開案WO 2014/093936中。
如本文關於細胞滲透性或細胞對化合物之吸收所使用，「促進滲透性之試劑」或「促進吸收之試劑」為活體外或活體內促進化合物對細胞之滲透性或促進細胞對化合物之吸收的試劑。可在基於活體外細胞之分析法中比較如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物或二-OH參考化合物，其中分析法可在具有或不具有允許化合物由細胞吸收之試劑(諸如毛地黃皂苷)下進行。如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物意外地在無需諸如可促進細胞之滲透性或促進細胞對化合物之吸收之試劑的情況下，在此類基於細胞之分析法中，例如在如本文中所描述之THP-1細胞分析法中具有活性。如本文中所描述之包含單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合物可在不存在可促進細胞之滲透性或促進細胞對化合物之吸收之試劑的情況下，例如在不存在可促進細胞之滲透性或促進細胞吸收之傳遞媒劑的情況下調配。此類添加劑或傳遞媒劑包括(但不限於)脂質或脂質類佐劑、脂質體、雙層間交聯多層微脂粒、奈米載體、奈米粒子及其類似物，諸如包含聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)及/或其共聚物之奈米粒子，諸如生物可降解聚之基於(D,L-乳酸-共-乙醇酸)[PLGA]或基於聚酐之奈米粒子或微米粒子。
關於本發明之CDN，「實質上純」意謂具有CDN活性之指定物質占組合物之至少50重量%，更通常占至少60重量%，典型地占至少70重量%，更典型地占至少75重量%，最典型地占至少80重量%，通常占至少85重量%，更通常占至少90重量%，最通常占至少95重量%且習知地占至少98重量%。純度之測定中通常不使用水、緩衝液、鹽、清潔劑、還原劑、蛋白酶抑制劑、穩定劑(包括所添加之蛋白質，諸如白蛋白)及賦形劑之重量。
當參考配位體/受體、核酸/互補核酸、抗體/抗原或其他結合配對(例如細胞激素與細胞激素受體)(各自通常在本文中稱為「目標生物分子」或「目標」)時，「特異性」或「選擇性」結合指示與蛋白質及其他生物製劑之異質性群體中目標之存在有關的結合反應。特異性結合可意謂例如在預期方法中，來源於抗體之抗原結合位點之結合化合物、核酸配位體、抗體或結合組合物以比非目標分子之親和力通常大至少25%，更通常大至少50%，最通常大至少100%(2倍)，通常大至少十倍，更通常大至少20倍且最通常大至少100倍之親和力結合於其目標。
「配位體」係指結合於目標生物分子之小分子、核酸、肽、多肽、糖、多糖、聚糖、糖蛋白、糖脂或其組合。儘管此類配位體可為受體之促效劑或拮抗劑，但配位體亦涵蓋結合劑，其不為促效劑或拮抗劑，且不具有促效劑或拮抗劑特性。配位體與其同源目標之特異性結合通常以「親和力」表示。在較佳實施例中，本發明之配位體以約104M-1與約108M-1之間的親和力結合。親和力計算為Kd=koff/kon(koff為解離速率常數，Kon為結合速率常數且Kd為平衡常數)。
可藉由在多種濃度(c)下量測經標記之配位體之結合分數(r)來在平衡下測定親和力。資料使用史卡查方程式(Scatchard equation)圖示：r/c=K(n-r)：其中r=平衡下結合配位體之莫耳數/受體之莫耳數；
c=平衡下之游離配位體濃度；K=平衡結合常數；且n=每個受體分子之配位體結合位點之數目。藉由圖形分析，在y軸上標繪r/c且在x軸上標繪r，因此產生史卡查曲線。在此項技術中熟知藉由史卡查分析進行親和力量測。參見例如van Erp等人，J.Immunoassay 12：425-43,1991；Nelson及Griswold,Comput.Methods Programs Biomed.27：65-8,1988。在替代方案中，可藉由等溫滴定熱量測定(ITC)來量測親和力。在典型ITC實驗中，將配位體之溶液滴定至其同源目標之溶液中。隨時間推移監測在其相互相用(△H)時釋放之熱量。隨著連續量之配位體滴定至ITC細胞中，所吸收或釋放之熱量與結合量成正比。隨著系統達到飽和，熱信號減小直至僅觀測到稀釋熱量。接著針對細胞中配位體及結合搭配物之比率，自各注射之熱量曲線獲得結合曲線。藉由適合的結合模型分析結合曲線以測定KB、n及△H。應注意KB=1/Kd。
如本文所使用之術語「前藥」係指預期化合物之改質，其中經改質之化合物呈現較低藥理學活性(與經改質之化合物相比)且其中經改質之化合物在身體內(例如在目標細胞或目標器官中)經由酶促或非酶促反應重新轉化呈未經改質之形式。在某些實施例中，一個核糖上之羥基包含前藥脫離基。前藥可改良藥物之物理化學、生物藥學及藥物動力學特性。傳統前藥歸類為藉由活體內經歷轉型作用而活化以形成活性藥物之藥物。前藥發展之原因通常為與母藥相關之不良水溶性、化學不穩定性、低口服生物可用性、血腦屏障滲透不足及高首次代謝。適合的前藥部分描述於例如「Prodrugs and Targeted Delivery」,J.Rautico編，John Wiley & Sons,2011中。實例包括(但不限於)由細胞酯酶移除之離去基、C6至C18脂肪酸酯、肉豆蔻醯基酯、戊醯基酯、己醯基酯及庚醯基酯。舉例而言，如本文中所描述之單-2'F-CDN化合物可包括在其餘2'羥基處之取代，以形成此類酯。
如本文所使用之術語「個體(subject/individual)」係指人類或非人類生物體。因此，本文中所描述之方法及組合物適用於人類及獸醫學疾病。在某些實施例中，個體為「患者」，亦即接收疾病或病狀之醫學護理之活人。此包括正在接受病變跡象研究之不具有既定疾病之人。較佳為診斷患有本發明之組合物及方法靶向之特定癌症之個體。用本文中所描述之組合物治療之較佳癌症包括(但不限於)前列腺癌、腎癌瘤、黑素瘤、胰臟癌、子宮頸癌、卵巢癌、結腸癌、頭頸癌、肺癌及乳癌。
「治療有效量」定義為足以展示患者利益(亦即引起降低、預防或改善所治療之病狀之症狀)試劑或醫藥組合物之量。當試劑或醫藥組合物包含診斷劑時，「診斷有效量」定義為足以產生信號、影像或其他診斷參數之量。醫藥調配物之有效量將根據諸如個體之敏感性程度、個體之年齡、性別及體重以及個體之特質反應之因素而變化。「有效量」涵蓋(但不限於)可改善、逆轉、緩和、預防或診斷醫學病狀或病症之症狀或病徵或其致病過程之量。除非明確地或由上下文另外指出，否則「有效量」不限於足以改善病狀之最小量。
「治療(Treatment/treating)」(關於病狀或疾病)為用於獲得有利或所需結果(包括且較佳為臨床結果)之方法。在本發明中，關於疾病之有利或所需結果包括(但不限於)以下中之一或多者：預防疾病、改良與疾病與相關之病狀、治癒疾病、減輕疾病之嚴重度、延緩疾病之進程、緩解與疾病相關之一或多種症狀、提高疾病患者之生活質量及/或延長存活期。類似地，在本發明中，關於病狀之有利或所需結果包括(但不限於)以下中之一或多者：預防病狀、改良病狀、治癒病狀、減輕病狀之嚴重度、延緩病狀之進程、緩解與病狀相關之一或多種症狀、提高病狀患者之生活質量及/或延長存活期。舉例而言，在其中本文中所描述之組合物用於治療癌症之實施例中，有利或所需結
果包括(但不限於)以下中之一或多者：降低贅生性或癌細胞之增殖(或破壞贅生性或癌細胞)、降低在癌症中發現之贅生性細胞之轉移、減小腫瘤之尺寸、減少由癌症引起之症狀、提供此等癌症患者之生活質量、降低治療疾病所需之其他藥物之劑量、延緩癌症進程及/或延長癌症患者之存活期。視上下文而定，個體之「治療」可暗示個體需要治療，例如在其中個體包含預期可由投與試劑改善之病症之情形中。
「疫苗」涵蓋防治性疫苗。疫苗亦涵蓋治療疫苗，例如投與包含與由疫苗提供之抗原或抗原決定基相關之病狀或病症的哺乳動物之疫苗。
原核以及真核細胞使用多種小分子進行細胞訊息傳導以及細胞內及細胞間通訊。已知環狀核苷酸(例如cGMP、cAMP等)在原核及真核細胞中具有調節及起始活性。與真核細胞不同，原核細胞亦使用環狀嘌呤二核苷酸作為調節分子。在原核細胞中，兩個GTP分子之縮合由酶二鳥苷酸環化酶(DGC)催化以產生c-diGMP，其表示細菌中之重要調節劑。
當前研究表明環狀diGMP或其類似物亦可刺激或增強患者中之免疫或發炎反應，或在哺乳動物中可藉由充當佐劑來增強對疫苗之免疫反應。病原體衍生之DNA之胞漿偵測需要經由TANK結合激酶1(TBK1)及其下游轉錄因子IFN調節因子3(IRF3)進行訊息傳導。一種稱為STING(IFN基因刺激因子；亦稱為MITA、ERIS、MPYS及TMEM173)之跨膜蛋白充當此等環狀嘌呤二核苷酸之訊息傳導受體，引起刺激TBK1-IRF3訊息傳導軸及STING依賴性I型干擾素反應。參見例如圖1。Burdette等人，Nature 478：515-18,2011證明STING直接結合於環狀二鳥苷酸單磷酸，但不與其他不相關核苷酸或核酸結合。
用作前驅物以衍生本發明之CDN之環狀嘌呤二核苷酸詳細描述
於例如Gao等人，Cell(2013)153：doi：10.1016/j.cell.2013.04.046；美國專利第7,709458號及第7,592,326號；WO2007/054279、WO2014/093936及WO2014/189805；以及Yan等人，Bioorg.Med.Chem Lett.18：5631(2008)中。此等CDN可使用標準有機化學技術改質以產生本發明之CDN。
如本文中所描述之本發明之單-F-CDN或二-F-CDN化合物為強效STING促效劑，且與已知的未經氟取代之CDN化合物(諸如RR-(A)(A))或內源性產生之cGAS產物ML cGAMP相比顯示出人意料的改良。比較本發明之單-F-CDN或二-F-CDN化合物與在2'及2"位置之取代不同的已知化合物，例如二-OH參考化合物，諸如3'3'-(A)(A)、3'3'-(G)(A)、3'3'-RR-(A)(A)或3'3'-RR-(G)(A)。單-F-CDN或二-F-CDN化合物之特性說明於以下實例11-17中，其中化合物與二-OH參考化合物相比顯示改良，如具有以下中之一或多者：i)在DSF分析法中具有較高Tm偏移，如實例11中關於hSTING(WT)、hSTING(HAQ)或hSTING(REF)中之一或多者所描述；ii)在hPBMC分析法中具有較高IFN-β轉錄之相關表現，如實例13中關於hSTING(WT)、hSTING(HAQ)或hSTING(REF)中之一或多者所描述；或iii)在THP1細胞分析法中具有較低EC50，如實例14中所描述，其中THP1分析法較佳在不存在毛地黃皂苷之情況下進行。在一些實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN與二-OH參考化合物相比顯示改良，如具有以下中之兩者或兩者以上：i)在DSF分析法中具有較高Tm偏移，如實例14中關於hSTING(WT)、hSTING(HAQ)或hSTING(REF)中之一或多者所描述；ii)在hPBMC分析法中具有較高IFN-β轉錄之相關表現，如實例13中關於hSTING(WT)、hSTING(HAQ)或hSTING(REF)中之一或多者所描述；或iii)在THP1細胞分析法中具有較低EC50，如實例14中所描述，其中THP1分析法較佳在不存在毛地黃皂苷之情況下進行。在一些實施例中，單-
F-CDN或二-F-CDN與二-OH參考化合物相比顯示改良，如具有以下各者i)在DSF分析法中具有較高Tm偏移，如實例11中關於hSTING(WT)、hSTING(HAQ)或hSTING(REF)中之一或多者所描述；ii)在hPBMC分析法中具有較高IFN-β轉錄之相關表現，如實例13中關於hSTING(WT)、hSTING(HAQ)或hSTING(REF)中之一或多者所描述；或iii)在THP1細胞分析法中具有較低EC50，如實例14中所描述，其中THP1分析法較佳在不存在毛地黃皂苷之情況下進行。在如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之一些實施例中，與3'3'-RR-(A)(A)相比，單-F-CDN或二-F-CDN化合物在hPBMC分析法中具有至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍更高的IFN-β轉錄之相關表現，如實例13中關於hSTING REF對偶基因所描述。在一些實施例中，在實例14中所描述之不添加毛地黃皂苷之THP1分析法中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物之EC50比二-OH參考化合物之EC50低至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍或至少8倍。在一些實施例中，在不添加可促進化合物對細胞之滲透性之試劑或可促進細胞對化合物之吸收之試劑的THP1細胞分析法中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物之EC50小於40μM，小於30μM，小於20μM，小於15μM或小於10μM。在一些實施例中，在實例14中所描述之不添加毛地黃皂苷之THP1分析法中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物之EC50小於40μM，小於30μM，小於20μM，小於15μM或小於10μM。
較佳環狀嘌呤二核苷酸為硫代磷酸酯類似物，在本文中稱為「硫代磷酸酯」。硫代磷酸酯為正常核苷酸之變異體，其中一個非橋聯氧由硫置換。核苷酸間鍵之硫化顯著降低內切核酸酶及外切核酸酶之作用，包括5'至3'及3'至5'DNA POL1外切核酸酶、核酸酶S1及P1、RNases、血清核酸酶及蛇毒磷酸二酯酶。此外，交聯脂質雙層之潛力
增加。
硫代磷酸酯鍵固有地為對掌性。熟習此項技術者將認識到，此結構中之磷酸酯可各自以R或S形式存在。因此，式I及其所有子式之化合物可為Rp,Rp、Sp,Sp、Sp,Rp及Rp,Sp形式。如上所述，本發明之環狀嘌呤二核苷酸包含CDN之經2'-F取代之形式，且特定言之CDN硫代磷酸酯。因此，可類似地獲得經2'-F取代之Rp,Rp、Sp,Sp、Sp,Rp及Rp,Sp形式。較佳嘌呤包括(但不限於)腺嘌呤、鳥嘌呤、肌苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、異鳥嘌呤等。本發明之單-F-CDN或二-F-CDN較佳為硫代磷酸酯類似物，包括其實質上純的Sp,Sp、Rp,Rp、SpRp或Rp,Sp立體異構體，且最佳為其實質上純的Rp,Rp立體異構體。
如本文中所使用，術語「烷基」係指含有至多二十四個碳原子之飽和直鏈或分支鏈烴基。烷基之實例包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基及其類似物。烷基典型地包括1至約24個碳原子，更典型地1至約12個碳原子，其中更佳為1至約6個碳原子。如本文所使用，術語「低碳烷基」包括1至約6個碳原子。如本文所使用，烷基可視情況包括一或多個其他取代基。
如本文中所使用，術語「烯基」係指含有至多二十四個碳原子且具有至少一個碳-碳雙鍵之直鏈或分支鏈烴鏈基團。烯基之實例包括(但不限於)乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁-1-基、二烯(諸如1,3-丁二烯)及其類似物。烯基典型地包括2至約24個碳原子，更典型地2至約12個碳原子，其中更佳為2至約6個碳原子。如本文所使用，烯基可視情況包括一或多個其他取代基。
如本文中所使用，術語「炔基」係指含有至多二十四個碳原子且具有至少一個碳-碳參鍵之直鏈或分支鏈烴基。炔基之實例包括(但不限於)乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基及其類似物。炔基典型地包括2
至約24個碳原子，更典型地2至約12個碳原子，其中更佳為2至約6個碳原子。如本文所使用，炔基可視情況包括一或多個其他取代基。
如本文中所使用，術語「醯基」係指藉由自有機酸移除羥基而形成之基團且具有通式-C(O)-X，其中X通常為脂族、脂環族或芳族。實例包括脂族羧基、芳族羧基、脂族磺醯基、芳族亞磺醯基、脂族亞磺醯基、芳族磷酸酯基、脂族磷酸酯基及其類似物。如本文所使用，醯基可視情況包括其他取代基。
術語「脂環族」係指環狀環系統，其中環為脂族。環系統可包含一或多個環，其中至少一個環為脂族。較佳脂環包括在環中具有約5至約9個碳原子之環。如本文所使用，脂環族可視情況包括其他取代基。
如本文中所使用，術語「脂族」係指其中任何兩個碳原子之間的飽和度為單鍵、雙鍵或參鍵之含有至多二十四個碳原子之直鏈或分支鏈烴基。脂族基較佳含有1至約24個碳原子，更通常1至約12個碳原子，其中更佳為1至約6個碳原子。脂族基之直鏈或分支鏈可雜有一或多個雜原子，其包括氮、氧、硫及磷。此類雜有雜原子之脂族基包括(但不限於)聚烷氧基，諸如聚伸烷基二醇、多元胺及聚亞胺。如本文所使用，脂族基可視情況包括其他取代基。
如本文中所使用，術語「烷氧基」係指形成於烷基與氧原子之間的基團，其中氧原子用於連接烷氧基與母分子。烷氧基之實例包括(但不限於)甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基及其類似基團。如本文所使用，烷氧基可視情況包括其他取代基。
如本文中所使用，術語「胺基烷基」係指經胺基取代之C\-Cn烷基。基團之烷基部分形成與母分子之共價鍵。胺基可位於任何位置且胺基烷基可在烷基及/或胺基部分處經另一取代基取代。
如本文中所使用，術語「芳烷基」及「芳基烷基」係指共價連接至C\-Cn烷基之芳族基。所得芳烷基(或芳基烷基)之烷基部分形成與母分子之共價鍵。實例包括(但不限於)苯甲基、苯乙基及其類似基團。如本文所使用，芳烷基可視情況包括連接至烷基、芳基或其兩者之形成該基團之其他取代基。
如本文中所使用，術語「芳基」及「芳族」係指具有一或多個芳環之單環或多環碳環系統。芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基、四氫萘基、茚滿基、亞基及其類似基團。較佳芳環系統在一或多個環中具有約5至約20個碳原子。如本文所使用，芳基可視情況包括其他取代基。
如本文中所使用，術語「鹵基」及「鹵素」係指選自氟、氯、溴及碘之原子。
如本文中所使用，術語「雜芳基」及「雜芳族」係指包含單環或多環芳環、環系統或稠環系統之基團，其中至少一個環為芳族且包括一或多個雜原子。雜芳基亦意謂包括稠環系統，其包括其中稠合環中之一或多者不含雜原子之系統。雜芳基通常包括一個選自硫、氮或氧之環原子。雜芳基之實例包括(但不限於)吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喏啉基及其類似基團。雜芳基可直接或經由鍵聯部分(諸如脂族基或雜原子)連接至母分子。如本文所使用，雜芳基可視情況包括其他取代基。
如本文中所使用，術語「雜芳基烷基」係指進一步包括共價連接之C1-C12烷基之如先前所定義之雜芳基。所得雜芳基烷基之烷基部分能夠形成與母分子之共價鍵。實例包括(但不限於)吡啶基甲基、嘧啶基乙基、萘啶基丙基及其類似基團。如本文所使用，雜芳基烷基可
視情況在雜芳基或烷基部分中之一者或兩者上包括其他取代基。
如上所述，單-F CDN或二-F CDN化合物亦包括CDN且尤其CDN硫代磷酸酯之前藥形式。前藥可改良藥物之物理化學、生物藥學及藥物動力學特性。傳統前藥歸類為藉由活體內經歷轉型作用而活化以形成活性藥物之藥物。前藥發展之原因通常為與母藥相關之不良水溶性、化學不穩定性、低口服生物可用性、血腦屏障滲透不足及高首次代謝。適合的前藥部分描述於例如「Prodrugs and Targeted Delivery」,J.Rautico編，John Wiley & Sons,2011中。
如本文關於二硫基-二磷酸酯環狀嘌呤二核苷酸所使用之術語「實質上純」係指相對於如本文中所描述之單-F-RR-CDN或二-F-RR-CDN化合物，諸如式II化合物中所指示之對掌性磷中心處之其他可能立體化學，純度為至少75%之Rp,Rp或Rp,Sp形式。作為實例，「實質上純的3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)」將關於Rp,SP及Sp,Sp形式，亦即相對於3'3'-RS-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-SS-(2'F-A)(2'F-A)為至少75%純的。在較佳實施例中，實質上純的環狀嘌呤二核苷酸為至少85%純、至少90%純、至少95%純、至少97%純及至少99%純的。儘管本發明之實質上純的環狀嘌呤二核苷酸製劑為「立體化學純」，但此不意謂指示製劑內在此等對掌性中心處具有特定立體化學之所有CDN在其他方面相同。舉例而言，實質上純的環狀嘌呤二核苷酸製劑可含有3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)與3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)之組合且仍為實質上純的環狀嘌呤二核苷酸製劑。此類製劑亦可包括如下文所描述之有利於患者治療之其他組分，其限制條件為製劑內之所有CDN在此等對掌性中心處具有特定立體化學。
本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物及其組合物可依足以誘導、改良或刺激適合的免疫反應之量單獨或與醫藥學上可接受之賦形劑組合投與宿主。免疫反應可包含(但不限於)特異性免疫反應、
非特異性免疫反應、特異性及非特異性反應、先天性反應、原發性免疫反應、適應性免疫性、繼發免疫反應、記憶免疫反應、免疫細胞活化、免疫細胞增殖、免疫細胞分化及細胞激素表現。在某些實施例中，本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物及其組合物與一或多種其他組合物結合投與，該一或多種其他組合物包括意圖刺激針對一或多種預定抗原之免疫反應的疫苗；佐劑；CTLA-4及PD-1路徑拮抗劑、脂質、脂質體、化學治療劑、免疫調節細胞株等。
本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物及其組合物可在其他治療性或預防性組合物或儀器治療之前、之後及/或與其同時投與。此等組合物包括(但不限於)B7共刺激分子、介白素-2、干擾素-γ、GM-CSF、CTLA-4拮抗劑、OX-40/OX-40配位體、CD40/CD40配位體、沙格司亭(sargramostim)、左旋咪唑(levamisol)、牛痘病毒、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin；BCG)、脂質體、礬(alum)、弗氏完全或不完全佐劑、脫毒內毒素、礦物油、表面活性物質(諸如脂質卵磷脂(lipolecithin))、普洛尼克多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子、肽及油或烴乳液。較佳為誘導T細胞免疫反應之載劑，其相對於抗體反應優先刺激溶胞T細胞反應，但亦可使用刺激兩種反應類型的載劑。在其中試劑為多肽之情況下，可投與多肽本身或編碼多肽之聚核苷酸。載劑可為細胞，諸如抗原呈現細胞(APC)或樹突狀細胞。抗原呈現細胞包括諸如巨噬細胞、樹突狀細胞及B細胞之細胞類型。其他專業抗原呈現細胞包括單核細胞、邊緣區庫普弗細胞(marginal zone Kupffer cells)、微神經膠質細胞、蘭格漢氏細胞(Langerhans' cells)、交錯樹突狀細胞、濾泡樹突狀細胞及T細胞。亦可使用兼性抗原呈現細胞。兼性抗原呈現細胞之實例包括星形膠質細胞、濾泡細胞、內皮細胞及纖維母細胞。載劑可為細菌細胞，其經轉型以表現多肽或傳遞聚核苷酸，其接著在經經疫苗接種之個體之細胞中表現。可添加佐劑(諸如
氫氧化鋁或磷酸鋁)以提高疫苗觸發、增強或延長免疫反應之能力。其他材料，諸如細胞激素、趨化激素及細菌核酸序列，例如CpG、toll樣受體(TLR)9促效劑以及TLR 2、TLR 4、TLR 5、TLR 7、TLR 8、TLR9之其他促效劑，包括脂蛋白、LPS、單磷醯基脂質A、脂磷壁酸、咪喹莫特(imiquimod)、雷西莫特(resiquimod)以及視黃酸誘導性基因I(RIG-I)促效劑，諸如聚I：C亦為潛在佐劑，其單獨或與所描述之組合物組合使用。佐劑之其他代表性實例包括合成佐劑QS-21，其包含自皂皮樹之樹皮純化之均質皂素及短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)(McCune等人，Cancer,1979；43：1619)。應理解，佐劑經歷最佳化。換言之，熟習此項技術者可進行常規實驗以測定待使用之最佳佐劑。
用於與其他治療劑共同投藥之方法為此項技術中所熟知(Hardman等人(編)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill,New York,NY；Poole及Peterson(編)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA；Chabner及Longo(編)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA)。通常，共同投藥或一起投藥表示用兩種或兩種以上藥劑治療個體，其中該等藥劑可同時或在不同時間投與。舉例而言，此類藥劑可以單獨投藥形式傳遞至單一個體，該等單獨投藥可在實質上相同時間或不同時間進行，且其可藉由相同投藥途徑或不同投藥途徑進行。此類藥劑可在同一次投藥(例如同一調配物)中傳遞至單一個體，使得其同時藉由相同投藥途徑投與。
由於本發明化合物之佐劑特性，其亦可與其他治療模式(包括其他疫苗、佐劑、抗原、抗體及免疫調節劑)組合使用。實例提供於下
文中。
除本文中描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物及其組合物以外，本發明之組合物或方法可進一步包含一或多種其他物質，其由於其性質而可用於刺激或以其他方式利用免疫系統以對所靶向之腫瘤細胞上之癌症抗原起反應。此類佐劑包括(但不限於)脂質、脂質體、誘導先天性免疫性之不活化細菌(例如不活化或滅毒單核球增多性李氏菌)、經由Toll樣受體(TLR)介導先天性免疫活化之組合物、(NOD)樣受體(NLR)、基於視黃酸誘導性基因(RIG)之I樣受體(RLR)、C類凝集素受體(CLR)及/或病原體相關分子模式(「PAMPS」)。PAMP之實例包括脂蛋白、脂多肽、肽聚糖、酵母聚糖、脂多糖、奈瑟氏球菌外膜蛋白(neisserial porins)、鞭毛蛋白、普洛非林(profillin)、半乳糖神經醯胺、胞壁醯二肽。肽聚糖、脂蛋白及脂磷壁酸為革蘭氏陽性(Gram-positive)細胞壁組分。脂多糖由大部分細菌表現，其中MPL為一個實例。鞭毛蛋白係指由病原性及共生細菌分泌之細菌鞭毛之結構組分。α-半乳糖苷基神經醯胺(α-GalCer)為自然殺手T(NKT)細胞之活化因子。胞壁醯二肽為所有細菌共有的生物活性肽聚糖主結構。此清單不意欲為限制性。較佳佐劑組合物描述於下文中。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與免疫檢查點抑制劑組合使用，諸如選自由以下組成之群的免疫檢查點抑制劑：CTLA-4路徑拮抗劑、PD-1路徑拮抗劑、Tim-3路徑拮抗劑、Vista路徑拮抗劑、BTLA路徑拮抗劑、LAG-3路徑拮抗劑或TIGIT路徑拮抗劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑係選自由以下組成之群：抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗Tim-3抗體、抗Vista抗體、抗BTLA抗體、抗LAG-3抗體或抗TIGIT抗體。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與CTLA-4路徑拮抗劑組合使用。在一些實施例中，組合用於治療實體腫瘤或血液科惡性疾病。認為CTLA-4為適應性免疫反應之重要負調節劑。經活化之T細胞上調CTLA-4，其與CD28相比以較高親和力結合抗原呈現細胞上之CD80及CD86，因此抑制T細胞刺激、IL-2基因表現及T細胞增殖。已在結腸癌瘤、轉移性前列腺癌及轉移性黑素瘤之鼠類模型中觀測到CTLA4阻斷之抗腫瘤作用。在一些實施例中，CTLA-4路徑拮抗劑為選自由以下組成之群的抗CTLA-4抗體分子：曲美單抗(tremelimumab)及伊派利單抗(ipilimumab)。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體為如例如美國專利第5,811,097號中所揭示之抗CTLA-4抗體。
伊派利單抗(Ipilimumab)(YervoyTM，一種CTLA-4抗體，亦稱為MDX-010，CAS編號477202-00-9)及曲美單抗(可自Pfizer購得之IgG2單株抗體，先前稱為替西單抗(ticilimumab)，CP-675,206)為人類化單株抗體，其結合於人類CTLA4且阻止其與CD80及CD86之相互相用。使用伊派利單抗及曲美單抗進行之I期及II期研究在癌症患者中具有顯著臨床活性。可由類似策略靶向之其他陰性免疫調節劑包括漸進式細胞死亡1(PD-1)、B及T淋巴細胞弱化子、轉型生長因子β、介白素-10及血管內皮生長因子。
在一些實施例中，如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與抗CTLA-4抗體及抗PD-1抗體組合使用。在一個實施例中，組合包括抗-PD-1抗體分子，例如本文中所描述，及抗CTLA-4抗體，例如伊派利單抗。可使用之例示性劑量包括約1mg/kg至10mg/kg，例如3mg/kg之抗PD-1抗體分子之劑量，及約3mg/kg之抗CTLA-4抗體(例如伊派利單抗)之劑量。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與PD-1路徑拮
抗劑組合使用。在一些實施例中，組合用於治療實體腫瘤或血液科惡性疾病。PD-1為表現於經活化之T細胞上之適應性免疫反應之另一種負調節劑。PD-1結合於B7-H1及B7-DC，且PD-1之接合可抑制T細胞活化。已由PD-1路徑阻斷表明抗腫瘤作用。已在文獻中報導抗PD-1抗體分子(例如尼沃單抗(Nivolumab)(OpdivoTM)、派立珠單抗(pembrolizumab)(KeytrudaTM)及皮立珠單抗(pidilizumab))及AMP-224為PD-1路徑阻斷劑之實例，其可用於本發明中。在一些實施例中，PD-1路徑拮抗劑為選自由以下組成之群的抗PD-1抗體分子：尼沃單抗、派立珠單抗或皮立珠單抗。
在一些實施例中，抗PD-1抗體為尼沃單抗。尼沃單抗之替代性名稱包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些實施例中，抗PD-1抗體為尼沃單抗(CAS寄存編號：946414-94-4)。尼沃單抗為完全人類IgG4單株抗體，其特異性阻斷PD1。尼沃單抗(純系5C4)及其他特異性結合於PD1之人類單株抗體揭示於US 8,008,449及WO2006/121168中。在一個實施例中，PD-1之抑制劑為尼沃單抗，且具有本文中所揭示之序列(或與其實質上一致或類似之序列，例如與指定序列至少85%、90%、95%或95%以上一致之序列)。
尼沃單抗之重鏈胺基酸序列如下：
(SEQ ID NO：2)
尼沃單抗之輕鏈胺基酸序列如下：
(SEQ ID NO：3)
在一些實施例中，抗PD-1抗體為派立珠單抗。派立珠單抗(亦稱為拉立珠單抗(lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475或KEYTRUDA®；Merck)為人類化IgG4單株抗體，其結合於PD-1。派立珠單抗及其他人類化抗PD-1抗體揭示於Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2)：134-44、US 8,354,509及WO2009/114335中。在一個實施例中，PD-1之抑制劑為派立珠單抗，且具有本文中所揭示之序列(或與其實質上一致或類似之序列，例如與指定序列至少85%、90%、95%或95%以上一致之序列)。
派立珠單抗之重鏈胺基酸序列如下：
(SEQ ID NO：4)
派立珠單抗之輕鏈胺基酸序列如下：
在一些實施例中，抗PD-1抗體為皮立珠單抗。皮立珠單抗(CT-011；Cure Tech)為結合於PD-1之人類化IgG1k單株抗體。皮立珠單抗
及其他人類化抗PD-1單株抗體揭示於WO2009/101611中。
在一些實施例中，抗PD-1抗體為AMP 514(Amplimmune)，或如US 8,609,089、US 2010028330及/或US 20120114649中所揭示之抗PD-1抗體。
在一些實施例中，PD-1路徑拮抗劑為2015年7月30日公開之題為「Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof」之US 2015/0210769中所揭示之抗PD-1抗體分子。
在一個實施例中，抗PD-1抗體分子包括至少一個或兩個重鏈可變域(視情況包括恆定區)、至少一個或兩個輕鏈可變域(視情況包括恆定區)或其兩者，其包含BAP049-純系-A、BAP049-純系-B、BAP049-純系-C、BAP049-純系-D或BAP049-純系-E之胺基酸序列；或如US 2015/0210769之表1中所描述，或由其中表1中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上一致(例如至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或99%以上一致)之序列。抗PD-1抗體分子視情況包含來自重鏈、輕鏈或其兩者之前導序列，如US 2015/0210769之表4中所示；或與其實質上一致之序列。US 2015/0210769之揭示內容以引用的方式併入本文中，如其係關於其中表4中之胺基酸序列及核苷酸序列。
在另一實施例中，抗PD-1抗體分子包括至少一個、兩個或三個來自US 2015/0210769中所描述之抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區之互補決定區(CDR)，例如選自以下中之任一者之抗體：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-純系-A、BAP049-純系-B、BAP049-純系-C、BAP049-純系-D或
BAP049-純系-E；或如其中表1中所描述，或由其中表1中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上一致(例如至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或99%以上一致)之序列。
在另一實施例中，抗PD-1抗體分子包括至少一個、兩個或三個來自重鏈可變區之CDR(或總體上所有CDR)，其包含US 2015/0210769之表1中所展示之胺基酸序列，或由其中表1中所展示之核苷酸序列編碼。在一個實施例中，CDR中之一或多者(或總體上所有CDR)與表1中展示之胺基酸序列相比具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或六個以上變化，例如胺基酸取代或缺失，或由其中表1中展示之核苷酸序列編碼。
在另一實施例中，抗PD-1抗體分子包括至少一個、兩個或三個來自輕鏈可變區之CDR(或總體上所有CDR)，其包含US 2015/0210769之表1中所展示之胺基酸序列，或由其中表1中所展示之核苷酸序列編碼。在一個實施例中，CDR中之一或多者(或總體上所有CDR)與表1中展示之胺基酸序列相比具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或六個以上變化，例如胺基酸取代或缺失，或由其中表1中展示之核苷酸序列編碼。在某些實施例中，抗PD-1抗體分子包括輕鏈CDR中之取代，例如輕鏈之CDR1、CDR2及/或CDR3中的一或多個取代。在一個實施例中，根據表1之抗PD-1抗體分子包括輕鏈可變區之位置102處輕鏈CDR3中之取代，例如輕鏈可變區之位置102處半胱胺酸至酪胺酸或半胱胺酸至絲胺酸殘基之取代(例如SEQ ID NO：16或24(對於鼠類或嵌合型，未經修飾)；或SEQ ID NO：34、42、46、54、58、62、66、70、74或78中之任一者(對於經修飾之序列))。
在另一實施例中，抗PD-1抗體分子包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個來自重鏈及輕鏈可變區之CDR(或總體上所有CDR)，其包含US 2015/0210769之表1中所展示之胺基酸序列，或由
其中表1中所展示之核苷酸序列編碼。在一個實施例中，CDR中之一或多者(或總體上所有CDR)與表1中展示之胺基酸序列相比具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或六個以上變化，例如胺基酸取代或缺失，或由其中表1中展示之核苷酸序列編碼。
在一個實施例中，抗PD-1抗體分子包括：(a)重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：4之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：5之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：3之VHCDR3胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：13之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：14之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：33之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0210769之表1中所揭示；(b)VH，其包含選自SEQ ID NO：1之VHCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：2之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：3之VHCDR3胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：10之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：11之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：32之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0210769之表1中所揭示；(c)VH，其包含SEQ ID NO：224之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：5之VHCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：3之VHCDR3胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：13之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：14之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：33之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0210769之表1中所揭示；或(d)VH，其包含SEQ ID NO：224之VHCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：2之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：3之VHCDR3胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：10之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：11之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：32之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0210769之表1中所揭示。
在另一實施例中，抗PD-1抗體分子包含(i)重鏈可變區(VH)，其包含選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：224之VHCDR1胺
基酸序列；SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：3之VHCDR3胺基酸序列；及(ii)輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：13之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：14之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0210769之表1中所揭示。
在一些實施例中，PD-1路徑拮抗劑為免疫黏附素(例如包含與恆定區(例如免疫球蛋白序列之Fc區)融合之PD-L1或PD-L2之細胞外或PD-1結合部分之免疫黏附素)。在一些實施例中，PD-1抑制劑為AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如WO2010/027827及WO2011/066342中所揭示)，其為阻斷PD-1與B7-H1之間的相互相用之PD-L2 Fc融合可溶性受體。
在一些實施例中，PD-1路徑拮抗劑為PD-L1或PD-L2抑制劑。在一些實施例中，PD-L1或PD-L2抑制劑為抗PD-L1抗體或抗PD-L2抗體。在一些實施例中，抗PD-L1抑制劑係選自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。在一些實施例中，PD-L1抑制劑為抗PD-L1抗體MSB0010718C。MSB0010718C(亦稱為A09-246-2；Merck Serono)為結合於PD-L1之單株抗體。MSB0010718C及其他人類化抗PD-L1抗體揭示於WO2013/079174中，且具有其中所揭示之序列(或與其實質上一致或類似的序列，例如與指定序列至少85%、90%、95%或95%以上一致之序列)。
MSB0010718C之重鏈胺基酸序列(如WO2013/079174中所揭示之SEQ ID NO：24)至少包括以下：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)
MSB0010718C之輕鏈胺基酸序列(如WO2013/079174中所揭示之SEQ ID NO：25)至少包括以下：QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO：7)
在一個實施例中，PD-L1抑制劑為YW243.55.S70。YW243.55.S70抗體為如WO 2010/077634中所描述之抗PD-L1抗體(分別為SEQ ID NO：20及21中所展示之重鏈及輕鏈可變區序列)，且具有其中所揭示之序列(或與其實質上一致或類似之序列，例如與指定序列至少85%、90%、95%或95%以上一致之序列)。
在一個實施例中，PD-L1抑制劑為MDX-1105。MDX-1105，亦稱為BMS-936559，為WO2007/005874中所描述之抗PD-L1抗體，且具有其中所揭示之序列(或與其實質上一致或類似之序列，例如與指定序列至少85%、90%、95%或95%以上一致之序列)。
在一個實施例中，PD-L1抑制劑為MDPL3280A(Genentech/Roche)。MDPL3280A為人類Fc最佳化IgG1單株抗體，其結合於PD-L1。MDPL3280A及其他針對PD-L1之人類單株抗體揭示於美國專利第7,943,743號及美國公開案第20120039906號中。
在其他實施例中，PD-L2抑制劑為AMP-224。AMP-224為PD-L2Fc融合可溶性受體，其阻斷PD1與B7-H1(B7-DCIg；Amplimmune；例如WO2010/027827及WO2011/066342中所揭示)之間的相互相用。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與TIM-3路徑拮抗劑組合使用。在一些實施例中，組合用於治療實體腫瘤或血液科惡性疾病。在一些實施例中，TIM-3路徑拮抗劑為抗TIM-3抗體。在一些實施例中，抗TIM-3抗體分子揭示於2015年8月6日公開之題為「Antibody Molecules to TIM-3 and Uses Thereof」之US 2015/0218274中。
在一個實施例中，抗TIM-3抗體分子包括至少一個或兩個重鏈可變域(視情況包括恆定區)、至少一個或兩個輕鏈可變域(視情況包括恆定區)或其兩者，其包含胺基酸序列ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或如US 2015/0218274之表1-4中所描述；或由其中表1至4中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上一致(例如至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或99%以上一致)之序列。抗TIM-3抗體分子視情況包含來自重鏈、輕鏈或其兩者之前導序列，如US 2015/0218274中所示；或與其實質上一致之序列。US 2015/0218274之揭示內容以引用的方式併入本文中，如其係關於其中表1-4中之胺基酸序列及核苷酸序列。
在另一實施例中，抗TIM-3抗體分子包括至少一個、兩個或三個來自US 2015/0218274中所描述之抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區之互補決定區(CDR)，例如選自以下中之任一者之抗體：ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或如US 2015/0218274之表1-4中
所描述；或由其中表1至4中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上一致(例如至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或99%以上一致)之序列。
在另一實施例中，抗TIM-3抗體分子包括至少一個、兩個或三個來自重鏈可變區之CDR(或總體上所有CDR)，其包含US 2015/0218274之表1-4中所展示之胺基酸序列，或由其中表1-4中所展示之核苷酸序列編碼。在一個實施例中，CDR中之一或多者(或總體上所有CDR)與表1-4中展示之胺基酸序列相比具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或六個以上變化，例如胺基酸取代或缺失，或由其中表1-4中展示之核苷酸序列編碼。
在另一實施例中，抗TIM-3抗體分子包括至少一個、兩個或三個來自輕鏈可變區之CDR(或總體上所有CDR)，其包含US 2015/0218274之表1-4中所展示之胺基酸序列，或由其中表1-4中所展示之核苷酸序列編碼。在一個實施例中，相對於其中表1-4中所示之胺基酸序列或由其中表1-4中所示之核苷酸序列編碼之胺基酸序列，一或多個CDR(或總體上所有CDR)具有一個、兩個、三個、四個、五個或五個以上變化，例如胺基酸取代、插入或缺失。在某些實施例中，抗TIM-3抗體分子包括輕鏈CDR中之取代，例如輕鏈之CDR1、CDR2及/或CDR3中的一或多個取代。
在另一實施例中，抗TIM-3抗體分子包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個來自重鏈及輕鏈可變區之CDR(或總體上所有CDR)，其包含US 2015/0218274之表1-4中所展示之胺基酸序列，或由其中表1-4中所展示之核苷酸序列編碼。在一個實施例中，相對於其中表1-4中所示之胺基酸序列或由其中表1-4中所示之核苷酸序列編碼之胺基酸序列，一或多個CDR(或總體上所有CDR)具有一個、兩個、三個、四個、五個或五個以上變化，例如胺基酸取代、插入或缺失。
在一個實施例中，抗TIM-3抗體分子包括：(a)重鏈可變區(VH)，其包含選自SEQ ID NO：9之VHCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：10之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：5之VHCDR3胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：12之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：13之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：14之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0218274之表1-4中所揭示；(b)VH，其包含選自SEQ ID NO：3之VHCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：4之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：5之VHCDR3胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：6之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：7之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：8之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0218274之表1-4中所揭示；(c)VH，其包含選自SEQ ID NO：9之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：25之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：5之VHCDR3胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：12之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：13之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：14之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0218274之表1-4中所揭示；(d)VH，其包含選自SEQ ID NO：3之VHCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：24之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：5之VHCDR3胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：6之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：7之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：8之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0218274之表1-4中所揭示；(e)VH，其包含選自SEQ ID NO：9之VHCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：31之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：5之VHCDR3胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO：12之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：13之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：14之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0218274之表1-4中所揭示；或(f)VH，其包含選自SEQ ID NO：3之VHCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：30之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：5之VHCDR3胺基酸序
列；及VL，其包含SEQ ID NO：6之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：7之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：8之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0218274之表1-4中所揭示。
在一些實施例中，TIM-3路徑拮抗劑為如美國專利第8,552,156號、WO 2011/155607、EP 2581113或美國公開案第2014/044728號中所揭示之抗TIM-3抗體。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與LAG-3路徑拮抗劑組合使用。在一些實施例中，組合用於治療實體腫瘤或血液科惡性疾病。在一些實施例中，LAG-3路徑拮抗劑為抗LAG-3抗體。在一些實施例中，抗LAG-3抗體分子揭示於2015年3月13日申請之題為「Antibody Molecules to LAG-3 and Uses Thereof」之US 2015/0259420中。
在一個實施例中，抗LAG-3抗體分子包括至少一個或兩個重鏈可變域(視情況包括恆定區)、至少一個或兩個輕鏈可變域(視情況包括恆定區)或其兩者，其包含以下中之任一者之胺基酸序列：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或
BAP050-hum20-Ser)、BAP050-純系-F、BAP050-純系-G、BAP050-純系-H、BAP050-純系-I或BAP050-純系-J；或如US 2015/0259420之表1如中所描述，或由表1中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上一致(例如至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或99%以上一致)之序列。US 2015/0259420之揭示內容以引用的方式併入本文中，如其係關於其中表1中之胺基酸序列及核苷酸序列。
在另一實施例中，抗LAG-3抗體分子包括至少一個、兩個或三個來自本文中所描述之抗體之重鏈可變區及/或輕鏈可變區之互補決定區(CDR)，例如選自以下中之任一者之抗體：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-純系-F、BAP050-純系-G、BAP050-純系-H、BAP050-純系-I或BAP050-純系-J；或如US 2015/0259420之表1中所描述，或由其中表1中之核苷酸序列編碼；或與任一前述序列實質上一致(例如至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或99%以上一致)之序列。
在另一實施例中，抗LAG-3抗體分子包括至少一個、兩個或三個
來自重鏈可變區之CDR(或總體上所有CDR)，其包含US 2015/0259420之表1中所展示之胺基酸序列，或由其中表1中所展示之核苷酸序列編碼。在一個實施例中，CDR中之一或多者(或總體上所有CDR)與表1中展示之胺基酸序列相比具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或六個以上變化，例如胺基酸取代或缺失，或由其中表1中展示之核苷酸序列編碼。
在另一實施例中，抗LAG-3抗體分子包括至少一個、兩個或三個來自輕鏈可變區之CDR(或總體上所有CDR)，其包含US 2015/0259420之表1中所展示之胺基酸序列，或由其中表1中所展示之核苷酸序列編碼。在一個實施例中，CDR中之一或多者(或總體上所有CDR)與表1中展示之胺基酸序列相比具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或六個以上變化，例如胺基酸取代或缺失，或由其中表1中展示之核苷酸序列編碼。在某些實施例中，抗PD-L1抗體分子包括輕鏈CDR中之取代，例如輕鏈之CDR1、CDR2及/或CDR3中的一或多個取代。
在另一實施例中，抗LAG-3抗體分子包括至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個來自重鏈及輕鏈可變區之CDR(或總體上所有CDR)，其包含US 2015/0259420之表1中所展示之胺基酸序列，或由其中表1中所展示之核苷酸序列編碼。在一個實施例中，CDR中之一或多者(或總體上所有CDR)與表1中展示之胺基酸序列相比具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或六個以上變化，例如胺基酸取代或缺失，或由其中表1中展示之核苷酸序列編碼。
在一個實施例中，抗LAG-3抗體分子包括：(i)重鏈可變區(VH)，其包括選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：286之VHCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：2之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：3之VHCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0259420之表1中所揭示；及
(ii)輕鏈可變區(VL)，其包括SEQ ID NO：10之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：11之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：12之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0259420之表1中所揭示。
在另一實施例中，抗LAG-3抗體分子包括：(i)重鏈可變區(VH)，其包括選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：286之VHCDR1胺基酸序列；SEQ ID NO：5之VHCDR2胺基酸序列；及SEQ ID NO：3之VHCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0259420之表1中所揭示；及(ii)輕鏈可變區(VL)，其包括SEQ ID NO：13之VLCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：14之VLCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO：15之VLCDR3胺基酸序列，各自如US 2015/0259420之表1中所揭示。
在一個實施例中，抗LAG-3抗體分子包含如US 2015/0259420之表1中所揭示之SEQ ID NO：1之VHCDR1胺基酸序列。在另一實施例中，抗LAG-3抗體分子包含如US 2015/0259420之表1中所揭示之SEQ ID NO：4之VHCDR1胺基酸序列。在另一實施例中，抗LAG-3抗體分子包含如US 2015/0259420之表1中所揭示之SEQ ID NO：286之VHCDR1胺基酸序列。
在一些實施例中，抗LAG-3抗體為BMS-986016。BMS-986016(亦稱為BMS986016；Bristol-Myers Squibb)為單株抗體，其結合於LAG-3。BMS-986016及其他人類化抗LAG-3抗體揭示於US 2011/0150892、WO2010/019570及WO2014/008218中。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與T細胞受體促效劑組合使用，諸如CD28促效劑、OX40促效劑、GITR促效劑、CD137促效劑、CD27促效劑或HVEM促效劑。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與CD27促效劑組合使用。例示性CD27促效劑包括抗CD27促效抗體，例如PCT公開
案第WO 2012/004367號中所描述。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與GITR促效劑組合使用。在一些實施例中，組合用於治療實體腫瘤或血液科惡性疾病。例示性GITR促效劑包括例如GITR融合蛋白質及抗GITR抗體(例如二價抗GITR抗體，諸如以下文獻中所描述之GITR融合蛋白質：美國專利第6,111,090號、歐洲專利第0920505B1號、美國專利第8,586,023號、PCT公開案第WO 2010/003118號及第2011/090754號，或例如以下文獻中所描述之抗GITR抗體：美國專利第7,025,962號、歐洲專利第1947183B1號、美國專利第7,812,135號、美國專利第8,388,967號、美國專利第8,591,886號、歐洲專利第EP 1866339號、PCT公開案第WO 2011/028683號、美國專利第8,709,424號、PCT公開案第WO 2013/039954號、國際公開案第WO2013/039954號、美國公開案第US2014/0072566號、國際公開案第WO2015/026684號、PCT公開案第WO2005/007190號、PCT公開案第WO 2007/133822號、PCT公開案第WO2005/055808號、PCT公開案第WO 99/40196號、PCT公開案第WO 2001/03720號、PCT公開案第WO99/20758號、美國專利第6,689,607號、PCT公開案第WO2006/083289號、PCT公開案第WO 2005/115451號、美國專利第7,618,632號、PCT公開案第WO 2011/051726號、國際公開案第WO2004060319號及國際公開案第WO2014012479號。
在一個實施例中，如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物與GITR促效劑組合使用，該GITR促效劑與PD-1抑制劑組合使用，例如WO2015/026684中所描述。
在另一實施例中，如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物與GITR促效劑組合使用，該GITR促效劑與TLR促效劑組合使用，例如WO2004060319及國際公開案第WO2014012479號中所描述。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與Toll樣受體促效劑組合使用。如本文所使用之術語「Toll樣受體」(或「TLR」)係指蛋白質之Toll樣受體家族之成員或其片段，其感測微生物產物及/或起始適應性免疫反應。在一個實施例中，TLR活化樹突狀細胞(DC)。Toll樣受體(TLR)為模式識別受體之家族，其最初鑑別為可識別微生物病原體之先天性免疫系統之感測器。TLR包含含有富含白胺酸之重複之胞外域、跨膜結構域及細胞內TIR(Toll/IL-1R)結構域之保守性跨膜分子之家族。TLR識別微生物中之不同結構，通常稱為「PAMP」(病原體相關分子模式)。結合於TLR之配位體調用框內細胞信號傳導路徑之級聯，該級聯誘導涉及炎症及免疫性之因子之產生。
在人類中，已鑑別十種TLR。表現於細胞之表面上的TLR包括TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-5及TLR-6，而TLR-3、TLR-7/8及TLR-9藉由ER隔室表現。可基於不同TLR表現模式鑑別人類樹突狀細胞子集。作為實例，骨髓或DC之「習知」子集(mDC)在刺激時表現TLR1-8，且產生活化標記物(例如CD80、CD86、I類及II類MHC、CCR7)之級聯、促炎性細胞激素及趨化激素。此刺激及所得表現之結果為抗原特異性CD4+及CD8+ T細胞激活。此等DC獲取增強之能力以吸收抗原且將其以適合形式呈現至T細胞。相比之下，DC之漿細胞樣子集(pDC)在活化時僅表現TLR7及TLR9，引起NK細胞以及T細胞之活化。由於染色腫瘤細胞可不利地影響DC功能，已提出在用於治療癌症之免疫療法方法中用TLR促效劑活化DC可對激活抗腫瘤免疫性為有益的。亦提出使用輻射及化學療法成功治療乳癌需要TLR4活化。
此項技術中已知且在本發明中使用之TLR促效劑包括(但不限於)以下：Pam3Cys，一種TLR-1/2促效劑；
CFA，一種TLR-2促效劑；MALP2，一種TLR-2促效劑；Pam2Cys，一種TLR-2促效劑；FSL-1，一種TLR-2促效劑；Hib-OMPC，一種TLR-2促效劑；聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)，一種TLR-3促效劑；聚腺苷-聚尿苷酸(聚AU)，一種TLR-3促效劑；經聚-L-離胺酸及羧基甲基纖維素(Hiltonol®)穩定之聚肌苷酸-聚胞苷酸，一種TLR-3促效劑；單磷醯基脂質A(MPL)，一種TLR-4促效劑；LPS，一種TLR-4促效劑；細菌鞭毛蛋白，一種TLR-5促效劑；唾液酸基-Tn(STn)，一種與許多人類癌細胞上之MUC1黏蛋白相關之碳水化合物及一種TLR-4促效劑；咪喹莫特，一種TLR-7促效劑；雷西莫特，一種TLR-7/8促效劑；洛索立賓，一種TLR-7/8促效劑；及未甲基化之CpG二核苷酸(CpG-ODN)，一種TLR-9促效劑。
由於其佐劑品質，TLR促效劑較佳與其他疫苗、佐劑及/或免疫調節劑組合使用，且可組合於多種組合中。因此，在某些實施例中，如本文中所描述，結合於STING且誘導STING依賴性TBK1活化之單-F-CDN或二-F-CDN化合物以及表現及分泌一或多種細胞激素(其刺激樹突狀細胞誘導、補充及/或成熟)之不活化腫瘤細胞可與一或多種TLR促效劑共同投與以用於治療目的。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物可與治療性抗體
組合使用。在一些實施例中，治療性抗體之作用機制為抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。ADCC為細胞介導之免疫防禦機制，藉此免疫系統之效應細胞主動溶解細胞膜表面抗原已由特異性抗體結合之目標細胞。其為抗體可用於(作為體液免疫反應之一部分)限制及制約感染之機制中之一者。經典ADCC由自然殺手(NK)細胞介導；巨噬細胞、嗜中性白血球及嗜伊紅血球亦可介導ADCC。ADCC為一種重要的針對腫瘤之治療性單株抗體(包括曲妥珠單抗及利妥昔單抗)之作用機制。本發明化合物可用於強化ADCC。
以下為可與本發明之單-F-CDN或二-F-CDN化合物共同使用之抗體之例示性清單。
莫羅單抗(Muromonab)-CD3：用於預防器官(例如腎臟)移植之急性排斥。人類化版本展示抑制1型糖尿病中β細胞之自體免疫性破壞之前景。
英利昔單抗(Infliximab)(Remicade®)及阿達木單抗(adalimumab)(Humira®)：結合於腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。用於一些發炎疾病，諸如類風濕性關節炎、牛皮癬、克羅恩氏病。
奧馬珠單抗(Omalizumab)(Xolair®)。結合於IgE，由此組織IgE結合於肥大細胞。針對過敏性哮喘使用。
達利珠單抗(Daclizumab)(Zenapax®)。結合於在經活化之T細胞之表面暴露之IL-2受體之一部分。用於預防所移植之腎臟之急性排斥。
利妥昔單抗(Rituximab)(商標名=Rituxan®)。結合於在大部分B細胞上發現之CD20分子且用於治療B細胞淋巴瘤。
異貝莫單抗(Ibritumomab)(商標名=Zevalin®)。此為針對與同位素結合之B細胞(及淋巴瘤)上之CD20分子的單株抗體。投與補充有美羅華(Rituxan)之淋巴瘤患者。
托西莫單抗(Tositumomab)(Bexxar®)。此為針對CD20之單株抗體及放射性同位素碘-131(131I)之結合物。
西妥昔單抗(Cetuximab)(Erbitux®)。阻斷HER1，HER1為在一些腫瘤細胞(一些乳癌、淋巴瘤)上發現之表皮生長因子(EGF)之受體。
曲妥珠單抗(Trastuzumab)(Herceptin®)阻斷HER2，HER2為在約20%乳癌中過表現之生長因子受體。
Adcetris®。與CD30(由一些淋巴瘤之細胞表現，但未在再生骨髓所需的正常幹細胞上發現之細胞表面分子)結合之單株抗體之結合物。
阿侖單抗(Alemtuzumab)(Campath-1H®)。結合於CD52，一種在淋巴球上發現且消耗T細胞及B細胞之分子。引起慢性淋巴球性白血病之完全緩解且展示預防腎臟移植排斥之前景。
Lym-1(Oncolym®)。結合於可在淋巴瘤細胞上大量表現之HLA-DR編碼之組織相容抗原。
伊派利單抗(Ipilimumab)(Yervoy®)，其起作用以增強身體自身對腫瘤之免疫反應。
維他欣(Vitaxin)。結合於在腫瘤血管上而非在供應正常組織之血管上發現之血管整合素(α-v/β-3)。在II期臨床試驗中，維他欣展示一些在無有害副作用下縮小實體腫瘤之前景。
貝伐單抗(Bevacizumab)(Avastin®)。結合於血管內皮生長因子(VEGF)，從而阻止其結合於其受體。用於治療結腸直腸癌。
阿昔單抗(Abciximab)(ReoPro®)。藉由結合血小板表面上通常由血纖維蛋白原連接之受體來抑制血小板凝集。有助於預防經歷血管成形術之患者中冠狀動脈之再阻塞。
可與如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物組合使用之其他治療性抗體包括促乳素受體(PRLR)抑制劑，例如美國專利
7,867,493中所揭示；HER3抑制劑，例如PCT公開案第WO 2012/022814號中所揭示；EGFR2及/或EGFR4抑制劑，例如PCT公開案第WO 2014/160160號中所揭示；M-CSF抑制劑，例如PCT公開案第WO 2004/045532號中所揭示；抗APRIL抗體，例如美國專利8,895,705中所揭示；或抗SIRPα抗體或抗CD47抗體，例如美國專利8,728,476及美國專利8,562,997中所揭示。
在一個實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與促乳素受體(PRLR)抑制劑(一種人類單株抗體分子(化合物A26)，如美國專利7,867,493中所揭示)組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，PRLR抑制劑為US 7,867,493中所揭示之人類單株抗體(化合物A26)。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與美國專利7,867,493中所描述之人類單株抗體分子(化合物A26)組合使用以治療病症，諸如癌症、前列腺癌或乳癌。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與HER3抑制劑、化合物A31或PCT公開案第WO 2012/022814號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，HER3抑制劑為化合物A31或PCT公開案WO 2012/022814中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與化合物A31或PCT公開案WO 2012/022814中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如胃癌、食道癌、頭頸癌、鱗狀細胞癌、胃癌、乳癌(例如轉移性乳癌)或消化道/胃腸道癌症。在一些實施例中，化合物A31為人類單株抗體分子。在一個實施例中，以約3、10、20或40mg/kg之劑量(例如每週一次(QW))投與HER3抑制劑或化合物A31。在一個實施例中，化合物係以約3-10、10-20或20-40mg/kg之劑量投與。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與FGFR2及/或FGFR4抑制劑、化合物A32或公開案PCT公開案第WO 2014/160160號中所揭示之化合物(例如針對FGFR2及/或FGFR4之抗體分子藥物結合物，例如其中所描述之mAb 12425)組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，FGFR2及/或FGFR4抑制劑為化合物A32或公開案PCT公開案第WO 2014/160160號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與化合物A32組合使用，或在另一組合中與如表2中所描述之化合物一起使用，以治療病症，諸如癌症、胃癌、乳癌、橫紋肌肉瘤、肝癌、腎上腺癌症、肺癌、食道癌、結腸癌或子宮內膜癌。在一些實施例中，化合物A32為針對FGFR2及/或FGFR4之抗體分子藥物結合物，例如mAb 12425。
在另一實施例中，組合(例如包含本文中所描述之單-F-CDN或二-化合物之組合)與M-CSF抑制劑、化合物A33或PCT公開案第WO 2004/045532號中所揭示之化合物(例如針對M-CSF之抗體分子或Fab片段)組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，M-CSF抑制劑為化合物A33或PCT公開案第WO 2004/045532號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與化合物A33或如PCT公開案第WO 2004/045532號中所描述之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、前列腺癌、乳癌或色素沉著性絨毛結節性滑膜炎(PVNS)。在實施例中，化合物A33為針對M-CSF之單株抗體分子或其片段(例如Fab片段)。在實施例中，M-CSF抑制劑或化合物A33係以約10mg/kg之平均劑量投與。
脂質體為由一個(「單層」)或一個以上(「多層」)磷脂層形成之囊泡。由於磷脂構築嵌段之兩性特徵，脂質體通常包含親水性層，其
呈現親水性外表面及圍繞親水性核心。脂質體在親水性/疏水性組分之合併中之變通性、其無毒性、可生物降解性、生物相容性、佐劑性、細胞免疫之誘導、持續釋放性及促進巨噬細胞之捕捉使其成為有吸引力的用於傳遞抗原之候選物。
WO2010/104833描述適合的脂質製劑。此類具有或不具有上文提及之「免疫原性多肽或碳水化合物」之脂質調配物，在本文中稱為VesiVax®(Molecular Express,Inc.)，可含有一或多種其他組分，諸如肽聚糖、脂肽、脂多糖、單磷醯基脂質A、脂磷壁酸、雷西莫特、咪喹莫特、鞭毛蛋白、含有未甲基化之CpG主結構之寡核苷酸、β-半乳糖苷基神經醯胺、胞壁醯二肽、全反式視黃酸、雙股病毒RNA、熱休克蛋白質、二(十八烷基)二甲基銨溴化物、陽離子性界面活性劑、toll樣受體促效劑、二肉豆蔻醯基三甲基銨丙烷及nod樣受體促效劑。有利的是，此等脂質調配物可用於傳遞一或多種根據本發明在本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物及其組合物。
此外，儘管如上文所論述之脂質調配物使用「類固醇衍生物」作為用於將免疫原性多肽或碳水化合物連接至脂質體之錨，但類固醇可簡單地以未結合之類固醇(諸如膽固醇)形式提供。
用於自脂質混合物製備脂質體之適合的方法為此項技術中所熟知。參見例如Basu及Basu,Liposome Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press,2002；Gregoriadis,Liposome Technology，第3版，Informa HealthCare,2006。較佳方法包括其中所描述之擠壓、均質化及音波處理方法。本發明中使用之用於製備脂質體之例示性方法描述於WO2010/104833中，其包含乾燥脂質混合物，接著在水性媒劑中進行水合作用且進行音波處理以形成脂質體。
在某些實施例中，在特定平均尺寸範圍內提供脂質體。可例如
藉由擠壓包含脂質體之水性媒劑使其通過具有預先選擇之孔徑之薄膜且收集流動通過該膜之材料來選擇脂質體尺寸。在較佳實施例中，選擇脂質體使其直徑實質上介於50與500nm之間，更佳直徑實質上介於50與200nm之間且最佳直徑實質上介於50與150nm之間。如本文所使用，術語「實質上」在此情形中意謂至少75%，更佳80%且最佳至少90%脂質體在指定範圍內。
可用於本發明中之其他脂質及脂質類佐劑包括水包油(o/w)乳液(參見例如Muderhwa等人，J.Pharmaceut.Sci.88：1332-9,1999))、VesiVax® TLR(Molecular Express,Inc.)、毛地黃皂苷(參見例如美國專利5,698,432)及葡萄哌喃糖基脂質(參見例如美國專利申請案20100310602)。
奈米粒子亦表示適用於大部分投藥途徑之藥物傳遞系統。在過去數年間，已研究多種用於製備奈米粒子之天然及合成聚合物，其中聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)及其共聚物(PLGA)由於其生物相容性及可生物降解性而廣泛研究。奈米粒子及其他奈米載劑充當若干類藥物之潛在載劑，諸如抗癌劑、抗高血壓劑、免疫調節劑及激素；及大分子，諸如核酸、蛋白質、肽及抗體。參見例如Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.21：387-422,2004；Nanomedicine：Nanotechnology,Biology and Medicine 1：22-30,2005。
在本文所描述之方法之其他實施例中，如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物與化學治療劑(例如小分子醫藥化合物)組合使用。因此，該等方法進一步涉及投與個體有效量之一或多種化學治療劑作為額外治療或組合治療。在某些實施例中，該一或多種化學治療劑係選自由以下組成之群：乙酸阿比特龍(乙酸阿比特龍)、六甲蜜胺(altretamine)、脫水長春花鹼(anhydrovinblastine)、奧瑞他汀
(auristatin)、貝瑟羅汀(bexarotene)、比卡魯胺(bicalutamide)、BMS 184476、2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧苯基)苯磺醯胺、博萊黴素(bleomycin)、N,N-二甲基-L-纈胺醯基-N-甲基-L-纈胺醯基-L-脯胺醯基-1-脯胺酸-第三丁基醯胺、惡病質素、西馬多丁(cemadotin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、環磷醯胺、3',4'-二去氫-4'-去氧-8'-諾維斯汀(3',4'-didehydro-4'-deoxy-8'-norvincaleukoblastine)、多烯紫杉醇(docetaxol)、多西他賽(doxetaxel)、環磷醯胺、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、順鉑(cisplatin)、克瑞托欣(cryptophycin)、環磷醯胺、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、放線菌素D、道諾黴素(daunorubicin)、地西他濱海兔毒素(decitabine dolastatin)、多柔比星(doxorubicin)(阿德力黴素(adriamycin))、依託泊苷(etoposide)、5-氟尿嘧啶、非那雄安(finasteride)、氟他胺(flutamide)、羥基尿素(hydroxyurea)及羥基尿素紫杉烷(hydroxyureataxanes)、異環磷醯胺(ifosfamide)、利阿唑(liarozole)、氯尼達明(lonidamine)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、恩雜魯胺(enzalutamide)、雙氯乙基甲胺(氮芥)、美法侖(melphalan)、羥乙基磺酸米伏布林(mivobulin isethionate)、根瘤菌素(rhizoxin)、塞尼氟(sertenef)、鏈脲菌素(streptozocin)、絲裂黴素(mitomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)、紫杉烷(taxanes)、尼魯胺(nilutamide)、奧那司酮(onapristone)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、潑尼氮芥(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、RPR109881、磷酸斯穆斯汀(stramustine phosphate)、他莫昔芬(tamoxifen)、他索那明(tasonermin)、紫杉醇(taxol)、維甲酸(tretinoin)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、硫酸長春地辛(vindesine sulfate)及長春氟寧(vinflunine)。
在本文所描述之方法之其他實施例中，如本文中所描述之單-F-
CDN或二-F-CDN化合物與化學治療劑及/或其他用於治療如本文中之方法中所描述之適應症的藥劑組合使用。在一些實施例中，如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物與一或多種選自由以下組成之群的藥劑組合使用：索塔妥林(sotrastaurin)、尼羅替尼(nilotinib)、5-(2,4-二羥基-5-異丙基苯基)-N-乙基-4-(4-((N-嗎啉基)甲基)苯基)異噁唑-3-甲醯胺、達妥昔布(dactolisib)、8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮、3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-(6-((4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)-1-甲基脲、布帕昔布(buparlisib)、8-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-((二甲基胺基)甲基)-1H-咪唑-2-基)喹喏啉-5-甲醯胺、(S)-N1-(4-甲基-5-(2-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)吡咯啶-1,2-二甲醯胺、(S)-1-(4-氯苯基)-7-異丙氧基-6-甲氧基-2-(4-(甲基(((1R,4S)-4-(4-甲基-3-側氧基哌嗪-1-基)環己基)甲基)胺基)苯基)-1,2-二氫異喹啉-3(4H)-酮、地拉羅司(deferasirox)、來曲唑(letrozole)、(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-N-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-二嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-甲基噁唑啶-2-酮、(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-異丙基-5,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮、4-((2-(((1R,2R)-2-羥基環己基)胺基)苯并[d]噻唑-6-基)氧基)-N-甲基吡啶甲醯胺、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、2-氟-N-甲基-4-(7-(喹啉-6-基甲基)咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪-2-基)苯甲醯胺、蘆可替尼(ruxolitinib)、帕比司他(panobinostat)、奧卓司他(osilodrostat)、(S)-N-((S)-1-環己基-2-((S)-2-(4-(4-氟苯甲醯基)噻唑-2-基)吡咯啶-1-基)-2-側氧基乙基)-2-(甲基胺基)丙醯胺、(S)-N-((S)-1-環己基-2-((S)-2-(4-(4-氟苯甲醯基)噻唑-2-基)吡咯啶-1-基)-2-側氧基乙基)-2-(甲基胺基)丙醯胺、磷酸索尼蒂吉伯(sonidegib phosphate)、色瑞替尼(ceritinib)、7-環戊基-N,N-二甲基-
2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醯胺、N-(4-((1R,3S,5S)-3-胺基-5-甲基環己基)吡啶-3-基)-6-(2,6-二氟苯基)-5-氟吡啶甲醯胺、2-(2',3-二甲基-[2,4'-二吡啶]-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙醯胺、恩拉菲尼(encorafenib)、7-環戊基-N,N-二甲基-2-((5-((1R,6S)-9-甲基-4-側氧基-3,9-二氮雙環[4.2.1]壬-3-基)吡啶-2-基)胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醯胺、畢尼替尼(binimetinib)、米哚妥林(midostaurin)、依維莫司(everolimus)、1-甲基-5-((2-(5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)吡啶-4-基)氧基)-N-(4-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺、二天冬胺酸帕瑞肽(pasireotide diaspartate)、多韋替尼(dovitinib)、(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯基)氮雜環庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基異菸鹼醯胺、N6-(2-異丙氧基-5-甲基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)-N4-(2-(異丙磺醯基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺、1,1-二氧化3-(4-(4-((5-氯-4-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-5-氟-2-甲基苯基)哌啶-1-基)硫雜環丁烷、5-氯-N2-(2-氟-5-甲基-4-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)哌啶-4-基)苯基)-N4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-2,4-二胺、5-氯-N2-(4-(1-乙基哌啶-4-基)-2-氟-5-甲基苯基)-N4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-2,4-二胺、伐司撲達(valspodar)及丁二酸凡塔藍尼(vatalanib succinate)。
在一個實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與PKC抑制劑、索塔妥林(化合物A1)或PCT公開案第WO 2005/039549號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，PKC抑制劑為索塔妥林(化合物A1)或PCT公開案第WO 2005/039549號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與索塔妥林(化合物A1)或如PCT公開案第WO 2005/039549號中所述之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、黑色素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、發炎性腸
病、移植排斥、眼科病症或牛皮癬。在某些實施例中，以約20至600mg，例如約200至約600mg、約50mg至約450mg、約100mg至400mg、約150mg至350mg或約200mg至300mg，例如約50mg、100mg、150mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg之劑量投與索塔妥林(化合物A1)。給藥時程可在例如每隔一天至每天、每天兩次或三次之範圍內變化。
在一個實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與BCR-ABL抑制劑、TASIGNA(化合物A2，尼羅替尼(nilotinib))或PCT公開案第WO 2004/005281號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，BCR-ABL抑制劑為TASIGNA，或PCT公開案第WO 2004/005281號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與TASIGNA(化合物A2)或如PCT公開案第WO 2004/005281號中所描述之化合物組合使用以治療病症，諸如淋巴球性白血病、帕金森氏病(Parkinson's Disease)、神經癌症、黑素瘤、消化道/胃腸道癌症、結腸直腸癌、骨髓白血病、頭頸癌或肺高血壓。在一個實施例中，BCR-ABL抑制劑或TASIGNA以約300mg(例如每天兩次，例如用於新近診斷之Ph+ CML-CP)或約400mg(例如每天兩次，例如用於耐受性或不耐受性Ph+ CML-CP及CML-AP)。BCR-ABL抑制劑或化合物A2以約300-400mg之劑量投與。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與HSP90抑制劑(諸如5-(2,4-二羥基-5-異丙基苯基)-N-乙基-4-(4-((N-嗎啉基)甲基)苯基)異噁唑-3-甲醯胺(化合物A3))或PCT公開案第WO 2010/060937號或第WO 2004/072051號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，HSP90抑制劑為5-(2,4-二羥基-5-異丙基苯基)-N-乙基-4-(4-
((N-嗎啉基)甲基)苯基)異噁唑-3-甲醯胺(化合物A3)，或PCT公開案第WO 2010/060937號或第WO 2004/072051號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與5-(2,4-二羥基-5-異丙基苯基)-N-乙基-4-(4-((N-嗎啉基)甲基)苯基)異噁唑-3-甲醯胺(化合物A3)或PCT公開案第WO 2010/060937號或第WO 2004/072051號中所描述之化合物組合使用，以治療病症，諸如癌症、多發性骨髓瘤、非小細胞肺癌、淋巴瘤、胃癌、乳癌、消化道/胃腸道癌症、胰臟癌、結腸直腸癌、實體腫瘤或血細胞生成病症。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與PI3K及/或mTOR之抑制劑、達妥昔布(化合物A4)或8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(化合物A41)或PCT公開案第WO 2006/122806號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，PI3K及/或mTOR抑制劑為達妥昔布(化合物A4)、8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(化合物A41)，或PCT公開案第WO 2006/122806號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與達妥昔布(化合物A4)、8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(化合物A41)或PCT公開案第WO 2006/122806號中所描述之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、前列腺癌、白血病(例如淋巴球性白血病)、乳癌、腦癌、膀胱癌、胰臟癌、腎癌、實體腫瘤或肝癌。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與FGFR抑制劑、3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-(6-((4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)-1-甲基脲(化合物
A5)或美國專利8,552,002中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，FGFR抑制劑為3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-(6-((4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)-1-甲基脲(化合物A5)或美國專利8,552,002中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與化合物A5或如US 8,552,002中所描述之化合物組合使用以治療病症，諸如消化道/胃腸道癌症、血液學癌症或實體腫瘤。在一個實施例中，FGFR抑制劑或3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-(6-((4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)-1-甲基脲(化合物A5)係以約100-125mg(例如每天)，例如約100mg或約125mg之劑量投與。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與PI3K抑制劑、布帕昔布(Buparlisib)(化合物A6)或PCT公開案第WO 2007/084786號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，PI3K抑制劑為布帕昔布(化合物A6)或PCT公開案第WO 2007/084786號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與布帕昔布(化合物A6)或PCT公開案第WO 2007/084786號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如前列腺癌、非小細胞肺癌、內分泌癌症、白血病、卵巢癌、黑素瘤、膀胱癌、乳癌、雌性生殖系統癌症、消化道/胃腸道癌症、結腸直腸癌、多形性膠質母細胞瘤、實體腫瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、血細胞生成病症或頭頸癌。在一個實施例中，PI3K抑制劑或布帕昔布(化合物A6)係以約100mg(例如每天)之劑量投與。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與FGFR抑制劑、8-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-((二甲基胺基)甲基)-1H-咪唑-2-基)喹喏啉-5-甲醯胺(化合物
A7)或PCT公開案第WO 2009/141386號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，FGFR抑制劑為8-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-((二甲基胺基)甲基)-1H-咪唑-2-基)喹喏啉-5-甲醯胺(化合物A7)或PCT公開案第WO 2009/141386號中所揭示之化合物。在一個實施例中，FGFR抑制劑為8-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-((二甲基胺基)甲基)-1H-咪唑-2-基)喹喏啉-5-甲醯胺(化合物A7)。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與8-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-((二甲基胺基)甲基)-1H-咪唑-2-基)喹喏啉-5-甲醯胺(化合物A7)或PCT公開案第WO 2009/141386號中揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如特徵為血管生成之癌症。在一個實施例中，FGFR抑制劑或8-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-((二甲胺基)甲基)-1H-咪唑-2-基)喹喏啉-5-甲醯胺(化合物A7)係以例如每個人每天約3mg至約5g、更佳約10mg至約1.5g之劑量投與，此劑量視情況分成1至3個例如可具有相同大小的單次劑量。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與PI3K抑制劑、(S)-N1-(4-甲基-5-(2-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)吡咯啶-1,2-二甲醯胺(化合物A8)或PCT公開案第WO 2010/029082號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，PI3K抑制劑為(S)-N1-(4-甲基-5-(2-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)吡咯啶-1,2-二甲醯胺(化合物A8)或PCT公開案第WO 2010/029082號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與(S)-N1-(4-甲基-5-(2-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)吡咯啶-1,2-二甲醯胺(化合物A8)或PCT公開案第WO 2010/029082號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如胃癌、乳癌、胰臟癌、消化道/胃腸道癌症、實體腫瘤及頭頸癌。在一個實施例中，
PI3K抑制劑或(S)-N1-(4-甲基-5-(2-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)吡咯啶-1,2-二甲醯胺(化合物A8)係以約150-300、200-300、200-400或300-400mg(例如每天)，例如約200、300或400mg之劑量投與。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與細胞色素P450之抑制劑(例如CYP17抑制劑)或PCT公開案第WO 2010/149755號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，細胞色素P450抑制劑(例如CYP17抑制劑)為PCT公開案第WO 2010/149755號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與PCT公開案第WO 2010/149755號中所揭示之化合物組合使用以治療前列腺癌。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與HDM2抑制劑、(S)-1-(4-氯苯基)-7-異丙氧基-6-甲氧基-2-(4-(甲基(((1R,4S)-4-(4-甲基-3-側氧基哌嗪-1-基)環己基)甲基)胺基)苯基)-1,2-二氫異喹啉-3(4H)-酮(化合物A10)或PCT公開案第WO 2011/076786號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，HDM2抑制劑為(S)-1-(4-氯苯基)-7-異丙氧基-6-甲氧基-2-(4-(甲基(((1R,4S)-4-(4-甲基-3-側氧基哌嗪-1-基)環己基)甲基)胺基)苯基)-1,2-二氫異喹啉-3(4H)-酮(化合物A10)或PCT公開案第WO 2011/076786號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與(S)-1-(4-氯苯基)-7-異丙氧基-6-甲氧基-2-(4-(甲基(((1R,4S)-4-(4-甲基-3-側氧基哌嗪-1-基)環己基)甲基)胺基)苯基)-1,2-二氫異喹啉-3(4H)-酮(化合物A10)或PCT公開案第WO 2011/076786號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如實體腫瘤。在一個實施例中，HDM2抑制劑或(S)-1-(4-氯苯基)-7-異丙
氧基-6-甲氧基-2-(4-(甲基(((1R,4S)-4-(4-甲基-3-側氧基哌嗪-1-基)環己基)甲基)胺基)苯基)-1,2-二氫異喹啉-3(4H)-酮(化合物A10)以約400至700mg之劑量投與，例如每週投與三次(連續2週投與且暫停一週)。在一些實施例中，劑量為約400、500、600或700mg；約400-500、500-600或600-700mg，例如每週投與三次。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與鐵螯合劑、地拉羅司(Deferasirox)(亦稱為EXJADE；化合物A11)或PCT公開案第WO 1997/049395號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，鐵螯合劑為地拉羅司或PCT公開案第WO 1997/049395號中所揭示之化合物。在一個實施例中，鐵螯合劑為地拉羅司(化合物A11)。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與地拉羅司(化合物A11)或PCT公開案第WO 1997/049395號中所揭示之化合物組合使用以治療鐵過載、血色素沈著症或骨髓發育不良。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與芳香酶抑制劑、來曲唑(Letrozole)(亦稱為FEMARA；化合物A12)或US 4,978,672中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，芳香酶抑制劑為來曲唑(化合物A12)或美國專利4,978,672中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與來曲唑(化合物A12)或美國專利4,978,672中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、平滑肌肉瘤、子宮內膜癌、乳癌、雌性生殖系統癌症或荷爾蒙不足。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與PI3K抑制劑(例如泛PI3K抑制劑)、(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-N-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-
5-甲基噁唑啶-2-酮(化合物A13)或PCT公開案第WO2013/124826號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，PI3K抑制劑為(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-N-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-甲基噁唑啶-2-酮(化合物A13)或PCT公開案第WO2013/124826號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與(4S,5R)-3-(2'-胺基-2-N-嗎啉基-4'-(三氟甲基)-[4,5'-聯嘧啶]-6-基)-4-(羥甲基)-5-甲基噁唑啶-2-酮(化合物A13)或PCT公開案第WO2013/124826號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症或晚期實體腫瘤。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與p53及/或p53/Mdm2相互相用之抑制劑、(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-異丙基-5,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮(化合物A14)或PCT公開案第WO2013/111105號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，p53及/或p53/Mdm2相互作用抑制劑為(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-異丙基-5,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮(化合物A14)或PCT公開案第WO2013/111105號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-異丙基-5,6-二氫吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮(化合物A14)或PCT公開案第WO2013/111105號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症或軟組織肉瘤。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與CSF-1R酪胺酸激酶抑制劑、4-((2-(((1R,2R)-2-羥基環己基)胺基)苯并[d]噻唑-6-基)氧基)-N-甲基吡啶甲
醯胺(化合物A15)或PCT公開案第WO 2005/073224號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，CSF-1R酪胺酸激酶抑制劑為4-((2-(((1R,2R)-2-羥基環己基)胺基)苯并[d]噻唑-6-基)氧基)-N-甲基吡啶甲醯胺(化合物A15)或PCT公開案第WO 2005/073224號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與4-((2-(((1R,2R)-2-羥基環己基)胺基)苯并[d]噻唑-6-基)氧基)-N-甲基吡啶甲醯胺(化合物A15)或PCT公開案第WO 2005/073224號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與細胞凋亡誘導劑及/或血管生成抑制劑(諸如甲磺酸伊馬替尼(亦稱為GLEEVEC；化合物A16))或PCT公開案第WO1999/003854號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如所描述之病症。在一個實施例中，細胞凋亡誘導劑及/或血管生成抑制劑為甲磺酸伊馬替尼(化合物A16)或PCT公開案第WO1999/003854號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與甲磺酸伊馬替尼(化合物A16)或PCT公開案第WO1999/003854號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、多發性骨髓瘤、前列腺癌、非小細胞肺癌、淋巴瘤、胃癌、黑素瘤、乳癌、胰臟癌、消化道/胃腸道癌症、結腸直腸癌、多形性膠質母細胞瘤、肝癌、頭頸癌、哮喘、多發性硬化、過敏、阿茲海默氏癡呆、肌肉萎縮性側索硬化或類風濕性關節炎。在某些實施例中，以約100至1000mg，例如約200mg至800mg、約300mg至700mg或約400mg至600mg，例如約200mg、300mg、400mg、500mg、600mg或700mg之劑量投與甲磺酸伊馬替尼(化合物A16)。給藥時程可在例如每隔一天至每天、每天兩次或三次之範圍內變化。在一個實施例中，甲磺酸伊馬替尼係以每天約100mg至600mg之口服劑量投與，例如每天約100mg、200mg、
260mg、300mg、400mg或600mg。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與JAK抑制劑、2-氟-N-甲基-4-(7-(喹啉-6-基甲基)咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪-2-基)苯甲醯胺(化合物A17)或其二鹽酸鹽或PCT公開案第WO 2007/070514號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，JAK抑制劑為2-氟-N-甲基-4-(7-(喹啉-6-基甲基)咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪-2-基)苯甲醯胺(化合物A17)或其二鹽酸鹽，或PCT公開案第WO 2007/070514號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與2-氟-N-甲基-4-(7-(喹啉-6-基甲基)咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪-2-基)苯甲醯胺(化合物A17)或其二鹽酸鹽或PCT公開案第WO 2007/070514號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如結腸直腸癌、骨髓白血病、血液學癌症、自體免疫疾病、非霍奇金氏淋巴瘤或血小板增多症。在一個實施例中，JAK抑制劑或2-氟-N-甲基-4-(7-(唑啉-6-基甲基)咪唑并[1,2-b][1,2,4]三嗪-2-基)苯甲醯胺(化合物A17)或其二鹽酸鹽係以約400-600mg(例如每天)之劑量投與，例如約400、500或600mg或約400-500或500-600mg。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-或二-F-CDN化合物之組合)與JAK抑制劑、磷酸蘆可替尼(亦稱為JAKAFI；化合物A18)或PCT公開案第WO 2007/070514號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，JAK抑制劑為磷酸蘆可替尼(化合物A18)或PCT公開案第WO 2007/070514號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與磷酸蘆可替尼(化合物A18)或PCT公開案第WO 2007/070514號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如前列腺癌、淋巴球性白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、肺癌、白血病、惡病體質、乳癌、胰臟
癌、類風濕性關節炎、牛皮癬、結腸直腸癌、骨髓白血病、血液學癌症、自體免疫疾病、非霍奇金氏淋巴瘤或血小板增多症。在一個實施例中，JAK抑制劑或磷酸蘆可替尼(化合物A18)係以約15-25mg之劑量投與，例如每天兩次。在一些實施例中，劑量為約15、20或25mg，或約15-20或20-25mg。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑組合使用。在一些實施例中，HDAC抑制劑係選自由以下組成之群：帕比司他、伏立諾他(vorinostat)、羅米地辛(romidepsin)、西達本胺(chidamide)、丙戊酸、貝林諾他(belinostat)、吡咯沙敏(pyroxamide)、莫塞諾他(mocetinostat)、阿貝司他(abexinostat)、恩替諾特(entinostat)、普拉諾他(pracinostat)、雷米諾他(resminostat)、吉韋諾他(givinostat)、奎西諾他(quisinostat)、瑞科諾他(ricolinostat)、CUDC-101、AR-42、CHR-2845、CHR-3996、4SC-202及CG200745。在一些實施例中，包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合與組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑、帕比司他(化合物A19)或PCT公開案第WO 2014/072493號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，HDAC抑制劑為帕比司他(化合物A19)或PCT公開案第WO 2014/072493號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與帕比司他(化合物A19)、PCT公開案第WO 2014/072493號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如小細胞肺癌、呼吸道/胸腺癌、前列腺癌、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨癌、非小細胞肺癌、內分泌癌症、淋巴瘤、神經癌症、白血病、HIV/AIDS、免疫病症、移植排斥、胃癌、黑素瘤、乳癌、胰臟癌、結腸直腸癌、多形性膠質母細胞瘤、骨髓白血病、血液學癌症、腎癌、非霍奇金氏淋巴瘤、頭頸癌、
血細胞生成病症或肝癌。在一個實施例中，HDAC抑制劑或帕比司他(化合物A19)以約20mg之劑量(例如每天)投與。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與細胞色素P450(例如11B2)、醛固酮或血管生成中之一或多者之抑制劑、奧卓司他(化合物A20)或PCT公開案第WO2007/024945號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，細胞色素P450(例如11B2)、醛固酮或血管生成中之一或多者之抑制劑為奧卓司他(化合物A20)或PCT公開案第WO2007/024945號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與奧卓司他(化合物A20)或PCT公開案第WO2007/024945號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如庫欣氏症候群(Cushing's syndrome)、高血壓或心臟衰竭療法。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與IAP抑制劑、(S)-N-((S)-1-環己基-2-((S)-2-(4-(4-氟苯甲醯基)噻唑-2-基)吡咯啶-1-基)-2-側氧基乙基)-2-(甲基胺基)丙醯胺(化合物A21)或US 8,552,003中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，IAP抑制劑為(S)-N-((S)-1-環己基-2-((S)-2-(4-(4-氟苯甲醯基)噻唑-2-基)吡咯啶-1-基)-2-側氧基乙基)-2-(甲基胺基)丙醯胺(化合物A21)或美國專利8,552,003中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與(S)-N-((S)-1-環己基-2-((S)-2-(4-(4-氟苯甲醯基)噻唑-2-基)吡咯啶-1-基)-2-側氧基乙基)-2-(甲基胺基)丙醯胺(化合物A21)或美國專利8,552,003中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如多發性骨髓瘤、乳癌、卵巢癌、胰臟癌或血細胞生成病症。在一個實施例中，IAP抑制劑或(S)-N-((S)-1-環己基-2-((S)-2-(4-(4-氟苯甲醯基)噻唑-2-基)吡咯啶-1-基)-2-側氧基乙基)-2-(甲胺基)丙醯胺(化合物A21)或
US 8,552,003中揭示之化合物係以約1800mg之劑量投與，例如每週一次。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)組合斯莫森德(Smoothened；SMO)抑制劑、磷酸索尼蒂吉伯(化合物A22)、(R)-2-(5-(4-(6-苯甲基-4,5-二甲基噠嗪-3-基)-2-甲基哌嗪-1-基)吡嗪-2-基)丙-2-醇(化合物A25)或PCT公開案第WO 2007/131201號或第WO 2010/007120號中所揭示之化合物使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，SMO抑制劑為磷酸索尼蒂吉伯(化合物A22)、(R)-2-(5-(4-(6-苯甲基-4,5-二甲基噠嗪-3-基)-2-甲基哌嗪-1-基)吡嗪-2-基)丙-2-醇(化合物A25)或PCT公開案第WO 2007/131201號或第WO 2010/007120號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與磷酸索尼蒂吉伯(化合物A22)、(R)-2-(5-(4-(6-苯甲基-4,5-二甲基噠嗪-3-基)-2-甲基哌嗪-1-基)吡嗪-2-基)丙-2-醇(化合物A25)或PCT公開案第WO 2007/131201號或第WO 2010/007120號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、神經管胚細胞瘤、小細胞肺癌、前列腺癌、基底細胞癌、胰臟癌或炎症。在某些實施例中，磷酸索尼蒂吉(化合物A22)係以約20至500mg之劑量投與，例如約40mg至400mg、約50mg至300mg或約100mg至200mg，例如約50mg、100mg、150mg、200mg、250mg或300mg。給藥時程可在例如每隔一天至每天、每天兩次或三次之範圍內變化。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與Alk抑制劑、色瑞替尼(亦稱為ZYKADIA；化合物A23)或PCT公開案第WO 2007/131201號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，Alk抑制劑為色瑞替尼(化合物A23)或PCT公開案第WO 2007/131201號中
所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與色瑞替尼(化合物A23)或PCT公開案第WO 2007/131201號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如非小細胞肺癌或實體腫瘤。在一個實施例中，以約750mg，例如每天一次之劑量投與Alk抑制劑或色瑞替尼(化合物A23)。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與JAK及/或CDK4/6抑制劑、7-環戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醯胺(化合物A24)或美國專利8,415,355或美國專利8,685,980中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，JAK及/或CDK4/6抑制劑為7-環戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醯胺(化合物A24)或美國專利8,415,355或美國專利8,685,980中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與7-環戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醯胺(化合物A24)或US 8,415,355或US 8,685,980中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如淋巴瘤、神經癌症、黑素瘤、乳癌或實體腫瘤。在一個實施例中，JAK及/或CDK4/6抑制劑或7-環戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醯胺(化合物A24)以約200-600mg之劑量投與，例如每天。在一個實施例中，以約200、300、400、500或600mg，或約200-300、300-400、400-500或500-600mg之劑量投與化合物。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與PIM激酶抑制劑、N-(4-((1R,3S,5S)-3-胺基-5-甲基環己基)吡啶-3-基)-6-(2,6-二氟苯基)-5-氟吡啶甲醯胺(化合物A27)或PCT公開案第WO 2010/026124號中所揭示之化合物組合使用以
治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，PIM激酶抑制劑為N-(4-((1R,3S,5S)-3-胺基-5-甲基環己基)吡啶-3-基)-6-(2,6-二氟苯基)-5-氟吡啶甲醯胺(化合物A27)或PCT公開案第WO 2010/026124號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與N-(4-((1R,3S,5S)-3-胺基-5-甲基環己基)吡啶-3-基)-6-(2,6-二氟苯基)-5-氟吡啶甲醯胺(化合物A27)或PCT公開案第WO 2010/026124號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、骨髓白血病或非霍奇金氏淋巴瘤。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與Wnt訊息傳導抑制劑、2-(2',3-二甲基至[2,4'-二吡啶]-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙醯胺(化合物A28)或PCT公開案第WO 2010/101849號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，Wnt信號傳導抑制劑為2-(2',3-二甲基-[2,4'-二吡啶]-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙醯胺(化合物A28)或PCT公開案第WO 2010/101849號中所揭示之化合物。在一個實施例中，Wnt信號傳導抑制劑為2-(2',3-二甲基-[2,4'-二吡啶]-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙醯胺(化合物A28)。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與2-(2',3-二甲基至[2,4'-二吡啶]-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙醯胺(化合物A28)或PCT公開案第WO 2010/101849號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如實體腫瘤(例如頭頸癌、鱗狀細胞癌、乳癌、胰臟癌或結腸癌)。在某些實施例中，以約1至50mg，例如約2mg至45mg、約3mg至40mg、約5mg至35mg、5mg至10mg或約10mg至30mg，例如約2mg、5mg、10mg、20mg、30mg或40mg之劑量投與2-(2',3-二甲基-[2,4'-二吡啶]-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙醯胺(化合物A28)。給藥時程可在例如每隔一天至每天、每天兩次或三次之範圍內變化。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與BRAF抑制劑、恩拉菲尼(化合物A29)或PCT公開案第WO 2011/025927號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，BRAF抑制劑為恩拉菲尼(化合物A29)或PCT公開案第WO 2011/025927號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與恩拉菲尼(化合物A29)或PCT公開案第WO 2011/025927號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如非小細胞肺癌、黑素瘤或結腸直腸癌。在一個實施例中，BRAF抑制劑或恩拉菲尼(化合物A29)以約200-300、200-400或300-400mg之劑量例如每天投與。在一個實施例中，化合物係以約200、約300或約400mg之劑量投與。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與CDK4/6抑制劑、7-環戊基-N,N-二甲基-2-((5-((1R,6S)-9-甲基-4-側氧基-3,9-二氮雙環[4.2.1]壬-3-基)吡啶-2-基)胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醯胺(化合物A30)或PCT公開案第WO 2011/101409號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，CDK4/6抑制劑為7-環戊基-N,N-二甲基-2-((5-((1R,6S)-9-甲基-4-側氧基-3,9-二氮雙環[4.2.1]壬-3-基)吡啶-2-基)胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醯胺(化合物A30)或PCT公開案第WO 2011/101409號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與7-環戊基-N,N-二甲基-2-((5-((1R,6S)-9-甲基-4-側氧基-3,9-二氮雙環[4.2.1]壬-3-基)吡啶-2-基)胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-甲醯胺(化合物A30)或PCT公開案第WO 2011/101409號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、套細胞淋巴瘤、脂肪肉瘤、非小細胞肺癌、黑素瘤、鱗狀細胞食道癌或乳癌。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或
二-F-CDN化合物之組合)與MEK抑制劑、畢尼替尼(化合物A34)或PCT公開案第WO 2003/077914號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，MEK抑制劑為畢尼替尼(化合物A34)，或PCT公開案第WO 2003/077914號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與畢尼替尼(化合物A34)或PCT公開案第WO 2003/077914號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如非小細胞肺癌、多系統基因病症、黑素瘤、卵巢癌、消化道/胃腸道癌症、類風濕性關節炎或結腸直腸癌。在一個實施例中，MEK抑制劑或畢尼替尼(化合物A34)係以約45mg之劑量投與，例如每天兩次。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與c-KIT、組織胺釋放、Flt3(例如FLK2/STK1)或PKC中之一或多者之抑制劑、米哚妥林(化合物A35)或PCT公開案第WO 2003/037347號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，抑制劑為米哚妥林(化合物A35)或PCT公開案第WO 2003/037347號中所揭示之化合物。在一個實施例中，c-KIT、組織胺釋放、Flt3(例如FLK2/STK1)或PKC中之一或多者之抑制劑為米哚妥林。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與米哚妥林(化合物A35)或PCT公開案第WO 2003/037347號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、結腸直腸癌、骨髓白血病、骨髓發育不良症候群、年齡相關之黃斑變性、糖尿病併發症或皮膚病學病症。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與TOR抑制劑(例如mTOR抑制劑)、依維莫司(亦稱為AFINITOR；化合物A36)或PCT公開案第WO 2014/085318號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在
一個實施例中，TOR抑制劑為依維莫司(化合物A36)或PCT公開案第WO 2014/085318號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與依維莫司(化合物A36)組合使用以治療病症，諸如間質性肺病、小細胞肺癌、呼吸道/胸腺癌、前列腺癌、多發性骨髓瘤、肉瘤、年齡相關之黃斑變性、骨癌、結節性硬化症、非小細胞肺癌、內分泌癌症、淋巴瘤、神經病症、星形細胞瘤、子宮頸癌、神經癌症、白血病、免疫病症、移值排斥、胃癌、黑素瘤、癲癇症、乳癌或膀胱癌。在一個實施例中，以約2.5-20毫克/天之劑量投與TOR抑制劑或依維莫司(化合物A36)。在一個實施例中，該化合物係以每天約2.5、5、10或20mg之劑量投與，例如每天約2.5-5、5-10或10-20mg。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與VEGFR-2、PDGFRβ、KIT或Raf激酶C中之一或多者之抑制劑、1-甲基-5-((2-(5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)吡啶-4-基)氧基)-N-(4-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(化合物A37)或PCT公開案第WO 2007/030377號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，VEGFR-2、PDGFRβ、KIT或Raf激酶C中之一或多者之抑制劑為1-甲基-5-((2-(5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)吡啶-4-基)氧基)-N-(4-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(化合物A37)或PCT公開案第WO 2007/030377號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與1-甲基-5-((2-(5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)吡啶-4-基)氧基)-N-(4-(三氟甲基)苯基)-1H-苯并[d]咪唑-2-胺(化合物A37)或PCT公開案第WO 2007/030377號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、黑素瘤或實體腫瘤。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或
二-F-CDN化合物之組合)與生長抑素促效劑及/或生長激素釋放抑制劑、二天冬胺酸帕瑞肽(亦稱為SIGNIFOR；化合物A38)或PCT公開案第WO2002/010192號或美國專利第7,473,761號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，生長抑素促效劑及/或生長激素釋放抑制劑為二天冬胺酸帕瑞肽(化合物A38)或PCT公開案第WO2002/010192號或美國專利第7,473,761號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與二天冬胺酸帕瑞肽(化合物A38)或PCT公開案第WO2002/010192號或美國專利第7,473,761號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如前列腺癌、內分泌癌、神經癌症、皮膚癌(例如黑素瘤)、胰臟癌、肝癌、庫欣氏症候群、胃腸道病症、胺端肥大症、肝管及膽管病症或肝硬化。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與信號轉導調節劑及/或血管生成抑制劑、多韋替尼(化合物A39)或PCT公開案第WO 2009/115562號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，信號轉導調節劑及/或血管生成抑制劑為多韋替尼(化合物A39)或PCT公開案第WO 2009/115562號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與多韋替尼(化合物A39)或PCT公開案第WO 2009/115562號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、呼吸道/胸腺癌、多發性骨髓瘤、前列腺癌、至小細胞肺癌、內分泌癌症或神經基因病症。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與EGFR抑制劑、(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯基)氮雜環庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基異菸鹼醯胺(化合物A40)或PCT公開案第WO 2013/184757號中所揭示
之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，EGFR抑制劑為(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯基)氮雜環庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基異菸鹼醯胺(化合物A40)或PCT公開案第WO 2013/184757號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯基)氮雜環庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基異菸鹼醯胺(化合物A40)或PCT公開案第WO 2013/184757號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症，例如實體腫瘤。在一個實施例中，EGFR抑制劑或(R,E)-N-(7-氯-1-(1-(4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯基)氮雜環庚烷-3-基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-2-甲基異菸鹼醯胺(化合物A40)以150-250mg之劑量投與，例如每天。在一個實施例中，該化合物係以約150、200或250mg，或約150-200或200-250mg之劑量投與。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與ALK抑制劑、N6-(2-異丙氧基-5-甲基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)-N4-(2-(異丙磺醯基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(化合物A42)或PCT公開案第WO 2008/073687號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，ALK抑制劑為N6-(2-異丙氧基-5-甲基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)至N4-(2-(異丙磺醯基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(化合物A42)或PCT公開案第WO 2008/073687號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與N6-(2-異丙氧基-5-甲基-4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)-N4-(2-(異丙磺醯基)苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4,6-二胺(化合物A42)或PCT公開案第WO 2008/073687號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症、多形性大細胞淋巴瘤(ALCL)、非小細胞肺癌(NSCLC)或神經母細胞瘤。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與IGF-1R抑制劑、1,1-二氧化3-(4-(4-((5-氯-4-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-5-氟-2-甲基苯基)哌啶-1-基)硫雜環丁烷(化合物A43)、5-氯-N2-(2-氟-5-甲基-4-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)哌啶-4-基)苯基)-N4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物A44)或5-氯-N2-(4-(1-乙基哌啶-4-基)-2-氟-5-甲基苯基)-N4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物A45)或PCT公開案第WO 2010/002655號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如所描述之病症。在一個實施例中，IGF-1R抑制劑為1,1-二氧化3-(4-(4-((5-氯-4-((5甲基-1H-吡唑-3-基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-5-氟-2-甲基苯基)哌啶-1-基)硫雜環丁烷(化合物A43)、5-氯-N2-(2-氟-5-甲基-4-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)哌啶-4-基)苯基)-N4-(5甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物A44)、5-氯-N2-(4-(1-乙基哌啶-4-基)-2-氟-5-甲基苯基)-N4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物A45)或PCT公開案第WO 2010/002655號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與1,1-二氧化3-(4-(4-((5-氯-4-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-5-氟-2-甲基苯基)哌啶-1-基)硫雜環丁烷(化合物A43)、5-氯-N2-(2-氟-5-甲基-4-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)哌啶-4-基)苯基)-N4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物A44)、5-氯-N2-(4-(1-乙基哌啶-4-基)-2-氟-5-甲基苯基)-N4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物A45)或PCT公開案第WO 2010/002655號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症或肉瘤。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與P-糖蛋白1抑制劑、伐司撲達(亦稱為AMDRAY；化合物A46)或EP 296122中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，P-糖蛋白1抑
制劑為伐司撲達(化合物A46)或EP 296122中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與伐司撲達(化合物A46)或EP 296122中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症或耐藥性腫瘤。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與VEGFR抑制劑、丁二酸凡塔藍尼(化合物A47)或WO 98/35958中所揭示之化合物中之一或多者組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，VEGFR抑制劑為丁二酸凡塔藍尼(化合物A47)或WO 98/35958中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與丁二酸凡塔藍尼(化合物A47)或EP 296122中所揭示之化合物組合使用以治療癌症。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與IDH抑制劑或WO2014/141104中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，IDH抑制劑為PCT公開案第WO2014/141104號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與WO2014/141104中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與BCL-ABL抑制劑或PCT公開案第WO2013/171639號、第WO2013/171640號、第WO2013/171641號或第WO2013/171642號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，BCL-ABL抑制劑為PCT公開案第WO2013/171639號、第WO2013/171640號、第WO2013/171641號或第WO2013/171642號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與PCT公開案第WO2013/171639號、第WO2013/171640號、第WO2013/171641號或第WO2013/171642號中所
揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與c-RAF抑制劑或PCT公開案第WO2014/151616號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，c-RAF抑制劑為化合物A50或PCT公開案第WO2014/151616號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與PCT公開案第WO2014/151616號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症。
在另一實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與ERK1/2 ATP競爭性抑制劑或PCT公開案第WO2015/066188號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，例如本文中所描述之病症。在一個實施例中，ERK1/2 ATP競爭性抑制劑為PCT公開案第WO2015/066188號中所揭示之化合物。在一個實施例中，單-F-CDN或二-F-CDN化合物與化合物A51或PCT公開案第WO2015/066188號中所揭示之化合物組合使用以治療病症，諸如癌症。在一些實施例中，組合(例如包含本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)及化合物A51或PCT公開案第WO2015/066188號中所揭示之化合物與一或多種選自以下之藥劑組合投與：化合物A8、化合物A17、化合物A23、化合物A24、化合物A27、化合物A29及化合物A33。
在一些實施例中，組合(例如包含如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之組合)與在免疫細胞分析法(例如huMLR分析法、T細胞增殖分析法及B細胞增殖分析法中之一或多者)中具有已知活性之抗癌劑組合投與，其中此類分析法為此項技術中已知且可用於證明化合物將不會抑制免疫反應(亦即證明在此類分析法中存在極少或不存在抑制)。可測定待與單-F-CDN或二-F-CDN化合物組合使用之化合物
在此類分析法中之IC50。在實施例中，抗癌劑之IC50為例如>1μM、1-4μM或大於4μM，例如4-10μM或4-20μM，或大於20μM。在實施例中，第二治療劑選自以下中之一或多者：化合物A9、化合物A16、化合物A17、化合物A21、化合物A22、化合物A25、化合物28、化合物A48及化合物49。
在一些實施例中，以約5-10或10-30mg之劑量投與化合物A28(或與化合物A28相關的化合物)。在一些實施例中，化合物A22(或與化合物A22相關的化合物)係以約200mg之劑量投與。在一些實施例中，以約400-600mg之劑量投與化合物A17(或與化合物A17相關的化合物)。在一些實施例中，以每天約400-600mg之劑量經口投與化合物A16(或與化合物A16相關的化合物)。在一些實施例中，以約200-400或300-400mg之劑量投與化合物A29(或與化合物A29相關的化合物)。在一些實施例中，化合物A24(或與化合物A24相關的化合物)以約200-600mg之劑量投與。在一些實施例中，以約750mg之劑量每天一次地投與化合物A23(色瑞替尼)(或與色瑞替尼相關的化合物)。在一些實施例中，以約200-400或300-400mg之劑量投與化合物A8(或與化合物A8相關的化合物)。在一些實施例中，化合物A5(或與化合物A5相關的化合物)係以約100-125mg之劑量投與。在一些實施例中，化合物A6(或與化合物A6相關的化合物)係以約100mg之劑量投與。在一些實施例中，化合物A1(或與化合物A1相關的化合物)係以約200-300或200-600mg之劑量投與。在一些實施例中，以約150-250mg之劑量投與化合物A40(或與化合物A40相關的化合物)。在實施例中，以約400至700mg之劑量投與化合物A10(或與化合物A10相關的化合物)，例如每週投與三次(連續投與2週且暫停一週)。在實施例中，BCR-ABL抑制劑係以約20mg(每天兩次)-80mg(每天兩次)之劑量投與。
「不活化腫瘤細胞」意謂已經處理以防止細胞分裂之腫瘤細胞(對患者而言為「自體」或「同種異體」)。在本發明中，此類細胞保留其免疫原性及其代謝活性。此類腫瘤細胞經遺傳修飾以表現轉基因，其作為癌症療法之一部分在患者內表現。因此，本發明之組合物或疫苗包含贅生性(例如腫瘤)細胞，其對經歷治療之患者而言為自體或同種異體，且最佳為與折磨患者之腫瘤細胞具有相同一般類型。舉例而言，通常將向患有黑素瘤之患者投與來源於黑素瘤之經遺傳修飾之細胞。本發明中使用之用於不活化腫瘤細胞之方法(諸如使用輻射)為此項技術中所熟知。
在一些實施例中，本發明之不活化腫瘤細胞經修飾以表現及分泌一或多種熱休克蛋白質。舉例而言，可表現及分泌gp96-Ig融合蛋白質以刺激免疫反應(Yamazaki等人，The Journal of Immunology,1999,163：5178-5182；Strbo等人，Immunol Res.2013 Dec；57(1-3)：311-25)。在一些實施例中，不活化腫瘤細胞經修飾以表現及分泌gp96-Ig融合蛋白質。
本發明之不活化腫瘤細胞與一或多種共刺激分子或藥劑共同投
與患者。較佳共刺激藥劑包含一或多種細胞激素，其刺激樹突狀細胞誘導、補充及/或成熟。用於評估此類共刺激藥劑之方法已在文獻中熟知。通常藉由某些細胞膜分子(諸如CD80及CD86)之表現及/或促炎性細胞激素(諸如在刺激後IL-12及I型干擾素)之分泌增加來評估DC之誘導及成熟。
在較佳實施例中，不活化腫瘤細胞本身經修飾以表現及分泌一或多種細胞激素，其刺激樹突狀細胞誘導、補充及/或成熟。關於使用GM-CSF來例示性描述本發明。因此，作為實例，腫瘤細胞可表現編碼GM-CSF之轉基因，如美國專利第5,637,483號、第5,904,920號、第6,277,368號及第6,350,445號以及美國專利公開案第20100150946號中所描述。用於胰臟癌治療之表現GM-CSF之遺傳修飾癌細胞或「表現細胞激素之細胞疫苗」之形式描述於美國專利第6,033,674號及第5,985,290號中。
可代替GM-CSF或與GM-CSF共同由此類不活化腫瘤細胞及/或旁鄰細胞表現之其他適合的細胞激素包括(但不限於)CD40配位體、FLT-3配位體、IL-12、CCL3、CCL20及CCL21中之一或多者。此清單不意欲為限制性。
儘管較佳投與個體之不活化腫瘤細胞表現一或多種相關細胞激素，但腫瘤細胞株可伴有不活化旁鄰細胞株，其表現及分泌一或多種細胞激素，該一或多種細胞激素刺激樹突狀細胞誘導、補充及/或成熟。旁鄰細胞株可提供所有刺激樹突狀細胞誘導、補充及/或成熟之細胞激素，或可補充可刺激由不活化腫瘤細胞表現及分泌之樹突狀細胞誘導、補充及/或成熟之細胞激素。作為實例，表現免疫調節細胞激素之旁鄰細胞株揭示於美國專利第6,464,973號及第8,012,469號，Dessureault等人，Ann.Surg.Oncol.14：869-84,2007以及Eager及Nemunaitis,Mol.Ther.12：18-27,2005中。
「粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)多肽」意謂具有免疫調節活性及與GenBank寄存編號AAA52122.1具有至少約85%胺基酸序列一致性之細胞激素或其片段。
在某些實施例中，CDN組合物與一或多種意欲刺激針對一或多種預定抗原之免疫反應的疫苗結合投與。可用於本發明中之目標抗原之實例列舉於下表中。目標抗原亦可為包含表中列舉之抗原之免疫活性部分的片段或融合多肽。此清單不意欲為限制性。
此項技術中已知的適合的抗原之其他生物體包括(但不限於)沙眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A鏈球菌群)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactia)(B鏈球菌群)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、奈瑟氏腦膜炎菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、沙門氏菌(Salmonella)物種(包括傷寒(typhi)、鼠傷寒(typhimurium))、腸道(包括幽門螺桿菌福氏志賀菌(Helicobactor pylori Shigella flexneri)及其他D志賀桿菌屬(shigella)物種群)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、梭菌(Clostridium)物種(包括艱難梭菌(C.difficile))、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)及創傷弧菌(V.vulnificus)。此清單不意欲為限制性。
如本文所使用，術語「醫藥」係指意欲用於治癒、治療或預防疾病之化學物質且其經歷美國食品藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration)(或其非美國等效機構)之審批過程，作為處方或非處方藥品。關於用於此類組合物之調配及投藥之技術之詳細說明可見於Remington,The Science and Practice of Pharmacy第21版(Mack Publishing Co.,Easton,PA)以及Nielloud及Marti-Mestres,Pharmaceutical Emulsions and Suspensions：第2版(Marcel Dekker,Inc,
New York)中。
在本發明中，醫藥組合物可藉由多種手段投與，包括以含有醫藥學上可接受之載劑、佐劑及媒劑之調配物形式經腸、非經腸、藉由吸入噴霧、局部或經直腸進行。「腸胃外投藥」涵蓋經口、頰內、舌下、局部、經皮、經眼、經耳、經鼻、經直腸、經子宮頸、經肺、經黏膜及經陰道途徑。如此處所使用，術語非經腸包括(但不限於)藉由多種輸注技術進行之皮下、靜脈內、肌肉內、動脈內、皮內、鞘內及硬膜外注射。如本文所使用，動脈內及靜脈內注射包括經由導管投藥。亦涵蓋經由冠狀動脈內血管支架及冠狀動脈內儲集器投藥。本發明化合物之腫瘤內(直接進入腫瘤塊)或腫瘤周圍(腫瘤塊周圍)投藥可直接活化局部浸潤DC，直接促進腫瘤細胞之細胞凋亡或使腫瘤細胞對細胞毒素劑敏感。如本文所使用，術語經口包含(但不限於)口服攝取或藉由舌下或頰內途徑傳遞。經口投藥包括流體飲料、能量棒以及丸劑調配物。
醫藥組合物可呈任何適用於所欲投藥方法之形式。當用於例如經口使用時，可製備錠劑、糖衣錠、口含錠、水性或油性懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳液、硬或軟膠囊、糖漿或酏劑。可根據製造醫藥組合物之技術中已知的任何方法製備欲用於口服使用的組合物，且該等組合物可含有一或多種試劑，包括甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑，以便提供可口製劑。含有藥物化合物與適用於製造錠劑之無毒性醫藥學上可接受之賦形劑之混雜物的錠劑為可接受的。此等賦形劑可為例如惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣或碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化及崩解劑，諸如玉米澱粉或褐藻酸；結合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；及潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可未包覆包衣，或可藉由已知技術經塗佈，包括腸包衣、結腸包衣或微囊封裝以延緩在胃腸道中之崩解及吸收及/或在更長週期內提供持續作用。
舉例而言，可單獨或伴以蠟使用諸如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯之時間延遲材料。
用於經口使用之調配物亦可呈硬明膠膠囊形式，其中藥物化合物與惰性固體稀釋劑(例如磷酸鈣或高嶺土)混合，或呈軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油介質(諸如花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。
醫藥組合物可與適用於製造水性懸浮液之賦形劑摻合，調配為水性懸浮液。此類賦形劑包括懸浮劑，諸如羧基甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、膠狀黃蓍及阿拉伯膠(gum acacia)；及分散或濕潤劑，諸如天然存在之磷脂(例如卵磷脂)、環氧烷與脂肪酸之縮合產物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、環氧乙烷與長鏈脂族醇之縮合產物(例如十七伸乙基氧鯨蠟醇)、環氧乙烷與衍生自脂肪酸之偏酯及己糖醇酐之縮合產物(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。水性懸浮液亦可含有一或多種防腐劑，諸如對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯；一或多種著色劑；一或多種調味劑及一或多種甜味劑，諸如蔗糖或糖精。
油性懸浮液可藉由使活性成分懸浮於植物油(諸如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)中或礦物油(諸如液體石蠟)中來調配。口服懸浮液可含有增稠劑，諸如蜂蠟、硬鏈烷烴或鯨蠟基醇。可添加甜味劑(諸如上述甜味劑)及調味劑，以提供可口的口服製劑。此等組合物可藉由添加抗氧化劑(諸如抗壞血酸)來保存。
適用於藉由添加水來製備水性懸浮液之本發明之分散性散劑及粒劑提供活性成分與分散劑或濕潤劑、懸浮劑及一或多種防腐劑之摻合物。適合之分散劑或濕潤劑及懸浮劑由上文已揭示之試劑例示。亦可存在其他賦形劑，例如甜味劑、調味劑以及著色劑。
本發明之醫藥組合物亦可呈水包油乳液形式。油相可為植物
油，諸如橄欖油或花生油，礦物油，諸如液體石蠟，或此等物質之混合物。適合的乳化劑包括天然存在之膠質，諸如阿拉伯膠及黃蓍膠；天然存在之磷脂，諸如大豆卵磷脂；來源於脂肪酸及己糖醇酐之酯或偏酯，諸如脫水山梨糖醇單油酸酯；及此等偏酯與環氧乙烷之縮合產物，諸如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。乳液亦可含有甜味劑及調味劑。
糖漿劑及酏劑可使用甜味劑(諸如甘油、山梨糖醇或蔗糖)一起調配。此類調配物亦可含有緩和劑、防腐劑、調味劑或著色劑。
本發明之醫藥組合物可呈無菌可注射製劑形式，諸如無菌可注射水性或油性懸浮液。此懸浮液可根據已知技術使用上文已提及之適合的分散劑或濕潤劑及懸浮劑調配。無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，諸如於1,3-丁二醇中之溶液；或製備成凍乾粉末。在可採用之可接受媒劑及溶劑中有水、林格氏溶液(Ringer's solution)及等張氯化鈉溶液。此外，無菌非揮發性油可習知地用作溶劑或懸浮介質。出於此目的，可使用任何溫和非揮發性油，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。此外，諸如油酸之脂肪酸亦可用於製備可注射劑。
可與載劑材料組合產生單一劑型之活性成分的量將視所治療之主體及特定投藥模式而變化。舉例而言，欲用於向人類經口投與之時間釋放調配物可含有約20至500mg活性材料與適當且適宜量之載劑材料的混配物，該量可在總組合物之約5%至約95%範圍內變化。較佳的是，製備可提供可易於量測之投藥量的醫藥組合物。典型地，全身性投與之有效量為約0.1mg/kg至約100mg/kg且取決於許多因素，包括例如個體(例如哺乳動物，諸如人類)之年齡及體重、需要治療之確切病狀及其嚴重度、投藥途徑，且將最終由臨床醫師或獸醫酌情處理。然而，應理解，任何特定患者之特定劑量水準將取決於多種因素，包
括所使用之特定化合物之活性、所治療之個體之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食；投藥時間及途徑；排泄率；先前投與之其他藥物；及經歷療法之特定病狀之嚴重度，如熟習此項技術者良好理解。
如上所述，適用於經口投藥之本發明之調配物可以離散單位形式呈現，諸如膠囊、扁囊劑或錠劑，各含有預定量之活性成分；呈粉末或顆粒形式；呈水性液體或非水性液體中之溶液或懸浮液形式；或呈水包油液體乳液或油包水液體乳液形式。醫藥組合物亦可以藥丸、舐劑或膏劑形式投與。
錠劑可藉由視情況與一或多種附屬成分一起壓縮或模製來製造。壓縮錠劑可藉由在適合的機器中壓縮呈自由流動形式之活性成分(諸如粉末或顆粒)來製備，視情況與黏結劑(例如聚維酮、明膠、羥基丙基乙基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羥基乙酸澱粉鈉、交聯聚維酮、交聯羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑混合。可藉由在適合的機器中使用經惰性液體稀釋劑濕潤之粉末狀化合物之混合物來製造模製錠劑。錠劑可視情況經塗佈或刻痕，且可使用例如不同比例之羥丙基甲基纖維素調配以提供其中活性成分之緩慢或控制釋放，以提供所需釋放特徵曲線。錠劑可視情況具有腸溶性或結腸包衣以提供在除胃以外的腸之部分的釋放。此在如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物情況下(當此類化合物對酸水解敏感時)尤其有利。
適用於在口腔中局部投與之調配物包括在調味基質(通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍)中包含活性成分的口含錠；在惰性基質(諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠)中包含活性成分之片劑；及在適合液體載劑中包含活性成分的漱口劑。
用於經直腸投與之調配物可以具有適合基質(包含例如可可脂或水楊酸酯)之栓劑形式呈現。
適用於經陰道投與之調配物可以子宮托、棉塞、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧調配物形式呈現，除了含有活性成分以外，其亦含有諸如此項技術中已知為適當之載劑。
適於非經腸投與之調配物包括可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者血液等張之溶質的水性及非水性無菌注射溶液；及可包括懸浮劑及增稠劑之水性及非水性無菌懸浮液。調配物可呈單位劑量或多劑量密封容器形式，例如安瓿及小瓶，且可儲存於冷凍乾燥(凍乾)條件中，僅需要在即將使用之前添加無菌液體載劑，例如注射用水。注射溶液及懸浮液可由先前所描述之類型的無菌粉末、顆粒及錠劑製備。
當藉由結構命名或描繪所揭示之化合物或其鹽時，應理解，該化合物或鹽(包括其溶劑合物(特定言之，水合物))可以結晶形式、非結晶形式或其混合物形式存在。化合物或鹽或其溶劑合物(特定言之，水合物)亦可呈現多形現象(亦即以不同結晶形式存在之能力)。此等不同結晶形式通常稱為「多晶型物」。應理解，當藉由結構命名或描繪時，所揭示之化合物或其溶劑合物(特定言之，水合物)亦包括其所有多晶型物。多晶型物具有相同化學組成，但在填料、幾何配置及結晶固體狀態之其他描述性特性方面不同。多晶型物可具有不同物理性質，諸如密度、形狀、硬度、穩定性及溶解特性。多晶型物通常呈現不同熔點、IR譜圖及X射線粉末繞射圖，其可用於進行鑑別。一般熟習此項技術者將瞭解，可例如藉由改變或調節在化合物之結晶或再結晶期間所使用之條件來產生不同多晶型物。
對於呈結晶形式之本發明化合物或其鹽之溶劑合物，熟習此項技術者將瞭解，可形成醫藥學上可接受之溶劑合物，其中溶劑分子在結晶期間併入結晶晶格中。溶劑合物可涉及非水性溶劑，諸如乙醇、異丙醇、二甲亞碸、乙酸、乙醇胺及乙酸乙酯，或其可涉及水作為併
入結晶晶格中之溶劑。其中水為併入結晶晶格中之溶劑的溶劑合物通常稱為「水合物」。水合物包括化學計量之水合物以及含有可變量之水的組合物。本發明包括所有此類溶劑合物。
由於在醫藥中之潛在用途，本發明化合物之鹽較佳為醫藥學上可接受的。適合的醫藥學上可接受之鹽包括由P.Heinrich Stahl及Camille G.Wermuth於Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use，第2版(Wiley-VCH：2011)以及Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(Mack Publishing,Easton PA：1990)以及Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(Mack Publishing,Easton PA：1995)中描述之鹽。術語「醫藥學上可接受之鹽」涵蓋之鹽係指本發明中化合物之無毒性鹽。
含有鹼性胺或其他鹼性官能基之本發明化合物之鹽可藉由此項技術中已知的任何適合的方法製備，包括用無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物)或用有機酸(諸如乙酸、三氟乙酸、順丁烯二酸、丁二酸、杏仁酸、反丁烯二酸、丙二酸、甲酸、褐藻酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、柳酸、哌喃并甲矽烷基酸(諸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羥基酸(諸如檸檬酸或酒石酸)、胺基酸(諸如天冬胺酸或麩胺酸)、芳族酸(諸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(諸如對甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸))或其類似物處理游離鹼。醫藥學上可接受之鹽之實例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙炔酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、丁二酸鹽、辛二酸鹽、癸二酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、丁-1,4-二酸鹽、己-1,6-二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、鄰酞酸鹽、苯乙酸鹽、苯丙酸鹽、苯基丁酸鹽、檸檬酸
鹽、乳酸鹽、乙醇酸鹽、樹脂酸鹽、乳酸鹽、右旋樟腦磺酸鹽、酒石酸鹽、扁桃酸鹽及磺酸鹽，諸如二甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、丙磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽及萘-2-磺酸鹽。
含有磷酸二酯、硫代磷酸二酯或其他酸性官能基之本發明化合物之鹽可藉由與適合的鹼反應來製備。醫藥學上可接受之鹽包括(但不限於)：乙酸鹽、吡啶、銨、哌嗪、二乙胺、菸鹼醯胺、甲酸、脲、鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鋰、肉桂酸、甲基胺基、甲磺酸、苦酸、酒石酸、三乙基胺基、二甲基胺基及參(羥基甲基)胺基甲烷。其他醫藥學上可接受之鹽為熟習此項技術者已知的。
此類醫藥學上可接受之鹽可用具有醫藥學上可接受之陽離子的鹼製得，其包括鹼金屬鹽(尤其鈉及鉀)、鹼土金屬鹽(尤其鈣及鎂)、鋁鹽及銨鹽、鋅，以及由生理學上可接受之有機鹼製成之鹽，該等鹼為諸如二乙胺、異丙胺、乙醇胺、二苯甲基乙二胺(benzathine)、苯甲基苯乙胺(benethamine)、緩血酸胺(2-胺基-2-(羥基甲基)丙-1,3-二醇)、嗎啉、依泊胺、哌啶、哌嗪、甲基吡啶、二環己胺、N,N'-二苯甲基乙二胺、2-羥乙胺、三-(2-羥基乙基)胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、丹醇(deanol)、咪唑、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、普魯卡因(procaine)、二苯甲基哌啶、去氫松香胺(dehydroabietylamine)、葡糖胺、三甲基吡啶、奎寧(quinine)、喹諾酮、第三丁胺(erbumine)及鹼性胺基酸，諸如離胺酸及精胺酸。
如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物(包括其鹽)可由其中磷酸或硫代磷酸鍵中之-SH或-OH(例如如本文中所描述之式I化合物之R5或R6)表示為-S-或-O-且具有相應陽離子以形成如本文中所描述之化合物之鹽的結構描述。舉例而言，如本文中所描述之第三態樣之式II化合物之鹽可由以下結構表示：
其中Ay+表示單價或多價鹽陽離子，且n及m為既定y之最低可能整數。舉例而言，當Ay+為單價時，亦即當y為1時，諸如Na+、K+、NH4 +、TEAH+或其類似物，n為1且m為2；當y為2時，諸如Ca2+、Mg2+及其類似物，n為1且m為1；當y為3時，例如Al3+或其類似物，n為3且m為2。舉例而言，單價或二價鹽陽離子之鹽可分別表示為
或在其中n=1之情況下，此等鹽可例如表示為(無方括號)，
或者，單價鹽可由與-S-或-O-中之每一者相鄰之A+描繪。舉例而言，如本文中所描述之式II之單-F-RR-CDN或二-F-RR-CDN化合物可
描繪為
在一些情況下，化合物亦可包括2'OH基團之鹽，例如式II化合物之參-三乙銨鹽(例如其中R19為F且R20為OH)可具有以下表示之結構
其他非醫藥學上可接受之鹽(例如三氟乙酸鹽或三乙銨)可用於例如分離本發明之化合物，且包括於本發明之範疇內。
本發明在其範疇內包括本發明化合物之鹽之所有可能的化學計量及非化學計量形式。
若以鹽形式分離含有鹼性胺或其他鹼性官能基之本發明化合物，則該化合物之相應游離鹼形式可藉由此項技術中已知的任何適合
的方法製備，包括用無機鹼或有機鹼處理鹽，宜使用與化合物之游離鹼形式相比具有較高pKa之無機鹼或有機鹼。類似地，若以鹽形式分離含有磷酸二酯、硫代磷酸二酯或其他酸性官能基之本發明化合物，則可藉由此項技術中已知的任何適合的方法製備該化合物之相應游離酸形式，包括用無機酸或有機酸處理鹽，宜使用與化合物之游離酸形式相比具有較低pKa之無機酸或有機酸。
對於特定患者，如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物之有效量可視諸如所治療之病狀、患者之整體健康狀況、投藥途徑及劑量以及副作用之嚴重度而變化。可獲得治療及診斷方法之指導(參見例如Maynard等人，(1996)A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK)。
有效量可在一次給藥中提供，但不限於一次給藥。因此，投藥可為如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醫藥學上可接受之溶劑合物或醫藥學上可接受之水合物之兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或二十次以上投藥。當本發明方法中存在醫藥組合物之一次以上投藥時，各次投藥可間隔一分鐘、兩分鐘、三分鐘、四分鐘、五分鐘、六分鐘、七分鐘、八分鐘、九分鐘、十分鐘或十分鐘以上之時間間隔，間隔約一小時、兩小時、三小時、四小時、五小時、六小時、七小時、八小時、九小時、十小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、24小時等。在小時之情形下，術語「約」
意謂加上或減去30分鐘內的任何時間間隔。投藥亦可間隔一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天之時間間隔及其組合。本發明不限於等時間間隔之給藥間隔，且涵蓋非等間隔給藥。
本發明可使用例如一次/週、兩次/週、三次/週、四次/週、五次/週、六次/週、七次/週、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次及其類似時程之給藥時程。給藥時程涵蓋在例如一週、兩週、三週、四週、五週、六週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月及十二個月之總時間段內給藥。
提供以上給藥時程之循環。可例如以約每七天；每14天；每21天；每28天；每35天；42天；每49天；每56天；每63天；每70天；及其類似時間重複循環。循環之間可存在非給藥間隔，其中該間隔可為約例如七天；14天；21天；28天；35天；42天；49天；56天；63天；70天；及其類似時間段。在此情形中，術語「約」意謂加上或減去一天、加上或減去兩天、加上或減去三天、加上或減去四天、加上或減去五天、加上或減去六天或加上或減去七天。
用於與其他治療劑共同投藥之方法為此項技術中所熟知(Hardman等人(編)(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill,New York,NY；Poole及Peterson(編)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA；Chabner及Longo(編)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams & Wilkins,Phila.,PA)。通常，共同投藥或一起投藥表示用兩種或兩種以上藥劑治療個體，其中該等藥劑可同時或在不
同時間投與。舉例而言，此類藥劑可以單獨投藥形式傳遞至單一個體，該等單獨投藥可在實質上相同時間或不同時間進行，且其可藉由相同投藥途徑或不同投藥途徑進行。此類藥劑可在同一次投藥(例如同一調配物)中傳遞至單一個體，使得其同時藉由相同投藥途徑投與。
如所述，本發明之組合物較佳調配為用於非經腸或經腸傳遞之醫藥組合物。用於向動物個體投藥之典型醫藥組合物包含醫藥學上可接受之媒劑，諸如水溶液、無毒性賦形劑，包括鹽、防腐劑、緩衝劑及其類似物。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第15版，Easton編，Mack Publishing Co.，第1405-1412頁及第1461-1487頁(1975)；The National Formulary XIV，第14版，American Pharmaceutical Association,Washington,DC(1975)。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油及可注射有機酯，諸如乙基油酸酯。水性載劑包括水、醇性/水性溶液、生理食鹽水溶液、非經腸媒劑，諸如氯化鈉、林格氏右旋糖等。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑。防腐劑包括抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體。根據此項技術中之常規技術調節醫藥組合物中各種組分之pH值及精確濃度。
已證實特定疫苗之重複投藥(同源強化)對強化體液反應有效。此類方法在強化細胞免疫時可能無效，因為針對載體之先前免疫性傾向於減弱穩固的抗原呈現及適合的發炎性信號之產生。一種避免此問題之方法為依序投與使用不同抗原傳遞系統之疫苗(異源強化)。在異源強化療程中，至少一個引發或強化傳遞包含傳遞本文中所描述之不活化腫瘤細胞/單-F-CDN或二-F-CDN化合物或其組合物。療程之異源臂可包含使用以下策略中之一或多者傳遞抗原：包含相關抗原之不活化或滅毒細菌或病毒，其為已用某種變性條件處理以使其在安裝病原性侵襲中無效或低效之粒子；
經純化之抗原，其為自病原體或含有病原體之組織樣品之細胞培養物純化之典型地天然產生之抗原，或其重組型版本；活病毒或細菌傳遞載體，其以重組方式經工程改造以在個體之宿主細胞中表現及/或分泌抗原。此等策略依賴於將病毒或細菌載體滅毒(例如經由基因工程改造)使其成為非病原性及無毒性；抗原呈現細胞(APC)載體，諸如樹突狀細胞(DC)載體，其包含負載有抗原或經包含編碼抗原之核酸之組合物(例如Provenge®(Dendreon Corporation))轉染的細胞，其用於治療抗去勢性轉移性前列腺癌；脂質抗原傳遞媒劑；及裸DNA載體及裸RNA載體，其可藉由基因槍、電致孔、細菌菌蛻、微粒、微米粒子、脂質體、聚陽離子奈米粒子及其類似物投與。
引發疫苗及強化疫苗可藉由以下途徑中之任一種或組合投與。在一個態樣中，引發疫苗及強化疫苗藉由相同途徑投與。在另一態樣中，引發疫苗及強化疫苗藉由不同途徑投與。術語「不同途徑」涵蓋(但不限於)身體上之不同位點，例如口腔、非口腔、腸內、腸胃外、直腸、節結內(淋巴結)、靜脈內、動脈、皮下、肌肉內、腫瘤周圍、腫瘤內、輸注、黏膜、鼻、腦脊髓空間或腦脊髓液中之位點等，以及藉由不同模式，例如經口、靜脈內及肌肉內。
引發或強化疫苗之有效量可在一次給藥中提供，但不限於一次給藥。因此，投藥可為疫苗之兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、十五次、十六次、十七次、十八次、十九次、二十次或二十次以上投藥。當存在疫苗之一次以上投藥時，各次投藥可間隔一分鐘、兩分鐘、三分鐘、四分鐘、五分鐘、六分鐘、七分鐘、八分鐘、九分鐘、十分鐘或十分鐘以上之時間間隔，間隔約一小時、兩小時、三小時、四小
時、五小時、六小時、七小時、八小時、九小時、十小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、24小時等。在小時之情形下，術語「約」意謂加上或減去30分鐘內的任何時間間隔。投藥亦可間隔一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天之時間間隔及其組合。本發明不限於等時間間隔之給藥間隔，且涵蓋非等間隔給藥，諸如由在第1天、第4天、第7天及第25天投藥組成之引發時程，僅為了提供非限制性實例。
以下實例用於說明本發明。此等實例不意欲限制本發明之範疇。
適用於溶液相寡核苷酸合成之無水溶劑及試劑購自商業供應商(Aldrich,ChemGenes Corporation,Wilmington,MA,USA)且使用無水技術在乾燥氬氣或氮氣下操作。胺基磷酸酯偶合反應及H-膦酸酯環化反應在氬氣或氮氣下，在無水乙腈或吡啶中進行。除非另外規定，否則乾燥吡啶中所有反應之起始物質藉由自吡啶濃縮(三次)來乾燥。除非以下實例中另外規定，否則層析條件如下。使用甲醇/二氯甲烷之梯度，在Combiflash Rf+ UV-Vis(Teledyne Isco)上使用RediSep Rf二氧化矽管柱(Teledyne Isco,Lincoln,NE)，在中壓層析(MPLC)下進行製備型矽膠急驟層析。使用乙腈於10mM TEAA水溶液中之梯度，在Combiflash Rf+ UV-Vis上使用RediSep Rf C18 Aq管柱(Teledyne Isco)在MPLC條件下進行逆相製備型層析。在具有兩個LC-20AD泵及在254nm下監測之SPD-M30A光電二極體陣列偵測器之Shimadzu Prominence HPLC系統上進行分析型高壓液相層析(HPLC)。在室溫下使用含10
mM TEAA之乙腈或含20mM NH4OAc之乙腈之梯度以及5微米(Thermo Scientific Acclaim 120)C-18管柱(4.6×250mm)或10微米(Thermo Scientific Hypersil)C-18管柱(4.0×250mm)。在50ml/min之流動速率下使用10mM TEAA及乙腈之梯度，在配備有在Varian Microsorb 60-8 C-18 41.6×250mm管柱上在254nm下監測之SPD-20A UV/Vis偵測器的Shimadzu製備型LC20-AP HPLC系統上進行製備型HPLC。在3%(重量/重量)負載下進行使用C-18 Sep-Pak(Waters)之固相萃取。使用電噴霧電離源(ESI)，使用與Shimadzu LCMS-2020單四極質譜儀耦合之具有Prominence HPLC之Shimadzu LCMS系統記錄分析型LCMS。
在作為溶劑之CDCl3、d6-DMSO、CD3OD或D2O中記錄1H NMR、19F NMR、31P NMR及13C NMR譜圖。1H之操作頻率為400MHz，19F為376MHz，31P為162MHz且13C為100MHz。除非另外說明，否則在環境溫度下(20-25℃)下記錄所有譜圖。使用C.Amman,P.Meier及A.E.Merbach,J.Magn.Reson. 1982,46,319-321中描述之乙二醇方法每月或每兩月一次校準可變溫度實驗之溫度。
最終化合物可以三乙銨(TEAH+或Et3NH+)鹽之形式存在，其可使用標準離子交換技術或其他熟知方法轉化成其他鹽形式(包括(但不限於)鈉(Na+)或銨(NH4 +))。
與文獻方法(Zhao等人Nucleosides,Nucleotides,and Nucleic Acid 289：352-378,2009)類似或如以下實例中所論述進行磷處立體化學之指派。
使用可自CambridgeSoft Corporation,100 CambridgePark Drive,Cambridge,MA 02140 USA(http：//www.cambridgesoft.com)購得之軟體程式ChemBioDraw Ultra V 14.0產生化合物名稱。實例中使用之化合物或參考化合物之簡略名稱亦提供於以下表3中。根據如PCT公開案
第WO2014/093936號中所描述之方法製備參考化合物3'3'-RR-(G)(A)、3'3'-RR-(G)(G)及3'3'-RR-(A)(A)，其關於此類合成以引用的方式併入本文中。實例中之結構亦可表示為鹽，例如-O-A+或-S-A+，其中A+為鹽陽離子。
縮寫及字首語。SalPCl=氯磷酸柳基酯(2-氯-4H-苯并[d][1,3,2]二氧磷雜苯-4-酮)。DCA=二氯乙酸。DDTT=3-((N,N-二甲基-胺基亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮。DAST=三氟化二乙基胺基硫。NaHCO3=碳酸氫鈉。DCM=CH2Cl2=二氯甲烷。EtOH=乙醇。EtOAc=乙酸乙酯。KOAc=乙酸鉀。MeCN=乙腈。MeOH=甲醇。NH4OAc=乙酸銨。DMAP=N,N-二甲基吡啶-4-胺。DMOCP=2-氯-5,5-二甲基-1,3,2-二氧磷雜環己烷-2-氧化物。DMTCl=4,4'-二甲氧基三苯甲基氯。DMT=4,4-二甲氧基三苯甲基。N-苯基三氟醯胺=1,1,1-三氟-N-苯基-N-((三氟甲基)磺醯基)甲磺醯胺。TBAF=氟化四丁銨。TBS=第三丁基二甲基矽烷基。TEAA=乙酸三乙銨。TEA=三甲胺。TEAH+=三乙銨。TEAB=碳酸氫三乙基銨。TFA=三氟乙酸。TMSCl=氯化三甲基矽烷。HF=氫氟酸。THF=四氫呋喃。G=鳥嘌呤。Gib=異丁醯基鳥嘌呤。A=腺嘌呤。ABz=苯甲醯基腺嘌呤。AMA=氫氧化銨/40%甲胺水溶液。
根據以下流程1製備5,12-二氧化(2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-2,9-雙(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,10-二氟-5,12-二巰基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔(6)，亦稱為3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-A(3',5')p-2'F-A(3',5')p]，及5,12-二氧化(2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12S,14aR)-2,9-雙(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,10-二氟-5,12-二巰基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔(6a)，3'3'-RS-(2'F-A)(2'F-A)或二硫基-(Rp,Sp)-環狀-[2'F-A(3',5')p-2'F-A(3',5')p]。
步驟1：製備(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-2-(經基甲基)四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(2)：向N-(9-((2R,3R,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-氟-4-經基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺(1，2.0g，3.0mmol，ChemGenes)於1,4-二噁烷(25mL)及吡啶(8mL)中之溶液中添加SalPCl(0.84g，4.1mmol)於1,4-二噁烷(12mL)中之溶液。在30分鐘之後，在室溫下將水(4mL)引入經攪拌之反應混合物，且將所得混合物倒入1N NaHCO3水溶液(100mL)中。此水性混合物用EtOAc(3×100mL)萃取且分配各層。合併EtOAc萃取物且在真空中濃縮至乾燥，得到無色發泡體。無色發泡體溶解於CH2Cl2(30mL)中，得到無色溶液。向此溶液中添加水(0.5mL)及DCA於CH2Cl2中之6%(v/v)溶液(30mL)。在室溫下攪拌十分鐘之後，向紅色溶液中添加吡啶(3.5mL)。所得白色混合物在真空中濃
縮且在與MeCN(30mL)一起濃縮之後以共沸物形式移除水。用MeCN(30mL)再重複此共沸過程兩次。在最後一次蒸發後，所得化合物2之白色漿料留存於MeCN(15mL)中。
步驟2：製備(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氫呋喃-3-基)氧基)(2-氰基乙氧基)硫磷醯基)氧基)甲基)-4-氟四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(4)：(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基胺基磷酸酯(3，2.5g，2.9mmol，ChemGenes)於MeCN(20mL)中之溶液經由在真空中濃縮來乾燥。再重複此過程兩次以便以共沸物形式移除水。在最後一次共沸後，將十個3Å分子篩引入化合物3於MeCN(7mL)中之溶液且溶液儲存在氮氣氛圍下。向化合物2與殘餘二氯乙酸吡啶-1-鎓於MeCN(15mL)中之攪拌混合物中添加化合物3於MeCN(7mL)中之溶液。在五分鐘之後，向攪拌混合物中添加DDTT(650mg，3.2mmol)。在30分鐘之後，在真空中濃縮黃色混合物得到呈黃色油狀之化合物4。
步驟3：製備N,N'-(((2R,3R,3aR,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-5-(2-氰基乙氧基)-3,10-二氟-12-巰基-12-氧離子基-5-硫離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2,9-二基)雙(9H-嘌呤-9,6-二基))二苯甲醯胺(5)：向化合物4於CH2Cl2(60mL)中之溶液中添加水(0.35mL)及DCA於CH2Cl2中之6%(v/v)溶液(60mL)。在室溫下十分鐘之後，將吡啶(20mL)引入紅色溶液。在真空中濃縮所得黃色混合物直至殘留約20mL黃色混合物。將吡啶(20mL)引入黃色混合物且在真空中濃縮混合物，直至殘留約20mL黃色混合物。向黃色混合物中添加吡啶(30mL)且在真空中濃縮混合物，直至殘留約30mL黃色混合物。向經攪拌之含黃色混合物之吡啶(30mL)中添加
DMOCP(1.6g，8.4mmol)。在七分鐘之後，向深橙色溶液中添加水(1.4mL)，緊接著引入3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮(0.71mg，4.2mmol)。在五分鐘之後，將深橙色溶液倒入1N NaHCO3水溶液(400mL)中。在十分鐘之後，兩相混合物用EtOAc(200mL)及乙醚(200mL)萃取。在分離之後，水層用EtOAc(200mL)及乙醚(200mL)反萃取。合併有機萃取物且真空濃縮。向經濃縮之黃色油中添加甲苯(75mL)且在真空中蒸發混合物以移除殘餘吡啶。用甲苯(75mL)重複此程序兩次。所得油藉由矽膠層析(0%至10% MeOH/CH2Cl2)純化以提供呈橙色油狀之化合物5(67mg，2.5%產率)。
步驟4：製備3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)(6)及3'3'-RS-(2'F-A)(2'F-A)(6a)：向化合物5(65mg，0.07mmol)於MeOH(0.9mL)中之攪拌溶液中添加氫氧化銨水溶液(0.9mL)且在50℃下加熱橙色漿料。在兩小時之後，使橙色溶液冷卻且真空濃縮。藉由逆相矽膠層析(0%至30% MeCN/10mM TEAA水溶液)純化橙色殘餘物，在凍乾之後獲得呈白色單三乙銨鹽形式之化合物6(18mg，38%產率)。LCMS-ESI：693.25[M-H]-(C20H22F2N10O8P2S2之計算值：694.305)；Rt：16.698' min，藉由HPLC條件(10mM TEAA,2%至20%)；Rt：20.026'.min，藉由LCMS條件(20mM NH4OAc,2%至20%)。1H NMR(400MHz,45℃,D2O)δ 8.44(s,2H),8.24(s,2H),6.52(d,J=16.4Hz,2H),5.80(d,J=3.6Hz,1H),5.67(d,J=4.0Hz,1H),5.37-5.26(m,2H),4.77-4.65(m,4H),4.22(dd,J=11.4Hz,6.0Hz,2H),3.34(q,J=7.0Hz,6H),1.43(t,J=7.0Hz,9H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -200.74至-200.98(m)。31P NMR(45℃,D2O)δ 54.46。如流程1中所描繪，藉由結合於野生型STING蛋白質之共晶體結構確認此化合物之立體化學。
亦製備化合物6之鈉鹽。將Bio-Rad's AG® 50W-X2樹脂(目錄號143-5241，生物技術級，100-200篩目，氫形式，CAS 69011-20-7)裝
載至來自Bio-Rad(Bio-Spin，目錄號732-6008)之小型微管柱(1mL容量)上達到微管柱上之0.2標記。樹脂用密理博(millipore)過濾水(0.5mL)浸沒五次且使所得水洗液在重力下流動通過。丟棄洗液。樹脂用2mL 1N氫氧化鈉水溶液處理。隨後，經冷凝之樹脂用2mL密理博過濾水洗滌六次。化合物6之TEAH+鹽(5mg)溶解於2mL密理博過濾水中且裝載至樹脂上。樹脂用2mL密理博過濾水洗滌六次且自溶離份收集所需產物且凍乾隔夜，得到化合物6之鈉鹽(3mg)。
在逆相層析步驟中純化之後亦分離Rp,SP異構體，在凍乾之後得到呈雙三乙銨鹽形式之化合物6a(9.0mg，99%)。LCMS-ESI：693.30[M-H]-(C20H22F2N10O8P2S2之計算值：694.05)；Rt 13.830' min，藉由HPLC條件(10mM TEAA,2%至20%).Rt 15.032' min，藉由LCMS條件(20mM NH4OAc,2%至20%)。1H NMR.(400MHz,45℃,D2O)δ 8.65(s,1H),8.50(s,1H),8.34(s,1H),8.26(s,1H),6.58(dd,J=16.4,2.8Hz,2H),6.00(dd,J=51.2,3.6Hz,1H),5.69(dd,J=51.2,3.8Hz,1H),5.32-5.15(m,2H),4.77-4.67(m,3H),4.61(d,J=12.4Hz,1H),4.25(dd,J=11.8,4.2Hz,2H),3.33(q,J=7.2Hz,12H),1.43(t,J=7.2Hz,18H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -200.75至-201.31(m)。31P NMR(45℃,D2O)δ 54.69,54.64。
與流程1之方法類似地製備化合物5,12-二氧化(2R,3S,3aR,5R,7aR,9R,10S,10aR,12R,14aR)-2,9-雙(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,10-二氟-5,12-二巰基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔(7)，亦稱為3'3'-RR-(2'βF-A)(2'βF-A)或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'βF-A(3',5')p-2'βF-A(3',5')p]，及5,12-二氧化(2R,3S,3aR,5R,7aR,9R,10S,10aR,12S,14aR)-2,9-雙(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,10-二氟-5,12-二巰基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔(7a)，亦稱為3'3'-RS-(2'βF-A)(2'βF-A)或
二硫基-(Rp,Sp)-環狀-[2'βF-A(3',5')p-2'βF-A(3',5')p]，
其中用N-(9-((2R,3S,4R,5R)-5-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-氟-4-羥基四氫呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺(0.4g，0.6mmol，Glen Research,Sterling,Virginia)替代步驟1中之化合物1，且用(2R,3R,4S,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基胺基磷酸酯(0.5g，0.6mmol，Glen Research)替代步驟2中之化合物3。在藉由逆相HPLC純化且凍乾之後，獲得呈雙三乙銨鹽形式之化合物7(6.4mg，97%純度)及化合物7a(5.0mg，93%純度)。
化合物7：LCMS-ESI：695.75[M+H]+(C20H22F2N10O8P2S2之計算值：694.05)；Rt 16.779' min，藉由HPLC條件(10mM TEAA,2%至20%)。Rt 7.616' min，藉由LCMS條件(20mM NH4OAc,2%至50%)。1H NMR.(400MHz,45℃,D2O)δ 8.65(s,2H),8.49(s,2H),6.79(dd,J=14.4,4.2Hz,2H),5.86(br s,1H),5.74(br s,1H),5.52-5.44(m,2H),4.59(br s,2H),4.51-4.40(m,4H),3.39(q,J=7.2Hz,12H),1.48(t,J=7.2Hz,18H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -196.47至-196.70(m)。
化合物7a：LCMS-ESI：695.75[M+H]+(C20H22F2N10O8P2S2之計算值：694.05)；Rt 14.216' min，藉由HPLC條件(10mM TEAA,2%至20%)。Rt 8.106' min，藉由LCMS條件(20mM NH4OAc,2%至50%)。
1H NMR.(400MHz,45℃,D2O)δ 8.65(s,1H),8.61(s,1H),8.44(s,2H),6.73(d,J=14.8Hz,2H),5.88-5.64(m,2H),5.48-5.41(m,2H),4.57(br s,2H),4.46-4.35(m,4H),3.34(q,J=7.2Hz,12H),1.43(t,J=7.2Hz,18H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -196.98至-197.61(m)。31P NMR(45℃,D2O)δ 57.28,55.16,55.09。
根據以下流程2製備2-胺基-9-((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-9-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,10-二氟-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮(14)，亦稱為3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-G(3',5')p-2'F-A(3',5')p]，及2-胺基-9-((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12S,14aR)-9-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,10-二氟-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮(14a)，亦稱為3'3'-RS-(2'F-G)(2'F-A)或二硫基-(Rp,Sp)-環狀-[2'F-G(3',5')p-2'F-A(3',5')p]。
步驟1：製備(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-5-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(9)：向(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-5-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基胺基磷酸酯(8，1g，ChemGenes)於乙腈(5
mL)及水(36μL)中之溶液中添加三氟乙酸吡啶鎓(232mg)。攪拌反應物1分鐘，接著添加第三丁胺(5mL)。反應進行10分鐘且在真空中濃縮，且在真空中與乙腈(2×10mL)共同蒸發，得到化合物9及10之混合物(約4：1)。混合物溶解於無水1,4-二噁烷(9mL)中，接著添加無水吡啶(3mL)及SalPCl(210mg)於1,4-二噁烷(4.5mL)中之溶液。在攪拌15分鐘之後，反應混合物用水(1.5mL)淬滅，接著添加飽和NaHCO3溶液(60mL)。混合物用3×60mL EtOAc萃取且合併之有機層在真空中濃縮，得到1.7g大部分化合物9之粗混合物(6：1)。
步驟2：製備(2R,3R,4R,5R)-4-氟-2-(羥基甲基)-5-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(11)：向化合物9(1.7g)及DCM(12mL)之溶液中添加水(0.18mL)，接著添加DCA於DCM中之6%溶液(12mL)之溶液。在10分鐘之後，反應混合物用吡啶(1.4mL)淬滅且接著在真空中濃縮。粗物質在真空中於3×6.6mL無水乙腈共同蒸發，殘留1.4mL化合物11。
步驟3：製備(2R,3R,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氫呋喃-3-基)氧基)(2-氰基乙氧基)硫磷醯基)氧基)甲基)-4-氟-5-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(12)：添加化合物3(在真空中與3×6.6mL無水乙腈共同蒸發，殘留4mL)於4mL無水乙腈中之溶液且攪拌1.4mL化合物11之溶液該反應物2分鐘。添加DDTT(0.226g)且反應進行30分鐘，接著在真空中濃縮至乾燥，得到3.6g化合物12。
步驟4：製備N-(9-((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-5-(2-氰基乙氧基)-3,10-二氟-9-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-12-巰基至12-氧離子基-5-硫離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲
醯胺(13)：向化合物12(1.8g)於DCM(12mL)中之溶液中相繼添加水(60μL)及DCA於DCM中之6%溶液(12mL)。在10分鐘之後，反應混合物用吡啶(5mL)淬滅且真空濃縮以移除DCM。添加額外量之吡啶(15mL)且混合物在真空中濃縮至10mL。添加DMOCP(292mg)且攪拌反應物3分鐘，接著添加水(266μL)，且接著添加3-H-1,3-苯并二硫醇-3-酮(130mg)。在5分鐘之後，反應物用NaHCO3飽和溶液(75mL)淬滅且用乙基醚與EtOAc之1：1混合物萃取。水層再用額外的25mL乙基醚與EtOAc之1：1混合物萃取。合併之有機層在真空中濃縮，得到1.2g粗化合物13。進行正相矽膠純化(100% DCM至90 DCM：10 MeOH)得到50mg呈白色固體狀之化合物13(富含RpRp非對映異構體)及20mg富含RpSp非對映異構體之N-(9-((2R,3R,3aR,5S,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-5-(2-氰基乙氧基)-3,10-二氟-9-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-12-巰基-12-氧離子基-5-硫離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺(13a)。
步驟5：製備RR-(2'F-G)(2'F-A)(14)及3'3'-RS-(2'F-G)(2'F-A)(14a)：富含RpRp之化合物13(50mg)於AMA(0.84mL)及EtOH(0.36mL)中之溶液加熱至50℃保持4小時。反應混合物冷卻至室溫且用氬氣充氣10分鐘，接著在真空中濃縮。藉由逆相C18 MPLC及製備型HPLC純化，得到9mg呈參三乙銨鹽形式之化合物14。LCMS-ESI：711.30[M+H]+(C20H22F2N10O9P2S2之計算值：710.05)；Rt：12.7min(2-50% MeCN/NH4OAc(20mM)緩衝液，20min,1mL/min,5μm Acclaim 120)。1H NMR(400MHz,45℃,D2O)δ 8.53(s,1H),8.35(s,1H),8.10(s,1H),5.72(dd,J=14.0,4.4Hz,1H),5.58(dd,J=14.0,4,0Hz,1H),5.31-5.22(m,2H),4.70-4.59(m,2H),4.24-4.19(m),3.26(q,J=7.2Hz,21H),2.05(s,1.7H),1.40(t,J=7.2Hz,32H)。19F NMR(400
MHz,45℃,D2O)δ -199.2(td,J=56,24Hz),200.1(td,J=56,24,20Hz),31P NMR(45℃,D2O)δ 54.91；54.65。參見圖1。
自富含RpSp非對映異構體之化合物13a類似地製備及純化RS-(2'F-G)(2'F-A)(14a)。化合物13a(20mg)於AMA(0.42mL)及EtOH(0.18mL)中之溶液加熱至50℃保持4小時。反應混合物冷卻至室溫且用氬氣充氣10分鐘，接著在真空中濃縮。藉由逆相C18 MPLC及製備型HPLC純化，得到6.9mg呈四-三乙銨鹽形式之化合物14a。LCMS-ESI：711.25[M+H]+(C20H22F2N10O9P2S2之計算值：710.05)；Rt：8.7min(2-50% MeCN/NH4OAc(20mM)緩衝液，20min,1mL/min,5μm Acclaim 120)。1H NMR(400MHz,45℃,D2O)δ 8.53(s,1H),8.37(s,1H),8.23(s,1H),6.62(d,J=17.6Hz,1H),6.42(d,J=17.6Hz,1H),5.97(dd,J=51.6,4Hz,1H),5.64(dd,J=51.6,4Hz,1H),5.27-5.25(m,2H),4.64-4.52(m,2H),4.24(td,J=10.8Hz,3.2Hz,2H),3.27(q,J=7.2Hz,24H),2.05(s,2H),1.40(t,J=7.2Hz,36H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -199.8(td,J=53,18Hz),-200.9-201.1(m),31P NMR(45℃,D2O)δ 55.3；54.62。
根據以下流程3製備9,9'-((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-3,10-二氟-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2,9-二基)雙(2-胺基-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮)(17)，亦稱為3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-G)或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-G(3',5')p-2'F-G(3',5')p]，及9,9'-((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12S,14aR)-3,10-二氟-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2,9-二基)雙(2-胺基-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮)(17a)，亦稱為3'3'-RS-(2'F-G)(2'F-G)或二硫基-
(Rp,Sp)-環狀-[2'F-G(3',5')p-2'F-G(3',5')p]。
步驟1：製備(2R,3R,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-5-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基)氧基)(2-氰基乙氧基)硫磷醯基)氧基)甲基)-
4-氟-5-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(15)：向化合物11(於3mL MeCN中，根據流程2自3.4g化合物9製備)中添加化合物8(ChemGenes，與3×13mL無水MeCN共同蒸發)於8mL無水MeCN中之溶液且攪拌反應物2分鐘。添加DDTT(0.452g)且反應進行30分鐘，接著在真空中濃縮至乾燥，得到8.14g化合物15。
步驟2：製備N,N'-(((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-5-(2-氰基乙氧基)-3,10-二氟-12-巰基-12-氧離子基-5-硫離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2,9-二基)雙(6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-9,2-二基))雙(2-甲基丙醯胺)(16)：向粗化合物15(8.4g)於DCM(48mL)中之溶液中相繼添加水(240μL)及DCA於DCM中之6%溶液(48mL)。在10分鐘之後，反應混合物用吡啶(20mL)淬滅且真空濃縮以移除DCM。添加額外量之吡啶(60mL)且混合物在真空中濃縮至20mL。添加DMOCP(1.2g)且攪拌反應物3分鐘，接著添加水(1mL)，且接著添加3-H-1,3-苯并二硫醇-3-酮(520mg)。在5分鐘之後，反應物用NaHCO3飽和溶液(300mL)淬滅且用乙基醚與EtOAc之1：1混合物萃取。水層用DCM進一步萃取。合併之有機層在真空中濃縮，得到粗化合物16。進行正相矽膠純化(100% DCM至90 DCM：10 MeOH)，得到150mg呈白色固體狀之16(富含RpRp非對映異構體)及260mg富含RpSp非對映異構體之N,N'-(((2R,3R,3aR,5S,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-5-(2-氰基乙氧基)-3,10-二氟-12-巰基-12-氧離子基-5-硫離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2,9-二基)雙(6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-9,2-二基))雙(2-甲基丙醯胺)(16a)。
步驟3：製備3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-G)(17)：化合物16(75mg)於AMA(1.3mL)及EtOH(0.54mL)中之溶液加熱至50℃保持4小時。反
應混合物冷卻至室溫且用氬氣充氣10分鐘，接著在真空中濃縮。藉由逆相C18 MPLC及製備型HPLC純化，得到19mg呈雙-三乙銨鹽形式之化合物17。LCMS-ESI：725.25[M-H]-(C20H22F2N10O10P2S2之計算值：726.04)；Rt：10.44min(2-50% MeCN/NH4OAc(20mM)緩衝液，20min,1mL/min,5μm Acclaim 120)。1H NMR(400MHz,45℃,D2O)δ 8.15(s,2H),6.40(d,J=18.8Hz,2H),5.67(d,J=52.0Hz,2H),5.34-5.26(m,2H),4.66-4.61(m,4H),4.22-4.18(m,2H),3.36(q,J=7.2Hz,10H),1.43(t,J=7.2Hz,15H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -199.2- -199.4(m),31P NMR(45℃,D2O)δ 54.7。
類似地製備3'3'-RS-(2'F-G)(2'F-G)(17a)。化合物16a(160mg)於AMA(1.3mL)及EtOH(0.54mL)中之溶液加熱至50℃保持4小時。反應混合物冷卻至室溫且用氬氣充氣10分鐘，接著在真空中濃縮。藉由逆相C18 MPLC及製備型HPLC純化，得到6.5mg呈銨鹽形式之化合物17a。LCMS-ESI：725.25[M-H]-(C20H22F2N10O10P2S2之計算值：726.04)；Rt：9.17min(2-50% MeCN/NH4OAc(20mM)緩衝液，20min,1mL/min,5μm Acclaim 120)。1H NMR(400MHz,45℃,D2O)δ 8.33(s,1H),8.15(s,1H),6.40(dd.J=17.6,7.6Hz,2H),6.02(dd,J=51.6,3.2Hz,1H),5.72(dd,J=51.2,3.2Hz,1H),5.39-5.29(m,2H),4.66-4.52(m,4H),4.25-4.17(m,2H),2.15(s,1.4H)。
根據以下流程4製備5,12-二氧化(2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aS,12R,14aR)-2,9-雙(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3-氟-10-羥基-5,12-二巰基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔(22)，亦稱為3'3'-RR-(A)(2'F-A)或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[A(3',5')p-2'F-A(3',5')p]，及5,12-二氧化(2R,3R,3aR,5S,7aR,9R,10R,10aS,12R,14aR)-2,9-雙(6-胺基-9H-嘌呤-9-
基)-3-氟-10-羥基-5,12-二巰基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔(22a)，亦稱為3'3'-RS-(A)(2'F-A)或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[A(3',5')p-2'F-A(3',5')p]。
步驟1：製備(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-2-(羥基甲基)四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(19)：向(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧
基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基胺基磷酸酯(18，2.0g，2.0mmol，ChemGenes)於MeCN(10mL)中之溶液中相繼添加水(0.07mL)及三氟乙酸吡啶鎓(0.47g，2.4mmol，1.2當量，Aldrich)。在攪拌八分鐘之後，將第三丁胺(10mL，95mmol，47當量，Aldrich)引入無色反應物。在十分鐘之後，無色溶液在真空中濃縮，且在與MeCN(30mL)再一起濃縮三次之後以共沸物形式移除水，得到無色發泡體。無色發泡體溶解於CH2Cl2(25mL)中，其產生無色溶液。向此無色溶液中添加水(0.36mL)及DCA於CH2Cl2中之6%(v/v)溶液(24mL)，其使無色溶液變成亮紅色溶液中。在室溫下攪拌十分鐘之後，將吡啶(3mL)引入紅色溶液。所得白色混合物在真空中濃縮且在與MeCN(30mL)一起濃縮之後以共沸物形式移除水。用MeCN(30mL)再重複此共沸過程三次。在最後一次蒸發後，所得化合物19之白色漿料保留於MeCN(15mL)中。
步驟2：製備(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氫呋喃-3-基)氧基)(2-氰基乙氧基)硫磷醚基)氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(20)：化合物3(1.8g，2.0mmol，ChemGenes)於MeCN(20mL)中之溶液經由在真空中濃度來乾燥。用MeCN(20mL)再重複此過程兩次以便以共沸物形式移除水。在最後一次共沸後，將六個3Å分子篩引入化合物3於MeCN(6mL)中之溶液且溶液儲存在氮氣氛圍下。將化合物3於MeCN(6mL)中之溶液引入化合物19與殘餘二氯乙酸吡啶-1-鎓於MeCN(15mL)中之攪拌混合物。在十分鐘之後，向攪拌混合物中添加DDTT(460mg，2.2mmol)。在30分鐘後，在真空中濃縮黃色混合物以提供呈黃色油狀之化合物20。
步驟3：製備N,N'-(((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-3-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-12-(2-氰基乙氧基)-10-氟-5-巰基-5-氧離子基-12-硫離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2,9-二基)雙(9H-嘌呤-9,6-二基))二苯甲醯胺(21)及N,N'-(((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12S,14aR)-3-(第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-12-(2-氰基乙氧基)-10-氟-5-巰基-5-氧離子基-12-硫離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2,9-二基)雙(9H-嘌呤-9,6-二基))二苯甲醯胺(21a)：將水(0.24mL)及DCA於CH2Cl2中之6%(v/v)溶液(50mL)引入化合物20於CH2Cl2(50mL)中之淺黃色溶液，產生紅色溶液。在室溫下攪拌十分鐘之後，向紅色溶液中添加吡啶(15mL)。在真空中濃縮所得黃色混合物直至殘留約25mL黃色混合物。再向黃色混合物中添加吡啶(50mL)且在真空中濃縮混合物，直至殘留約30mL黃色混合物。用吡啶(50mL)再重複此過程一次直至殘留30mL黃色混合物。將DMOCP(1.1g，6.0mmol，3當量，Aldrich)引入含經攪拌之黃色混合物之吡啶(30mL)。在攪拌五分鐘之後，向深橙色溶液中添加水(1.0mL)，接著立即添加3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮(0.5g，3.0mmol，1.5當量，Aldrich)。在攪拌五分鐘之後，將深橙色溶液倒入1N NaHCO3水溶液(400mL)中。在攪拌十分鐘之後，兩相混合物用EtOAc(200mL)及CH2Cl2(200mL)萃取。在分離各層之後，水層再用CH2Cl2(400mL)反萃取兩次。合併有機萃取物且真空濃縮。將甲苯(100mL)引入經濃縮之黃色油且在真空中移除殘餘吡啶。用甲苯(100mL)再重複此程序一次。所得黃色油藉由矽膠層析(0%至10% MeOH/CH2Cl2)純化，得到呈黃色固體狀之化合物21(270mg，13%)及化合物21a(120mg)。
步驟4：製備3'3'-RR-(A)(2'F-A)(22)及3'3'-RS-(A)(2'F-A)(22a)：將30%氫氧化銨水溶液(2.0mL)引入富含Rp,Rp非對映異構體之化合物
21(150mg)於MeOH(2.0mL)中之攪拌溶液中且黃色漿料在50℃下加熱。在兩小時之後，使黃色溶液冷卻至室溫且在真空中濃縮黃色溶液。向殘餘固體中添加三氫氟化三乙胺(1.2mL，Aldrich)且黃色溶液加熱至40℃。在兩小時之後，使黃色溶液冷卻至室溫。將此黃色溶液緩慢引入經冷卻之1M TEAB(6mL)及TEA(1.0mL)於冰-水浴中之溶液。攪拌所得黃色混合物30分鐘。在C18管柱(0%至20% MeCN/10mM水性TEAA)上藉由逆相層析純化黃色混合物，在凍乾之後得到呈白色參-三乙銨鹽形式之化合物22(24mg，23%，96%純度)。LCMS-ESI：693.25[M+H]+(C20H23FN10O9P2S2之計算值：692.06)；Rt 12.339' min，藉由HPLC條件(10mM TEAA,2%至20%)。Rt 7.625' min，藉由LCMS條件(20mM NH4OAc,2%至20%)。1H NMR.(400MHz,45℃,D2O)δ 8.65(s,1H),8.56(s,1H),8.37(s,1H),8.27(s,1H),6.58(d,J=16.8Hz,1H),6.33(s,1H),5.69(dd,J=51.6,3.6Hz,1H),5.36-5.27(m,1H),5.21(d,J=4.4Hz,1H),5.11-5.05(m,1H),4.76-4.65(m,3H),4.60(d,J=12.4Hz,1H),4.25(dd,J=11.8,4.4Hz,2H),3.24(q,J=7.2Hz,18H),1.37(t,J=7.2Hz,27H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -200.73 to -200.93(m)。31P NMR(45℃,D2O)δ 54.79。
使富含RpSp非對映異構體之化合物21a類似地反應，在藉由逆相層析純化及凍乾之後得到呈白色五-三乙銨鹽形式之化合物22a(29mg，34%，95%純度)。LCMS-ESI：691.25[M-H]-(C20H23FN10O9P2S2之計算值：692.06)；Rt 10.399' min，藉由HPLC條件(10mM TEAA,2% to 20%)。Rt 10.236' min，藉由LCMS條件(20mM NH4OAc,2%至20%)。1H NMR.(400MHz,45℃,D2O)δ 8.74(s,1H),8.69(s,1H),8.37(s,1H),8.33(s,1H),6.62(d,J=16.4Hz,1H),6.36(s,1H),5.93(dd,J=51.6,2.8Hz,1H),5.31-5.23(m,1H),5.19(d,J=4.4Hz,1H),5.13-5.07(m,1H),4.77-4.65(m,H),4.62-4.59(m,2H),4.29-4.25(m,
2H),3.34(q,J=7.2Hz,30H),1.43(t,J=7.2Hz,45H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -201.58 to -201.78(m)。31P NMR(45℃,D2O)δ 55.00。
根據實例4流程4之方法製備2-胺基-9-((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aS,12R,14aR)-9-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3-氟-10-羥基-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮(23)，亦稱為3'3'-RR-(2'F-G)(A)或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-G(3',5')p-A(3',5')p]，及2-胺基-9-((2R,3R,3aR,5S,7aR,9R,10R,10aS,12R,14aR)-9-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3-氟-10-羥基-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮(23a)，亦稱為3'3'-SR-(2'F-G)(A)或二硫基(Sp,Rp)-環狀-[2'F-G(3',5')p-A(3',5')p]
在步驟1中使用化合物18(2.0g，2.0mmol，ChemGenes)，在步驟2中用化合物8(2.0g，2.3mmol，ChemGenes)替代化合物3，且在步驟4中，用相同比例之AMA置換氫氧化銨水溶液，在藉由逆相製備型HPLC純化及凍乾之後得到呈雙-三乙銨鹽形式之化合物23(33mg，99%純度)及呈三-三乙銨鹽形式之化合物23a(50mg，98%純度)。
化合物23：LCMS-ESI：707.80[M-H]+(C20H23FN10O10P2S2之計算值：708.05)；Rt 14.310' min，藉由HPLC條件(10mM TEAA,2%至20%)。Rt 7.274' min，藉由LCMS條件(20mM NH4OAc,2%至50%)。1H NMR.(400MHz,45℃,D2O)δ 8.56(s,1H),8.35(s,1H),8.12(s,1H),6.39(d,J=18.4Hz,1H),6.31(s,1H),5.69(dd,J=51.6,4.2Hz,1H),5.38-5.30(m,1H),5.19-5.14(m,1H),4.91(d,J=4.4Hz,1H),4.65-4.63(m,4H),4.23-4.18(m,2H),3.34(q,J=7.2Hz,12H),1.41(t,J=7.2Hz,18H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -199.47至-199.72(m)。31P NMR(45℃,D2O)δ 54.70,54.52。
化合物23a：LCMS-ESI：709.80[M+H]+(C20H23FN10O10P2S2之計算值：708.05)；Rt 17.348' min，藉由HPLC條件(10mM TEAA,2%至20%)。Rt 6.354' min，藉由LCMS條件(20mM NH4OAc,2% to 50%)。1H NMR.(400MHz,45℃,D2O)δ 8.74(s,1H),8.36(s,1H),8.12(s,1H),6.41(d,J=19.2Hz,1H),6.33(s,1H),5.98(dd,J=51.6,4.4Hz,1H),5.41-5.29(m,1H),5.19-5.13(m,1H),4.89(d,J=4.4Hz,1H),4.63(d,J=9.2Hz,3H),4.57(d,J=12.0Hz,1H),4.28-4.18(m,2H),3.34(q,J=7.2Hz,18H),1.42(t,J=7.2Hz,27H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -200.11至-200.36(m)。31P NMR(45℃,D2O)δ 55.32,55.25,54.66。
根據實例4，流程4之方法製備2-胺基-9-((2R,3R,3aS,5R,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-9-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-10-氟-3-羥基-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮(24)，亦稱為3'3'-RR-(G)(2'F-A)或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[G(3',5')p-2'F-A(3',5')p]，及2-胺基-9-((2R,3R,3aS,5R,7aR,9R,10R,10aR,12S,14aR)-
9-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-10-氟-3-羥基-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮(24a)，亦稱為3'3'-RS-G)(2'F-A)或二硫基-(Rp,Sp)-環狀-[G(3',5')p-2'F-A(3',5')p]
在步驟1中使用化合物3(2.1g，2.4mmol，ChemGenes)替代化合物18，在步驟2中使用(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)-5-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基(2-氰基乙基)二異丙基胺基磷酸酯(1.6g，1.6mmol，ChemGenes)替代化合物3，在藉由逆相製備型HPLC純化及凍乾之後得到化合物24(10mg，94%純度)及呈五-三乙銨鹽形式之化合物24a(50mg，96%純度)。
化合物24：LCMS-ESI：708.00[M-H]+(C20H23FN10O10P2S2之計算值：708.05)；Rt 14.878' min，藉由HPLC條件(10mM TEAA,2%至20%)。Rt 7.381' min，藉由LCMS條件(20mM NH4OAc,2%至50%)。1H NMR.(400MHz,45℃,D2O)δ 8.52(s,1H),8.34(s,1H),8.12(s,1H),6.60(d,J=16.8Hz,1H),6.13(d,J=1.2Hz,1H),5.68(dd,J=51.6,4.2Hz,1H),5.39-5.25(m,1H),5.21-5.15(m,1H),4.90(d,J=2.8Hz,1H),4.70-4.63(m,2H),4.61-4.57(m,2H),4.23-4.20(m,2H),3.34(q,J=7.2Hz,30H),1.43(t,J=7.2Hz,45H)。19F NMR(400MHz,45
℃,D2O)δ -200.12至-200.31(m)。31P NMR(45℃,D2O)δ 54.9,54.4。
化合物24a：LCMS-ESI：710.10[M+H]+(C20H23FN10O10P2S2之計算值：708.05)；Rt 12.633' min，藉由HPLC條件(10mM TEAA,2%至20%)。Rt 8.662' min，藉由LCMS條件(20mM NH4OAc,2%至50%)。1H NMR.(400MHz,45℃,D2O)δ 8.63(s,1H),8.47(s,1H),8.34(s,1H),6.72(d,J=17.2Hz,1H),6.23(d,J=2.0Hz,1H),6.05(dd,J=51.6,4.4Hz,1H),5.47-5.32(m,1H),5.31-5.24(m,1H),4.98-4.90(m,1H),4.87-4.85(m,1H),4.84-4.78(m,1H),4.69-4.65(m,1H),4.63-4.56(m,1H),4.38-4.28(m,2H),3.34(q,J=7.2Hz,30H),1.47(t,J=7.2Hz,45H)。19F NMR(400MHz,45℃,D2O)δ -200.91至-201.11(m)。31P NMR(45℃,D2O)δ 55.6,55.5,54.5。
根據以下流程5製備N-(9-((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-3,10-二氟-9-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺(25)，亦稱為3'3'-RR-(2'F-iBuG)(2'F-BzA)，或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-iBuG(3',5')p-2'F-BzA(3',5')p]，及N-(9-((2R,3R,3aR,5S,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-3,10-二氟-9-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺(25a)，亦稱為3'3'-RS-(2'F-iBuG)(2'F-BzA)或二硫基-(Rp,Sp)-環狀-[2'F-iBuG(3',5')p-2'F-BzA(3',5')p]。
向化合物13'(155mg，0.17mmol，1eq，非對映異構體13與13a之混合物，參見實例2)於MeCN(0.83mL)中之溶液中添加第三丁基胺(0.82mL，7.8mmol，47eq)。反應進行10分鐘且在真空中濃縮。藉由逆相C18 MPLC純化，得到57mg呈三乙銨鹽形式之化合物25a及41mg呈三乙銨鹽形式之化合物25。
化合物25：LCMS-ESI：883.35[M-H]-(C31H32F2N10O11P2S2之計算值：884.11)；Rt：5.42min(20-100% MeCN/NH4OAc(20mM)緩衝液，10min,1mL/min,5μm Acclaim 120)。1H NMR(400MHz,45℃,D2O)δ 8.85(s,1H),8.80(s,1H),8.31(s,1H),8.13(d,J=7.6Hz,2H),7.82(t,J=7.2Hz,1H),7.73(t,J=7.6Hz,2H),6.74(d,J=16.8Hz,1H),6.50(s,J=19.2Hz,1H),5.84(dd,J=6.4,4.8Hz,1H),5.7(dd,J=7.6,4,0Hz,1H),5.36-5.21(m,2H),4.64-4.62(m,2H),4.23(td,J=12,
4.8Hz,2H),3.35(q,J=7.2Hz,12H),2.78-2.72(m,1H),2.05(s,0.2H),1.40(t,J=7.2Hz,18H),1.19(dd,J=6.8Hz,2.4Hz,6H)。
化合物25a：LCMS-ESI：883.30[M-H]-(C31H32F2N10O11P2S2之計算值：884.11)；Rt：5.16min(20-100% MeCN/NH4OAc(20mM)緩衝液，10min,1mL/min,5μm Acclaim 120)。1H NMR(400MHz,45℃,D2O)δ 8.91(s,1H),8.85(s,1H),8.36(s,1H),8.14(d,J=7.6Hz,2H),7.83(t,J=7.6Hz,1H),7.72(t,J=8.0Hz,2H),6.75(d,J=16.8Hz,1H),6.50(d,J=20.4Hz,1H),6.05(dd,J=50.8Hz,3.6Hz,1H),5.9(dd,J=52.0Hz,4.4Hz,1H),5.41-5.20(m,2H),4.81-4.76(m,2H),4.63-4.42(m,2H),4.30-4.22(m,2H),3.35(q,J=7.2Hz,9H),2.52-2.43(m,1H),2.05(s,0.5H),1.40(t,J=7.2Hz,12H),1.19(dd,J=59.2Hz,6.8Hz,6H)。
根據以下流程6製備N-(9-((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-9-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,10-二氟-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基)異丁醯胺(26)，亦稱為RR-(2'F-iBuG)(2'F-A)或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-iBuG(3',5')p-2'F-A(3',5')p]。
向25(20mg，根據實例7，流程5)於MeCN(0.83mL)中之溶液中
添加濃NH4OH(0.35mL)及MeOH(0.35mL)。反應在室溫下進行3小時且在真空中濃縮。藉由逆相C18 MPLC純化，得到6.1mg化合物26。LCMS-ESI：779.90[M-H]-(C24H28F2N10O10P2S2之計算值：780.09)；Rt：9.01min(2-50% MeCN/NH4OAc(20mM)緩衝液，10min,1mL/min,5μm Acclaim 120)。1H NMR(400MHz,45℃,D2O)δ 8.48(s,1H),8.24(s,1H),8.19(s,1H),6.36(d,16.4Hz,1H),6.23(d,J=17.6Hz.1H)5.60(d,J=51.6Hz,1H),5.20(d,J=52.0Hz,1H),5.18-5.08(m,2H),4.61-4.30(m,4H),4.00(s,3H),3.17(q,J=6.0Hz,16H),2.74-2.73(m,1H),2.05(s,0.3H),1.30(t,J=6.8Hz,24H),1.18(t,J=7.6Hz,6H)。
根據以下流程7製備N,N'-(((2R,3R,3aR,5R,7aR,9R,10R,10aR,12R,14aR)-3,10-二氟-5,12-二巰基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2,9-二基)雙(9H-嘌呤-9,6-二基))二苯甲醯胺(27)，亦稱為3'3'-RR-(2'F-BzA)(2'F-BzA)或二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-BzA(3',5')p-2'F-BzA(3',5')p]。
向化合物5(400mg，0.418mmol，1eq，參見例如實例1流程
1，步驟3之後分離)於MeCN(2.5mL)中之溶液中添加第三丁基胺(2.18mL，50eq)。密封混合物且攪拌45分鐘。在真空中濃縮混合物，得到282.1mg粗化合物27。使用製備型HPLC-C18(75% 10mM TEAA至55%乙腈/10mM TEAA)純化反應物，得到4.9mg呈三乙銨鹽形式之化合物27(>95%純度)。LCMS-ESI：903.9[M+H]+(C34H30F2N10O10P2S2之計算值：902.10)；Rt：6.79min(2-80% MeCN/NH4OAc(20mM)緩衝液，10min,1mL/min,5μm Acclaim 120)。1H NMR(400MHz,45℃,MeOD)δ 8.76(s,2H),8.70(d,J=12Hz,2H),8.03(t,J=10Hz,4H),7.60(d,J=6.8Hz,2H),7.52(d,J=6.4Hz,4H),6.53(t,J=8.8Hz,2H),5.59-5.46(d,J=52.4Hz,1H),5.17-5.11(m,1H),4.51-4.36(m,2H),4.03(d,J=9.2Hz,2H)。19F NMR(400MHz,45℃,MeOD)δ -201.54- -201.74,31P NMR(45℃,MeOD)δ 55.68。
根據以下流程8製備2-胺基9-((2R,3R,3aR,7aR,9R,10R,10aR,14aR)-9-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-3,10-二氟-5,12-二羥基-5,12-二氧離子基八氫-2H,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮，亦稱為3'3'-(2'F-G)(2'F-A)或環狀-[2'F-G(3',5')p-2'F-A(3',5')p]。
步驟1：製備(2R,3R,4R,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟-5-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(9)：向化合物8(10g，10mmol，ChemGenes，參見實例2)於MeCN(50mL)及水(360μL)中之溶液中添加三氟乙酸吡錠(2.32mg)。攪拌反應物1分鐘，接著添加第三丁基胺(50mL)。反應進行10分鐘且在真空中濃縮且與乙腈(2×100mL)一起在真空中共同蒸發，得到化合物9及10之混合物(約4：1，參見實例1)。
步驟2：製備(2R,3R,4R,5R)-4-氟-2-(羥基甲基)-5-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(11)：向化合物9及10之粗混合物(約8.5g，5mmol)及DCM(60mL)之溶液中相繼添加水(0.09mL)及DCA於DCM中之6%溶液(60mL)之溶液。在10分鐘之後，反應混合物用吡啶(7.0mL)淬滅且接著在真空中濃縮。粗混合物與3×35mL無水MeCN一起共同蒸發，留存7.0mL粗化合物11。
步驟3：製備(2R,3R,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲醯胺基
-9H-嘌呤-9-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氫呋喃-3-基)氧基)(2-氰基乙氧基)磷醯基氧基)甲基)-4-氟-5-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9H-嘌呤-9-基)四氫呋喃-3-基氫膦酸酯(28)：化合物3之溶液與3×35mL無水MeCN一起共同蒸發，留存20mL無水MeCN，且添加至化合物11之粗溶液中且攪拌反應物2分鐘。添加t-BuOOH(2.73mL於癸烷中之5.5M溶液)且反應進行30分鐘。添加亞硫酸氫鈉水溶液(1.25g於2.5mL水中)且攪拌混合物5分鐘。接著在真空中濃縮至乾燥，得到22g化合物28。
步驟4：製備N-(9-((2R,3R,3aR,7aR,9R,10R,10aR,14aR)-5-(2-氰基乙氧基)-3,10-二氟-12-羥基-9-(2-異丁醯胺-6-側氧基-1,6-二氫-9R-嘌呤-9-基)-5,12-二氧離子基八氫-2R,7H-二呋喃并[3,2-d：3',2'-j][1,3,7,9]四氧雜[2,8]二磷酸環十二炔-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲醯胺(29)：向化合物28(22g)於DCM(120mL)中之溶液中相繼添加水(600μL)及DCA於DCM中之6%溶液(120mL)。在10分鐘之後，反應混合物用吡啶(50mL)淬滅且真空濃縮以移除DCM。添加額外量之吡啶(150mL)且混合物在真空中濃縮至100mL。添加DMOCP(2.92g)且攪拌反應物3分鐘，接著添加水(3.2mL)且接著添加碘(1.65g)。在5分鐘之後，反應物用亞硫酸氫鈉溶液(1g NaHSO3於700mL水中)淬滅且用乙基醚與EtOAc之1：1混合物(800mL)萃取。水層用額外的200mL DCM進一步萃取。合併之有機層在真空中濃縮，得到7g粗化合物29。
步驟5：製備3'3'-(2'F-G)(2'F-A)(30)：化合物30(3.15g)於AMA(22mL)及EtOH(9.45mL)中之溶液加熱至50℃保持4小時。反應混合物冷卻至室溫且用氬氣充氣10分鐘。藉由逆相C18 MPLC及製備型HPLC純化，得到22mg化合物30。LCMS-ESI：677.30[M-H]-(C20H22F2N10O11P2之計算值：678.09)；Rt：8.73min(2-50% MeCN/NH4OAc(20mM)緩衝液，20min,1mL/min,5μm Acclaim 120)。1H
NMR(400MHz,45℃,D2O)δ 8.52(s,1H),8.33(s,1H),8.13(s,1H),6.60(d,J=17.2Hz,1H),6.40(d,J=18.4Hz,1H),5.75(d,J=4.0Hz,1H),5.62(d,J=3.6Hz,1H),5.18-5.10(m,2H),4.66-4.52(m,3H),4.31-4.25(m,2H),3.35(q,J=7.2Hz,26H),2.05(s,6.45H),1.43(t,J=7.2Hz,39H)。
編碼胺基酸140-379(對應於Swiss Prot Q86WV6之胺基酸編號)之DNA用以下引子經由聚合酶鏈反應自含有人類STING對偶基因之全長序列之質體擴增：正向TACTTCCAATCCAATGCAGCCCCAGCTGAGATCTCTG(SEQ ID NO：8)及反向TTATCCACTTCCAATGTTATTATTATCAAGAGAAATCCGTGCGGAG(SEQ ID NO：9)。根據Yi等人，(2013),PLoS One,8(10),e77846(DOI：10.1371/journal.pone.0077846指定STING變異體對偶基因。使用非接合依賴性選殖(Aslanidis等人，(1990)Nucleic acids research,18.20,6069-6074)將PCR產物選殖至編碼N端己組胺酸親和力標籤(6×HIS)之細菌表現載體中，接著選殖至小型泛素類調節子(SUMO)可溶性序列(Butt等人，(2005)Protein expression and purification 43.1,1-9)及菸草蝕刻病毒蛋白酶裂解位點(TEV)中。
編碼6×HIS-SUMO-TEV-STING胺基酸140-379之質體轉換成Rosetta2(DE3)大腸桿菌細胞(EMD Millipore)用於蛋白質表現。細胞在潛溶型培養液中在37℃下生長直至600nM吸光度達到0.6。接著，將為轉移至18℃且藉由向培養基中添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷達到0.25mM之濃度來誘導蛋白質表現隔夜。藉由在6,000倍重力下離心10分鐘來收集細胞。細胞集結粒在含有50mM Tris鹽酸鹽(Tris-HCl)pH 7.5、500mM氯化鈉(NaCl)、20mM咪唑、10%丙三醇、1mM
參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)及蛋白酶抑制劑錠劑(Pierce)之緩衝液(緩衝液A)中再懸浮於冰上。使用S-450D細胞破碎儀(Emmerson industrial)在冰上溶解細胞。細胞溶解物在4℃下在15,000倍重力下離心30分鐘。可溶性材料施用於鎳-氮基三乙酸(Ni-NTA)偶合之Sepharose CL-6B(Qiagen)1小時，同時在4℃下平緩搖盪。在轉移重力流多製備型管柱(Bio-Rad)之後，在緩衝液A中澈底洗滌樹脂。蛋白質自管柱在含有20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、300mM咪唑、10%丙三醇及0.5mM TCEP之緩衝液中溶離。為了移除6×HIS-SUMO標籤，溶離之蛋白質與TEV蛋白酶(δ)以1：250(w：w)之比率混合，且針對含有20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、5mM咪唑、10%丙三醇及0.5mM TCEP之緩衝液透析隔夜。藉由向樣品中添加Ni-NTA樹脂(Qiagen)來耗盡TEV蛋白酶及6×HIS-SUMO標籤，藉由使用多製備型管柱移除樹脂來收集經純化之STING胺基酸140-379。STING AA140-379用10,000道爾頓分子量截斷離心濃縮器(EMD Millipore)濃縮至約10mg/ml之最終濃度。將蛋白質等分，在液氮中快速冷凍且在-80℃下儲存直至使用。
差示掃描螢光測定法(DSF)為量測配位體結合於且穩定經純化之蛋白質之能力的技術(Niesen等人，(2007)Nature protocols 2.9,2212-2221)。蛋白質在所結合且在疏水性環境中發螢光之染料存在下加熱。藉由加熱使蛋白質熱變性，引起結合於未摺疊之蛋白質之染料及螢光增加。藉由計算變性曲線之半最大值來確定蛋白質變性之溫度中點(Tm)。在配位體存在下，蛋白質之溫度中點與蛋白質之配位體之親和力直接相關，且因此與其在較高溫度下使蛋白質穩定之能力相關。
在包含20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、SYPRO Orange(Life Technologies)之1：500稀釋物、1mg/ml經純化之STING AA140-379蛋白質及濃度為1mM之配位體的20μL反應物中進行DSF。將樣品
放入硬殼PCR盤(Bio-Rad)中。在CFX 96即時PCR機器(Bio-Rad)中以溫度之函數形式記錄螢光，在HEX通道上讀取，激勵波長450-490，發射波長560-580nm。溫度梯度為自15℃以每15秒0.5℃之速率上升至80℃且每隔0.5℃記錄一次。在自不含蛋白質及配位體之樣品減去背景信號之後。藉由針對Boltzmann S形功能(Graph Pad Prism)以溫度之函數形式擬合螢光曲線來計算中點溫度(Tm)。藉由自Tm(僅蛋白質)減去Tm(蛋白質及配位體)來計算在配位體存在下，STING AA140-379之熱穩定性之變化(Tm偏移)。
藉由DSF評估CDN化合物環狀-[A(3',5')p-A(3',5')p](CDA，3'3'-(A)(A))、二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[A(3',5')p-A(3',5')p](3'3'-RR-(A)(A))、二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-A(3',5')p-2'F-A(3',5')p](3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A))、環狀-[G(3',5')p-A(3',5')p](cGAMP,3'3'-(G)(A))、環狀-[G(2',5')pA(3',5')p](ML-cGAMP,2'3'-(G)(A))及二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-G(3',5')p-2'F-A(3',5')p](3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A))結合於經純化之STING蛋白質之能力。
圖2及3展示經氟取代之CDN化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)與未經氟取代之化合物3'3'-(A)(A)、3'3'-RR-(A)(A)、3'3'-(G)(A)及內源性細胞配位體2'3'-(G)(A)相比展示增加之Tm偏移。經氟取代之化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)之增加之Tm偏移表明其增加hSTING(REF)(圖2)及hSTING(WT)蛋白質(圖3)之熱穩定性，表明hSTING(WT)、hSTING(REF)及經氟取代之CDN化合物之間加強之結合相互相用。圖2亦表明含有(3',5')p(3',5')p核苷酸內磷酸鍵及2',2"-二氟-二硫基-(Rp,Rp)取代之CDN可強結合於由含有(3',5')p(3',5')p核苷酸內磷酸鍵之未經修飾之CDN弱結合之變異體。
亦在如以下表4中列舉之參考化合物及本發明之化合物中之每一
者的情況下使用野生型hSTING、HAQ對偶基因hSTING及REF對偶基因hSTING中之每一者。此等結果表明在所有三種hSTING中，3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)、3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-G)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)分別與其OH參考(亦即3'3'-RR-(A)(A)、3'3'-RR-(G)(G)及3'3'-RR-(G)(A))中之每一者相比改良之結合，其中3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)與天然產生之2'3'-(G)(A)相比展示改良之結合。當用REF對偶基因量測時，在一個或兩個鹼胺基上具有保護基之化合物3'3'-RR-(2'F-BzA)(2'F-BzA)、3'3'-RR-(2'F-iBuG)(2'F-BzA)及3'3'-RR-(2'F-iBuG)(2'F-A)與3'3'-RR-(A)(A)或3'3'-RR-(G)(A)相比亦展示改良之結合。在所有三種hSTING中，單-F衍生物3'3'-RR-(2'F-G)(A)及3'3'-RR-(G)(2'F-A)與OH參考物3'3'-RR-(G)(A)相比亦展示改良之結合。
為了評估兩種已知天然人類STING變異體hSTING(WT)及hSTING(REF)回應於原生及經氟取代之CDN化合物之訊息傳導能力，吾人量測穩定表現hSTING(WT)或hSTING(REF)之人胚腎(HEK)293T細胞株中IFN-β-報導子之活性。已描述hSTING(REF)對偶基因之序列(Ishikawa,H及Barber,G.N.(2008).Nature 455,674-678)，且具有NCBI參考序列NP_938023(圖6)。hSTING(WT)及hSTING(REF)變異體對偶基因之序列亦描述於Yi等人，2013,PLoS One,8(10),e77846(DOI：10.1371/journal.pone.0077846中。
親本HEK293T細胞株不表現內源性功能性STING，因此可使用穩定的表現HEK293T STING之細胞株評估外源性表現之STING對偶基因對多種CDN化合物之反應。用MSCV2.2反轉錄病毒質體產生此等細胞株，該等反轉錄病毒質體含有全長STING cDNA，其在具有綠色螢光蛋白(GFP)之框架中之IRES之上游具有經選殖之c端HA抗原決定基標籤。使用脂染胺(Invitrogen)將反轉錄病毒載體轉染至雙嗜性Phoenix封裝細胞株中。在兩天之後，收集病毒上清液且用於HEK293T細胞之轉導。
在伯克利大學(UC Berkeley)之癌症研究實驗室流動式細胞測量術機構(Cancer Research Laboratory Flow Cytometry Facility)使用Mo Flo細胞分類器將GFP陽性細胞分類。104個HEK293T STING細胞接種於
96孔培養盤中且用表現螢火蟲螢光素酶報導基因之上游人類IFN-β啟動子之50ng人類IFN-β報導子質體(pLuc-IFN-β)(Fitzgerald等人，2003,Nature Immunology,4(5)：491-496)及表現組成性活性胸苷激酶(TK)海腎(Renilla reniformis)螢光素酶報導基因(Promega)之10ng質體短暫轉染(使用Lipofectamine 2000)以用於正規化。在24小時之後，使用毛地黃皂苷滲透，用原生及合成CDN衍生物分子刺激細胞以確保均勻吸收。在25μl毛地黃皂苷緩衝液(50mM HEPES、100mM KCL、3mM MgCl2、0.1mM DTT、85mM Sucrose、0.2%BSA、1mM ATP、0.1mM GTP、10μg/mL毛地黃皂苷)中，用以下CDN化合物中之每一者之0.1μM至100μM之2倍稀釋物刺激各STING細胞株：環狀-[A(3',5')p-A(3',5')p](CDA,3'3'-(A)(A))、二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[A(3',5')p-A(3',5')p](3'3'-RR-(A)(A))、二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-A(3',5')p-2'F-A(3',5')p](3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A))、環狀-[G(3',5')p-A(3',5')p](3'3'-(G)(A))、環狀-[G(2',5')p-A(3',5')p](2'3'-(G)(A))及二硫基-(Rp,Rp)-環狀-[2'F-G(3',5')p-2'F-A(3',5')p](3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A))。
在20分鐘之後，移除刺激混合物且添加200μl補充有10%(體積/體積)胎牛血清、1% L-麩醯胺酸及1%青黴素/鏈黴素之DMEM培養基。再培育細胞6小時(37℃，5% CO2)且接著製備細胞溶解物，且使用Dual-Glo螢光素酶分析法系統(Promega，目錄號E2920)如製造商所描述在Spectramax M3光度計上量測報導基因活性。針對TK海腎螢光素酶基因活性正規化IFNβ螢火蟲螢光素酶報導基因活性且標繪為相比於未經刺激之細胞中之活性的誘導倍數(平均值+/-標準差)。
如圖5A(給藥過程)及5B(6.25μM CDN)中所示，在測試劑量下，藉由hSTING(WT)，經氟取代之CDN化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)與未經氟取代之化合物3'3'-(A)(A)及二硫基-(Rp,Rp)衍生物OH參考化合物3'3'-RR-(A)(A)相比誘導較高程度之IFNβ報導子活性。藉由
hSTING(WT)，當與內源性細胞配位體2'3'-(G)(A)相比時，3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)亦刺激較高程度之IFNβ報導子活性。藉由hSTING(WT)，經氟取代之CDN化合物3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)亦強烈誘導IFNβ報導子活性，且在較低劑量下，藉由hSTING(WT)，3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)與化合物3'3'-(G)(A)相比更有效地誘導IFNβ報導子活性。如6A(給藥過程)及6B(6.25μM CDN)中所示，表現hSTING(REF)之HEK 293T細胞對用3'3'-(A)(A)、3'3'-RR-(A)(A)及3'3'-(G)(A)進行之刺激之反應較弱，其皆含有標準(3',5')p(3',5')p核苷酸內磷酸鍵。相比之下，經氟取代之CDN化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)強烈誘導IFNβ報導子活性，達到與具有(2',5')p-(3',5')p核苷酸內磷酸鍵之內源性細胞配位體2'3'-(G)(A)類似的程度。此等結果表明含有標準(3',5')p-(3',5')p核苷酸內磷酸鍵及2',2"-二氟-二硫基-(Rp,Rp)取代之CDN化合物有效活化hSTING(REF)，一種典型地對由含有標準(3',5')p(3',5')p核苷酸內磷酸鍵之CDN進行之刺激具有抗性之對偶基因。
綜合而言，圖5A、5B及6A、6B中之資料說明經氟取代之CDN，3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)能夠強烈活化hSTING(REF)及hSTING(WT)，且因此能夠在表現STING之不同變異體之大量人類群體中實現人類STING訊息傳導。
在人類原發性血液單核細胞(hPBMC)中量測I型干擾素之誘導，以評估如本文中所描述之單-F-CDN或二-F-CDN化合物之效能。使用來自兩個獨特供體之hPBMC：一個供體為野生型(WT)STING對偶基因(STINGWT/WT)之同型接合子，且另一個供體為所謂的參考(REF)STING對偶基因(STINGREF/REF)之同型接合子。藉由PCR擴增及測序來測定此等供體之STING基因型：使用Quick Extract DNA提取溶
液(Epicentre)自104個hPBMC分離基因體DNA且用於擴增人類STING基因之外顯子3、6及7之區域。用於擴增及測序之引子為：hSTING外顯子3F GCTGAGACAGGAGCTTTGG(SEQ ID NO：10)、hSTING外顯子3R AGCCAGAGAGGTTCAAGGA(SEQ ID NO：11)、hSTING外顯子6F GGCCAATGACCTGGGTCTCA(SEQ ID NO：12)、hSTING外顯子6R CACCCAGAATAGCATCCAGC(SEQ ID NO：13)、hSTING外顯子7F TCAGAGTTGGGTATCAGAGGC(SEQ ID NO：14)、hSTING外顯子7R ATCTGGTGTGCTGGGAAGAGG(SEQ ID NO：15)。根據Yi等人，2013,PLoS One,8(10),e77846(DOI：10.1371/journal.pone.0077846指定STING變異體對偶基因。
將冷凍保存之hPBMC解凍且106個細胞保持未經處理或在補充有10%胎牛血清、1% L-麩醯胺酸及1%青黴素/鏈黴素之RMPI培養基中用參考化合物3'3'-RR-(A)(A)、3'3'-RR-(G)(G)、2'3'-(G)(A)、3'3'-(G)(A)或3'3'-RR-(G)(A)或單-F或二-F化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)、3'3'-RR-(2'F-A)(A)、3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-G)、3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)、3'3'-RR-(2'F-G)(A)及3'3'-RR-(G)(2'F-A)處理。細胞在37℃、5% CO2下，在各CDN為100μM至0.1μM之濃度範圍下培育。在2小時(圖7及圖8)或2小時及6小時(圖9-13)刺激之後，藉由離心收集細胞且用磷酸鹽緩衝生理食鹽水洗滌一次。使用Aurum Total RNA 96套組分離細胞RNA且使用iScript cDNA合成套組合成cDNA。使用PrimePCR探針分析及CFX96基因循環器(所有試劑及設備皆來自BioRad)藉由即時qRT-PCR評估目標及參考基因表現。相對於未經處理之細胞表示正規化IFNβ表現。目標基因包括I型干擾素(IFNβ)、Th1相關細胞激素(IFNγ、IL-12p40)及NF-kB依賴性發炎性細胞激素(TNFα、IL-6)。參考基因包括單獨的GUSB(圖7及圖8)或GUSB及HSP90AB1(圖9-13)。
圖7A及圖8A(給藥過程)以及圖7B及圖8B(6.25μM CDN)展示WT
STING對偶基因(圖7A、圖7B)或REF STING對偶基因(圖8A、圖8B)之hPBMC同型接合子之相關正規化IFNβ表現。關於STINGWT/WT hPBMC，3'3'-RR-(A)(A)及3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)皆誘導類似程度之IFNβ；然而，當與3'3'-(A)(A)化合物(其在此實例中為效能最低的WT STING促效劑)相比時，此等衍生物皆誘導較高程度之IFNβ轉錄。在所有劑量下，與由哺乳動物細胞天然產生之非標準2'3'-(G)(A)相比時，3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)刺激較高程度之STINGWT/WT hPBMC之IFNβ轉錄。此外，3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)為STINGWT/WT hPBMC中之最強效的I型干擾素之誘導劑，當與所測試劑量範圍中之親本cGAMP化合物相比時，引起約10-100倍更高程度之IFNβ。關於STINGREF/REF hPBMC，3'3'-(A)(A)、3'3'-RR-(A)(A)及3'3'-(G)(A)在測試劑量下不刺激顯著IFNβ轉錄程度之產生。相比之下，2'3'-(G)(A)、3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)刺激STINGREF/REF hPBMC之IFNβ轉錄之劑量依賴性產生。
在圖7及圖8中測試之劑量範圍中，與2'3'-(G)(A)相比，3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)皆為IFNβ轉錄STINGREF/REF hPBMC之更強效誘導劑。3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)為REF STING對偶基因之極強效刺激劑，因為當用3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)刺激細胞時，與用2'3'-(G)(A)進行類似給藥之細胞相比，IFNβ轉錄程度高12至70倍。此等結果表明對於WT或REF STING，CDA及cGAMP之2',2"-diF-RR衍生物與其相應親本化合物或天然產生之非標準2'3'-(G)(A)相比為更強效的人類細胞同型接合子之刺激劑。此等結果亦表明對於通常對含有標準鍵之CDN進行之刺激具有抗性之REF STING對偶基因，含有標準R(3',5')pR(3',5')p核苷酸內磷酸鍵及2',2"-二氟-二硫基-(Rp,Rp)修飾之化合物可刺激人類細胞同型接合子之IFNβ產生。
單-F CDN或二-F CDN 3'3'-RR-(2'F-G)(A)、3'3'-RR-(G)(2'F-A)及
3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)以及作為參考之3'3'-(G)(A)及3'3'-RR-(G)(A)之結果；3'3'-RR-(2'F-A)(A)及3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)以及作為參考之3'3'-RR-(A)(A)；及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-G)及作為參考之3'3'-RR-(G)(G)展示於圖9A(IFNβ，WT/WT)、圖9B(IFNβ，REF/REF)、圖10A(TNFα，WT/WT)、圖10B(TNFα，REF/REF)、圖11A(IL-6，WT/WT)、圖11B(IL-6，REF/REF)、圖12A(IFNγ，WT/WT)、圖12B(IFNγ，REF/REF)、圖13A(IL-12p40，WT/WT)及圖13B(IL-12p40，REF/REF)中。關於STINGWT/WT hPBMC，除3'3'-RR-(G)(G)之外，所有測試化合物皆引起強效、劑量依賴性細胞激素反應。取決於細胞激素，STINGWT/WT hPBMC中之反應在2小時(IFNβ，TNFα)或6小時(IFNγ)刺激時最高。IL-6及IL-12p40反應在STINGWT/WT hPBMC中在兩個時間點時類似。關於STINGREF/REF hPBMC，天然產生之哺乳動物化合物2'3'-(G)(A)誘導穩定、劑量依賴性反應，其中所有細胞激素在6小時刺激時達到峰值。與3'3'-(G)(A)及3'3'-RR-(G)(A)參考化合物相比，3'3'-RR-(2'F-G)(A)、3'3'-RR-(G)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)誘導所測試之細胞激素中之每一者之更穩定的劑量依賴性反應。腺嘌呤及鳥嘌呤上皆存在2'F取代引起最穩定的反應，且腺嘌呤鹼基上存在單2'F取代與鳥嘌呤鹼基上存在單2'F取代相比可引起更強效的反應。與3'3'-RR-(A)(A)參考化合物相比，經二-F取代之3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)誘導所有測試細胞激素之更穩定的反應，其中IFNβ及TNFα反應在2小時刺激之後達到峰值。儘管穩定性低於二-F化合物，但經單-F取代之3'3'-RR-(2'F-A)(A)化合物亦能夠在用100μM化合物進行6小時刺激時引起細胞激素反應。單-F-CDN及二-F-CDN化合物通常在hPBMC中展示穩定細胞激素反應，尤其3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)，表明在STINGREF/REF中與其OH參考化合物相比更穩定的反應，其中反應與天然產生之2'3'-(G)(A)類似或在一些情況下比其更穩
定。
為了以佐劑效能之特徵形式測定由單-F-CDN或二-F-CDN中之每一者在人類細胞中誘導之I型干擾素之相關含量，100,000個THP1-Dual細胞(含有經IRF-3誘導性分泌螢光素酶報導基因(Invivogen)轉染之hSTING HAQ對偶基因的人類單核球細胞株，其在包含五個IFN刺激之反應元素之啟動子控制下表現所分泌之螢光素酶)在96孔盤中用30ng/ml佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯活化隔夜。細胞用新鮮培養基洗滌且在37℃及5% CO2下與化合物一起在PB緩衝液(50mM 4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸、100mM KCl、3mM MgCl2、0.1mM二硫蘇糖醇、85mM蔗糖、1mM ATP、0.1mM GTP及0.2%牛血清白蛋白)中以2,000至0.0338μM之3倍滴定步驟培育30分鐘。30分鐘後，洗滌細胞且添加含有10% FBS之新鮮RPMI培養基，且細胞在37℃及5% CO2下培育。收集來自各自樣品之細胞培養物上清液，隨後培育隔夜，且將10μL細胞培養物上清液添加至50μL QUANTI-Luc試劑(Invivogen)中。藉由用SpectraMax M3分光光度計(Molecular Devices)量測所分泌之螢光素酶含量來測定I型干擾素活化。自此分析法中測試之參考化合物及本發明之化合物之10種濃度之連續稀釋物之劑量-反應曲線測定EC50值，如表5中列舉。此等結果說明diF化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)、3'3'-RS-(2'F-A)(2'F-A)、3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-G)、3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)、3'3'-RS-(2'F-G)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-iBuG)(2'F-A)與其OH參考化合物中之每一者相比改良的活性。單-F衍生物3'3'-RR-(2'F-G)(A)及3'3'-RR-(G)(2'F-A)與OH參考物3'3'-RR-(G)(A)相比亦展示改良之活性。
表5：THP1細胞中不存在毛地黃皂苷情況下之EC50(HAQ對偶基
為了測定衍生物分子是否引起抗腫瘤免疫性，將B16.SIY細胞(含5×105個細胞之100μL PBS)植入6-8週齡雌性C57BL/6小鼠(每組8隻小鼠)。小鼠用參考化合物3'3'-RR-(A)(A)及二-F化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)(5、50、100μg於40μL總體積之HBSS中)或HBSS媒劑對照物處理。在腫瘤移植9天後，在腫瘤達到約100mm3之體積時開始處理。藉由使用27標準尺寸針皮下注射至腫瘤中心(IT)來投與CDN化合物。小鼠在腫瘤移植後第16天抽血且藉由Ficoll梯度(Miltenyi Biotech)分離PBMC。1×105個PBMC與抗CD16/32單株抗體一起預培育以阻斷潛在非特異性結合，且用由與SIYRYYGL(SIY，SEQ ID NO：16)肽、抗TCRβ-AF700(H57-597)、抗CD8-Pacific Blue(53-6.7)、抗CD4-
Pacific Orange(RM4-5)(所有抗體皆來自BioLegend)及Fixable Viability染料eFluor 450(eBioscience)複合之鼠類H-2Kb組成的I類PE-MHC五聚體(Proimmune)標記。使用FACS Versa細胞計數器及FACSDiva軟體(BD)分析經染色之細胞。用FlowJo軟體(Tree Star)進行資料分析。
如圖14A中所示，與OH參考物3'3'-RR-(A)(A)化合物不同，所有用3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)化合物處理之小鼠在所有劑量下排斥現有B16-SIY黑素瘤之生長。為了證明該作用係由適應性T細胞免疫反應介導，在IT注射後第7天藉由流動式細胞測量術評估SIY特異性CD8+ T細胞之百分比之PBMC。如圖14B中所示，與經HBSS處理之對照組相比，自小鼠分離之PBMC用5μg OH參考化合物3'3'-RR-(A)(A)或二-F化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)處理，產生大量SIY特異性CD8+ T細胞(**P<0.01，都登氏(student's)t試驗法)。此等資料說明二-F衍生物化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)以抗原特異性方式引起T細胞介導之抗腫瘤免疫性之能力。
為了評估氟化衍生物化合物在不同鼠類腫瘤模型中促進抗腫瘤免疫性之能力，將腫瘤細胞皮下植入(於100μL PBS中)6-8週齡C57BL/6雌性小鼠之下背上。在腫瘤移植後約第14天，在腫瘤達到約100mm3之體積時開始處理(關於腫瘤類型、細胞數目及IT注射天數，參見下表)。藉由IT注射(10或100μg於40μL總體積之HBSS中)投與CDN化合物，且每三天重複一次，總共進行三次注射。投與化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)且僅投與對照小鼠媒劑(40μL HBSS)。每週量測腫瘤兩次。
如圖15A中所示，在侵襲性B16.F10黑素瘤模型中，3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)化合物與HBSS相比誘導顯著腫瘤抑制，其中3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)分子在100μg劑量下引起完全腫瘤消退。在MC38結腸癌瘤模型中，如圖15B中所示，與HBSS對照物相比，兩種化合物在所有測試劑量下皆引起完全腫瘤消退。此等資料說明氟化衍生物跨越不同腫瘤模型之廣泛抗腫瘤作用。
為了測定氟化衍生物是否可引起HIVgag特異性CD4+及CD8+ T細胞反應，用0μg(無CDN)、1μg或5μg CDN(在2%角鯊烯及水(AddaVax，Invivogen)中與5μg HIVgag p55蛋白質一起調配)使BALB/c小鼠(n=4)皮下免疫。在疫苗接種之後七天，自小鼠收集脾且製備脾細胞。在IFNγ ELISPOT分析法中，2×105個脾細胞用單獨的培養基(非刺激性)或1μM HIVgag p55 CD4+及CD8+特異性肽刺激隔夜。研究IFNγ ELISPOT且使用CTL盤讀取器及ImmunoSpot軟體定量。評估3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)誘導HIVgag特異性免疫反應之能力。
如圖16A中所示，與非CDN AddaVax+蛋白質對照組相比，3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)及3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)分子皆能夠引起針對HIVgag p55之顯著CD4+ T細胞反應(*P<0.05，**P<0.01，都登氏t試驗法)。如圖16B中所示，與非CDN對照組相比，3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)化合物亦引起針對HIVgag p55之顯著CD8+ T細胞反應(*P<0.05，都登氏t試驗法)。此等資料說明氟化化合物在針對相關免疫原之疫苗配置中充當強效佐劑之能力。
使用表面電漿共振評估單-F CDN及二-F CDN化合物之結合以測定結合常數。製備具有以下蛋白質序列之大腸桿菌表現構築體(人類-
STING[E149-S379]H232R)：
(SEQ ID NO：17)
在18℃下誘導大腸桿菌中之人類-STING[E149-S379]H232R表現且接著使用鎳親和層析及尺寸排阻層析純化蛋白質。製備等分試樣且在-80℃下儲存於30mM Tris pH 7.5/100mM NaCl/10%丙三醇中。
N端avi標記之人類-STING(E149-S379)H232R蛋白質在15℃下於Biacore T200(GE Healthcare)中固定(約2500 RU)於抗生蛋白鏈菌素晶片上。在15℃下針對hSTING描繪(30μL/min，樣品接觸180秒/解離120秒)環狀二核苷酸(如表6中所指示之CDN)於30mM Tris pH 7.5/50mM NaCL/0.005% Tween 20/1mM DTT/2% DMSO中之滴定。使用Biacore T200評估軟體進行資料之動力學分析。使用一種位點特異性結合演算法(方程式為Y=Bmax*X/(Kd+X))，使用Graphpad Prism 6.0軟體進行資料之穩態分析。在以下表6中報導Kd(微莫耳之單位)。
熟習此項技術者將易於瞭解本發明極其適合於實施目標及獲得
所提及之目的及優點，以及其中固有之目的及優點。本文中提供之實例表示較佳實施例、為例示性且不意欲限制本發明之範疇。
應理解，本發明在其應用中並不限制於以下描述中所闡述之或圖式中所說明之構造之細節及組件的配置。本發明包含除所描述之實施例以外的實施例且可以多種方式實踐及進行。又，應理解，本文中使用之措詞及術語以及摘要係出於說明目的且不應視為限制性。
因此，熟習此項技術者將瞭解，本發明所基於的概念可易於用作設計用於實現本發明之若干目的的其他結構、方法以及系統的基礎。因此，在申請專利範圍並不脫離本發明之精神及範疇的範圍內，申請專利範圍被視為包括此類等效構造是至關重要的。
儘管對於熟習此項技術者已足夠詳細地描述及例示本發明以便製造及使用本發明，但在不脫離本發明之精神及範疇的情況下，多種替代物、變化及改良應為顯而易見的。本文中提供之實例表示較佳實施例、為例示性且不意欲限制本發明之範疇。熟習此項技術者將知曉其中之變化及其他用途。此等變化涵蓋於本發明之精神內且由申請專利範圍之範疇定義。
熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本發明之範疇及精神的情況下對本文所揭示之本發明進行多種取代及變化。
本說明書中提及之所有專利及公開案表明熟習本發明所關於之此項技術者之水準。所有專利及公開案以引用方式併入，其程度如同各個別公開案專門且單獨指定為以引用方式併入。
本文中所說明性地描述之本發明可在不存在本文中未特定揭示之任何元件或多個元件、限制或多個限制之情況下合適地實踐。因此，舉例而言，在本文中之各種情況下，術語「包含」、「基本上由......組成」及「由......組成」中之任一者可由另外兩個術語中之任一者置換。已採用之術語及表述係用作描述而非限制之術語，且在使
用該等術語及表述中不意欲排除所顯示及描述之任何等效特徵或其部分，但應認識到在本發明主張範疇內，各種改良為可能的。因此，應理解儘管本發明已由較佳實施例及視情況選用之特徵特定揭示，但熟習此項技術者可次用本文所揭示之概念的修改及變化，且該等修改及變化視為處於由隨附申請專利範圍所界定的本發明之範疇內。
在以下申請專利範圍內闡述其他具體實例。
<110> 美商艾杜諾生物科技公司 喬治 艾德溫 卡提巴 大衛 凱恩 李奧納德 桑 凱西 瓜帝爾 羅拉 西斯 吉利曼 賈斯汀 雷恩 莎拉 M 麥克惠特 湯瑪斯 W 杜賓斯基 二世
<120> 活化「干擾素基因刺激因子」依賴性訊息傳導之組合物及方法
<130> ANZ-1004-UT
<150> US 62/131,235
<151> 2015-03-10
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 379
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：尼沃單抗之重鏈胺基酸序列
<400> 2
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：尼沃單抗之輕鏈胺基酸序列
<400> 3
<210> 4
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：派立珠單抗之重鏈胺基酸序列
<400> 4
<210> 5
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：派立珠單抗之輕鏈胺基酸序列
<400> 5
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈胺基酸序列
<400> 6
<210> 7
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈胺基酸序列
<400> 7
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：正向引子
<400> 8
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：反向引子
<400> 9
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hSTING外顯子3F
<400> 10
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hSTING外顯子3R
<400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hSTING外顯子6F
<400> 12
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hSTING外顯子6R
<400> 13
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hSTING外顯子7F
<400> 14
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hSTING外顯子7R
<400> 15
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
<210> 17
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：大腸桿菌表現構築體
<400> 17
Claims (16)
- 一種式III化合物，
- 如請求項1之化合物，其中該化合物係選自由以下組成之群：
- 如請求項1之化合物，其具有式IIIa之結構：
- 如請求項3之化合物，其中R21及R22皆為腺嘌呤。
- 如請求項3之化合物，其中R21為腺嘌呤且R22為鳥嘌呤。
- 一種化合物3'3'-RR-(2'F-A)(2'F-A)，其具有以下結構：
- 一種化合物3'3'-RR-(2'F-G)(2'F-A)，其具有以下結構：
- 如請求項1至7中任一項之化合物，其中該化合物為其鈉、鉀、鈣、鎂、鋅、鋁、銨、二乙胺、乙醇胺(olamine)、二苯甲基乙二胺(benzathine)、苯甲基苯乙胺(benethamine)、緩血酸胺(2-胺基-2-(羥基甲基)丙-1,3-二醇)、嗎啉、依泊胺、哌啶、甲基吡啶、二環己胺、N,N'-二苯甲基乙二胺、2-羥乙胺、三-(2-羥基乙基)胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、丹醇(deanol)、咪唑、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、普魯卡因(procaine)、二苯甲基哌啶、去氫松香胺(dehydroabietylamine)、葡糖胺、三甲基吡啶、奎寧(quinine)、喹諾酮、第三丁胺(erbumine)、離胺酸或精胺酸鹽。
- 如請求項1至7中任一項之化合物，其中該化合物為其鈉鹽。
- 一種醫藥組合物，其包含一或多種如請求項1至9中任一項之化合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
- 一種醫藥組合物，其包含一或多種如請求項1至9中任一項之化合物、另一種治療劑及醫藥學上可接受之賦形劑。
- 一種如請求項1至9中任一項之化合物或如請求項10或11之組合物的用途，其係用於製備用於治療患有癌症之個體的藥物。
- 如請求項12之用途，其中該藥物與一或多種其他癌症療法投 與，其中該一或多種其他癌症療法係選自由以下組成之群：放射療法、手術、化學療法或免疫療法。
- 一種i)如請求項1至9中任一項之化合物或如請求項10或11之組合物及ii)一或多種誘導抗體依賴性細胞毒性之治療性抗體的用途，其係用於製備用於治療個體中之疾病的藥物，其中該疾病係選自由以下組成之群：癌症、器官移植之急性排斥、I型糖尿病、類風濕性關節炎、牛皮癬、克羅恩氏病(Crohn's disease)、再狹窄及過敏性哮喘。
- 如請求項1至7中任一項之化合物，其係用於治療癌症。
- 如請求項1至7中任一項之化合物，其係用於治療選自由以下組成之群的疾病：癌症、器官移植之急性排斥、I型糖尿病、類風濕性關節炎、牛皮癬、克羅恩氏病、再狹窄及過敏性哮喘。
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