CN101472470B

CN101472470B - miR155转基因小鼠中前B细胞增殖和淋巴母细胞性白血病/高度淋巴瘤

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Publication number: CN101472470B
Application number: CN2007800230938A
Authority: CN
Inventors: C·M·克劳斯
Original assignee: Ohio State University Research Foundation
Current assignee: Ohio State University Research Foundation
Priority date: 2006-04-24
Filing date: 2007-04-24
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2027-04-24
Also published as: EP2023944A2; US7667090B2; WO2007127190A3; CA2650026A1; WO2007127190A2; AU2007243475B2; JP5127821B2; CN101472470A; US20090222934A1; AU2007243475A1; EP2023944A4; JP2009534051A; CA2650026C

Abstract

一种转基因非人动物，如小鼠，具有包括一个核酸构建体的基因组，该核酸构建体具有能指导在动物的B细胞中表达的至少一个转录调节序列，其中该转录调节序列与编码miR155基因产物的核酸可操作连接。一种测试试剂在治疗或预防淋巴组织增生疾病中的治疗功效的方法包括评估该试剂对转基因非人动物的影响。

Description

miR155转基因小鼠中前B细胞增殖和淋巴母细胞性白血病/高度淋巴瘤

政府支持

本发明完全或者部分得到美国政府财政补贴的支持。政府享有本发明的某些权利。

发明背景

急性白血病是一种骨髓和血液的快速进行性恶性疾病，其导致未成熟的，无功能的细胞，所谓的胚细胞，在髓和血液中的累积。胚细胞在髓中的累积可阻断正常血细胞的发育。结果，没有产生足够数量的红细胞，白细胞和血小板。当疾病是由于髓淋巴细胞祖细胞而引起的时，它导致急性淋巴母细胞性白血病(ALL)，而当疾病是由于髓细胞样祖细胞引起的时，它导致急性髓性白血病(AML)。

ALL是一种快速进行性癌症，其开始于髓淋巴细胞的恶变。ALL是最常见的儿童期白血病类型，而且在所有的年龄组中每年有3,000例新病例。转化的，目前恶性的，细胞增殖并在髓中累积为白血病淋巴母细胞。淋巴母细胞阻断髓中正常血细胞的形成，其导致不足的红细胞，白细胞和血小板产生。

高度淋巴瘤，也称为侵袭性淋巴瘤，包括淋巴瘤的几个亚型，其如果不治疗就会相对快速地进展。这些亚型包括，例如，AIDS相关的淋巴瘤，退行性变化的大细胞淋巴瘤，伯基特氏淋巴瘤，弥散性大细胞淋巴瘤，免疫母细胞淋巴瘤，淋巴母细胞性淋巴瘤和小的未裂解细胞淋巴瘤。相较于弥散性大B细胞淋巴瘤，高度淋巴瘤表现更具侵袭性，需要更强烈的化疗，而且更常发生于儿童中。因为快速分裂的细胞对抗癌剂更敏感，而且由于年轻患者通常没有其他的健康问题，所以这些淋巴瘤中的一些显示对治疗的显著应答。急性淋巴母细胞性白血病和高度淋巴瘤是儿童中最常见的白血病和淋巴瘤。这些疾病，绝大部分，是多克隆的，这表明仅仅少数遗传变化就足以诱导恶性肿瘤。

微小RNA(miRNA)表示一类新的丰富的小RNA，其按照与靶的互补程度，通过结合靶向的mRNA，和阻断它们的翻译或者启动它们的降解，在转录后水平上发挥重要的调节作用。自从它们1993年在Caenorhabditis elegans中的发现(Lee，R.等，Cell 75：843-854(1993))，许多报道表明，在大的蛋白阵列的转录后调节中这些微小的分子具有非常不同的作用，从细胞增殖和分化到脂类代谢(Nairz，K.，等，Dev.Biol.291：314-324(2006)；Chen，J.F.，等，Nat.Genet.38：228-233(2006)；Naguibneva，I.，等，Nat.Cell Biol.8：278-284(2006)；Esau，C.，等，Cell Metab.3：87-98(2006)；和Gauthier，B.R.，等，Nat.Med.12：36-18(2006))。

人和小鼠中造血系的miRNA分布图显示miRNA在造血发育过程中差异表达，这表明在造血分化中可能的作用(Chen，C.Z.，等，Science 303：83-86(2004)；Chen，C.Z.，等，Semin.Immunol.77：155-165(2005)；和Ramkissoon，S.H.，等，Leuk.Res.30：643-647(2006))。我们已经证实了miR-15a和miR-16-1在68％的慢性淋巴细胞性白血病(CLL)病例中缺失或下调(Calin，G.A.，等，Proc.Natl Acad Sci.USA 99：15524-15529(2002)；和Calin，G.A.，等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 101：1155-11760(2004))，而且miRNA基因经常位于与癌症相关的脆性位点和基因组区域(Calin，G.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：2999-3004(2004))。miR155和BIC(它的宿主基因)转录物已经显示在人B细胞淋巴瘤，特别是弥散性大B细胞淋巴瘤(Eis，P.S.，等，Proc.Natl Acad.Sci.USA102：3627-3632(2005))，霍奇金淋巴瘤(Kluvier，J.，等，J.Pathol 207：243-249(2006))，和某些类型的伯基特淋巴瘤(潜伏类型III埃-巴二氏病毒阳性伯基特淋巴瘤)(Kluvier，J.，等，Genes Chromosomes Cancer 45：147-153(2006))中累积。

目前，急需产生动物模型，其可用于筛选和鉴定候选试剂，该候选试剂具有治疗淋巴组织增生疾病，如B细胞恶性肿瘤(例如，B细胞白血病，B细胞淋巴瘤)的治疗潜能。

发明概述

本发明是基于携带miR155转基因的转基因小鼠，其表达靶向B细胞(例如，使用Ig重链-Eμ增强子)，最初显示白血病前期前B细胞增殖，在脾和骨髓中显著，而且以后逐渐形成B细胞恶性肿瘤的发现。过表达miR155的转基因小鼠逐渐形成与人淋巴组织增生疾病类似的淋巴组织增生疾病，从而这强烈暗示miR155涉及这些疾病的起始和/或进展。Eμ-mmu-miR155转基因小鼠可用于设计新的治疗方法来治疗人中的不同形式的淋巴组织增生疾病，如B细胞恶性肿瘤(例如，急性淋巴母细胞性白血病，高度淋巴瘤)。

因此，在一个方面，这里提供了用于淋巴组织增生疾病的新的动物模型。具体地，根据一个方面，提供了用于B细胞恶性肿瘤(例如，白血病(如，急性淋巴母细胞性白血病)，淋巴瘤(例如，高度淋巴瘤)，和赘生物的动物模型。

在一个实施方案中，这里提供了一种转基因的非人动物(例如，小鼠)，其基因组包括含有至少一个转录调节序列的核酸构建体，该转录调节序列能指导在动物的B细胞中的表达，并与编码miR155基因产物的核酸可操作连接。在一个特定的实施方案中，miR155基因产物包括与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。仍然在另一个实施方案中，miR155基因产物包括SEQ IDNO：2的核苷酸序列。

根据一个实施方案，所述的至少一个转录调节序列可以是能指导在动物的B细胞中表达的任何序列。在一个实施方案中，该转录调节序列包括V_H启动子(例如，来源于小鼠的V_H启动子)。在另一个实施方案中，该转录调节序列包括Ig重链-Eμ增强子(例如，来源于小鼠的Ig重链-Eμ增强子)。在一个相关的实施方案中，该核酸构建体包括β-球蛋白基因(例如，来源于人或其他哺乳动物物种的β-球蛋白基因)的3’UTR和聚腺苷酸序列。

这里还提供了转基因的非人动物，其基因组包括含有V_H启动子和Ig重链-Eμ增强子的核酸构建体，该V_H启动子和Ig重链-Eμ增强子与编码含有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的miR155基因产物的核酸可操作连接。在一个特定的实施方案中，转基因非人动物的基因组包括含有V_H启动子和Ig重链-Eμ增强子的核酸构建体，该V_H启动子和Ig重链-Eμ增强子与编码含有与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的miR155基因产物的核酸可操作连接。

在一个特定的实施方案中，相对于合适对照动物中的该群体，转基因非人动物在脾，骨髓或脾和骨髓二者中具有扩大的B2201ow/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^--淋巴样细胞群体。在一个相关的实施方案中，转基因非人动物显示淋巴组织增生疾病。在某个实施方案中，淋巴组织增生疾病是B细胞恶性肿瘤(例如，B细胞白血病，比如，急性淋巴母细胞性白血病；B细胞淋巴瘤，B细胞赘生物)。在一个另外的实施方案中，B细胞恶性肿瘤显示人急性淋巴母细胞性白血病，人淋巴母细胞性淋巴瘤或其组合的特征。在又一个实施方案中，淋巴组织增生疾病是白血病前期状况(例如，前B细胞增殖)。在另外的实施方案中，转基因非人动物显示增大的腹部，脾肿大，骨髓取代，淋巴细胞减少，或其组合。

这里还提供了测试试剂在治疗或预防受试者中的淋巴组织增生疾病的治疗功效的方法。根据一个实施方案，该方法包括施用试剂给转基因的非人动物(例如，小鼠)，其基因组包括含有至少一个转录调节序列(例如，V_H启动子，Ig重链-Eμ增强子，其组合)的核酸构建体，该转录调节序列能指导在动物的B细胞中的表达，其中该转录调节序列与编码含有与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的miR155基因产物的核酸可操作连接。在一个特定的实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。在另一个实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

试剂已经施用给转基因动物以后，将转基因动物中淋巴组织增生疾病的一种或多种症状和/或征象与没有施用该试剂的相同基因型的对照动物进行比较。如果相对于对照动物，该试剂抑制，阻止和/或减轻已经施用该试剂的转基因动物中淋巴组织增生疾病的一种或多种症状和/或征象，那么认为该试剂在治疗或预防淋巴组织增生疾病中具有治疗功效。在某个实施方案中，所述的淋巴组织增生疾病的一种或多种症状和/或征象选自：扩大的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样细胞群体，增大的腹部，脾肿大，骨髓取代，淋巴细胞减少和其组合。

在另一个实施方案中，这里提供了一种确定试剂是否影响受试者中的淋巴组织增生疾病的方法(例如，影响一种或多种症状和/或征象的可检测性和/或出现率的差异)。该方法包括施用试剂给这里描述的转基因非人动物，并将转基因动物中淋巴组织增生疾病的一种或多种症状和/或征象与相同基因型的对照动物的进行比较，其中对照动物没有施用该试剂。相对于对照动物，检测转基因动物中淋巴组织增生疾病的一种或多种症状和/或征象的可检测性和/或出现率的差异是该试剂影响淋巴组织增生疾病的指示。

在一个实施方案中，淋巴组织增生疾病是B细胞恶性肿瘤。在一个特定的实施方案中，B细胞恶性肿瘤选自急性淋巴母细胞性白血病，B细胞淋巴瘤(例如，高度淋巴瘤)，B细胞赘生物和其组合。B细胞恶性肿瘤可显示人急性淋巴母细胞性白血病，人淋巴母细胞性淋巴瘤或两者的特性。在另一个实施方案中，淋巴组织增生疾病是白血病前期状况，如特征为前B细胞增殖的状况。

本发明的这些以及其他的重要方面从下列详细说明中将变得更显而易见。

附图简述

本专利或申请文件包含至少一幅以颜色制作的附图。带有颜色附图的本专利或专利申请出版物的拷贝经请求并支付必要的费用由专利局提供。

图1的示意图描述了注射到怀孕的C57/B6和FVB/N雌性小鼠的卵细胞的雄原核中的miR155转基因构建体。通过将mmu-miR155基因插入到V_H启动子Eμ增强子下游的EcoRV与SalI位点之间，来制备miR155转基因构建体。

图2A的Southern印迹描述了具有C57BL/6背景的7个miR155转基因(1，3，5，6，7，10与14道)和8个野生型(2，4，8，9，11，12，13与15道)小鼠的基因型。

图2B的Southern印迹描述了具有FVB/N背景的8个miR155转基因(1，3，5，7，9，11，13与15道)和7个野生型(2，4，6，8，10，12与14道)小鼠的基因型。

图3的对总RNA的Northern印迹描述了使用mmu-miR155成熟序列作为探针，胸腺依赖性细胞中成熟miR155的表达，该胸腺依赖性细胞分离自15个转基因系中的6个系的3周龄小鼠的脾。脾细胞中成熟miR155最高表达水平的5个转基因系(1，2，5，8和9)，选作进一步培养和分析。一个转基因系不表达转基因(3道)。野生型对照缺乏转基因表达(4，6与7道)。

图4A的图片显示了相对于野生型小鼠，在6月龄时，由于临床上明显的脾肿大，而具有显著增大的腹部的转基因小鼠(左边)。

图4B的图片描述了图4A中所示的小鼠的脾。转基因小鼠的脾(左边)，由于白血病/淋巴瘤细胞的膨胀而增大。

图5A的显微照片描述了以200X放大倍数，3周龄转基因小鼠脾的苏木精/曙红(H & E)染色切片(小鼠50；建立者10)。切片显示非典型的淋巴增殖压缩了白髓。

图5B的显微照片描述了以100X放大倍数，来自6月龄的转基因小鼠的脾的H & E-染色切片。脾的总体结构正在被非典型的淋巴样增殖取代。只有少数胚的淋巴滤泡保留，其由于增殖而大小极大地缩小和压缩。

图5C的显微照片描述了以200X放大倍数，来自6月龄的转基因小鼠的脾的H & E-染色切片。由于成淋巴细胞的增殖，脾结构已经几乎被完全磨灭。2个小的压缩淋巴滤泡的残余物是可见的。

图5D的显微照片描述了以400X放大倍数，来自6月龄转基因小鼠(建立者8)的骨髓的H & E-染色切片，其显示了骨髓中成淋巴细胞的增殖，其导致造血中心的取代。

图5E的显微照片描述了以200X放大倍数，正常脾的H & E-染色切片。

图5F的显微照片描述了以200X放大倍数，来自3周龄转基因小鼠(72号小鼠)的脾的切片。切片已经用Ki67染色，并显示脾中增加的淋巴样增殖。

图6的显微照片以400X放大倍数，描述了3周龄转基因小鼠(50号小鼠)的脾切片中非典型的淋巴样增殖，其已经用IgM进行免疫组织化学染色。IgM存在于增殖的胸腺依赖性细胞的细胞质(cIgM)中，作为转基因小鼠中的褐色核周晕，而野生型胸腺依赖性细胞是强褐色，但是由于sIgM与cIgM的存在，没有明显的细胞核。

图7A的流式细胞术分析分布图描述了来自两个不同的建立者系(建立者8与10)的转基因小鼠的脾中，胸腺依赖性细胞的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-群体的膨胀。显示了3周龄(74号转基因小鼠，建立者8(74TG；左上方)和68号野生型小鼠(68WT；右上方))和7周龄(156号转基因小鼠，建立者10(156TG；左下方)和157号野生型小鼠(157WT；右下方))的两个转基因小鼠与两个野生型小鼠的门控脾细胞。比较左上四分之一的图片，选通B220⁺IgM群体，显示了相对于野生型，转基因脾中前体B细胞数目的增加。

图7B的流式细胞术分析分布图描述了来自建立者8的转基因小鼠的骨髓中，胸腺依赖性细胞的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-群体的膨胀。显示了6月龄的一个转基因和一个野生型小鼠(8号转基因小鼠，(8TG；左边)和24号野生型小鼠(24WT；右边)的门控骨髓白细胞。比较两个图的右上四分之一，表明相对于野生型小鼠，转基因小鼠骨髓的B200⁺IgM⁺门控成熟B细胞群体的减少。

图8A的图描述了B220-PE表达，如通过流式细胞术分析，对7周龄野生型小鼠no.223(223WT)的B220⁺-门控脾细胞所评估的。

图8B的图描述了CD10-FITC表达，如通过流式细胞术分析，对7周龄野生型小鼠no.223(223WT)的B220⁺-门控脾细胞所评估的。

图8C的图描述了B220-PE表达，如通过流式细胞术分析，对7周龄转基因小鼠no.222(222TG)的B220⁺-门控脾细胞所评估的，其表明相对于野生型小鼠，转基因小鼠中B220^low群体的显著增加(介于B220^-与B220⁺的两个峰值之间)。

图8D的图描述了CD10-FITC表达，如通过流式细胞术分析，对7周龄转基因小鼠no.222(222TG)的B220⁺-门控脾细胞所评估的，表明相对于野生型小鼠，仅仅在转基因小鼠中的B220⁺-门控群体中CD10⁺群体的百分比增加，这证明B220^low增生，至少部分地，是由于CD10⁺群体的增加。

图8E的图描述了B220-PE表达，如通过流式细胞术分析，对7周龄转基因小鼠no.221(221TG)的B220⁺-门控脾细胞所评估的，其表明相对于野生型小鼠，转基因小鼠中B220^low群体的显著增加(介于B220^-与B220⁺的两个峰值之间)。

图8F的图描述了CD10-FITC表达，如通过流式细胞术分析，对7周龄转基因小鼠no.221(221TG)的B220⁺-门控脾细胞所评估的，表明相对于野生型小鼠，仅仅在转基因小鼠中的B220⁺-门控群体中CD10⁺群体的百分比增加，这证明B220^low增生，至少部分地，是由于CD10⁺群体的增加。

图9是分离自转基因脾的淋巴样细胞的染色体组型，分析其染色体的缺失，易位和倒位，以及中期的数目。箭头表示9号染色体中的异常，其通过粗的额外条带的存在而鉴定。

图10是对从3到6周龄之间的5只转基因(TG)与4只野生型(WT)小鼠的脾细胞提取的DNA进行的Southern印迹。使用JH4探针和不同的消化酶进行了Southern印迹杂交，如在道顶部所标明的(StuI，BglII，BamHI，与HindIII)。高分子量的粗条带对应于种系。相对于野生型，转基因动物中没有重排的条带。

发明详述

下面是本发明的特定实施方案的描述。

如这里例示和描述的，过表达微小RNA，即miR155的转基因小鼠，逐渐形成淋巴组织增生疾病，其类似于人类中急性淋巴母细胞性白血病和高度淋巴瘤。这里提供的结果强烈地表明miR155和/或其他基因(例如，在癌症中激活的基因(例如，信号转导基因))的致癌表达涉及B细胞恶性肿瘤的起始和/或进展。因此，这里提供了一种动物模型，其可用于研究B细胞恶性肿瘤和其他淋巴组织增生疾病的起始和进展的机制。这种动物模型也可用于鉴定，开发和测试可用于治疗或预防淋巴组织增生疾病的新的治疗剂。

在一个实施方案中，这里提供了一种转基因动物，其基因组包括含有至少一个转录调节序列的核酸构建体或转基因，该转录调节序列能指导在B细胞中的表达，其中该转录调节序列与编码miR155基因产物的核酸序列可操作连接。术语“转基因”指通过人为干预，如通过这里描述的方法，引入到非人动物的一个或多个细胞中的核酸序列。引入的遗传信息可以是受体所属的动物物种外源的，仅仅是特定的单独受体外源的，或者是受体已经具有的遗传信息。在后面的情况中，相较于天然的内源基因，引入的遗传信息可以差异表达。

转基因非人动物具有包括核酸构建体/转基因的基因组，其能表达miR155基因产物。因为miR基因产物，(这里也称为微小RNA，miR和miRNA)没有翻译成蛋白，所以术语“miR基因产物”不包括蛋白。未处理的miR基因转录物也称为“miR前体”，而且一般包括长度大约为70-100个核苷酸的RNA转录物。可通过天然的处理途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)，或通过合成处理途径(例如，使用分离的处理酶，如分离的切酶，Argonaut或RNA酶III(如大肠杆菌RNA酶III))，将miR前体加工成活性的19-25个核苷酸的RNA分子。这种活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称为“加工的”miR基因转录物或“成熟”miRNA。当这里通过名称提及微小RNA时，该名称相应于前体和成熟形式，除非另有说明。

如这里使用的，“miR155基因产物”指来自miR155基因的未加工的(例如，前体)或加工的(例如，成熟)RNA转录物，如，但是不局限于，来自小鼠(小家鼠)的miR155基因。来自小鼠的前体miR155基因产物通过下面的核苷酸序列表示：5＇-CUGUUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGUUUUGGCCUCUGACUGACUCCUACCUGUUAGCAUUAACAG-3＇(SEQ IDNO：1)，而加工的，或成熟的，小鼠miR155基因产物通过下面的核苷酸序列表示：5＇-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGG-3＇(SEQ ID NO：2；GenBank登录号AJ459767)。

在某些实施方案中，miR155基因产物包括与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％的序列同一性的核苷酸序列。在一个特定的实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有100％同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，miR155基因产物包括与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有100％同一性的核苷酸序列。

可以通过公知的方法，例如，使用数学算法，来进行两个序列的实际比较。Karlin等中描述了这种数学算法的一个优选的，非限制性的例子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993))。这种算法被并入如Schaffer等(Nucleic Acids Res.，29：2994-3005(2001))所述的BLASTN和BLASTX程序(2.2版本)中。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的缺省参数(例如，BLASTN；可获自NCBI的因特网站点)。在一个实施方案中，检索的数据库是非冗余(NR)数据库，并且序列比较的参数可以设置为：无筛选程序；期望值为10；字长为3；矩阵是BLOSUM62；和缺口值具有11的存在(Existence)和1的延伸(Extension)。

用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。这种算法结合到ALIGN程序(2.0版本)中，其是GCG(Accelrys，San Diego，California)序列比对软件包的部分。当利用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权残基表，缺口长度罚分12，和缺口罚分4。用于序列分析的另外的算法是本领域已知的，而且包括Torellis和Robotti(Comput.Appl.Biosci.，10：3-5，1994)中描述的ADVANCE和ADAM；和Pearson和Lipman中描述的FASTA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444-2448，1988)。

在另一个实施方案中，可使用GCG软件包中的GAP程序(Accelrys，San Diego，California)，使用Blossom 63矩阵或PAM250矩阵，和缺口权12，10，8，6或4，以及长度权2，3，或4，得到两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个实施方案中，可使用GCG软件包中的GAP程序(Accelrys，San Diego，California)，使用缺口权50和长度权3，得到两个核酸序列之间的同一性百分数。

根据一个方面，转基因非人动物具有包括一种核酸构建体的基因组，该核酸构建体中编码miR155基因产物的核酸序列与能指导在动物的B细胞中表达的至少一个转录调节序列可操作连接。术语“转录调节序列”根据它的本领域公认的含义使用。它意图指任何DNA序列，依靠它的序列，其能导致连接的基因在特定的细胞中被上调或者下调。在启动子的情况中，启动子一般邻近编码区。然而，在增强子的情况中，增强子可以在离编码区一定距离处发挥功能，以便在增强子与编码区之间存在干预DNA序列。为了指导遗传信息的表达，其可包括编码特定蛋白的DNA序列(或“编码区”)，目标编码区可以功能性方式与至少一个转录调节序列连接。转录调节序列可用于增强，降低，调节基因表达，或指定基因表达于某些组织或某些发育阶段。该转录调节序列不必是天然存在的序列。

因此，在这里描述的一个实施方案中，编码miR155的序列与指导在B细胞中表达的转录调节序列可操作连接，以产生重组构建体或转基因。该转录调节序列可以是能指导在B细胞中表达的任何序列。适合的转录调节序列的例子包括，但不限于，V_H启动子，Ig重链-Eμ增强子及其组合。在一个特定的实施方案中，转录调节序列是小鼠的转录调节序列或来源于小鼠的转录调节序列。

如果核酸分子包括含有转录调节信息的核苷酸序列，而且这样的序列与编码微小RNA的核苷酸序列可操作连接，则该核酸分子被认为是“能表达”微小RNA或“能指导微小RNA的表达”。可操作连接是这样的连接，其中试图表达的调节核酸序列与核酸序列以容许基因表达的方式连接。

一般来说，基因表达所需的调节区包括，但不限于，转录调节序列(例如，启动子区域，增强子区域)，以及当转录成RNA时，有助于基因转录物稳定的DNA序列。

术语“启动子”根据它本领域公认的含义使用。它意图指通常基因或操纵子的编码序列上游的DNA区域，其结合RNA聚合酶并指导该酶以正确转录起始位点。如果启动子能影响DNA序列的转录，则该启动子区域与DNA序列可操作连接。

术语“增强子”根据它本领域公认的含义使用。它意图指在真核生物和某些真核病毒中发现的序列，当位于离研究的基因高达几千个碱基处时(以任一方向)，其能增强基因的转录。当位于所讨论的基因的5’侧(上游)时，这些序列通常充当增强子。然而，当位于基因的3’侧(下游)时，一些增强子是活性的。有时，没有(已知的)启动子时，增强子元件能激活从基因的转录。

所述的核酸构建体还可包括促进构建体和/或从该构建体表达的基因产物的表达和/或稳定性的序列。在一个特定的实施方案中，该核酸构建体包括β-球蛋白基因(例如，小鼠β-球蛋白基因)的3’UTR和聚腺苷酸序列。促进构建体和/或从该构建体表达的基因产物的表达和/或稳定性的其他序列是本领域已知的，而且包含于这里。

术语“转基因非人动物”这里用于包括所有的脊椎动物，除了人之外。在一个实施方案中，转基因的非人动物是哺乳动物类。这种转基因的非人动物包括，例如，转基因猪，转基因老鼠，转基因兔，转基因牛，转基因山羊，及其他转基因动物种类，特别是哺乳动物。另外，啮齿类动物家族的其他成员，例如，老鼠，和豚鼠，以及非人类的灵长类动物，如黑猩猩，可用于实施这里描述的实施方案。在一个特定的实施方案中，转基因非人动物是小鼠。这里描述的转基因非人动物包括处于所有发育阶段的受试者动物，包括胚胎和胎儿阶段。

“转基因动物”是包含一个或多个带有遗传信息的细胞的动物，该遗传信息直接或间接地通过考虑的遗传操作在亚细胞水平接受，如通过显微注射或用重组病毒感染。引入的核酸分子可以掺入到染色体内，或者它可以是染色体外复制DNA。这里描述的适合的转基因动物包括，但不限于，其中引入遗传信息到生殖系细胞中，从而赋予传递该信息给后代的能力的那些动物。如果这种后代实际上具有一些或者全部该信息，那么它们也是转基因动物。

为了产生转基因动物，本领域已知的用于引入重组构建体或转基因到胚胎中的任何方法，如，例如，显微注射，使用细胞枪，转染，脂质体融合，电穿孔，等等，可以使用。在一个特定的实施方案中，用于生产转基因动物的方法是显微注射，其包括注射DNA分子到受精卵的雄原核中(参见，例如，美国专利4,870,009；5,550,316；4,736,866；和4,873,191)。最初在小鼠中开发用于引入重组构建体/转基因到哺乳动物和它们的生殖细胞中方法。这种方法随后用于较大的动物，包括家畜类(参见，例如，PCT公开号WO 88/00239，WO90/05188和WO 92/11757)。显微注射DNA到接合子的细胞质中也可用于产生转基因动物。

用于评估引入的转基因以及它的表达存在的方法是很容易获得的，而且是本领域公知的。这种方法包括，但不限于，DNA(Southern)杂交以检测外源DNA，聚合酶链反应(PCR)，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和印迹以检测DNA，RNA或蛋白。

本实施方案不局限于任何一种动物，而是提供用于任何合适的非人脊椎动物。例如，如这里描述和例示的，可以产生转基因小鼠。其他非限制性的例子包括，例如，这里描述的其他非人哺乳动物，如豚鼠，兔，猪，绵羊，等等。通过显微注射产生转基因动物的成功率在小鼠中是最高的，其中大约25％的受精小鼠卵，该受精小鼠卵中已经注射DNA，而且其已经被移植到雌性中，将发育成转基因小鼠。用兔，猪，绵羊和牛获得了较低的成功率。

在一个特定的实施方案中，相对于合适对照动物中的该群体，这里描述的转基因非人动物在脾，骨髓或脾和骨髓二者中显示扩大的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样细胞群体。如这里使用的，术语“扩大的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-细胞群体”或“B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-细胞的增加”，指相较于对照动物，相对于其他的淋巴样细胞亚型，显示B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-细胞的数目和/或B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-细胞的比例增加的淋巴样细胞群体。

在另一个实施方案中，这里描述的转基因非人动物显示淋巴组织增生疾病。“淋巴组织增生”指其属于，或特征在于，淋巴网状内皮细胞系统细胞的增生；该术语一般用于指一群恶性赘生物。“淋巴网状内皮细胞”指淋巴样和网状内皮系统的细胞或组织。“淋巴组织增生不适”(或“淋巴组织增生疾病”或“淋巴组织增生障碍”)指由与共同的会分化成几种细胞的任何一种的，原始淋巴网状内皮细胞相关的细胞引起的一群恶性赘生物之一，该淋巴组织增生疾病包括，尤其是，淋巴细胞，组织细胞，和单核细胞性白血病，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤，淋巴肉芽肿病，所有的淋巴细胞性淋巴瘤，和与单株丙种球蛋白病相关的免疫分泌疾病。如这里使用的，“淋巴组织增生疾病”，“淋巴组织增生障碍”或“淋巴组织增生不适”也可指一种生理状态，其中相对于正常或对照动物，淋巴网状内皮细胞系统的增生，倍增和/或累积改变，但是受影响的动物却不必然地显示如上所述的赘生物之一的症状。如这里使用的，“白血病前期”状况指在白血病的明显症状发展之前的这种淋巴组织增生疾病。

在某个实施方案中，淋巴组织增生疾病是B细胞恶性肿瘤(例如，B细胞白血病(比如，急性淋巴母细胞性白血病)；B细胞淋巴瘤(例如，高级的淋巴瘤)，B细胞赘生物)。在一个另外的实施方案中，B细胞恶性肿瘤显示人急性淋巴母细胞性白血病，人淋巴母细胞性淋巴瘤或其组合的特征。在又一个实施方案中，淋巴组织增生疾病是白血病前期状况(例如，前B细胞增殖)。在另外的实施方案中，转基因非人动物显示增大的腹部，脾肿大，骨髓取代，淋巴细胞减少，或其组合。

在另一个实施方案中，存在这里描述的一种方法，其将转基因非人动物用作实验模型，用于研究淋巴组织增生疾病(例如，B细胞恶性肿瘤(如，白血病(例如，急性淋巴母细胞性白血病)，淋巴瘤(如，高度淋巴瘤)，和赘生物))，和测试可能的致癌剂和治疗剂。

在另一个方面，这里描述了一种测试试剂在治疗或预防受试者中的淋巴组织增生疾病的治疗功效的方法。根据一个实施方案，该方法包括施用该试剂给这里描述的转基因非人动物(例如，小鼠)。在一个实施方案中，转基因非人动物具有包括一个核酸构建体的基因组，该核酸构建体含有能指导在动物的B细胞中表达的至少一个转录调节序列(例如，V_H启动子，Ig重链-Eμ增强子，其组合)，其中该转录调节序列与编码miR155基因产物的核酸可操作连接。在一个特定的实施方案中，该转录调节序列与这样的核苷酸序列可操作连接，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性。在另一个实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。在另一个实施方案中，miR155基因产物包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

试剂已经施用给转基因动物以后，将转基因动物中淋巴组织增生疾病的一种或多种症状和/或征象与没有施用该试剂的相同基因型的对照动物进行比较。如果相对于对照动物，该试剂抑制，阻止和/或减轻已经施用该试剂的转基因动物中淋巴组织增生疾病的一种或多种症状和/或征象，那么认为该试剂在治疗或预防淋巴组织增生疾病中具有治疗功效。在某个实施方案中，淋巴组织增生疾病的一种或多种症状和/或征象选自：扩大的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样细胞群体，增大的腹部，脾肿大，骨髓取代，淋巴细胞减少和其组合。

适于测试试剂的治疗功效的淋巴组织增生疾病包括，例如，这里描述的那些疾病。在一个实施方案中，淋巴组织增生疾病是B细胞恶性肿瘤。在一个特定的实施方案中，B细胞恶性肿瘤选自急性淋巴母细胞性白血病，B细胞淋巴瘤(例如，高度淋巴瘤)，B细胞赘生物和其组合。B细胞恶性肿瘤可显示人急性淋巴母细胞性白血病，人淋巴母细胞性淋巴瘤或两者的特性。在另一个实施方案中，淋巴组织增生疾病是白血病前期状况，如特征为前B细胞增殖的状况。

如这里描述的，这里提供了在B细胞中表达miR155的转基因非人动物。在一个实施方案中，提供了一种转基因动物，其基因组包括含有至少一个转录调节序列的核酸构建体或转基因，该转录调节序列能指导在B细胞中的表达，其中该转录调节序列与编码miR155的核酸序列可操作连接。在一个特定的实施方案中，转基因包括编码miR155的DNA序列，其已经置于V_H启动子和/或Ig重链-Eμ增强子的转录调控下。在这种动物中，mir155的表达针对未成熟的和成熟的B细胞。在一个实施方案中，转基因动物是小鼠，其发展扩大的B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样细胞群体。

在另一个实施方案中，来自显示淋巴组织增生的转基因动物的白血球，可以转移到第二种动物(其可以是非转基因动物)，从而在第二种“受体”动物中诱导淋巴组织增生疾病的快速发病。

根据另一个实施方案，可根据这里描述的一个或多个方面，通过测定动物中这种药征的抗淋巴组织增生活性来测试用于预防和/或治疗淋巴组织增生疾病的可能的治疗药征或试剂。可通过测定抑制，预防，和/或破坏根据一个实施方案产生的转基因动物显示的和/或根据另一个实施方案产生的“受体”动物中淋巴组织增生疾病的一种或多种症状或征象的可能的治疗药征能力来评估这种活性。

可以测试各种治疗药征或试剂，如蛋白(例如，抗体)，肽，肽模拟物，小的有机分子，核酸等等，预防和/或治疗淋巴组织增生疾病。根据这里描述的方法，可以逐一地筛选试剂，或者同时测试一种或多种试剂。在测试化合物的混合物时，通过这里描述的处理选择的化合物，可以使用适合的方法分离(视情况而定)和鉴定(例如，测序，色谱法)。也可以根据这些方法确定测试样品中一种或多种化合物的存在。

可以例如，通过筛选分子文库或集合，如，国家癌症研究所的化学药品贮藏处，在测定抑制和/或预防这里描述的转基因动物显示的淋巴组织增生疾病的一种或多种症状或征象的分析中，鉴定预防和/或治疗淋巴组织增生疾病的试剂。可以测试文库，如通过组合的化学合成或其他方法生产的化合物(例如，有机化合物，重组或合成肽，“类肽”，核酸)的组合文库(参见，例如，Zuckerman，R.N.等，J.Med.Chem.，37：2678-2685(1994)和其中引用的参考文献；也参见，Ohlmeyer，M.H.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10922-10926(1993)和De Witt，S.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6909-6913(1993)，relating to tagged compounds；Rutter，W.J.等U.S.Patent No.5,010,175；Huebner，V.D.等，U.S.Patent No.5,182,366；和Geysen，H.M.，美国专利号4,833,092)。其中通过层析法，从携带独特标签的文库筛选化合物，鉴定单个化合物是可能的。

可以根据已知的方法另外配制鉴定的治疗药征，以产生药学上可接受的组合物。治疗药征或包含这种治疗药征的组合物可以各种标准方式施用给受试者(例如，转基因动物)。例如，试剂可以使用各种途径给药，包括，例如，口服，饮食，局部，经皮肤，直肠，肠胃外(例如，静脉内，动脉内，肌内，皮下，皮内注射)，和吸入(例如，支气管内，鼻内，口服吸入，鼻内滴剂)。给药可以是如表明的局部的或全身的。给药的优选模式可以根据待施用的抗体或抗原结合片段，和被治疗的特定不适(例如，疾病)而改变，但是，口服或肠胃外给药一般是优选的。

试剂可以肠胃外给药如，例如，通过静脉内，肌内，鞘内或皮下注射。肠胃外给药可以通过将试剂掺入到溶液或悬浮液中来实现。这种溶液或混悬液也可包括无菌稀释剂，如注射用水，盐溶液，抑菌盐水(包含大约0.9％mg/ml苯甲醇的盐水)，磷酸缓冲盐溶液(这里称为PBS)，Hank＇s溶液，Ringer＇s-乳酸盐，固定油类，聚乙二醇，甘油，丙二醇，及其他合成的溶剂。肠胃外制剂还可包括抗菌剂(例如，苯甲醇，对羟基苯甲酸甲酯)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸，亚硫酸氢钠)，和螯合剂(例如，EDTA)。缓冲液如醋酸盐，柠檬酸盐和磷酸盐和用于调节张力的试剂如氯化钠和葡萄糖，也可添加。肠胃外制剂可以封装到安瓿，一次性注射器，或由玻璃或塑料制成的多次剂量小瓶中。

实施例

实施例1：产生Eμ-mmu-miR155转基因小鼠

材料和方法

转基因小鼠：

通过PCR，从129SvJ小鼠(The Jackson Laboratory)，扩增包含miR155的前体序列的318-bp片段，并克隆到pBSVE6BK(pEμ)质粒的EcoRV和SalT位点，该质粒包含用于Ig重链的Eμ增强子，V_H启动子，和人β-球蛋白基因的3’UTR和聚腺苷酸(图1)，而且以前已经用于在Eμ-TCL1转基因小鼠中逐渐形成慢性淋巴细胞性白血病(Bichi，R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6955-6960(2002))。转基因，其通过用BssHII和PvuI切割该构建体分离，注射到怀孕的FVB/N和C57/B6小鼠的受精卵细胞的雄原核中。通过Southern印迹分析，其对用BamHI消化的尾部提取的DNA进行，使用设计用于靶向Eμ增强子序列的探针(图2A，2B)来筛选幼鼠中转基因的存在。鉴定转基因建立者，并饲养成年龄相当的野生型小鼠。转基因半合子小鼠出生，进行研究，并与它们的野生型对应物相比较。通过对尾部提取的DNA进行的PCR，对小鼠进行基因分型(数据未显示)。

Northern印迹分析：

脾离解在两个磨砂显微镜载玻片之间，并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤裂解物，通过用氯化铵(NH₄Cl)低渗裂解使红细胞耗竭，离心，并在PBS中重悬。用TRIzol试剂(GIBCO，Invitrogen)提取总RNA，在SDS/PAGE中点样和变性，并在Hybond N⁺膜(Amersham Pharmacia)中印迹。该膜与包含成熟的mmu-miR155序列的反义物的γ-³²P放射性探针杂交，孵育过夜，洗涤，并暴露于感光成像仪筛选(MolecularDynamics)。使用Typhoon图像处理系统(Amersham Biosciences)对图像进行处理(图3)。

结果

产生转基因小鼠，其中mmu-miR155(小鼠miR155)表达在VH启动子-Ig重链Eμ增强子调控下，其在B细胞发育的晚期前B细胞阶段变得有活性。通过Southern印迹杂交鉴定了15只转基因建立者(图2A，2B)，C57BL/B6背景上7只(指定为F1-F7)，FVB/N背景上8只(指定为F8-F15)。将这些建立者饲养成相同品系的野生型小鼠，以产生15个独立的转基因系。

对从转基因和野生型脾提取的总RNA进行实时PCR(数据未显示)和Northern印迹分析(图3)，显示在5个转基因小鼠的建立者系中高水平的miR155表达。1个转基因系完全缺乏表达，而所有其他的建立者系都表达转基因。如以前报道的，野生型小鼠在脾细胞中不表达成熟的miR155(Monticelli，S.，等，Genome Biol.6：R71(2005))。

实施例2：Eμ-mmu-miR 155转基因小鼠的表型表征揭示了脾和骨髓中前B细胞的增生，其导致B细胞恶性肿瘤

材料和方法

体测定：

杀死以后对小鼠称重，解剖它们的脾，测量和称重。

白细胞(WBC)和涂布标本：

从小鼠的眼球后血管抽取血液，涂布到磨砂显微镜载玻片上并用Giemsa染色或者离心，在PBS中洗涤，并用氯化铵处理。细胞用细胞-脉冲室计数。

流式细胞术分析：

通过低渗裂解(0.165M NH₄Cl)除去脾细胞或骨髓细胞的单细胞混悬液的成熟红细胞，并用下列配合抗体染色：抗-B220-PE，抗-IgM-FITC，抗-TCR-PE cy5，抗-CD5-PE，和抗-CD-43-FITC。所有的抗体都获自BD PharMingen。在Becton Dickinson FACSCa libur上进行流式细胞术，使用Mac软件的Becton Dickinson FACS CONVERT 1.0对数据进行分析。

组织学和免疫组织化学：

从宰后检验的小鼠分离脾，股骨和胸骨，并固定于10％缓冲的福尔马林中，包埋于石蜡中，然后切成4微米的切片。切片用苏木精/曙红按照标准方案染色。对于脱蜡步骤，切片于55℃加热1小时，通过分级乙醇系列和蒸馏水再水化，浸于PBS中，然后37℃用溶于Tris缓冲液中的0.1％胰蛋白酶溶液处理30分钟。用10％正常血清阻断内源过氧化物酶。将CD43，B220，和VpreB1(CD179a)抗体(BD PharMingen)用作第一抗体。第二抗体和二氨基联苯胺按照制造商的指导添加。

结果

相对于野生型小鼠的脾，转基因小鼠的身体和脾都增大了(图4A，4B)，而且转基因小鼠的脾重量/体重比例比野生型小鼠的比例大3到4倍(表1)。有趣地，该比例没有随着年龄改变很多。

表1.转基因和野生型小鼠的脾和身体测量。

小鼠	系(建立者)	年龄，周	BW，^*gr	SW，^**mg	WI，^***mg/gr
						72tg	8	3	22.68	210	9.25
69wt	8	8	23.90	90	3.76
						74tg	8	3	23.98	270	11.25
68wt	8	3	24.54	60	2.44
						8gt	8	24	38.3	380	9.92
24wt	N/A	24	26.5	100	3.77
						50tg	10	3	21.7	200	9.21
49wt	10	3	20.4	80	3.92
						148wt	8	6	26.97	240	8.89
149wt	8	6	25.9	100	3.86
						156tg	10	6	23.44	280	11.94
157wt	10	6	23.91	100	4.18
						220wt	8	7	23.13	120	5.2
221tg	8	7	22.37	260	11.6
						222tg	8	7	21.67	250	11.5
223wt	8	7	22.44	120	5.2

^*BW，以克(gr)计体重；^**SW，以毫克(mg)计的脾重量；^***WI，以毫克每克(mg/g)计的重量指数(转基因与野生型重量的比例)；tg，转基因小鼠；wt，野生型小鼠。

3月龄转基因小鼠的白血球计数(WBC)是每ml外周血10 X 10⁶±1 X 10⁶，相较于正常的，年龄相当的小鼠为每ml外周血40 X 10⁶±1.5 X 10⁶。相较于野生型年龄相当的小鼠，值没有变化，其为每ml外周血40 X 10⁶±1.5 X 10⁶，6月龄转基因小鼠的WBC甚至更低，其值为每ml外周血6 X 10⁶±0.5 X 10⁶。

3周龄转基因小鼠的脾的组织病理学(苏木精/伊红染液)，特征为侵入和扩大红髓的一致的非典型淋巴样群体。胚滤泡不受影响，而且存在许多次级造血中心(图5A)。组织学地，6月龄小鼠存在大大增加的恶性淋巴样群体，其具有显著的非典型和再结晶形态，红髓的血管通道增加，而且逐渐取代白髓。胚滤泡数目减少，而且脾的总体结构被淋巴样增生破坏(图5B)。组织学类似的淋巴样群体存在于6月龄小鼠的骨髓中。增生抗原，Ki67的表达，显示转基因小鼠中显著的淋巴样增生(图5D)，其在野生型小鼠中没有观察到。

转基因脾中淋巴样增生的免疫组织化学分析，显示非典型扩大的胸腺依赖性细胞是B220和VpreB1(CD179a)低阳性的，不过CD43是阴性的(数据未显示)。转基因小鼠脾的石蜡包埋切片的IgM染色，显示增殖胸腺依赖性细胞的细胞质中μ链的存在(图6)。相反，流式细胞术分析没有鉴定到这些细胞表面上IgM的表达，其表明扩大的淋巴样细胞表达细胞质的μ链，但是不表达表面IgM。

对来自3，6，或7周龄或6龄的转基因和野生型小鼠的脾和骨髓的WBC的单细胞混悬液，进行的流式细胞术分析，显示相较于它们的野生型对应物，转基因小鼠中脾和骨髓中B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样细胞的数目都增加。这种表型与在人急性淋巴母细胞性白血病或淋巴母细胞性淋巴瘤中观察到的增殖胸腺依赖性细胞的表型类似。这些发现表明，相较于在野生型小鼠的脾中仅仅1.65％，3周龄转基因小鼠的脾中B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-淋巴样群体，是总的门控淋巴样群体的9％(对1只转基因小鼠和1只野生型小鼠进行评价)。6周龄时，这些百分数在转基因小鼠的脾中变成6.6±1.4％，7周龄小鼠为4.7±0.3％，而在野生型脾中保持没有变化(分析的两种转基因小鼠来自两个不同的建立者系和两个野生型小鼠)。

在6月龄转基因小鼠的骨髓中，我们发现相较于野生型，如通过B220^low/IgM^-表达限定的前B细胞群体增加(图7和8)。B220^low/IgM^-细胞群体的正向散射分析显示，这些细胞将大的海蕾细胞(数据未显示)。

根据流式细胞术，组织学和免疫组织化学分析，推断前B细胞增殖，限定为B220^low/CD19^low/CD10^low/IgM^-/TCR^-/CD43^-，存在于转基因小鼠的脾和骨髓中，而且在3周龄是已经是可检测的。这种增生最终导致脾肿大，骨髓取代，和显著的淋巴细胞减少，常常与高级B细胞恶性肿瘤相关的特征。相较于野生型对照，其全部都是健康的(11只野生型小鼠中的11只)，与该特征一致，所有的转基因小鼠在6月龄都发展高级B细胞赘生物(7只转基因小鼠的7只)。显著地，没有过表达miR155的转基因小鼠系也是正常的。

实施例3：Eμ-mmu-miR155转基因小鼠的细胞遗传学分析

材料和方法

细胞遗传学：

股骨骨髓用RPMI培养基1640/20％ FBS冲洗，并收集到带有1％肝素的5ml RPMI培养基1640/20％ FBS中。细胞生长，并使用标准的细胞学技术，评价染色体的缺失，移位，倒位和中期的数目。

Ig重链重排：

使用下列寡核苷酸引物，通过扩增小鼠基因组DNA的Ig重链区域的JH4片段中序列，设计探针：正向，5＇-TGAAGGATCTGCCAGAACTGAA-3＇(SEQ ID NO：3)，和反向，5＇-TGCAATGCTCAGAAAACTCCAT-3＇(SEQ ID NO：4)。

转基因和野生型小鼠的脾离解到处于PBS中的磨砂显微镜载玻片之间，用氯化铵处理以裂解红血球，离心，并重悬于PBS中。从脾的白血球提取DNA，并用EcoRI，StuI，BglII，BamHI和HindIII消化。消化的DNA印迹到Hybond N⁺膜上，用JH4探针杂交，该探针用γ-³²p放射性标记，然后暴露于感光图像仪筛选，并使用Typhoon扫描仪进行处理。

结果

相较于来自正常同窝仔畜的脾，脾细胞的染色体组型的细胞遗传研究，没有鉴定到来自转基因小鼠的脾中一致的染色体异常。但是，偶然观察到一些基因组的改变(图9；参见箭头)。这些结果表明，扩大的前B细胞群体是二倍体和细胞遗传学拟似正常的。

为了检测克隆性，使用多酶消化酶，对来自3到6周龄之间的小鼠的脾细胞DNA进行Southern印迹分析，以评价V(D)J重排。相对于野生型小鼠，没有检测到转基因小鼠中重排条带的存在(图10)，除了1只转基因小鼠外，其在用每种不同的限制性内切酶进行Southern印迹上具有一致的重排条带(数据未显示)。这些数据表明，该龄的小鼠中B细胞群体大部分是多克隆的，至少直到6周龄。因为大部分恶性肿瘤是多克隆的，这种发现表明miR155可能是癌症中激活的信号转导途径的下游靶。

有趣地，已经在实体瘤中观察到miR155的过表达，如乳房和结肠癌，以及肺癌，其中miR155的过表达是差的预后的指示(Volinia，S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：2257-2261(2006))。

实施例4：微阵列表达分布图揭示了VpreB1 mRNA和其他靶的上调

材料和方法

RNA分离：

根据制造商的指导，用TRIzol试剂(Invitrogen)进行总的RNA分离。

miRNA表达分布图：

如所述的在miRNA微阵列芯片上进行RNA标记和杂交(Liu，C.G.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：9740-9744)。简要地，使用5’生物素末端标记的随机八聚物寡核苷酸引物，通过逆转录，用生物素对来自每种样品的5μg总RNA进行标记。在miRNA微阵列芯片(OhioState University，Ver.2.0)上进行生物素标记的cDNA的杂交，该芯片含有800个miRNA探针，包括245个人和200个小鼠miRNA基因，一式四份。使用Axon扫描仪4000B(Axon Instruments，Union City，CA)，通过结合链霉亲和素-Alexa647缀合物与生物素，检测杂交信号。通过GENEPIX 6.0软件(Axon Instruments)对图像进行定量。

mRNA表达分布图：

使用GeneChip小鼠基因组4302.0阵列(Affymetrix)，其包含用于超过45,000个表征的基因和表达的序列标签的探针组。根据Affymetrix方案，进行样本标记和处理，GeneChip杂交，以及扫描。简要地，使用SuperScript Choice System(Invitrogen)，其添加T7 RNA聚合酶启动子位点到3’-末端(Genset，La Jolla，CA)，从总RNA合成双链cDNA。使用BioArray T7 RNA聚合酶标记试剂盒(EnzoDiagnostics)，从cDNA体外产生生物素化的cRNA并扩增。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)，纯化cRNA以后，20μg的cRNA于94℃破碎35min。大约12.5μg的破碎cRNA用于250μl杂交混合物中，该混合物含有鲱鱼-精子DNA(0.1mg/ml；Promega)，加上细菌和噬菌体cRNA对照(1.5pM BioB，5pM BioC，25pM BioD，和100pM Cre)用作杂交效率的内部对照。混合物的等分试样(200μ1)，在GeneChip杂交烘箱640(Affymetrix)中，于45℃与阵列杂交18小时。洗涤每个阵列，并用链霉亲和素-藻红蛋白(Invitrogen)染色，用生物素化的抗链霉亲和素抗体(Vector Laboratories)，在GeneChip Fluidics Station 450(Affymetrix)上扩增。阵列用GeneArray G7扫描仪(Affymetrix)扫描，以获得图像和信号强度。

结果

对从5只转基因小鼠的脾的白血球提取的总RNA，进行微阵列分析，其包括不表达miR155转基因的1只小鼠，和6只野生型同窝仔畜对应物的白血球。分析显示，相对于野生型同窝对照小鼠(数据未显示)，在过表达miR155的转基因小鼠中，miR155，miR194，miR224，miR217和miR151的表达增加10到20倍(表3)，miR146和miR138的表达减少2到3倍。使用Affymetrix微阵列芯片，研究相同组的转基因小鼠中mRNA的差异表达，并与同窝仔畜对照中的mRNA表达进行比较。Affymetrix微阵列数据的统计分析显示，在miR155过表达小鼠中，200个增生相关的基因上调，而50个基因下调(表3)。显著地，VpreB1 mRNA是上调的，当前B细胞增殖发生时，期望其存在。这些数据补充了来自流式细胞术分析和免疫组织化学的数据。

表2.根据微阵列的预测分析(PAM)，miR155转基因/野生型小鼠分类的Affymetrix微阵列数据。

名称	探针组ID	基因称谓	mir155分数	Wt分数
					1456609_at	1456609_at	RIKEN cDNA 1810006K23基因	0.8041^*	-0.5744
1452324_at	1452324_at	浆细胞瘤变体易位1	0.4468^*	-0.3192
					1449452_a_at	1449452_a_at	糖蛋白2(酶原颗粒膜)	0.3377^*	-0.2412
1459923_at	1459923_at	脑表达的，X-连锁的6	0.319^*	-0.2279
					1449222_at	1449222_at	EB病毒诱导的基因3	0.31^*	-0.2214
1424437_s_at	1424437_s_at	ATP-结合表达盒，亚家族G(WHITE)，成员4	0.2723^*	-0.1945
					1425784_a_at	1425784_a_at	嗅介蛋白1	0.2717^*	-0.1941
1436827_at	1436827_at	基因模型944，(NCBI)	0.2537^*	-0.1812
					1425677_a_at	1425677_a_at	锚蛋白1，红色的	0.2513^*	-0.1795
1417636_at	1417636_at	溶质载体家族6(神经递质转运蛋白，甘氨酸)成员9	0.2476^*	-0.1769
					1441054_at	1441054_at	载脂蛋白L，2	0.233^*	-0.1664
1458642_at	1458642_at	杀伤细胞凝集素样受体家族E，成员1	0.2307^*	-0.1648
					1448558_a_at	1448558_a_at	磷酯酶A2，IVA组，(细胞溶质的，钙依赖的)	0.2157^*	-0.154
1418601_at	1418601_at	醛脱氢酶家族1，亚家族A7	0.2136^*	-0.1526
					1458667_at	1458667_at	RIKEN cDNA4930519N13基因	0.2084^*	-0.1488
1436443_a_at	1436443_a_at	含KDEL(Lys-Aso-Glu-Leu)的1	0.2073^*	-0.1481
					1416740_at	1416740_at	前胶原，类型V，α1	0.2025^*	-0.1447
1422663_at	1422663_at	起点识别复合体，亚基1-样(酿酒酵母)	0.2019^*	-0.1442
					1433892_at	1433892_at	精子相关抗原5	0.1988^*	-0.142
1435660_at	1435660_at	类似于RIKEN cDNA 5830484A20	0.1979^*	-0.1413
					1454622_at	1454622_at	溶质载体家族38，成员5	0.1847^*	-0.132
1426802_at	1426802_at	隔蛋白8	0.1821^*	-0.13
					1449869_at	1449869_at	前B淋巴细胞基团1(V perB1)	0.1798^*	-0.1284
1426015_s_at	1426015_s_at	天冬氨酸-β-羟化酶	0.1768^*	-0.1263
					1418710_at	1418710_at	CD59a抗原	0.1697^*	-0.1212
1437244_at	1437244_at	生长停止特异性2样3	0.1662^*	-0.1187
					1429830_a_at	1429830_a_at	CD59a抗原	0.1651^*	-0.118
1422524_at	1422524_at	ATP-结合表达盒，亚家族B(MDR/TAP)，成员6	0.1604^*	-0.1145
					1435287_at	1435287_at	内收蛋白2(β)	0.158^*	-0.1129
1436984_at	1436984_at	abl-相互作用物2	0.1554^*	-0.111
					1453226_at	1453226_at	RIKEN cDNA 3000004C01基因	0.1467^*	-0.1048
1429146_at	1429146_at	RIKEN cDNA 6620401M08基因	0.139^*	-0.0993

1454630_at	1454630_at	cDNA序列BC034054	0.1385^*	-0.099
					1429089_s_at	1429089_s_at	RIKEN cDNA 2900026A02基因	0.138^*	-0.0986
1455980_a_at	1455980_a_at	生长停滞特异性2样3	0.1375^*	-0.0982
					1427677_a_at	1427677_a_at	含SRY-框的基因6	0.1363^*	-0.0974
1419031_at	1419031_at	脂肪酸去饱和酶2	0.1338^*	-0.0956
					1422016_a_at	1422016_a_at	着丝粒自身抗原H	0.1309^*	-0.0935
1420176_x_at	1420176_x_at	免疫球蛋白λ样多肽1	0.13.05^*	-0.0932
					1434501_at	1434501_at	---	0.1246^*	-0.089
1419665_a_at	1419665_a_at	核内蛋白1	0.123^*	-0.0878
					1446391_at	1446391_at	突触核蛋白，α	0.1203^*	-0.0859
1419421_at	1419421_at	锚蛋白1，类红细胞	0.1181^*	-0.0844
					1452458_s_at	1452458_s_at	肽基脯氨酰异构酶(亲环蛋白)样5	0.1163^*	-0.0831
1417939_at	1417939_at	RAD51相关蛋白1	0.1149^*	-0.0821
					1436725_at	1436725_at	RIKEN cDNA E130306D19基因	0.1104^*	-0.0789
1437187_at	1437187_at	E2F转录因子7	0.1103^*	-0.0788
					1453004_at	1453004_at	RIKEN cDNA 3110004L20基因	0.1062^*	-0.0758
1428105_at	1428105_at	TPX2，微管相关蛋白同系物(光滑爪蟾)	0.1049^*	-0.0749
					1448926_at	1448926_at	同源异型框A5	0.1047^*	-0.0748
1437370_at	1437370_at	Shugoshin样2(裂殖酵母)	0.1046^*	-0.0747
					1430999_a_at	1430999_a_at	短卷曲螺旋蛋白	0.1038^*	-0.0742.
1454757_s_at	1454757_s_at	DNA区段，Chr12，ERATO Doi647，表达的	0.1018^*	-0.0727
					1418026_at	1418026_at	核酸外切酶1	0.1016^*	-0.0726
1435148_at	1435148_at	ATP酶，Na+/K+转运，β2多肽	0.1012^*	-0.0723
					1434553_at	1434553_at	RIKEN cDNA 4930577M16基因	0.1009^*	-0.0721
1422967_a_at	1422967_a_at	转铁蛋白受体	0.1008^*	-0.072
					1434479_at	1434479_at	表达的序列AI413331	0.1001^*	-0.0715
1431893_a_at	1431893_a_at	反-异戊烯转移酶	0.0994^*	-0.071
					1447655_x_at	1447655_x_at	含SRY-框的基因6	0.0959^*	-0.0685
1434789_at	1434789_at	含DEP域1B	0.095^*	-0.0678
					1421957_a_at	1421957_a_at	磷酸胞苷酰转移酶1，胆碱，α同工型	0.0946^*	-0.0676
1455228_at	1455228_at	Wolf-Hirschhorn综合征候选物1(人)	0.0937^*	-0.0669
					1435663_at	1435663_at	雌激素受体1(α)	0.093^*	-0.0664
1429058_at	1429058_at	RIKEN cDNA 1110004B13基因	0.0925^*	-0.0661
					1424229_at	1424229_at	双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶3	0.0919^*	-0.0657
1422930_at	1422930_at	细胞间粘附分子4，Landsteiner-Wiener血型	0.0917^*	-0.0655
					1452591_a_at	1452591_a_at	RIKEN cDNA 2410018G20基因	0.0905^*	-0.0646
1453416_at	1453416_at	生长停滞特异性2样3	0.0886^*	-0.0633
					1433908_a_at	1433908_a_at	皮层肌动蛋白	0.0874^*	-0.0624

1419595_a_at	1419595_a_at	γ-谷氨酰水解酶	0.0872^*	-0.0623
					1421654_a_at	1421654_a_at	核纤层蛋白A	0.0867^*	-0.062
1417323_at	1417323_at	RIKEN cDNA 5430413I02基因	0.085^*	-0.0607
					1450992_a_at	1450992_a_at	髓细胞样嗜亲性病毒整合位点1	0.0832^*	-0.0594
1435773_at	1435773_at	RIKEN cDNA 4930547N16基因	0.0829^*	-0.0592
					1438711_at	1438711_at	---	0.0829^*	-0.0592
1429701_at	1429701_at	RIKEN cDNA 2410003J06基因	0.0827^*	-0.0591
					1433582_at	1433582_at	RIKEN cDNA 1190002N15基因	0.0823^*	-0.0588
1460192_at	1460192_at	氧固醇结合蛋白样1A	0.0817^*	-0.0584
					1443870_at	1443870_at	ATP结合盒，亚家族C(CFTR/MRP)，成员4	0.0814^*	-0.0581
1456020_at	1456020_at	SH3域和tetratricopeptide重复2	0.???0813^*	-0.0581
					1451664_x_at	1451664_x_at	杀伤细胞凝集素样受体亚家族A，成员12///杀伤细胞凝集素样受体亚家族A，成员4///杀伤细胞凝集素样受体亚家族A，成员7///杀伤细胞凝集素样受体亚家族A，成员20///杀伤细胞凝集素样受体亚家族A，成员18	0.0812^*	-0.058
1421975_a_at	1421975_a_at	内收蛋白2(β)	0.0805^*	-0.0575
					1423124_x_at	1423124_x_at	RAD54样(酿酒酵母)	0.0789^*	-0.0563
1417749_a_at	1417749_a_at	紧密连接蛋白1	0.0779^*	-0.0557
					1425145_at	1425145_at	白细胞介素1受体样1	0.0768^*	-0.0549
1424722_at	1424722_at	RIKEN cDNA 1300017J02基因	0.0762^*	-0.0544
					1455409_at	1455409_at	螺旋体同源物1(果蝇)	0.0739^*	-0.0528
1453067_at	1453067_at	RIKEN cDNA 2610040C18基因	0.0734^*	-0.0524
					1430839_at	1430839_at	RIKEN cDNA 9430076G02基因	0.0713^*	-0.0509
1434577_at	1434577_at	cDNA序列BC052040	0.0704^*	-0.0503
					1457306_at	1457306_at	聚合酶(DNA指导的)，ε3(p17亚基)	0.0699^*	-0.0499
1429734_at	1429734_at	RIKEN cDNA 4632434I11基因	0.0695^*	-0.0496
					1449060_at	1449060_at	驱动蛋白家族成员2C	0.0684^*	-0.0489
1424223_at	1424223_at	RIKEN cDNA 1700020C11基因	0.0676^*	-0.0483
					1428372_at	1428372_at	肿瘤发生抑制5	0.0667^*	-0.0476
1436124_at	1436124_at	磷酸盐胞苷酰转移酶1，胆碱，β同工型	0.0663^*	-0.0474
					1417656_at	1417656_at	成髓细胞血症致癌基因样2	0.0661^*	-0.0472
1436922_at	1436922_at	---	0.0657^*	-0.047
					1455009_at	1455009_at	羧肽酶D	0.065^*	-0.0464
1434826_at	1434826_at	表达的序列AI256775	0.064^*	-0.0457
					1455746_at	1455746_at	驱动蛋白家族成员13A	0.0628^*	-0.0449
1419087_s_at	1419087_s_at	剪接因子3a，亚基1	0.0616^*	-0.044
					1418919_at	1418919_at	shugoshin样1(裂殖酵母)	0.0611^*	-0.0436

1433596_at	1433596_at	DnaJ(Hsp40)同源物，亚家族C，成员6	0.061^*	-0.0436
					1430538_at	1430538_at	RIKEN cDNA 2210013O21基因	0.0605^*	-0.0432
1454193_at	1454193_at	RIKEN cDNA 5430401H09基因	0.0605^*	-0.0432
					1450380_at	1450380_at	室管膜素相关蛋白2(斑马鱼)	0.06^*	-0.0428
1434322_at	1434322_at	RIKEN cDNA A930021H16基因	0.0596^*	-0.0426
					1438650_x_at	1438650_x_at	间隙连接膜通道蛋白α1	0.0593^*	-0.0424
1451914_a_at	1451914_a_at	内收蛋白2(β)	0.0574^*	-0.041
					1436584_at	1436584_at	Sprouty同源物2(果蝇)	0.0555^*	-0.0396
1455012_s_at	1455012_s_at	三联基序蛋白37	0.0551^*	-0.0394
					1452026_a_at	1452026_a_at	磷酯酶A2，XIIA类	0.0524^*	-0.0374
1451257_at	1451257_at	酰基辅酶A合成酶长链家族成员6	0.0521^*	-0.0372
					1435792_at	1435792_at	Sp100-rs的组分	0.0513^*	-0.0366
1435029_at	1435029_at	RIKEN cDNA B230120H23基因	0.0492^*	-0.0351
					1434630_at	1434630_at	锚蛋白重复结构域28	0.0491^*	-0.0351
1426801_at	1426801_at	隔蛋白8	0.0483^*	-0.0345
					1436936_s_at	1436936_s_at	灭活的X特异性转录物	0.0458^*	-0.0327
1418069_at	1418069_at	载脂蛋白C-II	0.0456^*	-0.0326
					1425837_a_at	1425837_a_at	CCR4碳分解代谢物阻抑4样(酿酒酵母)	0.0456^*	-0.0326
1441757_at	1441757_at	RIKEN cDNA 1190002F15基因	0.0454^*	-0.0325
					1422906_at	1422906_at	ATP结合盒，亚家族G(WHITE)，成员2	0.045^*	-0.0322
1454858_x_at	1454858_x_at	RIKEN cDNA 3300001H21基因	0.045^*	-0.0321
					1443673_x_at	1443673_x_at	---	0.0449^*	-0.032
1417587_at	1417587_at	永久同源物(果蝇)	0.0447^*	-0.0319
					1456022_at	1456022_at	同源结构域相互作用蛋白激酶2	0.0445^*	-0.0318
1438202_at	1438202_at	RIKEN cDNA C920005C14基因	0.0439^*	-0.0314
					1453836_a_at	1453836_a_at	单酸甘油酯脂肪酶	0.0434^*	-0.031
1422966_a_at	1422966_a_at	转铁蛋白受体	0.0431^*	-0.0308
					1439208_at	1439208_at	限制点激酶1同源物，(裂殖酵母)	0.0423^*	-0.0302
1422944_a_at	1422944_a_at	透明同源物3(果蝇)	0.0417^*	-0.0298
					1419412_at	1419412_at	趋化因子(C基序)配体1	0.0414^*	-0.0296
1435378_at	1435378_at	RIKEN cDNA 2210020M01基因	0.0414^*	-0.0296
					1422788_at	1422788_at	溶质载体家族43，成员3	0.0413^*	-0.0295
1452763_at	1452763_at	Prader-Willi/Angelman综合征1中非印迹同源物(人)	0.0413^*	-0.0295
					1428369_s_at	1428369_s_at	Rho GTP酶激活蛋白21	0.0409^*	-0.0292
1453107_s_at	1453107_s_at	果蝇forkhead框M1///脑磷酯结合蛋白///RIKEN cDNA	0.0404^*	-0.0288

		4933413G19基因
					1418219_at	1418219_at	白细胞介素15	0.0379^*	-0.027
1448834_at	1448834_at	果蝇forkhead框M1	0.0372^*	-0.0266
					1435054_at	1435054_at	必需减数分裂核酸内切酶同源物1(裂殖酵母)	0.0371^*	-0.0265
1434586_a_at	1434586_a_at	磷脂酰丝氨酸合成酶2	0.0367^*	-0.0262
					1418929_at	1418929_at	雌激素相关受体β样1	0.0366^*	-0.0261
1451469_at	1451469_at	RIKEN cDNA B430108F07基因	0.0363^*	-0.0259
					1428104_at	1428104_at	TPX2，微管相关蛋白同源物(光滑爪蟾)	0.0339^*	-0.0242
1427262_at	1427262_at	灭活的X特异性转录物	0.0337^*	-0.0241
					1431012_a_at	1431012_a_at	过氧化物酶体Δ3，Δ2-烯酰辅酶A异构酶	0.0336^*	-0.024
1434850_at	1434850_at	假设蛋白D030034H08	0.033^*	-0.0236
					1441520_at	1441520_at	钙调蛋白结合蛋白1	0.0329^*	-0.0235
1423344_at	1423344_at	促红细胞生成素受体	0.0328^*	-0.0234
					1434557_at	1434557_at	亨廷顿蛋白相互作用蛋白1	0.0325^*	-0.0232
1424863_a_at	1424863_a_at	同源结构域相互作用蛋白激酶2	0.0321^*	-0.0229
					1457670_s_at	1457670_s_at	核纤层蛋白A	0.0316^*	-0.0226
1451417_at	1451417_at	乳房癌1	0.0305^*	-0.0218
					1428952_at	1428952_at	蛋白质二硫键异构酶相关2	0.0303^*	-0.0217
1449514_at	1449514_at	G蛋白偶联受体激酶5	0.0296^*	-0.0211
					1416273_at	1416273_at	肿瘤坏死因子，α-诱导的蛋白2	0.0292^*	-0.0209
1460223_a_at	1460223_a_at	红细胞蛋白带4.9	0.0292^*	-0.0208
					1423902_s_at	1423902_s_at	Rho鸟嘌呤核苷交换因子(GEF)12	0.0291^*	-0.0208
1417404_at	1417404_at	ELOVL家族成员6，长链脂肪酸的延伸(酵母)	0.0289^*	-0.0206
					1420712_a_at	1420712_a_at	hepsin	0.0273^*	-0.0195
1452924_at	1452924_at	RIKEN cDNA 2310007D09基因	0.0273^*	-0.0195
					1429059_s_at	1429059_s_at	RIKEN cDNA 1110004B13基因	0.0272^*	-0.0194
1435784_at	1435784_at	自噬相关9样1(酵母)	0.0264^*	-0.0189
					1449648_s_at	1449648_s_at	RNA聚合酶1-1	0.0264^*	-0.0188
1460551_at	1460551_at	RAN，癌基因家族成员RAS	0.0259^*	-0.0185
					1439091_at	1439091_at	范科尼贫血，互补群D2	0.0249^*	-0.0178
1457851_at	1457851_at	---	0.0245^*	-0.0175
					1416575_at	1416575_at	细胞分裂周期45同源物(酿酒酵母)样	0.0234^*	-0.0167
1422922_at	1422922_at	RecQ蛋白样4	0.0234^*	-0.0167
					1456510_x_at	1456510_x_at	UbiE-YGHL1融合蛋白	0.0231^*	-0.0165
1448871_at	1448871_at	促分裂原激活蛋白激酶13	0.0226^*	-0.0161
					1450495_a_at	1450495_a_at	杀伤细胞凝集素样受体亚家族K，成员1	0.0225^*	-0.0161


					1442000_at	1442000_at	类似于新蛋白	0.0222^*	-0.0158
1452098_at	1452098_at	CTF18，染色体传递保真因子18同源物(酿酒酵母)	0.0219^*	-0.0156
					1453049_at	1453049_at	RTKEN cDNA 662040IM08基因	0.0217^*	-0.0155
1434864_at	1434864_at	Prader-Willi/Angelman综合征1中非印迹同源物(人)	0.0212^*	-0.0152
					1460495_s_at	1460495_s_at	蛋白酶，丝氨酸，25	0.021^*	-0.015
1453181_x_at	1453181_x_at	磷脂scramblasel	0.0209^*	-0.0149
					1420330_at	1420330_at	C-型凝集素结构域家族4，成员e	0.0208^*	-0.0149
1438011_at	1438011_at	磷酸胞苷酰转移酶1，胆碱，α同工型	0.0205^*	-0.0146
					1450344_a_at	1450344_a_at	前列腺E受体3(EP3亚型)	0.0204^*	-0.0146
1424895_at	1424895_at	G-蛋白信号调制器2(AGS3-样，线虫)	0.0201^*	-0.0144
					1426543_x_at	1426543_x_at	RIKEN cDNA 2310067E08基因；	0.0193^*	-0.0138
1423878_at	1423878_at	血型糖蛋白C	0.0186^*	-0.0133
					1427263_at	1427263_at	灭活的X特异性转录物	0.0186^*	-0.0133
1434150_a_at	1434150_a_at	RIKBN cDNA 3300001H21基因：///UbiE-YGHL1融合蛋白	0.0185^*	-0.0132
					1453681_at	1453681_at	ATP酶抑制因子1	0.0181^*	-0.013
1450556_at	1450556_at	膜收缩蛋白β1	0.0175^*	-0.0125
					1434554_at	1434554_at	三联基序蛋白37	0.0174^*	-0.0124
1448529_at	1448S29_at	血栓调节蛋白	0.0173^*	-0.0123
					1429404_at	1429404_at	RIKEN cDNA 2010317E24基因	0.0168^*	-0.012
1432886_at	1432886_at	RIKEN cDNA 5730488B01基因	0.0162^*	-0.0116
					1435325_at	1435325_at	泛素特异性蛋白酶46	0.016^*	-0.0114
1434587_x_at	1434587_x_at	磷脂酰丝氨酸合成酶2	0.0157^*	-0.0112
					1418003_at	1418003_at	RIKEN cDNA 1190002H23基因	0.0156^*	-0.0111
1434310_at	1434310_at	骨形态发生蛋白受体，II型(丝氨酸/苏氨酸激酶)	0.0147^*	-0.0105
					1435035_at	1435035_at	含RNA(鸟嘌呤-9-)甲基转移酶结构域的2	0.0144^*	-0.0103
1424413_at	1424413_at	阿片样物质生长因子受体样1	0.014^*	-0.01
					1436872_at	1436872 _at	转化，含酸性卷曲螺旋蛋白3	0.0133^*	-0.0095
1417878_at	1417878_at	E2F转录因子1	0.013^*	-0.0093
					1428433_at	1428433_at	同源结构域相互作用蛋白激酶2	0.0125^*	-0.0089
1429642_at	1429642_at	ANl，泛素样，同源物(光滑爪蟾)	0.0122^*	-0.0087
					1435786_at	1435786_at	Kelch样12(果蝇)	0.0119^*	-0.0085
1428391_at	1428391_at	RAB3A相互作用蛋白(Rab结合蛋白3)样1	0.0118^*	-0.0085

1451596_a_at	1451596_a_at	鞘氨醇激酶1	0.0117^*	-0.0084
					1422619_at	1422619_at	磷脂酸磷酸酶2a	0.0111^*	-0.0079
1449708_s_at	1449708_s_at	限制点激酶1同源物(裂殖酵母)	0.0106^*	-0.0076
					1429294_at	1429294_at	甲状腺激素受体相互作用物13	0.0105^*	-0.0075
1450862_at	1450862_at	RAD54样(酿酒酵母)	0.0103^*	·0.0074
					1433695_at	1433695_at	RIKEN cDNA 1500041B16基因	0.0097^*	-0.0069
1451083_s_at	1451083_s_at	丙氨酰-tRNA合成酶	0.0097^*	-0.0069
					1422620_s_at	1422620_s_at	磷脂酸磷酸酶2a	0.0094^*	-0.0067
1457722_at	1457722_at	RIKEN cDNA A630024B12基因	0.0091^*	-0.0065
					1455405_at	1455405_at	脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸磷酸酶相互作用蛋白2	0.009^*	-0.0064
1460010_a_at	1460010_a_at	磷脂酰丝氨酸合成酶2	0.0089^*	-0.0063
					1424412_at	1424412_at	阿片样物质生长因子受体样1	0.0083^*	-0.0059
1456475_s_at	1456475_s_at	蛋白激酶，cAMP依赖性调节，IIβ型	0.0082^*	-0.0058
					1449714_at	1449714_at	RIKEN cDNA 5730472N09基因	0.0077^*	-0.0055
1434645_at	1434645_at	RIKEN cDNA C530008M17基因	0.0069^*	-0.005
					1425157_x_at	1425157_x_at	RIKEN cDNA 1300010A20基因	0.0067^*	-0.0048
1432273_a_at	1432273_a_at	达菲血型	0.0063^*	-0.0045
					1417037_at	1417037_at	起点识别复合体亚基6样(酿酒酵每)	0.0062^*	-0.0044
1428402_at	1428402_at	锌指，含CCHC结构域的3	0.0062^*	-0.0044
					1416130_at	1416130_at	朊病毒蛋白	0.0061^*	-0.0043
1455218_at	1455218_at	RIKEN cDNA 6330503K22基因	0.0056^*	-0.004
					1452166_a_at	1452166_a_at	角蛋白复合物，酸性基团10	0.0049^*	-0.0035
1437992_x_at	1437992_x_at	间隙连接膜通道蛋白α1	0.0037^*	-0.0026
					1449015_at	1449015_at	抵抗素样α	0.0033^*	-0.0023
1428713_s_at	1428713_s_at	RIKEN cDNA 4833427B12基因	0.0032^*	-0.0023
					1427105_at	1427105_at	RIKEN cDNA 2610510J17基因	0.0031^*	-0.0022
1426541_a_at	1426541_a_at	RIKEN cDNA 2310067E08基因	0.0028^*	-0.002
					1424293_s_at	1424293_s_at	RIKEN cDNA 2610319K07基因	0.0024^*	-0.0017
1423724_at	1423724_at	ZW10相互作用物	0.002^*	-0.0014
					1451609_at	1451609_at	RIKEN cDNA 1300010A20基因	0.0018^*	-0.0013
1417902_at	1417902_at	溶质载体家族19(硫胺转运蛋白)，成员2	0.0016^*	-0.0012
					1424292_at	1424292_at	含DEP结构域的1a	0.0015^*	-0.0011
1455983_at	1455983_at	细胞分裂周期相关2	0.0015^*	-0.0011
					1448211_at	1448211_at	ATP酶，H+转运，溶酶体的，V0亚基E同工型2	0.0013^*	-9.00E-04
1453769_at	1453769_at	RIKEN cDNA 2610318C08基因	0.0012^*	-9.00E-04
					1417892_a_at	1417892_a_at	Sirtuin3(沉默交配型信息调节2，同源物3(酿酒酵母)	6.00E-04*	-4.00E-04


					1428195_at	1428195_at	RIKEN cDNA 4631427C17基因	-1.00E-04#	1.00E-04
1450932_s_at	1450932_s_at	胞质分裂9的奉献者	-3.00E-04#	2.00E-04
					1417652_a_at	1417652_a_at	微管蛋白辅因子a	-4.00E-04#	3.00E-04
1455210_at	1455210_at	锌指和同源异型框蛋白2	-0.0014#	0.001
					1419103_a_at	1419103_a_at	含自水解酶结构域的6	-0.0015#	0.001
1441975_at	1441975_at	酸性磷酸酶，前列腺	-0.0017#	0.0012
					1419119_at	1419119_at	造血细胞信号传感器	-0.0019#	0.0013
1449508_at	1449508_at	白介素27受体α	-0.0025#	0.0018
					1445711_at	1445711_at	表达的序列BB163080	-0.0029#	0.002
1426044_a_at	1426044_a_at	蛋白激酶C，θ	-0.0036#	0.0026
					1424903_at	1424903_at	Jumonji，富含AT的相互作用结构域ID(Rbp2样)	-0.0037#	0.0027
1416035_at	1416035_at	---	-0.0045#	0.0032
					1460260_s_at	1460260_s_at	亲核蛋白(核转运蛋白)α1	-0.0046#	0.0033
1439956_at	1439956_at	成人雄性主动脉和静脉cDNA，RIKEN全长富集文库，克隆：A530049N04产物：未知EST，全部插入序列	-0.0048#	0.0034
					1416406_at	1416406_at	星形细胞中富含的磷蛋白15	-0.0051#	0.0036
1419548_at	1419548_at	亲核蛋白(核转运蛋白)α1	-0.0054#	0.0039
					1437756_at	1437756_at	GTP酶，IMAP家族成员9	-0.0056#	0.004
1436067_at	1436067_at	含锌指和BTB结构域的10	-0.0058#	0.0042
					1450710_at	1450710_at	jumonji，富含AT相互作用结构域2	-0.0061#	0.0044
1433955_at	1433955_at	含布罗莫结构域和WD重复结构域的1	-0.0067#	0.0048
					1439343_at	1439343_at	3天婴儿胸腺cDNA，RIKEN全长富集文库，克隆：A630050A01产物：未分类，全部插入序列	-0.0073#	0.0052
1426771_at	1426771_at	表达的序列AI316828	-0.0079#	0.0057
					1419722_at	1419722_at	蛋白酶，丝氨酸19(neuropsin)	-0.0085#	0.0061
1419810_x_at	1419810_x_at	Rho GTP酶活化蛋白9	-0.0099#	0.0071
					1452322_a_at	1452322_a_at	含布罗莫结构域和WD重复结构域的1	-0.0106#	0.0076
1446835_at	1446835_at	---	-0.011#	0.0078
					1417371_at	1417371_at	pellino 1	-0.0111#	0.0079
1436353_at	1436353_at	RIKEN cDNA A230046K03基因	-0.0114#	0.0082
					1420685_at	1420685_at	GRB2相关的接头蛋白2	-0.0115#	0.0082

1456440_s_at	1456440_s_at	转录座位	-0.0117#	0.0084
					1454742_at	1454742_at	RasGEF域家族，成员1B	-0.0122#	0.0087
1450024_at	1450024_at	融合同源物的阻抑基因(果蝇)	-0.0125#	0.009
					1433953_at	1433953_at	锌指蛋白277	-0.0135#	0.0096
1417210_at	1417210_at	真核翻译起始因子2，亚基3，结构基因Y连锁的	-0.0137#	0.0098
					1444828_at	1444828_at	蛋白质磷酸酶2，调节亚基B(B56)，γ同工型	-0.0139#	0.0099
1447502_at	1447502_at	---	-0.014#	0.01
					1422445_at	1422445_at	整联蛋白的α6	-0.0148#	0.0106
1453244_at	1453244_at	RIKEN cDNA 5830416P10基因	-0.0157#	0.0112
					1426725_s_at	1426725_s_at	E26鸟类白血病致癌基因1，5＇结构域	-0.0175#	0.0125
1438577_at	1438577_at	转录座位	-0.018#	0.0129
					1452077_at	1452077_at	DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)框多肽3，Y-连锁的	-0.02#	0.0143
1416007_at	1416007_at	富含特定AT序列结合蛋白1	-0.0203#	0.0145
					1426438_at	1426438_at	DEAD，(Asp-Glu-Ala-Asp)框多肽3，Y-连锁的	-0.021#	0.015
1422122_at	1422122_at	Fc受体，IgE，低亲和力II，α多肽	-0.0213#	0.0152
					1434260_at	1434260_at	FCH和双SH3结构域2	-0.0215#	0.0153
1417816_s_at	1417816_s_at	肿瘤差异表达1	-0.0222#	0.0158
					1427532_at	1427532_at	T细胞受体相关跨膜接头1	-0.0222#	0.0159
1454947_a_at	1454947_a_at	cDNA序列BC002236	-0.0224#	0.016
					1418235_at	1418235_at	自噬相关5样(酵母)	-0.0243#	0.0173
1418353_at	1418353_at	CD5抗原	-0.0258#	0.0184
					1450262_at	1450262_at	Car样细胞因子1	-0.026#	0.0186
1455165_at	1455165_at	转录座位	-0.0268#	0.0191
					1439595_at	1439595_at	T细胞受体α链	-0.0272#	0.0194
1426620_at	1426620_at	碳水化合物磺基转移酶10	-0.0278#	0.0198
					1454745_at	1454745_at	Rho GTP酶活化蛋白29	-0.029#	0.0207
1439719_at	1439719_at	RIKEN cDNA E430004N04基因	-0.0292#	0.0208
					1435374_at	1435374_at	转录座位	-0.0302#	0.0216
1456678_at	1456678_at	RIKEN cDNA 1700091G21基因	-0.0306#	0.0218
					1423176_at	1423176_at	ErbB-2.1的传感器	-0.0348#	0.0249
1424374_at	1424374_at	GTP酶，IMAP家族成员4	-0.0355#	0.0253
					1446614_at	1446614_at	二酰基甘油激酶ζ	-0.0359#	0.0257
1448862_at	1448862_at	细胞间粘附分子2	-0.0365#	0.0261
					1439036_a_at	1439036_a_at	ATP酶，Na+/K+转运，β1多肽	-0.0375#	0.0268
1442023_at	1442023_at	RIKEN cDNA A530030E21基因	-0.0376#	0.0269
					1436182_at	1436182_at	富含特定AT序列结合蛋白1	-0.0385#	0.0275


					1443703_at	1443703_at	转录座位	-0.0385#	0.0275
1422562_at	1422562_at	与糖尿病相关的Ras	-0.0396#	0.0283
					1454893_at	1454893_at	RIKEN cDNA 1110013L07基因	-0.0402#	0.0287
1427831_s_at	1427831_s_at	锌指蛋白260	-0.0404#	0.0289
					1452163_at	1452163_at	E26鸟白血病致癌基因1，5＇结构域	-0.0417#	0.0298
1421570_at	1421570_at	白介素9受体	-0.0431#	0.0308
					1442998_at	1442998_at	胞嘧啶核苷5＇-三磷酸合成酶2	-0.0437#	0.0312
1426452_a_at	1426452_a_at	RAB30，RAS致癌基因家族成员	-0.0473#	0.0338
					1431980_a_at	1431980_a_at	砷(+3氧化态)甲基转移酶	-0.0478#	0.0341
1456205_x_at	1456205_x_at	微管蛋白辅因子a	-0.048#	0.0343
					1441041_at	1441041_at	RIKEN cDNA 2810407L07基因	-0.0491#	0.0351
1427418_a_at	1427418_a_at	低氧可诱导因子1，α亚基	-0.0492#	0.0351
					1456502_at	1456502_at	双特异性酪氨酸-(Y)-磷酸化调节激酶2	-0.0502#	0.0358
1432229_a_at	1432229_a_at	染色体结构域蛋白，Y染色体样2	-0.0516#	0.0368
					1453726_s_at	1453726_s_at	RIKEN cDNA 2810407CO2基因	-0.0517#	0.0369
1440343_at	1440343_at	核糖体蛋白S6激酶，多肽5	-0.0519#	0.037
					1435584_at	1435584_at	表达的序列AI662791	-0.0522#	0.0373
1419481_at	1419481_at	选择蛋白，淋巴细胞	-0.0524#	0.0374
					1437907_a_a_at	1437907_a_at	微管蛋白辅因子a	-0.0532#	0.038
1419192_at	1419192_at	白介素4诱导的1	-0.0554#	0.0395
					1424936_a_at	1424936_a_at	动力蛋白，纤毛轴，重链8	-0.0562#	0.0402
1448931_at	1448931_at	组织凝血活酶II(凝血酶)受体样2	-0.0571#	0.0408
					1423890_x_at	1423890_x_at	ATP酶，Na+/k+转运，β1多肽	-0.0582#	0.0415
1458432_at	1458432_at	酪氨酸激酶接头蛋白的2-非催化区域	-0.0588#	0.042
					1440217_at	1440217_at	类似于假定蛋白FLJ39743	-0.0593#	0.0424
1440647_at	1440647_at	信号诱导的增生相关1样1	-0.0596#	0.0426
					1440284_at	1440284_at	转录座位	-0.0598#	0.0427
145769I_at	1457691_at	转录座位	-0.0614#	0.0439
					1455256_at	1455256_at	TRAF2和NCK相互作用激酶	-0.0625#	0.0447
1421628_at	1421628_at	白介素18受体1	-0.0635#	0.0454
					1442045_at	1442045_at	16天婴儿胸腺cDNA，RIKEN全长富集文库，克隆：A130046K23产物：未知EST，全部插入序列	-0.0635#	0.0453

1452737_at	1452737_at	RIKEN cDNA 2810008M24基因	-0.0673#	0.0481
					1419480_at	1419480_at	选择蛋白，淋巴细胞	-0.0683#	0.0488
1459632_at	1459632_at	富含半胱氨酸的运动神经元	-0.0722#	0.0516
					1427359_at	1427359_at	RIKEN cDNA A630082K20基因	-0.0757#	0.0541
1426640_s_at	1426640_s_at	tribbles同源物2(果蝇)	-0.0783#	0.0559
					1435754_at	1435754_at	DNA片段，Chr6，Brigham&Women’sGenetics 1452表达的	-0.0791#	0.0565
1460204_at	1460204_at	细胞质酪氨酸激酶Dscr28C相关的(果蝇)	-0.0803#	0.0574
					1454897_at	1454897_at	RIKEN cDNA 6330509M05基因	-0.0804#	0.0574
1449520_at	1449520_at	表达序列AI428795	-0.0813#	0.058
					1421622_a_at	1421622_a_at	Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)4	-0.0841#	0.0601
1425245_a_t	1425245_a_at	G蛋白信号的调节子11	-0.0842#	0.0602
					1416008_at	1416008_at	富含特定AT序列结合蛋白1	-0.0847#	0.0605
1452009_at	1452009_at	RIKEN cDNA 9130422G05基因	-0.0861#	0.0615
					1445141_at	1445141_at	κB激酶β的抑制子	-0.0875#	0.0625
1431169_at	1431169_at	RIKEN cDNA D230012E17基因	-0.0878#	0.0627
					1443192_at	1443192_at	RIKEN cDNA E430004N04基因	-0.0882#	0.063
1428834_at	1428834_at	双特异性磷酸酶4	-0.091#	0.065
					1423989_at	1423989_at	RIKEN cDNA 2210010N04基因	-0.0914#	0.0653
1443573_at	1443573_at	聚(ADP-核糖)聚合酶家族，成员1	-0.0916#	0.0654
					1450061_at	1450061_at	外胚层神经皮层1	-0.0959#	0.0685
1452503_a_at	1452503_a_at	含布罗莫结构域和WD重复结构域的1	-0.0969#	0.0692
					1451313_a_at	1451313_a_at	RIKEN cDNA 1110067D22基因	-0.1008#	0.072
1437253_at	1437253_at	RIKEN cDNA A630054L15基因	-0.1009#	0.072
					1428726_at	1428726_at	含THUMP结构域的2	-0.1017#	0.0727
1451622_at	1451622_at	含LMBR1结合域的1	-0.103#	0.0736
					1435456_at	1435456_at	表达的序列AI428795	-0.1035#	0.0739
1444181_at	1444181_at	GTP酶，IMAP家族成员5	-0.1036#	0.074
					1418762_at	1418762_at	衰变加速因子1	-0.1059#	0.0757
1423297_at	1423297_at	内收蛋白3(γ)	-0.1071#	0.0765
					1425518_at	1425518_at	Rap鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)4	-0.1071#	0.0765
1427322_at	1427322_at	含布罗莫结构域和WD重复结构域的1	-0.1084#	0.0775
					1426158_at	1426158_at	T细胞受体，变体13	-0.1126#	0.0804
1416129_at	1416129_at	RIKEN cDNA 1300002F13基因	-0.1139#	0.0814
					1426550_at	1426550_at	SID1跨膜家族成员1	-0.1143#	0.0817
1428510_at	1428510_at	latrophilin 1	-0.1187#	0.0848
					1456520_at	1456520_at	RIKEN cDNA 9530033F24基因	-0.1202#	0.0859
1419212_at	1419212_at	Icos配体	-0.126#	0.09
					1437540_at	1437540_at	---	-0.1261#	0.0901

1429969_at	1429969_at	RIKEN cDNA 4833403J16基因	-0.13#	0.0929
					1459722_at	1459722_at	含锌指、SWIM结构域的6	-0.13#	0.0928
1449642_at	1449642at	EB病毒诱导基因2	-0.1319#	0.0942
					1444283_at	1444283_at	GTP酶，IMAP家族成员7	-0.1324#	0.0945
1434333_a_at	1434333_a_at	蛋白激酶D2	-0.1329#	0.0949
					1453119_at	1453119_at	含OUT结合域的1	-0.1339#	0.0957
1421852_at	1421852_at	钾通道亚家族K成员5	-0.1385#	0.099
					1425186_at	1425186_at	含LMBR1结构域的1	-0.1443#	0.103
1433977_at	1433977_at	硫酸类肝素(葡萄糖胺)3-O-磺基转移酶3B1	-0.1462#	0.1044
					1436491_at	1436491_at	RIKEN cDNA 5830431A10基因	-0.1518#	0.1084
1460242_at	1460242_at	衰变加速因子1	-0.1524#	0.1088
					1445277_at	1445277_at	16天婴儿胸腺cDNA，RIKEN全长富集文库，克隆：A130006J10产物：未知EST，全部插入序列	-0.1527#	0.1091
1418497_at	1418497_at	成纤维细胞生长因子13	-0.1588#	0.1134
					1455425_at	1455425_at	表达序列BB001228	-0.1632#	0.1166
1418998_at	1418998_at	犬尿氨酸3-单加氢酶(犬尿氨酸3-羟化酶)	-0.1673#	0.1195
					1452167_at	1452167_at	RIKEN cDNA 2810407C02基因	-0.1698#	0.1213
1442266_at	1442266_at	表达序列AI662175	-0.1713#	0.1223
					1439843_at	1439843_at	钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV	-0.1732#	0.1237
1427752_a_at	1427752_a_at	T细胞受体β，变体13///类似于TCRBV7S1///类似于TCRBV7S1	-0.1805#	0.1289
					1451253_at	1451253_at	包含PX结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶	-0.1819#	0.1299
1428669_at	1428669_at	脑表达的髓细胞组织增生致癌基因	-0.1862#	0.133
					1434967_at	1434967_at	含锌指，SWIM结构域的6	-0.1869#	0.1335
1422231_a_at	1422231_a_at	肿瘤坏死因子受体超家族，成员25	-0.1906#	0.1361
					1428914_at	1428914_at	RIKEN cDNA 2310014D11基因	-0.1917#	0.1369
1434175_s_at	1434175_s_at	RIKEN cDNA 2210010N04基因	-0.2013#	0.1438
					1416268_at	1416268_at	E26鸟白血病致癌基因2，3＇域	-0.203#	0.145
1436851_at	1436851_at	蛋白激酶N1	-0.2037#	0.1455
					1438862_at	1438862_at	RIKEN cDNA A630005104基因	-0.2078#	0.1484
1448107_x_at	1448107_x_at	激肽释放酶6	-0.2085#	0.149
					1424062_at	1424062_at	泛素缀合酶E2D，UBC4/5同源物(酵母)	-0.2114#	0.151
1444003_at	1444003_at	肺可诱导的中和相关的C3HC4 RING域蛋白	-0.2133#	0.1524

1428267_at	1428267_at	DEAH(Asp-Glu-Ala-His)框多肽40	-0.2217#	0.1584
					1443906_at	1443906_at	衰变加速因子1	-0.2229#	0.1592
1420583_a_at	1420583_a_at	RAR相关的孤儿基因受体	-0.2261#	0.1615
					1420965_a_at	1420965_a_at	外胚层神经皮层1	-0.2282#	0.163
1446244_at	1446244_at	DNA区段Chr 6，Brigham &Women＇s Genetics 1452表达的	-0.2305#	0.1647
					1440900_at	1440900_at	成人胸腺cDNA，RIKEN全长富集文库，克隆：5830404C02产物：未知EST，全部插入序列	-0.2324#	0.166
1416958_at	1416958_at	核受体亚家族1，D组，成员2	-0.2348#	0.1677
					1425832_a_at	1425832_a_at	趋化因子(C-X-C基序)受体6	-0.2391#	0.1708
1447792_x_at	1447792_x_at	成人胸腺cDNA，RIKEN全长富集文库，克隆：5830404C02产物：未知EST，全部插入序列	-0.2451#	0.1751
					1429443_at	1429443_at	copine IV	·0.2472#	0.1766
1455555_at	1455555_at	表达序列AV071699	-0.251#	0.1793
					1415837_at	1415837_at	激肽释放酶6	-0.2687#	0.1919
1453568_at	1453568_at	RIKEN cDNA 2310032F03基因	-0.2765#	0.1975
					1452815_at	1452815_at	嘌呤能受体P2Y G蛋白偶联的10	-0.2789#	0.1992
1446412_at	1446412_at	含WW结构域的氧化还原酶	-0.2819#	0.2014
					1448575_at	1448575_at	白介素7受体	-0.2862#	0.2044
1431050_at	1431050_at	核糖体蛋白S6激酶多肽5	-0.291#	0.2078
					1448576_at	1448576_at	白介素7受体	-0.3125#	0.2232
1422812_at	1422812_at	趋化因子(C-X-C基序)受体6	-0.314#	0.2243
					1437356_at	1437356_at	EB病毒诱导基因2	-0.322#	0.23
1448613_at	1448613_at	脑外基质蛋白1	-0.3377#	0.2412
					1433779_at	1433779_at	癌症易感候选者4	-0.4293#	0.3066

mir155mRNA标记：^*表明在小鼠mir155中过表达的基因，#表明下表达的基因。分数是PAM分数(Tibshirani，R.J.，Hastie，T.J.，Narasimhan，B.，和Chu，G.(2002)，＂Diagnosis of multiplecancer types by shrunken centroids of gene expression，＂Proceedings of the National Academy of Sciences，99，6567-6572)。“nearest shrunken centroids”的PAM方法，鉴定了最好表征mir155转基因的基因的亚类。PAM分数不是倍数变化。

表3.根据微阵列预测分析的(PAM)分类，Affymetrix微阵列数据描述了在mir155转基因小鼠中显著过表达的微小RNA的标记(5只转基因小鼠和6只野生型小鼠)。

名称 miR155分数 wt分数

mmu-mir-151-prec 3.9218^* -2.2411

mmu-mir-217-precNo2 3.1565^* -1.8037

mmu-mir-224-precformer175No1 1.9286^* -1.1021

mmu-mir-194-prec 1.6021^* -0.9155

mmu-mir-201-prec 1.5653^* -0.8945

mmu-mir-155-prec 1.4967^* -0.8553

mmu-mir-218-2-precNo2 0.939^* -0.5365

mmu-mir-182-prec 0.4886^* -0.2792

mir155微小RNA标记：^*表明在Eμ-mmu-miR155转基因小鼠中显著过表达的微小RNA。

这里引用的所有出版物的相关教导，其没有明确地引入作为参考，都以其全部内容引入这里作为参考。同时本发明尤其参考其优选实施方案说明和描述，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明进行形式和细节的各种改变，而不背离附加的权利要求所包含的本发明的范围。

Claims

1.一种生产转基因非人哺乳动物的方法，该方法包括将含有能指导在动物的B细胞中表达的至少一个转录调节序列的核酸构建体引入所述动物中，其中所述的转录调节序列包含V_H启动子，并且与编码miR155基因产物的核酸可操作连接，该miR155基因产物是SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，并且其中所述至少一个转录调节序列还包括Ig重链-Eμ增强子，其中所述动物是小鼠。

2.权利要求1的方法，其中所述V_H启动子来源于小鼠。

3.权利要求1的方法，其中所述I g重链-Eμ增强子来源于小鼠。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中相对于适合的对照，该动物的脾、骨髓或两者中具有扩大的B220low/CD19low/CD10low/IgM-/TCR-/CD43-淋巴样细胞群体。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述动物显示淋巴组织增生疾病。

6.权利要求5的方法，其中所述淋巴组织增生疾病是B细胞恶性肿瘤。

7.权利要求6的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是白血病，淋巴瘤或赘生物。

8.权利要求5的方法，其中所述淋巴组织增生疾病是白血病前期状况。

9.权利要求1-3中任一项的方法，其中该动物显示扩大的B2201ow/CD191ow/CD101ow/IgM-/TCR-/CD43-淋巴样细胞群体、增大的腹部、脾肿大、骨髓取代、淋巴细胞减少和其组合。

10.权利要求1的方法，其中所述核酸构建体包括β球蛋白基因的3’UTR和聚腺苷酸序列。

11.权利要求6的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤显示人急性淋巴母细胞性白血病，人淋巴母细胞性淋巴瘤或其组合的特征。