JP5127821B2 - miR155トランスジェニックマウスにおけるプレB細胞増殖及びリンパ芽球性白血病/高悪性度リンパ腫 - Google Patents
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Description
本発明は、全体が又は部分的に、米国政府からの基金により支援された。政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、その発現がB細胞を標的とし(例えば、Ig重鎖Eμエンハンサーを使用して)、最初に前白血病性プレB細胞増殖を示し(脾臓及び骨髄で明白)、及び後でB細胞悪性腫瘍を発生させる、miR155導入遺伝子を運んでいるトランスジェニックマウスの発見に基づいている。miR155を過剰発現するトランスジェニックマウスは、ヒトリンパ球増殖性疾患に似ているリンパ球増殖性疾患を発生し、それ故、これらの疾患の開始及び/又は進行におけるmiR155を強く示唆している。Eμ−mmu−miR155トランスジェニックマウスは、ヒトにおけるB細胞悪性腫瘍(例えば、急性リンパ芽球性白血病、高悪性度リンパ腫)のようなリンパ球増殖性疾患の異なった形態を治療するための新規治療アプローチを考案するために有用である。
本発明の特定の態様の説明が以下に示される。
本明細書に例示され及び記述されるように、マイクロRNA、miR155を過剰発現するトランスジェニックマウスは、ヒトの急性リンパ芽球性白血病及び高悪性度リンパ腫に似ているリンパ球増殖性疾患を発症する。本明細書で提供される結果は、miR155及び/又は他の遺伝子(単数又は複数)(例えば、癌で活性化される遺伝子(例えば、シグナル伝達遺伝子))の発癌性発現が、B細胞悪性腫瘍の開始及び/又は進行に関与していることを強く示している。従って、B細胞悪性腫瘍及び他のリンパ球増殖性状態の開始及び進行の根底にある機構を調べるために使用することができる動物モデルが本明細書で提供される。この動物モデルは、リンパ球増殖性障害を治療する又は予防することにおいて有用である新規治療剤の同定、開発及び試験にも使用することができる。
5’-CUGUUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGUUUUGGCCUCUGACUGACUCCUACCUGUUAGCAUUAACAG-3’ (配列番号1)により表され、一方、プロセシングされた又は成熟マウスmiR155遺伝子産物はヌクレオチド配列:
5’- UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGG-3’(配列番号2;GenBank 寄託番号AJ459767)により表される。
材料及び方法
トランスジェニックマウス:
miR155の前駆配列を含有する318bp断片をPCRにより129SvJマウス(The Jackson Laboratory)のゲノムから増幅し、Ig重鎖のためのEμエンハンサーVHプロモーター及びヒトβ−グロビン遺伝子の3’UTR及びポリ(A)を含有し(図1)、及び以前にEμ−TCL1トランスジェニックマウスにおける慢性リンパ球性白血病の発生のために使用されている(Bichi, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6955-6960 (2002))、pBSVE6BK(pEμ)プラスミドのEcoRV及びSalI部位内にクローン化した。該構築物をBssHII及びPvuIで切断することにより単離された導入遺伝子を、妊娠FVB/N及びC57/B6マウスの受精卵母細胞の雄性前核内に注入した。Eμエンハンサー配列を標的にするように設計されたプローブを使用し、BamHIで消化した尾部抽出DNAに対して実施されたサザンブロット分析により、導入遺伝子の存在について子をスクリーニングした(図2A、2B)。トランスジェニック初代を同定し、同年齢の野生型マウスと繁殖させた。トランスジェニックヘミ接合性マウスが誕生し、研究され、そしてそれらの野生型対応マウスと比較された。尾部抽出DNAに対して実施されたPCRによりマウスの遺伝子型を同定した(データは示されていない)。
脾臓を二つのすりガラス間で解離させ、溶解物をリン酸緩衝食塩水(PBS)中で洗浄し、塩化アンモニウム(NH4Cl)による低浸透圧性溶解により赤血球を枯渇させ、遠心分離し、PBSに再懸濁した。全RNAをトリゾール試薬(GIBCO,Invitrogen )で抽出し、SDS/PAGEにロードし及び変性させ、Hybond N+膜(Amersham Pharmacia)にブロットした。該膜を、成熟mmu−miR155配列のアンチセンス含有γ−32P放射性プローブとハイブリダイズし、一晩インキュベートし、洗浄し、及びPhosphorImagerスクリーン(Molecular Dynamics)に暴露した。イメージはTyphoon イメージ処理システム(Amersham Biosciences)を使用して処理した(図3)。
B細胞発生の後期プロB細胞段階で活性になるmmu−miR155(マウスmiR155)の発現が、VHプロモーター−Ig重鎖Eμエンハンサーの制御下であるトランスジェニックマウスが作製された。C57BL/B6バックグラウンドで7匹(F1〜F7と命名された)、及びFVB/Nバックグラウンドで8匹(F8〜F15と命名された)、計15匹のトランスジェニック初代がサザンブロットハイブリダイゼーションにより同定された(図2A、2B)。これらの初代を同一系統の野生型マウスと繁殖させて、15の独立したトランスジェニック系統を作製した。
材料及び方法
体部測定
マウスを殺した後に秤量し、それらの脾臓を切り取り、計測し、及び秤量した。
マウスの後眼窩血管から血液を抜き、すりガラススライド上に塗抹してギムザで染色するか、又は遠心分離し、PBS中で洗浄し、塩化アンモニウムで処理した。細胞を細胞計数器チャンバーで計数した。
脾細胞又は骨髄細胞の単細胞懸濁液は低浸透圧性溶解(0.165M NH4Cl)により成熟赤血球を枯渇させ、以下の共役抗体で染色した:抗B220−PE、抗IgM−FITC、抗TCR−PE cy5、抗CD5−PE、及び抗CD43−FITC。全ての抗体はBD PharMingen から入手した。フローサイトメトリーは、Becton Dickinson FACSCalibur で実施し、データはMac ソフトウエアのためのBecton Dickinson FACS CONVERT 1.0 を使用して解析した。
脾臓、大腿、及び胸骨を剖検したマウスから単離し、10%ホルマリン緩衝液で固定し、パラフィン中に含ませ、4ミクロン切片に切断した。切片を、標準プロトコールに従ってヘマトキシリン/エオシンで染色した。脱ワックス工程のため切片を55℃で1時間加熱し、段階的なエタノール系列及び蒸留水を通して再水和し、PBSに浸し、そして次ぎに中37℃にて30分、0.1%トリプシン含有トリス緩衝液で処理した。内在性ペルオキシダーゼは10%正常血清でブロックした。CD43、B220及びVpreB1(CD179a)抗体(BD PharMingen)を一次抗体に使用した。二次抗体及びジアミノベンジジンは使用説明書に従って加えた。
トランスジェニックマウスの脾臓は、野生型マウスの脾臓と比較して肥大しており(図4A、4B)、脾臓重量/体重比は野生型マウスの比よりも3から4倍高かった(表1)。興味深いことに、該比は年齢であまり変化しなかった。
フローサイトメトリー、組織学的及び免疫組織化学的分析に基づき、B2201ow/CD19low/CD10low/IgM−/TCR−/CD43−と定義されたプレB細胞増殖がトランスジェニックマウスの脾臓及び骨髄中で起こり、そして3週齢ですでに検出可能であった。この増殖は、最後には、しばしば高悪性度B細胞悪性腫瘍と関係があることを特色とする、脾腫、骨髄置換及び著しいリンパ球減少症を生じる。この特徴付けと一致して、全てのトランスジェニックマウスは6月齢までに、全て健康であった野生型対照と比較して(11匹の内の11匹の野生型マウス)、高悪性度B細胞新生物を発生した(7匹の内の7匹のトランスジェニックマウス)。とりわけ、miR155を過剰発現しないトランスジェニックマウス系統も又正常であった。
材料及び方法
細胞遺伝学:
大腿骨髄をRPMI培地1640/20%FBSで洗い流し、5mlの1%ヘパリン含有RPMI培地1640/20%FBSに集めた。細胞を増殖させ、標準細胞学的技術を用いて染色体欠失、転座、逆位、及びメタフェーズの数を評価した。
プローブは、以下のオリゴヌクレオチドプライマ−を使用してマウスゲノムDNAのIg重鎖領域のJH4断片中の配列を増幅することにより設計した:フォワード、5’-TGAAGGATCTGCCAGAACTGAA-3’(配列番号3)及びリバース、5’-TGCAATGCTCAGAAAACTCCAT-3’(配列番号4)。
脾細胞の核型の細胞遺伝学的研究は、正常同腹子からの脾臓と比較し、トランスジェニックマウスからのからの脾臓における一貫した染色体異常を同定することに失敗した。しかしながら、いくつかのゲノム変化が時折観察された(図9;矢印参照)。これらの結果は、プレB細胞の拡大した集団は二倍体であり、及び細胞遺伝学的に準正常であることを示している。クローン性を検出するため、V(D)J転位を評価する多消化酵素を使用し、3から6週齢のマウスからの脾細胞DNAに対してサザンブロット分析を実施した。野生型マウスと比較し、トランスジェニックマウスにおいて転位したバンドの存在は検出されなかった(図10)、但し一匹のトランスジェニックマウスは、異なった制限酵素のそれぞれで実施されたサザンブロット上に一貫した転位バンドを有していた(データは示されていない)。これらのデータは、この年齢のマウスにおけるB細胞集団は、大部分、少なくとも6週齢まではポリクローナルであったことを示している。悪性腫瘍の大部分はモノクローナルであるので、この発見は、miR155が、癌で活性化されるシグナル伝達経路の下流標的である可能性を示唆している。
材料及び方法
RNA単離:
全RNA単離は、使用説明書に従ってトリゾール試薬(Invitrogen)で実施した。
RNA標識及びmiRNAマイクロアレイチップ上のハイブリダイゼーションは記載されているように(Liu, C.G., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9740-9744)実施した。簡単には、5μgの各サンプルからの全RNAは、5’ビオチン末端標識ランダムオクタマーオリゴヌクレオチドプライマ−を使用する逆転写によりビオチンで標識した。ビオチン標識化cDNAのハイブリダイゼーションを、245のヒト及び200のマウスmiRNA遺伝子を含む800のmiRNAプローブを含有するmiRNAマイクロアレイチップ(Ohio State University, Ver. 2.0)上で四重に実施した。ハイブリダイゼーションシグナルを、Axon スキャナー4000B(Axon Instruments, Union City, CA)を使用する、ビオチンへのストレプトアビジン−アレキサン(Alexa)647複合物の結合により検出した。画像はGENEPIX 6.0 ソフトウエア(Axon Instruments)により定量した。
45,000より多くの特徴付けられた遺伝子及び発現された配列タグのためのプローブセットを含有するGeneChip Mouse genom 430 2.0 アレイ(Affymetrix)を使用した。サンプル標識及びプロセシング、GeneChip ハイブリダイゼーション及びスキャニングはAffymetrix プロトコールに従って実施した。簡単には、二重鎖cDNAを、3’末端にT7 RNAポリメラーゼプロモーター部位(Genset, La Jolla, CA)を付加するSuperscript Choice System(Invitrogen)を使用して全RNAから合成した。ビオチン化cRNAをインビトロでcDNAから発生させ、BioArray T7 RNAポリメラーゼ標識キット(Enzo Diagnostics)を使用して増幅した。cRNAの精製後、RNeasyミニキット(Qiagen, Hilden, Germany)を使用し、20μgのcRNAを94℃で35分断片化した。およそ12.5μgの断片化cRNAは、ハイブリダイゼーション効率の内部対照として働かせるためのニシン精子DNA(0.1mg/ml;Promega)+細菌及びファージ対照(1.5pM BioB、5pM BioC、25pM BioD及び100pM Cre)、を含有する250μlのハイブリダイゼーション混合物で使用した。混合物の一定分量(200μl)を、GeneChip ハイブリダイゼーションオーブン640(Affymetrix)中、45℃で18時間、アレイにハイブリダイズさせた。各アレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリン(Invitrogen)で染色し、そしてGeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix)上、ビオチン化抗ストレプトアビジン抗体(Vector Laboratories)で増幅した。アレイをGeneArray G7スキャナー(Affymetrix)でスキャンし、画像及びシグナル強度を得た。
マイクロアレイ分析を、5匹のトランスジェニックマウス(miR155導入遺伝子を発現しない1匹のマウスを含む)の脾臓白血球、及び6匹の野生型同腹子対応動物の白血球から抽出した全RNAに対して実施した。該分析は、野生型同腹子対照マウスと比較し(データは示されていない)、miR155を過剰発現するトランスジェニックマウスはmiR155、miR194、miR224、miR217及びmiR151の発現が10〜20倍増加し(表3)、及びmiR146及びmiR138の発現は2〜3分の1に減少した。Affymetrix マイクロアレイチップを使用し、トランスジェニックマウスの同一群におけるmRNAの差次的発現を研究し、同腹子対照におけるmRNA発現と比較した。Affymetrix マイクロアレイデータの統計的解析は、miR155過剰発現マウスにおいて、200の増殖関連遺伝子が上方制御され、及び50の遺伝子が下方制御されていたことを示した(表3)。とりわけ、プレB細胞の増殖が行われる時に起こることが予期されるVpreBl mRNAが上方制御されていた。これらのデータは、フローサイトメトリー分析及び免疫組織化学からのデータを補完する。
Claims (23)
- トランスジェニック非ヒト動物であって、そのゲノムが該動物のB細胞中での発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物を含んでなり、前記転写調節配列が、配列番号1及び/又は配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるmiR155遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されている、
ここで、当該少なくとも一つの転写調節配列は、VHプロモーター及びIg重鎖Eμエンハンサーを含み、
そしてここで当該トランスジェニック動物はマウスである、前記トランスジェニック非ヒト動物。 - 該核酸が、配列番号1及び/又は配列番号2を含んでなるmiR155遺伝子産物をコードする、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該VHプロモーターがマウスに由来する、請求項1または2に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該Ig重鎖Eμエンハンサーがマウスに由来する、請求項1ないし3のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該動物が、適した対照と比較し、脾臓、骨髄又はその両方にB2201ow/CD191ow/CD101ow/IgM−/TCR−/CD43−リンパ球系細胞の拡大した集団を有する、請求項1ないし4のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該動物がリンパ球増殖性状態を示す、請求項1ないし5のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該リンパ球増殖性状態がB細胞悪性腫瘍である、請求項6に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該B細胞悪性腫瘍が白血病、リンパ腫又は新生物である、請求項7に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該リンパ球増殖性状態が前白血病の状態である、請求項6に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該動物がB2201ow/CD191ow/CD101ow/lgM−/TCR−/CD43−リンパ球系細胞の拡大した集団、腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症及びそれらの組み合わせを示す、請求項1ないし9のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該核酸構築物が、βグロビン遺伝子の3’UTR及びポリ(A)配列を含んでなる、請求項1ないし10のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 該B細胞悪性腫瘍が、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特徴を示す、請求項7に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- トランスジェニック非ヒト動物であって、そのゲノムが、配列番号1及び/又は配列番号2を含んでなるmiR155遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されている、VHプロモーター及びIg重鎖Eμエンハンサーを含んでなる核酸構築物を含んでなり、ここで当該トランスジェニック動物はマウスである、前記トランスジェニック非ヒト動物。
- 剤が対象のリンパ球増殖性状態に影響するかどうかを決定する方法であって:
a)そのゲノムが、配列番号1及び/又は配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなるmiR155遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結された、該動物のB細胞中での発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物、を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物に前記剤を投与すること;及び
b) 前記トランスジェニック動物に前記剤を投与した後、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び/又は徴候を、同一遺伝子型の対照動物と比較することを含んでなり、ここで該対照動物に前記剤は投与されておらず、
前記対照動物と比較し、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の前記一つ又はそれより多くの症状及び/又は徴候の、検出能及び/又は出現比における相違は、該剤が該リンパ球増殖性状態の影響していることを示す、
ここで、当該少なくとも一つの転写調節配列は、VHプロモーター及びIg重鎖Eμエンハンサーを含み、
そしてここで当該トランスジェニック動物はマウスである、前記方法。 - 対象のリンパ球増殖性状態を治療すること又は予防することにおいての剤の治療効力を試験する方法であって:
(a)前記剤を、そのゲノムが該動物のB細胞中での発現を方向付けることができる少なくとも一つの転写調節配列を含んでなる核酸構築物を含んでなる、トランスジェニック非ヒト動物に投与すること、ここで該転写調節配列は、配列番号1及び/又は配列番号2と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列含んでなるmiR155遺伝子産物をコードする核酸に機能可能なように連結されており;及び
(b)前記トランスジェニック動物に前記剤を投与した後、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の一つ又はそれより多くの症状及び/又は徴候を、同一遺伝子型の対照動物と比較することを含んでなり、ここで該対照動物に前記剤は投与されておらず、
もし前記剤が、前記対照動物と比較し、前記トランスジェニック動物における前記リンパ球増殖性状態の前記一つ又はそれより多くの症状及び/又は徴候を抑制する、予防する及び/又は軽減するならば、前記剤は対象におけるリンパ球増殖性状態を治療すること又は予防することにおいて治療効力を有していると考えられる、
ここで、当該少なくとも一つの転写調節配列は、VHプロモーター及びIg重鎖Eμエンハンサーを含み、
そしてここで当該トランスジェニック動物はマウスである、前記方法。 - 該転写調節配列がマウスに由来する、請求項14または15に記載の方法。
- 該核酸が、配列番号1及び/又は配列番号2のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項14ないし16のいずれか1項に記載の方法。
- 該リンパ球増殖性状態がB細胞悪性腫瘍である、請求項14ないし17のいずれか1項に記載の方法。
- 該B細胞悪性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、B細胞新生物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 該B細胞悪性腫瘍が、ヒト急性リンパ芽球性白血病、ヒトリンパ芽球性リンパ腫又はそれらの組み合わせの特徴を示す、請求項18に記載の方法。
- 該リンパ球増殖性状態が前白血病状態である、請求項14ないし17のいずれか1項に記載の方法。
- 該前白血病の状態がプレB細胞増殖により特徴付けられる、請求項21に記載の方法。
- 前記リンパ球増殖性状態の該一つ又はそれより多くの症状及び/又は徴候が、B2201ow/CD191ow/CD101ow/IgM−/TCR−/CD43−リンパ球系細胞の拡大した集団、腹部腫脹、脾腫、骨髄置換、リンパ球減少症及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項14ないし22のいずれか1項に記載の方法。
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