CN116888148A

CN116888148A - 追踪基因工程化细胞的肽标志物

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Publication number: CN116888148A
Application number: CN202180093877.8A
Authority: CN
Inventors: 卡斯汀·黎奈曼; 汤玛士·奎曼; 盖文·M·班斗; 杰罗恩·W·J·凡·赫斯特; 孔向俊; 勒克·约瑟夫斯·艾格蒙特
Original assignee: Dutch Shangxin Gene Therapy Co
Current assignee: Dutch Shangxin Gene Therapy Co
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2023-10-13

Abstract

为了能够对注入的基因工程化细胞进行控制，使该基因工程化细胞表达可用于在未修饰的细胞池中检测这种细胞的标志物是有帮助的。一些实施方案涉及包含TCR恒定区和在TCR恒定区内的包含可检测且可识别的序列的外源氨基酸变异的标记蛋白。其他实施方案涉及连接到TCR链的抗体表位。标记蛋白和抗体表位二者都可用于追踪基因工程化细胞。

Description

追踪基因工程化细胞的肽标志物

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背景技术

细胞疗法是一种将活细胞注入、移植或植入患者体内以实现医疗效果的疗法，例如，通过在免疫治疗过程中移植能够通过细胞介导的免疫(cell-mediated immunity)来对抗癌细胞的T细胞，或移植干细胞以使患病组织再生。

发明内容

本文描述的一些实施方案涉及包含TCR恒定区和外源氨基酸变异的标记蛋白，该外源氨基酸变异包含在TCR恒定区内的可检测且可识别的序列。

在一些实施方案中，可用于检测、分离(isolation)或去除(depletion)基因工程化细胞的标记蛋白。标记蛋白或蛋白标志物可以起到标志物的作用；通过找到标志物，可以检测、分离或去除任何含有标记蛋白的细胞。标记蛋白可以包含表位肽(epitopepeptide)，该表位肽可以被合适的抗体识别。

本文所述的一些实施方案涉及用于检测、分离或去除已通过引入治疗性TCR基因而修饰的基因工程化T细胞的标记蛋白，其中所述标记蛋白来源于鼠TCR Cβ结构域，并通过人TCR Cβ2结构域内存在的氨基酸的突变而被引入人TCR Cβ2结构域中。

在一些实施方案中，提供了用于检测、分离或去除由新的TCR基因修饰以治疗癌症的细胞的标记蛋白，其包含本文提供的任一实施方案的标记蛋白。

一些实施方案涉及用于检测、分离或去除具有上述任一实施方案的标记蛋白的基因工程化细胞的试剂盒，该试剂盒包含识别所述标记蛋白的抗体或结合剂(bindingagent)。

一些实施方案涉及标记蛋白，其用于将一种或多种有效载荷(payload)靶向递送至表达这种标记蛋白的基因工程化细胞，该标记蛋白包含本文所述实施方案中任一项所述的标记蛋白。

一些实施方案涉及将一种或多种有效载荷靶向递送至表达标记蛋白的基因工程化细胞的方法。该方法包括a)获得包含一种或多种有效载荷和结合剂的缀合物，其中结合剂与标记蛋白特异性结合，和b)将基因工程化细胞与该缀合物接触。

一些实施方案涉及可插入TCR链或成为TCR链的一部分的抗体表位。在一些实施方案中，该表位可用于检测表达这种抗体表位的基因工程化细胞，其中该抗体表位被连接到(attached to)TCR链或嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor)。在一些实施方案中，抗体表位包含2A肽序列、HA.11表位标签、FLAG表位标签、Myc表位标签或V5表位标签。在一些实施方案中，抗体表位被插入TCR链的恒定区而不是TCR的可变区中。在一些实施方案中，抗体表位通过TCR链的一个或多个位置的氨基酸交换引入，而不是通过向TCR链添加额外的外源氨基酸引入。

一些实施方案涉及用于检测已通过引入治疗性TCR基因而被修饰的基因工程化T细胞的抗体表位，其包含上述实施方案中任一项所述的抗体表位。

一些实施方案涉及用于检测由新的TCR或CAR基因修饰以治疗癌症的细胞的抗体表位，其包含上述实施方案中任一项所述的抗体表位。

一些实施方案涉及用于检测表达上述实施方案中任一项所述的抗体表位的基因工程化细胞的试剂盒。

一些实施方案涉及包含能够表达2A肽序列或与其至少90％相同的序列的核苷酸序列的基因构建体(genetic construct)，其中构建体被配置用于表达来自单个开放阅读框的多种蛋白质，并且其中该核苷酸序列不会使该基因构建体的大小增加超过25个氨基酸。如本文所用，在与肽有关的上下文中，“基因”表示编码肽序列的核酸序列；除此之外，它没有别的意思。

一些实施方案涉及表达前述实施方案中任一项所述的标记蛋白的基因工程化细胞。

参照以下说明和所附权利要求，可以更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。

附图说明

图1.TCR恒定区表位的示意图。

图2A示出了抗体表位的示意图，其中抗体表位被连接到TCR链的C-末端。

图2B示出了抗体表位的示意图，其中抗体表位被连接到TCR链的N-末端。

图2C示出了抗体表位的示意图，其中抗体表位被插入到TCR链中。

图2D示出了抗体表位的示意图，其中抗体表位用于连接TCRα链和TCRβ链；TCRα链和TCRβ链的位置可以互换(switched)。

图3示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入(knock-in)NY-ESO-1 1G4 TCR的FACS分析。数据示出，当使用完整鼠Trbc2序列(fully murineTrbc2 sequence)时，外源polyA信号对于TCR表达是有用的，并且表达完整鼠Trbc2序列的细胞可以被H57抗体识别。

图4示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。数据示出，将来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的10个氨基酸残基掺入人TRBC2序列中足以实现TCR表达和H57抗体识别。

图5示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。数据示出来自鼠Trbc2 A链以及FG环的6个氨基酸残基对实现H57抗体识别是必需的。

图6示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。数据示出，将来自鼠Trbc2 A链以及FG环的6个氨基酸残基掺入人TRBC2序列中足以实现TCR表达和H57抗体识别。

图7示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。数据示出，可以用抗-2A肽抗体检测已经被工程化以表达包含T2A肽序列的NY-ESO-1 1G4 TCR的人原代T细胞。

图8示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。数据示出，可以用抗-2A肽抗体检测已经被工程化以表达包含T2A肽序列的NY-ESO-1 1G4 TCR的人原代T细胞，并且这种2A肽染色与TCR Vβ13.1染色相关。

图9示出了已被逆转录病毒转导以表达CD19 CAR构建体的人原代T细胞的FACS分析。数据示出，可以用抗-2A肽抗体检测已经被工程化以表达含有2A肽序列的CD19 CAR构建体的人原代T细胞，并且这种2A肽染色与相同构建体(Ly6G)中存在的转导标志物蛋白的染色相关。

图10示出了用于产生2A肽抗体3H4的免疫原的序列(SEQ ID NO:1)。

图11示出了T2A肽序列(SEQ ID NO:2)。

图12示出了P2A肽序列(SEQ ID NO:3)。

图13示出了包含可通过H57抗体检测的鼠TCR表位的人TCR Cβ2结构域的序列(SEQID NO:4)。

图14示出了与可通过3H4抗体检测的T2A肽表位连接的人TCR Cβ2结构域的序列(SEQ ID NO:5)。

图15示出了T2A或P2A肽序列的片段(SEQ ID NO:6)。

图16示出了E2A或F2A肽序列的片段(SEQ ID NO:7)。

图17示出了人TCR Cβ2结构域的序列(SEQ ID NO:8)。

图18示出了在无抗体预孵育后、与H57、H57-IL2或H57-IL2v预孵育后，用标记的H57抗体染色的huTRBC2-Mur6 1G4 TCR Jurkat细胞的FACS直方图，其中染色减少反映了预孵育的抗体或融合蛋白的结合。

图19示出了在无抗体预孵育后、与H57、H57-IL2或H57-IL2v预孵育后，用标记的H57抗体染色的huTRBC2-Mur6 1G4 TCR原代T细胞的FACS直方图和竞争浓度曲线，其中染色减少反映了预孵育的抗体或融合蛋白的结合。

图20示出了用针对IL2的标记抗体染色的huTRBC2-Mur6 1G4 TCR原代T细胞的FACS直方图和结合浓度曲线。

图21示出了由响应IL2、H57-IL2或H57-IL2v融合蛋白的CD25和CD69表达测量的刺激响应的FACS图。

图22示出了在一定浓度范围内的IL2、H57-IL2或H57-IL2v融合蛋白下的CD25和CD69表达响应(expression response)。

图23示出了FACS直方图，其示出了由细胞示踪紫(cell trace violet)测量的响应于IL2、H57-IL2或H57-IL2v融合蛋白的增殖增加。

图24示出了在一定浓度范围内的IL2、H57-IL2或H57-IL2v融合蛋白下，由细胞示踪紫测量的增殖增加。

图25示出了对于表达muTRBC2、huTRBC1-Mur6和huTRBC2-Mur61G4的细胞，H57和与人TCRβ恒定区结合的抗体的结合的FACS图。

图26A-26D示出了表达muTRBC2、huTRBC2和huTRBC2-Mur6 1G4TCR的原代T细胞中IFN-γ和IL2的增加。图26A(IFN-γ)和图26C(IL2)示出了加载到靶细胞上的NY-ESO肽的一系列浓度的浓度响应。图26B(IFN-γ)和图26D(IL2)示出了在最高肽加载浓度的单独实验中表达标志物的细胞百分比的点图。

图27A示出了在与表达muTRBC2、huTRBC2和huTRBC2-Mur6 1G4TCR的T细胞共培养期间靶细胞数量的时间进程。图27B示出了最近时间点(72小时)的单个实验中剩余相对细胞数的点图。

具体实施方式

在上文的发明内容部分和具体实施方式部分以及所附的权利要求书中，参照了本发明的特定特征。应当理解，在本说明书中本发明的公开内容包括这些特定特征的所有可能的组合。例如，在本发明的特定方面或实施方案或特定权利要求的上下文中公开了特定特征的情况下，该特征也可以尽可能地与本发明的其他特定方面和实施方案结合使用和/或在本发明的其他特定方面和实施方案中以及在本发明的一般情况下使用。

细胞疗法包括将细胞注入或以其他方式移植到患者体内的疗法。基因工程化T细胞就是这样一种材料。为了对注入的基因工程化T细胞进行控制，基因工程化T细胞表达一种可用于在未修饰的细胞池(a pool of unmodified cells)中检测这种T细胞的标志物是有用的。理想情况下，这种标志物也可用于在生产过程中分离出成功修饰的T细胞，或者一旦向患者施用，即可用于追踪或去除(deplete)这些T细胞。此外，这种标志物应该是非免疫原性的，并且应该构成治疗性基因构建体的天然部分。例如，这种标志物可以是多肽，其可以形成抗体可结合的表位。

本文所述的一些实施方案涉及可用于检测、分离或去除基因工程化细胞的标记蛋白。标记蛋白或蛋白标志物可以作为标志物发挥作用；任何含有标记蛋白的细胞均可通过找到标志物而被检测、分离或去除。在一些实施方案中，标记蛋白包含TCR恒定区和外源氨基酸变异，所述外源氨基酸变异包含在TCR恒定区内可检测且可识别的序列。

一些实施方案涉及标记蛋白，其用于将一种或多种有效载荷靶向递送到表达这种标记蛋白的基因工程化细胞，其包含本文所述实施方案中任一项所述的标记蛋白。

一些实施方案涉及可插入TCR链中或成为TCR链的一部分的抗体表位。在一些实施方案中，该表位可用于检测表达这种抗体表位的基因工程化细胞，其中该抗体表位被连接到TCR链或嵌合抗原受体。

定义

在整个说明书中，词语“包括”或变体诸如“包含”或“含有”将被理解为暗示包括所陈述的要素、整数或步骤或要素、整数或步骤的组，而不排除任何其他要素、整数或步骤或要素、整数或步骤的组。

提供以下术语和方法的解释是为了更好地描述本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。单数形式“一”、“一个”和“该”指的是一个或一个以上，除非上下文另有明确规定。例如，术语“包含一个核酸分子”包括单个或多个核酸分子，并被认为等同于短语“包含至少一个核酸分子”。术语“或”指的是所述可选要素中的单个要素或两个或多个要素的组合，除非上下文中另有明确说明。如本文所用，“包括”意指“包含”。因此，“包括A或B”意味着“包括A、B或A和B”，而不排除其他要素。除非另有说明，否则当本定义可能不同于其他可能的定义时，本文提供的定义将起控制作用。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文提及的所有HUGO基因命名委员会(HUGO GeneNomenclature Committee，HGNC)标识符(id)以其整体援引加入本文。尽管与本文所述方法和材料相似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但在下文中将描述合适的方法和材料。这些材料、方法和实例仅是说明性的，而不是限制性的。

“T细胞受体”或“TCR”表示在T细胞或T淋巴细胞表面发现的分子，其识别作为肽与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。TCR由两条不同的蛋白链组成(即，它是一种异源二聚体)。在人类中，在95％的T细胞中，TCR由阿尔法(α)链和贝塔(β)链组成(分别由TRA和TRB编码)，而在5％的T细胞中，TCR由伽玛(γ)链和德尔塔(δ)链(γ/δ)组成(分别由TRG和TRD编码)。这一比例在个体发育和疾病状态下(如白血病)会发生变化。物种之间也有所不同。每条TCR链包含两个胞外结构域：可变区(V)和恒定区(C)。恒定区靠近细胞膜，随后是跨膜区和短的胞质尾区(cytoplasmic tail)，而可变区与肽/MHC复合物结合。TCRα链和TCRβ链的可变区都有三个高变互补决定区(CDR)，称为CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，CDR3是主要的抗原识别区。在一些实施方案中，TCRα链基因包含V和J，TCRβ链基因包含有助于TCR多样性的V、D和J基因区段(segment)。TCR的恒定区由短的连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两条链之间形成连接。

术语“治疗性TCR基因(therapeutic TCR genes)”可指介导所需功能的TCRα链和TCRβ链的特定组合，例如，能够促进宿主免疫系统对抗疾病。治疗性TCR基因可以从体外进行突变的通过噬菌体、酵母或T细胞展示系统表达为重组TCR文库的TCR链中选择。治疗性TCR基因可以是自体的或同种异体的。

术语“癌(cancer)”表示已经经历了分化丧失的特征性间变(characteristicanaplasia)、生长速率加快、侵袭周围组织并且能够转移的恶性赘生物。术语“癌”应包括以个体内细胞失控生长为特征的疾病。在一些实施方案中，术语“癌”和“肿瘤”可互换使用。在一些实施方案中，术语“肿瘤”指良性或非恶性生长。

如本文所用，术语“新抗原(neo-antigen)”指来源于肿瘤特异性基因组突变的抗原。例如，新抗原可由肿瘤样品中由于非同义单核苷酸突变导致的突变蛋白的表达产生，或者由于突变诱导的移码导致的替代开放阅读框的表达产生。因此，新抗原可能与病理状况有关。在一些实施方案中，“突变蛋白”指包含至少一个不同于在标准氨基酸序列中相同位置处的氨基酸的氨基酸的蛋白。在一些实施方案中，突变蛋白包含相对于标准氨基酸序列的氨基酸的插入、缺失、取代、包含由阅读框移位而产生的氨基酸或它们的任意组合。

“抗体”表示至少包括轻链或重链免疫球蛋白的可变区的多肽，其特异性识别并结合抗原的表位。在一些实施方案中，抗体由重链和轻链组成，每条链都具有可变区，称为可变重链(V_H)区和可变轻链(V_L)区。V_H区和V_L区共同负责结合抗体识别的抗原。术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白，以及其变体和部分，如Fab’片段、F(ab)’₂片段和任何其它来源于完整免疫球蛋白的分子。

“基因工程化细胞”是使用生物技术改变其基因组成的细胞。这种变化包括在物种边界内和跨物种边界的基因转移，以产生改良的或新的生物体。新的DNA是通过使用重组DNA方法分离和复制感兴趣的遗传物质或通过人工合成DNA获得的。

“基因工程化T细胞”是使用生物技术改变其基因组成的T细胞。

表位肽、表位蛋白和抗体表位在本文中可互换使用。关于某些具体命名的表位，该名称也可以用来代替具有表位一词的单词或短语。对于命名为“mur6”的表位，该名称可根据上下文酌情指huTRBC1-Mur6或huTRBC2-Mur6。

有关标记蛋白的各种实施方案

本文所述的一些实施方案涉及可用于检测、分离或去除基因工程化细胞的标记蛋白。标记蛋白或蛋白标志物可以作为标志物发挥作用；任何含有标记蛋白的细胞均可通过找到标记物来检测、分离或去除。标记蛋白可以包含表位肽，表位肽可以被合适的抗体识别。在一些实施方案中，标记蛋白可用于刺激细胞。在一些实施方案中，将标记蛋白引入T细胞中，以允许检测、分离或去除基因工程化T细胞。在一些实施方案中，将标记蛋白引入T细胞中，以刺激工程化的T细胞。在一些实施方案中，将标记蛋白引入工程化的T细胞中，以便产生“手柄(handle)”来递送组分，包括但不限于细胞因子、核酸和小分子。在一些实施方案中，标记蛋白不用于刺激。

图1中示出了一些实施方案的示意图。在一些实施方案中，图1中所示的TCR恒定区可以是TCRα或TCRβ恒定区。可以使用全长或仅部分TCR恒定区。

在一些实施方案中，标记蛋白包含TCR恒定区和外源氨基酸变异，所述外源氨基酸变异包含在TCR恒定区内可检测且可识别的序列。在一些实施方案中，氨基酸变异被引入TCR恒定区而不是TCR可变区中，以保持TCR特异性和敏感性。在一些实施方案中，抗体表位被插入TCR链的恒定区而不是TCR的可变区中。在一些实施方案中，抗体表位通过TCR链的一个或多个位置的氨基酸交换引入，而不是通过向TCR链添加额外的外源氨基酸引入。

可检测且可识别的是指能够被分子生物学技术或一些其他相关技术发现或识别。例如，如果标记蛋白能够与特定的抗体结合，然后通过标准的分子生物学技术进行检测和鉴定，那么它就是可检测且可识别的，这些技术包括但不限于流式细胞术、IHC、免疫荧光显微术、蛋白质印迹(western blot)和ELISA。在一些实施方案中，标记蛋白在细胞表面上表达，因此是细胞外抗体可接近的。

外源氨基酸变异是指不天然存在于物种TCR恒定区中的氨基酸序列。外源氨基酸变异可以是来自另一物种的氨基酸序列，或人工序列。此外，它可以是连续或不连续的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，TCR恒定区来自一个物种，而外源氨基酸变异来自另一个物种。在一些实施方案中，TCR恒定区来自人类，外源氨基酸变异来自非人类物种。在一些实施方案中，该非人类物种是小鼠(mouse)。

外源氨基酸变异可以源自TCR恒定区的某些氨基酸的突变。例如，可以突变人TCR恒定区的某些氨基酸，使得人TCR恒定区的一段(piece)氨基酸序列变成鼠TCR序列。通过这种方式，可以将鼠表位引入人TCR恒定区，产生标记蛋白，而标记蛋白的氨基酸总数与天然人TCR恒定区蛋白相同。因此，这种方法的优点之一是，与天然人TCR恒定区相比，它不会增加标记蛋白的大小。此外，标记蛋白被掺入到TCRβ恒定区，因此它具有与TCR本身相同的稳定性和表达。此外，引入来自鼠TCR恒定区的选择性氨基酸而不使用完整的鼠TCR恒定区可以降低标记蛋白的免疫原性。在一些实施方案中，突变包括10个氨基酸突变。在一些实施方案中，突变包括6个氨基酸突变。在一些实施方案中，突变仅被引入两个TCR恒定区中的一个中。

还有其他方法可以将外源氨基酸变异引入TCR恒定区中。例如，可以将第一物种的TCR恒定区的一段氨基酸序列插入并替换第二物种TCR恒定区内具有相同数目的氨基酸的序列，以制成标记蛋白。与第二物种的天然TCR恒定区相比，这种方法也不会增加标记蛋白的大小。

在一些实施方案中，TCR恒定区包含由人类T细胞受体β恒定区2(TRBC2)基因编码的序列。在一些实施方案中，外源氨基酸变异包含鼠TCRβ链恒定区(TCRCβ结构域)的序列。在一些实施方案中，外源氨基酸变异包含以下10种氨基酸突变中的一种或多种：K4R、F7T、Y37F、N106E、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S、A114P。在一些实施方案中，外源氨基酸变异包括这些突变中的2、3、4、5、6、7、8、9或10种。

为了便于在单细胞水平上区分基因工程化细胞与未修饰细胞，抗体试剂可用于检测工程化细胞所特有的蛋白标志物。已发表的研究表明，杂交的鼠化TCR(其中人TCR可变区与鼠TCR恒定区相连)是有功能的，并且可以使用抗-鼠TCR Cβ抗体H57进行检测(Cohen等人，Cancer Res2006)。如本文所用，“H57”可指保留本文所述的选择性结合特性并至少具有H57可变区的任何抗体或其抗原结合片段。这种抗体不与人TCR Cβ结构域结合，因此可以独特地识别表达鼠化TCR的工程化T细胞。这种全TCR恒定区鼠化(murinization)的缺点是，它可能增加引入的TCR基因的免疫原性(Davis等人，Clin Cancer Res 2010)，并且它不允许治疗性TCR基因的框内外显子敲入人TCRα或TCRβ恒定区基因座。为了克服这些限制，在一些实施方案中，产生了“最小化的”的含鼠表位的TCR Cβ结构域，其中10个氨基酸被交换(swapped)(K4R、F7T、Y37F、N106E、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S、A114P，其中编号是根据Ensembl基因组浏览器。基因：人TRBC2基因序列中的TRBC2(ENSG00000211772))。在一些实施方案中，这些残基的编号参照SEQ ID NO:8中的编号安排。因此，提及“如SEQ ID NO:8中所编号的”表示SEQ ID NO:8中的氨基酸位置编号系统，而不是序列本身。在这10个氨基酸中，K4和F7是TCR CβA链的部分，Y37是TCR CβB链的部分，而N106-A114是TCR CβFG环的部分(Sasada等人，J Exp Med 2002)。在一些实施方案中，产生了“最小化的”含鼠表位的TCRCβ结构域(“huTRBC2-Mur6”)，其中在人TRBC2基因的序列中交换了6个氨基酸(K4R、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S)。这些含鼠表位的TCRβ链可以有效地与完整的人TCRα链配对，并在细胞表面被H57抗体检测到，这允许TCR修饰的T细胞的检测、分离和去除(depletion)。此外，这些含鼠表位的TCRβ链与治疗性TCR基因在人TCRα或TCRβ恒定区基因座的框内外显子敲入是相容的。

在一些实施方案中，外源氨基酸变异是可通过抗体、纳米抗体、Fab片段或DARPin检测和识别的。纳米抗体，也称为单结构域抗体(single-domain antibody)，是由单个单体可变抗体结构域(monomeric variable antibody domain)组成的抗体片段；像完整的抗体一样，它能够选择性地与抗原特异性结合。DARPin(设计锚蛋白重复蛋白(designedankyrin repeat proteins)的首字母缩写)是基因工程化抗体模拟蛋白，通常表现出高度特异性且高亲和力的靶蛋白结合；DARPin来源于天然存在的锚蛋白，这是一类在自然界中介导高亲和力蛋白-蛋白相互作用的蛋白。在一些实施方案中，外源氨基酸变异包含与某些特异性抗体结合并且可被这些抗体检测和识别的抗体表位。表位可以是连续的或不连续的序列。在一些实施方案中，TRBC2中的4位和108-113位置是鼠源的。根据一些实施方案，用标记蛋白检测TCR修饰的T细胞是基于可以通过流式细胞术检测的抗体染色。

在一些实施方案中，外源氨基酸变异是可通过抗-鼠TCR Cβ抗体H57检测和识别的。H57特异性结合鼠TCR Cβ结构域，并且不与人TCR Cβ结构域结合。当将可通过H57检测的鼠表位引入人TCR Cβ结构域时，所得标记蛋白可与具有天然人TCR Cβ结构域的蛋白区分开。存在于其他物种的TCRα恒定区或TCRβ恒定区(分别为TRAC和TRBC)中的任何抗体表位结构域可以以类似的方式利用，例如可被小鼠抗大鼠TCRαβ抗体R73检测到的抗体表位。

在一些实施方案中，人TRAC或TRBC中的氨基酸的定向突变可用于生成人工抗体表位，可针对所述人工抗体表位生成抗体。

在一些实施方案中，提供了一种标记蛋白。它可用于检测、分离或去除表达这种标记蛋白的基因工程化细胞，包括任何前述实施方案的标记蛋白。在一些实施方案中，基因工程化细胞包括基因工程化T细胞。在一些实施方案中，基因工程化T细胞包含通过引入治疗性TCR基因而被修饰的T细胞。术语“治疗性TCR基因”可以指介导所需功能的TCRα和TCRβ链的特定组合，例如，能够促进宿主免疫系统对抗疾病。

基于现有技术的检测TCR修饰的T细胞的方法具有不同缺点。通常，通过MHC多聚体或TCR V结构域特异性抗体检测TCR修饰的T细胞中的TCR蛋白表达(Altman等人，Science2006；Faint等人，J Immunol Methods 1999)。此外，TCR Cβ结构域特异性抗体已被用作pan-αβTCR抗体(克隆IP26；Schober等人，Nat Biomed Eng 2019)，或检测含有人TRBC1结构域的TCR(克隆JOVI-1；Maciocia等人，Nat Med 2017)或鼠Trbc1/2结构域(克隆H57；Mall等人，Cancer Res 2016)。然而，需要针对各TCR特异性特异性地生成MHC多聚体，这取决于HLA-等位基因限制，对于某些TCR是不可用的；TCR V结构域特异性抗体仅可用于某些TCR V结构域；如果TCR修饰的T细胞存在于利用相同TCR V结构域或TCR Cβ结构域的其他T细胞的池中，则不能使用TCR V结构域特异性抗体和TCR Cβ结构域特异性抗体。此外，由于大的鼠蛋白序列的可能的免疫原性，使用完整鼠TCR恒定区是不理想的；此外，基于完整鼠TCR恒定区的治疗性TCR基因构建体不能框内整合到人TCRα或TCRβ恒定区基因座中，并且需要外源polyA信号的共递送(co-delivery)才能进行有效表达。因此，完整鼠TCR恒定区所需的基因模板的尺寸将增加(increase in size)，可能会对采用位点特异性敲入方法时的基因递送效率产生负面影响。

类似地，基于现有技术的分离TCR修饰的T细胞的方法具有各种缺点。这些方法利用任何基于抗体的分离方法(例如，利用流式细胞术或基于磁珠的分离)。最常见的是，通过基于MHC多聚体的试剂进行TCR修饰的T细胞的分离(Knabel等人，Nat Med 2002)。如上所述，需要针对各TCR特异性特异性地生成MHC多聚体，这取决于HLA-等位基因限制，对于某些TCR是不可用的。其他分离方法包括：

-位于TCR抗原结合结构域中的抗体表位的使用(如Kieback等人，PNAS2008中所述)。氨基酸的添加或修饰因其可以改变结合结构域的结构而可以被认为干扰了TCR抗原的精细特异性和TCR敏感性。因此，这一构思需要对每一个TCR进行可行性研究，并可能影响某些TCR的抗原结合。

-TCR V结构域或人TRBC1特异性抗体的使用。也如上所述，此类试剂仅可用于某些TCR V结构域，并且如果TCR修饰的T细胞存在于利用相同TCR V结构域或人TRBC1的其他T细胞池中，则不能使用。

-与治疗性TCR基因一起表达的细胞表面标记蛋白的使用，例如截短的LNGFR或EGFR蛋白的共表达。然而，包含这样的细胞表面标志物增加了转基因的大小，这会影响基因工程和随后的转基因表达的效率，以及增强工程化T细胞的免疫原性。

此外，基于现有技术的TCR修饰的T细胞的去除方法也存在各种缺点。许多“安全开关(safety switches)”被描述用于过继性T细胞疗法(adoptive T cell therapy)，包括TCR和CAR疗法。所描述的系统包括：

-位于TCR抗原结合结构域中的抗体表位的使用(如Kieback等人，PNAS2008中所述)。这一构思需要对每个单独的TCR进行测试，并可能影响一部分(a fraction of)TCR的抗原结合。

-额外的转基因的使用，如单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus)TK(Bonini等人，Science 1997；Ciceri等人，Lancet Oncol 2009)或诱导型胱天蛋白酶-9(Straathof等人，Blood 2005；Di Stasi等人，N Engl J Med 2011)，其可在体内被选择性活化。然而，包含这种标志物增加了需要递送到细胞中的转基因的大小，这可能影响基因工程和随后的转基因表达的效率。

与现有技术相比，本文提供的一些实施方案可以提供以下优点中的一个或多个：

1.降低的免疫原性：一些实施方案将有限数目的氨基酸变化引入人TRBC结构域中。Cohen等人Cancer Res 2006描述的完整鼠Trbc2基因与人TRBC2基因相比含有33个外源氨基酸(foreign amino acids)。相比之下，一些实施方案中描述的含鼠表位的TRBC2基因仅含有10个或更少的外源氨基酸，例如9、8、7、6、5、4、3或2个不是人的而是鼠的氨基酸。

2.适用于所有人TCR的广泛通用性：与诸如TCR V结构域特异性抗体、MHC多聚体或TCR框架修饰等替代技术不同，本文描述的一些实施方案可用于所有TCR，而不受TCR V结构域的用途、MHC限制性和抗原特异性的影响。

3.高度特异性检测：即使在没有基因敲除内源TCR链的情况下，一些实施方案也允许高度特异性检测TCR修饰的T细胞。替代技术，如TCR V结构域-特异性抗体和人TRBC1-特异性抗体可能会与相当大部分的内源TCR链特异性反应，从而无法准确检测和特异性分离或去除TCR修饰的T细胞。

4.允许将治疗性TCR基因框内外显子敲入人TCR基因座：例如，如Schober等人(NatBiomed Eng 2019)所述，利用完全鼠化的Trbc基因敲入治疗性TCR构建体的TCRα基因座需要共递送完全鼠化的Trac基因和牛生长激素poly(A)序列，以终止外源转录。相比之下，一些实施方案中描述的利用含鼠表位的TRBC2基因的TCRβ链可以有效地与完整人TCRα链配对，因此与框内外显子TCRα基因座敲入和内源转录终止相容。这意味着治疗性基因构建体的大小减少了约500bp，从而提高了基因工程过程的效率。

5.避免了治疗性TCR基因盒大小的显著增加：一些实施方案是基于将人TCR恒定区中的选定氨基酸突变成鼠对应的氨基酸。用于检测、分离和/或去除TCR修饰的T细胞的替代技术包括使用额外的蛋白质(例如截短的EGFR、截短的LNGFR、HSV-TK和诱导型胱天蛋白酶(Caspase)-9)。因此，所递送的转基因的大小增加，从而影响基因工程和后续转基因表达的效率。此外，在转基因中包含额外的细胞表面表达蛋白会增强工程化T细胞的免疫原性。

在一些实施方案中，已经将通过引入治疗性TCR基因而被修饰的T细胞用于癌症治疗。在一些实施方案中，癌为实体瘤。治疗性TCR基因可以从体外突变的通过噬菌体、酵母或T细胞展示系统表达为重组TCR文库的TCR链中选择。治疗性TCR基因也可以指来自基于个体患者的肿瘤活检的新抗原特异性TCR基因。在识别出这些新抗原特异性TCR基因后，通过基因工程将它们导入到患者T细胞中，从而将T细胞的抗原特异性重新定向到(redirect)肿瘤新抗原。最后，通过静脉输注将基因工程化T细胞输回患者体内，以治疗这些癌症。这些实施方案可以应用于符合工程化过继T细胞治疗条件的所有癌症。

在一些实施方案中，为了在治疗性TCR基因构建体中制作标记蛋白，将鼠表位引入人TCR Cβ结构域，以允许通过抗小鼠TCR Cβ抗体H57检测基因工程化T细胞中引入的TCR。H57是在Kubo等人，J Immunol1989中首次描述的抗体。在一些实施方案中，使用H57-597。H57-597是针对TCRβ链C区表位的仓鼠单克隆抗体(mAb)。H57-597抗体不与携带γ/δTCR的T细胞发生交叉反应。固定化或可溶性的H57-597抗体能活化携带α/βTCR的T细胞。本文描述的一些实施方案涉及用于检测、分离或去除已经通过引入治疗性TCR基因而被修饰的基因工程化T细胞的标记蛋白，其中所述标记蛋白源自鼠TCR Cβ结构域，并通过突变人TCR Cβ2结构域内存在的氨基酸而被引入人TCR Cβ2结构域。

在一些实施方案中，提供了标记蛋白，用于检测、分离或去除由新的TCR基因修饰以治疗癌症的细胞，其包含本文提供的任一实施方案的标记蛋白。

一些实施方案涉及用于检测、分离或去除具有上述实施方案中任一项所述的标记蛋白的基因工程化细胞的试剂盒，其包含识别所述标记蛋白的抗体或结合剂。在一些实施方案中，试剂盒包括与H57抗体连接的磁珠，其可用于分离或去除表达含鼠表位的TCRβ链的T细胞。在一些实施方案中，该试剂盒包括用于检测组织中基因工程化细胞的染色剂。在一些实施方案中，该基因工程化细胞包括T细胞。在一些实施方案中，T细胞已经通过引入治疗性TCR基因而被修饰。在一些实施方案中，已经通过引入治疗性TCR基因而被修饰的T细胞用于癌症治疗。

与用于靶向递送的标记蛋白有关的各种实施方案

一些实施方案涉及标记蛋白，其用于将一种或多种有效载荷靶向递送至表达这种标记蛋白的基因工程化细胞，其包含本文所述实施方案中任一项所述的标记蛋白。

在一些实施方案中，通过与抗体、抗体模拟蛋白或任何其他抗原结合支架缀合来实现一种或多种有效载荷的递送。在一些实施方案中，一种或多种有效载荷的递送通过与H57抗体缀合来实现。

在一些实施方案中，递送的有效载荷为蛋白质、小分子、核酸、脂质体或纳米粒子。在一些实施方案中，有效载荷是双特异性或三特异性抗体。

在一些实施方案中，递送的有效载荷为细胞因子。在一些实施方案中，递送的有效载荷选自IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α。在一些实施方案中，细胞因子的序列被修饰以调节与其天然受体分子的相互作用。

在一些实施方案中，有效载荷为由T细胞表达的受体分子的激动剂或拮抗剂。在一些实施方案中，激动剂与CD27、CD28、CD137或CD278结合。在一些实施方案中，拮抗剂与TGF-β受体、PD-1、CTLA-4、Vista、类固醇受体或A₁-、A_2A-、A_2B-或A₃-腺苷受体结合。

在一些实施方案中，有效负载为调节T细胞活化、分化、增殖、存活或效应子功能的小分子。在一些实施方案中，小分子抑制TGF-β受体、PD-1、CTLA-4、Vista、类固醇受体信号传导或A₁-、A_2A-、A_2B-或A₃-腺苷受体信号传导。

在一些实施方案中，有效载荷为调节T细胞活化、分化、增殖、存活或效应子功能的核酸。在一些实施方案中，核酸包括miRNA、shRNA或siRNA。

一些实施方案涉及将一种或多种有效载荷靶向递送至表达标记蛋白的基因工程化细胞的方法。该方法包括a)获得包含一种或多种有效载荷和结合剂的缀合物，其中结合剂与标记蛋白特异性结合，和b)将基因工程化细胞与缀合物接触。

在一些实施方案中，结合剂为抗体、抗体模拟蛋白或任何其他抗原结合支架(antigen-binding scaffold)。

在一些实施方案中，一种或多种有效载荷为蛋白质、小分子、核酸、脂质体或纳米粒子。

如本文所理解的，基于现有技术将有效载荷靶向递送至工程化T细胞的方法可能具有各种缺点。大多数方法使用与细胞表面上存在的内源标志物(例如CD3e或PD-1)结合的抗体来靶向鼠T细胞或非工程化的人T细胞。一些研究描述了使用与用荧光亲脂性示踪染料(fluorescent lipophilic tracer dye)DiD标记的聚乙二醇化脂质体缀合的抗-Thy1.1F(ab’)₂片段将荧光脂质体靶向过继转移的小鼠T细胞(Zheng等人，J Control Release,2013)。另一项研究描述了使用与载有TGFβR1抑制剂SB525334的聚乙二醇化脂质体缀合的抗-Thy1.1 F(ab’)₂片段，对过继转移的小鼠T细胞进行TGFβ受体靶向抑制(Zheng等人，ACSNano,2017)。另一项研究描述了使用与载有TGFβR1抑制剂SD-208的聚乙二醇化PLGA基纳米离子缀合的抗-PD-1F(ab’)₂片段，对小鼠T细胞进行TGFβ受体靶向抑制(Schmid等人，NatCommun,2017)。另一篇描述了使用与装载有两个DNA质粒的纳米粒子缀合的抗-CD3εF(ab’)₂片段将CAR DNA构建体靶向小鼠T细胞，其中一个质粒编码CD19 CAR基因，侧翼为piggyBac反向重复序列，并且另一个质粒编码超活性piggyBac iPB7转座酶基因(hyperactive piggyBac iPB7 transposase gene)(Smith等人，Nature Nanotech,2017)。另一篇描述了使用与装载有编码Foxo1_3A变体转录因子的mRNA的纳米粒子缀合的抗-CD3ε抗体将转录因子mRNA靶向到人T细胞(Moffett等人，Nat Commun,2017)。还有一篇描述了使用与装载有TGFβR1抑制剂SB525334的两亲性金纳米粒子缀合的抗CD8α纳米抗体对小鼠T细胞进行TGFβ受体靶向抑制(Yang等人，Biomater Sci,2019)。然而，这些技术没有提供将有效载荷靶向递送至用于过继T细胞疗法的工程化人T细胞的解决方案。

一些技术允许使用与突变体IL-2多肽(IL2v)融合的抗-PD-1抗体，将IL-2细胞因子活性靶向人类T细胞和NK细胞，所述突变体IL-2多肽经工程化改造以与IL-2Rβγ结合，但不与IL-2Rα结合(WO/2018/184964，2018)。其他研究描述了使用与突变体人IFN-α融合的抗-CD8α抗体将I型干扰素细胞因子活性靶向小鼠T细胞和cDC1 DCs，该突变体人IFN-α在小鼠细胞上的活性比野生型小鼠IFN-α低约100倍(Huyghe等人，EMBO Mol Med,2020)。另一篇描述了使用与突变体IL-21多肽融合的抗-PD-1抗体将IL-21细胞因子活性靶向人T细胞，所述突变体IL-21多肽已经被工程化为比游离的WT IL-21活性低>1000倍(Shen等人，FrontImmunol,2020)。然而，这些技术没有提供将细胞因子活性靶向递送至用于过继T细胞疗法的工程化人T细胞的解决方案。

一些研究使用与引入的截短的HER2标记基因结合的DARPin靶向工程化人CAR T细胞。这涉及使用与Neo-2/15融合的抗-HER2 DARPin G3将IL-2和IL-15细胞因子活性靶向表达截短的HER2作为转导标记基因的人CAR T细胞，Neo-2/15是一种IL-2和IL-15模拟物，已被设计为与IL-2Rβγ结合，但不与IL-2Rα结合(Leung等人，AACR 2020Abstract#2222,2020)。然而，这并没有为将细胞因子活性靶向递送至用于过继T细胞疗法的工程化人T细胞提供解决方案，在这种疗法中，除了治疗性TCR或CAR基因之外，没有额外的标记基因被共递送。

本文所述的一些实施方案可克服上述一个或多个缺点。本文描述的各种实施方案靶向工程化的人T细胞，而不需要引入额外的标记基因，因此不必增加治疗性基因盒的大小，从而最大限度地提高了基因编辑效率。

在一些实施方案中，TCR Cβ结构域鼠表位的实施方案与上述实施方案的不同之处在于，可以靶向工程化的人T细胞，而不需要引入额外的标记基因，因此不必增加治疗性基因盒的大小，这有助于提高基因编辑效率。

与2A肽表位有关的各种实施方案

一些实施方案涉及可被插入TCR链或成为TCR链一部分的抗体表位。在一些实施方案中，表位可用于检测表达这种抗体表位的基因工程化细胞，其中该抗体表位被连接到TCR链或嵌合抗原受体。在一些实施方案中，基因工程化细胞包含编码包含抗体表位的肽的核苷酸构建体。在一些实施方案中，基因工程化细胞的检测基于可通过流式细胞术检测的抗体染色。该抗体能特异性结合并识别抗体表位。

如图2A-2D中所示，在一些实施方案中，抗体表位被连接到TCR链的C-末端或N-末端，该TCR链可以是恒定链或可变链。在其他实施方案中，抗体表位被插入到TCR链中。在一些实施方案中，抗体表位用于连接TCRα链和TCRβ链。在一些实施方案中，抗体表位的位置取决于TCR链的表达顺序。一些实施方案可以包括编码含有抗体表位序列的蛋白质的除TCR以外的基因。实例包括与例如用于调节T细胞功能的第二转基因融合的嵌合抗原受体(CAR)转基因。一些实施方案可以包括一个或多个抗体表位。一些实施方案可以具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个抗体表位，其中抗体表位可以相同或不同。只要有能特异性检测该表位的抗体，任何抗体表位都可用于这些实施方案中。在一些实施方案中，所使用的抗体与流式细胞术中的使用兼容。在一些实施方案中，抗体表位被连接到TCR恒定区的C-末端，因此位于细胞内，从而降低了免疫原性，因为抗体表位对于抗体介导的免疫反应是不可及的。在一些实施方案中，抗体表位被连接到TCR恒定区，以避免干扰TCR特异性和敏感性。

在一些实施方案中，基因工程化细胞包括T细胞。在一些实施方案中，T细胞已经通过引入治疗性TCR或CAR基因而被修饰。在一些实施方案中，已经通过引入治疗性TCR或CAR基因而修饰的T细胞用于癌症治疗。术语“治疗性TCR基因(therapeutic TCR genes)”可以指介导所需功能的TCRα和TCRβ链的特定组合，例如，能够促进宿主免疫系统对抗疾病。

在一些实施方案中，抗体表位包含2A肽序列、HA.11表位标签、FLAG表位标签、Myc表位标签或V5表位标签。这些表位标签可以用流式细胞仪兼容的抗体进行特异性检测。在一些实施方案中，抗体表位包括含有至多与2A肽相同数目的氨基酸的肽。本领域技术人员理解，任何表位标签，只要它们包含至多与2A肽相同数量的氨基酸，都可以用于制备抗体表位。

2A肽，或2A自切割肽，是一类18-22个氨基酸(aa)长的肽，其来源于病毒。2A肽家族的四个成员经常用于生命科学研究。他们是P2A、T2A、E2A或F2A。P2A来源于猪捷申病毒-1(porcine teschovirus-1)2A；T2A病毒来源于明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)2A；E2A来源于马A型鼻炎(equine rhinitis A)病毒；F2A来源于手足口病毒18。

在一些实施方案中，2A肽可以为P2A、T2A、E2A或F2A。在一些实施方案中，2A肽具有双重目的：首先，它允许将两个蛋白序列的表达联系起来；第二，它允许检测两个蛋白序列中的至少一个。如本文所用，当“基因”用于指编码2A肽等多肽的基因时，表示编码该肽(例如2A肽)的核苷酸序列。它不是指天然存在的基因排列，而是编码相关肽的核酸序列的简称。

在一些实施方案中，抗体表位包含2A肽序列片段或与其至少90％相同的序列，其中该2A肽序列不是完整的2A序列。

在一些实施方案中，该肽序列包含SEQ ID NO:1的序列(CGDVEENPG)。在一些实施方案中，该肽序列包含SEQ ID NO:6的序列(GDVEENPG)。在一些实施方案中，该肽序列包含SEQ ID NO:7的序列(GDVESNPG)。在一些实施方案中，该肽序列包含与SEQ ID NO:1至少75％相同的序列。

在一些实施方案中，抗体表位可以通过单克隆抗-2A肽抗体3H4来识别。3H4是Novus Biologicals公司最近开发的抗体。它可用于蛋白质印迹(Yu等人，Viruses 2020)、免疫沉淀和免疫细胞化学/免疫荧光。

一些实施方案涉及用于检测表达上述实施方案中任一项所述的抗体表位的基因工程化细胞的试剂盒。在一些实施方案中，基因工程化细胞包括T细胞。在一些实施方案中，T细胞已经通过引入治疗性TCR基因而被修饰。在一些实施方案中，已经通过引入治疗性TCR基因而修饰的T细胞用于癌症治疗。在一些实施方案中，试剂盒包括特异性结合抗体表位的抗体或结合剂。在一些实施方案中，抗体或结合剂可以包括荧光标志物或可检测的标志物。

一些实施方案涉及包含能够表达2A肽序列或与其至少90％相同的序列的基因的基因构建体，其中所述构建体被配置用于表达来自单个开放阅读框的多种蛋白质，并且其中所述基因不会使所述基因构建体的大小增加超过25个氨基酸。

在一些实施方案中，2A肽序列包含2A肽序列片段或与其至少90％相同的序列。2A肽序列不是完整的2A序列。在一些实施方案中，2A肽序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6的序列，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6至少75％相同的序列。(SEQ ID NO:2＝EGRGSLLTCGDVEENPGP；SEQ ID NO:3＝ATNFSLLKQAGDVEENPGP；SEQ ID NO:6＝GDVEENPG)。

在使用基因工程化T细胞的细胞疗法中，必须重新定向此类T细胞的抗原特异性。为了重定向T细胞的抗原特异性，应该引入外源TCRα和TCRβ链序列。因此，为了最大限度地提高基因工程的效率，治疗性TCR基因构建体应能促进两个TCR基因的同时表达。实现这一点的一种方法是通过使用2A自切割肽序列，其允许来自单个开放阅读框的两种蛋白质以等摩尔比共表达(Ryan和Drew，EMBO J 1994)。值得注意的是，基于2A肽的TCR转基因显示出与基于IRES的TCR转基因相比增加的表达和功能性(Leisegang等人，J Mol Med 2008)，推测这是由引入的TCR链的配对增强而导致的。

在一些实施方案中，在治疗性TCR基因构建体中，TCRα和TCRβ链利用共价连接至TCR Cα或TCR Cβ结构域(取决于表达顺序)的间插表位(intervening epitope)(例如，标志物或标签)序列(例如2A肽序列)进行共表达。由于2A肽序列通常不存在于哺乳动物细胞中，因此这种肽可以作为蛋白标志物来追踪基因工程化T细胞。为了将工程化的T细胞与未修饰的T细胞区分开，可以使用能够在单细胞水平上检测工程化的T细胞的抗体试剂。已经产生了可以使用单克隆抗-2A肽抗体3H4检测治疗性TCR基因的基于流式细胞术的染色方法。由于2A肽标志物与TCRβ链的胞内结构域共价连接，因此重要的是在膜透化细胞中进行这种染色程序。这些2A肽连接的TCRβ链允许使用3H4抗体有效地检测TCR修饰的T细胞，而来自野生型T细胞的背景信号非常少。此外，这些与2A肽连接的TCRβ链与将治疗性TCR基因框内外显子敲入到人TCR基因座中是相容的。

与现有技术相比，将根据本文所述的各种实施方案的基于抗体表位的蛋白标志物用于检测、分离或去除TCR修饰的T细胞提供了以下优点：(a)不会使治疗性基因构建体的大小增加超过25个氨基酸，(b)具有最小的免疫原性，(c)可用于每种治疗性TCR基因，而不需要根据TCR的抗原特异性进行优化，以及(d)与完整的人TCR恒定区的使用兼容。由于其位于细胞内(intracellular location)，该标志物适用于检测但不适用于分离或去除经工程化以表达治疗性TCR的T细胞。

更具体地，在一些实施方案中，对于包含2A肽表位的抗体表位，优于现有技术的一些优点可包括以下一种或多种：

1.降低的免疫原性：所公开的发明引入了与替代技术如完整鼠TCR恒定区相比有限数目的氨基酸变化。值得注意的是，虽然2A肽序列来源于病毒，但它们似乎不会在免疫活性个体中诱导免疫反应(Arber等人，Gene Ther 2013)。

2.适用于所有人TCR的广泛通用性；可以用于每种治疗性TCR基因，而不需要根据TCR的抗原特异性进行优化。

3.高度特异性检测，详见实施例3和实施例4。

4.允许将治疗性TCR基因框内外显子敲入人TCR基因座。

5.避免了治疗性TCR基因盒大小的显著增加；添加2A肽不会显著改变转基因的大小，因为2A肽很小。这一点很重要，因为在基因递送过程中，较大的转基因通常会导致较低的整合效率和较高的DNA毒性。

一些实施方案涉及表达前述实施方案中任一项所述的标记蛋白的基因工程化细胞。一些实施方案涉及表达前述实施方案中任一项所述的抗体表位的基因工程化细胞。一些实施方案涉及含有前述实施方案中任一项所述的基因构建体的基因工程化细胞。

可将标记蛋白或抗体表位引入任何合适的细胞中。合适的细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母和细菌。在一些实施方案中，合适的载体(carriers)包括病毒、酵母、细菌和噬菌体。虽然为了简单起见，本发明通篇使用术语“细胞”，但是在本文中，预期本文中所有此类公开的“细胞”不仅包括各种形式的T细胞(例如永生化T细胞)、酵母和细菌，还可以更广泛地用于任何载体，包括病毒和噬菌体。因此，如本文所用，围绕“细胞”的公开内容(指可引入组合文库的细胞)可包括真核细胞、原核细胞，并表示病毒和噬菌体也可用作载体的选择的情况。细胞可以是细胞系、永生化细胞或原代细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞，或来源于人细胞。在一些实施方案中，细胞群包括永生化T细胞或原代T细胞。在一些实施方案中，细胞是经工程化改造的，例如基因修饰，以减少或消除细胞功能特性的内源表达或背景表达。在一些实施方案中，细胞是经工程化改造的，例如基因修饰，以增强细胞在引入标记蛋白或抗体表位时表现出功能特性的能力。在一些实施方案中，细胞是经工程化改造的，例如基因修饰，以促进培养群体的生长和/或维持。在一些实施方案中，群体的细胞不包含赋予细胞至少一种功能特性的内源多肽。在一些实施方案中，细胞是经基因修饰的，以引入或增强或消除或降低CD4、CD8和CD28中一种或多种的表达。在一些实施方案中，经基因修饰的细胞是T细胞。

图3-9中示出了支持本文所述各种实施方案的一些数据。在这些和其他实施方案中，表1中列出的序列可能是有用的。图10-17也描述了下表中的各种序列。

表1：

图3示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。huTRBC1：完整人TRBC1序列；muTrbc2：没有polyA信号的完整鼠Trbc2序列；muTrbc2-BGHpA：具有BGH polyA信号的完整鼠Trbc2序列；huTRBC1-muFG：人TRBC1序列，其中掺入了鼠Trbc2 FG环(预测的H57结合表位；Wang等人，EMBO J 1998)。选择人原代CD3⁺T细胞，并用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后5天，收集细胞并用APC抗-小鼠TCR Cβ链抗体(克隆H57-597，目录号#109212，百进生物技术公司)和PE-Cy7抗-人TCR Vβ13.1抗体(克隆H131，目录号#362406，百进生物技术公司)共染色进行分析。数据显示，当使用完整鼠Trbc2序列时，polyA信号对于TCR表达是有用的，并且表达完整鼠Trbc2序列的细胞可以被H57抗体识别。然而，将鼠Trbc2 FG环掺入人TRBC1序列中，虽然能够使TCR表达，但不足以被H57抗体识别。

图4示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。huTRBC1：完整人TRBC1序列；muTrbc2-BGHpA：具有BGH polyA信号的完整鼠Trbc2序列；huTRBC2-muABFG：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环(预测的H57结合表位；Wang等人,EMBO J 1998和Sasada等人,J Exp Med 2002)的10个氨基酸残基。选择人原代CD3⁺T细胞，并用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后5天，收集细胞并用APC抗-小鼠TCR Cβ链抗体(克隆H57-597，目录号#109212，百进生物技术公司(BioLegend))和PE-Cy7抗-人TCR Vβ13.1抗体(克隆H131，目录号#362406，百进生物技术公司)共染色进行分析。数据显示，将来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的10个氨基酸残基掺入人TRBC2序列足以实现TCR表达和H57抗体识别(氨基酸突变为K4R、F7T、Y37F、N106E、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S、A114P)。

图5示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。huTRBC2：完整人TRBC2序列；huTRBC2-muABFG：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环(预测的H57结合表位)的10个氨基酸残基；muABFG R4K：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复(reverted back)为人对应物(human counterpart)(R4K)以定位(map)最小H57结合表位；muABFG T7F：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基回复为人对应物(T7F)以定位最小H57结合表位；muABFG F37Y：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(F37Y)以定位最小H57结合表位；muABFG E106N：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(E106N)以定位最小H57结合表位；muABFG K108E，人TRBC2序列：其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(K108E)以定位最小H57结合表位；muABFG P110T：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(P110T)以定位最小H57结合表位；muABFG E111Q：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(E111Q)以定位最小H57结合表位；muABFGG112D：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(G112D)以定位最小H57结合表位；muABFG S113R：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(S113R)以定位最小H57结合表位；muABFG P114A：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(P114A)以定位最小H57结合表位。选择人原代CD3⁺T细胞，并用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后5天，收集细胞并用APC抗-小鼠TCR Cβ链抗体(克隆H57-597，目录号109212，百进生物技术公司)和PE-Cy7抗-人TCR Vβ13.1抗体(克隆H131，目录号#362406，百进生物技术公司)共染色进行分析。数据显示，来自鼠Trbc2 A链以及FG环的6个氨基酸残基是H57抗体识别所必需的(氨基酸是R4、K108、P110、E111、G112和S113)。

图6示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。huTRBC2：完整人TRBC2序列；huTRBC2-mu10：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环(预测的H57结合表位)的10个氨基酸残基；huTRBC2-mu6：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A链以及FG环的6个氨基酸残基(鉴定出的最小H57结合表位)；huTRBC2-mu7：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A链以及FG环的7个氨基酸残基(经鉴定的最小H57结合表位+T7)。选择人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后6天，收集细胞并用APC抗-小鼠TCR Cβ链抗体(克隆H57-597，目录号109212，百进生物技术公司)和PE-Cy7抗-人TCR Vβ13.1抗体(克隆H131，目录号#362406，百进生物技术公司)共染色进行分析。数据显示，将来自鼠Trbc2 A链以及FG环的6个氨基酸残基掺入人TRBC2序列足以实现TCR表达和H57抗体识别(氨基酸突变为K4R、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S)。

图7示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。空白对照(Mock)电穿孔：细胞未被电穿孔；TRAC RNP：仅用TRAC RNP对细胞进行电穿孔；TRAC RNP+环状修复模板：用TRAC RNP和环状修复模板对细胞进行电穿孔；TRAC RNP+线性修复模板：用TRAC RNP和线性修复模板对细胞进行电穿孔。选择人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后10天，收集细胞，使其透化(permeabilized)并用非缀合的小鼠抗-2A肽抗体(克隆3H4，目录号NBP2-59627，Novus Biologicals公司)和BV421大鼠抗-小鼠IgG1抗体(克隆A85-1，目录号#562580，BD生物科学公司)染色进行FACS分析。所有染色均在BD透化/洗涤缓冲液(1x)中进行。数据显示，用抗-2A肽抗体可以检测到已经被工程化以表达包含T2A肽序列的NY-ESO-11G4 TCR的人原代T细胞。

图8示出了使用不同修复模板在人原代T细胞的内源TRAC基因座处敲入NY-ESO-11G4 TCR的FACS分析。空白对照(Mock)电穿孔：细胞未被电穿孔；TRAC RNP：仅用TRAC RNP对细胞进行电穿孔；TRAC RNP+环状修复模板，用TRAC RNP和环状修复模板对细胞进行电穿孔；TRAC RNP+线性修复模板：用TRAC RNP和线性修复模板对细胞进行电穿孔。选择人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后11天，收集细胞，使其透化并用非缀合的小鼠抗-2A肽抗体(克隆3H4，目录号#NBP2-59627，Novus Biologicals公司)、BV421大鼠抗-小鼠IgG1抗体(克隆A85-1，目录号#562580，BD生物科学公司)和PE-Cy7抗人-TCR Vβ13.1抗体(克隆H131，目录号#362406，百进生物技术公司)通过染色进行FACS分析。所有染色均在BD透化/洗涤缓冲液(1x)中进行。数据显示，用抗-2A肽抗体可以检测到已经被工程化以表达包含T2A肽序列的NY-ESO-1 1G4TCR的人原代T细胞，并且这种2A肽染色与TCR Vβ13.1染色相关。

图9示出了已被逆转录病毒转导以表达CD19 CAR构建体的人原代T细胞的FACS分析。空白对照(Mock)转导：细胞未被转导；Ly6G-Puro：用含有Ly6G-P2A-Puro构建体的逆转录病毒转导细胞；第一代CAR-Ly6G-Puro：用含有第一代CD19 CAR-T2A-Ly6G-P2A-Puro构建体的逆转录病毒转导细胞；第二代CAR-Ly6G-Puro：用含有第二代CD19CAR-T2A-Ly6G-P2A-Puro构建体的逆转录病毒转导细胞。选择人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后如上所述用逆转录病毒感染。转导后14天，收集细胞，使其透化并用非缀合的小鼠抗-2A肽抗体(克隆3H4，目录号NBP2-59627，Novus Biologicals公司)、BV421大鼠抗-小鼠IgG1抗体(克隆A85-1，目录号562580，BD生物科学公司)和PE/Dazzle 594抗-Ly6G抗体(克隆1A8，目录号127647，百进生物技术公司)通过染色进行FACS分析。所有染色均在BD透化/洗涤缓冲液(1x)中进行。数据显示，用抗-2A肽抗体可以检测到已经被工程化以表达含有2A肽序列的CD19 CAR构建体的人原代T细胞，并且这种2A肽染色与存在于同一构建体(Ly6G)中的转导标志物蛋白的染色相关。

当本文提及包含两个或更多个限定步骤的方法时，限定步骤可按任何顺序进行或同时进行(上下文排除该可能性的情况除外)，且该方法可包括在任何限定步骤之前、两个限定步骤之间或所有限定步骤之后进行的一个或多个其他步骤(上下文排除该可能性的情况除外)。

在一些实施方案中，设想了任何以下配置：

1.一种标记蛋白，其包含：

TCR恒定区；和

外源氨基酸变异，该外源氨基酸变异包含在所述TCR恒定区内可检测且可识别的序列。

2.根据配置1所述的标记蛋白，其中所述TCR恒定区包含TCRα恒定区或TCRβ恒定区。

3.根据配置1所述的标记蛋白，其中所述外源氨基酸变异包含所述TCR恒定区的序列的突变，任选地，其中所述标记蛋白包含huTRBC1-mur6或huTRBC2-mur6。

4.根据配置1所述的标记蛋白，其中所述TCR恒定区来自一个物种，并且所述外源氨基酸变异来自另一物种。

5.根据配置4所述的标记蛋白，其中所述TCR恒定区来自人类，并且所述外源氨基酸变异来自非人类物种。

6.根据配置5所述的标记蛋白，其中所述非人类物种为小鼠。

7.根据配置3所述的标记蛋白，其中所述TCR恒定区包含由人TRBC2基因编码的序列。

8.根据配置3所述的标记蛋白，其中所述外源氨基酸变异包含鼠TCR Cβ结构域的序列。

9.根据配置3所述的标记蛋白，其中所述突变包含10个氨基酸突变。

10.根据配置9所述的标记蛋白，其中所述突变形成不连续序列。

11.根据配置9所述的标记蛋白，其中10个氨基酸突变根据SEQ ID NO:8的编号系统编号为K4R、F7T、Y37F、N106E、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S、A114P。

12.根据配置3所述的标记蛋白，其中所述突变包含6个氨基酸突变。

13.根据配置12所述的标记蛋白，其中所述6个氨基酸突变为K4R、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S，任选地，其中所述标记蛋白包含SEQ ID NO:27。

14.根据配置1所述的标记蛋白，其中所述外源氨基酸变异是可通过抗体、纳米抗体、Fab片段或DARPin检测和识别。

15.根据配置1所述的标记蛋白，其中所述外源氨基酸变异是可通过抗小鼠TCR Cβ抗体H57-597检测和识别的。

16.一种标记蛋白，其用于检测、分离或去除表达这种标记蛋白的基因工程化细胞，其包含如配置1-15中任一项所述的标记蛋白。

17.根据配置16所述的标记蛋白，其中所述基因工程化细胞包括基因工程化T细胞。

18.根据配置17所述的标记蛋白，其中所述基因工程化T细胞包含已通过引入治疗性TCR基因而修饰的T细胞。

19.根据配置18所述的标记蛋白，其中所述已通过引入治疗性TCR基因而修饰的T细胞用于癌症治疗。

20.一种标记蛋白，其用于检测、分离或去除通过引入治疗性TCR基因而修饰的基因工程化T细胞，其中所述标记蛋白来源于鼠TCR Cβ结构域，并通过人TCR Cβ2结构域内存在的氨基酸的突变而被引入人TCR Cβ2结构域。

21.一种标记蛋白，其用于检测、分离或去除由新的TCR基因修饰以治疗癌症的细胞，所述标记蛋白包含根据配置1-20中任一项所述的标记蛋白。

22.一种用于检测、分离或去除具有如配置1-21中任一项所述的标记蛋白的基因工程化细胞的试剂盒，所述试剂盒包含识别所述标记蛋白的抗体。

23.根据配置22所述的试剂盒，其中所述基因工程化细胞包括T细胞。

24.根据配置23所述的试剂盒，其中所述T细胞已经通过引入治疗性TCR基因而被修饰。

25.根据配置24所述的试剂盒，其中所述已经通过引入治疗性TCR基因而修饰的T细胞用于癌症治疗。

26.一种标记蛋白，其用于将一种或多种有效载荷靶向递送至表达这种标记蛋白的基因工程化细胞，其包含如配置1-15中任一项所述的标记蛋白。

27.根据配置26所述的标记蛋白，其中所述一种或多种有效载荷的递送通过缀合至抗体、抗体模拟蛋白或任何其他抗原结合支架来实现。

28.根据配置27所述的标记蛋白，其中所述抗体是抗小鼠TCR Cβ抗体H57-597。

29.根据配置26所述的标记蛋白，其中所述一种或多种有效载荷是蛋白质、小分子、核酸、脂质体或纳米粒子。

30.根据配置26所述的标记蛋白，其中所述递送的有效载荷是细胞因子。

31.根据配置30所述的标记蛋白，其中所述细胞因子选自IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α。

32.根据配置30所述的标记蛋白，其中所述细胞因子的序列被修饰，以便调节与其天然受体分子的相互作用。

33.根据配置30所述的标记蛋白，其中所述细胞因子是由T细胞表达的受体分子的激动剂或拮抗剂。

34.根据配置26所述的标记蛋白，其中所述有效载荷是由T细胞表达的受体分子的激动剂或拮抗剂。

35.根据配置34所述的标记蛋白，其中所述激动剂结合CD27、CD28、CD137或CD278。

36.根据配置34所述的标记蛋白，其中所述拮抗剂结合TGF-β受体、PD-1、CTLA-4、Vista、类固醇受体或A₁-、A_2A-、A_2B-或A₃-腺苷受体。

37.根据配置26所述的标记蛋白，其中所述有效载荷是调节T细胞活化、分化、增殖、存活或效应子功能的小分子。

38.根据配置37所述的标记蛋白，其中所述小分子抑制TGF-β受体、PD-1、CTLA-4、Vista、类固醇受体信号传导或A₁-、A_2A-、A_2B-或A₃-腺苷受体信号传导。

39.根据配置26所述的标记蛋白，其中所述有效载荷是调节T细胞活化、分化、增殖、存活或效应子功能的核酸。

40.根据配置39所述的标记蛋白，其中所述核酸是miRNA、shRNA或siRNA。

41.根据配置26所述的标记蛋白，其中所述有效载荷是双特异性抗体或三特异性抗体。

42.一种用于将一种或多种有效载荷靶向递送至表达标记蛋白的基因工程化细胞的方法，所述方法包括：

获得包含所述一种或多种有效载荷和结合剂的缀合物，其中所述结合剂与所述标记蛋白特异性结合，和

将所述基因工程化细胞与所述缀合物接触。

43.根据配置42所述的方法，其中所述结合剂为抗体、抗体模拟蛋白或任何其他抗原结合支架。

44.根据配置42所述的方法，其中所述一种或多种有效载荷为蛋白质、小分子、核酸、脂质体或纳米粒子。

45.一种抗体表位，其用于检测表达这种抗体表位的基因工程化细胞，其中所述抗体表位被连接到TCR链或嵌合抗原受体(CAR)。

46.根据配置45所述的抗体表位，其中所述抗体表位被连接到TCR链的C-末端或N-末端，或者CAR的C-末端或N-末端。

47.根据配置45所述的抗体表位，其中所述抗体表位被插入到TCR链或CAR中。

48.根据配置45所述的抗体表位，其中基因工程化细胞包含T细胞。

49.根据配置48所述的抗体表位，其中T细胞已通过引入治疗性TCR基因或CAR基因而被修饰。

50.根据配置49所述的抗体表位，其中已通过引入治疗性TCR基因或CAR基因而被修饰的T细胞用于癌症治疗。

51.根据配置45所述的抗体表位，其中所述抗体表位用于连接TCRα链和TCRβ链，或用于将CAR与由另一基因编码的蛋白质连接。

52.根据配置45所述的抗体表位，其包含2A肽序列、HA.11表位标签、FLAG表位标签、Myc表位标签、V5表位标签或包含与所述2A肽多达相同数目的氨基酸的肽。

53.根据配置52所述的抗体表位，其中所述2A肽可以是P2A、T2A、E2A或F2A。

54.根据配置45所述的抗体表位，其包含：2A肽序列片段或与其至少90％相同的序列，其中所述2A肽序列不是完整的2A序列。

55.根据配置54所述的抗体表位，其中所述肽序列包含SEQ ID NO:1的序列(CGDVEENPG)或与其至少75％相同的序列。

56.根据配置54或55所述的抗体表位，其中所述抗体表位能够由单克隆抗-2A肽抗体3H4来识别。

57.一种抗体表位，其用于检测已通过引入治疗性TCR基因而被修饰的基因工程化T细胞，其包含如配置45-56中任一项所述的抗体表位。

58.一种抗体表位，其用于检测由新的TCR基因或CAR基因修饰以治疗癌症的细胞，其包含如配置45-56中任一项所述的抗体表位。

59.一种用于检测基因工程化细胞的试剂盒，其包含如配置45-56中任一项所述的抗体表位。

60.根据配置59所述的试剂盒，其中所述基因工程化细胞包括T细胞。

61.根据配置60所述的试剂盒，其中所述T细胞已经通过引入治疗性TCR基因而被修饰。

62.根据配置61所述的试剂盒，其中所述已经通过引入治疗性TCR基因而被修饰的T细胞用于癌症治疗。

63.一种基因构建体，其包含：能够表达2A肽序列或与其至少90％相同的序列的核苷酸序列，其中所述构建体被配置用于表达来自单个开放阅读框的多种蛋白质，并且其中所述核苷酸序列不会使所述基因构建体的大小增加超过25个氨基酸。

64.根据配置63所述的基因构建体，其中所述2A肽序列包含2A肽序列片段或与其至少90％相同的序列，其中所述2A肽序列不是完整的2A序列。

65.根据配置64所述的基因构建体，其中所述2A肽序列包含SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:6的序列，或与SEQ ID NO:

2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6至少75％相同的序列(SEQ ID N O:2＝EGRGSLLTCGDVEENPGP；SEQ ID NO:3＝ATNFSLLKQAG DVEENPGP；SEQ ID NO:6＝GDVEENPG)。

66.一种基因工程化细胞，其包含如配置1-15中任一项所述的标记蛋白，或如配置53-55中任一项所述的抗体表位，或如配置63-65中任一项所述的基因构建体。

实施例1

本实施例表明，将来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的10个氨基酸残基掺入人TRBC2序列足以允许TCR表达和H57抗体识别。

使用不同修复模板对在内源TRAC基因座处敲入了NY-ESO-1 1G4TCR的人原代T细胞进行FACS分析。选择人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后5天，收集细胞并用APC抗-小鼠TCR Cβ链抗体(克隆H57-597，目录号#109212，百进生物技术公司)和PE-Cy7抗-人TCR Vβ13.1抗体(克隆H131，目录号#362406，百进生物技术公司)通过共染色进行分析。然后进行FACS分析。

结果如图3中所示：huTRBC1：完整人TRBC1序列；muTrbc2：没有polyA信号的完整鼠Trbc2序列；muTrbc2-BGHpA：具有BGH polyA信号的完整鼠Trbc2序列；huTRBC1-muFG：人TRBC1序列，其中掺入了鼠Trbc2 FG环。

数据显示，当使用完整鼠Trbc2序列时，polyA信号对于TCR表达是有用的，并且表达完整鼠Trbc2序列的细胞可被H57抗体识别。然而，将鼠Trbc2 FG环掺入到人TRBC1序列中，虽然能够使TCR表达，但不足以被H57抗体识别。

接下来，测试了将来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的10个氨基酸残基掺入到人TRBC2序列中。类似地，选择人原代CD3⁺T细胞并用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后5天，收集细胞并用APC抗-小鼠TCR Cβ链抗体(克隆H57-597，目录号#109212，百进生物技术公司)和PE-Cy7抗-人TCR Vβ13.1抗体(克隆H131，目录号#362406，百进生物技术公司)通过共染色进行分析。然后进行FACS分析。

结果如图4中所示：huTRBC1：完整人TRBC1序列；muTrbc2-BGHpA：带有BGH polyA信号的完整鼠Trbc2序列；huTRBC2-muABFG：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的10个氨基酸残基。

数据显示，将来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的10个氨基酸残基掺入人TRBC2序列中足以允许TCR表达和H57抗体识别(氨基酸突变为K4R、F7T、Y37F、N106E、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S、A114P)。

实施例2

本实施例表明，将来自鼠Trbc2 A链以及FG环的6个氨基酸残基掺入人TRBC2序列中足以允许TCR表达和被H57抗体识别。

结果如图中5所示：huTRBC2：完整人TRBC2序列；huTRBC2-muABFG：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环(预测的H57结合表位)的10个氨基酸残基；muABFGR4K：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(R4K)以定位最小H57结合表位；muABFG T7F：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(T7F)以定位最小H57结合表位；muABFG F37Y：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(F37Y)以定位最小H57结合表位；muABFG E106N：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(E106N)以定位最小H57结合表位；muABFG K108E：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(K108E)以定位最小H57结合表位；muABFGP110T：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(P110T)以定位最小H57结合表位；muABFG E111Q：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链和FG环的9个氨基酸残基并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(E111Q)以定位最小H57结合表位；muABFG G112D：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(G112D)以定位最小的H57结合表位；muABFG S113R：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(S113R)以绘制最小H57结合表位；muABFG P114A：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环的9个氨基酸残基，并且将1个氨基酸残基恢复为人对应物(P114A)以定位最小H57结合表位。数据显示来自鼠Trbc2 A链和FG环的6个氨基酸残基是H57抗体识别所必需的(氨基酸是R4、K108、P110、E111、G112和S113)。

接下来，选择人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后6天，收集细胞并用APC抗-小鼠TCR Cβ链抗体(克隆H57-597，目录号#109212，百进生物技术公司)和PE-Cy7抗-人TCR Vβ13.1抗体(克隆H131，目录号#362406，百进生物技术公司)通过共染色进行分析。然后进行FACS分析。

结果如图6中所示：huTRBC2：完整人TRBC2序列；huTRBC2-mu10：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A和B链以及FG环(预测的H57结合表位)的10个氨基酸残基；huTRBC2-mu6：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A链和FG环的6个氨基酸残基(鉴定出的最小H57结合表位)；huTRBC2-mu7：人TRBC2序列，其中掺入了来自鼠Trbc2 A链和FG环的7个氨基酸残基(鉴定出的最小H57结合表位+T7)。数据显示，将来自鼠Trbc2 A链和FG环的6个氨基酸残基掺入人TRBC2序列足以实现TCR表达和被H57抗体识别(氨基酸突变为K4R、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S)。

实施例3

本实施例表明，用抗2A肽抗体可以检测已经被工程化以表达包含T2A肽序列的NY-ESO-1 1G4 TCR的人原代T细胞。

使用不同修复模板对在内源TRAC基因座处敲入了NY-ESO-1 1G4TCR的人原代T细胞进行FACS分析。选择人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后10天，收集细胞，使其透化并用非缀合的小鼠抗-2A肽抗体(克隆3H4，目录号NBP2-59627，Novus Biologicals公司)和BV421大鼠抗-小鼠IgG1抗体(克隆A85-1，目录号#562580，BD生物科学公司)通过染色进行FACS分析。所有染色均在BD透化/洗涤缓冲液(1x)中进行。然后进行FACS分析。

结果如图7中所示：空白对照(Mock)电穿孔：细胞未被电穿孔；TRAC RNP：仅用TRACRNP对细胞进行电穿孔；TRAC RNP+环状修复模板：用TRAC RNP和环状修复模板对细胞进行电穿孔；TRAC RNP+线性修复模板：用TRAC RNP和线性修复模板对细胞进行电穿孔。数据显示，用抗2A肽抗体可以检测到已经被工程化以表达包含T2A肽序列的NY-ESO-1 1G4 TCR的人原代T细胞。

实施例4

本实施例表明，用抗-2A肽抗体可以检测到已被工程化以表达包含T2A肽序列的NY-ESO-1 1G4 TCR的人原代T细胞，并且该2A肽染色与TCR Vβ13.1染色相关。

使用不同修复模板对在内源TRAC基因座处敲入了NY-ESO-1 1G4TCR的人原代T细胞进行FACS分析。选择人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后用TRAC RNP和修复模板电穿孔以引导TCR敲入。电穿孔后11天，收集细胞，使其透化并用非缀合的小鼠抗-2A肽抗体(克隆3H4，目录号#NBP2-59627，Novus Biologicals公司)、BV421大鼠抗-小鼠IgG1抗体(克隆A85-1，目录号#562580，BD生物科学公司)和PE-Cy7抗-人TCR Vβ13.1抗体(克隆H131，目录号#362406，百进生物技术公司)通过染色进行FACS分析。所有染色均在BD透化/洗涤缓冲液(1x)中进行。然后进行FACS分析。

结果如图8中所示：空白对照(Mock)电穿孔：细胞未被电穿孔；TRAC RNP：仅用TRACRNP对细胞进行电穿孔；TRAC RNP+环状修复模板：用TRAC RNP和环状修复模板对细胞进行电穿孔；TRAC RNP+线性修复模板：用TRAC RNP和线性修复模板对细胞进行电穿孔。数据显示，用抗-2A肽抗体可以检测到已经被工程化以表达包含T2A肽序列的NY-ESO-1 1G4 TCR的人原代T细胞，并且这种2A肽染色与TCR Vβ13.1染色相关。

实施例5

本实施例表明，用抗-2A肽抗体可以检测到已经被工程化以表达含有2A肽序列的CD19 CAR构建体的人原代T细胞，并且该2A肽染色与存在于相同构建体(Ly6G)中的转导标志物蛋白的染色相关。

用已被逆转录病毒转导以表达CD19 CAR构建体的人原代T细胞进行FACS分析。选择人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠活化2天，然后如上所述用逆转录病毒感染。转导后14天，收集细胞，使其透化并用非缀合的小鼠抗-2A肽抗体(克隆3H4，目录号#NBP2-59627，Novus Biologicals公司)、BV421大鼠抗-小鼠IgG1抗体(克隆A85-1，目录号#562580，BD生物科学公司)和PE/Dazzle 594抗-Ly6G抗体(克隆1A8，目录号#127647，百进生物技术公司)通过染色进行FACS分析。所有染色均在BD透化/洗涤缓冲液(1x)中进行。然后进行FACS分析。

结果如图9中所示：空白对照(Mock)转导：细胞未被转导；Ly6G-Puro：用含有Ly6G-P2A-Puro构建体的逆转录病毒转导的细胞；第一代CAR-Ly6G-Puro：用含有第一代CD19CAR-T2A-Ly6G-P2A-Puro构建体的逆转录病毒转导的细胞；第二代CAR-Ly6G-Puro：用含有第二代CD19CAR-T2A-Ly6G-P2A-Puro构建体的逆转录病毒转导的细胞。数据显示，用抗2A肽抗体可以检测到已经被工程化以表达含有2A肽序列的CD19CAR构建体的人原代T细胞，并且这种2A肽染色与存在于同一构建体(Ly6G)中的转导标志物蛋白的染色相关。

实施例6

本实施例示出了标记蛋白，其可用于将一种或多种有效载荷靶向递送至表达这种标记蛋白的基因工程化细胞。一种或多种有效载荷的递送通过与H57抗体缀合来实现。

IL2v的N-末端(任选地，通过(G4S)3接头肽)与H57 IgG Fc结构域的C-末端融合。Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代以减少与Fc受体的结合。取代(Substitutions)为L234A、L235A和P329G(LALAPG，基于人IgG1Fc结构域)。

对经工程改造以表达人TRBC2-Mur6 1G4 TCR的TCR敲除的CD8hi Jurkat细胞进行FACS分析。还对在内源TRAC基因座处敲入了huTRBC2-Mur6 1G4 TCR的人原代T细胞进行了FACS分析。将表达huTRBC2-mur6的细胞与不同浓度的H57抗体或H57-IL2或H57-IL2v免疫细胞因子预孵育30分钟。然后，通过用APC抗-小鼠TCR-Cβ抗体(克隆H57-597，目录号#553174，BD生物科学公司)和FITC抗人IL2抗体(克隆5344.111，目录号#340448，BD生物科学公司)进行染色，对细胞进行FACS分析。染色在含有2％ FBS的PBS中进行。

图18示出了20ng/mL的H57以及H57-IL2和H57-IL2v阻断了APC抗-小鼠TCR-Cβ抗体在huTRBC2-Mur6 1G4 Jurkat细胞上与huTRBC2-Mur6的结合。图19证明了H57以及H57-IL2和H57-IL2v阻断了APC抗-小鼠TCR-Cβ抗体在人原代huTRBC2-Mur6 1G4 TCR T细胞上与huTRBC2-Mur6的结合。如图20所示，与H57-IL2或H57-IL2v一起孵育的huTRBC2-Mur6 1G4 T细胞显示出与FITC抗-人IL2抗体的强染色，证明在这些细胞的表面上存在IL2。H57-IL2和H57-IL2v与不表达Mur6表位的人原代huTRBC2 1G4 T细胞的孵育确实导致了IL2染色，表明免疫细胞因子对IL2有Mur6特异性的靶向作用。总之，这些数据表明Mur6表位可用于通过H57-IL2和H57-IL2抗体-细胞因子融合蛋白介导向表达huTRBC2-Mur6恒定区的1G4 TCR工程化细胞靶向递送细胞因子。

实施例7

本实施例在体外评估了H57-IL2v缀合物对T细胞增殖的刺激能力。

来自实施例6的H57-IL2v缀合物将被加入到已用PHA预活化过夜的CFSE标记的原代人T细胞中，之后将细胞再培养4天。将不相关的抗体-IL2v缀合物用作对照。4天后，H57-IL2v缀合物对T细胞增殖的刺激能力将通过使用流式细胞术测量CFSE稀释度以及T细胞的CD25上调来评估。

在使用CFSE替代物的实验中，将来自实施例6的H57-IL2和H57-IL2v缀合物加入到在内源TRAC基因座处敲入了huTRBC2 1G4TCR或huTRBC2-Mur6 1G4 TCR的细胞示踪紫(CTV)标记的原代人T细胞中，之后将细胞培养4天。将非靶向的重组IL-2用作对照。1天后，通过测量T细胞活化标志物CD69和CD25的表达来评估H57-IL2和H57-IL2v缀合物的刺激能力。通过用PE抗-人CD69抗体(克隆FN50，目录号#557050，BD生物科学公司)和BV711抗-人CD25抗体(克隆2A3，目录号#563159，BD生物科学公司)共染色进行FACS分析。在培养4天后，通过使用流式细胞术测量T细胞的CTV稀释度和细胞计数来评估H57-IL2和H57-IL2v缀合物对T细胞增殖的刺激能力。所有染色均在含2％FBS的PBS中进行。

图21描绘了点图，示出敲入了huTRBC2 1G4 TCR或huTRBC2-Mur61G4 TCR的原代人T细胞与1nM的IL2、H57-IL2和H57-IL2v孵育1天后T细胞活化标志物CD69和CD25的表达。图22A和22B中的图表示出了在一定(免疫)细胞因子浓度范围内表达CD69的T细胞(图22A)和CD69高的T细胞(图22B)的百分比。这些结果表明，H57-IL2和H57-IL2v缀合物强烈并特异性地刺激表达huTRBC2-Mur6 1G4 TCR的T细胞。

在图23中，直方图示出在敲入了huTRBC2 1G4 TCR或huTRBC2-Mur6 1G4 TCR的原代人T细胞与1nM的IL2、H57-IL2和H57-IL2v孵育4天后T细胞的CTV稀释度。此外，图24示出了来自CTV FACS测量的平均增殖周期，计算方法是在一定(免疫)细胞因子浓度范围内的2log的MFI_{未分裂细胞}/MFI_所有细胞。这些结果表明，用H57-IL2和H57-IL2v靶向mur6特异性地促进表达huTRBC2-Mur6 1G4 TCR的T细胞的T细胞增殖。总之，这些数据表明1G4 TCR工程T细胞上的Mur6表位允许使用H57-IL2和H57-IL2v免疫细胞因子进行特异性细胞因子靶向，从而诱导表位特异性T细胞刺激。

实施例8

本实施例示出了H57-IL2v缀合物如何影响体内肿瘤中的肿瘤生长和T细胞积累。

此处使用NSG小鼠。NSG小鼠(NOD scidγ小鼠)是一种免疫缺陷型实验小鼠品牌，由杰克逊实验室(Jackson Laboratory)开发和销售，其携带NOD品系(strain NOD)。将NSG小鼠皮下植入NY-ESO-1+A375黑素瘤细胞，之后它们将接受表达NY-ESO-1TCR的原代人T细胞。此后，小鼠将接受每周一次的H57-IL2v缀合物或溶媒(vehicle)对照的注射。然后，将随时间推移测量对肿瘤生长和肿瘤中T细胞积累的影响。

实施例9

本实施例示出了来自鼠Trbc2的6个氨基酸残基的掺入。将A链和FG环掺入人TRBC1或TRBC2序列足以允许TCR表达和H57抗体识别。

使用不同DNA修复模板对在内源TRAC基因座处敲入了NY-ESO-1-特异性1G4 TCR的人原代T细胞进行FACS分析。选择来自3个健康供体(BC45、BC46和BC48)的人原代CD3⁺T细胞，并用抗-CD3/CD28珠(目录号#40203D，赛默飞世尔科技公司)活化2天，然后用TRAC RNP和DNA修复模板电穿孔以引导TCR敲入，以及用TRBC RNP电穿孔以引导内源TCRβ链敲除。电穿孔后5天，收集1G4 TCR工程化的T细胞，并通过与PE抗-小鼠TCR Cβ链抗体(克隆H57-597，目录号553172，BD生物科学公司)和亮紫421抗-人TCR Cβ链抗体(Brilliant Violet421anti-人TCR Cβchain antibody)(克隆IP26，目录号#306722，百进生物技术公司)共染色进行FACS分析。

结果如图25中所示：muTrbc2描绘了带有完整鼠Trbc2恒定区序列的1G4 TCR；huTRBC1-Mur6描绘了带有人TRBC1恒定区序列的1G4TCR，其中掺入了来自鼠Trbc2 A链和FG环的6个氨基酸残基(鉴定出的最小H57结合表位)；huTRBC2-Mur6描绘了带有人TRBC2恒定区序列的1G4 TCR，其中掺入了来自鼠Trbc2 A链和FG环的6个氨基酸残基(鉴定出的最小H57结合表位)。数据显示，将来自鼠Trbc2 A链和FG环的6个氨基酸残基掺入人TRBC1或TRBC2序列足以实现TCR表达和H57抗体识别(氨基酸突变分别为：对于huTRBC1-Mur6，为N4R、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S，对于huTRBC2-Mur6，为K4R、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S)。

实施例10

本实施例表明，如通过T细胞细胞因子产生所测得的，将来自鼠Trbc2 A链和FG环的6个氨基酸残基掺入到人TRBC2序列中不干扰TCR功能。

使用不同DNA修复模板对在内源TRAC基因座处敲入了NY-ESO-1-特异性1G4 TCR的人原代T细胞进行FACS分析。选择来自3个健康供体(BC20、BC93和BC97)的人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠(目录号#40203D，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))活化2天，然后用TRAC RNP和DNA修复模板电穿孔以引导TCR敲入，以及用TRBC RNP电穿孔以引导内源TCRβ链敲除。电穿孔后12天，收集1G4TCR工程化的T细胞，并与JY靶细胞共培养，该靶细胞已经装载了范围从101-107pg/mL的不同浓度的NY-ESO-1肽(SLLMWITQC)。共培养4小时后，加入GolgiPlug蛋白转运抑制剂(目录号#555028，BD生物科学公司(BDBiosciences))，将细胞再共培养16小时。然后，收集细胞，使其透化并通过与PE抗-人IFN-γ抗体(克隆号25723.11，目录号#340452，BD生物科学公司)和FITC抗-人IL-2抗体(克隆号#5344.111，目录号#340448，BD生物科学公司)共染色进行FACS分析。所有染色均在BD透化/洗涤缓冲液(1x；目录号#555028，BD生物科学公司)中进行。

结果如图26A-26D中所示：huTRBC2-Mur6描绘了带有人TRBC2恒定区序列的1G4TCR，其中掺入了来自鼠Trbc2 A链和FG环的6个氨基酸残基(鉴定出的最小H57结合表位)；huTRBC2描绘了带有完整人TRBC2恒定区序列的1G4 TCR；muTrbc2描绘了带有完整鼠Trbc2恒定区序列的1G4 TCR；未电穿孔的(Unelectroporated)描绘了未编辑的T细胞。图26A示出了来自1个具有代表性的健康供体(BC93)的T细胞响应于不同肽剂量的IFN-γ产量。符号描绘了来自每个肽剂量的3个技术重复的IFN-γ⁺T细胞的几何平均值％；误差线表示几何标准偏差。图26B示出了来自3名健康供体的T细胞响应于测试的最高肽剂量(107pg/mL)的IFN-γ产量的总结。符号表示来自每个T细胞供体的3个技术重复的IFN-γ⁺T细胞的百分比；线条描绘几何平均值。图26C示出了来自1位具有代表性的健康供体(BC97)的T细胞响应于不同肽剂量的IL-2产量。符号描绘了来自每个肽剂量的3个技术重复的IL-2⁺T细胞的几何平均值％；误差线表示几何标准偏差。图26D示出了来自3名健康供体的T细胞响应于测试的最高肽剂量(107pg/mL)的IL-2产量的总结。符号描绘了来自每个T细胞供体的3个技术重复的IL-2⁺T细胞的百分比；线条描绘几何平均值。总之，这些数据表明表达huTRBC2-Mur6恒定区的1G4TCR工程化T细胞可以介导与表达huTRBC2或muTrbc2恒定区的1G4TCR工程化T细胞相当的细胞因子产生，表明将Mur6表位掺入到人TRBC2中不会损害TCR功能。

实施例11

本实施例表明，如通过T细胞靶细胞杀伤所测量的，将来自鼠Trbc2A链和FG环的6个氨基酸残基掺入人TRBC2序列中不干扰TCR功能。

使用不同DNA修复模板，对在内源TRAC基因座处敲入了NY-ESO-1-特异性1G4 TCR的人原代T细胞进行了IncuCyte活细胞分析。选择来自3个健康供体(BC20、BC93和BC97)的人原代CD3⁺T细胞，用抗-CD3/CD28珠(目录号#40203D，赛默飞世尔科技公司)活化2天，然后用TRAC RNP和DNA修复模板电穿孔以引导TCR敲入，以及用TRBC RNP电穿孔以引导内源TCRβ链敲除。电穿孔后12天，收集1G4 TCR工程化的T细胞，并在IncuCyte S3活细胞分析系统(Sartorius)内与NY-ESO-1+A375-GFP+肿瘤细胞共培养，每2小时定量分析GFP+活肿瘤细胞的数量，共72小时。

结果示于图27A和27B中：huTRBC2-Mur6描绘了带有人TRBC2恒定区序列的1G4TCR，其中掺入了来自鼠Trbc2 A链和FG环的6个氨基酸残基(鉴定出的最小H57结合表位)；huTRBC2描绘了带有完整人TRBC2恒定区序列的1G4 TCR；muTrbc2描绘了带有完整鼠Trbc2恒定区序列的1G4 TCR；未电穿孔的描绘了未编辑的T细胞。图27A示出了来自1名具有代表性的健康供体(BC97)的T细胞的A375-GFP+肿瘤细胞杀伤动力学。符号表示来自每个时间点3次技术重复的几何平均活肿瘤细胞数；误差线表示几何标准偏差。图27B示出了来自3名健康供体的T细胞在测试的最后时间点(72小时)对A375-GFP+肿瘤细胞的相对杀伤的总结。符号描绘了来自每个T细胞供体的3次技术重复的活肿瘤细胞数；线条描绘几何平均值。为了计算相对肿瘤细胞数，将数据归一化(normalized)为未电穿孔T细胞的几何平均值，并将其设定为100％。总之，这些数据表明，表达huTRBC2-Mur6恒定区的1G4 TCR工程化T细胞可介导与表达huTRBC2或muTrbc2恒定区的1G4 TCR工程化T细胞等效的靶细胞杀伤作用，表明将Mur6表位掺入到人TRBC2中不会损害TCR功能。

序列表

<110> 荷兰商新基因治疗公司(Neogene Therapeutics B.V.)

<120> 追踪基因工程化细胞的肽标志物

<130> KHP232111057.2

<150> US 63/170196

<151> 2021-04-02

<150> US 63/129480

<151> 2020-12-22

<160> 40

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 1

Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

1 5

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 2

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 3

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 4

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<220>

<221> 变体（VARIANT）

<222> (1)...(1)

<223> Xaa为任何天然氨基酸

<400> 4

Xaa Asp Leu Arg Asn Val Phe Pro Pro Lys Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Lys Trp Pro Glu Gly

100 105 110

Ser Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175

Ser Arg Gly

<210> 5

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<220>

<221> 变体（VARIANT）

<222> (1)...(1)

<223> Xaa为任何天然氨基酸

<400> 5

Xaa Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Lys Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175

Ser Arg Gly Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly

180 185 190

Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

195 200

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 6

Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 7

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

1 5

<210> 8

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<220>

<221> 变体（VARIANT）

<222> (1)...(1)

<223> Xaa为任何天然氨基酸

<400> 8

Xaa Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Lys Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175

Ser Arg Gly

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 9

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 10

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 10

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 11

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<220>

<221> 变体（VARIANT）

<222> (1)...(1)

<223> Xaa为任何天然氨基酸

<400> 11

Xaa Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

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Phe

<210> 12

<211> 171

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<220>

<221> 变体（VARIANT）

<222> (1)...(1)

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<220>

<221> 变体（VARIANT）

<222> (1)...(1)

<223> Xaa为任何天然氨基酸

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<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

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<210> 23

<211> 179

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<210> 24

<211> 179

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

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<210> 25

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 25

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<210> 26

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 26

Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ala Val Phe Glu Pro

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Ser Arg Gly

<210> 27

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 27

Glu Asp Leu Arg Asn Val Phe Pro Pro Lys Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

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165 170 175

Ser Arg Gly

<210> 28

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 28

Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser

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100 105 110

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130 135 140

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275

<210> 29

<211> 311

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 29

Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala

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165 170 175

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180 185 190

Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu

195 200 205

Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn

210 215 220

His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu

225 230 235 240

Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu

245 250 255

Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln

260 265 270

Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala

275 280 285

Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val

290 295 300

Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 30

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 30

Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser

1 5 10 15

Trp Val Trp Ser Gln Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu

20 25 30

Ser Val Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp

35 40 45

Ser Ala Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Thr Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser

65 70 75 80

Gly Arg Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu

85 90 95

Tyr Ile Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala

100 105 110

Val Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly

115 120 125

Thr Ser Leu Ile Val His Pro

130 135

<210> 31

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 31

Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala

1 5 10 15

Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu

20 25 30

Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His

35 40 45

Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu

50 55 60

Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro

65 70 75 80

Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg

85 90 95

Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg

115 120 125

Leu Thr Val Leu

130

<210> 32

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 32

Glu Val Tyr Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Asn Ile Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Glu Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Ser

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Ala Gly Arg Phe Asp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 33

Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Ser Ser Ala Ser Val Thr Val Gly Glu Thr

1 5 10 15

Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Asp Gln Leu Pro Lys Asn Phe Ala Tyr

20 25 30

Trp Phe Gln Gln Lys Ser Asp Lys Asn Ile Leu Leu Leu Ile Tyr Met

35 40 45

Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Thr

50 55 60

Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp

65 70 75 80

Glu Ala Ala Tyr Tyr Cys Leu Ser Ser Tyr Gly Asp Asn Asn Asp Leu

85 90 95

Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 34

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 34

Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 35

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 35

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 36

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 36

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 37

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 38

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 39

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成多肽（Synthetic Polypeptide）

<400> 40

Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr

1 5 10

Claims

1.一种标记蛋白，其包含：

TCR恒定区；和

外源氨基酸变异，所述外源氨基酸变异包含在所述TCR恒定区内可检测且可识别的序列。

2.根据权利要求1所述的标记蛋白，其中所述TCR恒定区包含TCRα或TCRβ恒定区。

3.根据权利要求1所述的标记蛋白，其中所述外源氨基酸变异包含所述TCR恒定区的序列的突变，任选地，其中所述标记蛋白包含huTRBC1-mur6或huTRBC2-mur6。

4.根据权利要求1所述的标记蛋白，其中所述TCR恒定区来自一个物种，并且所述外源氨基酸变异来自另一物种。

5.根据权利要求4所述的标记蛋白，其中所述TCR恒定区来自人类，并且所述外源氨基酸变异来自非人类物种。

6.根据权利要求5所述的标记蛋白，其中所述非人类物种为小鼠。

7.根据权利要求3所述的标记蛋白，其中所述TCR恒定区包含由人TRBC2基因编码的序列。

8.根据权利要求3所述的标记蛋白，其中所述外源氨基酸变异包含鼠TCR Cβ结构域的序列。

9.根据权利要求3所述的标记蛋白，其中所述突变包含10个氨基酸突变。

10.根据权利要求9所述的标记蛋白，其中所述突变形成不连续序列。

11.根据权利要求9所述的标记蛋白，其中10个氨基酸突变根据SEQ ID NO:8的编号系统编号为K4R、F7T、Y37F、N106E、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S、A114P。

12.根据权利要求3所述的标记蛋白，其中所述突变包含6个氨基酸突变。

13.根据权利要求12所述的标记蛋白，其中6个氨基酸突变为K4R、E108K、T110P、Q111E、D112G、R113S，任选地，其中所述标记蛋白包含SEQ ID NO:27。

14.根据权利要求1所述的标记蛋白，其中所述外源氨基酸变异是可通过抗体、纳米抗体、Fab片段或DARPin检测和识别的。

15.根据权利要求1所述的标记蛋白，其中所述外源氨基酸变异是可通过抗小鼠TCR Cβ抗体H57-597检测和识别的。

16.一种标记蛋白，其用于检测、分离或去除表达这种标记蛋白的基因工程化细胞，其包含如权利要求1-15中任一项所述的标记蛋白。

17.根据权利要求16所述的标记蛋白，其中所述基因工程化细胞包括基因工程化T细胞。

18.根据权利要求17所述的标记蛋白，其中所述基因工程化T细胞包含已通过引入治疗性TCR基因而修饰的T细胞。

19.根据权利要求18所述的标记蛋白，其中所述已通过引入治疗性TCR基因而修饰的T细胞用于癌症治疗。

21.一种标记蛋白，其用于检测、分离或去除由新的TCR基因修饰以治疗癌症的细胞，所述标记蛋白包含根据权利要求1-20中任一项所述的标记蛋白。

22.一种用于检测、分离或去除具有权利要求1-21中任一项所述的标记蛋白的基因工程化细胞的试剂盒，所述试剂盒包含识别所述标记蛋白的抗体。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述基因工程化细胞包括T细胞。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述T细胞已经通过引入治疗性TCR基因而被修饰。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述已经通过引入治疗性TCR基因而修饰的T细胞用于癌症治疗。

26.一种标记蛋白，其用于将一种或多种有效载荷靶向递送至表达这种标记蛋白的基因工程化细胞，其包含权利要求1-15中任一项所述的标记蛋白。

27.根据权利要求26所述的标记蛋白，其中所述一种或多种有效载荷的递送通过缀合至抗体、抗体模拟蛋白或任何其他抗原结合支架来实现。

28.根据权利要求27所述的标记蛋白，其中所述抗体是抗小鼠TCR Cβ抗体H57-597。

29.根据权利要求26所述的标记蛋白，其中所述一种或多种有效载荷是蛋白质、小分子、核酸、脂质体或纳米粒子。

30.根据权利要求26所述的标记蛋白，其中所述递送的有效载荷是细胞因子。

31.根据权利要求30所述的标记蛋白，其中所述细胞因子选自IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-α、IFN-β、IFN-γ和TNF-α。

32.根据权利要求30所述的标记蛋白，其中所述细胞因子的序列被修饰，以便调节与其天然受体分子的相互作用。

33.根据权利要求30所述的标记蛋白，其中所述细胞因子是由T细胞表达的受体分子的激动剂或拮抗剂。

34.根据权利要求26所述的标记蛋白，其中所述有效载荷是由T细胞表达的受体分子的激动剂或拮抗剂。

35.根据权利要求34所述的标记蛋白，其中所述激动剂结合CD27、CD28、CD137或CD278。

36.根据权利要求34所述的标记蛋白，其中所述拮抗剂结合TGF-β受体、PD-1、CTLA-4、Vista、类固醇受体或A₁-、A_2A-、A_2B-或A₃-腺苷受体。

37.根据权利要求26所述的标记蛋白，其中所述有效载荷是调节T细胞活化、分化、增殖、存活或效应子功能的小分子。

38.根据权利要求37所述的标记蛋白，其中所述小分子抑制TGF-β受体、PD-1、CTLA-4、Vista、类固醇受体信号传导或A₁-、A_2A-、A_2B-或A₃-腺苷受体信号传导。

39.根据权利要求26所述的标记蛋白，其中所述有效载荷是调节T细胞活化、分化、增殖、存活或效应子功能的核酸。

40.根据权利要求39所述的标记蛋白，其中所述核酸是miRNA、shRNA或siRNA。

41.根据权利要求26所述的标记蛋白，其中所述有效载荷是双特异性抗体或三特异性抗体。

将所述基因工程化细胞与所述缀合物接触。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述结合剂为抗体、抗体模拟蛋白或任何其他抗原结合支架。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述一种或多种有效载荷为蛋白质、小分子、核酸、脂质体或纳米粒子。

46.根据权利要求45所述的抗体表位，其中所述抗体表位被连接到TCR链的C-末端或N-末端，或者CAR的C-末端或N-末端。

47.根据权利要求45所述的抗体表位，其中所述抗体表位被插入到TCR链或CAR中。

48.根据权利要求45所述的抗体表位，其中基因工程化细胞包含T细胞。

49.根据权利要求48所述的抗体表位，其中T细胞已通过引入治疗性TCR基因或CAR基因而被修饰。

50.根据权利要求49所述的抗体表位，其中已通过引入治疗性TCR基因或CAR基因而被修饰的T细胞用于癌症治疗。

51.根据权利要求45所述的抗体表位，其中所述抗体表位用于连接TCRα链和TCRβ链，或用于将CAR与由另一基因编码的蛋白质连接。

52.根据权利要求45所述的抗体表位，其包含2A肽序列、HA.11表位标签、FLAG表位标签、Myc表位标签、V5表位标签或包含至多与所述2A肽相同数目的氨基酸的肽。

53.根据权利要求52所述的抗体表位，其中所述2A肽可以是P2A、T2A、E2A或F2A。

54.根据权利要求45所述的抗体表位，其包含：2A肽序列片段或与其至少90％相同的序列，其中所述2A肽序列不是完整的2A序列。

55.根据权利要求54所述的抗体表位，其中所述肽序列包含SEQ ID NO:1的序列(CGDVEENPG)或与其至少75％相同的序列。

56.根据权利要求54或55所述的抗体表位，其中所述抗体表位能够由单克隆抗-2A肽抗体3H4来识别。

57.一种抗体表位，其用于检测已通过引入治疗性TCR基因而被修饰的基因工程化T细胞，其包含权利要求45-56中任一项所述的抗体表位。

58.一种抗体表位，其用于检测由新的TCR基因或CAR基因修饰以治疗癌症的细胞，其包含权利要求45-56中任一项所述的抗体表位。

59.一种用于检测基因工程化细胞的试剂盒，其包含权利要求45-56中任一项所述的抗体表位。

60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中所述基因工程化细胞包括T细胞。

61.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述T细胞已经通过引入治疗性TCR基因而被修饰。

62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述已经通过引入治疗性TCR基因而被修饰的T细胞用于癌症治疗。

64.根据权利要求63所述的基因构建体，其中所述2A肽序列包含2A肽序列片段或与其至少90％相同的序列，其中所述2A肽序列不是完整的2A序列。

65.根据权利要求64所述的基因构建体，其中所述2A肽序列包含SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:6的序列，或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6至少75％相同的序列(SEQ ID NO:2＝EGRGSLLTCGDVEENPGP；SEQ ID NO:3＝ATNFSLLK QAGDVEENPGP；SEQ IDNO:6＝GDVEENPG)。

66.一种基因工程化细胞，其包含权利要求1-15中任一项所述的标记蛋白，或权利要求53-55中任一项所述的抗体表位，或权利要求63-65中任一项所述的基因构建体。