CN102015027A - 与人慢性淋巴细胞性白血病(ccl)相关的微rna特征和其用途 - Google Patents
与人慢性淋巴细胞性白血病(ccl)相关的微rna特征和其用途 Download PDFInfo
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Abstract
公开了用于诊断、预后和/或治疗白血病相关疾病的方法和组合物。
Description
发明者：Carlo M.Croce，George Calin
交叉参考相关申请
本申请要求2008年2月28日提交的美国临时申请61/067,406的权益，其全部公开内容明确地通过引用合并入本文。
关于联邦政府支助的研究的声明
本发明是在NCI基金CA 76259和CA81533下由政府支助进行的。政府在本发明中具有某些权利。
本发明的技术领域和工业适用性
本发明总地说来涉及分子生物学领域。本发明的某些方面包括在白血病相关病症的诊断、治疗和预后中的应用。
发明背景
不承认本部分中公开的背景技术在法律上构成了现有技术。
微RNA(miRNA)是大约19至24nt的短非编码RNA，其通过与主要(但非唯一地)位于靶mRNA的3′UTR中的互补序列不完全碱基配对来调控基因表达。MiRNA代表真核细胞中通过诱导翻译抑制和转录物降解进行调控的基因的主要调控家族之一(1-4)。已开发了不同的算法例如TargetScan(5)、PicTar(6)和Diana microT(7)来鉴定miRNA的靶，但这些预测只有少数已经历实验验证，从而支持用于该目的的生物信息学与生物学策略的组合的基本原理。两个独立的研究预测20-30％的人基因可受miRNA控制(8，9)。正常miRNA表达模式的偏差在人疾病包括癌 症中起着重要作用(关于综述，参见参考文献10-15)。
miR-15a/16-1簇存在于染色体13q14.3(在B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中频繁缺失的基因组区域)，并且该簇的2个成员在大部分CLL患者中共转录和下调(16)。
CLL是具有家族频繁关联的疾病(对于CLL，10-20％的患者具有至少一级亲缘关系)(17)。之前，我们在大约15％的CLL患者中鉴定了几个miRNA(包括miR-16-1)中的种系或体细胞突变，大部分患者具有已知的CLL或其他造血和实体瘤的个人或家族史(18)。我们使用这些发现，连同天然发生CLL的小鼠的NZB品系中异常miR-15a/16-1基因座的鉴定(19)，现于本文中显示该簇也在家族性CLL中起着重要作用。
在miR-15a和miR-16的靶当中，我们鉴定到抗细胞凋亡蛋白Bcl2，其在CLL的恶性，主要地非分裂B细胞(20)中和许多实体恶性肿瘤和恶性血液病(21)中过表达。miR-15-a/16-1的恢复诱导MEG-01(来源于急性巨核细胞性白血病的细胞系)的细胞凋亡(22)。
尽管对治疗此类疾病的疗法进行了相当多的研究，但仍然难以有效地诊断和治疗它们，并且在患者中观察到的死亡率表明，需要改进此类疾病的诊断、治疗和预防。
发明概述
在第一方面，本文中提供了其沉默表征慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中miR-15a/16-1诱导的表型的基因的特征(signature)。
在另一个方面，本文中提供了miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR用于使一个或多个白血病细胞模型和原发性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中的基因失调的用途。
在另一个方面，在本文中提供了使用本文中描述的特征开发CLL的治疗方法的方法。
在另一个方面，在本文中提供了miR-15a和miR-16-1簇作为慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的肿瘤抑制剂的用途。
在另一个方面，在本文中提供了抑制白血病细胞的肿瘤移植物的生 长的方法，其包括将此类细胞暴露于miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR，其中对此类细胞施加了肿瘤抑制功能。
在另一个方面，在本文中提供了在有此需要的受试者中发挥抗白血病作用的方法，其包括通过给受试者施用miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR或其功能性变体来直接沉默IGSF4。
在另一个方面，在本文中提供了CLL与用miR-15a/16-1转染的MEG-01之间共同的基因的特征，其包括图15-表11中所列的一个或多个基因。
在另一个方面，在本文中提供了miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR和miR-29用于治疗CLL的用途。
在另一个方面，在本文中提供了miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR和miR-29在治疗CLL中的用途，其包括靶向MCL1和c-JUN转录物，其中miR-15a/16-1簇对B-CLL细胞的存活的影响增加。
在另一个方面，在本文中提供了减少PDCD4、RAB21、IGSF4、SCAP2和/或蛋白质组学鉴定的蛋白质(Bcl2、Wt1)中的一个或多个的表达的方法，其包括用miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR转染有此需要的细胞。
在另一个方面，在本文中提供了miR-15a/16-1簇直接靶向IGSF4的用途。
在另一个方面，在本文中提供了抑制细胞的生长的方法，其包括在一定条件下将表达IGSF4的细胞与miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR接触以便抑制IGSF5在细胞中的表达。
在某些实施方案中，细胞是癌细胞。
在某些实施方案中，细胞是慢性淋巴细胞性白血病细胞。
在某些实施方案中，细胞在生物中。
在某些实施方案中，生物是动物。
在某些实施方案中，生物经诊断患有癌症。
在另一个方面，在本文中提供了抑制选择的miRNA(已知其抑制一个或多个已鉴定的蛋白质的翻译)的形成的方法，其包括给有此需要的 受试者施用选自miR-15a/16-1簇的一个或多个miR。
在另一个方面，在本文中提供了包括图7-表3中所列的一个或多个miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
在另一个方面，在本文中提供了包括图8-表4中所列的一个或多个miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
在另一个方面，在本文中提供了包括图11-表7中所列的一个或多个miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
在另一个方面，在本文中提供了包括图12-表8中所列的一个或多个miR 15a/16-1调控的基因的CLL特征。
在另一个方面，在本文中提供了包括图13-表9中所列的一个或多个miR 15a/16-1调控的基因的CLL特征。
在另一个方面，在本文中提供了包括图14-表10中所列的一个或多个miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
在另一个方面，在本文中提供了包括图15-表11中所列的一个或多个miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
在另一个方面，在本文中提供了包括图16-表12中所列的一个或多个miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
在另一个方面，在本文中提供了用于确定诊断受试者是否患有或将发生慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的方法，其包括检查受试者的样品并且确定是否存在选自miR15a/16-1簇的miR的表达的正相关。
在另一个方面，在本文中提供了方法，其将本文中描述的特征用于患有或可能发生慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的受试者的诊断、治疗或预后的确定中的一个或多个。
在另一个方面，在本文中提供了预测患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的患者的结果的方法，其包括：确定与正常细胞相比较miRNA表达的独特特征，其中所述特征包括本文中描述的一个或多个miRNA特征。
在另一个方面，在本文中提供了方法，其：i)诊断受试者是否患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或处于发生所述疾病的风险中，ii)确定这样的受试者的预后，和/或iii)治疗这样的受试者，所述方法包括：测 量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平，其中所述生物标志物选自本文中描述的一个或多个CLL特征，和，其中相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，测试样品中生物标志物的水平的改变表示受试者患有CLL或处于发生CLL的风险中。
在某些实施方案中，测试样品中至少一个生物标志物的水平低于对照样品中相应的生物标志物的水平。
在某些实施方案中，测试样品中至少一个生物标志物的水平高于对照样品中相应的生物标志物的水平。
在另一个方面，本文中提供了用于影响慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中靶mRNA的转录物丰度和/或蛋白质表达的方法，其包括使有此需要的受试者中一个或多个微RNA失调。
在某些实施方案中，所述方法还包括抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
在另一个方面，本文中提供了微RNA和编码蛋白质的RNA的大规模基因表达特征谱分析用于鉴定在人慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中发生的微RNA功能的改变的用途。
在另一个方面，在本文中提供了确定患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的受试者的预后的方法，其包括测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平，其中：生物标志物与此类癌症中不利的预后相关；和相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，测试样品中至少一个生物标志物的水平的改变表示不利的预后。
在另一个方面，在本文中提供了确定患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的受试者的预后的方法，其包括诊断受试者是否患有CLL或处于发生CLL的风险中，包括：从获自受试者的测试样品逆转录RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；将所述靶寡脱氧核苷酸与包含mi RNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和将测试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中至少一个miRNA的信号的改变表示受试者患有这样的AML或处于发生这样的AML的风险中。
在某些实施方案中，相对于从对照样品产生的信号，至少一个miRNA的信号下调，和/或其中相对于从对照样品产生的信号，至少一个miRNA的信号上调。
在某些实施方案中，选自miR15a/16-1簇的miR的至少一个生物标志物的信号的改变，表示受试者患有具有不利预后的CLL癌症或处于发生所述CLL癌症的风险中。
在另一个方面，在本文中提供了用于调控白血病细胞中的蛋白质表达的方法，其包括调控白血病细胞中miR15a/16-1簇的一个或多个miR的表达。
在另一个方面，在本文中提供了用于调控白血病细胞中一种或多种蛋白质的表达水平的组合物，该组合物包含miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
在另一个方面，在本文中提供了用于在有此需要的受试者中增加白血病细胞中的蛋白质水平的组合物，其包含miR15a/16-1簇的一个或多个反义miR。
在另一个方面，在本文中提供了治疗患有白血病的受试者的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的方法，在所述白血病中至少一个生物标志物在受试者的癌细胞中相对于对照细胞下调或上调，所述方法包括：当至少一个生物标志物在癌细胞中下调时，给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物，或其分离的变体或生物学活性片段，以便抑制受试者中癌细胞的增殖；或，当至少一个生物标志物在癌细胞中上调时，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一个生物标志物的表达的化合物，以便抑制受试者中癌细胞的增殖。
在另一个方面，在本文中提供了治疗受试者的白血病的方法，其包括：测定白血病细胞中相对于对照细胞至少一个生物标志物的量；其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体，和通过下列来改变白血病细胞中表达的生物标志物的量：如果癌细胞中表达的生物标志物的量低于对照细胞中表达的生物标志物的量，给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物；或如果癌细胞中表达 的生物标志物的量高于对照细胞中表达的生物标志物的量，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一个生物标志物的表达的化合物。
在另一个方面，在本文中提供了用于治疗白血病的药物组合物，其包含至少一个分离的生物标志物和可药用载体，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR，或其功能性变体。
在某些实施方案中，药物组合物包含至少一种miR表达抑制剂化合物和可药用载体。
在另一个方面，在本文中提供了鉴定抗白血病试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，然后测量与白血病细胞中减少的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体，并且其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的增加表示测试试剂是抗白血病试剂。
在另一个方面，在本文中提供了鉴定抗白血病试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，然后测量与白血病细胞中增加的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的减少表示测试试剂是抗癌试剂，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
在另一个方面，在本文中提供了评估疗法预防、诊断和/或治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)相关疾病的有效性的方法，其包括：使动物经历其有效性有待评估的疗法，和通过评估至少一个生物标志物测定待测试的疗法在治疗或预防疾病中的有效性水平，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
在某些实施方案中，候选治疗剂包括下列中的一种或多种：药物组合物、营养组合物(nutraceutical composition)和顺势疗法组合物。
在某些实施方案中，待评估的疗法用于人受试者。
在另一个方面，在本文中提供了制品，其包含：至少一种结合包含至少一个生物标志物的白血病相关疾病的标志物的捕获试剂，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
在另一个方面，在本文中提供了用于筛选治疗白血病相关疾病的治 疗剂的候选化合物的试剂盒，其中试剂盒包括：至少一个生物标志物的一种或多种试剂和表达至少一个生物标志物的细胞，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
在某些实施方案中，使用包含特异性结合至少一个生物标志物的抗体或抗体片段的试剂检测生物标志物的存在。
在另一个方面，在本文中提供了干扰慢性淋巴细胞性白血病(CLL)相关疾病应答信号转导途径的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的疾病并发症的严重度，其中所述试剂包含至少一个生物标志物，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
在另一个方面，在本文中提供了治疗、预防、逆转或限制有此需要的个体的白血病相关疾病并发症的严重度的方法，其包括：给个体施用干扰至少白血病相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包含至少一个生物标志物，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
在另一个方面，在本文中提供了干扰至少慢性淋巴细胞性白血病(CLL)相关疾病应答级联的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的白血病相关疾病并发症的严重度，其中所述试剂包含至少一个生物标志物，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
在另一个方面，在本文中提供了包含miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体的反义抑制剂的组合物。
在另一个方面，在本文中提供了治疗有此需要的受试者的慢性淋巴细胞性白血病(CLLL)的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的组合物。
在某些实施方案中，预防性施用所述组合物。
在某些实施方案中，所述组合物的施用延迟CLL的一个或多个症状的发作。
在某些实施方案中，所述组合物的施用抑制CLL的发生。
在某些实施方案中，所述组合物的施用抑制CLL。
在另一个方面，在本文中提供了用于检测生物学样品中白血病的存在的方法，其包括：将怀疑包含白血病的生物学样品暴露于用于其的生物标志物；其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体，和如果有的话，检测样品中标志物的存在或不存在。
在某些实施方案中，生物标志物包括可检测的标记。
在某些实施方案中，所述方法还包括将来自受试者的生物学样品中生物标志物的量与来自正常受试者的相应生物学样品中生物标志物的量相比。
在某些实施方案中，所述方法还包括在不同时间点从受试者收集多个生物学样品和比较各生物学样品中标志物的量以确定标志物的量在一段时间内在受试者中是增加还是减少。
在另一个方面，在本文中提供了用于治疗受试者的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的方法，所述方法包括：白血病受体激动剂。
在某些实施方案中，受体激动剂是miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体的反义抑制剂。
在另一个方面，在本文中提供了制造用于治疗急性髓性白血病的药物的用途，所述药物包含选自下列的核酸分子：miR15a/16-1簇的miR或其功能性变体、来源于其的序列、这样的miR的互补序列和来源于这样的互补序列的序列。
在某些实施方案中，药物包含核酸分子，所述核酸分子提供选自下列的序列：miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体、来源于此类miR的序列、此类miR的互补序列和来源于此类互补序列的序列。
在另一个方面，在本文中提供了鉴定诱导慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞分化的有效治疗剂或治疗剂的组合的体外方法，该方法包括步骤：培养来源于CLL细胞的细胞，向细胞系的培养基中加入至少一种化合物，分析步骤(i)与(ii)之间至少一个miR的表达水平的变化，和鉴定诱导步骤(i)与(ii)之间miR的表达水平的改变的化合物或化合物的组合。
在某些实施方案中，步骤(iii)包括分析至少一个miR的表达水平。
在某些实施方案中，步骤(iv)包括鉴定调控至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
在某些实施方案中，步骤(iv)包括鉴定减少至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
在某些实施方案中，化合物是治疗癌症的治疗剂。
当根据附图进行阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员将变得显然。
附图概述
本专利或申请文件可包括一个或多个以彩色制成的图和/或一个或多个照片。具有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开案的拷贝将应请求且支付必要的费用后由专利局(Patent Office)提供。
图1A-1C：MiR15a/16-1簇抑制裸鼠中MEG-01肿瘤移植物的生长。
图1A：使用用pRS-E或pRS15/16预先转染的或模拟转染的MEG-01细胞注射的裸鼠中植入的肿瘤的生长曲线。
图1B：注射后28天裸鼠中模拟-、pRS-E-和pRS15/16-转染的MEG-01细胞的肿瘤移植物大小的比较。
图1C：裸鼠中的肿瘤重量±SD。
图2：通过微阵列或蛋白质组学在MEG-01中鉴定的miR-15a/16-1的一些靶的验证。
图2A：PDCD4、RAB21、IGSF4、SCAP2(在微阵列中下调的)、BCL2和WT1(在蛋白质组学中下调的)的qRT-PCR验证。IFG1、ACE和ERBB2是阴性对照。将结果针对pRS-E-转染的细胞进行标准化。用β-微管蛋白标准化样品。
图2B：MEG-01细胞中的IGSF4的萤光素酶测定，其显示miR-15a/16-1簇直接靶向该基因。
图3：用miR-15a/16-1转染的MEG-01细胞的基因表达特征谱。根据用空载体(红色)与用miR-15/16表达载体(红色)转染的MEG01之 间差异表达的5,659个探针的表达的样品的聚类。基因的红色表示表达值比所有样品的平均值更高，绿色表示表达值比所述平均值更低。
图4：将MEG-01中miR-15a/16-1的预测的与在实验(微阵列)中失调的靶相匹配的维恩图。通过TargetScan、MiRanda和PicTar预测的靶与在实验中下调的转录物之间的匹配的结果。以灰色表示的数目(4,769)表示在微阵列中下调但不被任何考虑的算法预测为靶的转录物的数目。
图5-表1：在miR-15a/16-1簇转染后在MEG-01细胞中失调的ARE-mRNA的簇分布。
图6-表2：MEG-01细胞中在miR-15a/16-1簇转染后最显著的GO分类。
图7-表3：通过蛋白质组学在MEG-01细胞中鉴定的被miR-15a/16-1簇下调的蛋白质的实例。
图8-表4：通过微阵列鉴定的mi R-15a/16-1下调的基因的CLL特征的实例。
图9-表5：在用miR-15a/16-1转染MEG-01细胞后失调的转录物。
图10-表6：在用miR-15a/16-1转染MEG-01细胞后下调的转录物，和通过TargetScan，PicTar和MiRanda预测的靶。
图11-表7：用miR-15a/16-1转染MEG-01细胞后上调/下调的转录物当中的ARE-mRNA。以红色(粗体)表示上调的基因；以黑色表示下调的基因。
图12-表8：在用mi R-15a/16-1转染MEG-01细胞后下调(相对于空载体)的转录物的基因本体论。
图13-表9：通过蛋白质组学在MEG-01细胞中鉴定的被miR-15a/16-1簇下调的蛋白。
图14-表10：8个具有高miR-15a/16-1水平的CLL与8个具有低miR-15a/16-1水平的CLL之间的比较。678个转录物显著差异地表达。
图15-表11：miR-15a/16-1下调的基因的CLL特征。
图16-表12：在用miR-15a/16-1转染MEG-01细胞后下调(相对于 空载体)和在具有miR-15a/16-1的高表达的CLL患者中下调的转录物的基因本体论。
优选实施方案的详述
在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明书。这些公开物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用合并入本公开内容以更全面地描述本发明涉及的现有技术。
本文中描述的是miR-15a和miR-16-1作为肿瘤抑制基因(TSG)在CLL中和可能地在其中此类基因丢失或下调的其他恶性肿瘤中的作用。
本文中还公开的是miR-15a和miR-16-1作为肿瘤抑制剂在白血病中的作用机制。我们分析了MEG-01白血病细胞中miR-15a和miR-16-1对转录物组和蛋白质组的作用。该方法允许我们确认许多靶基因，其表达在CLL的情况下也被研究。
在下列实施例中进一步解释本发明，其中，除非另有说明，所有部分和百分比以重量计并且温度是摄氏度。应理解，表示本发明的优选实施方案的这些实施例仅通过举例说明的方式给出。根据上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且无需背离其精神和范围，可以对本发明进行多种变化和改进以使其适应不同的用法和条件。本说明书中涉及的所有公开物，包括专利和非专利文献明确地通过引用并入本文。
实施例I
转染入MEG-01白血病细胞的miR-15a/miR-16-1的体内作用
我们报导了miR-15a/16-1簇通过激活内在的细胞凋亡途径来诱导MEG-01细胞的细胞凋亡(如通过激活APAF-1-胱天蛋白酶9-PARP途径所鉴定的)(22)。
为了进一步研究此类miRNA的作用，我们测定它们的体内肿瘤抑制功能。将用pRS15/16、pRS-E体外转染的或模拟(mock)转染的1千万个活的MEG-01细胞s.c.接种入免疫受损的“裸”小鼠的肋腹(每组5只)。
如图1A中显示的，miR-15a/16-1簇抑制MEG-01肿瘤植入物的生长。 28天后，在使用miR-15a/16-1-转染的MEG-01接种的5只小鼠的3只(60％)中肿瘤生长被完全抑制(图1B)。
在第28天，未处理的和空载体处理的小鼠的平均肿瘤重量分别为0.95±0.5g和0.58±0.39g；在用miR-15a/16-1-处理的细胞接种的小鼠中，肿瘤平均重量为0.020±0.01g(P＜0.003)(图1C)。
因此，这些实验的结果证明miR-15a/16-1簇在MEG-01白血病细胞中的肿瘤抑制功能。
miR-15a和mirR-16-1的外源表达的转录作用。
为了表征白血病中miR-15a/16-1肿瘤抑制的分子基础，我们首先研究miRNA对编码蛋白质的基因的基因组范围的转录的作用。我们将pRS15/16载体瞬时转染入MEG-01细胞。该载体包含编码上述两种miRNA的基因组区域(22)。使用空载体(pRS-E)的转染用作对照。通过利用参考文献18中描述的定量(q)RT-PCR测量miR-15a和miR-16-1的表达水平来评估转染的成功(数据未显示)。通过使用Affymetrix微阵列研究基因组范围的转录组。微阵列分析清楚地显示pRS15/16-和pRS-E-转染的细胞间不同的基因表达模式(图3)。
在用miR-15a/16-1簇转染后，355个探针(265个基因)显著上调以及5,304个探针(3,307个基因)下调(图9-表S5)。
用差异表达的基因进行的聚类分析显示pRS15/16-与pRS-E-转染的细胞之间明显不同的基因表达特征谱(图3)。
在下调的探针当中，140个探针(85个基因)被3个最常用的软件算法(TargetScan、PicTar和MiRanda)预测为miR-15/16的靶，所述算法基于不同的预测标准，从而组合使用时产生靶鉴定的最大可能性。如果我们只考虑一个预测程序，我们发现370、332和312个转录物分别被预测为此类miRNA的直接靶(图3、图10-表6)。
在上调的基因当中，不存在共同预测的靶。因此，miR-15a/16-1簇似乎直接或间接调控人基因组中总共25,000个预测的基因的大约14％(265个上调的基因和3,307个下调的基因)(23)(图4)。
在MEG-01中，在miR-15a/miR-16-1下调的基因中更频繁地发现富 含AU的元件(ARE)
因为对于miR-16-1，已报导了靶mRNA的“种子”区域中的直接相互作用(22)和ARE-介导的mRNA不稳定性(24)，因此我们研究包含ARE的mRNA在miR-15a/16-1-下调的转录物中的频率。
如图11-表7中显示的，在它们的3′UTR中包含ARE的基因的数目为265个上调的基因中的36个(13.6％)和3,307个下调的基因中的666个(20.1％)。该差异在统计学上是显著的，χ2值为6.674(P＝0.0098)。在预测为miR-15a/16-1的靶的85个基因中，28个(32.9％)包含ARE，然而在不是共同预测的靶的剩下的3,222个下调的基因当中，638个(19.8％)mRNA包含ARE(χ2值＝8.89，P＝0.003)。根据ARE区段中基序的数目，可将ARE-mRNA聚类为5个组，所述组包含5个(簇I)、4个(簇II)、3个(簇III)和2个(簇IV)五聚体重复，而簇V在所述的13-bp ARE模式中只包含1个五聚体(25)。
被miR-15a/16-1失调的基因的ARE-簇分布示于图4-表1。这些结果表明在miR-15a/16-1下调的靶，特别地共同预测的靶中更频繁地发现ARE，从而进一步确认了ARE在miR-16靶向中的影响。
被miR-15a/16-1簇失调的基因的基因本体论(GO)
使用GeneSpring Gene Ontology浏览器工具分析在用pRS15/16与pRS-E转染后发现在MEG-01细胞中差异表达的基因，以鉴定下调的基因中最具代表性的基因本体论分类(图6-表2，图4-表8)。这些结果显示miR-15a/16-1簇直接或间接影响许多细胞周期相关基因的表达。
特别地，参与细胞周期的不同转变检查点的许多基因被miRNA靶向。与我们之前的发现：BCL2是miR-15a/16-1的靶相一致，在该GO实体论分析中，分类“抗细胞凋亡”(GO：6916)在下调的转录物中具有显著的代表性。
miR-15a和miR-16-1对MEG-01蛋白质组的作用
因为已描述了依赖于miRNA的基因调控的转录和翻译水平(26)，因此为了研究miR-15a/16-1在蛋白质水平上对MEG-01细胞的作用，我们分析了在转染后48小时，在用pSR15/16或pRS-E载体转染的MEG-01 细胞之间差异表达的蛋白质。通过蛋白质组学分析，我们鉴定了其强度在pRS15/16组中相对于pRS-E组减小4倍或更多的蛋白质。我们分离到27种不同的蛋白(图7-表3，图13-表9)。
有趣地，鉴定到BCL2(我们已显示其为miR-15a/16-1的靶(22))和WT1(此类miRNA的另一个预测的靶)。被靶向的蛋白质具有许多种生物学功能并且可被分类为4个组。
第一组包括在细胞生长和细胞周期的调控中起作用的蛋白质(Ruvb11、Anxa2、Rcn1、Cct7、Sugt1、Cdc2、Psf1)，另一个分类由抗细胞凋亡蛋白质(Grp78、Bcl2、Pdia2)和作为癌基因或作为肿瘤抑制基因参与人肿瘤发生的蛋白质(Wt1、MageB3、Rab9B)组成。剩下的14种蛋白质具有不同的生物学功能，我们将它们鉴定为“其他类别”。在27个经实验鉴定下调的蛋白质中，8个(29.6％)是通过至少一个预测算法预测的miR-15a/16的靶。最后，在该8个蛋白质的组中，2个(Bcl2和Cfl2)也存在于下调的mRNA的组中。
MEG-01细胞系中的结果的验证
为了验证通过转录组学或蛋白质组学分析获得的结果，我们利用qRT-PCR在用pRS15/16或pRS-E(对照)转染的MEG-01细胞中测定了9个基因(通过EST微阵列鉴定的4个基因，通过蛋白质组学鉴定的2个基因以及未被这两种技术鉴定到从而被当作阴性对照的3个基因)的表达。如图2A中显示的，使用miR-15a/16-1的转染减少了微阵列鉴定的mRNA(PDCD4、RAB21、IGSF4、SCAP2)和蛋白质组学鉴定的蛋白质(Bcl2、Wt1)的表达。MiR-15a/16-1转染不影响任一个对照基因(IGF1、ACE和ERBB2)的表达。
我们还对经验证的基因中的一个基因(IGSF4)进行了萤光素酶测定并且证明miR-15a/16-1簇直接靶向IGSF4(图2B)。
我们和其他研究人员证明了与BCL2和DMTF1的直接相互作用(7，22)。因此，我们能够一致地确认MEG-01中下调的基因的特征谱并且在该白血病模型中鉴定miR-15a/16-1的另一个直接的靶。
miR-15a/mir 16-1的靶在原发性CLL中的表达的变化
因为MEG-01是具有异常13q14且丢失了miR15a/16-1簇的白血病细胞模型(与CLL相似)，并且是基于巨核细胞建立的白血病细胞系，因此我们也在原发性CLL中研究了miR-15a/16-1簇的不同表达的作用。
因此，为了确认在MEG-01细胞中鉴定的miR-15a/16-1的一些靶在CLL患者中是否与这两个miRNA的表达负相关，我们选择了一组16个CLL样品，在我们之前的研究中(18，27)已利用miRNA微阵列分析对其中的miR-15a/16-1的表达进行了测定。
我们已显示，13个miRNA的特征可区分惰性CLL(indolent CLL)和侵袭性CLL，并且miR-15a/16-1簇的丧失是惰性CLL的特点(18)。首先，我们通过qRT-PCR验证了miR-15a/16-1的表达和通过qRT-PCR验证了微阵列数据(数据未显示)。在考虑的16个患者当中，8个患者相对于另外8个患者具有更高的miR-15a/16-1的表达(P＝7.7×10-6，在微阵列分析时，P＝0.019，在qRT-PCR分析时)。通过EST寡核苷酸微阵列分析进行的具有高和低miR-15a/16-1表达的8个CLL之间的比较显示，678个Affymetrix探针(539个基因)在两个组间显著差异地表达(图14-表10)。总体上，539个基因中的82个(15.2％)是ARE mRNA，并且4个被所有3种生物信息学算法预测为靶。
被miR-15a/16-1下调的转录物的特征
我们选择在高表达miR-15/16的CLL中较低和在低表达miR-15/16子的CLL中较高的基因，所述基因与用pRS15/16转染后MEG-01细胞中下调的基因交叉。
显现了60个基因(70个探针)的特征(图8-表4，图15-表11)。此类基因中的13个(21.7％)是ARE-mRNA，分布在族III(7.8％)、IV(7.8％)和V(84.6％)中。相对于MEG-01中所有下调的mRNA(P＝0.76)和具有miR-15a/16-1的高表达的患者中所有被抑制的转录物(P＝0.14)，在该特征中未观察到在统计学上显著的ARE-mRNA的富集。我们进行这70个转录物的GO分析，并且在重要的代表性分类当中发现，其中一些之前在转染的MEG-01中被鉴定，并且参与细胞周期和细胞凋亡的调控，例如“抗细胞凋亡”(GO：6916)、“细胞凋亡的负调控”(GO：43066)和“程 序化细胞死亡的负调控”(GO：43069)(图16-表12)。MEG-01中和CLL患者中的结果的一致性确认了我们的体外模型的有效性，且鉴定了GO分类和一组蛋白质编码性基因，其表达一致地受所述簇控制。
讨论
我们显示，miR-15a/16-1通过在裸鼠中抑制白血病细胞的肿瘤植入物的生长而发挥体内肿瘤抑制功能。
为了研究miR-15a/16-1肿瘤抑制功能的分子基础，我们对在用pRS15/16(表达miR-15a/16-1的载体)转染MEG-01细胞后下调(使用相同的空载体(pRS-E)作为对照)的基因进行广泛的微阵列分析。
我们确认了由其他研究组在不同的模型中观察到的一些靶，例如实体瘤细胞系中的CDK6，CDC27和RAB11FIP2(28)和非洲爪蟾中的ACVR2A(29)。我们将我们通过实验鉴定的下调的基因与由3个最常用的鉴定miRNA-靶的算法(PicTar、TargetScan、MiRanda)共同预测的miR-15a/16-1的靶匹配，发现85个基因(2.6％)是共同的。
有趣地，通过将我们的结果与计算机方法(所述方法通过预测miRNA调控模块(MRM)或据信协同参与转录后基因调控的miRNA和靶基因的组群而鉴定miRNA靶)(30)匹配，我们发现13个miR-15/16MRM预测的基因中有5个基因(38.5％)(ATP2B1、FBXW7、PPM1D、SON和WT1)存在于我们的差异表达的基因当中。该百分比在所有考虑的预测算法中是最高的。
在265个在实验中上调的mRNA中，没有一个被预测为miR-15a/16的靶。该发现可通过间接作用(例如调控被这两个miRNA靶向的转录因子)来解释。还通过在转染后48小时进行蛋白质组学来研究miR-15a/16-1的外源性表达在MEG-01细胞中的作用。我们还研究了不同的转染后时间相隔以分析miR-15a/16-1在转录(24小时)或翻译(48小时)水平上的作用，因为在24小时后，mRNA沉默程度最大，但由于蛋白质耗竭而导致的次级转录作用最小(31)。
我们的蛋白质组学方法能够检测到miR-15a/16-1的27个靶，其中大约三分之一也是预测的靶。有趣地，25％(8个中的2个)的预测的靶 在转录组和蛋白质组中都下调。在被miR-15a/16-1下调的基因中，我们证实IGSF4是该簇的直接靶。
IGSF4最初在肺癌中被鉴定为肿瘤抑制基因，其参与细胞粘附(32，33)。Sasaki等人(34)已证明TSLC1/IGSF4用作癌蛋白参与成人T细胞白血病(ATL)的发生和进展。在本文中发明者现相信，通过直接沉默IGSF4，miR-15a/16-1在展示更广泛的抗白血病作用中是有用的。
我们还利用微阵列研究了相对于具有低水平的miR-15a/16-1的8个CLL患者在具有高水平的这两个miRNA的8个CLL患者中下调的mRNA，并且鉴定了在CLL和用miR-15a/16-1转染的MEG-01之间共同的60个基因的特征。
该特征(其包括大约2％的在MEG-01中下调的基因和大约11％的在患者中被抑制的基因)包括癌基因例如MCL1、JUN、SCAP2、TRA1、PDCD6IP、RAD51C和HSPA1A/1B，其可用于解释在体外(22)和体内(如本文中所显示的)在MEG-01中观察到的miR-15a/16-1的肿瘤抑制作用。
MCL1是促成CLL中B细胞存活并且与对化学疗法的抗性相关的抗细胞凋亡BCL-2家族的成员(35，36)。尽管MCL-1的表达在ZAP 70-阳性(侵袭性)对ZAP 70-阴性(惰性)B-CLL细胞中不同(37)，但其代表了急性和慢性淋巴性恶性肿瘤中的相关治疗靶，因为其的沉默足以促进ALL和CLL细胞的细胞凋亡并且增加对利妥昔单抗介导的细胞凋亡的敏感性(38)。有趣地，还已鉴定miR-29b在胆管上皮癌模型中靶向Mcl1(39)，并且许多证据集中于确定miR-29家族在实体恶性肿瘤(40)和恶性血液病(41)中作为TSG的作用。
这些发现提供了在CLL的治疗中将miR-15a/16-1与miR-29结合的理论基础。
此外，经由B细胞受体的持续信号转导通过诱导MCL1和通过激活c-JUNNH2-末端激酶(JNK)(至更低的程度)提高B-CLL细胞的存活(42)。
因此，通过靶向MCL1和c-JUN转录物，miR-15a/16-1簇对B-CLL细胞的存活的影响可甚至更强烈。BCL2在蛋白质组学列表中的存在确认了我们之前的关于该靶的转录后调控的声明(22)。
此外，MEG-01中参与RARS(精氨酰-tRNA合成酶)的相同途径的LARS(亮氨酰-tRNA合成酶)的抑制和RARS在下调的基因中的存在验证了我们之前的假说：该途径可被miR-15a/16-1靶向(16)。
有趣地，所述特征还包括许多重要的肿瘤抑制基因(RNASEL、HACE1、CEP63、CREBL2、MSH2、TIA1和PMS1)并且显示了关于miR-15a/16-1表达与CLL预后之间的关联的解释。
我们描述了，在具有未突变的IgVH和ZAP-70的高表达(不良预后)的CLL患者中，miR-15a/16-1的水平比具有更好的预后的CLL患者中的高(18)。观察到的癌基因和TSG在miR-15a/16-1CLL特征中的共存提供了关于这两个miRNA的高水平为什么与具有更差的预后的CLL相关的分子解释(18)。高miR-15a/16-1水平可下调许多TSG并且因此负作用于许多肿瘤抑制途径，从而导致更多的致癌表型。
最近，已证明miR-16关键性地参与ARE介导的mRNA不稳定性(24)。在MEG-01细胞中，我们发现ARE-mRNA在下调的基因(20.1％)中比在上调的基因(13.6％，P＝0.0098)中明显地更具代表性。虽然已鉴定的特征不富集ARE-mRNA，但其显示簇V ARE-mRNA占优势(84.6％)(这反映更多数目的该簇成员存在于MEG-01和患者中)，这表明更多数目的五聚体AU重复不相应于更高的由miR-15a/16-1产生的沉默作用。
最后，失调的基因的GO分析表明，miR-15a/16-1强烈地影响代谢途径、核酸结合途径和翻译因子的活性。在实体瘤细胞系中，miR-16-下调的转录物对于其沉默引起细胞在G0/G1期中积累的基因是富集的，并且该功能不依赖于富含AU的元件(28)。
我们现已发现，一些描述的miR-16的靶(其的破坏触发G0/G1-细胞积累)也在我们的细胞模型中下调(CDK6、CDC27、RAB11FIP2)，并且我们的数据也提供了一些之前描述的GO分类[即“有丝分裂细胞周期”(GO：278)，和“细胞周期”(GO：7049)]。
与之前的报导相反，我们发现相对于上调的靶，在下调的靶中存在统计学上显著更多数量的ARE-mRNA。这些差异可反映miR-15a/16-1的细胞特异性功能，然而在实体瘤和血液肿瘤模型中共同的发现： miR-15a/16-1靶向参与“细胞周期”的基因，表明该簇对该组基因的更普遍和强烈的作用。
我们现显示在白血病细胞模型和原发性CLL中被miR-15a/16-1失调的基因，并且鉴定了其沉默表征CLL中miR-15a/16-1-诱导的表型的共同基因的特征。
这些发现可对CLL的治疗方法的开发具有重要的意义。
材料和方法
细胞培养和患者样品
人巨核细胞MEG-01细胞系购自美国典型培养物保藏中心并且在37℃和5％CO2下培养于补充有1×非必需氨基酸和1mmol丙酮酸钠的10％FBS RPMI培养基1640中。为了进行患者研究，我们使用在CLL研究联合机构(CLL Research Consortium institutions)从经诊断患有CLL的患者获得(在获得知情同意后)的16个CLL样品。简而言之，从CLL患者获得血液，然后通过Ficoll/Hypaque梯度离心(AmershamPharmacia Biotech)分离单核细胞，并按照描述的方案(18)处理细胞以提取RNA。对于所有样品，微阵列表达数据是已知的，如参考文献18中所报导的，并且我们使用qRT-PCR进一步进行确认。
体内研究
按照机构指导方针进行动物研究。用表达miR-15a/miR-16-1的p-Retrosuper载体(43)(pRS15/16)体外转染MEG-01细胞系。未转染的(模拟)或用相同的空质粒(pRS-E)转染的细胞用作肿瘤发生对照。在转染后24小时时，将107个活细胞皮下注射入5周龄的雌性裸鼠(Charles River Breeding Laboratories)的左胁腹，每转染的或对照细胞系5只小鼠。在第7、15、21和28天测量肿瘤直径。28天后，杀死小鼠，进行尸体剖检，称取肿瘤的重量。使用公式V(以mm3表示)＝A×B2/2计算肿瘤体积，其中A是最大直径，B是垂直直径。
体外转染
按照制造商的说明书使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)，用1μg/ml(终浓度)pRS-15/16或pRS-E载体瞬时转染MEG-01细胞。 24小时后，按照制造商的说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。
微阵列杂交和数据分析
使用Human Genome U133A Plus 2.0GeneChip阵列(Affymetrix)通过微阵列分析从用pRS-15/16和pRS-E载体(各自以一式三份)转染的MEG01细胞系获得的2个样品和16个CLL样品。将GeneChip扫描仪产生的CEL文件输入GeneSpring GX7.3软件(Agilent Technologies)并且进行进一步处理。关于微阵列实验的详细内容描述于本文的实施例II中。
MiRNA的靶的预测
使用算法TargetScan(genes.mit.edu/targetscan/)、PicTar(pictar.bio.nyu.edu/)和miRanda(cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.p1)分析miRNA的预测的靶。
包含富含腺苷酸尿苷酸的元件(ARE)的基因的鉴定
如所描述的(44)，使用ARE-mRNA数据库版本3.0(ARED； rc.kfshrc.edu.sa/ared/)(参见实施例II)。
双向PAGE和利用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间(MALDI-TOF)和质谱(MS)进行的蛋白质鉴定。
按照制造商的说明书使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)，用1μg/ml(终浓度)pRS15/16或pRS-E载体瞬时转染MEG-01细胞，进行48小时，双向PAGE和利用MALDI-TOF和MS进行的蛋白质鉴定的详细内容描述于实施例II中。
qRT-PCR
按照制造商的说明书和如所描述的(45)，使用TaqMan MicroRNA测定试剂盒(Applied Biosystems)以一式三份进行miRNA的qRT-PCR分析。为了进行标准化，使用18S RNA；按照制造商的说明书，通过使用基因特异性引物和IQ SYBR green Supermix(Bio-Rad)将RNA逆转录成cDNA来进行其他目的基因的qRT-PCR分析。将β-微管蛋白用于标准化。
萤光素酶报告基因测定
为了进行萤光素酶报告基因实验，利用PCR从人cDNA扩增237bp的IGSF43′UTR区段，然后通过使用紧在萤光素酶的终止密码子下游的XbaI位点将其插入具有SV40启动子的pGL3-对照载体(Promega)。关于微阵列实验的详细内容描述于实施例II中。以一式三份进行实验。
实施例II
微阵列杂交
通过微阵列分析从用pRS-15/16和pRS-E载体(各自以一式三份)转染的MEG01细胞系获得的2个样品和16个CLL样品。在Ohio StateUniversity的微阵列设备上进行实验。使用NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies)定量所提取的RNA的量，然后使用AgilentBioanalyzer 2100(Agilent Technologies)评估RNA的质量。通过EnzoBioArray HighYield RNA Transcript Labeling试剂盒(Affymetrix)将总RNA(1.2μg)用于产生生物素标记的cRNA。在片段化后，将标记的cRNA用于在Human Genome U133A Plus 2.0GeneChip阵列(Affymetrix)上进行杂交。按照制造商的说明书进行杂交、清洗和染色。用Genechip 7G扫描杂交的阵列。
微阵列数据的分析
将GeneChip扫描仪产生的CEL文件输入GeneSpring GX 7.3软件(Agilent Technologies)。通过使用GC Robust Multiarray Average(GCRMA)方法标准化原始数据，然后进行数据转换，以将阴性值设置为0.01。然后将各测量值除以该样品中的所有测量值的第50百分位数，将每一个基因除以所有样品中的其测量值的中值。按照它们的几何平均表达在所比较的组之间具有2倍差异选择在miR-15/16转染后的MEG01中和在两个CLL组中差异表达的基因(通过ANOVA，统计学显著性P值＜0.05，应用Benjamini和Hoechberg校正以减少假阳性)。使用标准关联作为相似性的量度，将差异表达的基因用于样品的聚类分析。使用基因符号将假定的miR-15/16的靶的列表输入GeneSpring，通过使用Venn Diagram GeneSpring工具进行与目的列表的交叉。使用GeneSpring软件(使用P＜0.05)对差异表达的基因进行基因本体论(GO)分析， 以发现统计上富集的GO分类。
包含富含腺苷酸尿苷酸的元件(ARE)的基因的鉴定
使用ARE-mRNA数据库版本3.0(ARED；rc.kfshrc.edu.sa/ared/)(其包括＞4,000个通过计算机图谱定位至人基因组的ARE-mRNA)，就ARE在它们的3′-UTR中的存在细查在用pRS15/16转染后利用EST寡核苷酸微阵列分析鉴定的所有失调的(上调和下调的)基因。使用χ2检验(α＝0.05)计算在pRS15/16与pRS-E-转染的MEG-01细胞中，更多的含有ARE的mRNA存在于下调的基因的组(相对于上调的基因的组)中的概率。
双向PAGE和利用MALDI-TOF和MS进行的蛋白质鉴定
按照制造商的说明书，通过使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)，用1μg/ml(终浓度)pRS15/16或pRS-E载体瞬时转染EG-01细胞。转染48小时后，将细胞在含有7mol/升尿素、2mol/升硫脲(triourea)、4％CHAPS、2mmol/升三丁基膦和0.2％BioLyte 3/10两性电解质(Bio-Rad)的样品缓冲液中进行裂解。超声处理粗制的细胞匀浆物，然后以10,000x离心10分钟。在含有200μg总蛋白的样品缓冲液中水化固定的pH梯度条(11cm)(pH范围为3-10)，进行过夜。在等电聚焦后，使用Protean Cell(Bio-Rad)，通过在200V下进行1小时，利用8-16％的梯度SDS-PAGE在第二方向上分离蛋白质。所有凝胶运行3次，用胶体考马斯蓝(Pierce)染色，然后用Versadoc 3000成像系统(Bio-Rad)扫描。使用800GS扫描仪(Bio-Rad)获取凝胶图像，然后使用PDQuest软件(Bio-Rad)，就各凝胶图像中的总蛋白质密度对图像进行分析。在对凝胶上的总蛋白质进行标准化后定量蛋白质点。为了进行统计分析，计算一式三份重复的平均结果，在统计分析(学生氏t检验)中将所得的值用作独立的数据点。
在Ohio State University Davis Heart and Lung ResearchInstitute Proteomics Core Laboratory中进行MS。我们试图只鉴定来自在所有比较的凝胶中一致地被减少或诱导至少4倍的点的蛋白质。按照WinPREP Multiprobe II软件(PerkinElmer)中包括的方案将蛋白 质点转移至MassPrepstation(PerkinElmer)以进行自动化凝胶内蛋白质降解。简而言之，使凝胶碎片脱色，然后用DTT进行还原。在与碘乙酰胺一起温育后，清洗凝胶，然后用乙腈脱水。用6μg/ml胰蛋白酶(于50mmol/升的碳酸氢铵中)进行提取的蛋白质的凝胶内降解。使用1％甲酸/2％乙腈的混合物提取降解的肽，将其用于不锈钢MALDI板(Waters)上。以反射方式在MALDI-TOF质谱仪(Waters)上记录所得的肽的MS。通过搜索National Center for Biotechnology Information数据库(www3.ncbi.nlm.nih.gov/)，利用ProFound(prowl.rockefeller.edu/profound_bin/WebProFound.exe？FORM＝1/)将所得的肽与它们相应的蛋白质匹配。
萤光素酶报告基因测定
为了进行萤光素酶报告基因实验，通过PCR从人cDNA扩增237bp的IGSF43′UTR区段，然后使用紧在萤光素酶的终止密码子下游的XbaI位点将其插入具有SV40启动子的pGL3-对照载体(Promega)。将下列引物组用于产生特异性片段：
IGSF4-UTR Fw：5′-GCTCTAGAAAAAGGAGAACCAGCACAGC-3′[SEQ IDNO：1]，和
IGSF4-UTR Rv：5′-GCTCTAGATGACACACCTCACTTGCAGA-3′[SEQ IDNO：2]。
斜体字标示的核苷酸相应于内切核酸酶限制性位点。按照制造商的方案，通过使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)，用0.4μg萤火虫萤光素酶报告基因载体和0.08μg含有海肾萤光素酶的对照载体pRL-TK载体(Promega)在12孔板中共转染MEG-01细胞。对于每一个孔，使用1μg/ml(终浓度)pRS15/16或pRS-E载体。在转染后24小时，通过使用双萤光素酶测定(Promega)连续测量萤火虫和海肾萤光素酶活性(Promega)。以一式三份进行实验。
其用途和定义的实例
除非另外指出，否则本发明的实施将使用在本领域技术人员的能力之内的药物学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方 法。此类技术在文献中得到详尽的解释。参见，例如，Handbook ofExperimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwelleds.，Blackwell Scientific Publications)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，current addition)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan eds.，Academic Press，Inc.)。
因此，本文中提供了用于进一步解释的定义，所述定义不应解释为限定性的。
冠词“a”和“an”在本文中是指一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。例如，“an element”是指一个元素或多于一个的元素。
“标志物”和“生物标志物”是与其在正常或健康组织或细胞中的表达水平相比，其在组织或细胞中改变的表达水平与病症和/或疾病状态相关的基因和/或蛋白质和/或其功能性变体。
标志物的“正常”的表达水平是标志物在未患病症和/或疾病状态的人受试者或患者的细胞中的表达水平。
标志物的“过表达”或“显著更高的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平高于用于估量表达的测定的标准误，在某些实施方案中，至少2倍，在其他实施方案中，3、4、5或10倍于对照样品(例如，来自未患有标志物相关病症和/或疾病状态的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平。
标志物的“显著更低的表达水平”是指测试样品中的表达水平，所述表达水平比对照样品(例如，来自未患有标志物相关病症和/或疾病状态的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和在某些实施方案中几个对照样品中的标志物的平均表达水平低至少2倍，在其他实施方案中低3、4、5或10倍。
试剂盒是包含至少一种试剂，例如用于特异性检测标志物的表达 的探针的任何产品(例如，包装或容器)。可以以用于进行本发明的方法的单位的形式推销(promote)、分配或销售试剂盒。
“蛋白质”包括标志物蛋白和它们的片段；变异标志物蛋白和它们的片段；包含标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的肽和多肽；以及包含标志物或变异标志物蛋白，或标志物或变异标志物蛋白的至少15个氨基酸的区段的融合蛋白。
本文中所述的组合物、试剂盒和方法特别地具有下列非限定性用途：
评估受试者是否患有病症和/或疾病状态；
评估受试者的病症和/或疾病状态的分期；
评估受试者的病症和/或疾病状态的分级；
评估受试者的病症和/或疾病状态的性质；
评估受试者发生病症和/或疾病状态的可能性；
评估与受试者的病症和/或疾病状态相关的细胞的组织学类型；
制备可用于治疗受试者的病症和/或疾病状态的抗体、抗体片段或抗体衍生物；
评估病症和/或疾病状态在受试者的细胞中的存在；
评估一种或多种测试化合物抑制受试者的病症和/或疾病状态的功效；
评估疗法抑制受试者的病症和/或疾病状态的功效；
监控受试者的病症和/或疾病状态的进展；
选择抑制受试者的病症和/或疾病状态的组合物或疗法；
治疗患有病症和/或疾病状态的受试者；
抑制受试者的病症和/或疾病状态；
评估测试化合物的有害潜能；和
预防处于发生病症和/或疾病状态的风险中的受试者的病症和/或疾病状态的发作。
筛选方法
可产生动物模型以使能够筛选可用于治疗或预防受试者的病症和 /或疾病状态的治疗剂。因此，该方法可用于鉴定用于治疗或预防受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂。该方法包括对由本文所述的方法产生的动物模型施用候选试剂，和评估与未施用候选试剂的对照动物模型相比动物模型中的至少一种应答。如果至少一种应答在症状上减轻或在发作上延迟，则候选试剂是用于治疗或预防疾病的试剂。
候选试剂可以是本领域已知的药理学试剂(pharmacologicagent)或可以是之前未知具有任何药理活性的试剂。试剂可以是天然产生的或实验室中设计的。它们可从微生物、动物或植物分离，或可重组产生或通过任何适当的化学方法合成。它们可以是小分子、核酸、蛋白质、肽或模拟肽(peptidomimetics)。在某些实施方案中，候选试剂是具有大于50且小于大约2,500道尔顿的分子量的小有机化合物。候选试剂包含与蛋白质结构性相互作用所必需的官能团。还在生物分子中发现候选试剂，包括但不限于：肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。
可从多种来源(包括合成的或天然化合物的文库)获得候选试剂。存在例如许多可获得用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子的方法，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。备选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物的形式存在的天然化合物的文库是可获得的或可容易地产生。此外，天然或合成产生的文库和化合物可容易地通过常规化学、物理和生物学方法进行修饰，并且可用于产生组合文库。在某些实施方案中，候选试剂可使用组合文库方法领域中的许多方法中的任一方法来获得，所述方法包括非限定性实例：生物文库法；空间可定位平行固相或溶液相文库法(spatially addressable parallelsolidphase or solution phase libraries)；需要解卷积(deconvolution)的合成文库法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库法；和使用亲和层析选择的合成文库法。
在某些其他实施方案中，可将某些药理学药剂经历定向或随机化学修饰，例如酰化、烷化、酯化、酰胺化(amidification)等以产生结构类似物。
用于鉴定治疗受试者的病症和/或疾病状态的治疗剂的相同方法还可用于验证体外研究产生的前导化合物(lead compound)/试剂。
候选试剂可以是上调或下调受试者中一个或多个病症和/或疾病状态应答途径的试剂。在某些实施方案中，候选试剂可以是影响这样的途径的拮抗剂。
用于治疗病症和/或疾病状态的方法
本文提供了用于治疗、抑制、减轻或逆转病症和/或疾病状态应答的方法。在本文所述的方法中，对有此需要的个体施用干扰信号级联的试剂，所述个体例如但不限于其中这样的并发症还不明显的受试者和已具有至少一种这样的应答的受试者。
在前一种情况下，这样的治疗用于预防此类应答的发生和/或减轻它们发生的程度。在后一种情况下，这样的治疗用于减轻此类应答发生的程度，阻止它们进一步发展或逆转所述应答。
在某些实施方案中，干扰应答级联的试剂可以是对此类应答特异的抗体。
生物标志物的表达
可以以许多方式抑制标志物的表达，所述方式包括非限定性实例：可对疾病细胞提供反义寡核苷酸以抑制标志物的转录、翻译或两者。备选地，可对细胞提供编码特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段并且与适当的启动子/调节子区域有效连接的多核苷酸，以产生抑制所述蛋白的功能或活性的细胞内抗体。标志物的表达和/或功能还可通过用特异性结合标志物蛋白的抗体、抗体衍生物或抗体片段处理疾病细胞来抑制。通过使用本文中描述的方法，可筛选多种分子，特别地包括足够小以使它们能够穿过细胞膜的分子，以鉴定抑制标志物的表达或抑制标志物蛋白的功能的分子。可对受试者提供如此鉴定的化合物以抑制受试者的疾病细胞。
任何标志物或标志物的组合，以及与所述标志物组合的任何特定标志物可用于本文中描述的组合物、试剂盒和方法中。一般地，期望使用这样的标志物，对于所述标志物，疾病细胞中该标志物的表达水 平与正常结肠系统细胞中相同标志物的表达水平之间的差异尽可能大。虽然该差异可以小至用于评估标志物的表达的方法的检测极限，但期望差异至少大于评估方法的标准误，在一些实施方案中，与正常组织中相同标志物的表达水平相比，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000倍或更大的差异。
已公认，某些标志物蛋白被分泌至围绕细胞的细胞外空间。由于此类标志物蛋白可在体液样品中检测，因此将这些标志物用于组合物、试剂盒和方法的某些实施方案，所述体液样品可以比组织活检样品更容易地从人受试者收集。此外，用于检测标志物蛋白的体内技术包括将抗所述蛋白的标记抗体引入受试者。例如，抗体可用其在受试者中的存在和定位可利用标准成像技术来检测的放射性标记物进行标记。
为了确定任何特定的标志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳动物细胞例如人细胞系中表达标志物蛋白，收集细胞外液体，评估蛋白质在细胞外液体中的存在或不存在(例如，使用特异性结合所述蛋白的标记抗体)。
应理解，含有此类细胞的受试者样品可用于本文中所述的方法。在这些实施方案中，标志物的表达水平可通过评估样品中标志物的量(例如，绝对量或浓度)来评估。当然，可在评估样品中标志物的量之前将细胞样品经历多种收集后制备和贮藏技术(例如，核酸和/或蛋白质提取、固定、贮藏、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。
还应理解，可使标志物流出细胞进入例如呼吸系统、消化系统、血流和/或间质间隙。可以例如通过检查痰、BAL、血清、血浆、尿、粪便等来检测流出的标志物。
组合物、试剂盒和方法可用于检测标志物蛋白的表达，所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。例如，可将免疫学方法用于检测完整细胞上的此类蛋白，或可将基于计算机的序列分析法用于预测至少一个细胞外结构域(即，包括分泌蛋白和具有至少一个细胞表面结构域的蛋白质)的存在。可检测标志物蛋白的表达而无需裂解细胞(例如，使用特异性结合蛋白的细胞表面结构域 的标记抗体)，所述标志物蛋白具有至少一个展示于表达其的细胞的表面上的部分。
标志物的表达可通过多种用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的方法中的任一种来评估。此类方法的非限定性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交法、核酸逆转录法以及核酸扩增法。
在特定的实施方案中，标志物的表达可使用特异性结合标志物蛋白或其片段(包括已经历所有或部分其正常翻译后修饰的标志物蛋白)的抗体(例如，放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如，缀合有底物或蛋白质或蛋白质-配体对的配体的抗体)或抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体高变结构域等)来评估。
在另一个特定的实施方案中，标志物的表达通过下述来评估：从受试者样品的细胞制备mRNA/cDNA(即，转录的多核苷酸)，然后将mRNA/cDNA与为标志物核酸的互补序列的参照多核苷酸或其片段杂交。任选地，可在与参照多核苷酸杂交前使用多种聚合酶链式反应方法中的任一种来扩增cDNA；优选，其不进行扩增。同样可使用定量PCR检测一个或多个标志物的表达以评估标志物的表达水平。备选地，可使用检测标志物的突变或变体(例如，单核苷酸多态性、缺失等)的许多方法中的任一种来检测受试者中标志物的存在。
在相关实施方案中，将获自样品的转录的多核苷酸的混合物与在其上固定有多核苷酸(其与标志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更多个核苷酸残基)互补或同源)的基质接触。如果可在基质上差异地检测到互补或同源的多核苷酸(例如，可使用不同的发色团或荧光团检测或固定至不同的选择的位置)，那么可使用单个基质(例如，固定在所选择的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微阵列)同时评估多个标志物的表达水平。当使用包括将一个核酸与另一个核酸杂交的评估标志物表达的方法时，期 望在严格杂交条件下进行杂交。
在某些实施方案中，可使用质谱法或表面等离子共振术进行生物标志物测定(biomarker assay)。在不同的实施方案中，鉴定活性抗受试者的病症和/或疾病状态的试剂的方法可包括一个或多个下列步骤：a)提供含有一个或多个标志物或其衍生物的细胞的样品；b)从此类细胞制备提取物；c)将所述提取物与含有标志物结合位点的标记核酸探针混合；和，d)在测试试剂存在或不存在的情况下测定标志物与核酸探针之间的复合物的形成。测定步骤可包括将所述提取物/核酸探针混合物经历电泳迁移率试验(electrophoretic mobility shiftassay)。
在某些实施方案中，测定步骤包括选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于荧光的测定和超高通量测定，例如，表面等离子共振术(SPR)或荧光相关光谱(FCS)测定的测定。在此类实施方案中，SPR传感器用于指导生物分子相互作用的实时观察，因为SPR对金属-电介质表面上的微小折射率改变非常敏感。SPR是对大约200nm的SPR传感器/样品介面内的105至10-6折射率(RI)单位的改变敏感的表面技术。因此，SPR光谱法用于监控沉积在传感层上的薄有机薄膜的生长。
因为组合物、试剂盒和方法依赖于一种或多种标志物的表达水平的差异的检测，因此期望标志物的表达水平显著大于用于评估至少一种正常细胞和受结肠癌影响的细胞中的表达的方法的最小检测极限。
应理解，通过使用一种或多种标志物对另外的受试者样品进行常规筛选，将了解某些标志物在不同类型的细胞，包括受试者的特定病症和/或疾病状态细胞中过表达。
此外，通过就标志物的表达评估更大数量的受试者样品，并且使从其获得样品的个体受试者的结果相互关联，还将确认某些标志物的改变的表达与受试者的病症和/或疾病状态强相关以及其他标志物的改变的表达与其他疾病强相关。从而组合物、试剂盒和方法可用于表征受试者的病症和/或疾病状态的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种。
当组合物、试剂盒和方法用于表征受试者的病症和/或疾病状态的分期、分级、组织学类型和性质中的一种或多种时，期望选择标志物或标志物组以使在至少大约20％，在某些实施方案中，至少大约40％、60％或80％和基本上所有受试者(其患有相应分期、分级、组织学类型或性质的病症和/或疾病状态)中获得阳性结果。可选择本发明的标志物或标志物组以使对于一般群体可获得大于大约10％的阳性预测值(在非限定性的实例中，外加大于80％的测定特异性)。
当多个标志物用于组合物、试剂盒和方法时，可在单个反应混合物(即，使用针对各个标志物的试剂，例如不同的荧光探针)或在相应于一个或多个标志物的单独的反应混合物中，将受试者样品中各标志物的表达水平与相同类型的非病症和/或非疾病样品中多个标志物中的每一个的正常表达水平相比较。在一个实施方案中，相对于相应的正常水平，样品中一个以上的标志物的显著增加的表达水平表示受试者患有病症和/或疾病状态。当使用多个标志物时，可使用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多个单独的标志物；在某些实施方案中，可能期望使用更少的标志物。
为了使组合物、试剂盒和方法的灵敏性最大化(即在干扰可归因于受试者样品中系统来源的细胞的情况下)，期望本文中所使用的标志物是具有受限制的组织分布(例如通常不在非系统组织中表达)的标志物。
应认识到，组合物、试剂盒和方法对于具有增加的发生受试者的病症和/或疾病状态的风险的受试者和他们的医学顾问将是特别有用的。被认为具有增加的发生病症和/或疾病的风险的受试者包括例如具有此类病症或疾病的家族史的受试者。
可以以多种方法评估正常人系统组织中标志物的表达水平。在一个实施方案中，该正常表达水平通过下述来评估：评估一部分表现正常的系统细胞中标志物的表达水平且将该正常表达水平与一部分怀疑为异常的系统细胞中的表达水平相比较。备选地，特别是当由于常规进行本文中所述的方法而可获得进一步的信息时，可使用标志物的正 常表达的群体平均值。在其他实施方案中，标志物的″正常″表达水平可通过评估标志物在从未受影响的受试者获得的受试者样品、在怀疑病症和/或疾病状态在受试者中发作之前从受试者获得的受试者样品、编档保存的受试者样品等中的表达来进行测定。
本文中还提供了用于评估病症和/或疾病状态细胞在样品(例如编档保存的组织样品或从受试者获得的样品)中的存在的组合物、试剂盒和方法。这些组合物、试剂盒和方法基本上与上述的相同，除了必要时，使组合物、试剂盒和方法适用于除了受试者样品外的样品。例如，当待使用的样品是石蜡包埋的(parafinized)编档保存的人组织样品时，可能必需在用于评估样品中标志物表达水平的组合物、试剂盒或方法中调整化合物的比例。
试剂盒和试剂
试剂盒可用于评估疾病细胞的存在(例如在样品例如受试者样品中)。试剂盒包括多种试剂，其各自能够特异性结合标志物核酸或蛋白质。用于与标志物蛋白结合的合适的试剂包括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。用于与标志物核酸(例如基因组DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)结合的合适的试剂包括互补核酸。例如，核酸试剂可包括固定至基质的寡核苷酸(标记的或未标记的)、不与基质结合的标记的寡核苷酸、PCR引物对、分子信标探针等。
试剂盒可任选地包含用于进行本文中所述的方法的另外的成分。例如，试剂盒可包含适合于使互补核酸退火或适合于使抗体与其特异性结合的蛋白质结合的液体(例如SSC缓冲液)、一个或多个样品隔室、描述方法的进行的说明书、正常结肠系统细胞样品、结肠癌相关疾病细胞样品等。
产生抗体的方法
本文中还提供了制备产生用于评估受试者是否患有病症和/或疾病状态的抗体的分离的杂交瘤的方法。在该方法中，合成或分离(例如通过从表达其的细胞纯化或通过体内或体外转录和翻译编码蛋白质或肽的核酸)含有完整标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽。使用蛋白 质或肽免疫脊椎动物例如哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔或绵羊。任选地(和优选地)可用蛋白质或肽免疫脊椎动物至少另外一次，从而使脊椎动物呈现强烈的针对蛋白质或肽的免疫应答。从免疫的脊椎动物分离脾细胞，使用多种方法中的任一种将其与永生化的细胞系融合从而形成杂交瘤。然后使用标准方法筛选以该方式形成的杂交瘤，从而鉴定一个或多个产生特异性结合标志物蛋白或其片段的抗体的杂交瘤。本文还提供了通过该方法制备的杂交瘤和使用这样的杂交瘤制备的抗体。
评估功效的方法
本文还提供了评估测试化合物抑制疾病细胞的功效的方法。如上所述，标志物的表达水平的差异与受试者的细胞的异常状态相关。虽然公认，某些标志物的表达水平的变化可能由此类细胞的异常状态引起，但同样公认，其他标志物的表达水平的变化诱导、维持和促进此类细胞的异常状态。因此，抑制受试者的病症和/或疾病状态的化合物将使一个或多个标志物的表达水平改变至更接近该标志物的正常表达水平(即，所述标志物在正常细胞中的表达水平)的水平。
因此本方法包括将在测试化合物存在的情况下维持的第一细胞样品中的标志物的表达与在测试化合物不存在的情况下维持的第二结肠细胞样品中的标志物的表达相比较。在测试化合物存在的情况下，标志物的显著减少的表达表示该测试化合物抑制相关疾病。细胞样品可以例如是获自受试者的正常细胞的单个样品的等分、获自受试者的正常细胞的混合样品、正常细胞系的细胞、获自受试者的相关疾病细胞的单个样品的等分、获自受试者的相关疾病细胞的混合样品、相关疾病细胞系的细胞等。
在一个实施方案中，样品是获自受试者的癌症相关疾病细胞，并且检测多种据认为对于抑制各种癌症相关疾病是有效的化合物，以鉴定可能最佳地抑制受试者的癌症相关疾病的化合物。
同样可将该方法用于评估疗法抑制受试者的相关疾病的有效性。在该方法中，评估一个或多个标志物在样品对(一个样品经历疗法， 另一个不经历疗法)中的表达水平。与评估测试化合物的有效性的方法一样，如果疗法诱导显著更低的标志物表达水平，则疗法对于抑制癌症相关疾病是有效的。如上，如果来自选择的受试者的样品用于本方法，那么可在体外评估备选疗法以选择对于抑制受试者的癌症相关疾病最可能有效的疗法。
如本文中所描述的，人细胞的异常状态与标志物的表达水平的变化相关。还提供了用于评估测试化合物的有害潜能的方法。该方法包括在测试化合物存在和不存的情况下维持分开的人细胞等分。比较各等分中标志物的表达。在测试化合物存在的情况下维持的等分中标志物的显著更高的表达水平(相对于在测试化合物不存在的情况下维持的等分)表示测试化合物具有有害的潜能。各种测试化合物的相对有害潜能可通过比较相关标志物的表达水平的增强或抑制的程度，通过比较其表达水平被增强或抑制的标志物的数目，或通过比较两者来评估。在下列部分更详细地描述了各个方面。
分离的蛋白质和抗体
一个方面涉及分离的标志物蛋白和其生物活性部分，以及适合用作免疫原以产生抗标志物蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方案中，天然标志物蛋白可使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织来源分离。在另一个实施方案中，含有完整的标志物蛋白或其区段的蛋白质或肽通过重组DNA技术产生。除重组表达外，可使用标准肽合成技术化学合成此类蛋白质或肽。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含细胞材料或来自细胞或组织来源(所述蛋白质源自于其)的其他污染性蛋白，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学药品。术语“基本上不含细胞材料”包括其中将蛋白质与从其分离或重组产生所述蛋白质的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。因此，基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有低于大约30％、20％、10％或5％(按干重计算)的异种蛋白质(在本文中也称为“污染性蛋白”)的蛋白质制剂。
当重组产生蛋白质或其生物活性部分时，其也优选基本上不含培 养基，即，培养基占据低于大约20％、10％或5％的蛋白质制剂的体积。当通过化学合成产生蛋白质时，其优选基本上不含化学前体或其他化学药品，即，其与参与蛋白质合成的化学前体或其他化学药品分离。因此，此类蛋白质制剂具有低于大约30％、20％、10％、5％(按干重计算)的化学前体或除了目的多肽外的化合物。
标志物蛋白的生物活性部分包括含有与标志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全长蛋白质更少的氨基酸，并且展示相应的全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应的全长蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。标志物蛋白的生物活性部分可以是其长度为例如10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此外，其中标志物蛋白的其他区域被缺失的其他生物活性部分可通过重组技术来制备，并且可就标志物蛋白的天然形式的一种或多种功能活性对其进行评估。在某些实施方案中，有用的蛋白质与此类序列之一基本上同一(例如，至少大约40％，在某些实施方案中，50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一)并且保持相应的天然发生的标志物蛋白的功能活性但因天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上不同。
此外，标志物蛋白的区段文库可用于产生用于筛选和随后选择变异标志物蛋白或其区段的多肽的多样化(variegated)群体。
预测医学
本文中还提供了动物模型和标志物在预测医学领域中的用途，其中诊断测定、预后测定、药物基因组学和监控临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性治疗个体。因此，本文中还提供了用于测定一个或多个标志物蛋白或核酸的表达水平以确定个体是否处于发生特定病症和/或疾病的风险中的诊断测定。此类测定可用于预后或预测目的，从而在病症和/或疾病发作之前预防性治疗个体。
在另一个方面，方法可用于相同个体的至少周期性筛查以观察该个体是否已暴露于改变他/她的表达模式的化学药品或毒素。
另一方面涉及监控被施用以抑制病症和/或疾病或治疗或预防任 何其他病症的试剂(例如，药物或其他化合物)在临床试验中对标志物的表达或活性的影响(例如，以了解这样的治疗可能具有的任何系统性作用)。
药物组合物
化合物可进行配制以用于在合适的药物载体中局部(topically)、局域(locally)或全身性施用。Remington′s PharmaceuticalSciences，第15版，E.W.Martin(Mark Publishing Company，1975)，公开了常用载体和制备方法。化合物还可以封装在用于靶向细胞的合适的生物相容性微胶囊、微粒或微球体(由生物可降解或非生物可降解聚合物或蛋白质或脂质体形成)。此类系统对于本领域技术人员来说是熟知的并且可进行最优化以与合适的核酸一起使用。
在例如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；和Ausubel等人，1994，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York中描述了用于核酸递送的各种方法。此类核酸递送系统包括期望的核酸，例如但不限于，其以“裸露的”形式作为“裸露的”核酸，或配制于适合于递送的媒介物中例如与阳离子分子或形成脂质体的脂质的复合物中，或作为载体的成分或药物组合物的成分。可将核酸递送系统直接(例如通过将其与细胞接触)或间接(例如通过任何生物过程的作用)提供给细胞。
用于局部施用的制剂可包括软膏、洗剂、乳膏剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。需要时可使用常规药物载体(水性的、粉状的或基于油的)或增稠剂。
适合用于胃肠外施用例如通过关节内(关节中)、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与期望的受者的血液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌悬浮液、溶液或乳剂，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、分散剂、稳定剂和防腐剂。用于注射的制剂可以以单位剂型、与加入的防腐剂一起存在，例如存在于安 瓿中或存在于多剂量容器中。本领域技术人员可容易地确定制备和配制组合物的各种参数而无需过度的实验。可单独地或与其他合适的成分组合来使用化合物。
一般地，施用化合物(包括核酸)的方法在本领域内是熟知的。特别地，已用于核酸治疗剂的施用途径，和目前使用的制剂一起，为选择的核酸提供了优选的施用和配制途径，当然这将取决于因素例如特定的制剂、待治疗的受试者的状态的严重度和治疗功效所需的剂量。如本文中通常使用的，“有效量”是指在对其施用了制剂的受试者(与未接受所述化合物的匹配的受试者相比较)中能够治疗病症的一个或多个症状，逆转病症的一个或多个症状的进展，终止病症的一个或多个症状的进展或预防病症的一个或多个症状的发生的量。化合物的实际有效量可根据待使用的特定化合物或其组合、配制的特定组合物、施用模式，和个体的年龄、体重、状况，和待治疗的症状或病况的严重度而变化。
本领域技术人员已知的任何可接受的方法可用于给受试者施用制剂。取决于待治疗的病况，施用可以是局部的(即，至特定区域、生理系统、组织、器官或细胞类型)或全身性的。
药物基因组学
标志物还可用作药物基因组学标志物。如本文中所用的，“药物基因组学标志物”是其表达水平与受试者中特定临床药物应答或易感性相关的目的生物化学标志物。药物基因组学标志物表达的存在或量与预测的受试者应答和更特别地受试者的肿瘤对用特定药物或药物种类的疗法的应答相关。通过评估受试者中一个或多个药物基因组学标志物的表达的存在或量，可选择最适合于受试者的或预测具有更大的成功程度的药物疗法。
监控临床试验
监控试剂(例如，药物化合物)对标志物的表达水平的影响不仅可用于基础药物筛选，而且还可用于临床试验。例如，可在接受结肠癌相关疾病治疗的受试者的临床试验中监控试剂影响标志物表达的有 效性。
在一个非限定性实施方案中，本发明提供了用于监控利用试剂(例如，激动剂、拮抗剂、模拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)治疗受试者的有效性的方法，该方法包括步骤：
在施用试剂之前从受试者获得施用前的样品；
检测一个或多个选择的标志物在施用前的样品中的表达水平；
从受试者获得一个或多个施用后的样品；
检测标志物在施用后的样品中的表达水平；
将施用前的样品中标志物的表达水平与施用后的样品中标志物的表达水平相比较；和
相应地改变试剂至受试者的施用。
例如，在治疗过程中增加的标志物基因的表达可表明无效剂量，从而需要增加剂量。相反地，减少的标志基因的表达可表明有效治疗，从而不需要改变剂量。
电子设备可读介质、系统、阵列和使用其的方法
如本文中所使用的，“电子设备可读介质”是指用于存储、保存或包含可用电子设备直接阅读和存取的数据或信息的任何适当介质。此类介质可包括但不限于：磁性存储介质，例如软盘、硬盘存储介质以及磁带；光学存储介质例如光盘；电子存储介质例如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等；以及普通硬盘和这些类别的混合体例如磁性/光学存储介质。可对介质进行改造或设定以用于在其上记录本文中所述的标志物。
如本文中所用的，术语“电子设备”旨在包括任何适当的计算或处理设备或其他经改造或设定用于存储数据或信息的装置。适合用于本发明的电子设备的实例包括独立的计算设备；网络，包括局域网(LAN)、广域网络(WAN)因特网、内联网和外联网；电子器具例如个人数字助理(PDA)、手机、寻呼机(pager)等；以及局域和分布式处理系统。
如本文中所使用的，“记录”是指在电子设备可读介质上存储或 编码信息的过程。本领域技术人员可容易地采用任何用于在介质上记录信息的方法来产生包含本文中所述的标志物的材料。
许多软件程序和格式可用于在电子设备可读介质上存储本发明的标志物信息。为了获得或产生在其上记录了标志物的介质，可使用许多数据处理程序构建格式(data processor structuring format)(例如，文本文件或数据库)。通过以可读形式提供标志物，可常规存取用于多种目的的标志物序列信息。例如，本领域技术人员可使用可读形式的核苷酸或氨基酸序列来将靶序列或靶结构基序与存储在数据存储工具中的序列相比较。搜索工具用于鉴定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或区域。
因此，本文中还提供了用于保存进行确定受试者是否具有癌症相关疾病或对癌症相关疾病的易感性的方法的说明书的介质，其中所述方法包括步骤：确定标志物的存在或不存在，并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否具有癌症相关疾病或对癌症相关疾病的易感性，和/或推荐用于癌症相关疾病或癌症相关疾病前状况(pre-cancer-related disease condition)的特定治疗。
本文中还提供了电子系统和/或在网络中提供了用于确定受试者是否患有癌症相关疾病或具有对与标志物相关的癌症相关疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步骤：确定标志物的存在或不存在，并且基于标志物的存在或不存在来确定受试者是否患有特定病症和/或疾病或具有对此类病症和/或疾病的易感性，和/或推荐用于此类疾病或病症和/或这样的癌症相关疾病前状况的特定治疗。该方法还可包括接收与受试者相关的表型信息和/或从网络获取与受试者相关的表型信息的步骤。
本文中还提供了网络，用于确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对与标志物相关的病症和/或疾病的易感性的方法，所述方法包括步骤：接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或病症和/或疾病的信息，并且基于表型信息、标志物和获取的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有病症 和/或疾病或具有对其的易感性。所述方法还包括推荐用于病症和/或疾病或对其的易感性的特定治疗的步骤。
本文中还提供了用于确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性的商业方法，所述方法包括步骤：接收与标志物相关的信息，接收与受试者相关的表型信息，从网络获取相应于标志物和/或病症和/或疾病的信息，并且基于表型信息、标志物和获得的信息中的一个或多个，确定受试者是否患有病症和/或疾病或具有对其的易感性。所述方法还可包括推荐用于其的特定治疗的步骤。
本文中还提供了可用于测定阵列中一个或多个基因的表达的阵列。在一个实施方案中，阵列可用于测定组织中基因的表达，从而确定阵列中基因的组织特异性。这样，可就表达同时测定直至大约7000或更多个基因。这使得能够产生显示在一个或多个组织中特异性表达的一组基因的特征谱。
除了此类定性测定外，本文中还提供了基因表达的定量。因此，不仅组织特异性而且一组基因在组织中的表达水平也是可确定的。因此，可基于基因本身的组织表达和在该组织中的表达水平来对基因进行分类。这可用于例如确定组织间基因表达的关系。因此，可干扰一个组织，然后可测定对第二组织中的基因表达的影响。在本说明书中，可测定一种细胞类型对另一种细胞类型(响应生物刺激)的影响。
此类测定可用于例如在基因表达的水平上了解细胞间相互作用的效果。如果试剂被治疗性施用以治疗一种细胞类型但其对另一种细胞类型具有不期望的作用，则所述方法提供了确定不期望的作用的分子基础的测定，从而提供共施用中和剂(counteracting agent)或另外治疗不期望的作用的机会。类似地，即使在单个细胞类型中，可在分子水平上测定不期望的生物学效应。因此，可确定和中和试剂对非靶基因的表达的作用。
在另一个实施方案中，阵列可用于监控阵列中一个或多个基因的表达的时程。如本文中所公开的，这可发生在各种生物学背景(例如病症和/或疾病的发生，其进展)和过程(例如与其相关的细胞转化) 中。
阵列还可用于确定基因的表达或其他基因的表达在相同细胞或不同细胞中的作用。如果不能调控最终或下游靶，那么这提供了例如用于治疗性干预的备选分子靶的选择。
阵列还可用于确定一个或多个基因在正常和异常细胞中的差异表达模式。这提供了可用作诊断或治疗性干预的分子靶的一组基因。
替代标志物(Surrogate Marker)
标志物可用作一种或多种病症或疾病状态或导致其的状况的替代标志物。如本文中所使用的，“替代标志物”是与疾病或病症的不存在或存在，或与疾病或病症的进展相关的目的生物化学标志物。此类标志物的存在或量不依赖于疾病。因此，此类标志物可用于指示特定的疗程在减轻疾病状态或病症中是否有效。当疾病状态或病症的存在或程度难以通过标准方法来评估，或当在达到潜在危险的临床终点之前期望评估疾病进展时，替代标志物是特别有用的。
标志物还可用作药效标志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的，“药效标志物”是与药物作用特异性相关的目的生物化学标志物。药效标志物的存在或量与将对其施用药物的疾病状态或病症无关；因此，标志物的存在或量表示药物在受试者中的存在或活性。例如，药效标志物可表示药物在生物组织中的浓度，因为标志物在该组织中表达或转录，或者不表达或转录与药物的水平相关。这样，药物的分布或吸收可通过药效标志物来监控。类似地，药效标志物的存在或量可与药物的代谢产物的存在或量相关，这样标志物的存在或量表示药物在体内的相对分解速率。
药效标志物在增加药物作用的检测的灵敏性中特别有用，特别是当以低剂量施用药物时。由于即使少量的药物也可足以激活多轮的标志物转录或表达，因此扩增的标志物可以以比药物本身更容易检测的量存在。同样，标志物由于其本身的性质而可以更容易地进行检测；例如，通过使用本文中描述的方法，可将抗体用于针对蛋白标志物的基于免疫的检测系统，或可使用标志物特异性放射性标记探针来检测 mRNA标志物。此外，药效标志物的使用可提供由于药物治疗超出可直接观察的范围而产生的风险的基于机制的预测。
用于检测的方案
检测病症和/或疾病的方法可包括例如在一段时间内测量各标志物基因在来自受试者的生物学样品中的表达水平和将该水平与对照生物学样品中标志物基因的水平相比较。
当标志物基因是本文中描述的基因之一并且表达水平差异表达(例如，比对照中的表达水平更高或更低)时，受试者被判断为患有病症和/或疾病。当标志物基因的表达水平落在容许的范围内时，受试者不可能患有所述病症和/或疾病。
可通过测量对照中标志物基因的表达水平来预先测定对照的标准值，以比较表达水平。例如，可基于上述标志物基因在对照中的表达水平来测定标准值。例如，在某些实施方案中，容许的范围基于标准值采用±2S.D.。在测定标准值后，可通过只测量来自受试者的生物学样品中的表达水平并将该值与测定的对照的标准值相比较来进行检测方法。
标志物基因的表达水平包括标志物基因至mRNA的转录和至蛋白质的翻译。因此，基于相应于标志物基因的mRNA的表达强度或由标志物基因编码的蛋白质的表达水平的比较，进行检测病症和/或疾病的一个方法。
可根据各种基因分析方法在病症和/或疾病的检测中测量标志物基因的表达水平。具体地，可使用例如利用与此类基因杂交的核酸作为探针的杂交技术，或利用与标志物基因杂交的DNA作为引物的基因扩增技术。
可基于标志物基因的核苷酸序列设计用于检测的探针或引物。本文中描述了各标志物基因的核苷酸序列的标识号。
此外，应理解，高等动物的基因通常伴有高频率的多态性。也存在许多在剪接过程中产生含有相互不同的氨基酸序列的同种型的分子。与结肠癌相关疾病相关的、具有与标志物基因的活性相似的活性 的任何基因包括在标志物基因中，即使其由于多态性或为同种型而具有核苷酸序列差异。
也应理解，标志物基因可包括除了人外的其他物种的同源物。因此，除非明确指出，否则表述“标志物基因”是指对于物种独特的标志物基因的同源物或已被导入个体的外源标志物基因。
同样，应理解，“标志物基因的同源物”是指来源于除了人以外的物种的基因，其在严格条件下可作为探针与人标志物基因杂交。这样的严格条件对于本领域技术人员(其可通过实验或凭经验选择适当的条件来产生相同严格性)来说是已知的。
含有标志物基因的核苷酸序列或与标志物基因的核苷酸序列的互补链互补并且具有至少15个核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探针。因此，“互补链”是指由A:T(对于RNA为U)和G:C碱基对组成的双链DNA中相对于另一条链的一条链。
此外，“互补”不仅意指与至少15个连续核苷酸的区域完全互补的序列，而且还指具有在某些情况下至少40％，在某些情况下50％，在某些情况下60％，在某些情况下70％，在某些情况下80％、在某些情况下90％和在某些情况下95％或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之间的同源性的程度可利用算法BLAST等来测定。
此类多核苷酸可用作检测标志物基因的探针，或用作扩增标志物基因的引物。当用作引物时，多核苷酸通常包含15bp至100bp，在某些实施方案中15bp至35bp的核苷酸。当用作探针时，DNA包含标志物基因的整个核苷酸序列(或其互补链)，或具有至少15bp核苷酸的其部分序列。当用作引物时，3′区域必须与标志物基因互补，而5′区域可连接至限制性内切酶识别序列或标签(tag)。
“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此类多核苷酸可以是合成的或天然发生的。同样，通常也标记用作杂交探针的DNA。本领域技术人员易于理解此类标记方法。在本文中，术语“寡核苷酸”意指具有相对低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸内。
可使用例如Northern杂交、斑点印迹杂交或DNA微阵列技术进行 利用杂交技术的病症和/或疾病的检测。此外，可使用基因扩增技术例如RT-PCR法。通过在RT-PCR的基因扩增步骤中使用PCR扩增监控法，可更加定量地分析标志物基因的表达。
在PCR基因扩增监控法中，将检测靶(DNA或RNA的反转录物)与用荧光染料和吸收荧光的猝灭剂标记的探针杂交。当PCR进行并且Taq聚合酶以其5′-3′外切核酸酶活性降解探针时，荧光染料与猝灭剂彼此分离，从而检测到荧光。实时检测荧光。通过同时测量其中靶的拷贝数是已知的标准样品，可利用循环数(其中PCR扩增是线性的)测定受试者样品中靶的拷贝数。同样，本领域技术人员公认PCR扩增监控法可使用任何适当的方法来进行。
还可通过检测标志物基因编码的蛋白质来进行检测结肠癌相关疾病的方法。在下文中，标志物基因编码的蛋白质被描述为“标志物蛋白”。对于此类检测方法，可通过使用结合各标志物蛋白的抗体来应用例如，Western印迹法、免疫沉淀法和ELISA法。
用于检测的结合标志物蛋白的抗体可通过任何适当的技术来产生。同样，为了检测标志物蛋白，可适当地标记这样的抗体。备选地，可不标记抗体，而是标记特异性结合抗体的物质例如蛋白A或蛋白G以间接检测标志物蛋白。更特别地，此类检测方法可包括ELI SA法。
可以例如通过将标志物基因或其部分插入表达载体，将构建体导入适当的宿主细胞来产生转化株，培养所述转化株以表达重组蛋白，然后从培养物或培养上清液纯化表达的重组蛋白来获得用作抗原的蛋白质或其部分肽。备选地，可化学合成由基因编码的氨基酸序列或含有由全长cDNA编码的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。
此外，可通过将不仅生物学样品中标志物基因的表达水平而且标志物蛋白的活性用作指标来进行结肠癌相关疾病的检测。标志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物学活性。可使用各种方法测量每一种蛋白的活性。
即使在常规检测中受试者未被诊断为患有病症和/或疾病(尽管症状暗示此类疾病)，这样的受试者是否患有病症和/或疾病也可通过按 照本文中所述的方法进行检测来容易地确定。
更特别地，在某些实施方案中，当标志物基因是本文描述的基因之一时，其症状至少暗示对病症和/或疾病的易感性的受试者中，标志物基因的表达水平的增加或减少表明症状主要由所述病症和/或疾病引起。
此外，检测可用于确定病症和/或疾病是否在受试者中得到改善。换句话说，本文中描述的方法可用于判断用于所述病症和/或疾病的治疗的治疗效果。此外，当标志物基因是本文描述的基因之一时，已被诊断为患有所述病症和/或疾病的受试者中，标志物基因的表达水平的增加或减少意味着疾病已向前发展。
还可基于表达水平的差异测定病症和/或疾病的严重度和/或对其的易感性。例如，当标志物基因是本文描述的基因之一时，标志物基因的表达水平的增加程度与病症和/或疾病的存在和/或严重度相关。
动物模型
还可产生病症和/或疾病的动物模型，其中一个或多个标志物基因或功能上与标志物基因等同的基因的表达水平在所述动物模型中已被提高。如本文中所用的，“功能上等同的基因”通常是编码具有与标志物基因编码的蛋白质的已知活性相似的活性的蛋白质的基因。功能上等同的基因的代表性实例包括受试动物的标志物基因对应物，其是动物本身固有的。
动物模型可用于检测由于病症和/或疾病而引起的生理学变化。在某些实施方案中，动物模型可用于揭示标志物基因的另外的功能和评估其靶为标志物基因的药物。
动物模型可通过控制对应物基因的表达水平或施用对应物基因来产生。方法可包括通过控制选自本文中所述的基因的基因的表达水平来产生动物模型。在另一个实施方案中，方法可包括通过施用由本文中所描述的基因编码的蛋白质或施用抗所述蛋白的抗体来产生动物模型。还应理解，在某些其他实施方案中，可过表达标志物，以便可使用适当的方法测量标志物。在另一个实施方案中，动物模型可通过导 入选自此类基因的基因，或通过施用由这样的基因编码的蛋白质来产生。在另一个实施方案中，病症和/或疾病可通过抑制选自此类基因的基因的表达或由这样的基因编码的蛋白质的活性来诱导。反义核酸、核酶或RNAi可用于抑制表达。蛋白质的活性可通过施用抑制所述活性的物质例如抗体来有效地控制。
动物模型可用于阐明病症和/或疾病背后的机制，还可用于检测通过筛选获得的化合物的安全性。例如，当动物模型产生特定病症和/或疾病的症状时，或当牵涉某种病症和/或疾病的测量值在动物中改变时，可构建筛选系统以探测具有减轻疾病的活性的化合物。
如本文中所使用的，表述“表达水平的增加”是指下列情况的任一种：人工表达作为外源基因导入的标志物基因；受试动物本身固有的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译得到增强；或作为翻译产物的蛋白质的水解被抑制。
如本文中所用的，表述“表达水平的减少”是指其中受试动物的标志物基因的转录和其至蛋白质的翻译被抑制的情况，或其中作为翻译产物的蛋白质的水解被增强的情况。基因的表达水平可以例如通过DNA芯片上信号强度的差异来测定。此外，翻译产物(蛋白质)的活性可通过与正常情况中的活性相比较来测定。
也在预期的范围内的是：动物模型可包括转基因动物，包括例如其中已人工导入并且表达标志物基因的动物；标志物基因敲除动物；和其中已用另一个基因置换标志物基因的基因敲入动物。已向其中导入了标志物基因的反义核酸、核酶、具有RNA i作用的多核苷酸或用作诱饵核酸的DNA等的转基因动物可用作转基因动物。此类转基因动物还包括例如这样的动物，在所述动物中标志物蛋白的活性已通过将突变导入基因的编码区而得到增强或抑制，或氨基酸序列已被修饰而变得抗水解或对水解敏感。氨基酸序列中的突变包括置换、缺失、插入和添加。
表达的实例
此外，标志物基因本身的表达可通过向基因的转录调控区导入突 变来控制。本领域技术人员理解此类氨基酸置换。同样，被突变的氨基酸的数目不受特别限制，只要活性得到保持即可。通常，其在50个氨基酸以内，在某些非限定性实施方案中，在30个氨基酸以内，在10个氨基酸以内，或在3个氨基酸以内。突变的位点可以是任何位点，只要活性得到保持即可。
在另一个方面，本文中提供了治疗特定病症和/或疾病的治疗剂的候选化合物的筛选方法。一个或多个标志物基因选自本文中描述的基因。可通过选择能够增加或减少标志物基因的表达水平的化合物来获得结肠癌相关疾病的治疗剂。
应理解，表述“增加基因的表达水平的化合物”是指促进基因转录、基因翻译或蛋白质活性的表达的步骤中的任一步骤的化合物。另一方面，表述“减少基因的表达水平的化合物”，如本文中所用的，是指抑制这些步骤中的任一步骤的化合物。
在特定的方面，可在体内或体外进行筛选用于病症和/或疾病的治疗剂的方法。该筛选方法可以例如通过下列步骤来进行：
对动物受试者施用候选化合物；
测量动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平；或
选择与对照(其未与候选化合物接触)中标志物基因的表达水平相比较增加或减少标志物基因的表达水平的化合物。
在另一个方面，本文中提供了这样的方法，其通过将动物受试者与候选化合物接触，然后监控化合物对来源于动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平的作用来评估药剂的候选化合物对标志物基因的表达水平的功效。来源于动物受试者的生物学样品中标志物基因的表达水平的变化可使用与上述检测方法中所用的相同的技术来监控。此外，基于评估，可通过筛选来选择药剂的候选化合物。
本文中所引用的所有专利、专利申请和参考文献以其全文通过引用合并入本文。虽然对于制备和使用其的本领域技术人员来说已十分详尽地描述和例示了本发明，但各种改变、修饰和改进是显然的，且不背离本发明的精神和范围。本领域技术人员易于理解，本发明可进 行适当地改变以适合于实现目的和获得提及的目标和有利方面以及其中固有的那些。
某些核碱基(Nucleobase)序列
本文中描述的成熟miRNA和它们的相应的茎-环序列的核碱基序列是见于miRBase(见于http://microrna.sanger.ac.uk/的miRNA序列和注释的在线可搜索数据库)中的序列。miRBase序列数据库中的条目(entry)代表预测的miRNA转录物的发夹部分(茎-环)和关于成熟miRNA序列的定位和序列的信息。数据库中miRNA的茎-环序列严格说来不是前体miRNA(pre-miRNA)，并且在一些情况下可包括pre-miRNA和来自假定的初级转录物的一些侧翼序列。本文中描述的miRNA核碱基序列包括miRNA的任何形式，包括miRBase序列数据库的Release 10.0中描述的序列和miRBase序列数据库的任何更早的Release中描述的序列。序列数据库释放可导致某些miRNA的重新命名。序列数据库释放可导致成熟miRNA序列的变化。可包括此类修饰的寡核苷酸的化合物可与本文中描述的miRNA的任何核碱基序列形式互补。
应理解，本文中所示的任何核碱基序列不依赖于对糖部分、核苷间连接或核碱基的任何修饰。还应理解，包含U的核碱基序列也包括其中在一个或多个具有‘U’的位点上‘U’被‘T’置换的相同核碱基序列。反过来，应理解，包含T的核碱基序列也包括其中在一个或多个具有‘T’的位点上‘T’被‘U’置换的相同核碱基序列。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核碱基序列，这意味着修饰的寡核苷酸的核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域中与miRNA或其前体的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或两个序列在严格杂交条件下杂交。因此，在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列相对于其靶miRNA或靶miRNA前体序列可具有一个或多 个错配的碱基对，并且能够与其靶序列杂交。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与miRNA或其前体100％互补的核碱基序列。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列具有对miRNA的全长互补性。
miRNA(miR)疗法
在一些实施方案中，本发明提供了抑制受试者的一个或多个基因的表达的微RNA。微RNA表达特征谱可用作新型癌症生物标志物。
本文中包括使用一个或多个MiR抑制基因表达和/或活性的方法。在一些实施方案中，miR抑制蛋白质的表达。在其他实施方案中，miRNA抑制基因活性(例如，细胞侵袭活性)。
可通过本领域技术人员熟知的许多种技术从细胞或组织分离，重组产生或体外合成miRNA。在一个实施方案中，从细胞或组织分离miRNA。用于从细胞或组织分离miRNA的技术对于本领域技术人员来说是熟知的。例如，可使用来自Ambion，Inc.的mirVana miRNA分离试剂盒从总RNA分离miRNA。另一种技术利用flashIPAGETMFractionatorSystem(Ambion，Inc.)来进行小核酸的PAGE纯化。
关于miRNA治疗剂的使用，本领域技术人员理解，体内施用的核酸被吸收和分配至细胞和组织。
可以以合适的方式递送核酸，所述方式使得能够组织特异性地吸收试剂和/或核酸递送系统。本文中描述的试剂可通过任何已知的常规疗法来补充治疗状况，所述疗法包括但不限于抗体施用、疫苗施用、细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物和生物应答调节剂的施用。可一起或相继使用两个或多个组合的化合物。
本发明的某些实施方案提供了包含(a)一种或多种核酸或小分子化合物以及(b)一种或多种其他化学治疗剂的药物组合物。
另外的有用的定义
“受试者”是指经选择接受治疗或疗法的人或非人动物。“怀疑患有……的受试者”是指展示病症、疾病或病况的一个或多个临床指标的受试者。
“预防”或“防止”是指延迟或阻止病况或疾病的发作、发展或进展，持续一段时间，包括数周、数月或数年。“治疗”或“医治”是指一种或多种用于治愈或改善病症和/或疾病的特定方法的应用。在某些实施方案中，特定方法是一种或多种药剂的施用。
“改善”是指减轻病况或疾病的至少一个指标的严重度。在某些实施方案中，改善包括病况或疾病的一个或多个指标的进展的延迟或减缓。指标的严重度可通过对于本领域技术人员来说是已知的主观或客观量度来测定。
“有此需要的受试者”是指确定为需要治疗或疗法的受试者。
“施用”是指给受试者提供药剂或组合物，包括但不限于由医学专业人员施用和自我施用。
“胃肠外施用”是指通过注射或输注进行的施用。胃肠外施用包括但不限于皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用和颅内施用。“皮下施用”是指紧在皮肤下方施用。
“改善功能”是指使功能向正常参数改变。在某些实施方案中，通过测量在受试者的体液中发现的分子评估功能。“药物组合物”是指适合于给个体施用的物质的混合物，其包括药剂。例如，药物组合物可包含修饰的寡核苷酸和无菌水性溶液。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶”都是指能够被反义化合物靶向的核酸。“靶向”是指与靶核酸杂交并且诱导期望的作用的核碱基序列的设计和选择的过程。“被靶向”是指具有核碱基序列，所述序列允许与靶核酸杂交以诱导期望的作用。在某些实施方案中，期望的作用是靶核酸的减少。
“调控”是指对功能或活性的干扰。在某些实施方案中，调控是指基因表达的增加。在某些实施方案中，调控是指基因表达的减少。
“表达”是指藉以将基因的编码信息转变成存在于细胞中和在细胞中运转的结构的任何功能和步骤。
“区域”是指核酸内一部分连接的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的区域互补的核碱基序列。例如，在某些 此类实施方案中，修饰的寡核苷酸与miRNA茎-环序列的区域互补。在某些此类实施方案中，修饰的寡核苷酸与miRNA序列的区域100％同一。
“区段”是指更小的区域或区域的亚部分。
“核碱基序列”是指以5′至3′方向，不依赖于任何糖、连接和/或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
“连续核碱基”是指核酸中彼此紧密相邻的核碱基。
“核碱基互补性”是指两个核碱基通过氢键非共价配对的能力。“互补”是指第一核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域内与第二核碱基序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或100％同一，或两个序列在严格杂交条件下杂交。在某些实施方案中，具有与miRNA或其前体100％互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸可以在修饰的寡核苷酸的整个长度上不与miRNA或其前体100％互补。
“互补性”是指第一核酸与第二核酸之间的核碱基配对能力。“全长互补性”是指第一核酸的各核碱基能够与第二核酸中相应的位点上的各核碱基配对。例如，在某些实施方案中，其中各核碱基与miRNA中的核碱基具有互补性的修饰的寡核苷酸与miRNA具有全长互补性。
“百分比互补性”是指核酸中互补核碱基的数目除以核酸的长度。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的百分比互补性是指与靶核酸互补的核碱基的数目除以修饰的寡核苷酸的核碱基数目。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的百分比互补性是指与miRNA互补的核碱基的数目除以修饰的寡核苷酸的核碱基的数目。
“百分比结合的区域”是指与寡核苷酸区域互补的区域的百分比。通过将与寡核苷酸互补的靶区域的核碱基的数目除以靶区域的长度来计算百分比结合的区域。在某些实施方案中，百分比结合的区域是至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％。
“百分比同一性”是指第一核酸中与第二核酸相应的位点上的核碱基相同的核碱基的数目除以第一核酸中的核碱基的总数。
本文中使用的“大体上同一的”可以指第一与第二核碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核碱基的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或100％同一。
“杂交”是指通过核碱基的互补性发生的互补核酸的退火。
“错配”是指不能够与第二核酸的相应的位点上的核碱基配对的第一核酸的核碱基。
“非互补核碱基”是指不能够通过氢键配对的两个核碱基。
“同一的”是指具有相同核碱基序列。
“miRNA”或“miR”是指长度在18至25个核碱基之间的非编码RNA，其与编码RNA杂交并且调控编码RNA的表达。在某些实施方案中，miRNA是Dicer切割pre-miRNA的产物。miRNA的实例见于称为miRBase的miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk)。
“Pre-miRNA”或″pre-miR”是指具有发夹结构的非编码RNA，其包含miRNA。在某些实施方案中，pre-miRNA是称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶切割pri-miR的产物。
“茎-环序列”是指具有发夹结构并且包含成熟miRNA序列的RNA。Pre-miRNA序列和茎-环序列可重叠。茎-环序列的实例可见于称为miRBase的miRNA数据库(microrna.sanger.ac.uk/)。
“miRNA前体”是指源自基因组DNA并且包含含有一个或多个miRNA序列的非编码性结构化RNA的转录物。例如，在某些实施方案中，miRNA前体是pre-miRNA。在某些实施方案中，miRNA前体是pri-miRNA。
“反义化合物”是指具有允许与靶核酸杂交的核碱基序列的化合物。在某些实施方案中，反义化合物是具有与靶核酸互补的核碱基序列的寡核苷酸。
“寡核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，各核苷可以彼此独立地被修饰或不被修饰。“天然发生的核苷间连接”是指核苷之间的3′至5′磷酸二酯连接。“天然核碱基”是指相对于其天然发生的形式未被修饰的核碱基。“miR拮抗剂”是指经设计用于干扰或抑制miRNA的活性的试剂。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括靶向miRNA的反义化合物。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括具有与miRNA或其前体的核碱基序列互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，miR拮抗剂包括干扰或抑制miRNA的活性的小分子等。
本文中所描述的方法和试剂代表优选实施方案，是示例性的，并且不意欲限制本发明的范围。其中的改进和其他用途对于本领域技术人员来说显然的。这些改进包括在本发明的精神内并且由权利要求的范围界定。对于本领域技术人员来说，同样极显然的是可对本文中公开的发明进行各种替代和改进而不背离本发明的范围和精神。
应理解，虽然本发明已通过优选实施方案和任选特征明确地公开，但本领域技术人员可采用本文中公开的概念的改进和变化，并且此类改进和变化被认为在由所附权利要求界定的本发明的范围内。
虽然通过参考各种和优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，可进行各种变化并且可用等同物替代其元素而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改进以使特定的情况或材料适合于本发明的教导而不背离本发明的基本范围。
参考文献
本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的公开案和其他材料通过引用合并入本文，并且为方便起见提供于下列参考书目中。
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Claims (76)
1.其沉默表征慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中mi R-15a/16-1诱导的表型的基因的特征。
2.miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR用于使一个或多个白血病细胞模型和原发性慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中的基因失调的用途。
3.使用权利要求1的特征开发CLL的治疗方法的方法。
4.miR-15a和miR-16-1簇作为慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中的肿瘤抑制剂的用途。
5.抑制白血病细胞的肿瘤植入物的生长的方法，其包括将此类细胞暴露于miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR，其中对此类细胞施加肿瘤抑制功能。
6.在有此需要的受试者中发挥抗白血病作用的方法，其包括通过给受试者施用miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR或其功能性变体来直接沉默IGSF4。
7.CLL与用miR-15a/16-1转染的MEG-01之间共同的基因的特征，其包括图15-表11中所列的一个或多个基因。
8.miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR和miR-29用于治疗CLL的用途。
9.miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR和miR-29在治疗CLL中的用途，其包括靶向MCL1和c-JUN转录物，其中miR-15a/16-1簇对B-CLL细胞的存活的影响增加。
10.减少PDCD4、RAB21、IGSF4、SCAP2和/或蛋白质组学鉴定的蛋白质(Bcl2、Wt1)中的一个或多个的表达的方法，其包括用miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR转染有此需要的细胞。
11.miR-15a/16-1簇直接靶向IGSF4的用途。
12.抑制细胞的生长的方法，其包括在一定条件下将表达IGSF4的细胞与miR-15a/16-1簇中的一个或多个miR或其功能性变体接触，以便抑制IGSF5在细胞中的表达。
13.前述权利要求的方法，其中所述细胞是癌细胞。
14.前述权利要求的方法，其中所述细胞是慢性淋巴细胞性白血病细胞。
15.前述权利要求的方法，其中所述细胞在生物中。
16.前述权利要求的方法，其中所述生物是动物。
17.前述权利要求的方法，其中所述生物经诊断患有癌症。
18.抑制选择的miRNA的形成的方法，所述miRNA已知抑制一个或多个已鉴定的蛋白质的翻译，所述方法包括给有此需要的受试者施用选自miR-15a/16-1簇的一个或多个miR。
19.包括图7-表3中所列的一个或多个被miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
20.包括图8-表4中所列的一个或多个被miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
21.包括图11-表7中所列的一个或多个被miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
22.包括图12-表8中所列的一个或多个被miR 15a/16-1调控的基因的CLL特征。
23.包括图13-表9中所列的一个或多个被miR 15a/16-1调控的基因的CLL特征。
24.包括图14-表10中所列的一个或多个被miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
25.包括图15-表11中所列的一个或多个被miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
26.包括图16-表12中所列的一个或多个被miR 15a/16-1下调的基因的CLL特征。
27.用于确定诊断受试者是否患有或将发生慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的方法，其包括检查来自受试者的样品并且确定是否存在选自miR15a/16-1簇的miR的表达的正相关。
28.一种方法，其将前述权利要求的任一项的特征用于患有或可能发生慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的受试者的诊断、治疗或预后的确定中的一个或多个。
29.预测患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的患者的结果的方法，其包括：确定与正常细胞相比较miRNA表达的独特特征，其中所述特征包括前述权利要求的任一项的一个或多个miRNA特征。
30.一种方法，其用于：i)诊断受试者是否患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或处于发生所述疾病的风险中，ii)确定这样的受试者的预后，和/或iii)治疗这样的受试者，所述方法包括：测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平，其中所述生物标志物选自前述权利要求的一个或多个CLL特征，和，其中相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，测试样品中生物标志物的水平的改变表示受试者患有CLL或处于发生CLL的风险中。
31.权利要求30的方法，其中测试样品中所述至少一个生物标志物的水平低于对照样品中相应的生物标志物的水平。
32.权利要求30的方法，其中测试样品中所述至少一个生物标志物的水平高于对照样品中相应的生物标志物的水平。
33.用于影响慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中的靶mRNA的转录物丰度和/或蛋白质表达的方法，其包括在有此需要的受试者中使一个或多个微RNA失调。
34.权利要求33的方法，其包括抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
35.微RNA和编码蛋白质的RNA的大规模基因表达特征谱分析用于鉴定在人慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中发生的微RNA功能的改变的用途。
36.确定患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的受试者的预后的方法，其包括测量来自受试者的测试样品中至少一个生物标志物的水平，其中：
所述生物标志物与此类癌症的不利预后相关；和
相对于对照样品中相应的生物标志物的水平，测试样品中至少一个生物标志物的水平的改变表示不利的预后。
37.确定患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的受试者的预后的方法，其包括诊断受试者是否患有CLL或处于发生CLL的风险中，包括：
从获自受试者的测试样品逆转录RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；
将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和
将测试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，
其中至少一个miRNA的信号的改变表示受试者患有这样的AML或处于发生这样的AML的风险中。
38.权利要求31的方法，其中相对于从对照样品产生的信号，至少一个miRNA的信号下调，和/或其中相对于从对照样品产生的信号，至少一个miRNA的信号上调。
39.权利要求38的方法，其中选自miR15a/16-1簇的miR的至少一个生物标志物的信号的改变，表示受试者患有具有不利预后的CLL癌症或处于发生所述CLL癌症的风险中。
40.用于调控白血病细胞中蛋白质表达的方法，其包括调控白血病细胞中miR15a/16-1簇的一个或多个miR的表达。
41.用于调控白血病细胞中一种或多种蛋白质的表达水平的组合物，该组合物包含miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
42.用于在有此需要的受试者中增加白血病细胞中的蛋白质水平的组合物，其包含miR15a/16-1簇的一个或多个反义miR。
43.治疗患有白血病的受试者的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的方法，在所述白血病中至少一个生物标志物在受试者的癌细胞中相对于对照细胞下调或上调，所述方法包括：
当所述至少一个生物标志物在癌细胞中下调时，给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物，或其分离的变体或生物学活性片段，以便抑制受试者中癌细胞的增殖；
或，当所述至少一个生物标志物在癌细胞中上调时，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一个生物标志物的表达的化合物，以便抑制受试者中癌细胞的增殖。
44.治疗受试者的白血病的方法，其包括：测定白血病细胞中相对于对照细胞至少一个生物标志物的量；其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体，和通过下列改变白血病细胞中表达的生物标志物的量：
如果癌细胞中表达的生物标志物的量低于对照细胞中表达的生物标志物的量，给受试者施用有效量的至少一个分离的生物标志物；或
如果癌细胞中表达的生物标志物的量高于对照细胞中表达的生物标志物的量，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一个生物标志物的表达的化合物。
45.用于治疗白血病的药物组合物，其包含至少一个分离的生物标志物和可药用载体，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR，或其功能性变体。
46.前述权利要求的药物组合物，其包含至少一种miR表达抑制剂化合物和可药用载体。
47.用于鉴定抗白血病试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，然后测量与白血病细胞中减少的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平，
其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体，以及
其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的增加表示测试试剂是抗白血病试剂。
48.鉴定抗白血病试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，然后测量与白血病细胞中增加的表达水平相关的至少一个生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的减少表示测试试剂是抗癌试剂，
其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
49.评估疗法预防、诊断和/或治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)相关疾病的有效性的方法，其包括：使动物经历其有效性有待评估的疗法，和
通过评估至少一个生物标志物来测定被测试的疗法在治疗或预防疾病中的有效性水平，
其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
50.前述权利要求的方法，其中候选治疗剂包括下列中的一种或多种：药物组合物、营养组合物和顺势疗法组合物。
51.前述权利要求的方法，其中被评估的疗法用于人受试者。
52.一种制品，其包含：至少一种结合包含至少一个生物标志物的白血病相关疾病的标志物的捕获试剂，
其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
53.用于筛选治疗白血病相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括：至少一个生物标志物的一种或多种试剂和表达至少一个生物标志物的细胞，
其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
54.前述权利要求的试剂盒，其中使用包含与至少一个生物标志物特异性结合的抗体或抗体片段的试剂检测生物标志物的存在。
55.干扰慢性淋巴细胞性白血病(CLL)相关疾病应答信号转导途径的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的疾病并发症的严重度，
其中所述试剂包含至少一个生物标志物，其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
56.治疗、预防、逆转或限制有此需要的个体的白血病相关疾病并发症的严重度的方法，其包括：给个体施用干扰至少白血病相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包含至少一个生物标志物，
其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
57.干扰至少慢性淋巴细胞性白血病(CLL)相关疾病应答级联的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的白血病相关疾病并发症的严重度，其中所述试剂包含至少一个生物标志物，
其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体。
58.包含miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体的反义抑制剂的组合物。
59.治疗有此需要的受试者的慢性淋巴细胞性白血病(CLLL)的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的前述权利要求的组合物。
60.前述权利要求的方法，其中预防性施用所述组合物。
61.前述权利要求的方法，其中所述组合物的施用延迟CLL的一个或多个症状的发作。
62.前述权利要求的方法，其中所述组合物的施用抑制CLL的发生。
63.前述权利要求的方法，其中所述组合物的施用抑制CLL。
64.用于检测生物学样品中白血病的存在的方法，其包括：
将怀疑包含白血病的生物学样品暴露于用于其的生物标志物；
其中所述生物标志物选自miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体，和
如果有的话，检测样品中标志物的存在或不存在。
65.前述权利要求的方法，其中所述生物标志物包括可检测的标记。
66.前述权利要求的方法，其还包括将来自受试者的生物学样品中生物标志物的量与来自正常受试者的相应生物学样品中生物标志物的量相比。
67.前述权利要求的方法，其还包括在不同时间点从受试者收集多个生物学样品和比较各生物学样品中标志物的量以确定标志物的量在受试者中是随时间增加还是减少。
68.用于治疗受试者的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的方法，所述方法包括：白血病受体激动剂。
69.前述权利要求的方法，其中所述受体激动剂是miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体的反义抑制剂。
70.一种用途，其用于制造用于治疗急性髓性白血病的药物，所述药物包含选自下列的核酸分子：miR15a/16-1簇的miR或其功能性变体、来源于其的序列、这样的miR的互补序列和来源于这样的互补序列的序列。
71.前述权利要求的用途，其中所述药物包含核酸分子，所述核酸分子提供选自下列的序列：miR15a/16-1簇的一个或多个miR或其功能性变体、来源于此类miR的序列、此类miR的互补序列和来源于此类互补序列的序列。
72.鉴定诱导慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞分化的有效治疗剂或治疗剂的组合的体外方法，该方法包括步骤：
培养来源于CLL细胞的细胞，
向细胞系的培养基中加入至少一种化合物，
分析步骤(i)与(ii)之间至少一个miR的表达水平的变化，和
鉴定诱导步骤(i)与(ii)之间miR的表达水平的改变的化合物或化合物的组合。
73.前述权利要求的方法，其中步骤(iii)包括分析至少一个miR的表达水平。
74.前述权利要求的方法，其中步骤(iv)包括鉴定调控至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
75.前述权利要求的方法，其中步骤(iv)包括鉴定减少至少一个miR的表达水平的化合物或化合物的组合。
76.前述权利要求的方法，其中所述化合物是治疗癌症的治疗剂。
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