ES2865699T3 - Formulaciones de lípidos para la administración de ARN mensajero - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un ARNm que codifica un regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), encapsulado dentro de un liposoma para su uso en un método de tratamiento de la fibrosis quística, en donde el uso comprende administrar a un sujeto con necesidad de tratamiento la composición de tal manera que la administración de la composición da como resultado la expresión del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) codificado por el ARNm en uno o más tejidos afectados por la fibrosis quística; en donde el liposoma comprende DOPE, colesterol, DMG-PEG2K y un lípido catiónico que es cKK-E12: **(Ver fórmula)** la proporción de cKK-E12: DOPE: colesterol: DMG-PEG2K es 40:32:25:3 en relación molar, la composición se administra por vía pulmonar mediante aerosolización, inhalación o nebulización, la composición se formula como partículas respirables, lípido nebulizable o polvo seco inhalable, y el ARNm comprende uno o más nucleótidos modificados, en donde el uno o más nucleótidos modificados comprenden pseudouridina, N-1-metil-pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3- metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5- fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina 7- deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, y/o 2-tiocitidina.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones de lípidos para la administración de ARN mensajero

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente especificación hace referencia a un Listado de Secuencias (presentado electrónicamente como un archivo .txt llamado "2006685-0687_SL.txt" el 22 de octubre de 2014). El archivo .txt se generó el 22 de octubre de 2014 y tiene un tamaño de 35,552 bytes. Todo el contenido del Listado de Secuencias se incorpora en la presente como referencia.

ANTECEDENTES

La administración de ácidos nucleicos se ha explorado ampliamente como una opción terapéutica potencial para ciertos estados patológicos. En particular, la interferencia de ARN (ARNi) ha sido objeto de investigaciones y desarrollos clínicos significativos. Aunque el ARNi, como el ARN de interferencia corto (ARNip), puede tener potencial terapéutico, es de poca utilidad en el tratamiento de enfermedades que implican la deficiencia de una o más proteínas. La terapia con ARN mensajero (ARNm) se ha convertido en una opción cada vez más importante para el tratamiento de varias enfermedades, en particular, aquellas asociadas con la deficiencia de una o más proteínas.

La WO2013063468 A1 describe compuestos y composiciones caracterizados por la conjugación de varios grupos, como grupos lipofílicos, a un grupo amino o amida de un aminoácido, un péptido lineal o cíclico, un polipéptido lineal o cíclico, o un isómero estructural del mismo. Los compuestos se consideran útiles para una variedad de aplicaciones como, por ejemplo, una administración de nucleótidos mejorada.

La US5976569 A describe composiciones útiles en la administración de agentes activos. Estas composiciones de administración incluyen (a) un agente activo; y (b)(1) un portador de (i) por lo menos un aminoácido y (ii) por lo menos una dicetopiperazina o (b)(2) por lo menos una dicetopiperazina mono-N-sustituida, di-N-sustituida o no sustituida.

La WO2014153052 A2 describe materiales, formulaciones, métodos de producción y métodos para la administración de ARNm de CFTR para la inducción de la expresión de CFTR, incluyendo en el pulmón de mamífero.

La WO2007024708 A2 describe moléculas de ARN, oligoribonucleótidos y polirribonucleótidos que comprenden pseudouridina o un nucleósido modificado, vectores de terapia génica que comprenden los mismos, métodos para sintetizar los mismos y métodos para la sustitución génica, terapia génica, silenciamiento de la transcripción génica y administración de proteínas terapéuticas al tejido in vivo, que comprenden las moléculas.

La WO9914346 A2 describe métodos para la estabilización de ARNm.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación proporciona métodos y composiciones mejorados para la administración y expresión altamente eficientes de ARNm y proteína codificada in vivo. La divulgación se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que los liposomas basados en una clase particular de lípidos catiónicos son inesperadamente eficaces para administrar ARNm y producir proteína codificada in vivo, más eficaces incluso en comparación con los lípidos catiónicos que se consideraron entre los mejores en la administración de ARNm en el estado de la técnica. Antes de la presente invención, los lípidos catiónicos se han explorado ampliamente como un componente importante de los liposomas que se usan típicamente para encapsular ácidos nucleicos que incluyen ARNm para la administración in vivo. Debido a la estructura singularmente frágil y larga del ARNm y el complicado proceso de traducción in vivo, los lípidos catiónicos usados en los liposomas suelen desempeñar dos funciones. En primer lugar, los lípidos catiónicos promueven la interacción con el ARNm cargado negativamente durante la encapsulación, la circulación y la endocitosis, capturando y protegiendo de este modo el ARNm. Luego, una vez dentro del citosol, los lípidos catiónicos deben poder liberar el ARNm para que el ARNm pueda traducirse para producir una proteína codificada. Algunos lípidos catiónicos, en particular los conocidos como lípidos catiónicos titulables, son particularmente eficaces en la administración de ARNm. Un ejemplo de tales lípidos catiónicos que se sabe que son capaces de administrar eficazmente ARNm es C12-200. Sorprendentemente, los presentes inventores descubrieron que los lípidos catiónicos descritos en la presente pueden ser incluso más eficaces para administrar varios ARNm in vivo, que los mejor conocidos en el estado de la técnica, incluyendo el C12-200. Por ejemplo, como se muestra en los ejemplos a continuación, las partículas de liposomas que incorporan un lípido catiónico descrito en la presente (por ejemplo, cKK-E12) dieron como resultado una expresión de proteína casi un 50% más alta de la proteína del factor IX humano detectada en el plasma de los ratones administrados, en comparación con partículas de liposomas basados en C12-200. Además, el tiempo de residencia en plasma de diferentes proteínas expresadas de ARNm administrado por liposomas basados en cKK-E12 se mantiene hasta 7 días o más después de una única administración. Por tanto, los presentes inventores han demostrado que cKK-E12 puede ser de una utilidad única en la administración de ARNm para una producción sostenida y altamente eficaz de proteína (por ejemplo, proteína terapéutica) in vivo. Por lo tanto, la presente divulgación permite una terapia de ARNm mejorada que puede reducir significativamente la cantidad requerida de ARNm y lípidos asociados, la frecuencia de administración y los posibles efectos secundarios, proporcionando una terapia de ARNm más potente, segura e inocua para el paciente para varias enfermedades.

En particular, la presente invención proporciona una composición que comprende un ARNm que codifica un regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), encapsulado dentro de un liposoma para su uso en un método de tratamiento de la fibrosis quística, en donde el uso comprende administrar a un sujeto con necesidad de tratamiento la composición de tal manera que la administración de la composición da como resultado la expresión del regulador de la conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) codificado por el ARNm en uno o más tejidos afectados por la fibrosis quística;

en donde el liposoma comprende DOPE, colesterol, DMG-PEG2K y un lípido catiónico que es cKK-E12:

la proporción de cKK-E12: DOPE: colesterol: DMG-PEG2K es 40:32:25:3 en relación molar,

la composición se administra por vía administración pulmonar mediante aerosolización, inhalación o nebulización, la composición se formula como partículas respirables, lípido nebulizable o polvo seco inhalable, y

el ARNm comprende uno o más nucleótidos modificados, en donde el uno o más nucleótidos modificados comprenden pseudouridina, N-1-metil-pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y/o 2-tiocitidina.

En algunas realizaciones, el cKK-E12 constituye aproximadamente el 30-50% (por ejemplo, aproximadamente el 30-45%, aproximadamente el 30-40%, aproximadamente el 35-50%, aproximadamente el 35-45% o aproximadamente el 35-40%) del liposoma por relación molar. En algunas realizaciones, el cKK-E12 constituye aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45% o aproximadamente el 50% de la relación molar de liposomas.

En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño de o menos de aproximadamente 500 nm, 450 nm, 400 nm, 350 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 125 nm, 110 nm, 100 nm, 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm o 50 nm.

En algunas realizaciones, la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66 y/o 72 horas después de la administración. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días y/o 7 días después de la administración. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y/o 4 semanas después de la administración. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable después de un mes de la administración.

En algunas realizaciones, el ARNm tiene una longitud de o más de aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb o 5 kb.

En algunas realizaciones, el ARNm se administra a una dosis que varía de aproximadamente 0,1 - 5,0 mg/kg de peso corporal, por ejemplo aproximadamente 0,1 - 4,5, 0,1 - 4,0, 0,1 - 3,5, 0,1 - 3,0, 0,1 - 2,5, 0,1 - 2,0, 0,1 - 1,5, 0,1 - 1,0, 0,1 - 0,5, 0,1 - 0,3, 0,3 - 5,0, 0,3 - 4,5, 0,3 - 4,0, 0,3 - 3,5, 0,3 - 3,0, 0,3 - 2,5, 0,3 - 2,0, 0,3 - 1,5, 0,3 -1.0, 0,3 - 0,5, 0,5 - 5,0, 0,5-4,5, 0,5 - 4,0, 0,5 - 3,5, 0,5 - 3,0, 0,5 - 2,5, 0,5 - 2,0, 0,5 - 1,5, o 0,5 - 1,0 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, el ARNm se administra a una dosis de o menos de aproximadamente 5,0, 4,5, 4.0, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,0, 0,8, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 mg/kg de peso corporal.

Otras características, objetos y ventajas de la presente invención son evidentes en la descripción detallada y los dibujos que siguen. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los dibujos, si bien indican realizaciones de la presente invención, se dan a modo de ilustración solamente, no de limitación.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

Los dibujos son solo con propósitos ilustrativos, no limitativos.

La Figura 1 muestra un gráfico ejemplar de los niveles de factor IX humano (FIX) detectados en el suero de ratones tratados 24 horas después de la administración de liposomas C12-200 o cKK-E12 que contienen ARNm de FIX.

La Figura 2 muestra un gráfico ejemplar de FIX detectado en el plasma de ratones tratados con 0,1,0,3, 0,6, 1,0 o 3,0 mg/kg de una de las dos proporciones de ARNm de FIX que contiene liposomas cKK-E12 6 o 24 horas después de la administración.

La Figura 3 muestra un gráfico ejemplar del nivel de proteína ASS1 detectado en los hígados de ratones tratados con 0,1, 0,3, 0,6, 1,0 o 3,0 mg/kg de liposomas cKK-E12 que contienen ARNm de ASS1 24 horas después de la administración.

La Figura 4 muestra análisis de transferencia Western ejemplares de los niveles de proteína ASS1 en el hígado 24 horas después de la administración de 0,1, 0,3, 0,6, 1,0 o 3,0 mg/kg de liposomas cKK-E12 que contienen ARNm de ASS1.

La Figura 5 muestra un gráfico ejemplar de los niveles de proteína ASS1 en el hígado de ratones 0,5, 3, 6, 12, 24, 48, 72 horas después de una única inyección IV de ARNm de ASS1 que contiene liposomas cKK-E12 (1 mg/kg). También se muestra el nivel de proteína ASS1 7 días después de la administración.

La Figura 6 muestra análisis de transferencia Western ejemplares de los niveles de proteína ASS1 en el hígado 0,5, 3, 6, 12, 24, 48, 72 horas después de una única inyección IV de 1 mg/kg de ARNm de ASS1 que contiene liposomas cKK-E12. También se muestra el nivel de proteína ASS1 7 días después de la administración.

La Figura 7 muestra la detección de ARN mensajero de ASS1 humano mediante hibridación in situ en los hígados de ratones tratados. El ARNm exógeno es observable durante por lo menos 72 horas después de la administración después de una única dosis (1,0 mg/kg) de nanopartículas lipídicas basadas en MD1 cargadas con ARNm de ASS1. El ARNm de ASS1 humano es detectable en células sinusoidales así como en hepatocitos. La Figura 8 muestra una tinción inmunohistoquímica ejemplar de los niveles de proteína ASS1 en hígado de ratón 24 horas después de la administración de 1 mg/kg de ARNm de ASS1 que contiene nanopartículas lipídicas de cKK-E12. La proteína de ASS1 humana es detectable en células sinusoidales así como en hepatocitos.

La Figura 9 muestra tinción inmunohistoquímica de bajo aumento (4x) de los niveles de proteína ASS1 en hígado de ratón 24 horas después de la administración de 1 mg/kg de ARNm de ASS1 que contiene liposomas cKK-E12. Una comparación con el hígado de ratón no tratado (izquierda) demuestra la amplia distribución de la proteína ASS1 humana por todo el hígado.

La Figura 10 muestra resultados ejemplares que ilustran que las nanopartículas lipídicas de cKK-E12 administraron eficazmente ARNm de FL mediante nebulización. Los ratones se expusieron a miligramos de ARNm de FL encapsulado y el análisis se realizó 24 horas después de la exposición.

La Figura 11 ilustra la detección mediante transferencia Western de la proteína SMN-1 humana derivada de ARNm de hSMN-1 exógeno que se transfectó en células BHK-21. Se emplearon varios anticuerpos específicos para SMN humano: (A) anticuerpo anti-SMN 4F11 a una dilución 1:1.000; (B) anticuerpo a-SMN Pierce PA5-27309 a una dilución 1:10.000; y (C) anticuerpo a-SMN LSBio C138149 a una dilución 1:10.000.

La Figura 12A-C ilustra la detección multiplex de ácido nucleico in situ de ARNm de supervivencia de la neurona motora humana (hSMN-1) en tejido espinal (A) cervical, (B) torácico y (C) lumbar, 24 horas después de la administración intratecal.

La Figura 13 ilustra la detección positiva de la proteína SMN-1 humana producida en la médula espinal de una rata 24 horas después de la administración intratecal de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de SMN-1 humano. Se empleó anticuerpo anti-SMN 4F11 humano a una dilución de 1:2500. El panel A representa tejido de médula espinal de rata tratada y el panel B representa tejido de médula espinal de rata no tratada.

La Figura 14 transfección in vivo de ratones deficientes en CFTR con ARNm de CFTR humano optimizado con codón marcado con His¹⁰ C-terminal (SEQ ID NO: 11) encapsulado dentro de una formulación de nanopartículas o lipídicas (cKK-E12) o poliméricas (PEI). Después de la administración nebulizada de cada formulación de ARNm respectiva, se recogió el lisado de tejido de pulmón derecho e izquierdo y se analizó para la expresión de CFTR por transferencia Western usando anticuerpo anti-His 1187. El control de tejido pulmonar deficiente en CFTR y lisado CFTR-Hisio HEK293 ("His¹⁰" divulgado como SEQ ID NO: 11) se usó como controles negativo y positivo, respectivamente.

La Figura 15 ilustra la detección positiva de la proteína luciferasa de luciérnaga (FFL) activa en un pulmón de cerdo tratado mediante luminiscencia tras la exposición a nanopartículas lipídicas de cKK-E12 encapsuladas en ARNm de FFL/CO-CFTR-C-His¹⁰ ("His¹⁰" divulgado como SEQ ID NO: 11). Los cerdos se trataron con 1 mg de FFL 9 mg de nanopartículas lipídicas de cKK-E12 encapsuladas en ARNm de CO-CFTR-C-His¹⁰ ("His¹⁰" divulgado como SEQ ID NO: 11) mediante nebulización usando un nebulizador de chorro Pari y se sacrificaron 24 horas después del tratamiento. La luminiscencia de FFL se visualizó usando un bioluminómetro IVIS.

DEFINICIONES

Para que la presente invención se entienda más fácilmente, se definen primero a continuación ciertos términos. Se establecen definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos a lo largo de la especificación.

Aminoácido: como se usa en la presente, el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que pueda incorporarse en una cadena de polipéptidos. En algunas realizaciones, un aminoácido tiene la estructura general H^eN-C(H)(R)-COHO. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido de origen natural. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas realizaciones, un aminoácido es un d-aminoácido; en algunas realizaciones, un aminoácido es un 1-aminoácido. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte 1-aminoácidos estándar que se encuentran comúnmente en péptidos de origen natural. "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en la presente, "aminoácido sintético" abarca aminoácidos químicamente modificados, que incluyen pero no se limitan a sales, derivados de aminoácidos (como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo los aminoácidos carboxil- y/o amino terminales en péptidos, pueden modificarse mediante metilación, amidación, acetilación, grupos protectores y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar adversamente su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o modificaciones postraduccionales, como la asociación con una o más entidades químicas (por ejemplo, grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, fracciones formilo, grupos isoprenoides, grupos sulfato, fracciones de polietilenglicol, fracciones lipídicas, fracciones de carbohidratos, fracciones de biotina, etc.). El término "aminoácido" se usa indistintamente con "residuo de aminoácido" y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un residuo de aminoácido de un péptido. Resultará evidente del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o a un residuo de un péptido.

Animal: como se usa en la presente, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado vacuno, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, un animal modificado genéticamente y/o un clon.

Aproximadamente o alrededor de: como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de", según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).

Administración: como se usa en la presente, el término "administración" abarca tanto la administración local como la sistémica. Por ejemplo, la administración de ARNm abarca situaciones en las que se administra un ARNm a un tejido objetivo y la proteína codificada se expresa y se retiene dentro del tejido objetivo (también denominada "distribución local" o "administración local"), y situaciones en las que se administra un ARNm a un tejido objetivo y la proteína codificada se expresa y secreta en el sistema circulatorio del paciente (por ejemplo, suero) y se distribuye sistemáticamente y es absorbida por otros tejidos (también denominada "distribución sistémica" o "administración sistémica").

Expresión: como se usa en la presente, "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a la traducción de un ARNm en un polipéptido, ensamblar múltiples polipéptidos (por ejemplo, cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo) en una proteína intacta (por ejemplo, anticuerpo) y/o modificación postraduccional de un polipéptido o proteína completamente ensamblada (por ejemplo, anticuerpo). En esta solicitud, los términos "expresión" y "producción" y equivalentes gramaticales se usan indistintamente.

Funcional: como se usa en la presente, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma en la que muestra una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.

Vida media: como se usa en la presente, el término "vida media" es el tiempo necesario para que una cantidad como la concentración o actividad de ácido nucleico o proteína caiga a la mitad de su valor medido al comienzo de un período de tiempo.

Mejorar, aumentar o reducir: como se usa en la presente, los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir", o equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medición de referencia, como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en la presente, o una medición en un sujeto de control (o un sujeto de control múltiple) en ausencia del tratamiento descrito en la presente. Un "sujeto de control" es un sujeto que padece la misma forma de enfermedad que el sujeto que se está tratando, que tiene aproximadamente la misma edad que el sujeto que se está tratando.

In Vitro: Como se usa en la presente, el término ”in vitro” se refiere a eventos que se producen en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

In vivo: como se usa en la presente, el término ”in vivo” se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo multicelular, como un humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que se producen dentro de una célula viva (a diferencia de, por ejemplo, los sistemas in vitro).

Aislado: como se usa en la presente, el término "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido (1) separada de por lo menos algunos de los componentes con los que se asoció cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental) y/o (2) producida, preparada y/o fabricada por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o más de aproximadamente el 99% de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados tiene aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o más de aproximadamente el 99% de pureza. Como se usa en la presente, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Como se usa en la presente, el cálculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (por ejemplo, tampón, solvente, agua, etc.).

Distribución o administración local: como se usa en la presente, los términos "distribución local", "administración local" o equivalentes gramatical, se refieren a administración o distribución específica de tejido. Típicamente, la distribución o administración local requiere que una proteína (por ejemplo, enzima) codificada por ARNm que se traduzca y exprese intracelularmente o con secreción limitada que evite entrar en el sistema circulatorio del paciente.

ARN mensajero (ARNm): como se usa en la presente, el término "ARN mensajero (ARNm)" se refiere a un polinucleótido que codifica por lo menos un polipéptido. El ARNm, como se usa en la presente, abarca ARN tanto modificado como no modificado. El ARNm puede contener una o más regiones codificantes y no codificantes. El ARNm puede purificarse a partir de fuentes naturales, producirse usando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificarse, sintetizarse químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, el ARNm puede comprender análogos de nucleósidos, como análogos que tienen bases o azúcares químicamente modificados, modificaciones de la estructura principal, etc. Una secuencia de ARNm se presenta en la dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, un ARNm comprende nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, guanosina, citidina, uridina); análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases modificadas químicamente; bases biológicamente modificadas (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces de 5'-N -fosforamidita).

En algunas realizaciones, el ARNm comprende uno o más residuos de nucleótidos no estándar. Los residuos de nucleótidos no estándar pueden incluir, por ejemplo, 5-metil-citidina ("5mC"), pseudouridina ("^U") y/o 2-tio-uridina ("2sU"). Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 8.278.036 o la WO20110123l6 para un análisis de tales residuos y su incorporación en el ARNm. El ARNm puede ser ARN, que se define como ARN en el que el 25% de los residuos U son 2-tiouridina y el 25% de los residuos C son 5-metilcitidina. Las enseñanzas para el uso de ARN se divulgan en la Publicación de Patente de Estados Unidos US20120195936 y la publicación internacional WO2011012316. La presencia de residuos de nucleótidos no estándar puede hacer que un ARNm sea más estable y/o menos inmunogénico que un ARNm de control con la misma secuencia pero que solo contiene residuos estándar. En realizaciones adicionales, el ARNm puede comprender uno o más residuos de nucleótidos no estándar elegidos entre isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina citosina, así como combinaciones de estas modificaciones y otras modificaciones de nucleobases. Ciertas realizaciones pueden incluir además modificaciones adicionales al anillo de furanosa o nucleobase. Las modificaciones adicionales pueden incluir, por ejemplo, modificaciones o sustituciones de azúcar (por ejemplo, una o más de una modificación 2'-O-alquilo, un ácido nucleico bloqueado (LNA)). En algunas realizaciones, los ARN pueden formar complejos o hibridar con polinucleótidos y/o polinucleótidos peptídicos (PNA) adicionales. En realizaciones en las que la modificación del azúcar es una modificación 2'-O-alquilo, dicha modificación puede incluir, pero no se limita a, una modificación 2'-desoxi-2'-fluoro, una modificación 2'-O-metilo, una modificación 2'-O-metoxietilo y una modificación 2'-desoxi. En ciertas realizaciones, cualquiera de estas modificaciones puede estar presente en el 0-100% de los nucleótidos, por ejemplo, más del 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, o 100% de los nucleótidos constituyentes individualmente o en combinación.

Ácido nucleico: como se usa en la presente, el término "ácido nucleico", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de polinucleótidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de polinucleótidos mediante un enlace fosfodiéster. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a una cadena de polinucleótidos que comprende residuos de ácidos nucleicos individuales. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" abarca ARN así como ADN y/o ADNc de cadena sencilla y/o doble.

Paciente: como se usa en la presente, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a cualquier organismo al que puede administrarse una composición proporcionada, por ejemplo, para propósitos experimentales, de diagnóstico, profilácticos, cosméticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un humano. Un humano incluye formas pre y postnatales.

Farmacéuticamente aceptable: el término "farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivos, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

Distribución o administración sistémica: como se usa en la presente, los términos "distribución sistémica", "administración sistémica" o equivalentes gramaticales, se refieren a un mecanismo o enfoque de administración o distribución que afecta a todo el cuerpo o un organismo completo. Típicamente, la distribución o administración sistémica se logra a través del sistema de circulación del cuerpo, por ejemplo, el torrente sanguíneo. En comparación con la definición de "distribución o administración local".

Sujeto: Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a un humano o cualquier animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado, cerdo, oveja, caballo o primate). Un humano incluye formas prenatales y posnatales. En muchas realizaciones, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, lo que se refiere a un humano que se presenta a un proveedor de asistencia médica para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término "sujeto" se usa aquí de manera intercambiable con "individuo" o "paciente". Un sujeto puede padecer o ser susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede presentar o no síntomas de la enfermedad o trastorno.

Sustancialmente: como se usa en la presente, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, llegan a completarse y/o proceden a ser completos o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en la presente para capturar la posible falta de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

Tejidos objetivo: como se usa en la presente, el término "tejidos objetivo" se refiere a cualquier tejido que se ve afectado por una enfermedad a tratar. En algunas realizaciones, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos que presentan patologías, síntomas o características asociados a la enfermedad.

Cantidad terapéuticamente eficaz: como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico significa una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de los síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. Los expertos en la técnica apreciarán que una cantidad terapéuticamente eficaz se administra típicamente mediante un régimen de dosificación que comprende por lo menos una dosis unitaria.

Tratamiento: como se usa en la presente, el término "tratar", "tratamiento" o "tratar" se refiere a cualquier método usado para aliviar, mejorar, mitigar, inhibir, prevenir, retrasar la aparición, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia, parcial o completamente, de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección particular. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad y/o muestra solo signos tempranos de la enfermedad con el propósito de disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la enfermedad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Liposomas para la administración de ARNm

Como se usa en la presente, el término "liposoma" se refiere a cualquier vesícula de nanopartículas lipídicas lamelares, multilaminares o sólidas. Típicamente, un liposoma como se usa en la presente puede formarse mezclando uno o más lípidos o mezclando uno o más lípidos y polímero(s). Por tanto, el término "liposoma" como se usa en la presente abarca nanopartículas basadas tanto en lípidos como en polímeros. En particular, un liposoma de acuerdo con la presente invención incorpora cKK-E12 o (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona).

En algunas realizaciones, cKK-E12 constituye aproximadamente el 30-50% (por ejemplo, aproximadamente el 30-45%, aproximadamente el 30-40%, aproximadamente el 35-50%, aproximadamente el 35-45% o aproximadamente el 35-40%) del liposoma por relación molar. En algunas realizaciones, cKK-E12 constituye aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45% o aproximadamente el 50% de la relación molar de liposomas.

ARNm

La presente divulgación puede usarse para administrar cualquier ARNm. Típicamente se piensa que el ARNm es el tipo de ARN que transporta información desde el ADN hasta el ribosoma. La existencia de ARNm suele ser muy breve e incluye procesamiento y traducción, seguido de degradación. Típicamente, en organismos eucariotas, el procesamiento de ARNm comprende la adición de una "caperuza" en el extremo N-terminal (5') y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). Una caperuza típica es una caperuza de 7-metilguanosina, que es una guanosina que está enlazada a través de un enlace 5'-5'-trifosfato al primer nucleótido transcrito. La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La cola es típicamente un evento de poliadenilación mediante el cual se añade una fracción poliadenililo al extremo 3' de la molécula de ARNm. La presencia de esta "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasas. Típicamente, los ribosomas traducen el ARN mensajero en una serie de aminoácidos que componen una proteína.

Síntesis de ARNm

Los ARNm de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con cualquiera de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, los ARNm de acuerdo con la presente invención pueden sintetizarse mediante transcripción in vitro (IVT). Brevemente, la IVT se realiza típicamente con una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor, una agrupación de ribonucleótidos trifosfatos, un sistema tampón que puede incluir DTT e iones de magnesio y una ARN polimerasa apropiada (por ejemplo, T3, T7 o SP6 ARN polimerasa), ADNasa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variarán de acuerdo con la aplicación específica.

En algunas realizaciones, para la preparación de ARNm de acuerdo con la invención, se transcribe una plantilla de ADN in vitro. Una plantilla de ADN adecuada tiene típicamente un promotor, por ejemplo, un promotor T3, T7 o SP6, para la transcripción in vitro, seguido de la secuencia de nucleótidos deseada para el ARNm deseado y una señal de terminación.

La secuencia o secuencias de ARNm deseadas de acuerdo con la invención pueden determinarse e incorporarse en una plantilla de ADN usando métodos estándar. Por ejemplo, partiendo de una secuencia de aminoácidos deseada (por ejemplo, una secuencia enzimática), se lleva a cabo una traducción inversa virtual en base al código genético degenerado. Luego, pueden usarse algoritmos de optimización para la selección de codones adecuados. Típicamente, puede optimizarse el contenido de G/C para lograr el contenido de G/C más alto posible por un lado, teniendo en cuenta la mejor frecuencia posible de los ARNt de acuerdo con el uso de codones por otro lado. La secuencia de ARN optimizada puede establecerse y mostrarse, por ejemplo, con la ayuda de un dispositivo de visualización apropiado y compararse con la secuencia original (tipo salvaje). También puede analizarse una estructura secundaria para calcular las propiedades estabilizadoras y desestabilizadoras o, respectivamente, regiones del ARN.

ARNm modificado

El ARNm de acuerdo con la presente invención se sintetiza como ARNm modificado. Típicamente, los ARNm se modifican para mejorar la estabilidad. Las modificaciones del ARNm pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleótidos del ARN. Por tanto, un ARNm modificado de acuerdo con la invención puede incluir, por ejemplo, modificaciones de la estructura principal, modificaciones de azúcares o modificaciones de bases. En algunas realizaciones, los ARNm pueden sintetizarse a partir de nucleótidos naturales y/o análogos de nucleótidos (nucleótidos modificados) que incluyen, pero no se limitan a, purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)), y como nucleótidos modificados análogos o derivados de purinas y pirimidinas como, por ejemplo, 1-metil-adenina, 2-metil-adenina, 2-metiltio-N-6-isopentenil-adenina, N6-metiladenina, N6-isopentenil-adenina, 2-tio-citosina, 3-metil-citosina, 4-acetil-citosina, 5-metil-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metilguanina, 2-metil-guanina, 2,2-dimetil-guanina, 7-metil-guanina, inosina, 1-metil-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidro-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2-tio-uracilo, 5-metil-uracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tio-uracilo, 5'-etoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 1-metil-pseudouracilo, queosina, beta-D-manosil-queosina, wibutoxosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. La preparación de tales análogos es conocida por un experto en la técnica, por ejemplo, de la Patente de Estados Unidos N° 4.373.071, Patente de Estados Unidos N° 4.401.796, Patente de Estados Unidos N° 4.415.732, Patente de Estados Unidos N° 4.458.066, Patente de Estados Unidos N° 4.500.707, Patente de Estados Unidos N° 4.668.777, Patente de Estados Unidos N° 4.973.679, Patente de Estados Unidos N° 5,047,524, Patente de Estados Unidos N° 5.132.418, Patente de Estados Unidos N° 5.153.319, Patentes de Estados Unidos N° 5.262.530 y 5.700.642.

En algunas realizaciones, los ARNm (por ejemplo, ARNm que codifican enzimas) pueden contener modificaciones de la estructura principal del ARN. Típicamente, una modificación del estructura principal es una modificación en la que los fosfatos del estructura principal de los nucleótidos contenidos en el ARN se modifican químicamente. Las modificaciones de la estructura principal ejemplares incluyen típicamente, pero no se limitan a, modificaciones del grupo que consiste de metilfosfonatos, metilfosforamidatos, fosforamidatos, fosforotioatos (por ejemplo, citidina 5'-O-(1-tiofosfato)), boranofosfatos, grupos guanidinio cargados positivamente, etc. lo significa reemplazar el enlace fosfodiéster por otros grupos aniónicos, catiónicos o neutros.

En algunas realizaciones, los ARNm (por ejemplo, ARNm que codifican enzimas) pueden contener modificaciones de azúcar. Una modificación típica de azúcar es una modificación química del azúcar de los nucleótidos que contiene, incluyendo pero no limitado a, modificaciones de azúcar elegidas del grupo que consiste de 2'-desoxi-2'-fluoro-oligoribonucleótido (2'-fluoro-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-fluoro-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-desoxi-2'-deamina-oligorribonucleótido (2'-amino-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-O-alquiloligoribonucleótido, 2'-desoxi-2'-C-alquiloligoribonucleótido (2'-O-metilcitidina 5'-trifosfato, 2'-metiluridina 5'-trifosfato), 2'-C-alquiloligoribonucleótido e isómeros del mismo (2'-aracitidina 5'-trifosfato, 2'-arauridina 5'-trifosfato) o azidotrifosfatos (2'-azido-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-azido-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato).

En algunas realizaciones, los ARNm (por ejemplo, ARNm que codifican enzimas) pueden contener modificaciones de las bases de los nucleótidos (modificaciones de bases). Un nucleótido modificado que contiene una modificación de base también se denomina nucleótido de base modificada. Ejemplos de tales nucleótidos de base modificada incluyen, pero no se limitan a, 2-amino-6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2-tiouridina 5'- trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'-trifosfato, 5aminoaliluridina 5'-trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5-bromouridina 5'-trifosfato, 5-yodocitidina 5'-trifosfato, 5-yodouridina 5'-trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'-trifosfato, 6-azauridina 5'-trifosfato, 6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 7-desazaadenosina 5'-trifosfato, 7-deazaguanosina 5'-trifosfato, 8-azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, benzimidazol ribósido 5'-trifosfato, N1-metiladenosina 5'-trifosfato, N1-metilguanosina 5'-trifosfato, N6-metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, pseudouridina 5'-trifosfato, puromicina 5'-trifosfato o xantosina 5'-trifosfato.

Estructura de caperuza

Típicamente, la síntesis de ARNm incluye la adición de una "caperuza" en el extremo N-terminal (5') y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasas

Por tanto, en algunas realizaciones, los ARNm (por ejemplo, ARNm que codifican enzimas) incluyen una estructura de caperuza 5'. Típicamente, una caperuza 5' se añade de la siguiente manera: primero, una fosfatasa terminal de ARN elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleótido 5', dejando dos fosfatos terminales; luego, se añade guanosina trifosfato (GTP) a los fosfatos terminales mediante una guanilil transferasa, produciendo un enlace trifosfato 5'5'5; y luego el nitrógeno 7 de la guanina se metila mediante una metiltransferasa. Los ejemplos de estructuras de caperuza incluyen, pero no se limitan a, m7G (5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

En algunas realizaciones, las estructuras de caperuza de origen natural comprenden una 7-metil guanosina que se enlaza mediante un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleótido transcrito, lo que da como resultado una caperuza de dinucleótido de m7G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleósido. In vivo, la caperuza se añade enzimáticamente. La caperuza se añade en el núcleo y es catalizada por la enzima guanilil transferasa. La adición de la caperuza al extremo 5' terminal del ARN se produce inmediatamente después del inicio de la transcripción. El nucleósido terminal es típicamente una guanosina y está en la orientación inversa a todos los demás nucleótidos, es decir, G(5')ppp(5')GpNpNp.

Una caperuza común para el ARNm producido por transcripción in vitro es m7G(5')ppp(5')G, que se ha usado como caperuza de dinucleótidos en la transcripción con la ARN polimerasa T7 o SP6 in vitro para obtener ARN que tienen una estructura de caperuza en sus extremos terminales 5'. El método predominante para la síntesis in vitro de ARNm protegido emplea un dinucleótido preformado de la forma m7G(5')ppp(5')G ("m7GpppG") como iniciador de la transcripción.

Hasta la fecha, una forma habitual de una caperuza de dinucleótido sintética usada en experimentos de traducción in vitro es el análogo de caperuza antiinverso ("ARCA") o ARCA modificado, que generalmente es un análogo de caperuza modificado en el que el grupo OH 2' o 3' se reemplaza con -OCH³.

Los análogos de caperuza adicionales incluyen, pero no se limitan a, estructuras químicas seleccionadas del grupo que consiste de m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; análogos de caperuza no metilados (por ejemplo, GpppG); análogo de caperuza dimetilada (por ejemplo, m27GpppG), análogo de caperuza trimetilado (por ejemplo, m2-2'7GpppG), análogos de caperuza simétrica dimetilada (por ejemplo, m7Gpppm7G), o análogos de caperuza anti­ inversa (por ejemplo ARCA; m7,2OmeGpppG, m72dGpppG, m7’3OmeGpppG, m73dGpppG y sus derivados de tetrafosfato) (ver, por ejemplo, Jemielity, J. et al., "Novel ’anti-reverse’ cap analogs with superior translational properties", RNA, 9: 1108-1122 (2003)).

En algunas realizaciones, una caperuza adecuada es un 7-metil guanilato ("m7G") enlazado mediante un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleótido transcrito, lo que da como resultado m7G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleósido. Una realización preferida de una caperuza m7G utilizada en realizaciones de la invención es m7G(5')ppp(5')G.

En algunas realizaciones, la caperuza es una estructura Cap0. Las estructuras Cap0 carecen de un residuo 2'-O-metilo de la ribosa unido a las bases 1 y 2. En algunas realizaciones, la caperuza es una estructura Cap1. Las estructuras Cap1 tienen un residuo 2'-O-metilo en la base 2. En algunas realizaciones, la caperuza es una estructura Cap2. Las estructuras Cap2 tienen un residuo 2'-O-metilo unido a ambas bases 2 y 3.

Se conocen en la técnica una variedad de análogos de caperuza m7G, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Estos incluyen la m7GpppG descrito anteriormente, así como los análogos de caperuza ARCA 3'-OCH3 y 2'-OCH3 (Jemielity, J. et al., RNA, 9: 1108-1122 (2003)). Los análogos de caperuza adicionales para su uso en realizaciones de la invención incluyen análogos de tetrafosfato de dinucleósido N7-bencilado (descritos en Grudzien, E. et al., RNA, 10: 1479-1487 (2004)), análogos de caperuza de fosforotioato (descritos en Grudzien-Nogalska, E., et al., RNA, 13: 1745-1755 (2007)) y análogos de caperuza (incluyendo análogos de caperuza biotinilados) descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 8.093.367 y 8.304.529.

Estructura de cola

Típicamente, la presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasas. Se cree que la cola de poli A estabiliza los mensajeros naturales y el ARN de sentido sintético. Por lo tanto, en ciertas realizaciones puede añadirse una cola de poli A larga a una molécula de ARNm, volviendo de este modo el ARN más estable. Las colas de Poli A pueden añadirse usando una variedad de técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden añadirse colas largas de poli A a ARN sintético o transcrito in vitro usando poli A polimerasa (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Un vector de transcripción también puede codificar colas de poli A largas. Además, pueden añadirse colas de poli A mediante transcripción directamente a partir de productos de PCR. La poli A también puede ligarse al extremo 3' de un ARN de sentido con ARN ligasa (ver, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a ed., Ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: edición de 1991)).

En algunas realizaciones, los ARNm (por ejemplo, ARNm que codifican enzimas) incluyen una estructura de cola poli (A) 3'. Típicamente, la longitud de la cola de poli A puede ser de por lo menos aproximadamente 10, 50, 100, 200, 300, 400 por lo menos 500 nucleótidos (SEQ ID NO: 12). En algunas realizaciones, una cola de poli-A en el extremo terminal 3' del ARNm incluye típicamente de 10 a 300 nucleótidos de adenosina (SEQ ID NO: 13) (por ejemplo, aproximadamente de 10 a 200 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 10 a 150 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 10 a 100 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 20 a 70 nucleótidos de adenosina o aproximadamente de 20 a 60 nucleótidos de adenosina). En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de cola poli(C) 3'. Una cola de poli-C adecuada en el extremo terminal 3' del ARNm incluye típicamente aproximadamente de 10 a 200 nucleótidos de citosina (SEQ ID NO: 14) (por ejemplo, aproximadamente de 10 a 150 nucleótidos de citosina, aproximadamente de 10 a 100 nucleótidos de citosina, aproximadamente de 20 a 70 nucleótidos de citosina, aproximadamente de 20 a 60 nucleótidos de citosina, o aproximadamente de 10 a 40 nucleótidos de citosina). La cola de poli-C puede añadirse a la cola de poli-A o puede sustituir a la cola de poli-A.

En algunas realizaciones, la longitud de la cola de poli A o poli C se ajusta para controlar la estabilidad de una molécula de ARNm de sentido modificado de la invención y, por tanto, la transcripción de la proteína. Por ejemplo, como la longitud de la cola de poli A puede influir en la vida media de una molécula de ARNm de sentido, la longitud de la cola de poli A puede ajustarse para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y controlar de este modo el curso temporal de la expresión de polinucleótidos y/o producción de polipéptidos en una célula objetivo.

Región sin traducir de 5' y 3'

En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una región no traducida 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, una región 5' no traducida incluye uno o más elementos que afectan a la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una región no traducida 5' puede tener una longitud de entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos.

En algunas realizaciones, una región no traducida 3' incluye uno o más de una señal de poliadenilación, un sitio de unión para proteínas que afectan a la estabilidad de localización de un ARNm en una célula, o uno o más sitios de unión para ARNmi. En algunas realizaciones, una región 3' no traducida puede tener entre 50 y 500 nucleótidos de longitud o más.

Las secuencias de UTR 3' y/o 5' ejemplares pueden derivarse de moléculas de ARNm que son estables (por ejemplo, globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo del ácido cítrico) para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm de sentido. Por ejemplo, una secuencia de UTR 5’ puede incluir una secuencia parcial de un gen inmediato temprano 1 (IE1) de CMV, o un fragmento del mismo para mejorar la resistencia a nucleasas y/o mejorar la vida media del polinucleótido. También se contempla la inclusión de una secuencia que codifica la hormona del crecimiento humana (hGH), o un fragmento de la misma en el extremo 3' o región no traducida del polinucleótido (por ejemplo, ARNm) para estabilizar adicionalmente el polinucleótido. Generalmente, estas modificaciones mejoran la estabilidad y/o propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, vida media) del polinucleótido con respecto a sus contrapartidas no modificadas e incluyen, por ejemplo, modificaciones hechas para mejorar tal resistencia de los polinucleótidos a la digestión de nucleasas in vivo.

De acuerdo con varias realizaciones, los liposomas proporcionados pueden encapsular ARNm de cualquier tamaño. En algunas realizaciones, los liposomas proporcionados pueden encapsular ARNm de más de aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb o 5 kb de longitud.

Formación de liposomas

Los liposomas para su uso en las composiciones proporcionadas pueden prepararse mediante varias técnicas que se conocen actualmente en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse vesículas multilaminares (MLV) de acuerdo con técnicas convencionales, como depositando un lípido seleccionado en la pared interior de un envase o recipiente adecuado disolviendo el lípido en un solvente apropiado y luego evaporando el solvente para dejar un película fina en el interior del recipiente o mediante secado por pulverización. Luego, puede añadirse una fase acuosa al recipiente con un movimiento de vórtice que da como resultado la formación de las MLV. Las vesículas unilamelares (ULV) pueden formarse luego mediante homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilaminares. Además, pueden formarse vesículas unilaminares mediante técnicas de eliminación de detergentes.

En ciertas realizaciones, las composiciones proporcionadas comprenden un liposoma en el que el ARNm está asociado tanto en la superficie del liposoma como encapsulado dentro del mismo liposoma. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los liposomas catiónicos pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los liposomas catiónicos pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas.

Al proceso de incorporación de un ARNm deseado en un liposoma se hace referencia a menudo como "carga". Los métodos ejemplares se describen en Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992. Los ácidos nucleicos incorporados en liposomas pueden estar localizados total o parcialmente en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma, o asociados con la superficie exterior de la membrana del liposoma. A la incorporación de un ácido nucleico en liposomas también se hace referencia en la presente como "encapsulación", en donde el ácido nucleico está contenido por completo dentro del espacio interior del liposoma. El propósito de incorporar un ARNm en un vehículo de transferencia, como un liposoma, es a menudo proteger el ácido nucleico de un ambiente que puede contener enzimas o sustancias químicas que degradan los ácidos nucleicos y/o sistemas o receptores que provocan la rápida excreción de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un vehículo de administración adecuado es capaz de mejorar la estabilidad del ARNm contenido en el mismo y/o facilitar la administración del ARNm a la célula o tejido objetivo.

Tamaño del liposoma

Los liposomas adecuados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse en varios tamaños. En algunas realizaciones, los liposomas proporcionados pueden hacerse más pequeños que los liposomas de encapsulación de ARNm previamente conocidos. En algunas realizaciones, el tamaño reducido de los liposomas se asocia con una administración más eficaz de ARNm. La selección de un tamaño de liposoma apropiado puede tener en cuenta el sitio de la célula o tejido objetivo y, hasta cierto punto, la aplicación para la que se está elaborando el liposoma.

En algunas realizaciones, se selecciona un tamaño apropiado de liposoma para facilitar la distribución sistémica del anticuerpo codificado por el ARNm. En algunas realizaciones, puede ser deseable limitar la transfección del ARNm a ciertas células o tejidos. Por ejemplo, para dirigirse a hepatocitos, un liposoma puede tener un tamaño tal que sus dimensiones sean más pequeñas que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos en el hígado; en tales casos el liposoma podría penetrar fácilmente tales fenestraciones endoteliales para alcanzar los hepatocitos objetivo.

Alternativa o adicionalmente, un liposoma puede tener un tamaño tal que las dimensiones del liposoma sean de un diámetro suficiente para limitar o evitar expresamente la distribución en ciertas células o tejidos. Por ejemplo, un liposoma puede tener un tamaño tal que sus dimensiones sean mayores que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos para limitar de este modo la distribución de los liposomas a los hepatocitos.

En algunas realizaciones, el tamaño de un liposoma está determinado por la longitud del diámetro más grande de la partícula de liposoma. En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño de aproximadamente 500 nm, 450 nm, 400 nm, 350 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 125 nm, 110 nm, 100 nm, 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm o 50 nm. En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño no mayor de aproximadamente 250 nm (por ejemplo, no mayor de aproximadamente 225 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm o 50 nm). En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño que varía de aproximadamente 10-250 nm (por ejemplo, que varía de aproximadamente 10-225 nm, 10-200 nm, 10-175 nm, 10-150 nm, 10-125 nm, 10-100 nm, 10-75 nm o 10-50 nm). En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño que varía de aproximadamente 100-250 nm (por ejemplo, que varía de aproximadamente 100-225 nm, 100-200 nm, 100-175 nm, 100-150 nm). En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño que varía de aproximadamente 10-100 nm (por ejemplo, que varía de aproximadamente 10-90 nm, 10-80 nm, 10-70 nm, 10-60 nm o 10-50 nm).

Hay disponibles una variedad de métodos alternativos conocidos en la técnica para el dimensionamiento de una población de liposomas. Uno de estos métodos de dimensionamiento se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.737.323. La sonicación de una suspensión de liposomas mediante sonicación en baño o sonda produce una reducción progresiva del tamaño hasta un ULV pequeño de menos de aproximadamente 0,05 micras de diámetro. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de corte para fragmentar liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento de homogeneización típico, las MLV se recirculan a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan tamaños de liposomas seleccionados, típicamente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micras. El tamaño de los liposomas puede determinarse mediante dispersión de luz cuasi eléctrica (QELS) como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10: 421-150 (1981). El diámetro medio de los liposomas puede reducirse mediante sonicación de los liposomas formados. Los ciclos de sonicación intermitentes pueden alternarse con la evaluación QELS para guiar la síntesis de liposomas eficiente.

Composiciones farmacéuticas

Para facilitar la expresión de ARNm in vivo, pueden formularse vehículos de administración como liposomas en combinación con uno o más ácidos nucleicos, portadores, ligandos de direccionamiento o reactivos estabilizadores adicionales, o en composiciones farmacológicas donde se mezclan con excipientes adecuados. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición.

Los ARNm asociados o encapsulados en liposomas proporcionados, y las composiciones que contienen los mismos, pueden administrarse y dosificarse de acuerdo con la práctica médica actual, teniendo en cuenta la condición clínica del sujeto, el sitio y método de administración, el programa de administración, la edad, sexo, peso corporal del sujeto y otros factores relevantes para los médicos expertos en la técnica. La "cantidad eficaz" para los propósitos de la presente puede determinarse mediante consideraciones relevantes conocidas por los expertos en las técnicas de investigación clínica experimental, farmacológica, clínica y médica. En algunas realizaciones, la cantidad administrada es eficaz para lograr por lo menos cierta estabilización, mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores que se seleccionan como medidas apropiadas del progreso, regresión o mejora de la enfermedad por parte de los expertos en la técnica. Por ejemplo, una cantidad y un régimen de dosificación adecuados son aquellos que provocan por lo menos una producción transitoria de proteínas.

En algunas realizaciones, los liposomas y/o composiciones se formulan de tal manera que sean adecuados para la liberación prolongada del ARNm contenido en ellos. Tales composiciones de liberación prolongada pueden administrarse convenientemente a un sujeto a intervalos de dosificación prolongados. Por ejemplo, en una realización, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces al día, diariamente o en días alternos. En una realización preferida, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces a la semana, una vez a la semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas, o más preferiblemente cada cuatro semanas, una vez al mes, cada seis semanas., cada ocho semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses, cada seis meses, cada ocho meses, cada nueve meses o anualmente. También se contemplan composiciones y liposomas que se formulan para administración de depósito (por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea, intravítrea) para administrar o liberar un ARNm durante períodos de tiempo prolongados. Preferiblemente, los medios de liberación prolongada empleados se combinan con modificaciones realizadas en el ARNm para mejorar la estabilidad.

También se contemplan en la presente composiciones farmacéuticas liofilizadas que comprenden uno o más de los liposomas divulgados en la presente y métodos relacionados para el uso de tales composiciones como se describe, por ejemplo, en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/494,882, presentada el 8 de junio de 2011. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas liofilizadas de acuerdo con la invención pueden reconstituirse antes de la administración o pueden reconstituirse in vivo. Por ejemplo, una composición farmacéutica liofilizada puede formularse en una forma de dosificación apropiada (por ejemplo, una forma de dosificación intradérmica como un disco, varilla o membrana) y administrarse de tal manera que la forma de dosificación sea rehidratada con el tiempo in vivo por los fluidos corporales del individuo.

De acuerdo con varias realizaciones, la cadencia de expresión de los ARNm administrados puede ajustarse para adaptarse a una necesidad médica particular. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína codificada por el ARNm administrado es detectable 1, 2, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66 y/o 72 horas en suero o tejidos objetivo después de una única administración de los liposomas o composiciones proporcionados. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días y/o 7 días en suero o tejidos objetivo después de una única administración de los liposomas o composiciones proporcionados. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable 1 semana, 2 semanas, 3 semanas y/o 4 semanas en suero o tejidos objetivo después de una única administración de los liposomas o composiciones proporcionados. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable después de un mes o más después de una única administración de los liposomas o composiciones proporcionados.

La presente invención puede usarse para administrar ARNm en varias dosis. En algunas realizaciones, se administra un ARNm a una dosis que varía de aproximadamente 0,1 a 5,0 mg/kg de peso corporal, por ejemplo de aproximadamente 0,1 a 4,5, 0,1 a 4,0, 0,1 a 3,5, 0,1 a 3,0, 0,1 a 2,5, 0,1 a 2,0, 0,1 a 1,5, 0,1 a 1,0, 0,1 a 0,5, 0,1 a 0,3, 0,3 a 5,0, 0,3 a 4,5, 0,3 a 4,0, 0,3 a 3,5, 0,3 a 3,0, 0,3 a 2,5, 0,3 a 2,0, 0,3 a 1,5, 0,3 a 1,0, 0,3 a 0,5, 0,5 a 5,0, 0,5a4,5, 0,5 a 4,0, 0,5 a 3,5, 0,5 a 3,0, 0,5 a 2,5, 0,5 a 2,0, 0,5 a 1,5, o 0,5 a 1,0 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, se administra un ARNm a una dosis de o menos de aproximadamente 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,0, 0,8, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 mg/kg de peso corporal.

EJEMPLOS

Aunque se han descrito con especificidad ciertas composiciones para su uso en los métodos de la presente invención de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven únicamente para ilustrar los compuestos para su uso en los métodos de la invención y no se pretende que limiten la misma.

Ejemplo 1. Formulaciones de liposomas ejemplares para la liberación y expresión de ARNm

Este ejemplo proporciona formulaciones de liposomas ejemplares que incorporan los lípidos catiónicos descritos en la presente, por ejemplo, cKK-E12, para la administración y expresión eficaces de ARNm que codifica proteínas terapéuticas in vivo.

Materiales lipídicos

En general, las formulaciones descritas en la presente se basan en una mezcla de lípidos multicomponente de proporciones variables que emplean uno o más lípidos catiónicos, uno o más lípidos auxiliares (por ejemplo, lípidos no catiónicos y/o lípidos basados en colesterol) y uno o más más lípidos PEGilados diseñados para encapsular varios materiales a base de ácidos nucleicos. Como ejemplo no limitativo, se usa cKK-E12 (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona) en varias formulaciones descritas en la presente. Los lípidos auxiliares ejemplares incluyen uno o más de DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoilsn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)), colesterol, etc. Los lípidos PEGilados ejemplares incluyen una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s)de alquilo de longitud C⁶-C²⁰, por ejemplo, PEG-2K. Como ejemplos comparativos no limitativos, las formulaciones de liposomas usadas en varios ejemplos descritos en la presente incluyen cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K a varias proporciones. Por ejemplo, en ejemplos comparativos, la proporción de cKK-E12: DOPE: colesterol: DMG-PEG2K es de aproximadamente 40:30:20:10 en peso. En los ejemplos de la invención, la proporción de cKK-E12: DOPE: colesterol: DMG-PEG2K es de aproximadamente 40:32:25:3 en peso. A menos que se especifique lo contrario, los siguientes Ejemplos incluyen una mezcla en la proporción de cKK-E12: DOPE: colesterol: DMG-PEG2K de aproximadamente 40:30:25:5 en peso. Cualquier ejemplo con una mezcla en la proporción de cKK-E12: DOPE: colesterol: DMG-PEG2K de aproximadamente 40:30:25:5 en peso es un ejemplo comparativo.

Material de ARN mensajero

Las formulaciones descritas en la presente pueden usarse para administrar cualquier ARNm, en particular, ARNm terapéutico. Como se usa en la presente, un ARNm terapéutico se refiere a un ARNm que codifica una proteína terapéutica. Las formulaciones descritas en la presente también pueden usarse para administrar cualquier ARNm modificado o no modificado, o ARNm con secuencias de origen natural o con codones optimizados.

Como ejemplos comparativos no limitativos, se sintetizaron el Factor IX humano (FIX), la luciferasa de luciérnaga optimizada con codones (FFL), el ARN mensajero de la argininosuccinato sintetasa humana optimizada con codones (ASS1), el ARNm de supervivencia humana de la neurona motora 1 (SMN) optimizado con codones por transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmídico que codifica el gen, que fue seguida por la adición de una estructura de caperuza 5' (Cap 1) (Fechter, P.; Brownlee, GG "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) y una cola de poli (A) 3' de, por ejemplo, aproximadamente 250 nucleótidos de longitud (SEQ ID NO: 15) según se determina mediante electroforesis en gel. Típicamente, las regiones no traducidas (UTR) 5' y 3' están presentes en cada producto de ARNm y se representan como X e Y, respectivamente. Las secuencias de UTR 5' y 3' ejemplares se describen a continuación. Las secuencias ejemplares de ARNm de FIX, ASS1 y FFL usadas en los ejemplos comparativos de la presente se enumeran a continuación. También se muestran las secuencias UTR 5' y 3'.

ARNm del factor IX humano (FIX):

X AU GC AGCGCGU GAACAU GAU C AU GGC AGAAUC ACC AGGCCU C A U C ACC AU CU GC CUUUU AGGAU A U CU ACU C AGU GCU GA A U GU AC AG UUUUU CUU GAU C AU GA A A AC GCCAACAAAAUUCUGAGGCGGAGAAGGAGGUAUAAUUCAGGUAAAUUGGAAGAG UU U GUU C A AGGGA AC CUU GAGAGAGA AU GU A U GGA AGA A A AGU GU AGUUUU G A A GAAGC AC GAGAAGUUUUU GAAAACACUGAAAGAACAACUGAAUUUUGGAAGCAG UAUGUUGAUGGAGAUCAGUGUGAGUCCAAUCCAUGUUUAAAUGGCGGCAGUUGC A AGGAU GAC AUU AAUU C CU AU GA AU GUU GGU GU C CCUUU GGAUUU GA AGGA A AG A ACU GU GA AU U AGAU GU A AC A U GU AAC A U U A AGA AU GGC AGAU GCGAGC AGUUU UGUAAAAAUAGUGCUGAUAACAAGGUGGUUUGCUCCUGUACUGAGGGAUAUCGA CUU GC AGAAA ACC AGA AGUCCU GU GAACC AGC AGU GCC AUUUCC A U GU GGAAGA GUUUCUGUUUCACAAACUUCUAAGCUCACCCGUGCUGAGGCUGUUUUUCCUGAUG U GGACU A U GU A A AUU CU ACU GA AGCU GA A ACC AUUUU GGAU A AC AU C ACU CAA A GC AC CC A A U C A U UU A AU GACUU C ACU CGGGUU GUU GGU GGAGA AGAU GC C A A AC C AGGU C A AU U CC CUU GGC AGGUU GUUUU GA AU GGU A A AG UU GAU GC AUU CU GU G GAGGCU CUAU CGUUAAU GAAA AA U GGAUU GUA ACU GCU GCCC ACU GU GUU GA AA CU GGU GUU A A A AUU AC AGUU GU C GC AGGU GA AC AU A AU AU U GAGGAGAC AGA AC AUAC AGAGC A AAAGCGAAAU GU GAUU CGAAUUAUUCCU C ACC AC AACUAC AAU G

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ARNm de argininosuccinato sintetasa humana optimizada con codones (ASS1):

X AU GAGC AGC AAGGGC AGCGU GGU GCU GGCCU AC AGCGGCGGCCU GGAC ACC AGC UGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCA ACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGG CGCC AAGAAGGU GUU C AU CGAGGAC GU GAGCCGCGAGUU CGU GGAGGAGUU C AU CUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACC AGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGG GCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGC AAGGGC AACGACCAGGUGCGCUU CGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGC AUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCA AGCAGCACGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGA GAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAG GCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCC CGAC AU CCU GGAGAU CGAGUU C A AGAAGGGCGUGCCCGU GAAGGU GACC A ACGU GAAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAG GU GGCCGGCAAGCAC GGCGU GGGCCGC AU CGAC AU CGU GGAGAACCGCUU C AU CG GCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGC CCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAG GGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCG AGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAA GGU GC AGGU GAGCGU GCU GAAGGGCC AGGU GU AC AUCCU GGGCCGCGAGAGCCCC CU GAGC CU GUAC A AC GAGGAGCU GGU GAGC AU GA ACGU GC AGGGCGACUACGAG CCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACC ACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGAY (SEQ ID NO.: 2)

ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) optimizado por codones:

XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAA GACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGC CCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGA GUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAA UACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCC GUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACA ACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGU GAGC A AG A AAGGGCU GC A AA AGAU CCU C AACGU GC A AA AGAAGCUACCGAU C AU ACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUG UACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGC CCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAG UACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUC AGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCC UCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUU GAU CU GC GGCUUU C GGGU C GU GCU C AU GUAC C GCUU C GAGGAGGAGCUAUUCUU GCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUU AGCUUCUXJCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACG AGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAA ACGCUUeCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGC GCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGG UGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUG UGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGU UAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGC GGC GAC AU C GC CU ACU GGGACGA GGAC GAGC ACUTI CULI C AU C GU GGACCGGCU GA AGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAU CCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGAC GAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGA CCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCU GCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUU GGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUC GCCGUGUAAY (SEQ ID NO.: 3)

ARNm de la neurona motora 1 de supervivencia humana (SMN) optimizado con codones:

XAUGGCCAUGAGCAGCGGAGGCAGCGGCGGAGGAGUGCCCGAGCAGGAGGACAG CGUGCUGUUCAGGAGAGGCACCGGCCAGAGCGAUGACAGCGAUAUCUGGGACGA UACCGCUCUGAUCAAGGCCUACGACAAGGCCGUGGCCAGCUUCAAGCACGCCCUG A A A A A C GGC G A C AU CU GC GA GA C C A GC GGC A A GC C C A A G A C A A C C C C C A A G A G A A AGCCCGCCAAGAAGAAUAAGAGCCAGAAAAAGAACACCGCCGCCAGCCUGCAGCA GUGGAAGGUGGGCGACAAGUGCAGCGCCAUCUGGAGCGAGGACGGCUGCAUCUA CCCCGCCACCAUCGCCAGCAUCGACUUCAAGAGAGAGACCUGCGUGGUCGUGUAC ACCGGCUACGGCAACAGAGAGGAGCAGAACCUGAGCGACCUGCUGAGCCCCAUUU GU GAGGU GGC C AAU AACAUCGA ACAGA AC GCC CAGGAGAAC GAGA AU GAA AGCC AGGUGAGCACCGACGAGAGCGAGAACAGCAGAUCUCCUGGCAACAAGAGCGACAA CAUCAAGCCUAAGUCUGCCCCUUGGAACAGCUUCCUGCCCCCUCCUCCACCCAUG CCCGGACCCAGACUGGGACCCGGAAAACCUGGCCUGAAGUUCAACGGACCACCUC CCCCUCCACCUCCUCCCCCACCUCAUCUCCUGAGCUGCUGGCUGCCACCCUUCCCC AGCGGACCCCCUAUCAUCCCACCACCCCCUCCCAUCUGCCCCGACAGCCUGGACGA CGCCGAUGCCCUGGGCAGCAUGCUGAUCAGCUGGUACAUGAGCGGCUACCACACA GGAUACUACAUGGGCUUCAGACAGAACCAGAAGGAGGGCAGAUGCUCCCACUCCC UGAACUGAY (SEQ ID NO: 4)

Secuencias UTR de 5 'y 3'

X (Secuencia UTR 5') =

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC

Y (Secuencia U TR 3 ) = CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCC ACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU (SEQ ID NO.: 6)

GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCA CUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU (SEQ ID NO.: 7)

ARNm de CFTR humano optimizado con codones de Hisio C-terminal ("His ¹⁰" divulgado como SEQ ID NO: 11):

XAUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCA UGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGAC AUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAAC GGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACU GAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGG GGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUAC GACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGU GUI RJGCUUUUC AIJC GUC A GA ACA CUUUUGUUGC AUCC A GC A AUCUUC GGCCUCC A UCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGAC ACU GA A ACU CUC GU C GC GGGU GUU GGAUA AGAUUU C C AU C GGU C AGUU GGU GU C CCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUC GUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUG UUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUU CAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAA AUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCA A A GC C Lí A U U GC li GGG A A G A A GC IIA U GG A G A A G AIIG A U U G A A A A C C U C C GC C A A A 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AGCU CGAUU GAU GU GGAU AGC CU GAU GAGGU CCGUUU CG AGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACG A A ACC CU AU A A GAAU GGGC A AU U GAGU A AGGU AAU GAU C A U C GAGA ACAGU C AC GU GA AGA AGGAU GAC AU CU GGC CU AGCGGGGGU C AGAU GAC C GU GA AGGAC CU G ACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCA UUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGA CGUU GCU GU CGGCCUU CUU GAGACUU CU GA AU AC AGAGGGU GAGAU CC AGAU CG ACGGCGUUU CGU GGGAUAGC AU C ACCUU GC AGC AGU GGCGGAAAGCGUUU GGAG UAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCC U U AU GAAC AGU GGU C AGAU C A AGAGAUUU GGA A AGU CGCGGAC GAGGUU GGC CU U CGGAGU GU AAU CGAGC AGUUU CCGGGAAAACU CGACUUU GUCCUU GUAGAU GG GGGAUGCGU CCU GUCGC A U GGGC ACAAGC AGCU C AU GU GCCUGGCGCGAUCCGU C CUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGG UAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGG U GAUU CU CU GU GAGC AU C GU AU CGAGGC C AU GCU CGA AU GC C AGC A AUUU CUU G 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ARNm de CFTR humano optimizado con codones:

XAUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCA UGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGAC AUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAAC GGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACU GAGA AGGU GCUU CUU CU GGC GGUU C AU GUU CU ACGGU A U CUU CUU GU AU CU CGG GGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUAC GACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGU GUUU GCUUUU C AUCGU C AGAAC ACUUUU GUUGC AU CC AGC AAU CUUCGGCCU CC A U C AC AU CGGU AU GC AGAU GCGA AU CGCU AU GUUU AGCUU GAU CU ACAAAAAGAC ACU GA AACU CU CGUCGCGGGU GUU GGAU AAGAUUUCC A U CGGU C AGUU GGU GU C CCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUC GU GU GGAUUGCCCCGUU GC AAGU CGCCCUUUU GAU GGGCCUU AUUU GGGAGCU G UU GC AGGC AU CU GC CUUUU GU GGCCU GGGAUUU CU GAUU GU GUU GGC AUU GUUU CAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAA AU CUCGGAAAGACU CGU C AU C ACUU CGGA AAU GAU CGA A A AC AU CC AGU CGGU C A AAGCCUAUU GCU GGGA AGAAGCUAU GGAGAAGAU GAUU GAAA ACCU 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C ACCGUUU GGAU ACCU CGACG UAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUA AGACGAGAAU CCU GGU GAC AU C AAA AA U GGAAC ACCUUA AGA AGGCGGAC A AGA UCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCA AAACUU GC AGCCGGACUU CU C A AGC A A ACU C AU GGGGU GU GACU C AUUCGACC AG UU C AGCGCGGAACGGCGGAACU CGAU CUU GACGGAAACGCU GC ACCGAUU CU CGC UUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGC AGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACU C A AU U C GC A AGUU CU C A AU C GU CC AGA A A ACU C C ACU GC AGAU GA A U GGA AU U G AAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGA GCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUU CAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGG GGCAAAACAUU C ACC GC AAA ACGACGGC CU C AACGAGA A A AGU GU C ACUU GC ACC CCAGGCGAAUUU GACU GAACUCGAC AU CUAC AGCCGUAGGCUUU CGC AAGAAACC GGACUU GAGAU C AGC GA AGA A AU C A AU GA AGA AGAUUU GA A AGAGU GUUU CUUU GAU GAC A U GGAAU C AA U CCC AGCGGU GAC AACGU GGAAC AC AUACUUGCGUUAC AU C ACGGU GC AC 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Secuencia codificante de ARNm de CFTR humano optimizado con codones con una secuencia líder de hormona de crecimiento (en cursiva y subrayada):

AUGGCCACUGGAUCAAGAACCUCACUGCUGCUCGCUUUUGGACUGCUUUGCCUGCC CUGGUUGCAAGAAGGA UCGGCUUUCCCGACCA UCCCACUCUCCAXJGCAGCGGXJCCC CGCU CGA AAAGGCC AGU GUCGU GUCC AA ACU CUU CUU CU C AU GGACUCGGCCUAU CCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCC UCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGC GAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCU U CU GGCGGUU C AU GUU CUACGGU AU CUU CUU GUAU CU CGGGGAGGU C AC A A AAG CAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAA AGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAU CGU C AGA AC ACUUUU GUU GC AU C C AGC AAU CUU CGGCCUCC AU C AC AUCGGU AU G CAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCG UCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAU A ACCU C A AC A A AUU C GAU GAGGGACU GGC GCU GGC AC A U U U C GU GU GGAUU GC CC CGUU GC A AGU CGCCCUUUU GAIJ GGGCCUUAUUU GGGAGCU GUU GC AGGC AU CU G CCUUUU GU GGCCU GGGAUUU CU GAUU GU GUU GGC AUU GUUU C AGGCU GGGCUU G GGCGGAU GAU GAU GA AGU AU CGCGAC C AGAGAGC GGGU A A AAU CU 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Se mezclaron alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de cKK-E12, DOPE, Chol y DMG-PEG2K en una relación molar de 40:30:25:5 y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de FIX, ASS1 o FFL a partir de una solución madre de 1 mg/ml. La solución de lípidos se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8° C. La concentración final de ARNm de FIX fue de aproximadamente 0,77 mg/ml de ARNm de FIX (encapsulado), Zave = 76 nm, PDI = 0,08. La concentración final de ARNm de ASS1 fue de aproximadamente 0,64 mg/ml de ARNm de ASS1 (encapsulado), Zave= 78 nm (Dv (50) = 46 nm; Dv (90) = 96 nm). La concentración final de ARNm de FFL fue de aproximadamente 1,31 mg/ml de ARNm de FFL (encapsulado), Zave = 75 nm, PDI-0,11. La concentración final de ARNm de SMN fue de aproximadamente 1,85 mg/ml de ARNm de SMN (encapsulado). Tamaño de partícula medio (Zave) = 71 nm, (el tamaño de partícula para el 50% de las partículas fue de 44 nm o menos (Dv(50)) = 44 nm; y el tamaño de partícula para el 90% de las partículas fue de 93n o menos (Dv (90) = 93 nm)).

Ejemplo comparativo 2. Administración de nanopartículas de liposomas cargadas con ARNm

Este ejemplo comparativo ilustra métodos ejemplares de administración de nanopartículas de liposomas cargadas con ARNm y métodos para analizar el ARNm administrado y la proteína expresada posteriormente en varios tejidos objetivo in vivo.

Todos los estudios se realizaron usando ratones macho CD-1 de aproximadamente 6-8 semanas de edad al comienzo de cada experimento. Las muestras se introdujeron mediante una única inyección de bolo en la vena de la cola de una dosis total equivalente de 1,0 mg/kg (o especificado de otro modo) de ARNm de FIX, FFL o ASS1 encapsulado. Los ratones se sacrificaron y se perfundieron con solución salina en los puntos temporales designados.

Se recogieron varios tejidos de órganos como el hígado, el bazo, el riñón y el corazón de cada ratón, se distribuyeron en partes separadas y se almacenaron en formalina tamponada neutra al 10% o se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80° C para su análisis.

Todos los animales se sacrificaron mediante asfixia por CO² en los puntos temporales designados después de la administración de la dosis (± 5%) seguido de la toracotomía y la recogida de sangre cardiaca terminal. Se recogió sangre completa (volumen máximo obtenible) mediante punción cardíaca en animales sacrificados en tubos separadores de suero, se dejó coagular a temperatura ambiente durante por lo menos 30 minutos, se centrifugó a 22° C ± 5° C a 9300 g durante 10 minutos, y se extrajo suero. Para las recogidas de sangre intermedias, se recogieron aproximadamente 40-50 pl de sangre completa mediante punción en la vena facial o corte de cola. Las muestras recogidas de animales sin tratamiento se usaron como niveles de ASS1 de referencia para la comparación con los animales de estudio.

Análisis de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

A. ELISA de FIX humana

La cuantificación de la proteína FIX se realizó siguiendo los procedimientos descritos para el kit de ELISA FIX humano (AssayMax, Assay Pro, N° de catálogo EF1009-1).

B. ELISA de ASS1 humana

Se siguieron procedimientos estándar de ELISA empleando IgG anti-ASS1 2D1-2E12 de ratón como anticuerpo de captura con IgG anti-ASS1 #3285 de conejo como anticuerpo secundario (detección) (Shire Human Genetic Therapies). Se usó IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) para la activación de la solución de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). La reacción se inactivó usando H2SO4 2N después de 20 minutos. La detección se monitorizó mediante absorción (450 nm) en un instrumento Molecular Device SpectraMax. Se usaron suero y órganos de ratón no tratados y proteína ASS1 humana como controles negativos y positivos, respectivamente.

Mediciones del bioluminómetro IVIS

Para la luminiscencia visual en ratones tratados, se siguieron varios pasos. Inicialmente se empleó anestesia con vaporizador de isoflurano al 1-3% (habitualmente @2,5%). Usando un microaspersor, se administraron 50 pl/animal de luciferina en PBS a 60 mg/ml por vía intratraqueal/intranasal. Se dejó que la luciferina se distribuyera durante 5-10 minutos. Los animales se colocaron en una cámara de isoflurano hasta que fueron anestesiados. Los animales anestesiados se colocaron en la cámara de imagenología IVIS en decúbito dorsal y se colocaron en el colector. Se tomaron fotografías de ratones. En estos Ejemplos comparativos, los ajustes de adquisición que proporcionaron la mayor sensibilidad fueron: altura de la cámara en el nivel D, F/Stop en f1, agrupamiento en alta resolución y tiempo de exposición en 5 minutos. Las exposiciones se repitieron hasta 3 veces (5, 10 y 15 minutos después de la inyección de luciferina).

Análisis de hibridación in situ (ISH)

La hibridación in situ se realizó usando tecnología de sonda "ZZ". Las sondas se generaron basándose en la secuencia optimizada con codones de ARN mensajero humano. Los tejidos se fijaron durante 24-48 horas en formalina tamponada neutra al 10% y se insertaron en parafina. La detección positiva del ARNm deseado se logró a través de 6 pasos de amplificación consecutivos seguidos de visualización cromogénica usando 3,3'-diaminobencidina (DAB). La señal positiva se comparó con la del ratón no tratado.

Ejemplo comparativo 3. Producción in vivo altamente eficaz de proteínas terapéuticas

Este ejemplo comparativo demuestra una producción sostenida y altamente eficaz de proteínas codificadas por ARNm administrado por liposomas que incorporan los lípidos catiónicos descritos en la presente (por ejemplo, CKK-E12) en suero y varios tejidos de órganos.

Resultados de la producción de proteína FIX humana in vivo

La producción de proteína FIX humana a través de nanopartículas lipídicas basadas en cKK-E12 cargadas con ARNm de hFIX se probó en ratones CD-1 como una única inyección intravenosa en bolo. La Figura 1 representa la cantidad de proteína FIX humana detectada mediante ELISA cuando se tratan ratones con nanopartículas lipídicas basadas en cKK-E12 cargadas con ARNm de FIX humana en comparación con una nanopartícula lipídica basada en C12-200 que encapsula ARNm de hFIX. Los ratones se sacrificaron veinticuatro horas después de la inyección y se recogieron los órganos (como se ha descrito anteriormente).

Se ha demostrado que las nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 son un vehículo eficaz para administrar y expresar ARNm in vivo (ver la publicación de solicitud PCT N° WO2012170930). Sorprendentemente, como se representa en la Figura 1, las nanopartículas lipídicas basadas en cKK-E12 son incluso más eficaces en la administración de ARNm de FIX humana in vivo, lo que resulta en una expresión de proteína casi un 50% más alta detectada en el plasma de los ratones tratados, en comparación con las nanopartículas lipídicas basadas en C12-200.

La Figura 2 muestra los resultados de un experimento de respuesta a dosis representado por la cantidad de proteína FIX humana detectada mediante ELISA cuando se tratan ratones con nanopartículas lipídicas basadas en cKK-E12 cargadas con ARNm de FIX humana a varias dosis. Se extrajo sangre de los ratones a las 6 horas y se sacrificaron veinticuatro horas después de la inyección y se recogieron los órganos (como se ha descrito anteriormente).

Se logró una clara respuesta a la dosis al medir los niveles hepáticos de la proteína FIX humana. El intervalo de dosificación fue de 0,10 a 3,0 mg/kg de ARNm de FIX humana encapsulado. Estos datos demuestran la capacidad de las nanopartículas lipídicas para administrar de manera eficiente ARN mensajero, liberar la carga útil y procesar este ARNm exógeno mediante la traducción para producir proteína FIX humana, que luego se secreta en el torrente sanguíneo. Los niveles de proteína FIX humana están muy por encima de los niveles terapéuticos (>100 ng/ml de plasma) y superan los niveles fisiológicos normales (~5 ug/ml de plasma) cuando se dosifican a una dosis de 1,0 mg/kg o más. Además, el tiempo de residencia en plasma de esta proteína humana se mantiene durante por lo menos 24 horas después de la administración.

Resultados de la producción de proteína ASS1 humana in vivo

La producción de proteína ASS1 humana a través de nanopartículas lipídicas basadas en cKK-E12 cargadas con ARNm de hASS1 con codón optimizado se probó en ratones CD-1 como una única inyección intravenosa en bolo. La Figura 3 representa la cantidad de proteína ASS1 humana detectada mediante ELISA cuando se tratan ratones con nanopartículas lipídicas basadas en cKK-E12 cargadas con ARNm de ASS1 humana a varias dosis. Los ratones se sacrificaron veinticuatro horas después de la inyección y se recogieron los órganos (como se ha descrito anteriormente).

Se logró una clara respuesta a la dosis al medir los niveles hepáticos de la proteína ASS1 humana. Como se muestra en la Tabla 5, el intervalo de dosificación fue de 0,10 a 2,0 mg/kg de ARNm de ASS1 humana encapsulado en nanopartículas lipídicas de cKK-E12. Estos datos demuestran la capacidad de las nanopartículas lipídicas para acumularse en el hígado y liberar la carga útil de ARNm y el hígado para procesar este ARNm exógeno a través de la traducción para producir proteína ASS1 humana.

Tabla 5. Valores brutos de proteína ASS1 humana medidos mediante análisis ELISA (como se representa en la Figura 1). El ARNm de ASS1 humana optimizado con codones se administró a través de nanopartículas lipídicas basadas en cKK-E12. Las dosis se basan en ARNm de ASS1 encapsulado. Los valores se representan como nanogramos de proteína ASS1 humana por miligramo de proteína total en el hígado. BLD = Por debajo del límite de

Aunque la sensibilidad del ELISA tiene limitaciones a valores más bajos, el análisis de transferencia Western permite una visualización clara de la proteína ASS1 humana en dosis más bajas (0,3-3,0 mg/kg) (ver Figura 4). La Figura 4 representa una comparación de los niveles de proteína ASS1 humana en el hígado en función de la dosis mediante análisis de transferencia Western con una única dosis intravenosa de nanopartículas lipídicas de cKK-E12 encapsuladas en ARNm de ASS1 humana. Los ratones CD1 se sacrificaron 24 horas después de la administración y se recogieron y analizaron los hígados como se ha descrito anteriormente.

Para comprender mejor la capacidad de las nanopartículas lipídicas encapsuladas en ARNm de ASS1 para facilitar la administración de ARNm a órganos seleccionados (hígado), se realizó un análisis farmacocinético, monitorizando los niveles de proteína ASS1 humana en el hígado durante un período de una semana. La Figura 5 representa la cantidad de proteína ASS1 humana detectada en el hígado en varios puntos temporales hasta 7 días después de la administración de nanopartículas lipídicas cargadas con ASS1 humana (cKK-E12). Esto se logró como una dosis única (1,0 mg/kg de ARNm encapsulado) administrada por vía intravenosa.

En este caso, observamos un nivel sérico máximo de proteína ASS1 humana aproximadamente a las 24-48 horas posteriores a la administración. Todavía se observaron niveles medibles de proteína 1 semana después de la administración, según lo determinado por ELISA y transferencia Western (Figuras 5 y 6, respectivamente). La Figura 6 representa una comparación de los niveles de proteína ASS1 humana en el hígado a lo largo del tiempo mediante análisis de transferencia Western con una única dosis intravenosa de nanopartículas lipídicas encapsuladas en ARNm de ASS1 humana (dosis de 1,0 mg/kg).

La detección directa del ingrediente farmacéutico activo (ARNm de ASS1) en los hígados de los ratones tratados se logró usando métodos basados en hibridación in situ (ISH). Como se demostró en las Figuras 7 y 8, el ARN mensajero de ASS1 humana exógena pudo detectarse en niveles altos en el punto temporal más temprano probado (30 minutos) y la señal permaneció fuerte durante 48 horas después de la dosificación. Además, el ARNm de ASS1 humana todavía era detectable 72 horas después de la administración.

Además de ISH, la detección de la proteína ASS1 humana resultante se logró usando medios inmunohistoquímicos (IHC). Usando un anticuerpo monoclonal de ratón (02D2-2E12) para la unión específica, puede observarse fácilmente la presencia de la proteína ASS1 humana objetivo en el citoplasma de los hepatocitos de los hígados tratados. La Figura 9 muestra la tinción inmunohistoquímica de la proteína ASS1 humana en hígados de ratón tratados 24 horas después de la administración.

Administración in vivo de ARNm de FFL mediante nebulización

Para evaluar si eran factibles rutas de administración adicionales, se encapsuló ARNm de FFL en liposomas cKK-E12 y se nebulizaron esos liposomas. Como se muestra en la Figura 10, es posible nebulizar eficientemente nanopartículas lipídicas basadas en cKK-E12 que encapsulan el ARNm. La Figura 10 representa ratones tratados con luciferina 24 horas después de la exposición a nanopartículas lipídicas de cKK-E12 cargadas con ARNm de FFL nebulizado.

Ejemplo comparativo 4. Administración al SNC de ARNm de hSMN-1

Este ejemplo proporciona formulaciones de liposomas de cKK-E12 ejemplares para la administración y expresión eficaces de ARNm en el SNC. Específicamente, el ejemplo comparativo demuestra la administración de ARNm de la neurona motora 1 (hSMN-1) de supervivencia humana en varios tejidos del cerebro y la médula espinal.

Material de ARN mensajero

El ARN mensajero de la supervivencia de la neurona motora-1 (hSMN-1) en humanos optimizada por codones (ver SEQ ID NO: 4) se sintetizó mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmídico que codifica el gen, seguido de la adición de una estructura del caperuza 5’ (Cap1) (Fechter, P.; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) y una cola poli (A) 3’ de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud (SEQ ID NO: 15) según se determina mediante electroforesis en gel. Las regiones no traducidas 5' y 3' presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente, y se definen como se indica en el Ejemplo 1.

Protocolo de formulación

Las nanopartículas lipídicas (LNP) se formaron mediante métodos estándar de inyección de etanol (Ponsa, M.; Foradada, M.; Estelrich, J. "Liposomes obtained by the ethanol injection method" Int. J. Pharm. 1993, 95, 51-56). Para los varios componentes lipídicos, se preparó una solución madre etanólica de 50 mg/ml y se almacenó a -20° C. En la preparación de la formulación de nanopartículas lipídicas cKK-E12 enumerada en la Tabla 6, cada componente lipídico indicado se añadió a una solución de etanol para lograr una concentración final predeterminada y una relación molar, y se escaló hasta un volumen final de etanol de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de hSMN-1 a partir de una solución madre de 1 mg/ml. La solución de lípidos se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró y se dializó frente a 1xPBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó entre 2-8°C. La concentración de ARNm de SMN-1 se determinó mediante el ensayo Ribogreen (Invitrogen). La encapsulación de ARNm se calculó realizando el ensayo Ribogreen con y sin presencia de Triton-X 100 al 0,1%. Los tamaños de partícula (la dispersión de luz dinámica (DLS)) y los potenciales zeta se determinaron usando un instrumento Malvern Zetasizer en 1x PBS y soluciones de KCl 1 mM, respectivamente.

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Administración intratecal de nanopartículas de liposomas cargadas con ARNm

Todos los estudios in vivo se realizaron usando ratas o ratones de aproximadamente 6-8 semanas de edad al comienzo de cada experimento. Al comienzo del experimento, cada animal fue anestesiado con isoflurano (1-3%, al efecto) por inhalación. Una vez anestesiados, se afeitó a cada animal en el lugar exacto de la inyección (L4-L5 o L5-L6). Después de la inserción de la aguja, se usó un movimiento reflejo de la cola para indicar la punción de la dura y confirmar la colocación intratecal. Cada animal recibió una única inyección intratecal en bolo de la formulación de prueba enumerada en la Tabla 6. Todos los animales se sacrificaron 24 horas después de la inyección y se perfundieron con solución salina.

Aislamiento de tejidos de órganos para análisis.

A todos los animales se les extrajo todo el cerebro y la médula espinal. El cerebro se cortó longitudinalmente y se colocó en un casete de histología por animal. Toda la médula espinal se almacenó a temperatura ambiente en un tubo de 15 ml que contenía formalina tamponada neutra (NBF) al 10% durante por lo menos 24 horas y no más de 72 horas antes de transferirla a una solución de alcohol de grado histológico al 70%. Cada muestra de médula espinal se cortó en secciones cervical, torácica y lumbar. Cada sección de la médula espinal se cortó por la mitad y ambas mitades se colocaron en casetes individuales por sección (cervical, torácica y lumbar) para su procesamiento. Los tres casetes se incorporaron en un bloque de parafina por animal. Cuando fue aplicable, se congelaron rápidamente porciones de cerebro y médula espinal y se almacenaron a -80° C.

Análisis de transferencia Western de hSMN-1

Se siguieron procedimientos estándar de transferencia Western empleando varios anticuerpos que reconocen la proteína hSMN, como: (A) anticuerpo anti-SMN 4F11 a una dilución 1:1.000; (B) anticuerpo a-SMN Pierce PA5-27309 a una dilución 1:1.000; y (C) anticuerpo a-SMN LSBio C138149 a una dilución 1:1.000. Para cada experimento se transfectó un microgramo de ARNm de hSMN en ~1x106 células BHK-21 usando Lipofectamine 2000. Las células se trataron con OptiMem y se recogieron 16-18 horas después de la transfección. Los lisados celulares se recogieron, procesaron y cargaron en un gel de Tris glicina al 8-16%. El gel se transfirió usando una membrana de PVDF y se trató con el anticuerpo primario respectivo. Se usó anticuerpo de HRP de cabra anti-ratón como anticuerpo secundario a una dilución de 1:10.000 durante 45 minutos a temperatura ambiente seguido de lavado y desarrollo. Los datos demuestran que cada anticuerpo probado mostró una señal fuerte para hSMN-1 y era específico para SMN humano, como lo indica la ausencia en una señal de reacción cruzada para células BHK no tratadas (Figura 11).

Análisis de hibridación in situ (ISH)

El tejido de cada muestra representativa se analizó para el ARNm de hSMN-1 usando un análisis de hibridación manual in situ, realizado usando tecnología de sonda RNAscope® (Advanced Cell Diagnostic) "ZZ". Las sondas se generaron basándose en la secuencia de codones optimizados del ARN mensajero de SMN humano (SEQ ID NO: 4). Brevemente, el ensayo RNAscope® es un ensayo de hibridación in situ diseñado para visualizar moléculas de ARN individuales por célula en tejido fijado con formalina e incrustado en parafina (FFPE) montado en portaobjetos. Cada muestra de tejido incrustada se pretrató de acuerdo con el protocolo del fabricante y se incubó con una sonda de ARN de hSMN-1 específica del objetivo. Se demostró que la sonda hSMN-1 era específica para SMN-1 humana y tenía poca o ninguna reactividad cruzada con SMN-1 de ratón o rata. Una vez unida, la sonda de hSMN-1 hibrida con una cascada de moléculas de amplificación de señal, a través de una serie de 6 rondas consecutivas de amplificación. Luego, la muestra se trató con una sonda marcada con HRP específica para el casete de amplificación de señal y se analizó mediante visualización cromática usando 3,3'-diaminobencidina (DAB). Se usó una sonda específica para ubiquitina C como control positivo. La señal de SMN positiva se comparó con la del tejido de rata o ratón no tratado y tratado con vehículo de control. Las muestras teñidas se visualizaron bajo un microscopio de campo brillante estándar.

Análisis inmunohistoquímico

Se administraron nanopartículas lipídicas cargadas de ARNm de SMN-1 humana a ratas mediante inyección intratecal, y se recogieron y procesaron muestras de tejido 24 horas después de la administración de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. A continuación, se analizaron muestras de tejido espinal de rata para determinar la expresión de la proteína hSMN-1. Brevemente, se procesó tejido fijo incrustado en parafina y se colocó en portaobjetos. Los portaobjetos fueron desparafinados, rehidratados y la recuperación del antígeno se realizó usando una olla a presión con tampón citrato. Se emplearon varios tampones de bloqueo seguidos de la incubación del anticuerpo primario durante la noche a 4° C, usando el anticuerpo 4F11 a una dilución de 1:2500. Los portaobjetos resultantes se lavaron y se incubaron a temperatura ambiente con el polímero de anticuerpo secundario seguido de lavado y posterior desarrollo de desarrollo de cromógeno. Los datos demuestran que en tan poco como 24 horas después de la administración intratecal de ARNm de hSMN-1, se observa tinción para la proteína SMN-° human cuando se compara con el control sin tratamiento (Figura 13). Esto apoya los descubrimientos previos que demuestran la administración de ARNm de hSMN-1 al tejido espinal. Además, los datos demuestran que una vez administrado a la célula, el ARNm de hSMN-1 se expresa eficazmente para generar la proteína hSMN-1.

Resultados

Los datos presentados en este ejemplo comparativo demuestran que la administración intratecal de liposomas cargados con ARNm de hSMN-1 (por ejemplo, nanopartículas a base de lípidos o polímeros) da como resultado una administración intracelular con éxito de ARNm en neuronas del cerebro y la médula espinal, incluyendo aquellas células difíciles de tratar, como las células del asta anterior y los ganglios de la raíz dorsal.

Los resultados han demostrado que el ARNm encapsulado dentro de una nanopartícula lipídica (por ejemplo, nanopartícula lipídica que comprende cKK-E12) puede administrarse eficazmente a varios tejidos del SNC tras administraciones intratecales. Usando la formulación ejemplar divulgada en la Tabla 6, el ARNm se administró e internalizó eficazmente dentro de varias neuronas de la médula espinal (Figuras 12A-12C), verificado mediante ensayo de hibridación in situ. Sorprendentemente, la administración de ARNm intracelular se demostró en las células neuronales del cuerno anterior de difícil acceso, localizadas profundas dentro de los tejidos de la columna vertebral (Figuras 12A-12C). Se observó poco o ningún fondo con SMN-1 de ratón o rata, lo que indica especificidad para la sonda SMN-1 humana. La señal de SMN positiva se comparó con la del tejido de rata o ratón no tratado y tratado con vehículo de control. Las muestras teñidas se visualizaron bajo un microscopio de campo brillante estándar.

Estos datos demuestran que el enfoque de administración de ARNm basado en nanopartículas lipídicas o poliméricas descrito en la presente fue capaz de penetrar con éxito la membrana celular compleja y densa de las neuronas de la médula espinal y administrar la carga útil de ARNm para la producción de proteínas codificadas dentro de las neuronas. Fue particularmente sorprendente que el método de administración de ARNm descrito en la presente tuviera el mismo éxito en la penetración de neuronas difíciles de tratar, como las células del asta anterior y los ganglios de la raíz dorsal. Por tanto, los datos presentados en la presente demuestran que las nanopartículas lipídicas o polímeros, como las que comprenden cKK-E12, pueden servir como una opción prometedora para administrar ARNm a células neuronales en el tratamiento de una enfermedad del SNC. En particular, el presente ejemplo comparativo demuestra que las nanopartículas cargadas con ARNm de hSMN pueden administrarse eficazmente a las neuronas, incluyendo aquellas neuronas difíciles de tratar en la médula espinal, y pueden usarse para la producción de proteína de SMN y el tratamiento de la atrofia muscular espinal.

Ejemplo 5. Administración de ARNm de CO-CFTR-C-Hisio in vivo a ratones knockout para CFTR Síntesis de ARN mensajero. Para el experimento, se sintetizaron ARNm del regulador de la conductancia transmembrana de fibrosis quística humana optimizado con codones marcado con His¹⁰ en el extremo C terminal (CO-CFTR-C-His ⁰) (SEQ ID NO: 8) ("His¹⁰" divulgado como SEQ ID NO: 11) y de CFTR (CO-CFTR) humano optimizado con codones no marcado (SEQ ID NO: 9) mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmídico usando un método estándar. Los ARNm usados en este ejemplo y en el Ejemplo 6 se produjeron mediante IVT en el que el 25% de los residuos U eran 2-tiouridina y el 25% de los residuos C eran 5-metilcitidina.

Análisis de la proteína CFTR humana producida mediante nanopartículas cargadas de ARNm administradas por vía intratraqueal. Para el estudio, se usaron ratones knockout para CFTR. La formulación de ARNm de CFTR o el control del vehículo se introdujeron usando un nebulizador de chorro PARI Boy. Los ratones se sacrificaron y se perfundieron con solución salina, después de un período de tiempo predeterminado, para permitir la expresión de proteínas del ARNm.

Formulación de PEI. La formulación de PEI se ha usado para administrar ARNm de CFTR al pulmón y se usó como control en este experimento. Las formulaciones de nanopartículas poliméricas con PEI ramificada de 25 kDa se prepararon de la siguiente manera. La cantidad requerida de ARNm se diluyó justo antes de la aplicación en agua para inyección (Braun, Melsungen) hasta un volumen total de 4 ml y se añadió rápidamente a 4 ml de una solución acuosa de PEI ramificada de 25 kDa usando una pipeta en una proporción N/P de 10. La solución se mezcló pipeteando arriba y abajo diez veces y se nebulizó como dos fracciones separadas de 4,0 ml una tras otra en los pulmones de los ratones usando el nebulizador indicado.

Formulación de cKK-E12. Para el experimento de nanopartículas a base de lípidos, se creó una formulación de lípidos usando ARN de CO-CFTR-C-His¹⁰ en una formulación de cKK-E12:DOPE:Cho1 :PEGDMG2K (cantidades relativas 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg)). La solución se nebulizó en los pulmones de los ratones usando el nebulizador indicado.

Administración por nebulización (aerosol) de ARNm de CO-CFTR-C-His¹⁰ humano. Los materiales de prueba de CFTR se administraron mediante una única inhalación de aerosol a través del nebulizador de chorro PARI Boy (volumen de dosis nominal de hasta 8 ml/grupo). El material de prueba se administró a una caja que contenía todo el grupo de animales (n = 4) y se conectó al flujo de oxígeno y al sistema depurador.

Administración de ARNm de CO-CFTR-C-Hisw humano. El ARNm de CFTR se preparó de la manera descrita anteriormente. Se colocaron cuatro ratones knockout para CFTR en una caja de cámara de aerosol y se expusieron a 2 mg de ARNm de CFTR humano no modificado optimizado con codones total (que comprende la secuencia codificante de la SEQ ID NO: 8) mediante nebulización (nebulizador de chorro Pari Boy) en el transcurso de aproximadamente una hora. Los ratones se sacrificaron 24 horas después de la exposición.

Eutanasia. Los animales se sacrificaron mediante asfixia por CO² en momentos representativos después de la administración de la dosis (± 5%) seguido de la toracotomía y exanguinación. Se recogió sangre completa (volumen máximo obtenible) mediante punción cardíaca y se desechó.

Perfusión. Después de la exanguinación, todos los animales se sometieron a perfusión cardíaca con solución salina. Brevemente, la perfusión intracardíaca de todo el cuerpo se realizó insertando una aguja de calibre 23/21 unida a una jeringuilla de 10 ml que contenía solución salina en la luz del ventrículo izquierdo para la perfusión. Se hizo una incisión en la aurícula derecha para proporcionar una salida de drenaje para la perfusión. Se aplicó una presión suave y constante al émbolo para perfundir al animal después de que la aguja se hubiera colocado en el corazón. Se aseguró un flujo adecuado de la solución de lavado cuando el perfundido que sale fluye trasparente (libre de sangre visible), lo que indica que la solución de lavado ha saturado el cuerpo y el procedimiento se ha completado.

Recogida de tejidos. Después de la perfusión, se extrajeron los pulmones (derecho e izquierdo) de todos los animales. Ambos pulmones (derecho e izquierdo) se congelaron al instante en nitrógeno líquido y se almacenaron por separado a una temperatura nominal de -70° C.

Expresión de CFTR humano en CO-CFTR-C-Hisw en ratones knockout para CFTR. La expresión de CFTR

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un ARNm que codifica un regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), encapsulado dentro de un liposoma para su uso en un método de tratamiento de la fibrosis quística, en donde el uso comprende administrar a un sujeto con necesidad de tratamiento la composición de tal manera que la administración de la composición da como resultado la expresión del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) codificado por el ARNm en uno o más tejidos afectados por la fibrosis quística;

en donde el liposoma comprende DOPE, colesterol, DMG-PEG2K y un lípido catiónico que es cKK-E12:

la proporción de cKK-E12: DOPE: colesterol: DMG-PEG2K es 40:32:25:3 en relación molar,

la composición se administra por vía pulmonar mediante aerosolización, inhalación o nebulización,

la composición se formula como partículas respirables, lípido nebulizable o polvo seco inhalable, y

el ARNm comprende uno o más nucleótidos modificados, en donde el uno o más nucleótidos modificados comprenden pseudouridina, N-1-metil-pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, y/o 2-tiocitidina.

2. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el lípido catiónico constituye el 30-50% del liposoma en relación molar, opcionalmente en donde el lípido catiónico constituye el 40% del liposoma en relación molar.

3. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el liposoma tiene un tamaño de menos de 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm o 50 nm.

4. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la expresión de la proteína codificada por el ARNm es detectable:

(i) 3 horas después de la administración; y/o

(ii) 6 horas después de la administración; y/o

(iii) 12 horas después de la administración; y/o

(iv) 24 horas después de la administración; y/o

(v) 1 semana después de la administración.

5. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ARNm tiene una longitud igual o mayor de 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, o 5 kb.

6. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ARNm se administra a una dosis:

(i) que varía de 0,1 - 2,0 mg/kg de peso corporal; o

(ii) de o menos de 1,0 mg/kg de peso corporal; por ejemplo, de o menos de 0,5 mg/kg de peso corporal, o de o menos de 0,3 mg/kg de peso corporal.