CN102120038A - 一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因治疗药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因治疗药物，该基因药物载体质粒的转基因表达框的3’-UTR区含有miR-155的结合序列，其碱基序列为CCCCTATCACAATTAGCATTAA；及其制备方法。本发明从解决目前尚无办法的由rAAV载体的转基因产物引起的细胞免疫反应为目标，采用MicroRNA靶向沉默特定细胞内的转基因表达的技术方法，该载体不仅能有效地在体内表达转基因，并且能抑制由rAAV载体的转基因产物引起的细胞免疫反应，为基于rAAV载体的基因药物的安全性提供了保障。
Description
技术领域
本发明涉及分子药物学、分子医学和疾病防治领域，具体涉及基于重组腺相关病毒(rAAV，)基因治疗药物，尤其是一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因治疗药物及其制备方法，该药物可有效抑制由于转基因产物导致的免疫反应的产生。
背景技术
基因治疗为治疗单基因缺陷引起的疾病提供了一个似乎完美的解决方案，但始于1990年的基因治疗临床研究一直面临各种技术挑战和重重困难，其中包括一位受试者在临床试验中死亡。随着几种重大疾病基因治疗的成功，基因治疗取得了重大突破，因而被Science杂志评为2009年十大科学进展之一[Alberts B.Science，2009，326(5960)：p1589]。成功的案例就包括应用重组腺相关病毒(rAAV)基因药物成功治愈Leber’s先天性黑内障的临床研究结果。
长期以来，大家一致认为rAAV基因药物具有无致病性、低免疫原性、能介导外源基因长期表达和宿主范围广泛等优点，是最有发展前景的基因治疗载体。在小鼠、大鼠、狗和非人灵长类动物体内进行的大量rAAV基因药物的临床前研究也从未发现由淋巴细胞介导的适应性免疫反应。但由美国宾州大学High教授主持进行的治疗血友病的I/II期临床研究却发生了严重的细胞免疫反应，病人转氨酶水平急剧升高，肝功能受到严重损害，该临床研究被迫终止[Manno CS，et al.Nat Med，2006，12：p342-347.]。该研究结果再次敲响了安全性的警钟。rAAV基因药物在人体内诱发的细胞免疫反应，很有可能就此终结其临床应用的可能性。
抗原在细胞内的加工递呈一般按照经典途径进行：内源性蛋白被加工为抗原肽后荷肽于MHC-I类分子，以pMHC-I的形式转运并递呈至细胞表面，即MHC-I类途径；外源性输入蛋白的抗原肽则荷肽于MHC-II类分子，即MHC-II类途径。非经典途径也称为交叉递呈途径，即外源性抗原通过MHC-I类分子递呈，而内源性抗原通过MHCI-II分子递呈，一般认为该途径的应用较为罕见，且主要发生在树突细胞(DC)。在构建rAAV基因药物时，已经剔除了与其衣壳蛋白编码和加工有关的所有病毒基因，rAAV在靶细胞内仅表达转基因，不应当再表达衣壳蛋白，所以按照经典途径难以解释AAV衣壳蛋白抗原的递呈。Mingozzi等认为在人体内，任何有核细胞均可通过非经典递呈途径处理外源性蛋白并递呈至细胞表面，然后激活记忆性T细胞[Mingozzi F，et al.Nat Med，2007，13：p 419-422.]。Pien等采用可溶性T细胞受体(TCR)多聚体技术，首次观察到在肝细胞表面递呈的rAAV衣壳蛋白pMHC-I，为外源性输入rAAV抗原的交叉递呈提供了直接的证据[Pien GC，et al.J Clin Invest，2009，119：p1688-1695.]。但在小鼠体内进行的实验表明经转基因手段内源性表达AAV衣壳蛋白的肝细胞可以激活CTL并被裂解，而外源性输入的rAAV衣壳蛋白虽可能以交叉递呈途径激活CTL，但不足以引起细胞的裂解，说明即使存在非经典途径递呈抗原，其加工和递呈抗原肽的效率也明显低于经典途径。
如何避免rAAV基因药物在临床应用中可能发生的免疫毒性，成为研究人员奋斗的目标。目前提出的解决方案包括免疫调节、载体优化和提高药物纯度等几个方面[刁勇等.药学学报，2010.45(9)：p1071-1077]。许瑞安等曾发明了一种用于基因治疗rAAV载体，可以在肝和造血细胞特异性抑制病毒衣壳蛋白复制，从而抑制AAV病毒衣壳蛋白引起的细胞免疫毒性[许瑞安等.一种用于基因治疗的新型细胞特异性内含microRNA结合序列的基因HAAVmir.200910136134.5]。但rAAV载体转导靶细胞后由转基因产物引起的细胞免疫反应仍没有可行的解决方案。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因治疗药物及其制备方法。本发明从解决目前尚无办法的由rAAV载体的转基因产物引起的细胞免疫反应为目标，采用MicroRNA靶向沉默特定细胞内的转基因表达的技术方法，该载体不仅能有效地在体内表达转基因，并且能抑制由rAAV载体的转基因产物引起的细胞免疫反应，为基于rAAV载体的基因药物的安全性提供了保障。
为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因治疗药物，该基因药物载体质粒的转基因表达框的3′-UTR区含有miR-155的结合序列，其碱基序列为CCCCTATCACAATTAGCATTAA。
所述载体质粒的转基因表达框的3’-UTR区含有2-8个串联的miR-155的结合序列。
所述的基因药物载体质粒的转基因表达框的3′-UTR区含有miR-155的结合序列，其碱基序列为AGCATTAA。
所述载体质粒的转基因表达框的3’-UTR区含有2-8个串联的miR-155的结合序列。
一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因药物的制备方法，采用无辅助病毒的多质粒共转染法制备，即采用磷酸钙法将载体质粒与辅助质粒(如H22，pXX6)共转染293细胞，60-72小时后收获重组病毒，经纯化后备用。所述的辅助质粒采用AAV辅助质粒(H22)和腺病毒辅助质粒(pXX6)购自华侨大学分子药物学研究所或美国宾州大学。
本发明的有益效果为：本发明从解决目前尚无办法的由rAAV载体的转基因产物引起的细胞免疫反应为目标，采用MicroRNA靶向沉默特定细胞内的转基因表达的技术方法，该载体不仅能有效地在体内表达转基因，并且能抑制由rAAV载体的转基因产物引起的细胞免疫反应，在体内应用时可降低针对转基因产物的细胞免疫毒性。为基于rAAV载体的基因药物的安全性提供了保障。
附图说明
图1是本发明新型rAAV药物的转基因表达框的构建。该基因表达框依次含有启动子、转基因、转基因表达调控元件、MicroRNA结合序列、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2 ITR。
MicroRNA结合序列内含有碱基序列AGCATTAA。X为随机碱基，m为10～20之间的任意自然数。
图2是本发明载体质粒pAAV-GFP-155T的转基因表达框的构建。该基因表达框依次含有启动子、转基因、调控元件WPRE、miRNA-155结合序列155T、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2 ITR。
图3是本发明rAAV基因药物转导未成熟与成熟DC后与B3Z细胞共培养，通过B3Z细胞表达LacZ的情况检测DC通过MHC-I类途径呈递OVA抗原肽的能力。
rAAV/OVA-155T载体转导未成熟DC(图3A)；rAAV/OVA-155T载体转导成熟DC(图3B)；rAAV/OVA-155TN载体转导未成熟DC(图3C)；rAAV/OVA-155TN载体转导成熟DC(图3D)。
具体实施方式
实施例1
rAAV/OVA-155T的制备
①miR-155紧密结合序列155T的设计
参照相关网站(如www.mirbase.org)公布的miR-155序列设计其紧密结合序列155T：5′-CCCCTATCACAATTAGCATTAA-3′。
②载体质粒pAAV-GFP-155T的构建
设计四个串联155T序列为：5′-TCTAGAGTCG
CGATCGGT
GTGACTCGAG-3′。方框内为紧密结合序列155T。
将以上序列经XhoI和XbaI双酶切后，与同样双酶切的rAAV载体质粒连接，(所述的载体质粒的基因表达框依次含有启动子、转基因、转基因表达调控元件、MicroRNA结合序列、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2 ITR(inverted terminal repeat sequence)，见图1所示)；得到载体质粒pAAV-GFP-155T。在pAAV-GFP-155T中，四个155T序列以串联的方式连接至rAAV载体质粒转基因表达框的3′UTR区域(见图2所示)。
③载体质粒pAAV-OVA-155T的构建
以卵清蛋白(OVA)cDNA替代GFPcDNA，得到载体质粒pAAV-OVA-155T。
④制备rAAV/OVA-155T
取载体质粒pAAV-OVA-155T、AAV辅助质粒(pAAV)和腺病毒辅助质粒(pAd)，按照三质粒共转染法，即采用磷酸钙法将载体质粒与辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获重组病毒，经纯化后得到rAAV/OVA-155T备用。
实施例2
rAAV/OVA-155TN的制备
①miR-155非紧密结合序列155TN的设计
将实施例1中miR-155紧密结合序列155T仅保留3′端的8个碱基，其余碱基随机变化，得到miR-155非紧密结合序列155TN：5′-XmAGCATTAA-3′。其中X代表随机碱基，m为随机碱基个数。本实施例中Xm采用ATCCATCGACCGAA，m为14。
②载体质粒pAAV-GFP-155T的构建
按照实施例1方法，将四个155TN序列以串联的方式连接至rAAV载体质粒转基因表达框的3′UTR区域，(所述的载体质粒的基因表达框依次含有启动子、转基因、转基因表达调控元件、MicroRNA结合序列、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2 ITR(inverted terminal repeat sequence)，见图1所示)；得到载体质粒pAAV-GFP-155TN。
③载体质粒pAAV-OVA-155TN的构建
以卵清蛋白(OVA)cDNA替代GFPcDNA，得到载体质粒pAAV-OVA-155TN。
④制备rAAV/OVA-155TN载体
取载体质粒pAAV-OVA-155TN、AAV辅助质粒(pAAV)和腺病毒辅助质粒(pAd)，按照三质粒共转染法，即采用磷酸钙法将载体质粒与辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获重组病毒，经纯化后得到rAAV/OVA-155T备用。
实施例3
rAAV/OVA-155TN(1)和rAAV/OVA-155TN(8)的制备
①载体质粒pAAV-GFP-155TN(1)和pAAV-GFP-155TN(8)的构建
按照实施例1方法，将一个155TN序列或八个155TN序列以串联的方式连接至rAAV载体质粒转基因表达框的3′UTR区域，(所述的载体质粒的基因表达框依次含有启动子、转基因、转基因表达调控元件、MicroRNA结合序列、polyA尾巴，基因表达框两端为AAV2 ITR(inverted terminalrepeat sequence)，见图1所示)；分别得到载体质粒pAAV-GFP-155TN(1)和pAAV-GFP-155TN(8)。
②载体质粒pAAV-OVA-155TN(1)和pAAV-OVA-155TN(8)的构建
以卵清蛋白(OVA)cDNA替代GFPcDNA，分别得到载体质粒pAAV-OVA-155TN(1)和pAAV-OVA-155TN(8)。
③制备rAAV-OVA-155TN(1)和rAAV-OVA-155TN(8)载体
取载体质粒pAAV-OVA-155TN(1)或pAAV-OVA-155TN(8)、AAV辅助质粒(pAAV)和腺病毒辅助质粒(pAd)，按照三质粒共转染法，即采用磷酸钙法将载体质粒与辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获重组病毒，经纯化后分别得到rAAV-OVA-155TN(1)和rAAV-OVA-155TN(8)。
实施例4
本发明的rAAV基因药物的衣壳蛋白可选自AAV血清型1-12的任意一种。
下面是本发明制备的rAAV基因药物的部分药理学试验，其中OVA是Ovalbumin的缩写，WPRE是Woodchuck hepatitis virusposttranscriptional regulatory element的缩写，DC是Dendritic Cell的缩写，CTL是cytotoxic T lymphocyte的缩写，MHC是majorhistocompatibility complex的缩写，UTR是untranslated region的缩写。
1.rAAV基因药物在不同成熟度DC中的抗原加工与呈递
卵清蛋白(OVA)是细胞免疫实验最常用的免疫原性蛋白。本实验以卵清蛋白(OVA)cDNA作为转基因，得到重组病毒rAAV基因药物。体外研究rAAV基因药物在不同成熟度DC中的抗原加工与呈递。
rAAV基因药物转导未成熟与成熟DC(感染复数为105)后与B3Z细胞共培养，通过B3Z细胞表达LacZ的情况检测DC通过MHC-I类途径呈递OVA抗原肽的能力。
B3Z细胞为T细胞杂交瘤，带LacZ基因，可专属性识别细胞表面呈递的H-2Kb限制性OVA抗原SIIFEKL多肽。识别后B3Z细胞被活化，激活LacZ基因的表达，其表达产物的多少即反映DC的抗原呈递能力。
由图3可知，rAAV/OVA-155T基因药物转导未成熟DC后，可以激活B3Z细胞表达LacZ基因(图3A)，但转导成熟DC后，激活B3Z细胞表达LacZ基因的能力明显受到抑制(图3B)。说明在基因药物转基因表达框的3′UTR区域插入序列155T后，可以抑制抗原在成熟DC内的加工与呈递。
同样，rAAV/OVA-155TN基因药物转导未成熟DC后，可以激活B3Z细胞表达LacZ基因(图3C)，但转导成熟DC后，激活B3Z细胞表达LacZ基因的能力明显受到抑制(图3D)。说明在基因药物转基因表达框的3′UTR区域插入序列中仅含有AGCATTAA，也可以抑制抗原在成熟DC内的加工与呈递。
DC是体内功能最强、惟一既能活化静息T细胞、又能刺激CTL增殖的专职抗原提呈细胞，其抗原呈递能力是其它类型抗原提呈细胞的1000倍，因而成为启动、调控和维持免疫应答的中心环节。DC的成熟度与其功能特点密切相关，成熟DC在免疫反应过程中发挥枢纽作用。未成熟DC具有高效的抗原摄取、处理功能，但对T细胞的激活作用较弱，甚至可以通过诱导调节性T细胞的分化间接引起T细胞失能和耐受。成熟DC抗原摄取能力大大降低，但抗原提呈功能大大增强，表面提呈pMHC的成熟DC会迁移到淋巴器官刺激和活化T细胞增殖，引起细胞免疫毒性。本专利rAAV载体可实现转基因在iDC表达，而在成熟DC中选择性沉默，从而阻断成熟DC的抗原提呈能力，并有效降低对T细胞的活化，可以从根本上抑制细胞免疫毒性的发生。
2.rAAV基因药物rAAV/OVA-155T和rAAV/OVA-155TN对细胞免疫应答的影响
在抗原刺激下，机体特异性细胞免疫应答的表现为T细胞增殖分化及分泌细胞因子IFN-γ。
①四聚体染色测定
四聚体染色技术是目前检测抗原特异性CD8+T细胞的金标准。
C57BL/6小鼠经皮下注射rAAV/OVA-155T或rAAV/OVA-155TN(剂量为1011vp/鼠)免疫10天后，常规制备脾脏细胞悬液，加入PE标记的四聚体与抗CD8单抗，流式细胞仪检测OVA抗原特异性CD8+T细胞。结果见表1。仅注射溶媒PBS的小鼠四聚体阳性T细胞比率为0.21％，经rAAV/OVA免疫的动物四聚体阳性T细胞比率高达2.98％，表明OVA的表达引起了机体特异性细胞免疫应答，抗原特异性CD8+T细胞发生增殖。而经rAAV/OVA-155T或rAAV/OVA-155TN免疫的小鼠，四聚体阳性T细胞比率略高于正常小鼠，但明显低于rAAV/OVA组，说明新基因药物可以降低细胞免疫应答。
表1.OVA抗原特异性CD8+T细胞的检测结果
| 基因药物 | 四聚体阳性T细胞比率(％) |
| rAAV/OVA-155T | 0.73±0.21 |
| rAAV/OVA-155TN | 0.82±0.30 |
| rAAV/OVA | 2.98±1.56 |
| PBS | 0.21±0.11 |
②ELISpot法检测IFN-γ分泌细胞
ELISpot是检测淋巴细胞分泌细胞因子情况的一种方法，比ELISA灵敏度高100～1000倍，不仅能分析细胞因子分泌的总量变化，更能检测活化淋巴细胞的数量变化。
C57BL/6小鼠经皮下注射rAAV/OVA-155T或rAAV/OVA-155TN(剂量为1011vp/鼠)免疫10天后，常规制备脾脏细胞悬液，ELISpot法检测IFN-γ分泌细胞的数量。结果见表2。仅注射溶媒PBS的小鼠IFN-γ分泌细胞比率为0.35％，经rAAV/OVA免疫的动物IFN-γ分泌细胞比率高达3.57％，表明OVA的表达引起了机体特异性细胞免疫应答，分泌IFN-γ的T细胞数量增加。而经rAAV/OVA-155T或rAAV/OVA-155TN基因药物免疫的小鼠，IFN-γ分泌细胞比率略高于正常小鼠，但明显低于rAAV/OVA组，说明新载体可以降低细胞免疫应答。
表2.IFN-γ分泌细胞的的检测结果
| 基因药物 | IFN-γ分泌细胞的比率(％) |
| rAAV/OVA-155T | 0.85±0.27 |
| rAAV/OVA-155TN | 0.76±0.31 |
| rAAV/OVA | 3.57±1.58 |
| PBS | 0.35±0.12 |
③体内CTL细胞毒性测定
常规制备正常C57BL/6小鼠脾细胞悬液，与OVA抗原SIIFEKL多肽孵育，标记高浓度的CFSE，得到靶细胞；另取脾细胞与对照肽孵育，标记低浓度的CFSE，作为对照。等量混合，静脉注射至免疫10天的小鼠，流式细胞仪测定，计算低标记/高标记脾细胞比率。然后通过脾细胞裂解率计算体内CTL活力。
结果见表3。仅注射溶媒PBS的小鼠脾细胞裂解率为5％，经rAAV/OVA免疫的动物IFN-γ分泌细胞比率高达40％，表明OVA的表达引起了体内CTL细胞毒性。而经rAAV/OVA-155T或rAAV/OVA-155TN基因药物免疫的小鼠，脾细胞裂解率略高于正常小鼠，但明显低于rAAV/OVA组，说明新载体可以降低细胞免疫应答。
表3.体内CTL细胞毒性结果
| 基因药物 | 脾细胞裂解率(％) |
| rAAV/OVA-155T | 11±3 |
| rAAV/OVA-155TN | 10±3 |
| rAAV/OVA | 40±18 |
| PBS | 5±2 |
3.rAAV基因药物rAAV/OVA-155TN(1)和rAAV/OVA-155TN(8)对细胞免疫应答的影响
①四聚体染色测定
C57BL/6小鼠经皮下注射rAAV/OVA-155TN(1)或rAAV/OVA-155TN(8)(剂量为1011vp/鼠)免疫10天后，常规制备脾脏细胞悬液，加入PE标记的四聚体与抗CD8单抗，流式细胞仪检测OVA抗原特异性CD8+T细胞。结果见表4。仅注射溶媒PBS的小鼠四聚体阳性T细胞比率为0.22％，经rAAV/OVA免疫的动物四聚体阳性T细胞比率高达2.76％，表明OVA的表达引起了机体特异性细胞免疫应答，抗原特异性CD8+T细胞发生增殖。而经rAAV/OVA-155TN(1)或rAAV/OVA-155TN(8)免疫的小鼠，四聚体阳性T细胞比率高于正常小鼠，但低于rAAV/OVA组。rAAV/OVA-155TN(8)的抑制效果优于rAAV/OVA-155TN(1)。
表4.OVA抗原特异性CD8+T细胞的检测结果
| 基因药物 | 四聚体阳性T细胞比率(％) |
| rAAV/OVA-155TN(1) | 1.34±0.34 |
| rAAV/OVA-155TN(8) | 0.68±0.33 |
| rAAV/OVA | 2.76±1.87 |
| PBS | 0.22±0.10 |
②ELISpot法检测IFN-γ分泌细胞
C57BL/6小鼠经皮下注射rAAV/OVA-155TN(1)或rAAV/OVA-155TN(8)(剂量为1011vp/鼠)免疫10天后，常规制备脾脏细胞悬液，ELISpot法检测IFN-γ分泌细胞的数量。结果见表5。仅注射溶媒PBS的小鼠IFN-γ分泌细胞比率为0.33％，经rAAV/OVA免疫的动物IFN-γ分泌细胞比率高达3.68％，表明OVA的表达引起了机体特异性细胞免疫应答，分泌IFN-γ的T细胞数量增加。而经rAAV/OVA-155TN(1)或rAAV/OVA-155TN(8)免疫的小鼠，IFN-γ分泌细胞比率高于正常小鼠，但低于rAAV/OVA组。rAAV/OVA-155TN(8)的抑制效果优于rAAV/OVA-155TN(1)。
表5.IFN-γ分泌细胞的的检测结果
| 基因药物 | IFN-γ分泌细胞的比率(％) |
| rAAV/OVA-155TN(1) | 1.46±0.54 |
| rAAV/OVA-155TN(8) | 0.78±0.36 |
| rAAV/OVA | 3.68±1.67 |
| PBS | 0.33±0.11 |
③体内CTL细胞毒性测定
常规制备正常C57BL/6小鼠脾细胞悬液，与OVA抗原SIIFEKL多肽孵育，标记高浓度的CFSE，得到靶细胞；另取脾细胞与对照肽孵育，标记低浓度的CFSE，作为对照。等量混合，静脉注射至免疫10天的小鼠，流式细胞仪测定，计算低标记/高标记脾细胞比率。然后通过脾细胞裂解率计算体内CTL活力。
结果见表6。仅注射溶媒PBS的小鼠脾细胞裂解率为5％，经rAAV/OVA免疫的动物IFN-γ分泌细胞比率高达45％，表明OVA的表达引起了体内CTL细胞毒性。而经rAAV/OVA-155TN(1)或rAAV/OVA-155TN(8)免疫的小鼠，脾细胞裂解率高于正常小鼠，但低于rAAV/OVA组。rAAV/OVA-155TN(8)的抑制效果优于rAAV/OVA-155TN(1)。
表6.体内CTL细胞毒性结果
| 基因药物 | 脾细胞裂解率(％) |
| rAAV/OVA-155T | 21±6 |
| rAAV/OVA-155TN | 12±4 |
| rAAV/OVA | 45±15 |
| PBS | 5±2 |
序列表
Claims (5)
1.一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因治疗药物，其特征在于：该基因药物载体质粒的转基因表达框的3′-UTR区含有miR-155的结合序列，其碱基序列为CCCCTATCACAATTAGCATTAA。
2.如权利要求3所述的一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因药物，其特征在于：所述载体质粒的转基因表达框的3’-UTR区含有2-8个串联的miR-155的结合序列。
3.如权利要求1所述的一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因药物，其特征在于：所述的基因药物载体质粒的转基因表达框的3′-UTR区含有miR-155的结合序列，其碱基序列为AGCATTAA。
4.如权利要求1所述的一种可抑制转基因产物所致免疫反应的基因药物，其特征在于：所述载体质粒的转基因表达框的3’-UTR区含有2-8个串联的miR-155的结合序列。
5.一种如权利要求1所述的可抑制转基因产物所致免疫反应的基因药物的制备方法，其特征在于：采用无辅助病毒的多质粒共转染法制备，即采用磷酸钙法将载体质粒与辅助质粒共转染293细胞，60-72小时后收获重组病毒，经纯化后备用。
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