JP2009511482A - Wwox遺伝子、同じものを含むベクター、および癌の治療における使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することによる、対象における癌の診断、予後および治療のための新規な方法および組成物を提供する。
Description
政府援助
本発明は、NCI/NIH Grant/Contract Number CA78890,CA77738およびCA56036のグラントによって、すべてまたは一部が援助された。米政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、NCI/NIH Grant/Contract Number CA78890,CA77738およびCA56036のグラントによって、すべてまたは一部が援助された。米政府は本発明に一定の権利を有する。
技術分野
本発明は一般に、癌において、とりわけ肺癌において見いだされた異常な細胞増殖を含むが、それらに限定されないそのような細胞増殖を制御するための組成物および方法に関する。
本発明は一般に、癌において、とりわけ肺癌において見いだされた異常な細胞増殖を含むが、それらに限定されないそのような細胞増殖を制御するための組成物および方法に関する。
発明の背景
肺癌は米国における主要な癌死亡の原因であり(1)、米国では年間約170,000例の新規な症例が発生し(1)、死亡率は非常に高い。非小細胞肺癌(NSCLC)は肺癌の約80%を占める。外科手術が依然として主要なNSCLCの治療であるが、患者の大部分は治癒切除を受けることができない。新規な薬物および治療計画にもかかわらず、肺癌患者の予後はここ10年間、顕著に変化していない。組換えウイルス遺伝子治療が肺癌患者において研究されてきた;野生型p53をコードするアデノウイルス(Ad)およびレトロウイルスが肺癌治験において腫瘍内に注入されてきた(2〜6)。肺癌第I相研究における組換えAd注入(7)は安全性および実行可能性を証明していて、組換えAdによる遺伝子治療の毒性および有効性を評価するために、第I/II相治験が現在患者を動員している。
肺癌は米国における主要な癌死亡の原因であり(1)、米国では年間約170,000例の新規な症例が発生し(1)、死亡率は非常に高い。非小細胞肺癌(NSCLC)は肺癌の約80%を占める。外科手術が依然として主要なNSCLCの治療であるが、患者の大部分は治癒切除を受けることができない。新規な薬物および治療計画にもかかわらず、肺癌患者の予後はここ10年間、顕著に変化していない。組換えウイルス遺伝子治療が肺癌患者において研究されてきた;野生型p53をコードするアデノウイルス(Ad)およびレトロウイルスが肺癌治験において腫瘍内に注入されてきた(2〜6)。肺癌第I相研究における組換えAd注入(7)は安全性および実行可能性を証明していて、組換えAdによる遺伝子治療の毒性および有効性を評価するために、第I/II相治験が現在患者を動員している。
肺癌は脆弱部位(fragile site)FRA3B(9)でのFHIT(fragile histidine triad)遺伝子(8)の初期の発現損失に関連している。脆弱領域はとりわけ環境発癌性物質への暴露により損傷を受けやすく、それが肺癌における病因である。最近、Yendamuri et al.(10)は、WWOX(オキシドレダクターゼを含むWWドメイン)遺伝子も非小細胞肺癌の一部において変化していることを証明している。WWOXは脆弱部位FRA16D(11)に位置し、2つのWWドメインと短鎖デヒドロゲナーゼドメインを持つ414‐aaタンパク質をコードする。WWドメインはタンパク質‐タンパク質相互作用ドメインであり、通常の上皮細胞において重要なシグナリングの役割を果たすWwox相互作用子が確認されている。Wwoxはp73と相互作用し、細胞質への核p73の再分布を引き起こし、その転写活性を抑制することができる(12)。Wwoxは、細胞増殖における役割を持つAp2‐γ転写因子とも相互作用する(13)。きわめて最近、Wwoxは転写活性化因子である細胞内ErbB4ドメインへの結合に関してYapタンパク質と競合することが報告されている(14)。したがって、Wwox経路は、癌治療標的としても使える可能性があるいくつかの下流シグナリングタンパク質を含む。
WWOX遺伝子は、乳房、卵巣、前立腺、膀胱、食道、および膵臓を含む多くの型の癌において変化している(15〜19)。非小細胞肺癌において、WWOXエキソンを持たない転写物が腫瘍の26%、そして8個のうち5個の細胞株で検出された(10)。WWOX対立遺伝子の損失は腫瘍の37%で発生し、プロモーターは偏平細胞肺癌の62.5%において高度にメチル化されている(10、19)。肺癌における腫瘍抑制を研究するために、我々はWWOX遺伝子を運ぶAdによる感染により、Wwox‐ネガティブ(A549、H460、およびH1299)および‐ポジティブ肺癌細胞(U2020)におけるWwoxタンパク質発現のin vitroおよびin vivoでの効果を検討した;H1299細胞も誘導性Wwox発現ベクターにより安定にトランスフェクションされ、それが生理的レベルに近いレベルのタンパク質の誘導を可能にする。Wwox回復はWwoxタンパク質を構成的に発現する肺癌細胞に対して効果を示さずに、効果的にin vitroでのアポトーシスを誘導し、ヌードマウスにおける肺癌腫瘍形成性を抑制した。
発明の概要
本発明は、機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象において癌を治療するための方法を提供する。ある態様では、癌は肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、および膵臓癌から選択される。ある態様では、投与は遺伝子治療を含み、そしてある態様では組換えアデノウイルス遺伝子治療のような、組換えウイルス遺伝子治療を含む。
本発明は、機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象において癌を治療するための方法を提供する。ある態様では、癌は肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、および膵臓癌から選択される。ある態様では、投与は遺伝子治療を含み、そしてある態様では組換えアデノウイルス遺伝子治療のような、組換えウイルス遺伝子治療を含む。
本発明はさらに、対象の少なくとも1つの癌細胞においてWwox発現を誘導することを含む、対象において癌を治療する方法を提供する。本発明はまた、癌細胞株においてWwoxの発現を誘導することを含む、該細胞株において細胞増殖阻止を誘導する方法を提供する。ある態様では、癌細胞または癌細胞株は肺癌である。
本発明はまた、機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド;および機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含む、ポリヌクレオチドを提供する。ある態様では、ポリヌクレオチドの2つの末端が連結され、その結果環状ポリヌクレオチドになる。
本発明はまた、WWOX遺伝子産物発現カセットを含むベクターを提供し、該カセットは機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド;および機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含む。ある態様では、ベクターはウイルスベクターであり、そしてある態様ではウイルスベクターは組換えアデノウイルスベクターである。本発明はまた、本発明に記載のウイルスベクターを含む細胞を提供する。細胞は肺細胞、とりわけ、肺癌細胞であってもよい。
本発明はまた、対象において癌を治療するための医薬組成物を提供し、該医薬組成物はウイルスベクターおよび薬剤的に受容できる賦形剤を含み、該ベクターはWWOX遺伝子産物発現カセットを含み、該カセットは機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドおよび機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含む。ウイルスベクターは、たとえば、組換えアデノウイルスベクターであってもよい。ある態様では、組成物は吸入のために製剤される。
本発明はさらにその上、機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド;および機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含むプラスミドを提供する。本発明はまた、本発明に記載のプラスミドを含む細胞を提供する。
本発明はまた、WWOX遺伝子を再活性化することが可能な治療用化合物を対象に投与することを含む、対象において癌を治療する方法を含む。ある態様では、対象はヒトである。ある態様では、WWOX遺伝子の再活性化が結果としてアポトーシスを誘導する。
本発明の付加的な特徴および利点は、一部は後に続く説明において示され、そして一部は説明から明らかであり、あるいは本発明の実施によって知ってもよい。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲においてとりわけ指摘される要素および組み合わせによって実現され、獲得されることになる。
請求されたように、先の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも代表的で、解説的なものでしかなく、本発明を制限するものではないことを理解すべきである。
本発明の種々の目的および利点は、添付の図面の観点から解釈される場合、以下の好ましい態様の詳細な説明から当業者には明白になる。
本発明の種々の目的および利点は、添付の図面の観点から解釈される場合、以下の好ましい態様の詳細な説明から当業者には明白になる。
好ましい態様の詳細な説明
細胞培養。American Type Culture Collectionから得たWwox‐ネガティブA549、H460、およびH1299ならびにWwox‐ポジティブU2020肺癌細胞株は10%FBSを含むRPMI培地1640中で維持した。Qbiogene(Carlsbad,CA)から得たHEK‐293CymR細胞は10%FBSを含むDMEM中で培養した。H1299細胞はp53を発現しないが、A549およびH460は野生型p53を発現する(20)。
細胞培養。American Type Culture Collectionから得たWwox‐ネガティブA549、H460、およびH1299ならびにWwox‐ポジティブU2020肺癌細胞株は10%FBSを含むRPMI培地1640中で維持した。Qbiogene(Carlsbad,CA)から得たHEK‐293CymR細胞は10%FBSを含むDMEM中で培養した。H1299細胞はp53を発現しないが、A549およびH460は野生型p53を発現する(20)。
組換えAdおよびin vitro形質導入。正常ヒト肝臓RNA由来のWWOXcDNA(Ambion,Austin,TX)はSuperScript First−Strand Synthesis(Invitrogen)により逆転写された。2本鎖cDNAは以下の条件を使用して、PCR増幅により作製された:95℃を3分間、94℃30秒間および65℃60秒間および72℃30秒間を30サイクル、ならびに72℃を7分間;WWOXフォワード5′‐GCCAGGTGCCTCCACAGTCAGCC‐3′およびWWOXリバース5′‐TGTGTGTGCCCATCCGCTCTGAGCTCCAC‐3′プライマーが使用された。cDNAはAdenovator−CMV5(CuO)−IRES−GFPトランスファーベクター(Qbiogene)にクローニングされた(11)。このベクターはクメート(cumate)‐誘導性CMV5(CuO)プロモーターにより駆動されるトランスジーン発現を可能にする。内部リボソームエントリー部位配列はGFPの同時発現を確実にする。組換えプラスミドAd−WWOXは、構成的にCymRタンパク質を発現する、改変されたヒト胎児腎臓HEK−293 CymR細胞(Qbiogene)にトランスフェクトされ、それはWWOX Adのパッケージングおよび増殖中に、CMV5(CuO)プロモーターおよびWwox発現を抑制する。14〜21日後に、相同組換えが細胞で起こり、プラーク形成を導いた。プラークは単離され、ウイルスはHEK−293CymR細胞中で増幅され、CsClグラジエント遠心分離によって精製された。力価は吸光度測定(1ml毎のウイルス粒子の数)およびプラークアッセイ(プラーク‐形成units/ml)により測定され、トランスジーン発現はWwoxモノクローナル抗体を使用したイムノブロットにより評価された(21)。細胞は次第に感染多重度(mois)(細胞毎のウイルス粒子の数)を増加させて組換えAdにより形質導入され、形質導入効率はGFP‐発現細胞の可視化により測定された。
誘導性WWOXトランスフェクタント。ヒトWWOXcDNAはpINDベクターのBamHIおよびEcoRI部位にクローニングされた。H1299細胞はエクジソン核受容体サブユニットを含む10μgのpVgRXRベクターによりトランスフェクトされ、クローンが選抜され、レポータープラスミドによる一過性トランスフェクションによるポナステロンA(ponA)‐誘導性発現に関して試験された。最も高い発現を示すクローンは10μgのpIND−WWOXベクターによりトランスフェクトされ、ゼオシン(150μg/ml)およびG418(1,200μg/ml)中で培養された。H1299/Iクローンは選抜され、ponA(5〜10μM)処理後に誘導性WWOX発現に関して試験された。
ウェスタンブロット解析。タンパク質抽出およびイムノブロット解析は参考文献13に記載のように行った。以下の一次抗血清が使用された:マウスモノクローナル抗‐Wwox、1:500;ウサギポリクローナル抗‐カスパーゼ3、1:1,000(Cell Signaling Technology,Beverly,MA);ウサギポリクローナル抗‐カスパーゼ9、1:200(Santa Cruz Biotechnology);マウスモノクローナル抗‐カスパーゼ8(Cell Signaling Technology);ウサギポリクローナル抗‐PARP[ポリ(ADP‐リボース)ポリメラーゼ]、1:1,000(Cell Signaling Technology);およびウサギポリクローナル抗‐β‐アクチン、1:1,000(Cell Signaling Technology)。
細胞増殖および細胞周期速度論。細胞(2x105)はmois10、25、50、75、および100で感染され、24時間間隔で採取され、トリパンブルーで染色され、計数された(ViCell counter,Beckman Coulter)。フローサイトメトリーの場合、細胞は感染後5日目に採取され、冷メタノールで固定され、RNアーゼ処理され、プロピジウムヨージド(50μg/ml)で染色された。細胞はダブレットディスクリミネーティングゲーティング(doublet discriminating gating)を使用することによるEPICS−XLスキャン(Beckman Coulter)によってDNA内容物が分析された。すべての分析はデュプリケートで行われた。
in vivo研究。動物研究は研究所のガイドラインに従って行われた。H460、A549、およびU2020細胞はin vitroでAd−WWOX(moi=100)もしくはAd−GFPに感染されるか、または偽感染された。感染24時間後、感染または対照細胞株ごとに5匹の、6週齢の雌ヌードマウス(Charles River Breeding Laboratories)の左脇腹に、5x106の生存細胞がs.c.注射された。H1299細胞はin vitroにおいて、moi100でAd‐GFPまたはAd‐WWOXに感染された。H1299/I細胞は10μMponAで処理され(H1299/I+細胞)、Wwox発現を誘導した。腫瘍形成性対照は非誘導細胞(H1299/I−)であった。誘導(H1299/I、ponA処理後24時間)および非誘導(107)細胞は5匹のヌードマウスに注射され;5匹のマウスはまた、Ad−WWOX、Ad−GFP、および偽感染H1299細胞を注射された。腫瘍直径は5日ごとに測定され、腫瘍は剖検後に重量を測定された。腫瘍容積は方程式V(mm3)=axb2/2を使用することにより計算され、式中aは最大直径であり、bは直角に交わる直径である。
ex vivo研究。H1299、H1299/I−、およびH1299/I+を注射されたマウスの腫瘍由来のタンパク質溶解産物は、イムノブロット解析によりWwox発現を評価された。H1299/I+腫瘍由来のフラグメントは培養され、2日間10μMのponAで処理され、イムノブロットにより誘導性Wwox発現を検出された。
統計解析。in vitroおよびin vivo実験の結果は平均値±SDとして表わされた。Studentの両側t検定を使用して試験および対照試料の値を比較した。P<0.05は有意な差を示した。
親の、およびAd‐WWOX‐感染肺癌細胞におけるWwox発現。肺癌細胞株のタンパク質のイムノブロット解析は、A549、H460およびH1299細胞は内因性Wwoxを発現しないが、WwoxはU2020細胞において検出されることを示した。乳癌MCF‐7細胞は豊富な内因性Wwoxを発現し(18)、陽性対象として使用された(図1A)。
肺癌細胞はmoi100でAd‐WWOXまたはAd‐GFPに感染され;アデノウイルストランスジーンは、GFP蛍光の共焦点顕微鏡観察による評価のように、それぞれの細胞株の細胞のほぼ100%で発現された(データは示さない)。感染後72時間でのイムノブロット解析はすべてのAd‐WWOX‐形質導入細胞におけるWwox過剰発現を示した(図1B)。
感染細胞の細胞周期速度論。Wwox過剰発現により誘導された細胞周期変更は、いくつかのmoiでのAd‐WWOXまたはAd‐GFPによる感染後に評価された。内因性Wwoxを発現しないA549、H460およびH1299細胞では、Ad‐WWOX感染後にサブ‐G1集団が観察されたが、内因性Wwox‐陽性U2020細胞では観察されなかった。Ad‐GFP感染は細胞周期特性を改変しなかった。Ad‐WWOX感染(moi=100)後96時間で、58%のA549、94%のH460、および17%のH1299細胞がサブ‐G1部分にあり;7%のU2020細胞はサブ‐G1部分にあった(図2)。細胞死のWwox誘導はmoi‐および時間‐依存的であった(データは示さない)。
Wwox‐再発現細胞におけるアポトーシス経路。A549、H460、H1299、およびU2020肺癌細胞株は次第にmoiを増加させて感染され、形質導入された細胞の割合は共焦点顕微鏡観察および細胞周期速度論解析によりモニターされた。内因性Wwoxを欠如する肺癌細胞株(A549、H460、およびH1299)では、ある範囲のmoiで、Ad‐WWOXおよびAd‐GFP感染に対する細胞増殖に有意な差が観察された(図3A)。U2020細胞は内因性Wwox発現によって影響を受けなかった。
Wwox‐誘導アポトーシス経路を研究するために、下流のアポトーシスエフェクターの発現がin vitroで評価された。感染後96時間で、プロ‐カスパーゼ3および全長PARP‐1レベルが、Ad‐GFP対照細胞に比較して、Ad‐WWOX‐感染A549およびH460細胞において低下した。H1299細胞では、全長PARP‐1の減少が観察された。前駆体の切断は感染したU2020細胞では観察されなかった(図3B)。
H1299細胞における条件的Wwox発現の影響。H1299/Iクローン7はponAにより誘導された時だけWWOXトランスジーンを発現し(図4A)、その後の実験で使用された。Wwox発現はponA処理後用量‐依存的様式で(図4B)、24から27時間まで増加した(図4C)。
クローン7H1299/I−(非誘導)細胞は平板培養され、24時間後(1日目)にWwox発現が10μMponAにより誘導された。最大発現は4日目に観察され、5日目までには細胞増殖は有意に影響を受け(図4D)、細胞数の低下を引き起こし、WwoxがH1299細胞の増殖を阻止することを暗示した。
Ad‐WWOX‐感染肺癌細胞株の腫瘍形成性。ヌードマウスはin vitroでmoi100のAd‐GFPまたはAd‐WWOXに感染し、24時間培養された、5x106のA549、H460、およびU2020細胞を接種された。非感染細胞は腫瘍形成性対照として使用された。注射後28日目に、腫瘍増殖はAd‐WWOX‐感染H460細胞を接種されたマウスにおいて完全に抑制された(図5A)。28日目における対照(Ad‐GFPおよび非処理H460細胞)の平均腫瘍重量はそれぞれ0.61±0.15および0.64±0.11gであった。28日目において、Ad‐WWOX‐感染A549細胞を接種されたマウス5匹のうち2匹は全く腫瘍を示さず、平均腫瘍重量は0.08±0.03gであり、Ad‐GFP‐感染A549(0.81±0.16g)および偽感染A549(0.86±0.15g)細胞の腫瘍より有意(P<0.001)に低かった(表1)。感染したU2020細胞を注射されたマウスでは、腫瘍増殖抑制は全く観察されなかった(図5A)。
腫瘍形成性に関する誘導されたWwox発現の効果。我々は次にAd‐WWOXに感染した、またはponAによりWwoxを発現するように誘導されたH1299細胞の腫瘍形成性を比較した。ヌードマウスはAd‐WWOXまたはAd‐GFPによる感染後24時間目に1x107細胞を接種された。5匹のマウスもponA処理後24時間目に、1x107の非誘導H1299/I(H1299/I−)および107のH1299/I+細胞を接種された。注射後28日目に、Ad‐WWOX‐感染H1299細胞およびH1299/I+細胞を接種された5匹のうち3匹および5匹のうち4匹のマウスは腫瘍を全く提示しなかった(図5B)。Ad‐WWOX‐感染(0.10±0.26g)およびH1299/I+(0.21±0.31g)細胞由来の腫瘍の平均重量はAd‐GFP(1.66±0.28g)、H1299/I−(1.98±0.41g)、および親H1299(1.87±1.33g)細胞由来の腫瘍と比較して有意に低下した(図7‐表1)。したがってウイルス感染によって送達された(Ad‐WWOX)または不活性な“内因性”WWOX遺伝子の発現の誘導によるWwox発現(H1299/I+)は、ヌードマウスにおける肺癌細胞増殖を抑制することにおいて効果的であった。
H1299/I+を外植された腫瘍におけるWwox発現。ex vivoにおけるWwox発現を評価するために、我々は親H1299、H1299/I−、およびH1299/I+腫瘍に由来するフラグメントから抽出されたタンパク質のイムノブロット解析を行った;Wwox発現はいずれの腫瘍からも見いだされなかった(図6A)。外植され、培養されたH1299/I+腫瘍のフラグメントはponAで処理し、イムノブロット解析によりWwox発現を試験することにより、誘導性WWOXプラスミドの保持を検討された。H1299/I+外植片におけるWwox誘導の検出は、WWOXプラスミドが存在し、誘導性であることを明らかにし(図6B)、小型腫瘍が、in vivoでインデューサー欠如のためにWwox発現を損失している接種された細胞から得られたことを暗示した。
考察
革新的な治療的方策が肺癌治療にとって緊急に必要である。一般的な脆弱部位における遺伝子は新生物形成過程の初期に、とりわけ環境発現物質への暴露により、しばしば不活性化されるため、我々は癌の発生における脆弱遺伝子発現損失の効果、およびそれらの回復の治療的効果に関心をもってきた(22)。いくつかの研究は、脆弱WWOX遺伝子発現は肺癌の顕著な割合において(10、16)、とりわけプロモーターの高度メチル化によって(16)不活性化されることを暗示している。高度メチル化は可逆的であり、癌治療にとって有望な方策である。したがって、我々は内因性Wwoxの発現を欠く肺癌細胞におけるWwox発現の回復が、肺癌細胞株に蓄積されている非常に多くの癌に関連した遺伝的変更にもかかわらず、悪性を無効にすることになるかどうかを確認してきた。我々はAd‐WWOXによる感染によって4種の肺癌細胞株におけるWwox発現を回復させ、内因性Wwoxを欠く肺癌細胞の、非常に劇的な腫瘍形成性損失を観察している。
革新的な治療的方策が肺癌治療にとって緊急に必要である。一般的な脆弱部位における遺伝子は新生物形成過程の初期に、とりわけ環境発現物質への暴露により、しばしば不活性化されるため、我々は癌の発生における脆弱遺伝子発現損失の効果、およびそれらの回復の治療的効果に関心をもってきた(22)。いくつかの研究は、脆弱WWOX遺伝子発現は肺癌の顕著な割合において(10、16)、とりわけプロモーターの高度メチル化によって(16)不活性化されることを暗示している。高度メチル化は可逆的であり、癌治療にとって有望な方策である。したがって、我々は内因性Wwoxの発現を欠く肺癌細胞におけるWwox発現の回復が、肺癌細胞株に蓄積されている非常に多くの癌に関連した遺伝的変更にもかかわらず、悪性を無効にすることになるかどうかを確認してきた。我々はAd‐WWOXによる感染によって4種の肺癌細胞株におけるWwox発現を回復させ、内因性Wwoxを欠く肺癌細胞の、非常に劇的な腫瘍形成性損失を観察している。
3種のWwox‐ネガティブ細胞株におけるWWOX遺伝子の導入は、サブ‐G1DNA内容物を持つ細胞の割合によって、および培養における細胞増殖の抑制によって示されるように、結果としてin vitroでのアポトーシスを誘導した。サブ‐G1DNA内容物を持つWWOX‐感染H1299細胞の割合は、おそらくH1299細胞におけるWwox発現の回復後しばらくしてアポトーシスが起こる可能性があるため、他の2種のWWOX‐ネガティブ細胞株より低かった;別の可能性は、腫瘍抑制効果は3種の肺癌細胞株において同様であるが、A549およびH460細胞におけるp53の発現が、Wwoxタンパク質の発現とともに付加的な効果を示したということである。内因性Wwoxを発現するU2020肺癌細胞はWwoxの過剰発現によって影響を受けず、正常なWwox‐発現肺細胞はWWOX遺伝子治療後のWwox過剰発現によって影響を受けないことを暗示した。in vitroにおける3種すべての肺癌細胞の増殖は、Wwox過剰発現の数日後の細胞数の下降によって示されるように、ウイルス感染またはponA誘導後のWwox過剰発現によって不都合に影響を受けた。
我々は、3種のWWOX‐ネガティブ肺癌細胞株におけるAd‐WWOX形質導入による、および安定にトランスフェクションされたH1299肺癌細胞におけるWwox発現の誘導による、肺癌細胞株のin vivo腫瘍形成性の効率的な抑制を観察した。攻撃的なH460細胞株の腫瘍形成性はAd‐WWOX処理により、注射後28日目に完全に抑制された。腫瘍の発生およびサイズにおける有意な低下が、WWOX‐形質導入A549およびH1299細胞を注射された動物において観察された。結果は、Wwoxの損失が肺癌の病因に重要な役割を果たす可能性があることを暗示する。おそらく、in vivo微小環境がともかくもWwoxアポトーシス経路を活性化するため、H1299細胞における両方のWwox回復の方法がin vitroよりin vivoにおいて、結果としていっそう劇的な効果になるように見えることは興味深い。
この研究は、WWOXが細胞増殖阻止およびアポトーシスを肺癌細胞に誘導することを証明する。A549およびH460細胞株において、我々は固有の経路によるカスパーゼ‐依存的なアポトーシスの誘導を観察した。H1299細胞では、我々は全長PARP‐1の切断を観察したが、おそらくこれらの細胞においてアポトーシスが後になって起こるためにプロカスパーゼ3、9、および8は切断されなかった。WwoxおよびFhitタンパク質発現は、プロモーター高度メチル化に関連して肺、乳房、および膀胱癌においてしばしば低下する(16)。エピジェネティックな変更は特定の薬剤または阻害剤によって無効にすることができ、治療薬のような阻害剤を暗示する(23〜26)。WwoxのponA‐誘導性発現は、エピジェネティックな機序によるサイレンシング後のWWOX再活性化の効果のモデルと見なされうる。誘導性Wwox発現を回復後の腫瘍形成性損失の程度は、in vitroおよびin vivoの両方におけるAd‐WWOX発現後に観察される腫瘍抑制に匹敵し、Wwoxの甚だしい過剰発現は腫瘍抑制をもたらすために必ずしも必要でないことを暗示した。この発見は、エピジェネティックにサイレンシングされたWWOX遺伝子を再活性化可能な薬物が肺癌の治療に効果的でありうることを暗示する。
肺癌細胞におけるWwoxタンパク質発現の回復後に、in vitroでのアポトーシスの誘導およびin vivoでの腫瘍形成性の抑制が起こり、Wwoxシグナル経路の再活性化が肺癌予防および治療の潜在的な標的であることを暗示する。
特許法の条項に従って、本発明の原則および実施様式は好ましい態様において説明され、例示されている。しかし、本発明はその意図および範囲から逸脱せずに、明確に説明され、例示されたものと異なって実行されてもよいことは理解されるべきである。
参考文献
先に論じた参考文献および以下の参考文献は、それらが本明細書に述べたものに対する代表的な手続き上の、または他の補足的な細目を提供する程度に、明確に参照として本明細書に援用される。
先に論じた参考文献および以下の参考文献は、それらが本明細書に述べたものに対する代表的な手続き上の、または他の補足的な細目を提供する程度に、明確に参照として本明細書に援用される。
Claims (28)
- 機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、対象において癌を治療するための方法。
- 癌が肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、および膵臓癌から選択される、請求項1に記載の方法。
- 癌が肺癌である、請求項2に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項1に記載の方法。
- 投与が遺伝子治療を含む、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子治療が組換えウイルス遺伝子治療を含む、請求項5に記載の方法。
- 組換えウイルス遺伝子治療が組換えアデノウイルス遺伝子治療を含む、請求項6に記載の方法。
- 対象の少なくとも1つの癌細胞においてWwox発現を誘導することを含む、対象において癌を治療する方法。
- 癌細胞株においてWWOXの発現を誘導することを含む、該細胞株における細胞増殖阻止を誘導する方法。
- 癌細胞株が肺癌である、請求項9に記載の方法。
- 機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド;および機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含むポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドの2つの末端が連結され、その結果環状ポリヌクレオチドを生じる、請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- 機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド;および機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含むWWOX遺伝子産物発現カセットを含むベクター。
- ベクターがウイルスベクターである、請求項13に記載のベクター。
- ウイルスベクターが組換えアデノウイルスベクターである、請求項14に記載のベクター。
- 請求項14に記載のウイルスベクターを含む細胞。
- 細胞が肺細胞である、請求項16に記載の細胞。
- 肺細胞が肺癌細胞である、請求項17に記載の細胞。
- ウイルスベクターおよび薬剤的に受容できる賦形剤を含む、対象において癌を治療するための医薬組成物であって、該ベクターはWWOX遺伝子産物発現カセットを含み、該カセットは機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドおよび機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含む、医薬組成物。
- ウイルスベクターが組換えアデノウイルスベクターである、請求項19に記載の医薬組成物。
- 組成物が吸入のために製剤される、請求項19に記載の医薬組成物。
- 機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド;および機能性WWOX遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した非相同プロモーターを含むプラスミド。
- 請求項22に記載のプラスミドを含む細胞。
- WWOX遺伝子を再活性化することが可能な治療用化合物を対象に投与することを含む、対象において癌を治療する方法。
- 対象がヒトである、請求項24に記載の方法。
- WWOX遺伝子の再活性化が結果としてアポトーシスを誘導する、請求項24に記載の方法。
- 内因性Wwoxの発現を欠如する肺癌細胞におけるWwox発現を回復し、それによって悪性を無効にすることを含む、癌治療の方法。
- 肺癌細胞においてWWOX細胞増殖阻止およびアポトーシスを誘導するための方法。
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