KR102199911B1

KR102199911B1 - 태반 기능 평가용 바이오마커, 동물모델 및 이를 이용한 태반 기능 평가 방법

Info

Publication number: KR102199911B1
Application number: KR1020190114222A
Authority: KR
Inventors: 백인정; 이종걸; 유현주
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단; 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2021-01-08

Abstract

본 발명은 태반 기능 평가용 바이오마커, 동물모델 및 이를 이용한 태반 기능 평가 방법 등에 관한 것이다.

Description

태반 기능 평가용 바이오마커, 동물모델 및 이를 이용한 태반 기능 평가 방법{Biomarker for evaluating placental function, animal model and method for evaluating placental function using the same}

태반은 임신 중 태아의 생존과 성장에 필수적인 기관이다. 모계와 태아 순환의 접점을 형성하여 기체와 대사 교환을 가능하게 하며, 분자를 모체에서 태아 쪽으로 수송하기 시작할 때 기능하게 된다. 태반의 원활한 수송 기능은 자궁 내 태아 성장의 주요 요인으로 작용한다. 또한, 태반은 다양한 임신 관련 호르몬, 사이토카인, 성장 인자의 중요한 원천으로 작용하며, 산모의 면역체계로부터 태아를 보호한다. 태반 발달과 배아발생을 위한 필수 유전자를 확인하기 위해 태아에게 치명적인 돌연변이를 포함한 유전자 변형 마우스(GEM)를 이용한 많은 연구가 수행되고 있다.

유전자 녹아웃 마우스를 이용한 표현형 연구에 따르면 통계적으로 25%~30%의 GEM에서 배아치사 현상이 관찰되고, 그 중 10%에서 배아 외 결점(extra-embryonic defects)이 나타나지만, 발생학적 관점에서 유전자의 기능연구는 돌연변이가 태아 자체에 미치는 변이 영향에 초점을 맞추고 있다.

마우스 태반 표현형을 확인함에 있어 조직병리학적 평가 외에도 긴 사슬 다가 불포화 지방산(LC-PUFA, Long chain-polyunsaturated fatty acids)의 이동의 분석을 통해 태반의 역할을 측정하는 시도가 있었다. 임신한 모체의 영양분 섭취에 의해 태아에 공급되는 긴 사슬 다가 불포화 지방산은 농도경사에 따른 단순 확산에 의한 이동보다 단백질 매개 능동 수송에 의존한다. 지방산은 지방산 운반 단백질(FATP_Fatty Acid Transport protein)과 같은 막관통 단백질에 의해 흡수되고, 태반의 세포 내 지방산 결합 단백질(FABP_Fatty Acid Binding Protein)에 의해 세포 내로 운반된다. 다중의 FABPs (FABP1 내지 12)와 FATPs (FATP1 내지 6)가 보고되어 있지만, 태반의 구획에서 이 단백질들의 정확한 발현 위치(localization)와 태반내 지방산 수송에서의 역할은 거의 알려진 바 없다.

배/태아 발달에서 다양한 장기의 발달을 위해 필수 지방산은 반드시 필요한 요소이며 태아의 기하급수적인 조직 성장을 지원하는 구조적 구성 요소로서 단기간에 정점에 이른다. 마우스에서는 배아기 11.5일부터 태반의 수송 기능이 본격적으로 작동하는 것으로 알려져 있지만, 그 이전 시기 태반의 기능적 중요성에 대한 알려진 바는 거의 없을 뿐 아니라, 태반이 수행하는 주요 영양분의 운반과 관련하여 임신기 전반에 걸친 지방산 및 관련 단백질의 배아/태반 내 양적변화도 밝혀진 바 없다. 윤리 및 안전의 문제로 관련 연구 및 임상적 적용에 효과적인 접근법이 없는 이유로 초기 임신기 태반 기능 결함에 의한 태아/모체의 합병증을 진단하는데 어려움이 있다. 따라서 태반의 수송기능 활성화 시기를 정확히 판단하고 태반의 수송 결함이 태아에 미치는 영향을 확인하는 것이 중요하며, 이를 진단할 수 있는 바이오마커 개발이 필요한 상태이다.

Acta Biochim Pol. 2015;62(3):499-507

이에 본 발명자들은 태반의 조직학적 평가뿐만 아니라, 태반 기능의 표현형을 위한 프레임워크를 확립하기 위해, 태반과 배아에서 여러 지방산 전달 분자의 시공간적 발현을 평가하였으며, 플랫폼이 효과적으로 작동하는지 확인하기 위해, 이전에 태반 결함으로 인한 태아 사망이 보고된 적이 있던 Rb1 (Retinoblastoma 1) 단백질 결손 녹아웃 마우스를 CRISPR/Cas9를 이용하여 개발하였다. 해당 마우스를 이용하여, Rb1 결핍 태반의 기능적 수송 능력, 지방산 전달 분자의 발현 패턴, 영양막 줄기세포(TSC)의 지표 유전자, 다양한 분화형태의 영양막세포의 분화 지료 유전자와 그 혈통을 평가함으로써, 태반의 기능적 표현형 분석의 틀이 될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 Fabp3 (fatty acid binding protein 3) 및 Fatp4 (fatty acid transport protein 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 태반 기능 평가용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 태반 기능 평가 방법으로,

피검체로부터 시료를 수득하는 단계; 및

Fabp3(fatty acid binding protein 3) 및 Fatp4(fatty acid transport protein 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Rb1 결손 동물모델로서,

상기 동물 모델은 Crispr/Cas9 유전자 가위를 이용하여 제조되며,

태반 기능 평가 용도로 이용되는 것을 특징으로 하는, 동물모델을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Fabp3 및 Fatp4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 태반 기능 조절용 물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Fabp3(fatty acid binding protein 3) 및 Fatp4(fatty acid transport protein 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 태반 기능 평가용 바이오마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 태반 기능 평가 방법으로,

피검체로부터 시료를 수득하는 단계; 및

Fabp3(fatty acid binding protein 3) 및 Fatp4(fatty acid transport protein 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 Rb1 결손 동물모델로서,

태반 기능 평가 용도로 이용되는 것을 특징으로 하는, 동물모델을 제공한다.

또한, 본 발명은 Fabp3 및 Fatp4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 태반 기능 조절용 물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 Fabp3 및 Fatp4는 단백질 또는 mRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 조성물은 Fabp4(fatty acid binding protein 4) 및 Fatp6(fatty acid transport protein 6)을 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 단백질 발현 수준은 Fabp3 및 Fatp4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적인 항체로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 mRNA 발현 수준은 Fabp3 및 Fatp4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 시료는 태반 조직일 수 있으며, 바람직하게는 태반 미로층(labyrinthine layer) 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 임신 기간 동안의 배아와 태반에서 지방산 전달 분자의 표현 패턴을 탐구한 결과, 지방산 결합 단백질(Fabp3, Fabp4)과 지방산 수송 단백질(Fatp4, Fatp6)이 태반 부위와 임신 기간에 따라 상이하게 발현되었으며, 태반 혈관 분포를 평가하는데 유용한 지표가 될 수 있음을 확인하였다. 또한, CRISPR/Cas9를 이용하여, 비정상적인 태반 발달로 인해 태아에게 치명적으로 알려져 있는 Rb1 녹아웃 마우스를 이 플랫폼에 적용하여 그 결과가 기능적 태반의 표현형 분석의 프레임 워크가 될 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명의 단백질 및 동물 모델을 이용하여 태반 기능을 효과적으로 평가할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a 내지 도 1d는 E9.5-E18.5의 배아 및 태반에서 지방산 결합 단백질 및 지방산 수송 단백질의 발현 변화를 확인한 결과로,
도 1a 및 도 1b는 각각 배아 및 태반에서 Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6의 mRNA 수준값은 Gapdh으로 표준화하였으며, 데이터는 평균±SEM (n=3/그룹)으로서 E10.5 그룹의 발현에 대하여 상대적으로 표현하였고,
도 1c 및 도 1d는 배아 및 태반에서 Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6의 단백질 수준을 나타낸 것으로, 화살표와 별표는 각각 예상되는 밴드 크기와 비특이적 밴드 신호를 나타낸 것이며, 각 값은 β-액틴으로 표준화하였으며. 데이터는 평균±SEM (n=4/그룹)으로서 E10.5 그룹의 발현에 대하여 상대적으로 표현한 결과이다.
도 2는 배아기 10.5와 13.5 태반의 미로(labyrinthine)층에서 Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6의 국부 발현을 확인한 결과로, 빨간색과 하늘색 화살표는 각각 태아(F)와 모(M) 혈액 공간의 내벽에서 양성 신호를 나타낸 것이다(배율 x1000).
도 3은 배아기 10.5에서 태반 미로층을 제외한 태반 층의 Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6의 국부 발현을 확인한 결과로, 접합 구역에서 Fatp6은 모계 혈액 공간(Maternal blood space, MBS)의 안쪽에서 많이 발현되었다 : dec, 탈락막(decidua); jz, 접합 구역(junctional zone); lab, 미로(labryrinth); TGC, 세포영양막 거대세포(trophoblast giant cell)(제 1 행의 배율 x40, 제 2 내지 제 4 행의 배율 x400)
도 4는 배아기 13.5 태반 내벽에서의 Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6의 국부 발현을 확인한 결과로, 접합 구역에서 Fatp6은 모계 혈액 공간 (Maternal blood space, MBS)의 안쪽에서 많이 발현되었다 : dec, 탈락막(decidua); jz, 접합 구역(junctional zone); lab, 미로(labryrinth); TGC, 세포영양막 거대세포(trophoblast giant cell)(제 1 행의 배율 x40, 제 2 내지 제 4 행의 배율 x400.)
도 5a 내지 도 5c는 CRISPR/Cas9-매개 retinoblastoma 1 (Rb1) 녹아웃 마우스의 생성 및 Rb1-결핍 배아와 태반의 표현형을 나타낸 것으로,
도 5a는 마우스 Rb1 유전자 자리의 표적 DNA 서열은 빨간색으로 표시한 것으로 밑줄 친 서열은 sgRNA과 protospacer adjacent motif (PAM) 서열이며,
도 5b는 아가로오스 겔 전기 영동 및 PAGE 기반의 유전자형 분석법으로 founder 마우스와 돌연변이된 Rb1 서열을 확인한 결과로 숫자는 각 신생 마우스를 나타낸 것이며(M, 분자 크기 마커; WT, 야생형; *, founder 마우스; -는 결실된 뉴클레오티드),
도 5c는 founder 마우스의 Rb1 돌연변이 대립 유전자의 생식선 전달을 나타낸 것으로, Rb1 돌연변이 founder#2 (WT / Δ3 / Δ23 / Δ64)를 WT와 교차시켰고, 새끼의 유전자형은 PCR(젤 이미지)과 후속 Sanger 시퀀싱에 의해 결정하였다(밑줄 친 서열은 PAM, "-"는 삭제 된 뉴클레오티드).
도 6a 및 도 6b는 Rb1 결핍 배아와 태반의 표현형을 분석한 결과로,
도 6a는 배아기 13.5의 Rb1 결핍 배아 및 태반의 비정상적인 표현형을 확인한 것으로, 별표와 화살표는 더 가벼운 간 및 피하 부종을 나타낸다(제1행). 붉은줄이 있는 영역은 미성숙한 적혈구로 채워진 태아의 혈액 공간을 나타낸다(제3행) (Dec, 탈락막; JZ, 접합 구역; Lab, 미로. 배율은 두 번째 행에서 x40 및 세 번째 행에서 x400).
도 6b는 배아기 9.5 ~ 13.5에서 Rb1 결핍 태반의 영양막 세포 표지 유전자의 발현을 확인한 결과로, 점선은 각 유전자에 대한 WT 컨트롤의 평균값을 나타낸다. 각 값은 Gapdh 으로 표준화되었으며, 데이터는 평균 ± SEM(n=3/그룹; one way ANOVA에서 * p <0.05, * p <0.01, *** p <0.001)으로, WT의 발현에 상대적으로 표현되었다(TSC, 세포영양막 줄기 세포(trophoblast stem cell); SpT, spongiotrophoblast; GlyT, 글리코겐 영양막 세포(glycogen trophoblast); TGC, 세포영양막 거대 세포(trophoblast giant cell); SynT-1 및 SynT-II, 합포체영양막(syncytiotrophoblast) type I 및 II)
도 7a 내지 도 7c는 Rb1 결핍 태반에서 지방산 결합 단백질 및 수송 단백질의 발현을 확인한 결과로,
도 7a는 배아기 9.5, 10.5 및 13.5의 Rb1 결핍 태반에서 Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6 전사체의 발현을 확인한 것으로, 점선은 각 유전자에 대한 WT 컨트롤의 평균값을 나타내며, 각 값은 Gapdh 발현으로 표준화되었고, 데이터는 평균 ± SEM(n=3/그룹; one way ANOVA에서 * p <0.05, ** p <0.01)으로, WT의 발현에 상대적으로 표현되었으며,
도 7b는 배아기 9.5, 10.5 및 13.5의 Rb1 결핍 태반의 Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6의 단백질 수준을 확인한 것으로, 화살표와 별표는 각각 예상되는 밴드 크기와 비특이적 밴드 신호를 나타내며, 점선은 각 단백질에 대한 WT 컨트롤의 평균값을 나타내며, 평균 ± SEM으로 표시한 것이며(데이터는 평균 ± SEM(n=3/그룹; one way ANOVA에서 * p <0.05),
도 7c는 배아기 13.5의 Rb1 결핍 태반의 미로(labyrinthine) 층에서 Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6의 발현을 나타낸 것으로, 빨간색과 하늘색의 화살표는 태아 (F) 및 모(M) 혈액 공간의 각각의 내벽에서 양성 신호를 나타낸다(배율 x1000).
도 8은 배아기 13.5의 Rb1 결핍 태반층에서 Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6의 국소 발현을 확인한 것으로, 하늘색 화살표는 모(M) 혈액 공간의 안쪽에서의 양성 신호를 나타낸다(제 1 행 배율 x40, 제 2 내지 제 4 행 배율 x400).

본 발명은 Fabp3(fatty acid binding protein 3) 및 Fatp4(fatty acid transport protein 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 태반 기능 평가용 바이오마커 조성물, Rb1 결손 동물모델 및 그를 이용한 태반 기능 평가 방법 등을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

“Fabp3” 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서의 Fabp3 단백질은 서열번호 15로 표시되는 마우스의 Fabp3(NP_034304.1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(괄호 안은 NCBI Genebank accession number).

상기 “Fabp3” mRNA는 바람직하게는 서열번호 19로 표시되는 Fabp3 mRNA(NM_010174.2)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(괄호 안은 NCBI Genebank accession number). 상기한 Fabp3 mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genebank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.

“Fatp4” 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서의 Fatp4 단백질은 서열번호 16로 표시되는 마우스의 Fatp4(NP_036119.1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(괄호 안은 NCBI Genebank accession number).

상기 “Fatp4” mRNA는 바람직하게는 서열번호 20로 표시되는 Fatp4 mRNA(NM_011989.5)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(괄호 안은 NCBI Genebank accession number). 상기한 Fatp4 mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genebank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.

“Fabp4” 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서의 Fabp4단백질은 서열번호 17로 표시되는 마우스의 Fabp4(NP_077717.1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(괄호 안은 NCBI Genebank accession number).

상기 “Fabp4” mRNA는 바람직하게는 서열번호 21로 표시되는 Fabp4 mRNA(NM_024406.3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(괄호 안은 NCBI Genebank accession number). 상기한 Fabp4 mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genebank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.

“Fatp6” 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서의 Fatp6단백질은 서열번호 18로 표시되는 마우스의 Fatp6(NP_001074541.1)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(괄호 안은 NCBI Genebank accession number).

상기 “Fatp6” mRNA는 바람직하게는 서열번호 22로 표시되는 Fatp6 mRNA(NM_001081072.1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(괄호 안은 NCBI Genebank accession number). 상기한 Fatp6 mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genebank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.

“단백질”은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

“폴리뉴클레오티드(polynucleotide)” 또는 “핵산”은 단일 또는 이중 가닥의 형태로 된 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 ‘상보적(complementary)'이라고 한다.

“mRNA(messenger RNA 또는 전령 RNA)"는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 리보솜(ribosome)으로 전달하여 폴리펩티드 합성(단백질 번역, translation)의 청사진 역할을 하는 RNA이다. 유전자를 주형(template)으로 하여 단일 가닥의 mRNA가 전사(transcription) 과정을 통하여 합성된다.

"상보적(complementary)"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 구체적으로는 생리학적 조건 하(세포 내)에서 핵산 분자 내 타겟팅 모이어티가 타겟(예컨대, Fabp3 또는 Fatp4 유전자)에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 보다 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

“검출”은 목적하는 물질(본 발명에서의 마커 단백질의 존재(발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 같은 맥락에서, 본 발명에서 상기 단백질의 발현수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것(즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 단백질 검출은 목적 단백질의 존재 여부 검출, 또는 상기 단백질 발현량의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.

단백질의 '발현 증가(또는 고발현)'라는 의미는 발현되지 않던 것이 발현된 것(즉, 검출되지 않던 것이 검출된 것) 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 과발현된 것(즉, 검출량이 많아지는 것)을 의미한다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.

상기 '프라이머(primer)'는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 각 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 KRS 또는 AIMP1의 mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다. 본 발명에서 상기 프라이머는 바람직하게는 서열번호 6로 표시되는 Fabp3 또는 Fatp4의 mRNA에 특이적으로 결합하는 한 세트, 한 쌍 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 '프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 Fabp3 또는 Fatp4 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 Fabp3 또는 Fatp4 mRNA의 발현양을 측정함으로써 태반 및 배아 조직에서 지방산 이동 또는 자간전증 등의 모체의 이상에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 본 발명에서 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 Fabp3 또는 Fatp4 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지 물질(labeling material)의 결합 등이 있다.

상기 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.

Fabp3 또는 Fatp4 단백질은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 Fabp3 또는 Fatp4 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 Fabp3 또는 Fatp4 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 Fabp3 또는 Fatp4 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 Fabp3 또는 Fatp4 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

예를 들어, 다클론 항체는 Fabp3 또는 Fatp4 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.

단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519, 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

"기능적 등가물"이라는 용어는 예를 들어, 기준(reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준(reference) 서열과 실험(subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과(net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 통상적으로, 그런 실질적 등가물인 서열은 단지 약 35%(즉, 실질적으로 등가적인 서열에서의 각 잔기 치환, 부가 및 결실의 숫자는 상응하는 기준 서열과 비교하고 실질적으로 등가적인 서열에서의 나머지 전체 숫자로 나누었을 때 약 0.35 또는 그 이하이다) 정도로 본 명세서에 나열된 것에서부터 다양하다. 그런 서열은 나열된 서열과 65%의 서열 동일성을 갖는다. 본 발명에 따른 실질적 등가물인, 예를 들어 돌연변이, 아미노산 서열은 나열된 아미노산 서열과 바람직하게는 최소한 80%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 90%의 서열 동일성을 갖는다. 실질적 등가물인 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 유전자 암호의 중복(redundancy) 또는 축퇴(degeneracy)를 고려할 때, 더 낮은 백분율의 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가져야 한다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 합성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다. 등가물을 결정하기 위해, 성숙 서열(예를 들어, 위(spurious) 종결코돈(stop codon)을 제조하는 돌연변이를 통한)의 절단(truncation)은 무시되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본 발명에서 용어, "태반 기능 평가"란 태반이 다양한 임신 관련 호르몬, 사이토카인, 성장 인자의 중요한 원천으로 작용하면서 산모의 면역체계로부터 태아를 보호하는 기능을 수행할 능력이 있는지 평가하는 것으로, 보다 구체적으로 태아에게 지방산을 수송하는 기능을 수행하기에 적절한 상태인지 평가하는 것일 수 있다. 또한, 태반 기능 평가는 임신 주수에 따른 태반 기능의 예측도 포함된다.

본 발명에서, "평가용 바이오마커, 평가하기 위한 마커, 또는 평가 마커"란 태반 기능을 평가할 수 있는 물질로, 정상 세포 또는 조직에 비하여 태반 기능 이상 세포 또는 조직에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 단백질, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 태반 기능 평가용 바이오마커는 정상 태반 조직의 세포에 비하여, 태반 기능 이상 유발 물질에 노출된 조직의 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 Fabp3 및/또는 Fatp4로, 태반 기능 이상 유발 물질에 노출된 조직의 세포에서 특정 시기에서 특이적으로 낮은 수준의 발현을 나타내는 특징이 있다.

본 명세서에서, 용어 '검출'은 목적하는 물질(본 발명에서의 마커 단백질)의 존재(발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 같은 맥락에서, 본 발명에서 상기 단백질의 발현수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것(즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 단백질 검출은 Fabp3 및/또는 Fatp4 단백질의 존재 여부 검출, 또는 상기 단백질 발현량의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.

본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 바이오마커의 발현에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

시험물질을 처리하는 것은 시험물질을 세포 또는 조직 배양 배지에 추가한 후 세포를 일정 시간 배양하는 것을 의미한다. 상기 세포가 실험동물 형태로 제공될 때, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하는 이로 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 mRNA의 발현량 측정은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-timeRT-PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 단백질 발현량 측정은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 대조군은 태반 기능이 정상적인 동물 모델일 수 있으며, 보다 구체적으로 Rb1 유전자가 결손되지 않은 동물 모델일 수 있고, 본 발명의 동물모델에서 채취한 시료와 수득 부위 및 수득 시기가 동일한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 태반 기능 평가 방법으로,

피검체로부터 시료를 수득하는 단계; 및

본 발명의 태반 기능 평가 방법은 대조군과 비교하여 Fabp3 및 Fatp4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 발현 수준이 감소된 경우, 태반이 비정상적으로 기능하는 것으로 평가하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 피검체는 태반 기능을 평가하고자 하는 모든 동물, 바람직하게 인간을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 인간을 제외한 포유류, 보다 바람직하게는 설치류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 상기 피검체로부터 시료를 수득하는 단계는 피검체로부터 체외로 자연적으로 배출된 시료를 수득하는 단계일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 시료는 이에 제한되는 것은 아니나, 태반 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 복수, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있으며, 바람직하게는 태반 조직일 수 있다. 상기 태반 조직은 바람직하게는 태반 미로층 조직일 수 있다.

또한, 본 발명은 Rb1 결손 동물모델로서,

태반 기능 평가 용도로 이용되는 것을 특징으로 하는, 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 유전자 가위 기술을 이용하여 목적하는 Rb1 유전자 결손 동물모델을 제작한다.

"동물 모델"이란 사람과 아주 유사한 형태를 가진 동물을 말한다. 사람의 연구에 있어 동물 모델이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환 모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.

“동물 모델”은 인간을 제외한 동물일 수 있으며, 예를 들어 포유류, 바람직하게는 설치류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"포유류"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 사냥 동물, 또는 애완 동물, 가령 개, 말, 고양이, 소, 랫트, 마우스, 비-인간 영장류 (가령, 원숭이, 유인원) 등을 포함하여, 포유류로 분류된 임의의 동물을 나타낸다.

"설치류"는 계통발생적 순서 설치목(Rodentia)의 모든 구성원을 나타내며 그것으로부터 유래되는 향후의 모든 세대의 임의의 및 모든 자손을 포함한다.

"녹아웃(knock-out)"은 표적 유전자의 기능 저하를 가져다 주는 유전자 서열 상의 변형을 의미하는데, 바람직하게는 이로써 표적 유전자 발현이 탐지 가능하지 않거나 무의미하다. Rb1 유전자의 녹아웃은 Rb1 유전자의 기능이 실질적으로 저하되어 발현이 탐지될 수 없거나 또는 무의미한 수준으로만 존재하는 것을 의미한다. "녹아웃"에는 예를 들어, 표적 유전자 변형을 증진시키는 물질에 해당 동물을 노출시키거나, 표적 유전자 부위에서 재조합을 증진시키는 효소를 도입시키거나 또는 출생 후에 표적 유전자 변형을 지시하는 기타 방법시, 표적 유전자의 변형이 일어날 수 있는 조건적 녹아웃이 또한 포함된다.

상기 유전자 가위 기술은 원하는 DNA 서열을 인식하여 자르는 기술이므로 유전자의 기능을 없애는 녹아웃(knock out) 연구 수단으로 주로 사용된다.

유전자의 기능을 연구하는 도구로서의 유전자 가위 기술은 DNA 염기서열에 변이를 도입하여 유전자 코드(genetic code) 자체를 바꾸는 것으로 RNAi(RNA interference)를 이용해 RNA를 표적으로 하는 knock down과는 다르다. RNAi 기술에서 사용되는 miRNA, siRNA 또는 shRNA는 전사된 mRNA와 결합하여 분해하거나 번역을 저해함으로써 유전자 발현량을 감소시킨다. 반면, 유전자 가위 기술은 DNA 염기 서열에 직접적인 변이를 도입하여 녹아웃 시키는 기술로 녹다운(knock down)으로는 보기 어려웠던 부분까지도 확인할 수 있다. 그리고 RNAi 기술은 RNA가 전사되는 부분(Coding DNA Sequences;CDS)에 대해서만 적용이 가능하지만, 유전자 가위 기술은 표적 가능한 영역에 대한 제약이 적기 때문에 CDS 이외의 부분에 대한 연구에도 사용할 수 있다.

CRISPR-Cas 유전자 가위 기술은 인간이나 동식물 등 다양한 개체의 유전자에 변이를 도입할 수 있고, 이를 통해 유전자의 기능을 밝히는 연구 방법으로 사용되고 있다.

상기 CRISPR/Cas 시스템은 특정 서열을 표적화하기 위해 맞춤형 단백질의 생성을 필요로 하지 않고, 오히려, 단일의 Cas 효소가 짧은 RNA 분자에 의해 프로그램화되어, 특정 DNA 표적을 인식할 수 있다. 게놈 시퀀싱(sequencing) 기법 및 분석 방법의 레퍼토리에 CRISPR-Cas 시스템을 부가하면, 방법을 상당히 단순화시킬 수 있다.

본 발명자들은 CRISPR/Cas9 유전자가위 기술을 활용하여 Rb1 결손 마우스 동물 모델을 제조하는 것이 전통적인 유전자재조합 기법을 이용하여 표적 유전자로부터 만들어지는 단백질의 일부분만을 제거한 Rb1 결손 마우스를 제조하는 것과 비교하여 태반 기능을 평가함에 적합함을 확인하였다(본 발명의 실시예 참조).

또한, 본 발명은 Crispr/Cas9 유전자 가위를 이용하는 태반 기능 평가용 Rb1(Retinoblastoma 1) 결손 동물 모델의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 Rb1 유전자 중 exon1 일부를 표적으로 하여 CRISPR/Cas9 유전자가위로 염색체 상에서 제거한 Rb1 유전자 결손 마우스를 얻는 단계;

상기 Rb1 유전자 결손 마우스 간에 교배를 통하여 2세대 마우스를 얻는 단계; 및

상기 2세대 마우스로부터 Rb1 유전자가 발현되지 않는 마우스를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가용 동물 모델의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제작한 태반 기능 평가용 Rb1(Retinoblastoma 1) 결손 동물 모델의 이용방법에 관한 것이다. 구체예로서, Rb1 유전자 결손 동물모델의 이용방법에 관한 것이다.

일반적으로, 녹아웃 동물모델은 유전자 또는 억제된 유전자에 따라서 다양한 용도를 가진다. 예를 들어, 유전자 또는 억제된 유전자가 배아의 성장을 저해하거나, 태반의 지방산의 수송을 억제하는 것으로 간주되는 단백질을 인코딩하는 경우, 포유류는 면역조절에 유용한 약물, 즉, 이들 활성도를 증진하거나 또는 저해하는 약물에 대하여 스크리닝하는 데에 이용될 수 있다.

본 발명의 전체적인 Rb1 유전자 결손 마우스는 배아가 피하 부종 및 창백한 간과 같은 비정상적이고 심각한 표현형을 나타내는 바, 이로 인한 다양한 임신 질환, 구체적으로는 태반의 불완전한 형성 또는 비정상적인 기능으로 인한 질환의 치료를 위한 잠재적인 약물을 스크리닝하는 데에 이용될 수 있다. 유용한 약물에 대한 스크리닝은 마우스에게 용량 범위에 걸쳐 후보약물을 투여하는 단계, 및 평가되는 질환에서 약물의 효과(들)에 대해 다양한 시점에서 분석시험하는 단계를 포함한다.

추가적으로, 본 발명의 Crispr/Cas9 유전자가위를 이용한 유전자 결손 동물모델은 특정한 유전자, 예를 들어 Rb1 유전자 돌연변이의 효과를 연구하는 데에 유용할 수 있다. 본 발명의 Rb1 녹아웃 마우스 및 이의 자손의 구체예는 발현될 수 있는 추가적인 전이유전자 및/또는 그들이 함유할 수도 있는 녹아웃 구조체에 따라서 또한 다양한 용도를 가질 것이다.

유용한 약물에 대한 스크리닝은 포유류에서 태반 기능 결손을 먼저 유도하는 단계, 또는 태반 관련 질병의 모델을 유도하는 단계, 및 이후 포유류에게 용량 범위에 걸쳐 후보 약물을 투여하는 단계, 그리고 평가되는 태반 기능 결손 또는 태반 관련 질병에서 약물의 효과(들)에 대해 다양한 시점에서 분석시험하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 약물은 태반 기능 결손 또는 태반 관련 질환 모델의 유도에 노출시키기에 앞서 또는 상기 노출과 동시에 투여될 수 있다. 기타 구체예에서, 발명적 전체적인 Rb1 녹아웃 마우스는 예를 들어 온-타겟/ 오프-타겟 효과를 구별하기 위한 약물 연구 및 개발을 위해 추가로 유용하다.

태반 기능 결손 또는 태반 관련 질환을 치료하는 데에 있어 이용하기 위한 약물을 스크리닝하는 것과 더불어, 본 발명의 동물모델은 태반 기능 결손 또는 태반 관련 질환을 예방하거나 또는 치유하는 것을 목표로 한 치료 섭생(therapeutic regimen)을 설계하는 것에 있어 유용할 수 있다. 예를 들어, 포유류는 태반 기능 결손 또는 태반 관련 질환의 개시에 앞서, 또는 개시와 동시에, 또는 개시 후에 특정한 식이요법, 정기적인 운동, 방사선 치료, 및/또는 하나 이상의 화합물 또는 물질의 조합으로 치료될 수 있다. 이러한 전반적인 치료 또는 섭생이 태반 기능 결손 또는 태반 관련 질환과 싸우는 데에 있어 화합물 단독으로 치료하는 것보다 더욱 효과적일 수 있다. 추가적으로, 혈액 압력, 체온, 체중, 맥박, 행동, 털가죽의 외형 (주름진(ruffled) 털)등과 같은 기준이 평가될 수 있다.

본 발명의 전체적인 Rb1 녹아웃 마우스는 하나 이상의 세포주를 발생시키는 데에 또한 이용될 수 있다. 이러한 세포주는 예를 들어, 특정한 조직 또는 기관 상에서 녹아웃의 효과(들)를 평가하는 것, 및 조직내 Rb1의 활성도 수준에 영향을 줄 수 있는 화합물을 스크리닝하는 것에 관해 많은 용도를 가진다. 이러한 화합물은 치료제로서 이용될 수 있다.

이러한 세포주의 생성은 통상의 기술자에게 공지된, 다양한 방법을 이용하여 성취될 수 있다. 실제 배양 조건은 배양될 조직 및 세포 유형에 의존할 것이다. 상이한 농도의 대량 및 미량 영양소, 성장 인자, 혈청 등을 함유한 다양한 배지는 과도한 실험 없이 세포 상에서 검사되어 세포의 성장 및 증식을 위한 최적 조건을 결정할 수 있다. 유사하게도, 기타 배양 조건, 가령 세포 밀도, 배지 온도, 및 인큐베이터내 이산화탄소 농도가 또한 쉽게 평가되고 최적화될 수 있고, 그리고 이 과정에 영향을 주는 화합물을 식별할 수 있다. 평가 대상이 되는 약제는 어떠한 투여 경로의 약제도 스크리닝할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다. 비경구적 및 경구적으로 투여되는 약제도 스크리닝할 수 있다. 약제의 투여량은 약제의 성질, 투여 대상의 종류, 연령이나 체중 등의 조건을 기초로 종합적으로 판단하여, 최적의 양을 적절하게 결정해야 하며 특별히 한정되지 않는다. 투여 시기나 투여 회수 등의 투여 조건은 약제의 성질, 시험 및 평가 목적 등에 따라 적절하게 최적이 되도록 설정하면 되며 특별히 제한되지 않는다.

또한, 이러한 방법을 이용하여 약제 효과를 수치화하여 정량적으로 파악할 수 있다. 통상 피험 약제 투여 종료 후에 태반 조직 내 단백질을 검출하고 비교하는 방법을 이용하여 약제 효과를 정량화할 수 있다.

이처럼, 본 발명은 Rb1 유전자 결손 동물모델 제조방법 및 이에 의해 생산된 태반 기능 평가용 동물모델과 이의 이용에 관한 다양한 이용을 모두 포함한다.

본 발명의 태반 기능 조절용 물질 스크리닝 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 동물 모델에 후보 약물을 투여하는 단계; 및

상기 후보 약물 투여 후 상기 동물 모델로부터 수득한 시료에서 Fabp3 및 Fatp4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계.

본 명세서에서, 상기 태반 기능 조절용 물질 스크리닝 방법은 후보 약물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 Fabp3 및 Fatp4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 증가시키는 후보 약물이 태반의 기능을 개선하거나 완화시키는 것으로 선별하는 단계;를 추가로 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는 임신 주기에 따른 단백질의 발현량을 확인하였으며, 태반의 기능이 손상된 Rb1 결손 모델에서 태반 기능이 확립되어야할 E13.5 시기에 Fabp3 및 Fatp4 단백질의 발현 수준이 유의하게 감소함을 확인하였다(본 발명의 실시예 4 및 도 7 참조)

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험 준비]

1. 실험용 동물

모든 동물 실험은 식품의약품안전처(MFDS)의 지침에 따라 실시되었다. 아산생명과학연구소의 제도적 동물관리 및 이용위원회(IACUC)가 동물실험계획서를 검토하고 승인했다(승인 번호: 2016-12-187). 모든 마우스는 서울아산병원 실험동물연구실의 특정 병원체 음성시설에서 사육되었다. C57B6/N 마우스는 OrientBio(경기도, 대한민국)에서 구입하였다. 7주령 암컷 마우스는 자연적으로 수컷 마우스와 교배하였고, 다음날 아침 질전(varginal plugs)을 검사했다. 임신한 마우스는 무작위로 6개 그룹(E9.5, 10.5, 11.5, 13.5, 15.5, 18.5)에 배정되어 배아와 태반의 표본을 얻었을 때 희생되었다. Rb1 야생형 또는 녹아웃 마우스를 얻기 위해, Rb1 이형 녹아웃 수컷과 암컷을 이종 교배시켜, 다음 실험 절차에 쓰일, E9.5-13.5에서 멘델의 비율을 가진 Rb1+/+ 및 Rb1-/- 배아를 생성했다.

2. CRISPR-Cas9를 사용한 Rb1 녹아웃 마우스 생산

Rb1 녹아웃 마우스는 CRISPR-Cas9방법으로 생성되었다. Rb1-특정 단일 유도 RNA(sgRNA)와 Cas9 mRNA를 C57BL/6N 마우스 접합체의 세포질 속에 주입하여 가임신한 대리모(foster mother)의 난관으로 옮겼다. 유전자 DNA 샘플은 꼬리 생체검사로부터 Rb1의 처음 돌연변이를 가진 마우스(Founder mice)를 검사하기 위해 준비하였고, Rb1-돌연변이 형질의 선택을 위해, PAGE 기반 유전자형 분석을 수행하였다. 대상 부위를 포괄하는 유전체 부위는 PAGE에 의해 분해된 이질 듀플렉스(heteroduplex) DNA를 형성하기 위해, PCR 증폭, 용해, 재가열하였다. Rb1 유전자는 올리고머 5'-gacgttttcccgcggttgg-3'(서열번호 1) 및 5'-tttttgcatctgaccggggc-3'(서열번호 2)을 사용하여 1차 PCR반응으로 유전자형을 분석하였고, 5'-aacgggagtcgggtgaggacg-3'(서열번호 3) 및 5'-agatgggggaccaaggggacc-3'(서열번호 4)을 이용하여 중첩 PCR반응으로 야생형 대립형질에서 각각 670bp와 383bp의 DNA파편을 증폭시켰다. Rb1 돌연변이 마우스의 PCR 산물은 T-Blunt PCR 클로닝 키트(SOT01-K020, Solgent)를 사용하여 복제되었고, Sanger 시퀀싱을 사용하여 돌연변이를 확인하였다(마크로젠, 서울, 대한민국). Rb1 돌연변이 founder를 만든 후, 야생형 대립 형질로부터 131bp의 DNA단편을 증폭시키기 위해, 자손으로부터 추출한 유전체 DNA 샘플을 프라이머 5'-gcgtcatgccgcccaaag-3'(서열번호 5) 및 5'-tcctcacctggccagggg-3'(서열번호 6)을 이용하여 PCR반응으로 유전자형을 분석하였다.

3. 가스 크로마토그래피/질량 분석기 (GC/MS)

임신한 마우스를 희생시키고 배아와 태반의 조직샘플을 칭량하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 다음 남아있는 수분을 간단히 제거한 후 급속 동결시켰으며, 사용할 때까지 -80 °C에서 보관했다.

샘플 준비를 위해, 마우스 배아 또는 태반 50-100mg에 400μl의 chloroform/methanol (2/1)을 가한 후, TissueLyzer (Qiagen)를 사용하여 균질화하고 액체-액체 추출을 수행였고, 지질을 함유하는 유기층을 유리병에 수집하였다. Myristic acid-d27 (50μl, 0.1mg/ml)을 샘플에 첨가하였다. 샘플을 진공 원심 분리기를 사용하여 건조시켰다. 건조된 시료는 80 ℃에서 30분동안 MeOH중 0.5M KOH 200μl로 가수분해되었고 실온으로 냉각되었다. 그 다음, 1M HCl을 첨가하여 용액을 중화시켰다. 500μl의 hexane을 첨가하여 지방산을 추출하고, hexane상을 진공상태에서 건조시켰다. 건조된 샘플을 BCl3-MeOH 12% w/w (Sigma-Aldrich) 200μl와 60 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 그 후, 100μl의 H2O 및 100μl의 헥산을 순차적으로 첨가하고, 샘플을 격렬하게 혼합하였다. 상부상(upper phase)에 샘플을 5분 동안 놓은 후에 수집하였다. 이어서, 20-30mg의 무수 황산나트륨을 첨가하고, GC-MS 분석을 위해 상등액을 준비하였다.

4. RNA 분리, 역전사 및 정량 실시간 PCR

Trizol Reagent 키트(15596026, Invitrogen)를 사용하여, 배아 또는 태반에서의 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 분리하였다. SuperScript III First-Strand 합성 시스템(18080-051, Invitrogen)을 사용하여, 상보적인 DNA(cDNA)를 생성하고 차후의 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하였다. 정량적 실시간 PCR 반응은 iQ SYBR Green Supermix(170-8882AP, Bio-Rad)를 사용하여 수행되었다. 다음 유전자 특이적 포워드(F) 및 리버스(R) 프라이머 (5'→ 3'서열)를 사용하였다 : Fabp3F, CATGAAGTCACTCGGTGTGG(서열번호 7); Fabp3R, TGCCATGAGTGAGAGTCAGG(서열번호 8); Fabp4F, TCACCATCCGGTCAGAGAGTA(서열번호 9); Fabp4R, GCCATCTAGGGTTATGATGCTC(서열번호 10); Fatp6F, GGCTTGAGGATGCCGCTTA(서열번호 11); Fatp6R, GTACTCTGGGCTCATGCTATGAAGT(서열번호 12); Gadph F, AGTGGCAAAGTGGAGATT(서열번호 13); Gadph R, GTGGAGTCATACTGGAACA(서열번호 14).

PCR 조건은 다음과 같다 : 95 ℃에서 3 분간 초기 배양한 후, 95 ℃에서 15 초, 60 ℃에서 25 초, 72 ℃에서 30 초의 50 회 열사이클을 20μl에서 수행하였다. QuantStudio 3 Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여, 반응을 수행했다. 데이터는 Gapdh로 표준화되었고, E10.5 그룹 또는 야생형 대조군의 발현 수준에 상대적으로 표현되었다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)을 사용하였다.

배아와 태반의 데이터는 태아 초기 단계(E9.5와 E10.5)에서 유전자형(야생형 및 Rb1 녹아웃)이 다른 배아를 비교했을 때를 제외하고는, 조직 중량(지방산/g 조직 중량)당 함량으로 표시했다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 결정되었다.

5. 웨스턴 블랏

단백질 분해 효소 칵테일(P2714, Sigma-Aldrich) 및 phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF, 0754-1, Amresco)가 보충된 세포 추출 완충액 (Invitrogen, FNN0011)에서의 조직 균질화에 의해 단백질 용해물이 제조되었다. 13,000rpm에서 원심 분리한 후, 2% sodium dodecyl sulfate(SDS, Sigma-Aldrich)를 포함한 loading buffer에서 100 ℃에서 5 분간 끓여, 단백질 추출물을 포함하는 상등액을 변성시켰다. 준비된 샘플을 타겟 단백질의 분자량에 따라, 다른 polyacrylamide 농도(%)로 SDS-polyacrylamide 겔 전기 영동 (PAGE)의 겔에 로딩하고, polyvinylidene difluoride (PVDF) 막(IPVH00010, Millipore)에 옮긴 후, 다음과 같이 일차 항체로 면역 블로팅을 하였다 : 항-Fabp3 (ab45966, Abcam), 항-Fabp4 (sc18661, Santa Cruz), 항-Fatp4 (ab199719, Abcam), 항-Fatp6 (ab84183, Abcam), 및 항-β-actin (sc47778, Santa Cruz). Horseradish peroxidase(HRP)과 결합된 2차 항체를 배양한 후, 신호가 강화된 화학 발광 (ECL) 시스템(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, 34080, Thermo Scientific)을 사용하여 시각화 하였다. 밴드 강도는 농도계와 ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴으로 표준화시키고, E10.5 그룹 또는 야생형 대조군의 발현 수준에 비례하여 나타내었다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)을 사용하였다.

6. 태반과 면역 조직 화학검사의 현미경 평가

조직을 4% paraformaldehyde에 고정시키고, 파라핀을 매립하고, 4μm에서 절편을 형성 한 다음, 탈랍(dewax)하고, 다시 수화하여, 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색하거나 면역 조직 화학법을 실시하였다. Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6의 검출을 위해, 파라핀 절편을 시트르산 완충액(10 mM 시트르산, 0.05 % Tween 20, pH 6.0)에서 열에 의해 유도 된 항원을 회수하고, 5% 염소 혈청으로 차단시킨 다음, 항-Fabp4(ab13979, Abcam)를 제외하고, 웨스턴 블롯팅 프로토콜을 설명하는 섹션에 나열된 일차 항체와 함께 항온 처리하였다. 절편을 세척하고 제조사의 지침에 따라 비오틴화된 염소의 항-토끼 IgG(PK6101, Vector Labs)와 함께 배양한 뒤, DAB+ 기질 발색소 시스템(K3467, Dako)을 사용하여 검출을 수행하였다.

실시예 1. 임신 중 태아와 태반에서 지방산 결합과 수송 단백질의 일시적인 발현 변화

Fabp3과 Fabp4을 포함하는 세포 내 FA 결합 단백질(Fabp)과 Fatp4와 Fatp6을 포함하는 transmembrane FA 수송 단백질 (Fatp)의 전사 및 단백질 수준을 E9.5-18.5에서 태아와 태반에서 측정하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, Fabs와 Fatps의 mRNA는 E9.5-18.5에서 태아와 태반 모두에서 검출되었으며 대부분의 Fatp 단백질은 시간이 지남에 따라 증가함을 확인하였다.

실시예 2. E10.5와 E13.5에서 태반에서 지방산 결합과 수송 단백질의 시공간적 발현 프로필

태반에서 Fabp3, Fabp4, Fatp4 및 Fatp6의 공간적 발현 양상을, 면역 조직 화학을 이용하여 분석하고, 발현 부위 및 임신 주수(gestational ages)를 비교하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 미로층(labyrinthine layer)에서, Fabp3 및 Fatp4는 E10.5 및 E13.5에서 태아 혈액 공간 (FBS, fetal blood spaces)의 내벽에서 독점적으로 발현되었지만, Fabp4는 E10.5에서 발현되지 않았고, 이후 E13.5의 FBS에서 높은 수준으로 검출되었음을 확인하였다. Fatp6은 E10.5의 모체 혈액 공간 (MBS, Maternal blood spaces)의 안쪽에만 발현되었지만, FBS와 MBS의 E13.5 시기에 모두 검출되었다.

또한, E10.5 및 E13.5에서 Fabp 및 Fatp의 수준은 미로층과 함께 탈락막(decidua), 접합 구역(juctional zone) 및 난황낭(yolk sac)과 같은 태반의 다른 부분에서도 조사되었으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

E10.5 및 E13.5에서의 태반 지방산 결합 및 수송 단백질의 발현 프로파일

위치	Fabp3	Fabp4	Fatp4	Fatp6
탈락막	weak	+++	++	+
접합 구역	absent	absent	weak	weak ++MBS within JZ
미로층	++ FBS	absent at E10.5 + FBS at E13.5	++ FBS	++ MBS at E10.5 ++ FBS & MBS at E13.5
난황낭	+	absent at E10.5 ++ at E13.5	+++	+

+ 보통, ++ 강한, +++ 더욱 강한 양성.

JZ, 접합 구역; YS, 난황낭; FBS, 미로의 태아 혈액 공간의 내벽; MBS, 미로의 모 혈액 공간의 내벽.

상기 결과는 단기간 미로층이 드러나는 시점으로부터 FA 수송 용량 및 부분적인 전달 단백질에 기초하여, 태반 기능에 대한 정보를 제공할 수 있음을 나타낸다.

이에, 본 발명자들은 테반 기능 평가에 유용한 마커를 제공하는지 보다 명확히 하기 위하여, 태반 결함으로 인한 배아 사망률을 보이는 CRISPR/Cas9-매개 retinoblastoma 1 (Rb1) 녹아웃 마우스를 생산하고, 이러한 마커의 유전자 변형 마우스에 대한 적용 가능성을 검증하기 위해 아래와 같은 실시예를 수행하였다.

실시예 3. CRISPR/Cas9 매개 Rb1(retinoblastoma1) 녹아웃 마우스의 배아 및 태반의 표현형 확인

마우스 Rb1 유전자의 exon1 표적화를 위해, single guide RNA (sgRNA)와 Cas9 mRNA를 사용하였다(도 5a). 첫(founder) 돌연변이 마우스가 아가로오스 겔 전기 영동, PAGE 분석에 의해 동정되었고, 생거(Sanger) 시퀀싱에 의해 확인되었다 (도 5b). 돌연변이 대립 유전자는 생식 세포 계통에 성공적으로 전달되었으며(도 5c), Rb1 이형 접합 녹아웃 마우스 계통(line)이 수득되었다. 선택된 돌연변이는 Rb1의 엑손 1에서 23bp의 결실으로, 프레임 이동을 유도하고 조기 종료 코돈이 뒤따르게 된다.

Rb1 heterozygous 수컷과 암컷을 교배시킨 후, Rb1 null 배아와 태반을 수득하였으며, E13.5에서 Rb1-null 배아는 피하 부종 및 창백한 간과 같은 특징으로 하는 등 비정상적이고 심각한 표현형을 나타냄을 확인하였다. 조직학적으로 R1이 결핍된 미로 내의 태아 혈액 영역은 야생형 태반과 비교하여 감소함을 확인하였다(도 6a).

새로 생성된 Rb1 녹아웃 마우스 라인은 추가 표현형 분석에 적절함을 확인할 수 있었다. 조직 병리학적 소견의 타당성을 확인하기 위하여, Rb이 결핍된 태반에서 TSC와 그 계통의 전사체들을 E13.5에서 분석한 결과, TSC의 비정상적으로 증가되었으며, TSC의 증식에 따라 Rb1 -/- 태반에서 줄기 세포 표지자 Esrrb가 유의하게 증가한 것으로 나타났으며, Ctsq(사인 곡성 거대 세포, sinusoidal giant cell), Gcm1, Synb 및 Mct4(syncytiotrophoblast type II)를 포함하는 E13.5 태반 미로 혈관 관련 마커 유전자가 유의하게 감소함을 확인하였다(도 6a 및 도 6b).

실시예 4. Rb1 KO 태아와 태반의 태반 표현형 관련 마커의 분석

도 7에 나타난 바와 같이, 지방산 결합 및 수송 단백질의 수준을 Rb1 결핍 태반에서 평가하였다. E9.5와 E10.5에서 지방산 전달 분자 및 세포영양막 전사 인자는 Rb1이 결핍된 태반과 WT 사이의 발현 수준이 유의한 차이가 없음을 확인하였다.

그러나, E13.5에서 Fabp3 및 Fatp4의 mRNA 및 단백질 수준은 WT와 비교하여 Rb1 결핍 태반에서 유의하게 감소함을 확인하였다. Fabp4 및 Fatp6 수준은 Rb1 녹아웃 태반에서 유의적으로 변화되지 않았다. 미로층에서 이들의 발현을 국소적으로 평가한 결과, 검사된 Fabps 및 Fatps 모두 Rb1 결핍 E13.5 태반에서 발현 수준이 감소함을 확인할 수 있었다(도 7c).

도 8에 나타난 봐아 같이, 탈락막, 접합 구역 및 난황낭을 포함한 배아의 다른 부분에서는 단백질 발현의 차이가 발견되지 않았으며, 이는 태아-모체간 교환에서 어떠한 태반 조직보다도 미로층에서 FA 전달 분자의 수준을 확인함으로써 태반의 기능적 결함을 평가할 수 있음을 나타낸다.

이상의 실시예를 종합하여, 본 발명자들은 임신 기간 동안의 배아와 태반에서 지방산 결합 단백질(Fabp3, Fabp4)과 지방산 수송 단백질(Fatp4, Fatp6)이 태반 부위와 임신 기간에 따라 상이하게 발현되었으며, 태반 혈관 분포를 평가하는데 유용한 지표가 될 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 단백질 및 동물 모델을 이용하여 태반 기능을 효과적으로 평가할 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Biomarker for evaluating placental function, animal model and method for evaluating placental function using the same <130> MP19-156 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rb1 Oligomer <400> 1 gacgttttcc cgcggttgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rb1 Oligomer <400> 2 tttttgcatc tgaccggggc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 aacgggagtc gggtgaggac g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 agatggggga ccaaggggac c 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gcgtcatgcc gcccaaag 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tcctcacctg gccagggg 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp3_F <400> 7 catgaagtca ctcggtgtgg 20 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Leu Ile Phe Glu 85 90 95 Gly Thr Asp Thr His Trp Thr Phe Arg Gln Leu Asp Glu Tyr Ser Ser 100 105 110 Ser Val Ala Asn Phe Leu Gln Ala Arg Gly Leu Ala Ser Gly Asn Val 115 120 125 Val Ala Leu Phe Met Glu Asn Arg Asn Glu Phe Val Gly Leu Trp Leu 130 135 140 Gly Met Ala Lys Leu Gly Val Glu Ala Ala Leu Ile Asn Thr Asn Leu 145 150 155 160 Arg Arg Asp Ala Leu Arg His Cys Leu Asp Thr Ser Lys Ala Arg Ala 165 170 175 Leu Ile Phe Gly Ser Glu Met Ala Ser Ala Ile Cys Glu Ile His Ala 180 185 190 Ser Leu Glu Pro Thr Leu Ser Leu Phe Cys Ser Gly Ser Trp Glu Pro 195 200 205 Ser Thr Val Pro Val Ser Thr Glu His Leu Asp Pro Leu Leu Glu Asp 210 215 220 Ala Pro Lys His Leu Pro Ser His Pro Asp Lys Gly Phe Thr Asp Lys 225 230 235 240 Leu Phe Tyr Ile Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Ala Ala 245 250 255 Ile Val Val His Ser Arg Tyr Tyr Arg Met Ala Ser Leu Val Tyr Tyr 260 265 270 Gly Phe Arg Met Arg Pro Asp Asp Ile Val Tyr Asp Cys Leu Pro Leu 275 280 285 Tyr His Ser Ala Gly Asn Ile Val Gly Ile Gly Gln Cys Leu Leu His 290 295 300 Gly Met Thr Val Val Ile Arg Lys Lys Phe Ser Ala Ser Arg Phe Trp 305 310 315 320 Asp Asp Cys Ile Lys Tyr Asn Cys Thr Ile Val Gln Tyr Ile Gly Glu 325 330 335 Leu Cys Arg Tyr Leu Leu Asn Gln Pro Pro Arg Glu Ala Glu Ser Arg 340 345 350 His Lys Val Arg Met Ala Leu Gly Asn Gly Leu Arg Gln Ser Ile Trp 355 360 365 Thr Asp Phe Ser Ser Arg Phe His Ile Pro Gln Val Ala Glu Phe Tyr 370 375 380 Gly Ala Thr Glu Cys Asn Cys Ser Leu Gly Asn Phe Asp Ser Arg Val 385 390 395 400 Gly Ala Cys Gly Phe Asn Ser Arg Ile Leu Ser Phe Val Tyr Pro Ile 405 410 415 Arg Leu Val Arg Val Asn Glu Asp Thr Met Glu Leu Ile Arg Gly Pro 420 425 430 Asp Gly Val Cys Ile Pro Cys Gln Pro Gly Gln Pro Gly Gln Leu Val 435 440 445 Gly Arg Ile Ile Gln Gln Asp Pro Leu Arg Arg Phe Asp Gly Tyr Leu 450 455 460 Asn Gln Gly Ala Asn Asn Lys Lys Ile Ala Asn Asp Val Phe Lys Lys 465 470 475 480 Gly Asp Gln Ala Tyr Leu Thr Gly Asp Val Leu Val Met Asp Glu Leu 485 490 495 Gly Tyr Leu Tyr Phe Arg Asp Arg Thr Gly Asp Thr Phe Arg Trp Lys 500 505 510 Gly Glu Asn Val Ser Thr Thr Glu Val Glu Gly Thr Leu Ser Arg Leu 515 520 525 Leu His Met Ala Asp Val Ala Val Tyr Gly Val Glu Val Pro Gly Thr 530 535 540 Glu Gly Arg Ala Gly Met Ala Ala Val Ala Ser Pro Ile Ser Asn Cys 545 550 555 560 Asp Leu Glu Ser Phe Ala Gln Thr Leu Lys Lys Glu Leu Pro Leu Tyr 565 570 575 Ala Arg Pro Ile Phe Leu Arg Phe Leu Pro Glu Leu His Lys Thr Gly 580 585 590 Thr Phe Lys Phe Gln Lys Thr Glu Leu Arg Lys Glu Gly Phe Asp Pro 595 600 605 Ser Val Val Lys Asp Pro Leu Phe Tyr Leu Asp Ala Arg Lys Gly Cys 610 615 620 Tyr Val Ala Leu Asp Gln Glu Ala Tyr Thr Arg Ile Gln Ala Gly Glu 625 630 635 640 Glu Lys Leu <210> 17 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 Protein(NP_077717.1) <400> 17 Met Cys Asp Ala Phe Val Gly Thr Trp Lys Leu Val Ser Ser Glu Asn 1 5 10 15 Phe Asp Asp Tyr Met Lys Glu Val Gly Val Gly Phe Ala Thr Arg Lys 20 25 30 Val Ala Gly Met Ala Lys Pro Asn Met Ile Ile Ser Val Asn Gly Asp 35 40 45 Leu Val Thr Ile Arg Ser Glu Ser Thr Phe Lys Asn Thr Glu Ile Ser 50 55 60 Phe Lys Leu Gly Val Glu Phe Asp Glu Ile Thr Ala Asp Asp Arg Lys 65 70 75 80 Val Lys Ser Ile Ile Thr Leu Asp Gly Gly Ala Leu Val Gln Val Gln 85 90 95 Lys Trp Asp Gly Lys Ser Thr Thr Ile Lys Arg Lys Arg Asp Gly Asp 100 105 110 Lys Leu Val Val Glu Cys Val Met Lys Gly Val Thr Ser Thr Arg Val 115 120 125 Tyr Glu Arg Ala 130 <210> 18 <211> 619 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fatp6 Protein(NP_001074541.1) <400> 18 Met Leu Leu Ser Trp Leu Thr Gly Leu Gly Ala Gly Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 His Phe Leu Gln Lys Leu Leu Phe Pro Tyr Phe Trp Asp Asp Phe Trp 20 25 30 Tyr Leu Leu Lys Val Val Arg Tyr Gly Ile Gln Met Glu Met Tyr Lys 35 40 45 Leu Arg Gly Glu Leu Val Thr Val Leu Asp Lys Phe Leu Ser His Thr 50 55 60 Arg Lys Gln Pro Arg Lys Ala Phe Ile Ile Tyr Glu Gly Asp Val Tyr 65 70 75 80 Thr Tyr Glu Asp Val Asp Lys Arg Ser Asn Arg Ile Ala His Ala Leu 85 90 95 Leu Asn His Ser Ser Leu Lys Arg Gly Asp Val Val Ala Leu Leu Met 100 105 110 Ser Asn Glu Pro Asp Phe Val His Val Trp Phe Gly Leu Ala Lys Leu 115 120 125 Gly Cys Val Val Ala Phe Leu Asn Ser Asn Leu Arg Phe Asp Ser Leu 130 135 140 Leu His Cys Ile Asn Thr Cys Glu Pro Thr Ala Val Val Val Gly Gly 145 150 155 160 Asp Leu Leu Gly Ser Ile Glu Glu Ile Leu Pro Ser Leu Pro Lys His 165 170 175 Val Arg Val Trp Gly Met Lys Asp Ser Val Pro Glu Gly Ile Asp Ser 180 185 190 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Leu Ala Ser Asp Glu Pro Val Pro Pro Ser 195 200 205 His His Val Thr Ser Ser Leu Lys Ser Thr Cys Leu Tyr Ile Phe Thr 210 215 220 Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Ala Ala Val Ile Ser Gln Leu Gln 225 230 235 240 Val Leu Lys Gly Ser Val Gly Leu Trp Ala Phe Gly Cys Thr Ala Asp 245 250 255 Asp Ile Ile Tyr Ile Thr Leu Pro Leu Tyr His Ser Ser Gly Ser Leu 260 265 270 Leu Gly Ile Gly Gly Cys Val Glu Leu Gly Ala Thr Cys Val Leu Lys 275 280 285 Lys Lys Phe Ser Ala Ser Gln Phe Trp Asn Asp Cys Lys Lys Tyr Asn 290 295 300 Val Thr Val Phe Gln Tyr Ile Gly Glu Leu Cys Arg Tyr Leu Cys Lys 305 310 315 320 Gln Pro Gln Arg Glu Gly Glu Lys Asp His Arg Val Arg Leu Ala Val 325 330 335 Gly Asn Gly Leu Ser Ser Asp Val Trp Arg Gln Phe Leu Asp Arg Phe 340 345 350 Gly Asn Ile Lys Met Cys Glu Leu Tyr Gly Ala Thr Glu Gly Asn Ile 355 360 365 Val Phe Met Asn His Thr Gly Lys Ile Gly Ser Val Gly Arg Ala Asn 370 375 380 Phe Phe Tyr Ser Leu Phe Phe Ser Phe Glu Leu Ile Lys Tyr Asp Phe 385 390 395 400 Gln Lys Asp Glu Pro Trp Arg Asn Gly Gln Gly Trp Cys Ser Cys Val 405 410 415 Arg Lys Gly Glu Pro Gly Leu Leu Ile Ser Arg Val Asn Lys Lys Asn 420 425 430 Pro Phe Phe Gly Tyr Ala Gly Ser Asp Thr His Thr Lys Ser Lys Leu 435 440 445 Leu Phe Asp Val Phe Arg Lys Gly Asp Val Tyr Phe Asn Thr Gly Asp 450 455 460 Leu Met Phe Gln Asp Gln Glu Asn Phe Val Tyr Phe Trp Asp Arg Leu 465 470 475 480 Gly Asp Thr Phe Arg Trp Lys Gly Glu Asn Val Ala Thr Thr Glu Val 485 490 495 Ala Asp Val Leu Gly Arg Leu Asp Phe Ile Gln Glu Ala Asn Val Tyr 500 505 510 Gly Val Arg Val Pro Gly Tyr Glu Gly Lys Ala Gly Met Thr Ser Val 515 520 525 Ile Leu Lys Pro Asn Lys Ser Leu Asp Leu Glu Lys Met Tyr Asn Gln 530 535 540 Val Val Thr Ser Leu Pro Ala Tyr Ala Cys Pro Leu Phe Leu Arg Ile 545 550 555 560 Gln Asp Lys Met Glu Thr Thr Gly Thr Phe Lys Leu Lys Lys Leu Gln 565 570 575 Leu Val Glu Glu Gly Phe Asp Pro Leu Lys Ile Ser Asp Pro Leu Tyr 580 585 590 Phe Met Asp Asn Leu Lys Lys Ser Tyr Val Pro Leu Thr Glu Glu Ile 595 600 605 Tyr Asn Gln Ile Met Ser Glu Glu Val Lys Leu 610 615 <210> 19 <211> 680 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp3 mRNA(NM_010174.2) <400> 19 gcggttctca gtgcctgctc gcctcctcac tcatcgcacc atggcggacg cctttgtcgg 60 tacctggaag ctagtggaca gcaagaattt tgatgactac atgaagtcac tcggtgtggg 120 ctttgccacc aggcaggtgg ctagcatgac caagcctact accatcatcg agaagaacgg 180 ggatactatc accataaaga cacaaagtac cttcaagaac acagagatca actttcagct 240 gggaatagag ttcgacgagg tgacagcaga tgaccggaag gtcaagtcac tggtgacgct 300 ggacggaggc aaactcatcc atgtgcagaa gtggaacggg caggagacaa cactaactag 360 ggagctagtt gacgggaaac tcatcctgac tctcactcat ggcagtgtgg tgagcactcg 420 gacttatgag aaggaggcgt gacctggctg ctccgtcact gaccgcccgc tcctctgcca 480 actggccacc cctcagctca gcaccatgct gcctcatggt tttcccctct gacattttgt 540 ataaacattc ttgggttggg atttttctgg agatacgggg catcagcctg gacccagttc 600 ctactatgta tgtggtttat tttttaaaac tgtatccaaa gggtgctcca aggtcaataa 660 agcagaacca aggccaccca 680 <210> 20 <211> 4054 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fatp4 mRNA(NM_011989.5) <400> 20 agtggtgcgc gcagggctgg aggggctggg cggtgtcggg cgcgctgggg ctgggttgcg 60 ctgaggtgca cggactcaga agctcgccct ctgcggggac ggcacagaag gcggtgctgc 120 cggctggcac agccggtgcg ggtgcgggag gcgggtgggg gtggagcggg gcagaggtac 180 agaccctaca aggacgagga gtgggccaga cgcaccgagg ctcggctgtg tgtgccccgg 240 ggcggccgat gcccccagcg caccgcactc cgctgccgca accgggccgc atcctgacgg 300 ggcgccgcgc cgcgcagccg cagccgggtc acaatgctac ttggagcatc tctggtgggg 360 gcgctactgt tctccaagct agtgctgaag ctgccctgga cccaggtggg attctccctg 420 ttgctcctgt acttggggtc tggtggctgg cgtttcatcc gggtcttcat caagacggtc 480 aggagagata tctttggtgg catggtgctc ctgaaggtga agaccaaggt gcgacggtac 540 cttcaggagc ggaagacggt gcccctgctg tttgcttcaa tggtacagcg ccacccggac 600 aagacagccc tgattttcga gggcacagac actcactgga ccttccgcca gctggatgag 660 tactccagta gtgtggccaa cttcctgcag gcccggggcc tggcctcagg caatgtagtt 720 gccctcttta tggaaaaccg caatgagttt gtgggtctgt ggctaggcat ggccaagctg 780 ggcgtggagg cggctctcat caacaccaac cttaggcggg atgccctgcg ccactgtctt 840 gacacctcaa aggcacgagc tctcatcttt ggcagtgaga tggcctcagc tatctgtgag 900 atccatgcta gcctggagcc cacactcagc ctcttctgct ctggatcctg ggagcccagc 960 acagtgcccg tcagcacaga gcatctggac cctcttctgg aagatgcccc gaagcacctg 1020 cccagtcacc cagacaaggg ttttacagat aagctcttct acatctacac atcgggcacc 1080 acggggctac ccaaagctgc cattgtggtg cacagcaggt attatcgtat ggcttccctg 1140 gtgtactatg gattccgcat gcggcctgat gacattgtct atgactgcct ccccctctac 1200 cactcagcag gaaacatcgt ggggattggc cagtgcttac tccacggcat gactgtggtg 1260 atccggaaga agttctcagc ctcccggttc tgggatgatt gtatcaagta caactgcaca 1320 attgtacagt acattggcga gctctgccgc tacctcctga accagccacc ccgtgaggct 1380 gagtctcggc acaaggtgcg catggcactg ggcaacggtc tccggcagtc catctggacc 1440 gacttctcca gccgtttcca catcccccag gtggctgagt tctatggggc cactgaatgc 1500 aactgtagcc tgggcaactt tgacagccgg gtgggggcct gtggcttcaa tagccgcatc 1560 ctgtcctttg tgtaccctat ccgtttggta cgtgtcaatg aggataccat ggaactgatc 1620 cggggacccg atggagtctg cattccctgt caaccaggtc agccaggcca gctggtgggt 1680 cgcatcatcc agcaggaccc tctgcgccgt ttcgacgggt acctcaacca gggtgccaac 1740 aacaagaaga ttgctaatga tgtcttcaag aagggggacc aagcctacct cactggtgac 1800 gtcctggtga tggatgagct gggttacctg tacttccgag atcgcactgg ggacacgttc 1860 cgctggaaag gggagaatgt atctaccact gaggtggagg gcacactcag ccgcctgctt 1920 catatggcag atgtggcagt ttatggtgtt gaggtgccag gaactgaagg ccgagcagga 1980 atggctgccg ttgcaagtcc catcagcaac tgtgacctgg agagctttgc acagaccttg 2040 aaaaaggagc tgcctctgta tgcccgcccc atcttcctgc gcttcttgcc tgagctgcac 2100 aagacaggga ccttcaagtt ccagaagaca gagttgcgga aggagggctt tgacccatct 2160 gttgtgaaag acccgctgtt ctatctggat gctcggaagg gctgctacgt tgcactggac 2220 caggaggcct atacccgcat ccaggcaggc gaggagaagc tgtgatttcc ccctacatcc 2280 ctctgagggc cagaagatgc tggattcaga gccctagcgt ccaccccaga ggggtcctgg 2340 gcaatgccag accaaagcta gcagggcccg cacctccgcc cctaggtgct gatctcccct 2400 ctcccaaact gccaagtgac tcactgccgc ttccccgacc ctccagaggc tttctgtgaa 2460 agtctcatcc aagctgtgtc ttctggtcca ggcgtggccc ctggccccag ggtttctgat 2520 aggctccttt aggatggtat cttgggtcca gcgggccagg gtgtgggaga ggagtcacta 2580 agatccctcc aatcagaagg gagcttacaa aggaaccaag gcaaagcctg tagactcagg 2640 aagctaagtg gccagagact atagtggcca gtcatcccat gtccacagag gatcttggtc 2700 cagagctgcc aaagtgtcac ctctccctgc ctgcacctct ggggaaaaga ggacagcatg 2760 tggccactgg gcacctgtct caagaagtca ggatcacaca ctcagtcctt gtttctccag 2820 gttcccttgt tcttgtctcg gggagggagg gacgagtgtc ctgtctgtcc ttcctgcctg 2880 tctgtgagtc tgtgttgctt ctccatctgt cctagcctga gtgtgggtgg aacaggcatg 2940 aggagagtgt ggctcagggg ccaataaact ctgccttgac tcctcttagc ctgacagcct 3000 ggctccttgc ctacctcctt cccctctagc ccctttcgct tagcccttgg gataagccct 3060 tagccagtcc tcttttccaa agctctgcct tcctataact ccttaggaga gactcccacc 3120 agatctgaca ggatgttaaa ctttggaact taacctttaa agtaagcatg tggctttggg 3180 caagtgtctc ctgaattatg ggggtaatta agggattcag aaactacaca aagccattag 3240 gagtgggagg atacttggcg tctttgaggg aaagccctcc cctgcacaga actgtccatg 3300 gacccatgcg ctgttgctcc atcttctgcc aaatgaccca ttggagcctc cccagccctc 3360 tgaggctttc tatgaaagtt tcatgtctaa gctctgtctt cttggccagg aggcctctgc 3420 acccgggctg agactgacag gcacctttag gatgatgcat ctgatccaga cagactgcct 3480 gacctcctca ggcaacccta gccagtcagc agcacattgg tccagagtcc tccagcctgg 3540 gagtccctgg gaagtacaga gggtcctaac agcccagggt ggactgctca agggccctcc 3600 tccactgttg gaccttctcc tgtatctgtg aggtcaattt cttgagttct gagatggttt 3660 tgtgtggtcc tgattgccat tttacttggg tacgatgtgg agaatggctt tgacctcagg 3720 atctttctgc ttcctcccag gtgctgggat gaaagacatc tggcttgagt ggttttgttg 3780 tggttatgtg cgcatgactc aggtttctgc aaacatgagt ccagaggcct cagaatcccc 3840 tggagctgga attaaagggg gggggggttc taggagctaa cctgggtctc aaagcacatt 3900 tttttggggg ggggtgttga ttggtgttca agacacagtt tctctatgta acagctctga 3960 acttacaaag atccgcctgc tccagagtgc agagattaaa tgtgtaccac caccaccctg 4020 gcttgaagca ggtcttataa atggactatt caag 4054 <210> 21 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 mRNA(NM_024406.3) <400> 21 gggcatcttt aaaagtgagc tatctggact tcagaggctc atagcaccct cctgtgctgc 60 agcctttctc acctggaaga cagctcctcc tcgaaggttt acaaaatgtg tgatgccttt 120 gtgggaacct ggaagcttgt ctccagtgaa aacttcgatg attacatgaa agaagtggga 180 gtgggctttg ccacaaggaa agtggcaggc atggccaagc ccaacatgat catcagcgta 240 aatggggatt tggtcaccat ccggtcagag agtactttta aaaacaccga gatttccttc 300 aaactgggcg tggaattcga tgaaatcacc gcagacgaca ggaaggtgaa gagcatcata 360 accctagatg gcggggccct ggtgcaggtg cagaagtggg atggaaagtc gaccacaata 420 aagagaaaac gagatggtga caagctggtg gtggaatgtg ttatgaaagg cgtgacttcc 480 acaagagttt atgaaagggc atgagccaaa ggaagaggcc tggatggaaa tttgcatcaa 540 acactacaat agtcagtcgg atttattgtt tttttttaaa gatatgattt tccactaata 600 agcaagcaat taattttttc tgaagatgca ttttattgga tatggttatg ttgattaaat 660 aaaacctttt tagacttaga aaaaaaaaaa aaaaaa 696 <210> 22 <211> 2598 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fatp6 mRNA(NM_001081072.1) <400> 22 gtctagccca atgccccagg gcgtatcacc agcgttctgt agctttctgg gcgaaaacct 60 ttgatttctt tcatgggata tacaaagaca tcttgagcca gaactacagg tgccagcctc 120 tgagctttca ggacaggagt ctccagggca aaaagaggtg aaactcttgg aaaagaaaga 180 gacactgcta ggacccatcg ggtctgctgg aggtctgggc acccatgctc ctgtcatggc 240 tcacaggatt gggggctgga ctgctctccc tgcatttcct gcagaaactt ctgttcccgt 300 atttctggga tgatttctgg tacttgctga aggtggtgcg ctacggaatt cagatggaga 360 tgtacaaact gaggggggag ctggtcacgg tgctggataa gttcctgagc cacaccagga 420 agcaaccacg gaaagccttc atcatttatg agggggacgt ctacacctac gaggacgtgg 480 acaagaggag taacagaata gcccacgctc tcctgaacca ctcctcgctg aaaagggggg 540 acgttgtggc tttgttgatg agcaacgagc ccgacttcgt tcatgtgtgg tttggcctgg 600 ctaaactggg ctgcgtggtg gccttcctca actccaacct tcgcttcgat tccctcctac 660 actgcatcaa cacctgtgaa cccactgccg tggtggtggg cggagatttg cttggaagca 720 tagaagaaat acttcccagt ctcccaaaac acgtcagagt ttggggaatg aaggattctg 780 ttccagaagg tatagattca ctccaagaaa agctgagtct cgcctctgat gagccagtac 840 caccaagcca tcatgtcacc tcaagcctca agtctacttg cctctacatt tttacctctg 900 gaacaacagg tctacccaaa gcagctgtga ttagccagtt gcaagtgttg aagggatctg 960 ttgggctatg ggcgtttggc tgcacagctg atgacatcat ttatataacc ctccctctgt 1020 accacagctc agggtctctc cttggaattg gtggatgtgt tgagttgggc gccacgtgtg 1080 tgctaaagaa gaaattctcc gcaagccagt tttggaatga ttgcaagaag tacaacgtga 1140 ctgtgtttca gtacattggg gaactttgcc gttatctgtg caaacagcct cagagagaag 1200 gggaaaagga ccatcgggta cgtttggcag ttggaaacgg tttgagcagt gatgtgtgga 1260 gacaattttt agacagattt ggaaatatta aaatgtgtga actgtacgga gctaccgaag 1320 gaaacatagt cttcatgaac catactggga agattggatc tgtcgggaga gcaaatttct 1380 tctacagtct ctttttctcc tttgagttga tcaagtatga ctttcagaaa gatgaaccat 1440 ggcggaacgg acaaggctgg tgctcctgtg tgagaaaagg agaacctggt ctcctcattt 1500 ctcgtgtgaa taagaagaat cccttcttcg gctacgctgg ctcggacacg cacacgaaaa 1560 gcaagctgct ctttgatgtg tttcggaagg gagacgtgta cttcaacacc ggagacctaa 1620 tgttccaaga ccaggagaac ttcgtttatt tttgggaccg tcttggagac actttcaggt 1680 ggaaaggaga aaacgtcgca accacagagg tcgctgatgt gcttgggagg ttggacttca 1740 tccaggaagc aaacgtgtac ggtgtgcgtg tgccaggtta tgaaggaaaa gcaggaatga 1800 cttctgttat cctaaaacca aacaagtctt tagacttaga aaaaatgtac aaccaagtgg 1860 tgacatctct gccagcttac gcctgcccac tgtttttaag aattcaggac aaaatggaaa 1920 ctacagggac attcaagcta aagaagctac aactggtgga agaaggattt gatccgctga 1980 agatttctga cccgctttac tttatggata acttgaaaaa atcttatgtc ccattgaccg 2040 aagagattta taatcagata atgtcagagg aagttaaact gtaaagactg tctttgtggg 2100 actttgatga cttcctggga aagatgaagg aagattcgtg agcttccttg tggacaatca 2160 gggaggagtt ccttgcatta atcaatcata aatagaaaga aaattgtaca tgaagaatgc 2220 tttgtagacc caagctttca aggcccccac tctgcagcac agtgggccat gaagtgggag 2280 ctgtttgcct cgtggttatg ttatgaggct ggcttgagga tgccgcttac agacgctgcc 2340 cggagtcacc aggaagcagc atacttcata gcatgagccc agagtacagc gatttctgaa 2400 tgcgtttggg aagtaaaagc caacaggcca tagtattacc acctgactcc gggactcggg 2460 gaaatgtgag gatttactct gaagcgagat ggggaagcag tgttcagcag gcgatgcatt 2520 tccttcgcaa gcagaagttc cttgagttta atgaggctta aatttgcttt gattgacata 2580 aactttagct gttttttt 2598

Claims

Fatp4(fatty acid transport protein 4)를 유효성분으로 포함하는 태반 기능 평가용 바이오마커 조성물로서,
상기 태반 기능이란 태반이 태아에게 지방산을 수송하는 기능인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 Fatp4는 단백질 또는 mRNA인 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가용 바이오마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 Fabp3(fatty acid binding protein 3), Fabp4(fatty acid binding protein 4) 및 Fatp6(fatty acid transport protein 6)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가용 바이오마커 조성물.
태반 기능 평가 방법으로,
피검체로부터 시료를 수득하는 단계;
Fatp4(fatty acid transport protein 4)의 발현 수준을 측정하는 단계;및
Fatp4의 발현 수준이 감소된 경우, 태반이 비정상적으로 기능하는 것으로 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며,
상기 태반 기능이란 태반이 태아에게 지방산을 수송하는 기능인 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가 방법.
제4항에 있어서,
상기 발현 수준은 단백질 또는 mRNA 발현 수준인 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가 방법.
제5항에 있어서,
상기 단백질 발현 수준은 Fatp4 단백질에 특이적인 항체로 측정하는 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가 방법.
제5항에 있어서,
상기 mRNA 발현 수준은 Fatp4 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머로 측정하는 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가 방법.
제4항에 있어서,
상기 시료는 태반 조직인 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가 방법.
제8항에 있어서,
상기 태반 조직은 태반 미로층(labyrinthine layer) 조직인 것을 특징으로 하는, 태반 기능 평가 방법.
삭제
Rb1 유전자 결손 동물모델에 후보 약물을 투여하는 단계;
Fatp4의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
후보 약물을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 Fatp4의 발현 수준을 증가시키는 후보 약물이 태반의 기능을 개선시키는 것으로 선별하는 단계를 포함하며,
상기 태반 기능이란 태반이 태아에게 지방산을 수송하는 기능인 것을 특징으로 하는, 태반 기능 조절용 물질 스크리닝 방법.
제11항에 있어서,
상기 발현 수준은 단백질 또는 mRNA 발현 수준인 것을 특징으로 하는, 태반 기능 조절용 물질 스크리닝 방법.
제12항에 있어서,
상기 단백질 발현 수준은 Fatp4 단백질에 특이적인 항체로 측정하는 것을 특징으로 하는, 태반 기능 조절용 물질 스크리닝 방법.
제12항에 있어서,
상기 mRNA 발현 수준은 Fatp4 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머로 측정하는 것을 특징으로 하는, 태반 기능 조절용 물질 스크리닝 방법.