ES2329807T3

ES2329807T3 - Translectura regulada de codones de terminacion.

Info

Publication number: ES2329807T3
Application number: ES05700620T
Authority: ES
Inventors: Thomas Bouquin
Original assignee: Maxygen ApS; Maxygen Holdings Ltd
Current assignee: Maxygen ApS; Maxygen Holdings Ltd
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-28
Publication date: 2009-12-01
Anticipated expiration: 2025-01-28
Also published as: ATE440949T1; WO2005073375A1; DE602005016218D1; US20070224635A1; EP1716233B1; DK1716233T3; EP1716233A1

Abstract

Un procedimiento para evaluar selectivamente o seleccionar células que expresen un nivel deseado de un polipéptido, que comprende: a) proporcionar una pluralidad de células eucariotas en la que cada una comprende un casete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica el polipéptido; al menos un codón de terminación secuencia abajo del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que codifica un péptido de anclaje a la membrana celular secuencia abajo del codón de terminación; b) cultivar las células en presencia de un agente de inhibición de la terminación en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, siendo el agente de inhibición de la terminación un antibiótico de aminoglicósido; y c) usar una citometría de flujo para seleccionar al menos una célula que exprese el polipéptido fusionado con un péptido de anclaje a la membrana celular.

Description

Translectura regulada de codones de terminación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a diversos procedimientos basados en la inhibición selectiva de codones de terminación durante la traducción de proteínas, basados fundamentalmente en el uso de un antibiótico de aminoglicósido, incluyendo procedimientos para la producción alternativa de proteínas solubles o unidas a la membrana a partir de la misma célula, para la selección de clones celulares o de células y para la evaluación de la expresión de proteínas.

Antecedentes de la invención

Aunque los anticodones de los ARN de transferencia de aminoacilos (ARNt) reconocen los codones sentido, conduciendo a la incorporación de un aminoácido específico, no existen ARNt eucariotas con anticodones que se apareen con ninguno de los tres codones (sin sentido) de terminación UAA, UGA y UAG. La terminación de la traducción tiene lugar cuando un codón de terminación entra en el sitio A del ribosoma y está esencialmente controlada por el factor de liberación eRF1, cuya función está modulada por la GTPasa eRF3 (Stansfield, 1995; Zhouravleva, 1995). La terminación de la traducción es normalmente un procedimiento muy eficiente. Sin embargo, la mala incorporación de un aminoácido en el codón de terminación, también denominada inhibición o translectura traduccional, puede estar influida por varios parámetros, entre los que el contexto de las secuencias locales que rodean al codón de terminación parece desempeñar un papel fundamental. Se ha evaluado la importancia del nucleótido que se encuentra inmediatamente secuencia abajo del codón sin sentido en análisis traduccionales in vitro, y se ha confirmado que la eficiencia real de la terminación de la traducción depende enormemente de una secuencia tetranucleotídica (Manuvakhova et al., 2000).

Hace tiempo que se sabe que los antibióticos pertenecientes al grupo de los aminoglicósidos interfieren con el centro de descodificación del ARN ribosómico (ARNr). Estos antibióticos provocan una mala lectura del código del ARN y pueden permitir la inserción de aminoácidos alternativos en el sitio de un codón de terminación (Palmer et al., 1979). En función de la dosis, estos fármacos pueden inhibir la síntesis de proteínas. Estas observaciones han hecho posible el tratamiento de las enfermedades provocadas por mutaciones sin sentido con antibióticos de aminoglicósido. Algunos investigadores han usado esta propiedad de los aminoglicósidos en cultivos celulares o animales transgénicos que presentaban codones sin sentido en un gen estructural para permitir que la maquinaria de la traducción tradujera el ARNm completo y así complementar la mutación. Mediante el uso de células de mamífero cultivadas, Burke y Mogg (1985) observaron que los antibióticos de aminoglicósido paromomicina y G-418 podían restablecer parcialmente la síntesis de una proteína de tamaño completo de un gen mutante con una mutación UAG prematura. Posteriormente, se observó que la G-418 y la gentamicina restablecen la expresión de la proteína llamada regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) en una línea celular que porta una mutación sin sentido en el CFTR (Bedwell et al., 1997; Howard et al., 1996). Se ha hecho un estudio similar en ratones mutantes que presentaban un codón de terminación prematuro en el gen de la distrofina (Barton-Davis et al., 1999). Estas observaciones indican que los aminoglicósidos son eficientes en la promoción de la translectura traduccional tanto en células cultivadas como en organismos completos.

El documento US 2002/0086427 A1 da a conocer un sistema de expresión eucariota inducible en el que es posible activar o desactivar la expresión de un gen deseado en el nivel de la traducción génica mediante una señal inducible. Esto se realiza introduciendo una mutación en la secuencia que codifica el gen de interés que provoca una disminución o una alteración de la traducción, p. ej., un codón de terminación, y poniendo en contacto la célula eucariota que contiene el gen mutado de interés con un agente que inhiba el efecto de la mutación, p. ej., un aminoglicósido.

El documento WO 03/014361 da a conocer un procedimiento para la selección de clones de una sola célula usando el acoplamiento traduccional dependiente de un codón de terminación de la expresión de un gen marcador con la expresión de un gen de interés, dando como resultado dos productos génicos recombinantes, un producto codificado por el gen de interés y una proteína de fusión que comprende el gen de interés combinado con el gen marcador seleccionable. El gen marcador es, p. ej., un gen de resistencia farmacológica o un gen indicador tal como el gen de la GFP (proteína verde fluorescente). El procedimiento puede incluir el uso de un mecanismo de inhibición de un codón de terminación, p. ej., un elemento de la SECIS (secuencia de inserción de la selenocisteína) para obtener la inserción del aminoácido selenocisteína en un codón de terminación UGA.

El documento WO 03/099996 describe un procedimiento para seleccionar una célula que produzca un polipéptido secretado proporcionando una población de células que comprende una célula que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido secretado, poniendo en contacto la población de células con un compuesto que se une específicamente al polipéptido secretado, detectando la unión del compuesto con el polipéptido secretado sobre la superficie de la célula y seleccionando la célula en base a la presencia o la cantidad del compuesto unido con el polipéptido secretado sobre la superficie de la célula.

El documento WO 01/44516 da a conocer procedimientos de evaluación selectiva que implican la inhibición de un codón de terminación en un casete de expresión que comprende un péptido indicador secuencia abajo de un polipéptido de interés.

Ahora se ha descubierto que es posible usar los antibióticos de aminoglicósido para obtener selectivamente la translectura traduccional para, p. ej., la producción alternativa de formas solubles y unidas a la membrana o etiquetadas o marcadas de otro modo de una proteína recombinante a partir del mismo vector. Este descubrimiento tiene importantes implicaciones para proporcionar una variedad de procedimientos mejorados y ventajosos para la selección y la evaluación de clones celulares o células individuales, y para la evaluación de la expresión de proteínas.

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Resumen de la invención

En su sentido más amplio, la invención se refiere a diversos procedimientos, a veces denominados más adelante "translectura regulada", para la evaluación selectiva o la selección de células que expresen un polipéptido de interés, así como para la producción de un polipéptido de interés a partir de una célula seleccionada; en los que las células comprenden un casete de expresión que comprende un gen de interés y una secuencia que codifica de uno o más entre un péptido de anclaje a la membrana celular, un péptido indicador y una etiqueta epitópica, y además al menos un codón de terminación secuencia abajo de la secuencia que codifica el polipéptido de interés.

En un aspecto general, la invención se refiere a procedimientos para evaluar selectivamente o seleccionar células que expresen un nivel deseado de un polipéptido de interés, o para evaluar la expresión de polipéptidos recombinantes en una población de células, en los que las células comprenden un casete de expresión que comprende, en secuencia, una secuencia que codifica un polipéptido de interés, un codón de terminación y una secuencia que codifica un péptido de anclaje a la membrana celular.

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Una realización particular de este aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para evaluar selectivamente o seleccionar células que expresen un nivel deseado de un polipéptido de interés, que comprende:

a): proporcionar una pluralidad de células eucariotas en la que cada una comprende un casete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica el polipéptido de interés, al menos un codón de terminación secuencia abajo del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que codifica un péptido de anclaje a la membrana celular secuencia abajo del codón de terminación;

b): cultivar las células en presencia de un agente de inhibición de la terminación en condiciones que permitan la expresión del polipéptido de interés, siendo el agente de inhibición de la terminación un antibiótico de aminoglicósido; y

c): usar una citometría de flujo para seleccionar al menos una célula que exprese el polipéptido de interés fusionado con un péptido de anclaje a la membrana celular.

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Otra realización particular de este aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para evaluar la expresión de proteínas recombinantes en una población de células, que comprende:

a): proporcionar una pluralidad de células eucariotas en la que cada una comprende un casete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica un polipéptido recombinante, al menos un codón de terminación secuencia abajo del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que codifica un péptido de anclaje a la membrana celular secuencia abajo del codón de terminación;

b): cultivar las células en presencia de un agente de inhibición de la terminación en condiciones que permitan la expresión de una proteína de fusión que comprende el polipéptido recombinante y el péptido de anclaje a la membrana celular, siendo el agente de inhibición de la terminación un antibiótico de aminoglicósido; y

c): clasificar las células mediante citometría de flujo para seleccionar al menos una célula que exprese la proteína de fusión a un nivel deseado y/o con una uniformidad deseada.

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En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento para evaluar selectivamente o seleccionar al menos una célula que exprese un polipéptido con una afinidad de unión deseada por un ligando a partir de células que expresen un banco de variantes del polipéptido, que comprende:

a): proporcionar una pluralidad de células eucariotas en la que cada una comprende un casete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica una variante de polipéptido, al menos un codón de terminación secuencia abajo del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que codifica un péptido de anclaje a la membrana celular secuencia abajo del codón de terminación;

b): cultivar las células en presencia de un agente de inhibición de la terminación en condiciones que permitan la expresión de la variante de polipéptido, siendo el agente de inhibición de la terminación un antibiótico de aminoglicósido; y

c): usar una citometría de flujo para seleccionar al menos una célula que exprese la variante de polipéptido fusionada con un péptido de anclaje a la membrana celular en base a la afinidad de unión de dicha variante de polipéptido por dicho ligando.

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Un segundo aspecto general de la invención se refiere a procedimientos que permiten la expresión alternativa de diferentes polipéptidos a partir de una sola célula o de una línea celular, por ejemplo, i) un polipéptido soluble o ii) un polipéptido unido a la membrana; o i) un polipéptido sin marcar unido a la membrana o ii) un polipéptido marcado unido a la membrana.

Una realización particular de este aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para expresar alternativamente bien i) un polipéptido soluble o ii) un polipéptido unido a membrana a partir de una sola célula o de una línea celular, que comprende:

b): cultivar las células en presencia de un agente de inhibición de la terminación en condiciones que permitan la expresión del polipéptido de interés, siendo el agente de inhibición de la terminación un antibiótico de aminoglicósido;

c): usar una citometría de flujo para seleccionar al menos una célula que exprese el polipéptido de interés fusionado con un péptido de anclaje a la membrana celular; y

d): cultivar dicha célula seleccionada en ausencia de un agente de inhibición de la terminación para obtener la expresión del polipéptido de interés como un polipéptido soluble.

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Otra realización más de este aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para expresar alternativamente i) un polipéptido sin marcar unido a membrana o ii) un polipéptido marcado unido a membrana a partir de una sola célula o de una línea celular que comprende:

a): proporcionar una pluralidad de células eucariotas en la que cada una comprende un casete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica el polipéptido de interés y un péptido de anclaje a la membrana celular, al menos un codón de terminación secuencia abajo del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que codifica un péptido indicador o una etiqueta epitópica secuencia abajo del codón de terminación;

b): cultivar las células en presencia de un agente de inhibición de la terminación en condiciones que permitan la expresión del polipéptido de interés y del péptido de anclaje a la membrana celular, siendo el agente de inhibición de la terminación un antibiótico de aminoglicósido;

c): usar una citometría de flujo para seleccionar al menos una célula que exprese la proteína de fusión que comprende el polipéptido de interés, el péptido de anclaje a la membrana celular y un péptido indicador o una etiqueta epitópica; y

d): cultivar dicha célula seleccionada en ausencia de un agente de inhibición de la terminación para obtener la expresión de una proteína que comprende el polipéptido de interés en forma unida a la membrana sin el péptido indicador ni la etiqueta epitópica.

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También se dan a conocer en la presente memoria procedimientos adecuados para su uso como alternativas a la selección basada en antibióticos convencional de células transformadas con un gen de interés, mediante los cuales las células seleccionadas resultantes se pueden usar para la producción de un polipéptido de interés sin la expresión no deseada de un gen de resistencia a un antibiótico. En una realización, esta revelación se refiere a un procedimiento para evaluar selectivamente o seleccionar células que expresen un polipéptido de interés a partir de una población de células, que comprende:

a): transfectar una población de células con un casete de expresión que comprende, en secuencia, un gen de interés, al menos un codón de terminación y un péptido de dirección a una célula, casete de expresión que no comprende un gen de resistencia a un antibiótico;

b): cultivar la población transfectada de células en presencia de un agente de inhibición de la terminación; y

c): seleccionar al menos una célula que exprese el polipéptido de interés fusionado con un péptido de dirección a la célula.

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En otra realización, se da a conocer un procedimiento en el que la resistencia a antibióticos se usa a efectos de selección o evaluación selectiva en presencia de un antibiótico de aminoglicósido y un antibiótico de no aminoglicósido, pero en el que las células seleccionadas no expresan el gen de resistencia a un antibiótico en condiciones de producción normales en ausencia de un antibiótico de aminoglicósido. Esta realización se refiere a un procedimiento para evaluar selectivamente o seleccionar células que expresen un polipéptido de interés a partir de una población de células, que comprende:

a): transfectar una población de células con un casete de expresión que comprende, en secuencia, un gen de interés, al menos un codón de terminación y un gen de resistencia a un antibiótico, en el que el gen de resistencia a un antibiótico proporciona resistencia a un antibiótico de no aminoglicósido;

b): cultivar la población transfectada de células en presencia de un antibiótico de aminoglicósido y el antibiótico de no aminoglicósido; y

c): seleccionar al menos una célula que sea capaz de crecer en presencia del antibiótico de no aminoglicósido.

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En un aspecto más, se da a conocer un procedimiento para evaluar selectivamente o seleccionar clones celulares que expresen un nivel elevado de un polipéptido de interés, pero en el que no es necesario el uso de un aminoglicósido. Este procedimiento comprende las etapas de:

a): proporcionar una pluralidad de células en la que cada una comprende un casete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica el polipéptido, al menos un codón de terminación secuencia abajo del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que codifica un péptido de anclaje a la membrana celular, un péptido indicador o una etiqueta epitópica secuencia abajo del codón de terminación;

b): cultivar las células en condiciones que permitan la expresión del polipéptido; y

c): seleccionar al menos una célula que exprese el polipéptido fusionado con un péptido de anclaje a la membrana celular.

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Otro aspecto más de lo dado a conocer se refiere a un procedimiento para producir un polipéptido, que comprende cultivar una línea celular obtenida mediante cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, línea celular que es cultivada en ausencia de un antibiótico de aminoglicósido para permitir la expresión del polipéptido, y aislar dicho polipéptido, p. ej., tal que el polipéptido es un polipéptido soluble que es secretado en un medio de cultivo y el polipéptido es aislado de dicho medio.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra los datos del vector pLenti6-PC-GPI.

La figura 2 muestra los datos del vector pLenti6-PC-UAAC-GPI.

La figura 3 muestra los datos del vector pLenti6-PC-UGAC-GPI.

La figura 4 muestra los resultados de un análisis de FACS de la expresión en la superficie celular de la proteína C (PC) y un anclaje GPI con o sin un codón de terminación y en presencia de diferentes cantidades del antibiótico de aminoglicósido G-418.

La figura 5 muestra los resultados de la clasificación FACS y de los análisis de líneas celulares transgénicas que albergan el constructo PC-UAAC-GPI y que han sido tratadas (B) o no tratadas (A) con G-418. Las células cuya fluorescencia fue incluida bien en la entrada P2 o P3 de (B) fueron clasificadas individualmente y desarrolladas en mayor profundidad antes del análisis de FACS de la PC anclada a la membrana (C).

La figura 6 muestra una comparación de la actividad de la proteína C (PC) de 26 clones individuales en comparación con la fluorescencia relativa de los respectivos clones determinados mediante FACS.

La figura 7 muestra los datos del vector Retro-IFN-UGAG.

La figura 8 muestra los resultados del análisis FACS de tres clones diferentes en cuanto a la uniformidad de la expresión de proteínas recombinantes en poblaciones de células.

La figura 9 muestra los datos del vector pCDNA6-FVII-UAA-EGFPd.

La figura 10 muestra los datos del vector pCDNA6-ARI-UAA-V5.

La figura 11 muestra los datos del vector pCDNA6-FVII-UAA-GPI.

La figura 12 muestra los resultados de la clasificación FACS de células CHO-K1 control (A) y células CHO-K1 transfectadas para expresar una proteína de fusión FVII-GPI (B) usando una selección basada en la translectura traduccional mediada por un aminoglicósido con G-418 en ausencia de un gen de resistencia al antibiótico.

La figura 13 muestra los resultados de una segunda serie de clasificación FACS de células CHO-K1 no transfectadas como control (A) y células CHO-K1 transfectadas (B), en la que las células transfectadas eran aquéllas seleccionadas como positivas para la expresión de la proteína de fusión FVII-GPI según lo mostrado en la figura 12 (B) y cultivadas durante 10 días antes del análisis.

La figura 14 muestra la secuencia de ADN y de aminoácidos del casete PC-GPI (SEC ID N.º 1), incluyendo el péptido señal PC nativo, en el constructo de la figura 1 (negrita: secuencia de ADN y aminoácidos del anclaje GPI; cursiva: codones de terminación).

La figura 15 muestra la secuencia de ADN y de aminoácidos del casete PC-UAAC-GPI-4Terminación (SEC ID N.º 2), incluyendo el péptido señal PC nativo, en el constructo de la figura 2 (subrayado + cursiva: codón de terminación de la translectura; negrita: secuencia de ADN y aminoácidos del anclaje GPI; cursiva: codones de terminación).

La figura 16 muestra la secuencia de ADN y de aminoácidos del casete PC-UGAC-GPI-4Terminación (SEC ID N.º 3), incluyendo el péptido señal PC nativo, en el constructo de la figura 3 (subrayado + cursiva: codón de terminación de la translectura; negrita: secuencia de ADN y aminoácidos del anclaje GPI; cursiva: codones de terminación).

La figura 17 muestra la secuencia de ADN y de aminoácidos del casete FVII-UAA-GPI (SEC ID N.º 4), incluyendo el péptido señal FVII nativo, en el constructo de la figura 11 (subrayado + cursiva: codón de terminación de la translectura; negrita: secuencia de ADN y aminoácidos del anclaje GPI; cursiva: codones de terminación).

La figura 18 muestra la secuencia de ADN y de aminoácidos del casete IFN-UGAG (SEC ID N.º 5), incluyendo un péptido señal sintético, en el constructo de la figura 7 (subrayado: secuencia de ADN de IF-N\alpha-21b humano maduro; encuadrado: secuencia de ADN de la etiqueta E y la etiqueta S; subrayado + cursiva: codón de terminación de la translectura; sombreado: secuencia de ADN del epítopo V5; negrita: secuencia de ADN y aminoácidos del anclaje GPI; cursiva: codones de terminación).

La figura 19 muestra los datos del vector Retro-HC Lib.

La figura 20 muestra los datos del vector Retro-LC Lib.

La figura 21 muestra los datos del vector pB205.

La figura 22 muestra la secuencia de ADN y de aminoácidos del casete FVII-UAA-GPI (SEC ID N.º 6) en el constructo de la figura 21, incluyendo el péptido señal FVII nativo y una secuencia de FVII humano modificado con las sustituciones de los aminoácidos P10Q, K32E, A34E, R36E, T106N y V253N en comparación con FVII humano de tipo natural (subrayado + cursiva: codón de terminación de la translectura; negrita: secuencia de ADN y aminoácidos del anclaje GPI; cursiva: codones de terminación).

La figura 23 muestra los resultados de la producción libre de suero de FVII recombinante soluble en clones de CHO-K1 obtenidos usando una clonación por dilución limitada "clásica" en comparación con la producción de clones seleccionados usando el enfoque de translectura regulada de la invención en combinación con un análisis de FACS.

Exposición detallada de la invención

La invención proporciona, en una realización, un sistema que permite la selección eficiente de líneas celulares que expresen niveles elevados de proteínas recombinantes mediante el uso de la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, también denominada citometría de flujo) y que se basa en la propiedad de los antibióticos de aminoglicósido para promover la translectura traduccional. El casete de expresión se compone, por ejemplo, de un gen recombinante de interés (GDI) para ser expresado en células huésped, seguido por un codón de terminación y una señal de anclaje a la membrana celular. Se puede seleccionar uno cualquiera de los tres codones de terminación (UAA, UAG y UGA) en diversos contextos tetranucleotídicos, en función de los niveles de fondo deseados de la inhibición, así como la expresión inducible dependiente de un aminoglicósido y los niveles máximos de translectura tras el tratamiento con el aminoglicósido. En presencia de aminoglicósidos, se promueve la translectura traduccional y se produce un subconjunto de proteína recombinante como la proteína recombinante fusionada con la señal de anclaje a la membrana celular. Como resultado de ello, esta proteína de fusión se expone en la superficie exterior de las células huésped, pudiéndose seleccionar las células que presentan niveles elevados de proteína recombinante anclada a la membrana mediante FACS. Tras la clasificación celular, se cultivan las células en ausencia de aminoglicósido para permitir una terminación de la traducción eficiente y una producción de niveles elevados de proteína recombinante soluble.

En otra realización de la invención, se puede reemplazar la señal de anclaje a la membrana por un gen indicador tal como la proteína verde fluorescente (GFP) o una etiqueta epitópica tal como el epítopo V5. En presencia de aminoglicósidos, se promueve la translectura traduccional y, como resultado de ello, se produce una versión marcada de la proteína recombinante. Esto permite la fácil detección o cuantificación de la expresión de proteínas recombinantes mediante transferencias Western o ELISA, por ejemplo. Si sólo se desea la producción de proteína recombinante nativa, se cultivan las células en ausencia de aminoglicósidos para permitir una terminación de la traducción eficiente. Además, si la proteína recombinante es una proteína anclada a la membrana, tal como algunos receptores hormonales, la translectura mediada por aminoglicósidos permite la clasificación de líneas celulares mediante FACS usando anticuerpos de detección marcados frente al gen indicador o al epítopo. Tras la clasificación celular, se retira el antibiótico de aminoglicósido del medio de cultivo para permitir la producción de proteína recombinante sin marcar.

En otra realización de la invención, se fusionan traduccionalmente tanto un gen indicador (o un epítopo) como una señal de anclaje a la membrana con el GDI que está seguido por un codón de terminación. El casete de expresión resultante (GDI-codón de terminación-gen indicador-señal de anclaje a la membrana) permite comúnmente una selección basada en la FACS eficiente de células tratadas con aminoglicósido que expresan niveles elevados de proteína recombinante, porque la proteína de fusión está dirigida a la membrana celular. Además, la proteína indicadora o la etiqueta epitópica, que está secuencia abajo de la señal de terminación, se puede usar como una diana para anticuerpos específicos durante la clasificación FACS. Alternativamente, la proteína indicadora puede ser una proteína que presente propiedades fluorescentes naturales (p. ej., GFP). Cuando se desee la expresión de proteínas recombinantes solubles, se retiran los aminoglicósidos del medio de cultivo para permitir una terminación de la traducción eficiente. Como resultado de ello, se puede producir la proteína recombinante nativa sola a partir de la misma célula o el mismo vector usados para producir la versión anclada o marcada del polipéptido de interés.

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Definiciones

A no ser que se defina lo contrario en la presente memoria o más adelante en el resto de la memoria, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado comúnmente entendido por aquellos expertos habituales en la técnica a la que pertenece la presente invención.

Una "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de polinucleótido" o "polinucleótido" es un ácido nucleico (que es un polímero de nucleótidos (A, C, T, U, G, etc., o análogos de nucleótido naturales o artificiales)) o una sucesión de caracteres que representan un ácido nucleico, en función del contexto. Bien la secuencia de ácido nucleico dada o la secuencia de ácido nucleico complementaria se puede determinar a partir de cualquier secuencia de polinucleótido especificada.

De manera similar, una "secuencia de aminoácidos" es un polímero de aminoácidos (una proteína, un polipéptido, etc.) o una sucesión de caracteres que representa un polímero de aminoácidos, en función del contexto. Bien el ácido nucleico dado o el ácido nucleico complementario se puede determinar a partir de cualquier secuencia de polinucleótido especificada.

Los términos "proteína", "péptido" o "polipéptido" se pueden usar indistintamente en la presente memoria para referirse a polímeros de aminoácidos, sin que ninguno de estos términos se limite a una secuencia de aminoácidos de una longitud determinada. De manera similar, los términos "proteína de interés" o "polipéptido de interés" se pueden usar indistintamente en el presente contexto. Estos términos pretenden incluir no sólo las proteínas de longitud completa, sino también, p. ej., fragmentos o versiones truncadas, variantes, dominios, etc., de cualquier proteína o polipéptido dado. De manera similar, el término "péptido", como se usa en la presente memoria, incluye proteínas de longitud completa, así como, p. ej., péptidos más cortos de cualquier longitud dada en función del contexto.

La "población de células", en el contexto de la presente invención, puede ser cualquier población de cualquier tipo de célula, en concreto, células eucariotas. La población puede comprender células que expresen un banco de polipéptidos, p. ej., un banco de anticuerpos de pacientes que no hayan recibido un tratamiento determinado o un banco de variantes de polipéptido, en la que el objetivo consiste en identificar anticuerpos o variantes de polipéptido del banco que tengan una afinidad de unión deseada, o puede comprender una colección de clones celulares, en la que el objetivo consiste, p. ej., en identificar clones que tengan un nivel de expresión elevado y uniforme de un polipéptido de interés. Para las poblaciones de células que expresan un banco de polipéptidos, éstas pueden ser, por ejemplo, un banco de anticuerpos de pacientes que no hayan recibido un tratamiento determinado, un banco de anticuerpos obtenido mediante la inmunización con una diana de interés, o un banco de un polipéptido anticuerpo o no anticuerpo de interés que haya sido sometido a una mutagénesis. En el caso de los bancos sometidos a mutagénesis, la mutagénesis se puede realizar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Un procedimiento de mutagénesis general preferido es el barajado de ADN o la evolución dirigida; véase, por ejemplo, Kurtzman et al. (2001) para consultar la evolución de proteínas dirigida aplicada a proteínas terapéuticas, y Whalen et al. (2001) para consultar el barajado de ADN aplicado a vacunas.

"Selección" o "evaluación selectiva" se refiere a la identificación de una o más células de una población de células, en la que la una o más células cumplen uno o más criterios de selección predeterminados según lo determinado mediante procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar la selección o la evaluación selectiva usando una FACS u otro procedimiento basado en la fluorescencia, un ELISA u otro procedimiento basado en la afinidad, o por medio de un procedimiento basado en la radiactividad. Las células que son identificadas como resultado del procedimiento de evaluación selectiva/selección serán aisladas generalmente de células no seleccionadas de la población de células original, p. ej., para su uso en una o más series adicionales de selección, incluyendo opcionalmente (además), mutagénesis, para un análisis cualitativo o cuantitativo adicional, o para su uso, p. ej., en el desarrollo de una línea celular para la producción de proteínas. En la presente memoria, en general, los términos "selección" y "evaluación selectiva" se usan indistintamente.

En el procedimiento de la invención para evaluar selectivamente o seleccionar células que expresen un polipéptido con una afinidad de unión deseada por un ligando a partir de células que expresan un banco de variantes de polipéptido, el ligando puede ser cualquier molécula que se una con el polipéptido de interés, incluyendo tanto polipéptidos como moléculas no peptídicas ("moléculas pequeñas"). En el caso de los ligandos de polipéptido, el ligando puede ser cualquier clase de polipéptido para el que se desee optimizar la unión con el polipéptido de interés, incluyendo un receptor. Por ejemplo, cuando el polipéptido de interés es un interferón alfa, el "ligando" en este contexto puede ser el receptor 1 ó 2 del interferón alfa, aunque estos receptores no serían considerados normalmente como un "ligando". Un uso particularmente interesante de este procedimiento de la invención es el de la evaluación selectiva de bancos de anticuerpos basada en la unión de los anticuerpos con un antígeno diana.

El polipéptido de interés no se limita a ninguna proteína o grupo de proteínas en concreto, sino que, por el contrario, puede ser cualquier proteína, de cualquier función u origen, que se desee seleccionar y/o expresar mediante los procedimientos descritos en la presente memoria. El polipéptido de interés puede ser, por tanto, una proteína terapéutica, tal como la citocina, un anticuerpo, una hormona o una enzima terapéutica. Alternativamente, el polipéptido de interés puede ser, p. ej., una enzima industrial.

El polipéptido de interés puede ser una proteína madura o una forma precursora de la misma, o un fragmento funcional de la misma que haya conservado esencialmente una actividad biológica de la proteína madura.

El polipéptido puede ser un polipéptido terapéutico útil en una terapia para seres humanos o veterinaria, i.e., un polipéptido que sea fisiológicamente activo al ser introducido en el sistema circulatorio de o ser administrado de otro modo a un ser humano o a un animal; un polipéptido de diagnóstico útil en el diagnóstico; o un polipéptido industrial útil a efectos industriales, tales como un procedimiento de fabricación en el que el polipéptido constituya un ingrediente funcional o en el que el polipéptido sea usado para el procesamiento u otra modificación de las materias primas durante la fabricación.

El polipéptido puede ser de origen mamífero, p. ej., de origen humano, porcino, ovino, ursino, murino, de conejo, de asno, de murciélago; de origen microbiano, p. ej., de hongo, levadura; o de origen bacteriano; o puede ser derivado de otras fuentes tales como de veneno, o de una sanguijuela, una rana o un mosquito. En el caso de un polipéptido terapéutico, éste es preferiblemente de origen humano, mientras que un polipéptido industrial de interés suele ser de origen microbiano.

Los ejemplos específicos de grupos de polipéptidos que se pueden seleccionar o expresar según la invención incluyen: un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una proteína plasmática, una proteína eritrocítica o trombocítica, una citocina, un factor de crecimiento, una proteína profibrinolítica, una proteína de unión, un inhibidor de la proteasa, un antígeno, una enzima, un ligando, un receptor y una hormona. Es de particular interés un polipéptido que medie su efecto biológico mediante la unión con un receptor celular cuando sea administrado a un paciente. En el caso de un anticuerpo, éste puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, y puede ser de cualquier origen incluyendo de origen humano, murino o de conejo. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado. Los anticuerpos específicos y los fragmentos de los mismos incluyen aquéllos que son reactivos con cualquiera de las proteínas de no anticuerpo terapéuticas mencionadas más adelante.

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Anticuerpos

En una realización, los procedimientos de la presente invención se pueden aplicar a la selección y la expresión de anticuerpos para cumplir una amplia variedad de funciones determinadas en buena parte por la selección del antígeno o los antígenos diana.

Como se usa en la presente memoria, un "anticuerpo" se refiere a una proteína que comprende uno o más polipéptidos codificados sustancial o parcialmente por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina, p. ej., un fragmento que contiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (RDC). Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como los miles de genes de regiones variables de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican comúnmente, p. ej., bien como kappa o como lambda. Las cadenas pesadas se clasifican comúnmente, p. ej., como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Una unidad estructural muy común de inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. En la naturaleza, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). El terminal N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos fundamentalmente responsables del reconocimiento antigénico. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.

Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por la digestión de diversas peptidasas. De este modo, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces de tipo disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2 (fragmento de unión al antígeno) y Fc (fragmento cristalizable o fragmento de unión complementaria). F(ab)'2 es un dímero de Fab, que es una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace tipo disulfuro. El F(ab)'2 puede ser reducido en condiciones suaves para romper el enlace de tipo disulfuro de la región bisagra convirtiendo así el dímero (Fab')2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra. La porción Fc de la molécula de anticuerpo corresponde en buena parte a la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, y es responsable de la función efectora del anticuerpo (véase "Fundamental Immunology", IV Edición. W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1998), para una descripción detallada de los fragmentos de anticuerpos). Mientras que diversos fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, cualquier experto en la técnica entenderá que tales fragmentos Fab' o Fc se pueden sintetizar de novo bien químicamente o mediante la utilización de una metodología de ADN recombinante, despliegue en péptidos o similar. De este modo, el término anticuerpo, como se usa en la presente memoria, también incluye fragmentos de anticuerpos bien producidos mediante la modificación de anticuerpos enteros o sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante.

Los anticuerpos también incluyen anticuerpos monoclonales compuestos de un solo brazo, anticuerpos monocatenarios, incluyendo anticuerpos Fv monocatenarios (scFv) en los que hay una cadena pesada variable y una cadena ligera variable unidas entre sí (directamente o a través de un ligador peptídico) para formar un polipéptido continuo, así como fragmentos divalentes, trivalentes y tetravalentes (Pack et al. 1995; Pack et al., 1993; Pack & Plueckthun, 1992). Los anticuerpos son, p. ej., policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados, monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos producidos por un banco de expresión de Fab o similares.

Mediante el uso de procedimientos conocidos generalmente en la técnica, es posible generar y desarrollar, a través de la selección de antígenos diana apropiados, anticuerpos como candidatos de un tratamiento para un número de enfermedades humanas; véase, p. ej., el documento WO 01/32712 para consultar una descripción detallada de los procedimientos para generar una diversidad de anticuerpos, así como para acceder a más información sobre anticuerpos concretos. Por ejemplo, las enfermedades que resultan de una mala regulación del sistema inmune, tales como enfermedades inflamatorias crónicas (p. ej., el lupus eritematoso, la artritis reumatoide y la diabetes) y las alergias pueden responder favorablemente a anticuerpos que se dirigen a componentes de la red reguladora inmune, p. ej., determinantes de la superficie de células T y células B, superantígenos, CPH de clase II, interferón gamma, interferón alfa y leucointegrina. De manera similar, se pueden desarrollar reactivos de anticuerpos humanizados y optimizados para el tratamiento de trastornos autoinmunes agudos, tales como la hidropesía fetal inducida por el factor Rhesus (Rh) a través de la generación de anticuerpos anti-Rh recombinantes mejorados.

Además, los anticuerpos dirigidos frente a otras dianas, tales como marcadores aislados de endotelio vascular o epitelio activado, tienen potencial en la modulación de la respuesta inmune. De manera similar, los anticuerpos frente a inmunomoduladores de moléculas pequeñas, tales como la nitrotirosina, pueden desempeñar un papel en la regulación de los trastornos del sistema inmune. Los anticuerpos elevados y optimizados frente a alérgenos, por ejemplo, alérgeno de los ácaros del polvo, ofrecen un posible agente terapéutico en el tratamiento de alergias comunes.

Los procedimientos de la invención se pueden usar para seleccionar y/o expresar anticuerpos dirigidos frente a receptores y ligandos de la superficie de linfocitos (p. ej., B7, CD80, CD86, CD28 y CTLA-4), moléculas de adhesión (p.ej., LFA-1, Pgp-1, VLA-4, VCAM-1, ICAM-1, etc.), interleucinas y sus receptores (p. ej., IL-2, RIL-2, etc.) y otras citocinas (por ejemplo, interferón gamma, factor de la necrosis tumoral, interferón alfa, factor de crecimiento transformante beta, etc., así como, p. ej., cualquiera de las citocinas enumeradas más adelante) y receptores de citocinas, tales como receptores de cualquiera de las citocinas enumeradas más adelante. También son de interés los anticuerpos frente a los antígenos de grupo de diferenciación (CD), por ejemplo: CD25, CD20, CD28, CD18, CD23, CD22, CD30, CD44, CD150 y sus receptores, p. ej., CD45R.

Los anticuerpos para los agentes inmunoterapéuticos del cáncer también son candidatos para la selección y/o la expresión mediante los procedimientos de la invención. Los marcadores de pancarcinomas, así como los marcadores expresados sobre la superficie de tipos específicos de tumores, p. ej., carcinoma de vejiga, de mama, de próstata, de ovario, melanoma, glioma, linfoma y colorrectal, etc, se pueden aislar y usar para generar anticuerpos monoclonales. De manera similar, los factores de crecimiento tumoral conocidos, las moléculas reguladoras y los marcadores, incluyendo el FNT alfa, interferón gamma, ras, ErbB2, R-ErbB-3, adrenomedulina, Fas, FCE, R-FCE, neuT de rata, receptor de Flk-1, factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV), nsclc, marcadores de pancarcinomas, antígeno carcinoembrionario (ACE), gonadotrofina coriónica humana (GCH) y alfafetoproteína (AFP), son todos adecuados como dianas de anticuerpo.

Los trastornos neurológicos tales como la enfermedad de Alzheimer pueden ser tratados, por ejemplo, mediante el desarrollo de anticuerpos optimizados frente a agregados de beta-amiloide. También se pueden desarrollar anticuerpos para el tratamiento de trastornos degenerativos crónicos, tales como la esclerosis múltiple. Los anticuerpos también son optimizados para su uso en el tratamiento de sobredosis de drogas y toxicidad, p. ej., cocaína y antidepresivos. Los reactivos útiles para el diagnóstico de trastornos neurológicos también pueden ser seleccionados y/o expresados usando los procedimientos de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos frente a componentes neurales, tales como la hexosaminidasa A, son valiosos en el diagnóstico de trastornos neurológicos específicos, p. ej., la enfermedad de Tay-Sachs.

Los anticuerpos humanizados optimizados para unirse a proteínas implicadas en la homeostasis de lípidos, tales como la proteína transportadora de ésteres de colesterol (PTEC), lipoproteína de baja densidad (LDL) y el marcador de placas ateroescleróticas, el Z2D3, tienen una posible utilidad en el diagnóstico y el tratamiento de hiperlipidemia y arteriosclerosis. De manera similar, los anticuerpos frente a adipocitos humanos tienen potencial en el tratamiento de la obesidad. Los anticuerpos dirigidos frente a la fosfolipasa A2 de tipo II son un posible reactivo en el tratamiento del infarto de miocardio y los anticuerpos frente a la fibrina tienen potencial en el tratamiento de los trastornos de la coagulación.

También se pueden usar anticuerpos en el tratamiento de enfermedades infecciosas, incluyendo aquéllas provocadas por patógenos virales, p. ej., el virus del herpes simple, el herpes Zoster, la hepatitis A, B y C, el citomegalovirus, el virus sincitial respiratorio, la rabia, el virus del papiloma humano, la varicela Zoster, el parvovirus B19 y agentes virales que provocan el resfriado común, entre otros. También es de interés la coevolución de anticuerpos frente al VIH, incluyendo epítopos derivados de proteínas de la envoltura, e incluyendo p17, gp120, gyp41 y p24. También se pueden desarrollar anticuerpos que son útiles en el tratamiento de enfermedades infecciosas provocadas por agentes bacterianos, incluyendo enterococos, (p. ej., E. coli verotoxin), bacilo psocyaneus (flagelo), Pneumocystis carinii, Pseudomonas aureuginosa, Staphylococcus epidermidis, Clostridium difficile, Cryptosporidium sp., Pseudomonas sp., y tétanos. Los candidatos para el tratamiento de infecciones por hongos incluyen proteínas de choque térmico ubicuas, p. ej., la hsp90 de Candida albicans, que se puede seleccionar en cuanto a la alta unión por afinidad, en lugar de la antigenicidad limitada del antígeno diana.

Además de los anticuerpos útiles en el tratamiento o el diagnóstico de trastornos específicos según lo enumerado anteriormente y según lo presentado, p. ej., en las tablas 1 y 2 del documento WO 01/32712, quedará claro que diversos subconjuntos de clases de anticuerpos, tales como anticuerpos antiidiotípicos, anticuerpos miméticos, anticuerpos anti-codón, anticuerpos bifuncionales, fragmentos divalentes, fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos compuestos de un solo brazo, anticuerpos monovalentes, anticuerpos humanizados, anticuerpos primatizados, anticuerpos desencadenantes, agregados de anticuerpos y conjugados de anticuerpos, pueden ser todos seleccionados y/o expresados mediante los procedimientos de la invención. Los conjugados de anticuerpos incluyen anticuerpos conjugados con restos de proteínas (p. ej., enzimas, factor de crecimiento nervioso), agentes quimioterapéuticos o antiproliferativos (genisteína, doxorrubicina, calicheamicina, MX-DPTA, maitansina, mitomicina, etc.), radio-conjugados (p. ej., renio-186, renio-188, astatina-211, tecnetio-99, indio-111) y toxinas (p.ej., las exotoxinas de Pseudomonas truncadas PE38 y PE40, ricina bloqueada). También se incluyen anticuerpos conjugados con restos bioactivos, tales como agentes vasoactivos y restos que facilitan el transporte del anticuerpo a través de membranas o al interior del núcleo. También se contemplan anticuerpos conjugados con partículas no biológicas, tales como oro y nanopartículas magnéticas (NPM, p. ej., de un tamaño que varía de 10-50 nm).

Los anticuerpos se pueden producir, p. ej., usando bancos de anticuerpos humanos obtenidos de sujetos que no han sido inmunizados con un determinado antígeno diana) o de células aisladas de seres humanos que estén inmunizados con una diana de interés (p. ej., células aisladas de pacientes que padecen una enfermedad tal como una infección por VIH o cualquier otra afección que dé como resultado la producción de anticuerpos frente a una diana). Por ejemplo, se puede usar cualquiera de las dianas relevantes para evaluar selectivamente bancos de anticuerpos desplegados obtenidos de sujetos que no han sido inmunizados con un determinado antígeno diana (p.ej., bancos de seres humanos no inmunizados). Alternativamente, se pueden usar las dianas para generar anticuerpos en animales, tales como ratones o conejos usando procedimientos estándar. Se pueden crear bancos de anticuerpos que comprendan cadenas pesadas y ligeras como bancos mono-cistrónicos separados de cadenas pesadas o de cadenas ligeras, o usando un vector bi-cistrónico, combinando cadenas pesadas y ligeras en el mismo vector.

Polipéptidos de no anticuerpo

En el caso de los polipéptidos terapéuticos de no anticuerpo, éstos se pueden seleccionar entre los siguientes:

i): una proteína plasmática, p. ej., un factor del sistema de coagulación, tal como factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XIII, trombina, proteína C, antitrombina III o co-factor de heparina II, inhibidor de factores tisulares (p. ej., 1 ó 2), receptor de proteína C de la superficie celular endotelial, un factor del sistema fibrinolítico, tal como pro-uroquinasa, uroquinasa, activador de plasminógeno tisular, inhibidor del activador de plasminógeno 1 (IAP-1) o inhibidor del activador de plasminógeno 2 (IAP-2), el factor de Von Willebrand o un inhibidor de la \alpha-1-proteinasa;

ii): una proteína eritrocítica o trombocítica, p. ej., hemoglobina, trombospondina o factor plaquetario 4;

iii): una citocina, p. ej., una interleucina, tal como IL-1 (p. ej., IL-1\alpha o IL-1\beta), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, un polipéptido relacionado con citocina, tal como IL-1Ra, un interferón tal como interferón-\alpha, interferón-\beta o interferón-\gamma, un factor estimulante de colonias tal como FEC-GM o FEC-G, factor de células madre (FCM), una proteína de unión, un miembro de la familia de los factores de necrosis tumoral (p. ej., FNT-\alpha, linfotoxina-\alpha, linfotoxina-\beta, FasL, CD40L, CD30L, CD27L, Ox40L, 4-IBBL, RANKL, TRAIL, TWEAK, LIGHT, TRANCE, APRIL, THANK o TALL-1);

iv): un factor de crecimiento, p. ej., factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), factor de crecimiento transformante \alpha (FCT-\alpha), factor de crecimiento transformante \beta (FCT-\beta), factor de crecimiento epidérmico (FCE), factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV), somatotropina (hormona de crecimiento), una somatomedina, tal como factor de crecimiento de tipo insulínico I (FCI-I) o factor de crecimiento de tipo insulínico II (FCI-II), eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (TPO) o angiopoyetina;

v): una proteína profibrinolítica, p. ej., estafiloquinasa o estreptoquinasa;

vi): un inhibidor de la proteasa, p. ej., aprotinina o CI-2A;

vii): una enzima, p. ej., superóxido-dismutasa, catalasa, uricasa, bilirrubin-oxidasa, tripsina, papaína, asparaginasa, arginasa, arginin-desiminasa, adenosin-desaminasa, ribonucleasa, alkalino-fosfatasa, \beta-glucuronidasa, purina-nucleósido-fosforilasa o batroxobina;

viii): un opioide, p. ej., endorfinas, encefalinas u opioides no naturales;

ix): una hormona o un neuropéptido, p. ej., insulina, calcitonina, glucagones, hormona adrenocorticotrópica (HACT), somatostatina, gastrinas, colecistocininas, hormona paratiroidea (HPT), hormona luteinizante (HL), hormona de estimulación folicular (HEF), hormona de liberación de gonadotropina, gonadotropina coriónica, factor de liberación de corticotropina, vasopresina, oxitocina, hormonas antidiuréticas, hormona de estimulación tiroidea, hormona de liberación de tirotropina, relaxina, péptido de tipo glucagón 1 (GLP-1), péptido de tipo glucagón 2 (GLP- 2), prolactina, neuropéptido Y, péptido YY, polipéptido pancreático, leptina, orexina, CART (transcripto regulado por cocaína y anfetamina), un péptido relacionado con CART, melanocortinas (hormonas estimulantes de melanocitos), hormona de concentración de melanina, péptidos natriuréticos, adrenomedulina, endotelina, exendina, secretina, amilina (IAPP; precursor de polipéptido amiloide de los islotes), péptido intestinal vasoactivo (PIV), polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP), péptidos agouti y relacionados con agouti u hormonas de liberación de somatotropina; o

x): otro tipo de proteína o péptido terapéutico, tal como timosina, bombesina, péptidos de tipo bombesina, proteína de unión a la heparina, CD4 soluble, hormonas pigmentarias, factor de liberación hipotalámico, malanotoninas, proteína activadora de la fosfolipasa, una enzima destoxificante, tal como aciloxiacil-hidrolasa o un péptido antimicrobiano.

En el caso de un polipéptido industrial, éste es comúnmente una enzima, en concreto, una enzima microbiana usada en productos o en la fabricación de productos, tales como detergentes, artículos para el hogar, productos de higiene personal, productos agroquímicos, productos textiles, productos alimentarios, en concreto, productos de panadería, piensos, o en procedimientos industriales tales como la limpieza de superficies duras. El polipéptido industrial no está normalmente destinado a la administración interna a seres humanos ni a animales. Los ejemplos específicos incluyen hidrolasas, tales como proteasas, lipasas o cutinasas, oxidorreductasas, tales como laccasa y peroxidada, transferasas, tales como transglutaminasas, isomerasas, tales como la proteína disulfuro-isomerasa y glucosa-isomerasa, enzimas de degradación de la pared celular, tales como celulasas, xilanasas, pectinasas, mannanasas, etc., enzimas amilolíticas, tales como endoamilasas, p. ej., alfa-amilasas o exo-amilasas, p. ej., beta-amilasas o amiloglucosidasas, etc.

Enfoques de la translectura regulada

El codón de terminación, también conocido como un codón de terminación de cadena, usado en el procedimiento de la invención puede ser uno cualquiera o más de los tres codones UAA, UAG y UGA que señalizan la terminación de la síntesis de una proteína. Aunque normalmente los casetes de expresión para su uso en los procedimientos de la invención comprenderán únicamente un solo codón de terminación secuencia arriba de la secuencia que codifica el péptido de anclaje a la membrana celular, del péptido indicador, de la etiqueta epitópica o del gen de resistencia a un antibiótico, también es posible usar una serie de dos o más codones de terminación, p. ej., dos o tres codones de terminación, que pueden ser iguales o diferentes. Según lo descrito más detalladamente más adelante, en general, hay un nivel muy bajo de translectura del codón de terminación incluso en ausencia de un agente de terminación de la cadena. En función de factores tales como el nivel natural de la translectura de fondo para un codón de terminación dado en un constructo dado y el objetivo de un determinado procedimiento de selección según la invención, puede ser en algunos casos deseable usar más de un codón de terminación para reducir más la translectura de fondo. De manera similar, los niveles de translectura con y sin un agente de inhibición de la terminación también se pueden ajustar mediante la selección de un codón de terminación adecuado cuando sólo se use un solo codón de terminación. Como se describe en la presente memoria, el contexto tetranucleotídico del codón de terminación, i.e., el propio codón de terminación trinucleotídico, así como el nucleótido que se encuentra inmediatamente secuencia abajo del codón de terminación, también tiene una influencia en los niveles de translectura.

Además del posible uso de múltiples codones de terminación tras el gen de interés, normalmente, normalmente será ventajoso usar múltiples codones de terminación secuencia abajo de la secuencia que codifica el péptido de anclaje a la membrana celular, del péptido indicador, de la etiqueta epitópica o del gen de resistencia al antibiótico. El uso de múltiples codones de terminación en esta posición, p. ej., hasta aproximadamente diez codones de terminación, tal como hasta aproximadamente seis u ocho codones de terminación, tal como aproximadamente dos, tres, cuatro o cinco codones de terminación, garantizará la terminación eficaz de la traducción incluso en presencia del agente de inhibición de la terminación.

El término "péptido de anclaje a la membrana celular" se refiere a un péptido o una proteína que sirve para anclar el polipéptido de interés a una membrana celular, bien directa o indirectamente. El anclaje indirecto se refiere a las situaciones en las que el péptido de anclaje a la membrana celular no está anclado a la propia membrana celular, sino que está unido indirectamente con la bicapa de la membrana lipídica, como es el caso del anclaje GPI (glicosil-fosfatidilinositol). El anclaje directo se refiere a las situaciones en las que el péptido de anclaje a la membrana celular está embebido directamente en y anclado a la bicapa lipídica de la membrana. Los polipéptidos que están anclados a la membrana celular mediante un péptido de anclaje serán desplegados en la superficie de la célula, pudiendo ser así identificados, p. ej., mediante FACS o, alternativamente, mediante otros procedimientos, tales como otros procedimientos basados en la fluorescencia, ELISA u otros procedimientos basados en la afinidad o procedimientos basados en la radiactividad. Sin embargo, un procedimiento preferido es la FACS, debido a su capacidad de evaluación selectiva de alto rendimiento que permite una evaluación selectiva rápida y eficaz de poblaciones celulares de muy gran tamaño.

A efectos de la evaluación selectiva mediante el uso de p. ej., la FACS, la señal dirigida a la membrana celular se ubica normalmente en el extremo COOH de la fusión de proteínas (secuencia abajo del codón de terminación, excepto cuando se indique lo contrario en la presente memoria). Además, es importante que la parte soluble de la proteína (i.e., el polipéptido de interés) se visualice en el lado derecho de la membrana (el lado extracelular) para la posterior interacción de anticuerpo/ligando durante la FACS. Un péptido de anclaje preferido es el anclaje GPI.

Se han descubierto muchos tipos diferentes de proteínas, tales como enzimas, receptores, antígenos de protozoos y antígenos de mamífero en una variedad de organismos eucariotas, unidos a la membrana plasmática mediante anclajes GPI (Ikezawa, 2002). Se conocen numerosas secuencias de anclajes GPI en la técnica, y el uso de tales anclajes GPI para la expresión de proteínas se describe, p. ej., en los documentos WO 89/01041, WO 90/12099 y WO 95/22614. Un ejemplo de un anclaje GPI adecuado a efectos de la presente invención es el anclaje GPI de fosfatasa alcalina placentaria humana (FAPH) con la secuencia LEPTYCDLAPPAGTTDAAH-PGRSVVP-ALLPLLAGTLLLLETATAP (SEC ID N.º 7) (que es una versión ligeramente modificada de la secuencia descrita por Millan, 1986).

Un ejemplo de otro dominio de anclaje adecuado para su uso en los procedimientos de la invención es el dominio de anclaje transmembrana C-terminal del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (RFCDP) con la secuencia AVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAIL-ALVV-LTIISLIILIMLWQKKPR (SEC ID N.º 8) (Kawagishi et al., 1995).

En una realización preferida, las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de interés fusionado con un péptido de anclaje a la membrana celular son clasificadas usando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En el contexto de la presente invención, la clasificación FACS de proteínas de fusión unidas a la membrana es particularmente ventajosa, pues permite una evaluación selectiva rápida de grandes números de células para identificar aquéllas en las que el agente de inhibición de la terminación ha dado como resultado la translectura traduccional, pues sólo estas células expresarán el polipéptido de interés en la superficie celular en forma de una proteína de fusión que comprenda el polipéptido de interés y el péptido de anclaje a la membrana celular. Una vez que estas células han sido identificadas mediante FACS, pueden ser entonces cultivadas en ausencia del agente de inhibición de la terminación para dar como resultado la producción del polipéptido de interés como un polipéptido soluble sin el péptido de anclaje. Sorprendentemente, el inventor ha descubierto que existe una correlación positiva y estadísticamente relevante entre la fluorescencia, determinada por FACS, y los niveles de actividad de las proteínas solubles. De este modo, se puede usar la clasificación FACS en el procedimiento de la invención no sólo para análisis cualitativos para identificar células que expresen una proteína de interés, sino que, en realidad, se pueden usar cuantitativamente para identificar células que expresen niveles elevados de una proteína dada. Se ha descubierto además que los procedimientos de la invención son ventajosos para evaluar la heterogeneidad de la expresión de proteínas, i.e., para identificar y seleccionar células o clones celulares que presenten tanto un nivel deseado como una uniformidad deseada de expresión de una proteína.

El término "péptido indicador" se refiere a un péptido o una proteína que puede ser fácilmente analizado mediante procedimientos adecuados, permitiendo de ese modo la fácil detección de proteínas de fusión que comprendan un polipéptido de interés y el péptido indicador. Hay un número de péptidos indicadores diferentes que son conocidos en la técnica e incluyen la proteína verde fluorescente (GFP), la luciferasa, la \beta-galactosidasa, la \beta-glucuronidasa y la cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT).

Una "etiqueta epitópica" se refiere a una secuencia de aminoácidos corta que sirve como un sitio de reconocimiento de anticuerpos (epítopo), permitiendo la detección de una proteína de fusión que comprenda el polipéptido de interés y la etiqueta epitópica, p. ej., por medio de anticuerpos marcados fluorescentamente que se unan a la etiqueta. Se conocen numerosas etiquetas epitópicas en la técnica, y hay productos para detectar etiquetas epitópicas, p. ej., anticuerpos tales como anticuerpos marcados fluorescentemente, comercialmente disponibles. Los ejemplos de etiquetas epitópicas incluyen V5 (GKPIP-NPLLGLDST) (SEC ID N.º 9), His_{6} (HHHHHH) (SEC ID N.º 10), FLAG^{TM} (DYKDDDDKG) (SEC ID N.º 11), HA (YPYDVPDYA) (SEC ID N.º 12), c-Myc (EQKLISEEDL) (SEC ID N.º 13), G-VSV (YTDIEMNRLGK) (SEC ID N.º: 14) y VHS (QPELAPEDPED) (SEC ID N.º 15).

El casete de expresión puede incluir si se desea secuencias que codifican dos o más entre un péptido de anclaje a la membrana celular, un péptido indicador y una etiqueta epitópica. Por ejemplo, puede comprender un péptido de anclaje a la membrana celular junto con bien un péptido indicador o una etiqueta epitópica, permitiendo así que el polipéptido de interés se visualice en la superficie celular en forma de una proteína de fusión anclada a la membrana que pueda ser evaluada selectivamente o seleccionada no sólo mediante FACS, sino también mediante el péptido indicador o la etiqueta epitópica. En este caso, el codón de terminación estará ubicado secuencia abajo de la secuencia que codifica el polipéptido de interés, pero secuencia arriba de la secuencias que codifican el péptido de anclaje y el péptido indicador o la etiqueta epitópica.

Alternativamente, en concreto para las proteínas que, en su forma nativa, son dirigidas a la membrana plasmática, p. ej., los receptores hormonales, el codón de terminación puede estar ubicado secuencia abajo de la secuencia que codifica el péptido de anclaje a la membrana celular, pero secuencia arriba de la secuencia que codifica el péptido indicador. En este caso, la expresión en presencia de un aminoglicósido da como resultado una proteína de fusión no nativa que puede ser clasificada o seleccionada mediante, p. ej., FACS o cromatografía de afinidad en base al péptido indicador, mientras que la expresión en ausencia de un aminoglicósido da como resultado una proteína unida a la membrana "de tipo nativo" que comprende el polipéptido de interés. El término "tipo nativo", en este contexto, se refiere al hecho de que la proteína de fusión comprende una forma no marcada del polipéptido de interés (pudiendo ser el polipéptido de interés una forma mutagenizada de un polipéptido "nativo") que está dirigida de manera natural a la membrana celular.

En otra realización alternativa más, se puede incluir un polinucleótido que codifica una etiqueta epitópica o de un péptido indicador, en concreto, una etiqueta epitópica, antes del codón de terminación, con un polinucleótido que codifica un péptido de anclaje detrás del codón de terminación para generar el siguiente constructo: gen de interés-etiqueta-TERMINACIÓN-anclaje. En este caso, el procedimiento es adecuado para seleccionar líneas celulares que produzcan niveles elevados de la proteína marcada soluble mediante FACS. La etiqueta puede ser, p. ej., una etiqueta de His, una etiqueta epitópica V5 o cualquiera del resto de etiquetas o péptidos indicadores enumerados anterior-
mente.

El "agente de inhibición de la terminación" es un agente químico que es capaz de inhibir la terminación de la traducción que resulta de la presencia de un codón de terminación. En concreto, el agente de inhibición de la terminación es un antibiótico que pertenece al grupo de los aminoglicósidos. Como se explica anteriormente, los antibióticos de aminoglicósido son conocidos por su capacidad para permitir la inserción de aminoácidos alternativos en el sitio de un codón de terminación, dando como resultado de ese modo la "translectura" de un codón de terminación que, de lo contrario, normalmente daría como resultado la terminación de la cadena. Los antibióticos de aminoglicósido incluyen G-418 (Geneticin®), gentamicina, paromomicina, higromicina, amicacina, canamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, estreptomicina y tobramicina.

Los expertos en la técnica entenderán que incluso en ausencia de un agente de inhibición de la terminación, generalmente, habrá un nivel bajo de translectura de fondo del codón de terminación. El grado de translectura de fondo varía algo en función del codón de terminación en particular, incluyendo el contexto tetranucleotídico, pudiendo variar también la translectura entre los diferentes antibióticos de aminoglicósido. De manera similar, para un codón de terminación y un agente de inhibición de la terminación dados, se puede ajustar el grado de translectura traduccional variando la concentración del agente de inhibición de la terminación. Estas diferencias en la translectura de fondo y la translectura traduccional obtenidas con diferentes codones de terminación y agentes de inhibición de la terminación se pueden usar ventajosamente en el contexto de la presente invención para seleccionar combinaciones de codones de terminación/tetranucleótidos y aminoglicósidos que proporcionen el resultado deseado. Por ejemplo, la translectura de fondo del codón de terminación UAA es inferior a la del codón de terminación UGA, mientras que se pueden obtener tasas de translectura traduccional superiores usando, p. ej., G-418 con un codón de terminación UGA que con un codón de terminación UAA.

En un experimento con G-418, por ejemplo, el presente inventor obtuvo hasta aproximadamente el 25% de células positivas en FACS para el codón de terminación UGA (tetranucleótido UGAC), pero sólo hasta aproximadamente el 10% de células positivas en FACS para el codón de terminación UAA (tetranucleótido UAAC). Los niveles de fondo de las células positivas en FACS en ausencia de G-418 fueron, en este caso, aproximadamente del 13% y 0,5%, respectivamente, para UGAC y UAAC. A modo de ejemplo, se puede usar por tanto la estrategia de terminación de UAA para seleccionar clones de expresión elevada mediante FACS antes de la producción de proteína soluble en ausencia de un aminoglicósido, pues el constructo UAA casi no tiene translectura de fondo. Por el contrario, la estrategia de terminación de UGA puede ser una buena alternativa cuando se deseen niveles máximos de translectura, y la translectura de fondo no supone un problema, p. ej., para la evaluación selectiva de un banco funcional.

Según lo indicado anteriormente, un aspecto de esta revelación se refiere a procedimientos para evaluar selectivamente o seleccionar clones celulares que expresen un nivel elevado de un polipéptido de interés, pero en los que no es necesario el uso de un aminoglicósido. Sorprendentemente, se ha descubierto que a efectos de seleccionar clones celulares que expresen un nivel deseado de un polipéptido de interés, es posible realizar una selección eficaz con un aminoglicósido en base a un nivel bajo aunque detectable de translectura de fondo en células de expresión elevada, dando como resultado una proteína de fusión que comprende el polipéptido fusionado con un péptido de anclaje a la membrana celular que permita desplegar la proteína de fusión en la superficie celular. Este enfoque de selección no basada en aminoglicósidos de clones celulares que tienen niveles de expresión altos y uniformes se puede usar, por ejemplo, tras la selección de células que expresen un polipéptido con propiedades deseadas de un banco usando cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria.

Como se explica en otro sitio en la presente memoria, el inventor ha descubierto que los niveles de translectura en presencia de un aminoglicósido se correlacionan generalmente con los niveles de expresión de la proteína, permitiendo así la selección eficaz de clones de expresión elevada, pero también se ha descubierto que este mismo enfoque se puede usar incluso sin una translectura mediada por un aminoglicósido. Esto se ilustra en la figura 4 (véase el ejemplo 2), que muestra que incluso sin el antibiótico de aminoglicósido G-418, sigue habiendo un nivel significativo de translectura traduccional de fondo, i.e., un nivel de translectura del 12,9% en la entrada R2 para el constructo PC-UGAC-GPI.

En el contexto de la presente invención, el término "proteína soluble" o "polipéptido soluble" se refiere al polipéptido de interés cuando se expresa en forma soluble sin estar fusionado con un péptido de anclaje a la membrana celular. Por lo tanto, la proteína soluble se obtiene en general mediante la expresión en ausencia de un agente de inhibición de la terminación, mediante lo cual al menos un codón de terminación secuencia abajo del primer polinucleótido da como resultado la terminación eficaz de la cadena tal que el polipéptido de interés no está unido a la membrana. Sin embargo, si se desea, el polipéptido soluble puede ser expresado junto con un péptido indicador o una etiqueta epitópica, estando ubicada la secuencia que codifica el péptido indicador o de la etiqueta, en este caso, secuencia arriba del o de los codones de terminación.

Según lo indicado anteriormente, se revelan en la presente memoria procedimientos adecuados para su uso como alternativas a la selección basada en antibióticos convencional de células transformadas con un gen de interés. Esto permite la selección eficaz de células que hayan sido transformadas con el gen de interés, pero tiene la ventaja en comparación con los procedimientos de selección basados en la resistencia a un antibiótico de permitir también el uso de las células seleccionadas resultantes en la producción del polipéptido de interés sin la expresión no deseada de un gen de resistencia al antibiótico. En una realización preferida de este aspecto de la revelación, no está presente ningún gen de resistencia al antibiótico en el casete de expresión que comprende el gen de interés, el codón de terminación y el péptido de dirección a una célula, i.e., en este caso, la selección de células que expresan el polipéptido de interés no está basada en la resistencia a un antibiótico. En cambio, la selección se relaciona con la presencia del péptido de dirección a una célula.

Como se usa en la presente memoria, un "péptido de dirección a una célula" es un péptido o una proteína que dirige el polipéptido de interés a la célula en la que es producido, i.e., bien al interior de la célula o enlazado al exterior de la célula. Los ejemplos de péptidos de dirección a células adecuados incluyen péptidos de dirección a membranas, tales como el anclaje GPI, p. ej., para los casos en los que los anticuerpos dirigidos frente a la fusión del polipéptido de interés-péptido de dirección a una célula se vayan a usar durante la clasificación FACS, así como cualquier péptido que dirija la fusión a compartimentos celulares del interior de la célula. Los péptidos de dirección a células que se pueden usar para la dirección intracelular incluyen, p. ej., una señal de localización nuclear (SLN), una señal que dirige el polipéptido a otros compartimentos sub-celulares (p. ej., el citoplasma, mitocondrias o el retículo endoplasmático) y estructuras celulares, tales como microtúbulos. Para la dirección intracelular, se entenderá que al menos una de las proteínas pertenecientes a la fusión del polipéptido de interés-péptido de dirección a una célula tiene propiedades bioquímicas que permiten su detección en la célula, por ejemplo, mediante fluorescencia.

En otra realización de este aspecto de la exposición, la selección de células que expresan el polipéptido de interés se puede realizar usando una técnica de resistencia a antibióticos convencional, pero en la que la presencia de uno o más codones de terminación secuencia abajo del gen de interés y secuencia arriba del gen de resistencia a un antibiótico garantiza que el gen de resistencia al antibiótico no se exprese en condiciones de producción normales en ausencia de un antibiótico de aminoglicósido. La selección en la que se usa esta realización de la revelación empleará normalmente dos antibióticos diferentes en el medio de selección, i.e., un antibiótico de aminoglicósido que da como resultado la translectura traduccional y la expresión del gen de resistencia al antibiótico, y un antibiótico de no aminoglicósido usado para la selección real. Las células transformadas con el casete de expresión que contiene el gen de interés expresarán, por tanto, el gen de resistencia a un antibiótico, lo que proporciona resistencia al antibiótico de no aminoglicósido, pero sólo en presencia de un antibiótico de aminoglicósido que permita la translectura traduccional del o de los codones de terminación. Se puede usar cualquier antibiótico de no aminoglicósido como el antibiótico para la selección en esta realización, p. ej., ampicilina, bleomicina, fleomicina, espectinomicina, blasticidina, puromicina, zeocina, etc.

En cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, puede ser ventajoso cultivar las células transformadas en presencia de una sal de butirato, p. ej., butirato de sodio, para aumentar los niveles de expresión del polipéptido de interés (véase, p. ej., Gorman et al., 1983). Incluso en presencia de un aminoglicósido, los niveles de translectura de los codones de terminación pueden seguir siendo relativamente bajos, y por tanto, será a menudo deseable aumentar los niveles de expresión para poder detectar más fácilmente el polipéptido de interés. Este puede ser particularmente el caso para la evaluación selectiva de bancos de expresión en base a la translectura del codón de terminación dando como resultado la expresión del polipéptido de interés fusionado con el péptido de anclaje a la membrana celular. La sal de butirato se usará comúnmente a una concentración de aproximadamente 1-10 mM, en función del tipo de célula. Para la expresión de células CHO, por ejemplo, una concentración adecuada es de aproximadamente 1-2 mM (Hunt et al., 2002).

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La presente invención es aplicable a cualquier tipo de célula huésped de organismos en los que se potencie la translectura del codón de terminación en presencia de aminoglicósidos, en particular, células eucariotas, tales como células de mamífero u otras células animales, células de hongos filamentosos, células de levaduras, células de insectos y plantas transgénicas y animales. Los ejemplos de células huésped de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) (p. ej., CHO-K1; ATCC CCL-61), líneas celulares de mono verde (COS) (p. ej., COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); células de ratón (p. ej., NS/O), líneas celulares de riñón de hámster neonato (BHK) (p. ej., ATCC CRL-1632 o ATCC CCL-10) y células humanas (p. ej., HEK 293 (ATCC CRL-1573)).

Los ejemplos de células huésped de hongos filamentosos adecuadas incluyen cepas de Aspergillus, p. ej., A. oryzae, A. niger o A. nidulans, Fusarium y Trichoderma. Los ejemplos de células huésped de levadura adecuadas incluyen cepas de Saccharomyces, p. ej., S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia, tal como, P. pastoris o P. methanolica, Hansenula, tal como, H. polymorpha y Yarrowia. Los ejemplos de células huésped de insecto adecuadas incluyen una línea celular de Lepidoptera, tal como Spodoptera frugiperda (Sf9 o Sf21) o células de Trichoplusioa ni (High Five) (US 5.077.214).

Preferiblemente, las células usadas en los procedimientos de la invención se seleccionan entre células de mamífero y células de levadura.

Los expertos en la técnica serán capaces de seleccionar los vectores adecuados, las secuencias de control de la expresión y los huéspedes para llevar a cabo los procedimientos de la invención. Por ejemplo, en la selección de un vector, se debe tener en cuenta el huésped, porque el vector debe ser capaz de replicarse en él o ser capaz de integrarse en el cromosoma. Se debería tener en cuenta el número de copias del vector, la capacidad para controlar el número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores de antibióticos. El vector puede ser cualquier vector conocido en la técnica, en concreto, un plásmido o un vector viral. Para los procedimientos de evaluación selectiva de bancos, un ejemplo de un vector adecuado es un vector retroviral. Los vectores retrovirales son ventajosos a este efecto por permitir el control fácil del número de copias (p. ej., para proporcionar un solo vector por célula) y también permiten altos títulos en el banco debido a la elevada eficacia de infección. A efectos de producción, en particular a efectos de la producción de proteínas terapéuticas, es preferible usar un vector no retroviral para eliminar el posible riesgo de desarrollo de retrovirus recombinantes infecciosos. Tanto los vectores retrovirales como los no retrovirales se encuentran disponibles comercialmente.

Para seleccionar una secuencia de control de la expresión, también se deberían tener en cuenta una variedad de factores. Estos incluyen, por ejemplo, la resistencia relativa de la secuencia, su capacidad de control y su compatibilidad con la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, particularmente, en lo que respecta a las posibles estructuras secundarias. Los huéspedes deberían ser seleccionados teniendo en cuenta su compatibilidad con el vector elegido, la posible toxicidad del producto codificado por la secuencia de nucleótidos, sus características de secreción, su capacidad para plegar correctamente el polipéptido, sus necesidades de fermentación o de cultivo y la facilidad de purificación de los productos codificados por la secuencia de nucleótidos.

El término "secuencias de control" se define en la presente memoria para incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de los polipéptidos según la invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o foránea a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia propeptídica, una secuencia promotora, potenciadora o de activación secuencia arriba, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Las secuencias de control incluirán generalmente al menos un promotor y un péptido señal.

Los ejemplos de las secuencias de control adecuadas para dirigir la transcripción en células de mamífero incluyen los promotores tempranos y tardíos de SV40 y adenovirus, p. ej., el promotor tardío principal del adenovirus 2, el promotor de MT-1 (gen de metalotioneína), el promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV), el promotor del factor de elongación humano 1\alpha (FE-1\alpha), el promotor de la proteína de choque térmico mínima 70 de Drosophila, el promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR), el promotor de la ubiquitina C humana (UbC), el terminador de la hormona humana del crecimiento, señales de poliadenilación de la región EIb de adenovirus o SV40 y la secuencia consenso de Kozak (Kozak, 1987).

Para mejorar la expresión en células de mamífero se puede insertar un intrón sintético en la región no traducida de 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Un ejemplo de intrón sintético es el intrón sintético del plásmido pCI-Neo (disponible en Promega Corporation, WI, EE.UU.).

Los ejemplos de secuencias de control adecuadas para dirigir la transcripción en células de insectos incluyen el promotor de la polihedrina, el promotor P10, el promotor de la proteína básica del virus de la polihedrosis de Autographa californica, el promotor del gen temprano inmediato del baculovirus 1 y el promotor del gen temprano retardado 39K del baculovirus y la secuencia de poliadenilación de SV40.

Los ejemplos de secuencias de control adecuadas para su uso en células huésped de levadura incluyen los promotores del sistema de apareamiento \alpha de levadura, el promotor de la triosa-fosfato-isomerasa (TPI) de levadura, promotores de genes glicolíticos de levadura o de genes de alcohol-deshidrogenasa, el promotor ADH2-4c y el promotor GAL inducible.

Los ejemplos de secuencias de control adecuadas para su uso en células huésped de hongo filamentoso incluyen el promotor y el terminador ADH3, un promotor derivado de los genes que codifican la amilasa TAKA, la triosa-fosfato-isomerasa o la alcalino-proteasa de Aspergillus oryzae, una \alpha-amilasa de A. niger, la glucoamilasa de A. niger o A. nidulans, la acetamidasa de A. nidulans, la lipasa o la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, el terminador TPI1 y el terminador ADH3.

A efectos de la presente invención, estará generalmente presente un péptido señal para obtener la expresión del polipéptido de interés bien en forma anclada a la membrana o en forma soluble secretada. Tal péptido señal debería ser uno reconocido por la célula elegida para la expresión del polipéptido. El péptido señal puede ser homólogo (p. ej., ser ese que está normalmente asociado con el polipéptido en cuestión) o heterólogo (i.e., procedente de otra fuente) al polipéptido, o puede ser homólogo o heterólogo a la célula huésped, i.e., ser un péptido señal normalmente expresado desde la célula huésped o uno que no se exprese normalmente desde la célula huésped.

En los procedimientos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio de nutrientes adecuado para la producción del polipéptido en cuestión usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden cultivar las células mediante cultivo en un matraz de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo las fermentaciones continua, discontinua, por alimentación discontinua o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizadas en un medio adecuado y en condiciones que permiten que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo tiene lugar en un medio de nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno, y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados se encuentran disponibles en proveedores comerciales o se pueden preparar según las composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la colección americana de cultivos tipo). Cuando se secreta el polipéptido en el medio de nutrientes, el polipéptido puede ser directamente recuperado del medio.

Según lo explicado en la presente memoria, la selección o la evaluación selectiva de los polipéptidos según los procedimientos de la invención se puede realizar mediante cualquiera de los procedimientos adecuados, p. ej., mediante FACS en el caso de polipéptidos unidos a la membrana o mediante la detección adecuada de un péptido indicador o de una etiqueta epitópica.

Los polipéptidos producidos según la invención se pueden recuperar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, es posible recuperar el polipéptido del medio de nutrientes mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, la centrifugación, la filtración, la ultrafiltración, la extracción o la precipitación. La purificación se puede realizar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (p. ej., de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, de cromatoenfoque y de exclusión por tamaños), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación en sulfato de amonio) o extracción (véase, p. ej., "Protein Purification" (II Edición), Janson and Ryden, editors, Wiley, Nueva York, 1998).

La presente invención proporciona también equipos que incluyen los casetes de expresión, los vectores de expresión, las células y los procedimientos de la invención. Los equipos de la invención comprenden opcionalmente al menos uno de los siguientes de la invención: (1) al menos un componente del equipo que comprende un casete de expresión según lo descrito en la presente memoria adecuado para realizar un procedimiento para la invención; una célula o un casete de expresión que comprende tal casete de expresión; un antibiótico de aminoglicósido; o una composición que comprende al menos uno de tales componentes; (2) las instrucciones para poner en práctica cualquier procedimiento descrito en la presente memoria, las instrucciones para usar cualquier componente identificado en (1) o cualquier composición de cualquiera de tales componentes; (3) un envase para contener dicho al menos uno de tales componentes o composiciones y (4) materiales de empaquetado. Comúnmente, el equipo comprenderá al menos un componente de (1) junto con las instrucciones de uso y un recipiente y/o los materiales de empaquetado. Los componentes individuales del equipo pueden estar empaquetados conjuntamente o por separado.

También se da a conocer en la presente memoria el uso de cualquier aparato, componente, composición o equipo descrito anteriormente y en la presente memoria, para la práctica de cualquier procedimiento o análisis descrito en la presente memoria, y/o para el uso de cualquier aparato, componente, composición o equipo para poner en práctica cualquier análisis o procedimiento descrito en la presente memoria.

La invención se ilustra ahora más detalladamente mediante los siguientes ejemplos no restrictivos.

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Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de pLenti6-PC-GPI, pLenti6-PC-UAAC-GPI y pLenti6-PC-UGAC-GPI

Para construir el vector pLenti6-PC-GPI (Figura 1), se amplificó una fusión traduccional entre las secuencias que codifican la proteína C (PC) humana y el anclaje GPI mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando los cebadores TBO017 (5'-CACCATGTGGCAGCTCACAAGCC-3') (SEC ID N.º 16) y TBO014 (5'-AGAAGGCA
CAGTC-GAGGCTGATC) (SEC ID N.º17). Se usó un vector que contenía una fusión entre la secuencia de PC y la secuencia de GPI (Figura 14) como molde. Se clonó el producto resultante de la PCR en el vector pLenti6/V5-D-TOPO (Invitrogen) usando el procedimiento recomendado por el fabricante. Para construir el vector pLenti6-UAAC-GPI, el vector pLenti6-PC-GPI sirvió como molde para dos reacciones PCR independientes:

la secuencia que codifica la PC fue amplificada usando los cebadores TBO077 (5'-CGGTGACCAGTGCTTGGTC
TTGC-3') (SEC ID N.º 18) y TBO103 (5'-CAGTACGTGGGTTCCAGTTAAGGTGCCCAGCTCT-TCTGGGGGGC
TTCC-3') (SEC ID N.º19). En una segunda reacción PCR, se amplificó la secuencia del anclaje GPI usando los cebadores TBO102 (5'-CCAGAAGAGCT-GGGCACC-TTAACTGGAACCCACGTACTGCGAC-CTCGC-3') (SEC ID N.º 20) y TBO104 (5'- ATCAGCGGTTTAAACTTTCACTATTACTAG-GGAGCGGTAGCGGTTTCC-3') (SEC ID N.º 21). Los dos productos resultantes de la PCR sirvieron como moldes en un procedimiento de PCR de la fusión usando los cebadores TBO077 y TBO104. Se escindió el fragmento resultante de la PCR usando las endonucleasas de restricción PstI y PmeI, y se unió en el vector pLenti6-PC-GPI (Figura 1) en los sitios de endonucleasa correspondientes produciendo pLenti6-PC-UAACGPI (Figura 2). Este vector de expresión alberga la secuencia de PC fusionada traduccionalmente con la secuencia del anclaje GPI y un codón de terminación UAA entre las secuencias que codifican la PC y el anclaje GPI (Figura 15). Además, hay cuatro codones de terminación detrás del anclaje GPI para terminar eficazmente la traducción incluso en presencia de aminoglicósidos.

Para construir el vector pLenti6-UGAC-GPI, el vector pLenti6-PC-GPI sirvió como molde para dos reacciones PCR independientes: la secuencia que codifica la PC humana fue amplificada usando los cebadores TBO077 y TBO108 (5'-CAGTACGTGGGTTCCAGTC-AAG-GTGCCCAGCTCTTCTGGGGGGCTTCC-3') (SEC ID N.º 22). En una segunda reacción PCR, se amplificó la secuencia del anclaje GPI usando los cebadores TBO107 (5'- CCA
GAAGAGCTGGGCACCTTGACTGGAAC-CCACGTACTGCGACCTCGC-3') (SEC ID N.º 23) y TBO104. Los dos productos resultantes de la PCR sirvieron como moldes en un procedimiento de PCR de la fusión usando los cebadores TBO077 y TBO104. Se escindió el fragmento resultante de la PCR usando las endonucleasas de restricción PstI y PmeI, y se unió en el vector pLenti6-PC-GPI (Figura 1) en los sitios de endonucleasa correspondientes produciendo pLenti6-PC-UGAC-GPI (Figura 3). Este vector de expresión alberga la secuencia de la proteína C fusionada traduccionalmente con la secuencia del anclaje GPI y un codón de terminación UGA entre las secuencias que codifican la PC y el anclaje GPI (Figura 16). Además, hay cuatro codones de terminación del anclaje GPI para terminar eficazmente la traducción incluso en presencia de aminoglicósidos.

Usando el mismo enfoque general, se pueden preparar vectores similares usando la secuencia que codifica cualquier polipéptido deseado en lugar de la secuencia que codifica la proteína C humana.

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Ejemplo 2 Inhibición de la terminación in vivo inducida por aminoglicósido

Para demostrar que es posible usar un vector de expresión de un gen recombinante según lo expuesto en la presente memoria para la inhibición de la terminación in vivo inducida por aminoglicósido, se usaron los vectores retrovirales pLenti6-PC-UAAC-GPI y pLenti6-PC-UGAC-GPI para transfectar células HEK293FT (Invitrogen) usando el reactivo de transfección Lipofectamine^{TM} 2000 (Invitrogen). Como control, se usó el vector retroviral pLenti6-PC-GPI para transfectar células HEK293FT y producir partículas retrovirales. Tras 48 horas, se recogieron los sobrenadantes que contenían partículas retrovirales, se esterilizaron por filtración para eliminar los restos celulares y, posteriormente, se usaron para infectar células CHO-K1. Se seleccionaron células CHO-K1 en cuanto a la resistencia al antibiótico blasticidina a la concentración de 5 mg/l durante 10 días. Se transfectaron las mezclas resultantes de células resistentes a la blasticidina a 5 matraces de cultivo por cada mezcla celular y se cultivaron hasta obtener una confluencia del 25%. Para inducir la translectura traduccional, se añadió antibiótico G-418 a los matraces de cultivo a concentraciones finales que variaban de 12,5 mg/l a 100 mg/l, y se incubaron los matraces durante otras 48 horas a 37ºC. Se separaron las células de los matraces mediante tripsinización y se incubaron con anticuerpos monoclonales de PC anti-humanos de ratón. Posteriormente, se lavaron las células y se incubaron con un anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de conejo, marcada con ficoeritrina (DAKO R0439)). Se analizaron las líneas celulares retrovirales marcadas mediante FACS en cuanto a la PC recombinante anclada a la membrana usando un instrumento FACScalibur^{TM} (Becton Dickinson) con una longitud de onda de excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 585 nm.

Los resultados mostrados en la figura 4 ilustran que ambas líneas celulares que expresan los indicadores PC-UAAC-GPI y PC-UGAC-GPI muestran la PC en la superficie celular en presencia de aminoglicósido. Además, la cantidad de proteína recombinante que es detectada (eje Y) es proporcional a la concentración del G-418. Además, la cantidad de PC anclada a la membrana recombinante es más abundante para el constructo PC-UGAC-GPI que para el constructo PC-UAAC-GPI, y esto es aplicable a todas las concentraciones de aminoglicósido que fueron analizadas. Este resultado coincide con la translectura traduccional mediada por aminoglicósido realizada en un modelo in vitro (Manuvakhova et al., 2000). Al contrario de las líneas celulares retrovirales que expresan los indicadores PC-UAAC-GPI y PC-UGAC-GPI, la línea celular retroviral que expresa el indicador PC-GPI no presenta una mayor cantidad de proteína recombinante desplegada en presencia de aminoglicósido. Este resultado se esperaba teniendo en cuanta que el casete de expresión no alberga un codón de terminación entre las secuencias de PC y GPI. Este resultado también confirma que ambos tetranucleótidos UAAC y UGAC pueden ser usados satisfactoriamente para modular la translectura traduccional in vivo mediada por aminoglicósido.

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Ejemplo 3 Selección eficaz de clones celulares que expresan niveles elevados de proteína C recombinante mediante FACS

Hasta ahora, la selección de clones que expresaban niveles elevados de proteína soluble recombinante ha sido una tarea que requiere mucha mano de obra y que comúnmente limita el número de clones que pueden ser analizados a unos pocos cientos. Además, debido a que la expresión del gen marcador seleccionable no se correlaciona directamente con los niveles de expresión del gen de interés, la mayoría de los clones no expresa niveles de proteína recombinante satisfactorios. La clasificación de células basada en FACS ofrece una capacidad de evaluación selectiva de alto rendimiento que permite el análisis/la clasificación diaria de poblaciones celulares mayores de 1.000.000. Sin embargo, no hay un procedimiento simple actualmente disponible para la explotación de los enfoques de FACS para aislar células que expresen proteínas solubles en base a los niveles de expresión. Un sistema que permitiría la producción alternativa de proteína recombinante anclada a la membrana y soluble representaría, por tanto, una valiosa herramienta para el aislamiento rápido de células que expresen niveles de proteínas muy elevados.

Para demostrar que es posible usar un vector de expresión de un gen recombinante según lo revelado en la presente memoria para la selección de clones celulares que produzcan niveles de proteína recombinante muy elevados, se usó el vector retroviral pLenti6-PC-UAAC-GPI para transfectar células HEK293FT usando el reactivo de transfección Lipofectamine^{TM} 2000 (Invitrogen). Tras 48 horas, se recogieron los sobrenadantes que contenían partículas retrovirales, se esterilizaron por filtración para eliminar los restos celulares y, posteriormente, se usaron para infectar células CHO-K1. Se seleccionaron células CHO-K1 en cuanto a la resistencia al antibiótico blasticidina a la concentración de 5 mg/l durante 10 días. Se transfectaron las mezclas resultantes de células resistentes a la blasticidina a 2 matraces de cultivo y se cultivaron hasta obtener una confluencia del 25%. Para inducir la translectura traduccional, se añadió antibiótico G-418 a un matraz de cultivo a la concentración final de 100 mg/l, y se incubaron los matraces durante otras 48 horas a 37ºC. Se separaron las células de los matraces mediante tripsinización y se incubaron con anticuerpos monoclonales de PC anti-humanos de ratón. Posteriormente, se lavaron las células y se incubaron con un anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de conejo, marcada con ficoeritrina (FE) (DAKO R0439)). Se clasificaron las células CHO-K1 marcadas en base a su fluorescencia relativa a 585 nm usando un clasificador celular Vantage^{TM}de FACS (Becton Dickinson) y usando una longitud de onda de excitación de 488 nm. Los resultados de la clasificación FACS de las células cultivadas en presencia de G-418 se muestran en la figura 5B, mientras que la figura 5A muestra los resultados de las células cultivadas sin G-418. Se clasificaron individualmente las células que presentaron niveles elevados de fluorescencia (entrada P2, figura 5B) o niveles moderados de fluorescencia (entrada P3, figura 5B) en placas de cultivos celulares de 96 pocillos que contenían 0,1 ml de medio de cultivo sin G-418 para permitir la producción de PC recombinante soluble. Se incubaron las placas de cultivos celulares a 37ºC durante 5 días, tras lo que se analizó al microscopio la presencia de colonias celulares individuales en cada cultivo. Se incubaron las placas a 37ºC hasta que las células alcanzaron la confluencia, tras lo que se transfirieron las células a pocillos de cultivo de mayor tamaño (placas de cultivo de 12 pocillos que contenían 1 ml de medio en cada pocillo). Se cultivaron las células hasta obtener una confluencia del 25%, tras lo que se añadió medio recién preparado que contenía G-418 a una concentración final de 100 mg/l a cada pocillo para inducir la translectura traduccional. Se incubaron las placas durante otros 3 días a 37ºC. Se reservaron los sobrenadantes y se almacenaron a -80ºC hasta que se realizaron los análisis de la actividad de la PC soluble. Se tripsinizaron las células y luego se marcaron con anticuerpos primarios y secundarios según lo descrito anteriormente, y posteriormente, se analizó la fluorescencia usando un analizador de células FACScalibur^{TM} (Becton Dickinson) con una longitud de onda de excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 585 nm.

Las células cuya fluorescencia fue incluida bien en la entrada P2 o P3 de la figura 5B fueron clasificadas individualmente y cultivadas durante más tiempo, tras lo que se realizó un análisis de la PC anclada a la membrana mediante FACS. Los resultados se presentan en la figura 5C, que muestra la detección de PC anclada a la membrana en clones de CHO-K1 que expresan la fusión PC-GPI. Se analizaron 48 clones que presentaron niveles bajos de PC y 48 clones que presentaron niveles altos de PC durante la clasificación FACS en cuanto a los niveles de PC anclada a la membrana por medio del análisis de FACS. Los resultados confirman los niveles de expresión relativa de proteína recombinante que fueron observados durante la clasificación FACS. De hecho, la mayoría de los clones que fueron clasificados como altos expresadores de PC presentaron niveles de proteína recombinante superiores a los clones que fueron clasificados como bajos expresadores de PC. Estos resultados indican que la etapa de la clasificación FACS fue satisfactoria, tanto en la medición de los niveles de PC anclada a la membrana como en la clasificación de las células individuales.

Para evaluar si existe una correlación entre los niveles de PC anclada a la membrana (i.e., translectura inducida por aminoglicósido) y soluble (i.e., terminación de la traducción eficaz tras la secuencia de PC), se midieron sobrenadantes procedentes de 26 clones que presentaban diversos niveles de PC anclada a la membrana en un análisis de PC enzimático. Los resultados de este análisis, presentados en la figura 6A, confirman que existe una correlación entre los niveles de expresión de proteína recombinante soluble y anclada a la membrana. De hecho, los clones que presentaban niveles elevados de PC anclada a la membrana (calculado mediante un análisis de FACS) presentan niveles elevados de PC soluble, mientras que los clones que presentaron niveles bajos de PC anclada a la membrana presentan niveles relativamente bajos de PC soluble. Se representaron en una nueva gráfica los niveles de fluorescencia de FACS y los niveles de la actividad de la PC soluble para reforzar la confirmación de la correlación entre los niveles de expresión de proteína recombinante anclada a la membrana y soluble (figura 6B). El análisis estadístico en el que se usó un test de correlación de Pearson y se supuso una distribución Gausiana indica que hay menos del 0,01% de probabilidad (valor P = 0,0001) de que los datos se deban a una distribución aleatoria.

En conclusión, los datos aquí presentados muestran que existe una correlación directa entre los niveles de PC soluble y anclada a la membrana. Como resultado de ello, la presente invención proporciona un procedimiento basado en la FACS de alto rendimiento para la selección eficaz de clones individuales que expresen niveles altos de proteínas recombinantes solubles.

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Ejemplo 4 Selección eficaz de clones celulares que expresan niveles elevados de factor VII recombinante mediante FACS en condiciones libres de suero

El factor VII (FVII) es un zimógeno para la serin-proteasa dependiente de la vitamina K que es esencial para el inicio de la coagulación sanguínea. El FVII es una proteína soluble que se sintetiza fundamentalmente en el hígado y que circula por el plasma. La proteína FVII alberga distintos dominios funcionales: el dominio N-terminal, también denominado dominio Gla, es modificado post-traduccionalmente mediante gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico. Además, la proteína FVII contiene dos dominios con homología con el factor de crecimiento epidérmico (FCE1 y FCE2) y un dominio serin-proteasa C-terminal. Debido a su importante papel en el tratamiento de los trastornos hemostáticos, la proteína FVII recombinante se produce en células transgénicas. Sin embargo, para obtener una molécula activa, la proteína recombinante debe ser producida en células transgénicas que presenten una modificación de la proteína post-traduccional similar a la molécula nativa, concretamente, células de mamífero. Al contrario de los sistemas de producción heterólogos bacterianos o de hongos, los rendimientos de las proteínas recombinantes sintetizadas en cultivos de células de mamífero a menudo son bajos y están asociados con una inestabilidad genómica del transgén. Además, la mayoría de las líneas celulares de mamífero que se usan para la expresión heteróloga de proteínas recombinantes tienen necesidades nutricionales especiales, tales como la adición de suero de mamífero (p. ej., suero bovino fetal = SBF). Debido a que tales aditivos son de origen animal, ha surgido la preocupación sobre la posible presencia de agentes infecciosos tales como retrovirus y priones.

La producción inicial de líneas celulares recombinantes se realiza tradicionalmente en presencia de suero en el medio de cultivo. Tras el aislamiento de los clones que producen niveles deseados de proteína recombinante, los clones deben ser adaptados a las condiciones de crecimiento libres de suero antes de la producción de proteínas farmacéuticas terapéuticas. Esto es una tarea que requiere mucha mano de obra que limita el número de clones que se puede procesar. Además, muchos clones no alcanzan los niveles deseados de expresión de proteína recombinante tras haber sido adaptados a las condiciones libres de suero. Hemos desarrollado una línea celular de CHO-K1 que no requiere la adición de suero en el medio de cultivo. La adaptación a las condiciones libres de suero se realizó mediante la reducción progresiva de la concentración de SBF en el medio de cultivo durante un período de tiempo (datos no mostrados). Esta línea celular (CHOK1-JRH325) se mantiene en medio libre de suero 325 PF CHO de EXCELL^{TM} (JRH325; JRH Biosciences), que es un medio de cultivo definido químicamente privado de componentes de origen animal y, por tanto, está libre de agentes infecciosos. La línea celular de CHOK1-JRH325 adaptada a condiciones libres de suero es una línea celular no adherente que presenta una tasa de crecimiento similar a la línea celular CHO-K1 parental.

Para demostrar que es posible usar un vector de expresión de un gen recombinante según lo revelado en la presente memoria para la selección de clones celulares de mamífero que produzcan niveles muy elevados de FVII recombinante en condiciones de crecimiento libres de suero, se construyó el vector retroviral pB205 (figura 21). Este vector alberga una fusión traduccional entre una variante del FVII humano (con las sustituciones de los aminoácidos P10Q, K32E, A34E, R36E, T106N y V253N en comparación con el FVII humano de tipo natural), un codón de terminación UAA y la señal de anclaje GPI (figura 22). La fusión traduccional está bajo el control transcripcional del promotor del CMV. Además, el vector contiene el gen bsd que confiere resistencia al antibiótico blasticidina. Se usó el plásmido pB205 para transfectar las células CHOK1-JRH325 usando el reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche Applied Science). Se seleccionaron células en cuanto a su resistencia al antibiótico blasticidina a la concentración de 2,5 mg/l durante 10 días. La mezcla resultante de células resistentes a la blasticidina fue sometida parcialmente a un procedimiento de clonación por dilución "clásica", parcialmente hasta tres series de translectura traduccional con la clasificación FACS según la invención.

El procedimiento de dilución clásica fue dirigido a la siembra de una célula individual en cada pocillo de las placas de cultivo de 96 pocillos. Se dejaron crecer las células hasta que las colonias cubrieron la mayoría de la superficie de los pocillos de cultivo, tras lo que se analizaron aproximadamente 370 clones en una primera serie de ELISA para seleccionar los clones que expresaban los niveles más altos de FVII soluble. De estos 370 clones, se transfirieron los 44 clones con los niveles de expresión más altos a matraces T para cultivarlos durante más tiempo y analizarlos (véase más adelante).

Alternativamente, se trataron células procedentes de la misma mezcla original de células resistentes a la blasticidina transgénicas para el constructo B205 con 100 mg/l de geneticina durante 2 días para promover la translectura traduccional. Se recogieron las células y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón de FVII antihumano producido por un hibridoma (Acm) dirigido frente al dominio FCE1 de la proteína FVII. Posteriormente, se lavaron las células y se incubaron con un anticuerpo secundario (IgG de conejo anti-ratón, marcada con ficoeritrina (DAKO R0439)). Se analizaron las líneas celulares retrovirales marcadas mediante FACS en cuanto al FVII recombinante anclado a la membrana usando un clasificador celular FACScalibur^{TM} (Becton Dickinson) con una longitud de onda de excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 585 nm. Las células que presentaron la señal fluorescente más potente (el 10% mejor; 1.000.000 de células clasificadas) fueron clasificadas y cultivadas durante más tiempo.

Se sometió la población de células clasificadas resultante a una segunda serie de tratamiento con geneticina y enriquecimiento basado en la FACS en el que las células que presentaban la señal fluorescente más potente (el 3,5% mejor; 400.000 células clasificadas) fueron clasificadas como una mezcla y cultivadas durante más tiempo. Se sometieron estas células a una tercera serie de tratamiento con geneticina y enriquecimiento basado en FACS, siendo las células que presentaron la señal fluorescente más potente (el 4% mejor; 50.000 células clasificadas) seleccionadas para un mayor cultivo y un análisis. Se dejaron crecer estas células durante unos cuantos días, tras lo que fueron sometidas a un procedimiento de clonación por dilución "clásica" dirigido a la siembra de una célula individual en cada pocillo de las placas de cultivo de 96 pocillos. Se dejaron crecer las células hasta que las colonias cubrieron la mayoría de la superficie de cultivo, tras lo que se analizaron las células en cuanto a los niveles de proteína FVII soluble recombinante por medio de ELISA. Se analizaron aproximadamente 220 clones procedentes del enriquecimiento basado en FACS y 370 clones procedentes de la clonación por dilución limitada "clásica" según lo descrito anteriormente en una primera serie de ELISA para seleccionar los clones que expresaban los niveles más altos de FVII soluble. De estos clones, se transfirieron a matraces T y se dejaron crecer 28 clones procedentes del enriquecimiento basado en FACS y 44 clones procedentes de la clonación por dilución limitada "clásica" hasta que las células hubieron cubierto aproximadamente la mitad de la superficie de los matraces T, con un reabastecimiento de medio normal. Se midió la densidad de las células para cada clon simultáneamente con una segunda medición basada en ELISA del FVII recombinante soluble en el medio de cultivo. Esto permitió el cálculo de la productividad específica de cada clon, determinado como pg de FVII producido por célula diariamente (pg FVII/célula/día).

Los resultados presentados en la figura 23 muestran una comparación de la producción de FVII recombinante soluble entre una clonación por dilución limitada "clásica" por un lado y el enfoque de translectura regulada de la invención en combinación con las capacidades de FACS por otro lado. Los resultados muestran sin lugar a dudas que los clones que han sido sometidos a una translectura regulada y a una FACS ("clones de FACS") secretan cantidades mucho mayores de FVII recombinante (media = 23 veces mayor) que los clones generados a partir del enfoque clásico. Además, todos los clones de FACS cuya productividad ha sido evaluada en la figura 23 presentan una productividad de proteína recombinante mayor que el mejor clon obtenido a partir de la clonación por dilución limitada clásica. Tomando estos resultados conjuntamente, se confirma que la tecnología de translectura regulada en combinación con las capacidades de la FACS ofrece una potente herramienta para el aislamiento de clones que secretan niveles muy elevados de proteína recombinante soluble en condiciones de cultivo libres de suero.

Ejemplo 5 Producción alternativa de proteína recombinante soluble o anclada a la membrana a partir de la misma célula - evaluación selectiva de bancos funcionales

Muchas aplicaciones secuencia abajo tras una clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) requieren la producción de proteína recombinante soluble. Sin embargo, la citometría de flujo se basa habitualmente en la producción de proteína recombinante dirigida a la membrana o al interior de la célula. Por lo tanto, los vectores de expresión para evaluar selectivamente bancos funcionales incluyen comúnmente una señal de anclaje a la membrana, tal como un anclaje GPI, o un dominio transmembrana que permitirá dirigir la proteína recombinante a la membrana celular en la que podrá ser detectada mediante citometría de flujo. Tras el enriquecimiento basado en FACS del banco en los clones que presentan un rasgo deseado (p. ej, una mejor unión de receptor y ligando), se debe rescatar el ADN recombinante y subclonarlo en un nuevo vector para la expresión de proteína soluble (i.e., que no contiene una señal de anclaje a la membrana). Tras ello, se elaboran preparaciones de plásmidos individuales antes de la transfección celular y los análisis funcionales tales como el ELISA. Este enfoque clásico requiere mucho tiempo, necesita equipamiento de robótica y puede resultar en la pérdida de parte de la diversidad del banco. De hecho, cada manipulación de un banco de expresión (PCR, unión, clonación, transfección de células diana, etc.) da como resultado la pérdida de complejidad del banco. Además, el procedimiento de subclonación completo requiere mucho tiempo y es caro. Sería, por tanto, ideal poder producir una proteína recombinante bien en forma soluble o anclada a la membrana desde el mismo vector. Al contrario de los enfoques clásicos, la tecnología de "translectura regulada" de la presente invención hace posible realizar la evaluación selectiva basada en FACS y el análisis funcional a partir de las mismas células.

Para demostrar que es posible usar un vector de expresión de un gen recombinante según lo revelado en la presente memoria para la producción alternativa de bancos de expresión de formas solubles o ancladas a la membrana, se puede crear un banco de interferón alfa (IFN\alpha) humano mediante evolución molecular (barajado de ADN), p. ej., a partir de 12 genes humanos que codifican la familia del IFN\alpha (Chang et al., 1999). Se subclona el banco de IFN\alpha en un vector retroviral que conduce a la expresión de un casete que comprende un péptido señal sintético, la secuencia del IFN\alpha, la etiqueta E (secuencia de aminoácidos GAPVPYPDPLEPR) (SEC ID N.º 24) y la etiqueta S (secuencia de aminoácidos KETAAAKFERQHMDS) (SEC ID N.º 25), el codón sin sentido UGA (por ejemplo, el tetranucleótido UGAC), el epítopo V5 y el anclaje GPI. Véase la figura 7 para más datos sobre las características del plásmido y la figura 18, que muestra la secuencia que codifica una secuencia de IFN-alfa humano de tipo natural, el IFN-alfa humano 21b, así como otros datos de la secuencia de aminoácidos y de ADN del casete IFN-UGAG. Según lo mostrado en la figura 18, el casete IFN-UGAG comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido señal sintético, la secuencia del IFN, la etiqueta E, la etiqueta S, el codón de terminación UGA, el epítopo V5 y el anclaje GPI (PS-IFN-etiqueta E-Etiqueta S-UGA-V5-GPI).

Se usó el banco resultante para transfectar las células HEK293FT usando el reactivo de transfección
Lipofectamin^{TM} 2000 (Invitrogen). Tras 48 horas, se recogieron los sobrenadantes que contenían partículas retrovirales, se esterilizaron por filtración para eliminar los restos celulares y se usaron para infectar células CHO-K1. Las células CHO-K1 transfectadas establemente con el banco se seleccionan en cuanto a la resistencia al antibiótico blasticidina a la concentración de 5 mg/l durante 10 días. Para inducir la translectura traduccional, se añadió antibiótico G-418 al matraz de cultivo a la concentración final de 100 mg/l, y se incubó el matraz durante otras 48 horas a 37ºC. Se detectó la fusión de proteína anclada a la membrana usando anticuerpo marcado con ITCF dirigido frente al epítopo V5 (Invitrogen 46-0308). Es de esperar que el tratamiento con G-418 aumente sustancialmente el porcentaje de células que presentan niveles detectables de proteína de fusión. Además, se espera que la presencia de un codón de terminación entre las secuencias de IFN\alpha-etiqueta E-etiqueta S y V5-GPI de como resultado una reducción espectacular del porcentaje de células positivas en FACS en la población original sin clasificar en comparación con un banco similar que no incluya este codón de terminación. Como la translectura del codón de terminación sólo es parcial, esta reducción de las células positivas en FACS entre la población original también será observada incluso en presencia de aminoglicósido. Como resultado se ello, cuando se usa el enfoque de translectura regulada, es preferible usar bancos que presenten niveles más elevados de diversidad para proporcionar un nivel de diversidad similar al de los bancos que son desplegados sin este enfoque. Esto es aceptable para la mayoría de los bancos de expresión.

Para aumentar más el porcentaje de células que presentan niveles detectables de proteína de fusión anclada a la membrana, se puede repetir el mismo experimento cultivando las células en presencia de butirato de sodio aproximadamente 2 mM, que se usa habitualmente para aumentar los niveles de expresión de proteínas recombinantes (Gorman et al., 1983). Se espera que, en presencia de tanto G-418 como butirato de sodio, aumente sustancialmente el porcentaje de células que presenten niveles detectables de proteína de fusión por encima del porcentaje obtenido usando sólo G-418.

El experimento se puede realizar, p. ej., mediante la clasificación en una mezcla de un millón de células que sean positivas en el despliegue del epítopo V5 ("la población de V5"). Se espera que las células crezcan normalmente, y que el tratamiento simultáneo de las células con G-418 y butirato de sodio, así como la etapa de la FACS no afecten a la supervivencia de las células. Se trata la población de V5 con G-418, luego se analiza en cuanto al despliegue de proteína recombinante usando anticuerpo anti-V5 marcado con ITCF. Se espera que una fracción elevada de la población presente niveles detectables de proteína recombinante calculados mediante los niveles de fluorescencia. Para investigar la unión de la población de V5 con un receptor de IFN 2 truncado marcado con histidina (sIFNAR2-His), se pueden incubar las células con, p. ej., 100nM de receptor. La unión de sIFNAR2-His con el banco de IFN desplegado se puede detectar usando una combinación de anticuerpos de IgG1 de ratón anti-His y de IgG1 de rata anti-ratón marcados con RPE. El anticuerpo anti-V5 de IgG2 de ratón marcado con ITCF se usa para medir los niveles de fusión de proteína recombinante desplegada en la superficie celular. Se espera que un porcentaje relativamente elevado de las células que son pretratadas con G-418 presente la unión con sIFNAR2-His que es detectable mediante citometría de flujo y que la tecnología de translectura regulada permita la evaluación selectiva basada en FACS de los bancos de expresión que presenten un porcentaje relativamente elevado de clones no funcionales.

Tras la clasificación FACS, se cultivan células independientes (i.e., clones) en placas de cultivo de 96 pocillos sin G-418 para permitir la terminación de la traducción eficaz y, por tanto, promover la producción de un banco de IFN\alpha-etiqueta E-etiqueta S soluble. Se cultivan las células hasta la confluencia, tras lo que se analizan los sobrenadantes en cuanto a la actividad de la ARNasa, que está mediada por la presencia de la etiqueta S de las quimeras de IFN\alpha-etiqueta E-etiqueta S solubles.

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Ejemplo 6 Evaluación de la heterogeneidad de la expresión de proteína recombinante en poblaciones celulares mediante el análisis de FACS

La producción de proteína recombinante en células de mamífero para uso terapéutico requiere el aislamiento de clones que produzcan niveles estables de proteína recombinante a lo largo de las generaciones. Desafortunadamente, las células derivadas de los mismos clones originales suelen presentar variaciones sustanciales de los niveles de expresión de proteína recombinante. Esto puede ser el resultado de diversas causas, tales como la inestabilidad genética o la metilación del ADN. Como resultado de ello, las líneas celulares recombinantes que presentan tales discrepancias son inapropiadas y deben ser desechadas, a pesar de sus niveles de expresión de proteína recombinante.

Para demostrar que es posible usar un vector de expresión de un gen recombinante según lo revelado en la presente memoria para la evaluación de la heterogeneidad de la expresión de proteína recombinante en clones celulares, se usó el vector retroviral pLenti6-PC-UAAC-GPI para transfectar células HEK293FT y producir el retrovirus según lo descrito en el ejemplo 2. Se seleccionaron células CHO-K1 en cuanto a la resistencia al antibiótico blasticidina a la concentración de 5 mg/l durante 10 días. Para inducir la translectura traduccional, se añadió antibiótico G-418 al matraz de cultivo a la concentración final de 100 mg/l, y se incubó el matraz durante otras 48 horas a 37ºC. Se separaron las células de los matraces mediante tripsinización y posteriormente se sometieron a una clasificación FACS según lo descrito en el ejemplo 2. Se clasificaron las células individuales en base a sus niveles de fluorescencia en placas de cultivos de 96 pocillos que contenían 0,1 ml de medio de cultivo sin G-418 para permitir la producción de PC recombinante soluble. Se incubaron las placas de cultivos celulares a 37ºC durante 5 días, tras lo que se analizó al microscopio la presencia de colonias celulares individuales en cada cultivo. Se incubaron las placas a 37ºC hasta que las células alcanzaron la confluencia, y posteriormente se transfirieron las células a pocillos de cultivo de mayor tamaño (placas de cultivo de 12 pocillos que contenían 1 ml de medio en cada pocillo). Se cultivaron las células hasta obtener una confluencia del 25%, tras lo que se añadió medio recién preparado que contenía G-418 a una concentración final de 100 mg/l a cada pocillo para inducir la translectura traduccional. Se incubaron las placas durante otros 3 días a 37ºC. Se tripsinizaron las células, luego se marcaron con anticuerpos primarios y secundarios según lo descrito en el ejemplo 2, y posteriormente, se analizó la fluorescencia usando un analizador de células FACScalibur^{TM} (Becton Dickinson).

Los resultados mostrados en la figura 8 confirman que la presente invención permite el análisis de clones en cuanto a la uniformidad de la expresión de proteína recombinante en poblaciones de células. De hecho, el análisis de FACS de clones celulares que expresan la fusión PC-GPI revela que algunos clones expresan niveles de proteína PC-GPI relativamente uniformes (figura 8A), mientras que otros clones presentan niveles de proteína recombinante mucho más variables que comúnmente dan como resultado máximos de fluorescencia más amplios (figura 8B). Aunque los últimos pueden expresar niveles de proteína recombinante globales similares, no son adecuados como líneas celulares productoras, porque los niveles de expresión recombinante globales habitualmente descienden a lo largo de las generaciones debido a que las células que han perdido parcial o totalmente la capacidad de producir proteína recombinante generalmente crecen más rápido que las células que expresan niveles altos de proteína recombinante.

Además, la clonación de células basada en FACS a veces conduce a errores que dan como resultado la presencia de más de una célula en cada pocillo de cultivo celular. La presencia de múltiples clones en el mismo pocillo generalmente se calcula en el microscopio, pero requiere mucha mano de obra y puede conducir a valoraciones incorrectas. En la figura 8C, se presenta un ejemplo de la presencia de al menos dos clones celulares diferentes. De hecho, hay visibles dos máximos individuales claros correspondientes a poblaciones celulares que expresan niveles de proteína de fusión PC-GPI bien bajos o altos. La presencia de dos poblaciones celulares diferentes puede deberse a un fallo en la etapa de la FACS que conduce a la clasificación de dos células en el mismo pocillo. Alternativamente, es posible que la población de células que expresa los niveles de PC más bajos haya surgido de células que hayan perdido la capacidad de expresar la proteína recombinante. Las posibles causas de tal pérdida de la capacidad de expresión son múltiples y pueden incluir la reorganización cromosómica o la metilación del ADN. En cualquier caso, tales poblaciones celulares deben ser desechadas.

Hasta ahora, estos clones que presentan discrepancias en los niveles de expresión de proteína recombinante no se podían distinguir de los clones que presentaban niveles estables de expresión de proteína recombinante en las etapas tempranas posteriores a la clonación. Habitualmente, es necesaria la medición enzimática normal de los niveles de proteína recombinante para muchas generaciones de cultivos celulares para poder identificar y así eliminar tales clones inestables. Esta etapa requiere mucha mano de obra y reduce drásticamente el número de clones que se puede analizar.

La presente invención proporciona un procedimiento alternativo de bajo coste que se puede realizar en las etapas tempranas para analizar la estabilidad de los niveles de expresión de proteína recombinante. Además, la invención permite la detección de la presencia de múltiples poblaciones celulares que expresen diferentes niveles de expresión de proteína recombinante en clones celulares putativos.

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Ejemplo 7 Producción alternativa de proteína recombinante soluble marcada o nativa a partir de la misma célula

Las proteínas recombinantes que son expresadas en células eucariotas a menudo se fusionan traduccionalmente con etiquetas epitópicas que habitualmente son péptidos cortos para los que los anticuerpos específicos son valiosos. Alternativamente, los péptidos de mayor tamaño que presentan propiedades enzimáticas o bioquímicas interesantes (péptidos indicadores) pueden ser fusionados traduccionalmente con la proteína de interés. El marcaje de proteína recombinante mediante la fusión traduccional con etiquetas epitópicas o péptidos de mayor tamaño tiene múltiples aplicaciones, incluyendo la purificación de proteínas a través de una matriz de afinidad (p. ej., etiqueta de poli-histidina, epítopo V5), la localización subcelular (variantes de GFP), la transferencia Western y la inmunoprecipitación (etiquetas epitópicas).

Sin embargo, la presencia de etiquetas peptídicas puede interferir en las propiedades de la proteína de interés, inhibiendo el plegamiento de la proteína, la secreción o actividades enzimáticas. Además, la presencia de una etiqueta puede ser tóxica para la célula o simplemente no ser deseada en aplicaciones secuencia abajo. Como resultado de ello, puede que sólo se desee la presencia de una etiqueta peptídica transitoriamente.

La presente invención representa una herramienta ideal para la producción alternativa de proteínas recombinantes en sus formas nativas o marcadas a partir de las mismas células.

En el siguiente ejemplo, se fusiona traduccionalmente la secuencia que codifica el factor de coagulación humano siete (FVII) con la secuencia que codifica la proteína verde fluorescente aumentada (EGFP) (n.º de acceso del banco de genes AAB02572) usando un enfoque de PCR similar al descrito en el ejemplo 1. Para evitar la posible reiniciación traduccional interna, se elimina el primer codón de metionina (Met) de la EGFP y se reemplaza por el triplete de terminación de la traducción UAA. Se clona el fragmento de ADN resultante en el vector pCDNA6/myc-His-A (Invitrogen) para proporcionar el vector pCDNA6-FVII-UAA-EGFPd, que contiene cuatro codones de terminación secuencia abajo del gen de EGFP (figura 9).

Se usó el vector pCDNA6-FVII-UAA-EGFPd para transfectar las células CHO-K1 usando el reactivo de transfección Lipofectamin^{TM} 2000 (Invitrogen). Tras 48 horas, se seleccionaron células en cuanto a la resistencia al antibiótico blasticidina a la concentración de 5 mg/l durante 10 días. Se transfectaron las mezclas resultantes de células resistentes a la blasticidina a dos matraces de cultivo y se cultivaron hasta obtener una confluencia del 25%. Para inducir la translectura traduccional, se añadió antibiótico G-418 a un matraz de cultivo a la concentración final de 100 mg/l, y se incubaron ambos matraces durante otras 48 horas a 37ºC. Se recogen los sobrenadantes y se analizan en cuanto a la presencia de las proteínas FVII y EGFP mediante ELISA y análisis de fluorescencia, respectivamente.

En presencia de G-418, tendrá lugar la translectura traduccional y se detectará el indicador de EGFP. Por el contrario, no se esperan niveles de fluorescencia de EGFP por encima de los niveles de fondo en los sobrenadantes de las células desarrolladas en ausencia de G-418. Para confirmar este resultado, se puede realizar una transferencia Western usando anticuerpos anti-FVII. Se espera una banda de 45 kDa en los sobrenadantes procedentes tanto de muestras tratadas con G-418 como de muestras sin tratar. Esta banda se corresponde con la proteína FVII nativa. Se espera la presencia de una segunda banda que presente un tamaño molecular mayor (72 kDa) sólo en los sobrenadantes de las células tratadas con G-418. Esta banda de mayor tamaño se corresponde con una fusión de proteínas que comprende las proteínas FVII y EGFP.

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Ejemplo 8 Producción alternativa de proteína recombinante anclada a la membrana marcada o nativa a partir de la misma célula

Algunas proteínas recombinantes que se producen en células son dirigidas a la membrana plasmática. Este es el caso de muchos receptores hormonales. Como estas proteínas también están ancladas a la membrana plasmática de las células huésped, es posible enriquecer con células que expresen niveles elevados de proteína recombinante usando un enfoque de FACS. Sin embargo, este enfoque requiere que haya disponibles anticuerpos específicos frente al receptor para la detección de la proteína recombinante. Alternativamente, se pueden usar compuestos químicos o péptidos que sean conocidos por interactuar específicamente con la proteína recombinante. Si no hay ninguno disponible, la presente invención representa una alternativa atractiva, porque se pueden expresar etiquetas epitópicas o peptídicas que estén fusionadas traduccionalmente con la proteína recombinante en células tratadas con aminoglicósido.

Para demostrar que la invención descrita en la presente memoria se puede usar para la producción alternativa de proteína recombinante anclada a la membrana marcada o nativa a partir de la misma célula, se construye el vector pCDNA6-AR1-UAA-V5 (Figura 10). Este vector conduce la expresión del receptor de adiponectina 1 (AdipoR1) que pertenece a la familia de receptores transmembrana 7M (Yamauchi et al., 2003). El vector pCDNA6-AR1-UAA-V5 contiene un codón de terminación UAA inmediatamente secuencia abajo de la secuencia de AdipoR1, así como una secuencia que codifica el epítopo V5.

Se generan líneas celulares CHO-K1 transfectadas establemente con este vector según lo descrito en el ejemplo 5. Tras la generación de las líneas celulares, se dividen las células en dos matraces y se cultivan hasta obtener una confluencia del 25%. Para inducir la translectura traduccional, se añade antibiótico G-418 a un matraz de cultivo a la concentración final de 100 mg/l, y luego se incuban ambos matraces durante otras 48 horas a 37ºC. Se separan las células de los matraces mediante tripsinización y se incuban posteriormente con anticuerpos monoclonales anti-V5 marcados con ITCF (Invitrogen 46-0308).

Se clasifican las células CHO-K1 marcadas en base a su fluorescencia relativa a 530 nm usando un clasificador celular FACSVantage^{TM} (Becton Dickinson) con una longitud de onda de excitación de 488 nm. Se clasifican individualmente las células que presentan niveles de fluorescencia altos o moderados en placas de cultivos de 96 pocillos que contienen 0,1 ml de medio de cultivo sin G-418 para permitir la producción de AdipoR1 nativo recombinante. Se incuban las placas de cultivos celulares a 37ºC durante 5 días, tras lo que se calcula al microscopio la presencia de colonias celulares individuales en cada cultivo. Se incuban las placas a 37ºC hasta que las células alcanzan la confluencia y, posteriormente, se transfieren las células a pocillos de cultivo de mayor tamaño (placas de cultivo de 12 pocillos que contenían 1 ml de medio en cada pocillo). Se cultivan las células hasta obtener una confluencia del 25%, tras lo que se añade medio recién preparado que contiene G-418 a una concentración final de 100 mg/l a cada pocillo para promover la translectura traduccional. Se incuban las placas de cultivos durante otros 3 días a 37ºC. Se tripsinizan las células, luego se marcan con anticuerpos anti-V5 según lo descrito anteriormente, y posteriormente, se analiza la fluorescencia usando un analizador de células FACScalibur^{TM} (Becton Dickinson).

Se analizan 48 clones que presentan niveles bajos de V5 y 48 clones que presentan niveles altos de V5 durante la clasificación FACS en cuanto a los niveles de V5 anclado a la membrana por medio del análisis de FACS. Se espera que los resultados confirmen los niveles de expresión relativa de proteína recombinante que son observados durante la clasificación FACS. Se espera que la mayoría de los clones que son clasificados como altos expresadores de V5 presenten niveles de proteína recombinante superiores a los clones que están clasificados como bajos expresadores de V5.

Como resultado de ello, la presente invención proporciona un procedimiento basado en la FACS de alto rendimiento para la selección eficaz de clones individuales que expresen niveles altos de proteínas recombinantes ancladas a la membrana.

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Ejemplo 9 Selección de líneas celulares recombinantes privadas de resistencia a un antibiótico

Para obtener líneas celulares productoras de una proteína recombinante de interés, los procedimientos clásicos se basan en la presencia de un gen recombinante adicional que es portado por el vector de ADN usado durante la transfección y que confiere resistencia a un antibiótico. Tras la transfección, se cultivan las células en presencia de concentraciones de antibiótico conocidas por inhibir el crecimiento celular o matar células de tipo natural. Como resultado de ello, sólo pueden crecer las células que expresen la proteína recombinante que confiera resistencia al antibiótico dado.

Aunque la presencia del marcador de la resistencia proporciona un procedimiento valioso para seleccionar células que expresen una proteína recombinante de interés, muchas aplicaciones de secuencia abajo no requieren la presencia, o la expresión, de este marcador seleccionable. Por ejemplo, el promotor que conduce al gen marcador de la resistencia a menudo es un promotor muy potente de origen vírico que es constitutivamente activo. Como resultado de ello, el ARN recombinante que codifica el marcador de selección puede competir con otros ARN en la producción de proteínas y puede reducir los rendimientos de la proteína recombinante de interés. Además, la producción masiva de ARN que codifica el marcador de selección puede desencadenar un silenciamiento génico post-traduccional y, por tanto, puede conducir a rendimientos reducidos de la proteína recombinante de interés. Otra ventaja de un procedimiento que permita la selección de líneas celulares privadas de resistencia a un antibiótico es que eliminaría la posibilidad de una transferencia horizontal del gen marcador de selección de resistencia a un antibiótico a especies de tipo natural, lo que representa un posible riesgo para el medio ambiente. Otra posible ventaja más de la presente invención es la posibilidad de crear líneas transgénicas que expresen simultáneamente un número ilimitado de transgenes diferentes. De hecho, sólo hay unos cuantos marcadores de selección disponibles hasta la fecha, lo que limita drásticamente el número de diferentes transgenes que pueden ser expresados en la misma célula.

Para demostrar que la invención descrita en la presente memoria se puede usar para la selección de líneas celulares recombinantes privadas de resistencia a un antibiótico, se realizó una PCR usando los oligonucleótidos TBO235 (5' AAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCG 3') (SEC ID N.º 26) y TBO260 (5' CCTGCTATTGTCTTCCCAATCC 3') (SEC ID N.º 27) usando el vector pCDNA6-FVII-UAA-GPI (véase la figura 17) como molde. El producto resultante de la PCR englobaba el promotor del CMV, el intrón de b-globina, el gen de FVII, el codón de terminación UAA, la señal del anclaje GPI y la señal de poliadenilación de b-globina (figura 11). Se purificó el producto de la PCR y se usó posteriormente para transfectar células CHO-K1 con Lipofectamine^{TM} 2000 (Invitrogen) según lo descrito anteriormente. Además, se incubó un matraz que contenía células CHO-K1 con Lipofectamine^{TM} 2000, pero sin ADN como control negativo. Cinco horas después de la transfección, se añadió G-418 a los dos matraces de cultivo a la concentración final de 100 mg/l para promover la translectura traduccional. Se separaron las células de los matraces usando solución de disociación celular (Sigma) y se incubaron con anticuerpos monoclonales de FVII anti-humanos de ratón. Se lavaron posteriormente las células y se incubaron con un anticuerpo secundario (IgG de conejo anti-ratón, marcada con ficoeritrina (DAKO R0439)). Se analizaron las líneas celulares retrovirales marcadas mediante FACS en cuanto al FVII recombinante anclado a la membrana usando un instrumento FACScalibur^{TM} (Becton Dickinson) con una longitud de onda de excitación de 488 nm y un filtro de emisión de 585 nm.

Como la expresión de la proteína FVII recombinante está correlacionada con la expresión de la fusión de proteínas FVII-GPI que surge de la translectura traduccional mediada por aminoglicósido, se pueden seleccionar células transgénicas por medio de FACS en base a la detección de FVII anclada a la membrana. Como se observa en la figura 12, una población clara (entrada R3; 7,1%) de células CHO-K1 transfectadas presentó señales de fluorescencia, en comparación con sólo el 0,4% para la muestra de control negativo (en la que el 0,4% para las células de control negativo se debe al fondo de falso positivo). Aproximadamente 2.500 células de la entrada R3 de las células transfectadas fueron clasificadas como mezcla y desarrolladas durante 9 días en ausencia de antibiótico, tras lo que se indujo la translectura traduccional mediante el tratamiento de las células con G-418 a 100 mg/l durante 2 días. Se separaron las células de los matraces, luego se marcaron para la detección de FVII y se analizaron mediante citometría de flujo según lo descrito anteriormente. Se cultivaron células CHO-K1 no transfectadas de una manera similar como control negativo. Como se muestra en la figura 13, el tratamiento con G-418 dio como resultado el 3,4% de las células que eran positivas en el despliegue de FVII, mientras que sólo el 1,1% de las células fueron positivas en el control de CHO-K1 no transfectadas, debiéndose de nuevo este último porcentaje al fondo de falso positivo.

Es interesante destacar que hubo un mayor porcentaje de células transfectadas que dieron positivo en el despliegue de FVII durante la primera serie de FACS que durante la segunda etapa de clasificación (7,1% en la primera serie en comparación con el 3,4% en la segunda serie). Este resultado sugiere que una proporción sustancial de las células que dieron positivo en el despliegue de FVII durante la primera serie de clasificación no integraron de forma estable el transgén en su genoma. Esto era de esperar, porque la primera serie de clasificación tuvo lugar sólo 2 días después de la transfección. Como resultado de ello, gran parte de la proteína recombinante que fue detectada surgía de la expresión transitoria debido a la presencia del ADN recombinante usado para la transfección. Por el contrario, cuando se realizó la segunda serie de clasificación, las células habían sido cultivadas durante un total de 13 días desde que habían sido transfectadas. Por consiguiente, bien habían perdido o habían integrado establemente el transgén en su genoma. Tomados conjuntamente, estos resultados demuestran que es posible usar la presente invención para generar y seleccionar líneas celulares estables que expresen proteínas recombinantes sin la necesidad de usar un marcador de selección tal como un antibiótico o una proteína fluorescente.

Una vez obtenida una mezcla de células que expresan establemente la proteína recombinante, es posible someter la mezcla de células a una clonación de células individuales por medio de la FACS u otros procedimientos.

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Ejemplo 10 Expresión y evaluación selectiva de bancos de anticuerpos usando el enfoque de la translectura regulada

Los anticuerpos monoclonales (Acm) se están convirtiendo rápidamente en una de las clases más comunes de proteínas terapéuticas debido a su elevada especificidad frente a muchas clases de antígenos (Ag) diana. Como los Acm de longitud completa son secretados normalmente en el medio de cultivo de líneas celulares de producción, se han desarrollado fragmentos de región variable monocatenarios (scFv) para desplegar el fragmento de anticuerpo en la superficie de partículas de bacteriófago. El enfoque del despliegue en fagos se ha usado ampliamente para enriquecer bancos de anticuerpos scFv para la unión con un Ag dado. Sin embargo, los fragmentos scFv obtenidos de tal procedimiento de evaluación selectiva tienen que volver a ser injertados en estructuras de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpos antes de la producción estable en líneas celulares de mamífero. Esta etapa de subclonación es técnicamente difícil, requiere mucho tiempo y puede resultar en cierta pérdida de especificidad del anticuerpo, porque los anticuerpos scFv no siempre conservan la especificidad de unión de los anticuerpos completos. Además, algunos Acm genera-
dos a partir de tales procedimientos han resultado ser difíciles de producir a niveles de concentración satisfactorios.

El enfoque de translectura regulada ofrece la única oportunidad para desplegar Acm de longitud completa en la superficie celular de líneas celulares de mamífero para el enriquecimiento basado en la FACS. En el siguiente ejemplo, se construye un banco de anticuerpos humanos de longitud completa mediante el barajado de ADN, la mutagénesis de sitio dirigida o la PCR propensa a error. Se construyen dos vectores retroviral independientes que presentan diferentes marcadores de la resistencia a un antibiótico para producir el banco de cadenas ligeras de Acm (LC lib) y el banco de cadenas pesadas (HC lib), según lo mostrado en las figuras 19 y 20. Además, el vector para la producción de HC contiene un codón de terminación, un epítopo V5 y una señal de anclaje GPI. Tras la generación de líneas celulares CHO-K1 resistentes a la blasticidina estables que expresan el casete Retro-HC Lib-TERMINACIÓN-V5-GPI, se enriquecen las células en HC y/o despliegue de V5 por medio de citometría de flujo tras la inducción de una translectura traduccional mediante un tratamiento con aminoglicósido. Las células clasificadas son infectadas posteriormente con los segundos vectores retrovirales para la expresión de LC (Retro-LC Lib) y se genera una mezcla estable usando una selección con zeocina. Hay un vector retroviral, pLenti4/V5-DEST, que porta el gen de resistencia a la zeocina disponible en Invitrogen. Se trata la población de células resultante con un aminoglicósido para promover la translectura traduccional. Tras ello, se enriquece la población de células en células que muestran niveles detectables de Acm de longitud completa usando una combinación de anticuerpos fluorescentes adecuados para la citometría de flujo y dirigidos frente al epítopo V5 y los dominios HC y LC constantes del Acm desplegado.

Tras el tratamiento con aminoglicósido, se analiza simultáneamente el banco en cuanto a la unión a Ag y el despliegue de Acm (usando un anticuerpo marcado dirigido frente al epítopo V5 o HC) y se somete a una primera serie de enriquecimiento dirigida a la clasificación de todas las células que despliegan Acm y que interactúan con el Ag. Hay varios enfoques posibles para la detección de la interacción entre Acm y Ag en función de la naturaleza del marcaje de los Ag. Para los Ag conjugados con biotina, una etapa de detección de estreptavidina-RPE permite la visualización de la fluorescencia a 585 nm. Para los Ag marcados con fluoresceína, la fluorescencia se visualiza a 530 nm. Se usa simultáneamente un anticuerpo anti-V5 con la detección de Ac como un marcador de la cantidad de Acm recombinante desplegado en la superficie celular. Se someten posteriormente las células clasificadas a 1 ó 2 series de enriquecimiento basado en la constante de disociación usando Ag sin marcar como competidor y en presencia de un aminoglicósido para promover la translectura traduccional. Las células que presentan una unión no desplazable con el Ag son sometidas a la última serie de citometría de flujo y son clonadas individualmente en placas de cultivo de 96 pocillos. Como hay un codón de terminación presente inmediatamente secuencia abajo de la HC, la mayoría de HC producida en ausencia de aminoglicósido no tendrá la etiqueta de V5-GPI y seguirá por tanto la ruta secretora. Como resultado de ello, se secretará Acm funcional en el medio de cultivo, permitiendo así la caracterización funcional directamente desde los sobrenadantes de los clones clasificados.

Aunque la invención precedente haya sido descrita en cierto detalle a efectos de aclarar y facilitar su comprensión, será evidente para cualquier experto en la técnica a partir de la lectura de esta exposición que es posible hacer diversos cambios en cuanto a la forma y al contenido.

Por ejemplo, todas las técnicas, los procedimientos, las composiciones, los aparatos y los sistemas anteriormente descritos se pueden usar en diversas combinaciones.

Referencias

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Claims

1. Un procedimiento para evaluar selectivamente o seleccionar células que expresen un nivel deseado de un polipéptido, que comprende:

a): proporcionar una pluralidad de células eucariotas en la que cada una comprende un casete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica el polipéptido; al menos un codón de terminación secuencia abajo del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que codifica un péptido de anclaje a la membrana celular secuencia abajo del codón de terminación;

b): cultivar las células en presencia de un agente de inhibición de la terminación en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, siendo el agente de inhibición de la terminación un antibiótico de aminoglicósido; y

c): usar una citometría de flujo para seleccionar al menos una célula que exprese el polipéptido fusionado con un péptido de anclaje a la membrana celular.

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2. Un procedimiento para evaluar la expresión de polipéptido recombinante en una población de células que comprende:

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3. Un procedimiento para evaluar selectivamente o seleccionar al menos una célula que exprese un polipéptido con una afinidad de unión deseada por un ligando a partir de células que expresen un banco de variantes de polipéptido que comprende:

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4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además:

d): cultivar al menos una célula seleccionada en ausencia de un agente de inhibición de la terminación para obtener la expresión del polipéptido como un polipéptido soluble.

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5. Un procedimiento para expresar alternativamente i) un polipéptido soluble o ii) un polipéptido unido a membrana a partir de una sola célula o de una línea celular, que comprende:

a): proporcionar una pluralidad de células eucariotas en la que cada una comprende un casete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica el polipéptido, al menos un codón de terminación secuencia abajo del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que codifica un péptido de anclaje a la membrana celular secuencia abajo del codón de terminación;

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b): cultivar las células en presencia de un agente de inhibición de la terminación en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, siendo el agente de inhibición de la terminación un antibiótico de aminoglicósido;

c): usar una citometría de flujo para seleccionar al menos una célula que exprese el polipéptido fusionado con un péptido de anclaje a la membrana celular; y

d): cultivar dicha célula seleccionada en ausencia de un agente de inhibición de la terminación para obtener la expresión del polipéptido como un polipéptido soluble.

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6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que al menos una célula seleccionada expresa una proteína de fusión que comprende el polipéptido fusionado con un péptido de anclaje a la membrana celular, estando la proteína de fusión desplegada en la superficie de dicha célula.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el péptido de anclaje a la membrana celular es un anclaje GPI.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el antibiótico de aminoglicósido se selecciona del grupo constituido por G-418, gentamicina, paromomicina, higromicina, amicacina, canamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, estreptomicina y tobramicina.

9. Un procedimiento para expresar alternativamente i) un polipéptido sin marcar unido a membrana o ii) un polipéptido marcado unido a membrana a partir de una sola célula o de una línea celular, que comprende:

a): proporcionar una pluralidad de células eucariotas en la que cada una comprende un casete de expresión que comprende un primer polinucleótido que codifica el polipéptido y un péptido de anclaje a la membrana celular, al menos un codón de terminación secuencia abajo del primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que codifica un péptido indicador o una etiqueta epitópica secuencia abajo del codón de terminación;

b): cultivar las células en presencia de un agente de inhibición de la terminación en condiciones que permitan la expresión del polipéptido y del péptido de anclaje a la membrana celular, siendo el agente de inhibición de la terminación un antibiótico de aminoglicósido;

c): usar una citometría de flujo para seleccionar al menos una célula que exprese una proteína de fusión que comprenda el polipéptido, el péptido de anclaje a la membrana celular y un péptido indicador o una marca epitópica; y

d): cultivar dicha célula seleccionada en ausencia de un agente de inhibición de la terminación para obtener la expresión de una proteína que comprenda el polipéptido en forma unida a la membrana sin el péptido indicador ni la marca epitópica.

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10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el péptido de anclaje a la membrana celular es un anclaje GPI.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 ó 10, en el que el segundo polinucleótido codifica un péptido indicador seleccionado del grupo constituido por proteína verde fluorescente, luciferasa, \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa y cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT).

12. El procedimiento de la reivindicación 9 ó 10, en el que el segundo polinucleótido codifica una marca epitópica seleccionada del grupo constituido por V5, His, FLAG^{TM}, HA, c-myc, VSV-G y VHS.

13. Un procedimiento para producir un polipéptido que comprende cultivar una línea celular obtenida mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la línea celular es cultivada en ausencia de un antibiótico de aminoglicósido para permitir la expresión del polipéptido, y aislar dicho polipéptido.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el polipéptido es un polipéptido soluble que es secretado en un medio de cultivo, y el polipéptido es aislado de dicho medio.

15. Un equipo adecuado para realizar el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende uno o más de: (1) al menos un componente del equipo que comprende un casete de expresión según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-12; una célula o un vector de expresión que comprende dicho casete de expresión; un antibiótico de aminoglicósido; o una composición que comprende al menos uno de tales componentes; (2) las instrucciones para poner en práctica un procedimiento según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-14, las instrucciones para usar cualquier componente identificado en (1) o cualquier composición de cualquiera de tales componentes; (3) un envase para contener dicho al menos uno de tales componentes o composiciones y (4) materiales de empaquetado.