KR101589970B1

KR101589970B1 - 가금류의 환경 스트레스 진단용 조성물 및 진단용 키트, 가금류의 환경스트레스 가능성 예측방법

Info

Publication number: KR101589970B1
Application number: KR1020140155601A
Authority: KR
Inventors: 최양호; 김연화; 윤형숙; 김지민
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2016-02-01

Abstract

본 발명은, 가금류에 있어서 환경 스트레스 진단용 조성물에 있어서, 하나 이상의 자궁 단백질이 환경 스트레스 가능성이 높을 때 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 하나 이상의 자궁 단백질이 환경 스트레스 가능성이 높을 때 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 가금류의 환경 스트레스 가능성을 예측하는 방법으로서, 하나 이상의 자궁 단백질의 발현 증가는 가금류의 스트레스 가능성이 높음을 나타내는 표지로서 사용되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 가능성 예측방법을 제공한다.
가금류의 환경 스트레스 가능성을 예측하는 방법으로서, 하나 이상의 자궁 단백질의 감소는 가금류의 스트레스 가능성이 높음을 나타내는 표지로서 사용되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 가능성 예측방법을 제공한다.

Description

가금류의 환경 스트레스 진단용 조성물 및 진단용 키트, 가금류의 환경스트레스 가능성 예측방법{Diagnostic compositions and kit including the compositions for environmental stress in poultry, and Method for prediction of Environmental stress in poultry by using the compositions and the kit}

본 발명은 축산기술분야의 기술로서 가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물, 진단용 조성물 및 진단용 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 스트레스를 받은 가금류의 자궁 단백질과 스트레스를 받지 않은 가금류의 자궁 단백질의 발현 차이를 파악하고, 이를 이용한 가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물, 진단용 조성물 및 진단용 키트, 가금류의 환경스트레스 가능성 예측방법에 관한 것이다. 이를 통해 최종적으로 가금류의 육질, 난의 품질과 가금류의 복지를 사후적으로 평가하는 방법에 관한 것이다.

스트레스는 동물의 면역력을 감소시키고 양적 및 질적 생산성을 저하시킨다. 스트레스 받은 산란계에서 산란율과 난질이 저하된다. 산란계에게 스트레스를 가하면 혈중 코르티코스테론(corticosterone), 글루코스, 콜레스테롤의 농도가 변화되고, 비장, 간 및 F-낭의 무게가 변한다는 것이 알려져 있다.

스트레스는 산란계의 초산일령을 지연시키고 산란 피크기간을 단축시키며, 계란을 생산하는 기관, 즉 난관과 난소의 무게를 감소시킨다. 이러한 결과와 일치하게 스트레스는 난소에서 대형 난포수를 감소시키고 폐색난포수를 증가시키며, 그럼으로써 번식관련 스테로이드 호르몬 (테스토스테론, 프로제스테론 및 에스트로젠)의 혈장농도를 감소시킨다. 스트레스는 난소의 유전자발현을 감소시키며, 난관과 난소에서 단백질발현에 영향을 미칠 수 있음이 보고되었다.

스트레스는 산란계의 계란 형성에 영향을 미치는 중요한 요인 중 하나이고, 또한 난관과 난소 내의 단백질과 유전자 발현에도 주요하게 작용한다. 난관의 구성요소중의 하나인 자궁은 난각을 만드는 장소이다. 계란의 질을 판단하는 주요한 항목인 난각은 어미의 상태에 따라서도 변한다. 산란계에서 스트레스 호르몬으로 알려져있는 코르티코스테론(corticosterone)의 처리는 난각의 질을 판단하는 지표인 난각강도, 난각무게, 그리고 난각두계에 영향을 주고, 그로 인하여 산란계는 연란, 파란, 이상란을 생산한다. 비정상란이 생산되는 원인으로는 코르티코스테론이 산란계의 난관에서 생성되는 미네랄 그리고 단백질 합성에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 더욱이, 산란계에서 melengestrol acetate 또는 사료의 급여를 중단하면 환우상태로 접어든다. 산란계에게 환경 스트레스 중에 하나인 환우기간 동안 산란계의 난관, 난백분비부 그리고 난관분비부의 무게는 감소된다.

또한, 스트레스를 받은 산란계에서 산란율과 난질이 저하되고, 코르티코스테론(corticosterone; CORT), 글루코스(glucose), 콜레스테롤(cholesterol)의 농도가 변화되고, 비장, 간 및 F-낭의 무게가 변한다는 것이 여러 연구를 통해 밝혀졌다. 또한 산란계에 있어서 스트레스는 초산일령을 지연시키고, 산란 피크 기간을 단축시키며, 계란을 생산하는 기관, 즉 난관과 난소의 무게를 감소시킨다. 이러한 결과와 일치하게 스트레스는 난소에서 대형 난포수를 감소시키고, 폐색난포수를 증가시키며, 번식관련 스테로이드 호르몬인 테스토스테론(testosterone), 프로제스테론(progesterone) 및 에스트로젠(estrogen)의 혈장농도를 감소시킨다. 또한 난소의 유전자 발현을 감소시키며, 난관과 난소에서 단백질 발현에 영향을 미친다.

최근, 프로테옴(Proteome) 분석이 단백질 레벨에서 차등적으로 유전자 발현을 분석하고 바이오 마커(marker)를 동정하는 수단으로 소개되고 있다. 그러나, 단백체(Proteomis) 연구는 현재까지 질병관련 연구를 위주로 발달하여 왔으며, 환경 스트레스에 대한 단백체 연구는 극히 미비한 실정이다.

따라서 본 발명에서는 스트레스 호르몬의 일종인 코르티코스테론을 닭의 사료에 배합한 후 급여한 후 발현 정도에 차이가 나는 자궁 단백질을 확인하여 닭에 있어서의 스트레스 진단용 마커 조성물, 진단용 조성물 및 진단용 키트, 가금류의 환경스트레스 가능성 예측방법을 제공하고자 한다.

Agarwal, R., K.V.Sastry, V. Tripathi, R. Singh, R. Saxena, J. Mohan, and R. P. Singh. 2013. Expression profile of luteinizing hormane receptor gene in hierarchal follicles and regressing oviduct tissues of White Leghorn hens during moulting. Reprod Domest Anim 48:278-283. doi 10.1111/j.1439-0531.2012.02145.x Ahmed, A. A., W. Ma, Y. Ni., S. Wang, and R. Zhao. 2014. Corticosterone in ova modifies aggressive behaviors and reproductive performances through alterations of the hypothalamic- pityitary-gonadal axis in the chichen. Anim Repord Sci 14:193-201. doi 10.1016/j.anireprosci.2014.02.013 Bakst, M. R. 1998. Structure of the avuan oviduct with emphasis on sperm storage in poultry. J Exp Zool 282:618-626 Heryanto, B., Y. Yoshimura, and T. Tamura. 1997. Cell proliferation in the process of oviducal tissue remodeling during induced molting in hens. Poult Sci 76:1580-1586. Klingensmith, P. M., P. Y. Hester, and E. K. Wilson. 1984. Relationship of plasma corticosterone and adrenal cholesterol and corticosterone to the production of soft-shelled and shell-less eggs. Poult Sci 63:1841-1845 Koch, J. M., J. S. Moritz, D. C. Lay, Jr., and M. E. Wilson. 2007. Effect of melengestrol acetate as an alternative to induce molting in hens on the expression of yolk proteins and turnover of oviductal epithelium. Anim Reprod Sci. 102:14-23. Love, O. P., K.E. Wynne-Edwards, L. Bond, and T.D. Williams. 2008. Determinants of within- and aming-clutch variation in york corticisterone in the European statling. Horm behav 53:104-111. doi 10.1016/j.yhb도.2007.09.007 Pitk, M., V. Tilgar, and R. Mand. 2012. Acute stress affects the corticosterone level in bird eggs: a case study with great tits(parys major) Horm Behav 62:475-479. doi 10.1016/j.yhbdh.2012.08.004 Rubolini, D., M. Romano, G. Boncoraglio, R. P. Ferrari, R. Martinelli, P. Galeotti, M. Fasola, and N. Saino. 2005. Effects of elecated egg corticosterone levels on behavior, growth, and immunity of tellow-legged gull(Larus michahellis) chicks. Horm Behav 47:592-605

이에 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 가금류의 환경 스트레스에 특이적인 자궁 단백질을 이용한 환경스트레스 진단용 마커 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 자궁 단백질에 대한 항체를 이용한 환경스트레스 진단용 조성물 및 진단용 키트를 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 목적은 환경스트레스에 따른 가금류의 자궁 단백질 발현양의 변화 여부를 검출하고, 이를 이용하여 가금류의 환경스트레스 가능성 예측방법을 제공하는 데에 있다.

상기와 같은 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은, 가금류에 있어서 환경 스트레스 진단용 마커 조성물에 있어서, 서열번호 1의 Vinculin(VCL), 서열번호 2의 Glutathione S-transferase omega-1(GSTO1), 서열번호 3의 UDP-glucose 4-epimerase isoformX2(GALE), 서열번호 4의 Argininosuccinate synthase(ASS1), 서열번호 5의 Pyridoxal kinase isoform 1(PDXK), 서열번호 6의 Chromosome 1 open reading frame, human C11orf54(C11orf54) 및 서열번호 7의 UPF0553 protein C9orf64 isoform 1(C9orf64)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 자궁 단백질이 환경 스트레스 가능성이 높을 때 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물에 있어서, 서열번호 8의 Acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex(DLAT), 서열번호 9의 Alpha-enolase(ENO1), 서열번호 10의 Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial precursor(PDHA1), 서열번호 11의 Succinyl-CoA:3-ketoacid-coenzym A transferase 1, mitochondrial(SCAKCA), 서열번호 12의 Long-chain specific acryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial(ACADL), 서열번호 13의 Enonyl-CoA hydratase, mitochondrial precursor(ECHS1), 서열번호 14의 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydogenase, mitochondrial(ALDH4A1) 및 서열번호 15의 Guanine deaminase(GDA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 자궁 단백질이 환경 스트레스 가능성이 높을 때 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 가금류의 환경 스트레스 가능성을 예측하는 방법으로서, 서열번호 1의 Vinculin(VCL), 서열번호 2의 Glutathione S-transferase omega-1(GSTO1), 서열번호 3의 UDP-glucose 4-epimerase isoformX2(GALE), 서열번호 4의 Argininosuccinate synthase(ASS1), 서열번호 5의 Pyridoxal kinase isoform 1(PDXK), 서열번호 6의 Chromosome 1 open reading frame, human C11orf54(C11orf54) 및 서열번호 7의 UPF0553 protein C9orf64 isoform 1(C9orf64)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 자궁 단백질의 발현 증가는 가금류의 스트레스 가능성이 높음을 나타내는 표지로서 사용되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 가능성 예측방법을 제공한다.

또한, 가금류의 환경 스트레스 가능성을 예측하는 방법으로서, 서열번호 8의 Acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex(DLAT), 서열번호 9의 Alpha-enolase(ENO1), 서열번호 10의 Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial precursor(PDHA1), 서열번호 11의 Succinyl-CoA:3-ketoacid-coenzym A transferase 1, mitochondrial(SCAKCA), 서열번호 12의 Long-chain specific acryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial(ACADL), 서열번호 13의 Enonyl-CoA hydratase, mitochondrial precursor(ECHS1), 서열번호 14의 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydogenase, mitochondrial(ALDH4A1) 및 서열번호 15의 Guanine deaminase(GDA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 자궁 단백질의 감소는 가금류의 스트레스 가능성이 높음을 나타내는 표지로서 사용되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 가능성 예측방법을 제공한다.

이와 같이 본 발명에 의하면, 가금류의 자궁 단백질 차등발현 분석을 통하여 특정 자궁 단백질 성분의 발현의 증감 여부를 분석할 수 있기 때문에 가금류의 스트레스의 유무를 판단할 수 있으며 상기 자궁 단백질은 가금류의 육질 또는 난의 품질 분석에 새로운 지표로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 자궁 단백질을 기초로 제조된 항체는 가금류의 환경 스트레스를 진단 및 가금류의 육질과 난의 품질을 분석할 수 있는 immunoassay 키트(ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor 등)에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 보다 높은 특이도와 민감도를 나타내는 항체의 개발을 통해 다양한 환경 스트레스 진단 및 가금류 육질 및 난의 품질 분석 스펙트럼을 갖는 단백질 칩 개발에 이용될 수도 있다.

본 발명은 가금류의 환경스트레스에 특이적인 진단용 마커 조성물, 진단용 조성물 및 진단용 키트, 가금류의 환경 스트레스 가능성 예측방법을 제공하여 가금류에 있어서 스트레스의 유무를 판단할 수 있으며, 환경스트레스 유무 판단을 통해 환경 스트레스 유발인자의 파악이 가능하다. 즉 가금류의 사육환경과 스트레스 간의 상관관계 파악이 가능하고, 이를 통해 가금류의 사육환경에서 환경스트레스를 유발하는 인자가 무엇인지 파악하는 것이 가능하다. 파악된 가금류의 환경스트레스 유발인자 제거를 통해 가금류의 사육환경 개선, 가금류의 면역력 개선을 통한 각종 질환 예방, 수명 연장, 가금류의 육질 개선, 가금류의 난품질 개선을 이룰수 있다. 가금류의 환경스트레스 유무 판단을 통해 동물복지 향상을 기할 수 있다. 또한 가금류의 환경스트레스 예측을 통해 보다 우수한 가금을 선발하여 개량할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 시험 시작 후 2주일째의 자궁을 수집하여 SDS-PAGE를 실시한 결과, 37~50, 20~25kD에서의 변화를 관찰한 사진이다.
도 2는 이차 전기영동을 실시하고, 이미지 마스터(Image master)로 2DE gel을 분석한 결과 중 컨트롤(control) 그룹의 사진이다.
도 3은 이차 전기영동을 실시하고, 이미지 마스터(Image master)로 2DE gel을 분석한 결과 중 스트레스(stress) 그룹의 사진이다.
도 4는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 297(VCL 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 5는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 34(GSTO1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 6은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 274(DLAT 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 7은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 166(ENO1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 8은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 99(GALE 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 9는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 143(PDHA1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 10은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 223(SCAKCA 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 11은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 140(ACADL 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 12는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 339(ECHS1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 13은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 158(ASS1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 14는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 231(ALDH4A1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 15는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 173(GDA 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 16은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 87(PDXK 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 17은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 92(C11orf54 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.
도 18은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 94(C9orf64)의 차이를 나타낸 표이다.
도 19는 대조구와 실험구의 단백질과 유전자의 분석에 필요한 정보를 나타낸 표이다.
도 20은 2D 전기영동 후 단백질을 질량분석기(Mass Spectrometry)로 분석한 표이다.
도 21은 단백질 발현 분석에서 유의하게 증가된 단백질을 qPCR로 분석한 표이다.
도 22는 단백질 발현 분석에서 유의하게 감소된 단백질을 qPCR로 분석한 표이다.

본 발명은, 가금류에 있어서 환경 스트레스 진단용 마커 조성물에 있어서, 서열번호 1의 Vinculin(VCL), 서열번호 2의 Glutathione S-transferase omega-1(GSTO1), 서열번호 3의 UDP-glucose 4-epimerase isoformX2(GALE), 서열번호 4의 Argininosuccinate synthase(ASS1), 서열번호 5의 Pyridoxal kinase isoform 1(PDXK), 서열번호 6의 Chromosome 1 open reading frame, human C11orf54(C11orf54) 및 서열번호 7의 UPF0553 protein C9orf64 isoform 1(C9orf64)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 자궁 단백질이 환경 스트레스 가능성이 높을 때 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.

본 발명의 자궁 단백질은 자궁의 모든 부분에서 발현되는 단백질을 의미하며, 본 발명의 실시예에서는 자궁의 난각분비부 단백질을 이용하였다. 하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 재조합 항체일 수 있으나, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

폴리클로날 항체는 당업자에 알려진 종래방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등과 같은 포유동물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 면역원은 근내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등의 방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여된다. 외부숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리정제한다.

모노클로날 항체는 당업자에 잘 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술(Koeher and Milstein (1975) Nature, 256:495 및 Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511)에 의해 제조될 수 있다. 보다 구체적으로, 먼저 순수한 바이오마커 단백질을 약 20 ㎍을 얻어서 Balb/C 쥐 등과 같은 적합한 숙주 동물에 면역화를 시키거나 펩타이드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 숙주 동물에 면역화시킨다. 그 후에 쥐 등의 숙주 동물에서 분리된 항체-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 폴리에틸렌글리콜 이용법과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시켜 불멸화된 하이브리도마를 생성한다. 이 후, ELISA 방법을 사용하여 원하는 모노클노날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 모노클로날 항체를 분리 정제한다. 상기 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

또한 모노클로날 항체는 당업자에게 잘 알려진 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 보다 구체적으로, 파지 항체 라이브러리 방법은 바이오마커 단백질에 대한 항체 유전자(Single chain fragment variable, scFv 형태)를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현함으로서 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 상기 바이오마커 단백질과 결합하는 모노크로날 항체를 분리, 제작하는 방법이다.

상기 방법으로부터 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리할 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 키트에 포함되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 있다.

본 발명의 진단 키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조되며, 이러한 키트에 통상적으로 포함되는 동결건조형태의 항체, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등 이외에 항원-항체 결합체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질, 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescent sources), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 가금류의 환경 스트레스에 특이적으로 발현하는 자궁 단백질의 발현양의 변화 여부를 검출하는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스를 분석하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 가금류의 환경 스트레스에 특이적으로 발현하는 자궁 단백질의 발현양의 변화 여부를 검출하는 것을 특징으로 하는 가금류의 육질과 난의 품질을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 분석 방법들에서, 상기 자궁 단백질의 발현양의 변화 여부를 검출하는 단계는 가금류의 자궁으부터 이차원 전기영동(2-DE)으로 바이오마커 단백질의 존재를 직접 검출하거나, 가금류의 자궁을 상기 자궁 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원항체반응을 통해 자궁 단백질의 존재를 간접적으로 확인한다.

항체를 이용하여 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 항체결합 magnetic particle을 tube에 결합시킨 다음 antigen-tracer와 난분해성 오염물질을 서로 경쟁적으로 반응시켜 효소반응을 유발시켜 정량하는 magnetic particle법, 항체결합 latex particle을 이용한 latex particle법, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 분석 방법들을 통하여, 스트레스를 받은 가금류의 자궁과 스트레스를 받지 않은 가금류의 자궁에서 차등 발현되는 자궁 단백질의 변화를 판단하여서 가금류의 환경 스트레스 예측, 가금류의 육질 및 난의 품질을 분석할 수 있다.

본 발명에서 자궁 단백질의 발현양이 변화한다는 것은 자궁 단백질의 발현양이 증가 또는 감소된다는 것을 의미한다.

실시예 1: 동물실험

47주령의 Single Comb Brown Hy-Line Leghorn hens 40 수를 크기가 동일한 2개의 사육실에 설치된 4칸이 한 조인 3단 직립형 케이지에 1칸에 1수씩 개별적으로 수용하였다. 사육실의 온도는 18 내지 22℃를 유지하였고, 오전 6시에 점등되어 오후 9시에 소등(15시간 점등)되었다. 시험기간 동안 사료와 물은 제한 없이 공급되었다. 두 처리구로 분리하여 2주간의 적응기간 후, 한 처리구(대조구)에는 컨트롤 (control)사료(사료 1㎏에 0㎎의 코르티코스테론 포함)가, 나머지 한 처리구(실험구)에는 실험사료(1kg에 30mg의 코르티코스테론이 포함)가 2 주 동안 공급되었다.

컨트롤 사료에는 에탄올(ETOH) 500㎖를 실험사료는 99.5% EtOH 500㎖에 815㎎ 코르티코스테론(92%, C2505, 시그마, 미국)을 완전히 녹인 후, 25㎏ 일반사료와 함께 혼합기에서 30분 이상 배합하여 제조되었다.

실시예 2 : 난각분비부 적출

컨트롤 사료 또는 실험사료 개시 후, 2주일에 산란계의 자궁을 수거한 후 분석시까지 -80℃에 보관하였다.

실시예 3: 단백질 추출

실시예 2를 통하여 분리된 산란계의 자궁 중 100 내지 200mg의 자궁을 샘플 양 5배의 lysis buffer A(1% sodium dodecyl sulfate(SDS), 1mM phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF), protease inhibitor coctale, 100mM Tris-HCl(pH 6.8))에 넣고 균질화시킨다. Lysis Buffer A와 같은 양의 lysis buffer B(7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 0.1M dithiothreitol(DTT), 1mM PMSF, protease inhibitor cocktail, 40 mM Tris-HCl(pH 6.8))를 넣고 상온에서 1시간 동안 혼합하였다. 잠시 동안 sonication 시킨 후 상온에서 1시간 동안 incobation 하였다. 잠시 동안 sonication 시킨 후 상온에서 1시간 동안 incubation 하였다. 15,000 x g, 4℃, 20분 동안 원심분리 시킨 후 4℃에서 1시간 동안 incubation 시킨 후 15,000 x g, 4℃, 20분 동안 한번 더 원심분리하였다. 상층액인 수용성 단백질을 2DE Quant kit(GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sweden)를 이용하여 정량을 하였다.

실시예 4: SDS-PAGE 분석

5ug의 soluble protein을 sample buffer(2% SDS, 10% glycerol, 500mM Tris-HCl(pH 6.8))에 혼합하여 12% SDS polyacrylamide gel에 20 mA에서 3시간 동안 전기영동을 한 후 은염색(silver staning)을 하였다.

실시예 5: Twe dimensional electrophoresis(2DE) 분석

100ug의 soluble protein을 rehydration buffer(7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 2.5% DTT, 10% isopropanol, 5% glycerol 및 2% IPG buffer)와 혼합하였다. pH 4 내지 10, non-linear(NL)의 18cm IPG strip을 이용하여 12시간 동안 단백질을 rehydration하였다. 단백질을 pH별로 1차 분리하기 위해 IPGphor 3 system (GE amersharm)을 사용하여 50V에서 30분, 100V에서 30분, 250V에서 1시간, 9시간 동안 8,000V까지 천천히 전압을 올린 후 8,000V에서 6시간 동안 focusing하였다. Focusing이 끝난 IPG strip을 15분 동안 equilibration buffer(6M urea, 50mM Tris-HCl(pH 8.8), 30% glycerol, 2% SDS 및 bromophenol blue)와 1% DTT를 넣고 1차 equilobration을 실시하였고, 2차 wquilibration은 2.5% iodoacetamide을 넣고 실시하였다. 그리고 단백질을 크기 별로 2차 분리를 하기 위하여 12% SDS polyacrylamide gels을 제조하였다. SDS-PAGE gel을 이용하여 20mA에서 15시간 동안 전기영동을 한 후 silver stain을 실시 하였다. Image master(Image master 2D Plantinum v7.0, GE)을 이용하여 두 처리구간의 단백질 발현을 비교 분석하였다.

실시예 6: Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time-ofFlight Mass Spectrometry(MALDI-TOF/MS)와 MALDI-TOF/TOF/MS/MS 분석

Pipet tip을 이용해 원하는 spot을 잘라낸 후 tube에 수집하였다. 30mM potassium ferricuanide, 100mM sodiumthiosulfate pentahydrate를 첨가하여 silver dye를 gel에서 빠지게 한 후 완전히 건조시켰다. 50 내지 100ul의 10mM DTT / 0.1M ABC(ammonium vicarbonate)를 첨가한 후 56℃에서 약 45분 동안 반응시켰다. 상층액을 제고하고 50 내지 100uM의 55mM lodoacetamide / 0.1M ABC를 첨가한 후 약 30분 동안 반응시킨 후 완전히 건조시켰다. Trypsin digestion buffer(0.0012ug/uL in 25mM NH₄HCO₃(pH7.8))를 3uL첨가 후 37℃에서 overnight 하였다. Sample에 extraction solution(acetonitrile : water : TFA = 66 : 33 : 0.1)처리를 하여 gel에서 peptide를 추출하였다. 추출된 peptide solution 과 matrix solution (α-Cyano--4-hydroxy-cinnmic acid)을 혼합한 후 MALDI TOF/TOF sample plate에 분주하고 ABI 4800 Plus TOF-TOF Mass Spectrometer(Applide Biosystems, Framingham. MA, USA)를 이용하여 분석하였다. MS/MS spectra를 Uniprot database를 이용하여 검색하였다.

실시예 7: Revers Transcription (RT) and Real-time Quantitative PCR(qPCR) 분석

난각분비부로부터 RNA를 추출하기 위해 약 100mg의 조직과 RNA 추출 kit(Easy-spin^TM total RNA extraction kit, Intron, Korea)를 사용하였다. RNA의 농도는 spectrophotometer를 이용하여 260nm의 흡광도에서 측정하였다(Nanodrop200C, Thermo scientific, USA).

RNA의 질을 측정하기 위하여 RNA를 1% agarose gel에 로딩하여 18S와 28S의 밴드를 확인하였다. cDNA합성 kit(PrimeScript^TM 1st strand cDNA synthesis kit, Takara, Japan)를 사용하여 RNA를 cDNA로 역전사하였다. 각 primer의 반응 조건을 확인하기 위하여 cDNA를 PCR kit(Accupower hotstart PCR premix, Biomeer, Korea)를사용하여 유전자를 증폭시킨 후 1.5% agarose gel에 로딩하여 유전자의 밴드를 확인하였다. Quantitative PCR(qPCR) 분석은 Power SYBR Green PCR Mater Mix(Applied Biosystems, UK)와 Step One Plus Real-time PCR System(Applied Biosystems, UK)를 이용하였고, housekeeping gene으로는 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 사용하였다.

실시예 8: 통계 분석

각 처리구 당 3개의 개체로 2DE 분석과 intensity를 측정하였고, 두 처리구간의 차등발현 유무는 t-test로 유의성이 검정되었다. 모든 실험 data는 평균 ± 표준오차로 표시하였다. 독립적인 컨트롤과 스트레스 집단들 간의 평균의 동일성에 대한 검증을 실시하여 P-value를 확인하였다. P-value가 0.05 이하인 것은 두 집단의 평균이 유의하게 차이가 있다 라는 것을 의미한다.

실시예 9: 결과

도 1은 시험 시작 후 2주일째의 자궁을 수집하여 SDS-PAGE를 실시한 결과, 37 내지 50, 20 내지 25kD에서의 변화를 관찰한 사진이다. 도 1을 참조하면, 시험 히작 후 2주일째의 자궁을 수집하여 SDS PAGE를 실시한 결과, 37 내지 50, 20 내지 25kD에서 변화가 관찰되었다.

도 2는 이차 전기영동을 실시하고, 이미지 마스터(Image Master)로 2DE gel을 분석한 결과 중 컨트롤 그룹의 사진이다.

도 3은 이차 전기영동을 실시하고, 이미지 마스터(Image master)로 2DE gel을 분석한 결과 중 스트레스(stress) 그룹의 사진이다.

도 4는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 297(VCL 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 5는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 34(GSTO1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 6은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 274(DLAT 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 7은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 166(ENO1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 8은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 99(GALE 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 9는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 143(PDHA1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 10은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 223(SCAKCA 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 11은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 140(ACADL 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 12는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 339(ECHS1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 13은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 158(AAS1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 14는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 231(ALDH4A1 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 15는 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 173(GDA 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 16은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 87(PDXK 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 17은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 92(C11orf54 단백질)의 차이를 나타낸 표이다.

도 18은 대조구와 실험구의 단백질 스팟 번호 94(C9orf64)의 차이를 나타낸 표이다.

도 19는 단백질 발현 분석에서 유의하게 증가 또는 감소된 단백질을 바탕으로 29개 유전자의 발현을 qPCR로 분석한 표이다.

도 20은 2D 전기영동 후 단백질을 질량분석기(Mass Spectrometry)로 분석한 표이다.

도 2 내지 20을 참조하면, 이차 전기영동을 실시하고, 이미지 마스터로 2DE gel을 분석한 결과 411개의 spots이 확인되었다. 그 중 코르티코스테론을 섭취한 산란계의 각 단백질 중 278개의 spot들이 그렇지 않은 대조구에 비해 1.2배 이상 증가 또는 감소되었다. 이미지 마스터를 이용하여 한 처리구당 3개의 gel 이미지의 spot 강도를 측정하였고, t-test로 통계적으로 분석하였다. 30개의 단백질 spot이 유의하게 증가하였고, 28개의 단백질 spot이 유의하게 감소하였다(P≤0.05). 이들 spot들을 MALDI TOF-TOF/MS/MS/로 분석하여 Uniprot database로 검색한 결과 36개의 spot이 32가지의 단백질로 동정되었다. 또한, 이들 중 유의성이 있게 감소 또는 증가한 단백질은 15가지로 동정되엇다. 또한, 단백질 발현 분석에서 유의하게 증가 또는 감소된 단백질을 바탕으로 유전자의 발현을 qPCR로 분석하였다.

도 21은 단백질 발현 분석에서 유의하게 증가된 단백질을 qPCR로 분석한 표이다.

상기 도 21을 참조하면 스트레스 환경 하에서 7개의 단백질이 유의적으로 증가하였다.

도 22는 단백질 발현 분석에서 유의하게 감소된 단백질을 qPCR로 분석한 표이다.

상기 도 22를 참조하면 스트레스 환경 하에서 8개의 단백질이 유의적으로 감소하였다.

상기의 분석 결과를 참조하면, 하기의 표 1, 표 2 및 표 3의 총 15가지의 유전자 및 단백질은 스트레스에 특이적으로 증가 또는 감소됨으로써, 닭에 있어서 스트레스에 관련된 유전자 그리고 단백질을 환경스트레스 진단용 마커 조성물로 개발할 수 있다.

상기 표 1, 표 2 및 표 3의 총 15가지 유전자 및 단백질은 스트레스에 특이적으로 증가 또는 감소됨으로써, 닭에 있어서 스트레스 관련된 유전자 및 단백질을 환경 스트레스 진단용 마커 조성물로 개발할 수 있다.

증가되는 단백질 및 유전자는 7가지이다.

1. Vinculin (VCL): VCL단백질은 스트레스에 특이적으로 증가되었다. VCL은 세포골격단백질으로 세포-매트릭스의 결합 그리고 세포-세포결합에 관련이 있는 액틴필라멘트결합단백질이다. 이 단백질의 중요한 역할은 세포의 형태와 위치를 조절한다.

2. Glutathione S-transferase omega-1 (GSTO1): GSTO1단백질 및 유전자는 스트레스에 특이적으로 증가되었다. GSTO1은 GST superfamily에 속해있는 단백질이고, GSTO1 유전자에 의해 encode되는 효소이다. 쥐의 연구에서 GSTO1단백질은 세포의 산화 환원 항상성에서 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

3. Acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex (DLAT): DLAT단백질은 스트레스에 특이적으로 감소되었다. DLAT은 2-oxoacid dehydrogenase family에 속해있고, glycolysis과 citric acid cycle에 연관이 있는 효소이다. Pyruvate dehydrogenase deficiency(피르빈산탈수소 효소결손증)은 유아기때 신경기능의 이상증상으로 유전적질병인 lactic acidosis(유산증)을 발생시킨다.

4. Alpha-enolase (ENO1): ENO1단백질은 스트레스에 특이적으로 감소되었다. ENO1은 glycolytic enzyme(당분해효소)로서 대부분의 조직에서 존재한다. ENO1은 갑상선관련 질병, 천식 그리고 Behet's disease의 자가 항원으로 알려져 있다.

5. UDP-glucose 4-epimerase isoformX2 (GALE): GALE단백질은 스트레스에 특이적으로 증가되었다. UDP-glucose 4-epimerase는 UDP-galactose 4-epimerase 또는 GALE로 명명되어지고, 박테리아, 균, 식물 그리고 포유류 세포의 homodimeric epimerase로 알려져있는 효소이다. 또한 galactose metabolism과 UDP-GaINAc synthesis에 주요한 역할을 한다. 사람의 경우 GALE가 부족 또는 정상적인 기능을 할 수 없을 때 탄수화물 대상이상이 발생되어 Type III galactosemia (제3형의 갈락토스혈증)이 발병할 수 있다.

6.Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial precursor (PDHA1): PDHA1단백질은 스트레스에 특이적으로 감소되었다. PDHA1단백질은 은 PDHA1유전자로부터 encode되는 효소이다. PDHA1은 matrix multienzyme complex (다성분 효소 복합체)로 glycolysis와 the tricarboxylic acid (TCA) cycle에 주요한 역할을 한다.

7. Succinyl-CoA:3-ketoacid-coenzyme A transferase 1, mitochondrial (SCAKCA): SCAKCA단백질 그리고 유전자는 스트레스에 특이적으로 감소되었다. SCAKCA은 OXCT1 유전자로부터 encode되는 단백질로서 3-oxoacid CoA-transferase gene family에 속해있는 효소이다. SCAKCA의 효소가 부족해지면 ketone body catabolism이 비정상적으로 작동한다.

감소되는 단백질 및 유전자는 8개이다.

1. Long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondrial (ACADL): ACADL의 단백질은 스트레스에 특이적으로 감소되었다. ACADL단백질은 acyl-CoA dehydrogenase family에 속해있는 효소로서, 미토콘드리아의 fatty acid -oxidation작용에서 각 cycle마다 꼭 필요한 효소이다. ACADL이 부족하게 되면 지방산의 산화작용이 감소되어 대사성 장애가 발생된다.

2.Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial precursor (ECHS 1): ECHS 1의 단백질은 스트레스에 특이적으로 감소되었다. 이 단백질은 fatty acid -oxidation pathway의 두 번째 단계에 존재하는 gene으로부터 encode되는 효소이기 때문에, ECHS 1이 부족하게 되면 지방산의 산화작용이 감소되어 대사성 장애가 발생된다.

3. Argininosuccinate synthase (ASS1): ASS1의 단백질과 유전자는 스트레스에 특이적으로 증가되었다. ASS은 citrulline과 aspartate의 합성을 촉진하는 효소로서 citrulline-NO cycle 반응물질이고, urea cycle의 세 번째 과정에서 필수적으로 필요한 효소이다.

4. Delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase, mitochondrial (ALDH4A1): ALDH4A1단백질은 스트레스에 특이적으로 감소되었다. ALDH4A1은 ALDH4A1 유전자로부터 encode되고 aldehyde dehydrogenase family에 속하는 효소단백질이다. Proline 생합성과정에 주요한 역할을 하는 ALDH4A1가 부족하게 되면 type II hyperprolinemia(II형 고플롤린혈증)이 발생하게 된다.

5. Guanine deaminase (GDA): GDA단백질과 유전자는 스트레스에 특이적으로 감소되었다. GDA는 guanine catabolic process에서 guanine을 xanthine으로 변화시키는 효소단백질이다.

6. Pyridoxal kinase isoform 1 (PDXK): PDXK단백질과 유전자는 스트레스에 특이적으로 증가되었다. PDXK단백질은 PDXK유전자로부터 encode된 효소단백질이다. 세포의 확산에 관련된 물질로만 알려져있다.

7. Chromosome 1 open reading frame, human C11orf54 (C11orf54): C11orf54단백질과 유전자는 스트레스에 특이적으로 증가되었다. C11orf54단백질은 C11orf54유전자로부터 encode된다.

8. UPF0553 protein C9orf64 isoform 1 (C9orf64): C9orf64단백질은 스트레스에 특이적으로 증가되었고 유전자 (P=0.07)또한 스트레스에 특이적으로 증가되는 경향을 보였다. C9orf64유전자는 chromosome 9에 위치하고, LOC84267이라는 단백질을 생성한다.

본 연구의 결과는 corticosterone으로 처리 (스트레스)가 자궁 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있다는 증거를 처음으로 제시한다. 뿐만 아니라 그 외의 사양조건, 즉 환경 스트레스가 직접 자궁 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있다는 것을 제시한다. 이것은 다시 말해서 환경에 의해 자궁 단백질을 구성하는 개별 단백질의 함량이 변할 수 있다는 것을 의미하며 따라서 환경 조건이 가금류의 육질, 난의 품질에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다.

이러한 자궁 단백질은 가금류의 육질 및 난의 품질 평가에 이용될 수 있을 뿐만 아니라 나아가 사육 당시 가금류의 스트레스 상태를 추정하는 지표로 이용될 수 있다. 따라서 가금류의 자궁 단백질을 검정함으로써 사후에 사육단계의 환경에 대한 동물복지를 추정할 수 있는 표식으로 활용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 자궁 단백질은 가금류의 환경스트레스 진단용 조성물로 활용될 수 있다.

이상 상기에 설명한 바와 같이 본 발명은, 스트레스 호르몬의 일종인 코르티코스테론을 사료에 혼합하여 급여함으로 스트레스가 가금류에 미치는 영향에 대해 확인한 발명으로써, 스트레스에 인해 차등적으로 발현되는 유전자를 확인하였으며, 이를 통해 닭의 스트레스 가능성 여부를 확인할 수 있는 스트레스 진단용 마커 조성물, 진단용 조성물 및 키트, 그리고 스트레스를 판단할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

<110> Gyeongsang National University Foundation of University-Industry cooperation <120> Diagostic compositions and kit including the compositions for environmental stress in poultry and Method of prediction of Environmental stress in poultary by using the compositions and the kit <130> 2014-11-10 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1135 <212> PRT <213> VCL <400> 1 Met Pro Val Phe His Thr Arg Thr Ile Glu Ser Ile Leu Glu Pro Val 1 5 10 15 Ala Gln Gln Ile Ser His Leu Val Ile Met His Glu Glu Gly Glu Val 20 25 30 Asp Gly Lys Ala Ile Pro Asp Leu Thr Ala Pro Val Ser Ala Val Gln 35 40 45 Ala Ala Val Ser Asn Leu Val Arg Val Gly Lys Glu Thr Val Gln Thr 50 55 60 Thr Glu Asp Gln Ile Leu Lys Arg Asp Met Pro Pro Ala Phe Ile Lys 65 70 75 80 Val Glu Asn Ala Cys Thr Lys Leu Val Arg Ala Ala Gln Met Leu Gln 85 90 95 Ala Asp Pro Tyr Ser Val Pro Ala Arg Asp Tyr Leu Ile Asp Gly Ser 100 105 110 Arg Gly Ile Leu Ser Gly Thr Ser Asp Leu Leu Leu Thr Phe Asp Glu 115 120 125 Ala Glu Val Arg Lys Ile Ile Arg Val Cys Lys Gly Ile Leu Glu Tyr 130 135 140 Leu Thr Val Ala Glu Val Val Glu Thr Met Glu Asp Leu Val Thr Tyr 145 150 155 160 Thr Lys Asn Leu Gly Pro Gly Met Thr Lys Met Ala Lys Met Ile Asp 165 170 175 Glu Arg Gln Gln Glu Leu Thr His Gln Glu His Arg Val Met Leu Val 180 185 190 Asn Ser Met Asn Thr Val Lys Glu Leu Leu Pro Val Leu Ile Ser Ala 195 200 205 Met Lys Ile Phe Val Thr Thr Lys Asn Thr Lys Ser Gln Gly Ile Glu 210 215 220 Glu Ala Leu Lys Asn Arg Asn Phe Thr Val Glu Lys Met Ser Ala Glu 225 230 235 240 Ile Asn Glu Ile Ile Arg Val Leu Gln Leu Thr Ser Trp Asp Glu Asp 245 250 255 Ala Trp Ala Ser Lys Asp Thr Glu Ala Met Lys Arg Ala Leu Ala Leu 260 265 270 Ile Asp Ser Lys Met Asn Gln Ala Lys Gly Trp Leu Arg Asp Pro Asn 275 280 285 Ala Pro Pro Gly Asp Ala Gly Glu Gln Ala Ile Arg Gln Ile Leu Asp 290 295 300 Glu Ala Gly Lys Ala Gly Glu Leu Cys Ala Gly Lys Glu Arg Arg Glu 305 310 315 320 Ile Leu Gly Thr Cys Lys Thr Leu Gly Gln Met Thr Asp Gln Leu Ala 325 330 335 Asp Leu Arg Ala Arg Gly Gln Gly Ala Thr Pro Met Ala Met Gln Lys 340 345 350 Ala Gln Gln Val Ser Gln Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Lys Val Glu 355 360 365 Asn Ala Ala Arg Lys Leu Glu Ala Met Thr Asn Ser Lys Gln Ala Ile 370 375 380 Ala Lys Lys Ile Asp Ala Ala Gln Asn Trp Leu Ala Asp Pro Asn Gly 385 390 395 400 Gly Ser Glu Gly Glu Glu His Ile Arg Gly Ile Met Ser Glu Ala Arg 405 410 415 Lys Val Ala Glu Leu Cys Glu Glu Pro Lys Glu Arg Asp Asp Ile Leu 420 425 430 Arg Ser Leu Gly Glu Ile Ser Ala Leu Thr Ala Lys Leu Ser Asp Leu 435 440 445 Arg Arg His Gly Lys Gly Asp Ser Pro Glu Ala Arg Ala Leu Ala Lys 450 455 460 Gln Ile Ala Thr Ser Leu Gln Asn Leu Gln Ser Lys Thr Asn Arg Ala 465 470 475 480 Val Ala Asn Thr Arg Pro Val Lys Ala Ala Val His Leu Glu Gly Lys 485 490 495 Ile Glu Gln Ala Gln Arg Trp Ile Asp Asn Pro Thr Val Asp Asp Arg 500 505 510 Gly Val Gly Gln Ala Ala Ile Arg Gly Leu Val Ala Glu Gly Arg Arg 515 520 525 Leu Ala Asn Val Met Met Gly Pro Tyr Arg Gln Asp Leu Leu Ala Lys 530 535 540 Cys Asp Arg Val Asp Gln Leu Ala Ala Gln Leu Ala Asp Leu Ala Ala 545 550 555 560 Arg Gly Glu Gly Glu Ser Pro Gln Ala Arg Ala Ile Ala Ala Gln Leu 565 570 575 Gln Asp Ser Leu Lys Asp Leu Lys Ala Arg Met Gln Glu Ala Met Thr 580 585 590 Gln Glu Val Ser Asp Val Phe Ser Asp Thr Thr Thr Pro Ile Lys Leu 595 600 605 Leu Ala Val Ala Ala Thr Ala Pro Ser Asp Thr Pro Asn Arg Glu Glu 610 615 620 Val Phe Glu Glu Arg Ala Ala Asn Phe Glu Asn His Ala Ala Arg Leu 625 630 635 640 Gly Ala Thr Ala Glu Lys Ala Ala Ala Val Gly Thr Ala Asn Lys Thr 645 650 655 Thr Val Glu Gly Ile Gln Ala Thr Val Lys Ser Ala Arg Glu Leu Thr 660 665 670 Pro Gln Val Val Ser Ala Ala Arg Ile Leu Leu Arg Asn Pro Gly Asn 675 680 685 Gln Ala Ala Tyr Glu His Phe Glu Thr Met Lys Asn Gln Trp Ile Asp 690 695 700 Asn Val Glu Lys Met Thr Gly Leu Val Asp Glu Ala Ile Asp Thr Lys 705 710 715 720 Ser Leu Leu Asp Ala Ser Glu Glu Ala Ile Lys Lys Asp Leu Asp Lys 725 730 735 Cys Lys Val Ala Met Ala Asn Met Gln Pro Gln Met Leu Val Ala Gly 740 745 750 Ala Thr Ser Ile Ala Arg Arg Ala 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Gly Lys Cys Ile Gly Ala Ile Ala Met Thr Glu Pro 165 170 175 Gly Ala Gly Ser Asp Leu Gln Gly Val Arg Thr Tyr Ala Lys Lys Asp 180 185 190 Gly Ser Asp Trp Ile Leu Asn Gly Ser Lys Thr Phe Ile Thr Asn Gly 195 200 205 Trp Met Cys Asp Val Val Ile Val Val Thr Val Thr Asn Arg Glu Ala 210 215 220 Arg Ser Pro Ala His Gly Ile Ser Leu Phe Leu Val Glu Asn Gly Thr 225 230 235 240 Lys Gly Phe Asn Lys Gly Arg Lys Leu Asn Lys Ile Gly Leu Lys Ala 245 250 255 Gln Asp Thr Ala Glu Leu Phe Phe Glu Asp Val Arg Leu Pro Ala Ser 260 265 270 Ala Leu Leu Gly Lys Glu Asn Lys Gly Phe Tyr Tyr Leu Met Ala Glu 275 280 285 Leu Pro Gln Glu Arg Leu Val Ile Ala Asp Leu Ala Leu Ala Ser Cys 290 295 300 Glu Phe Met Phe Glu Glu Thr Arg Asp Tyr Val Arg Gln Arg Lys Ala 305 310 315 320 Phe Gly Lys Thr Val Ala His Leu Gln Thr Val Gln His Lys Leu Ala 325 330 335 Glu Met Lys Thr Asn Ile Cys Val Gly Arg Ala Phe Leu Asp Asn Cys 340 345 350 Leu Gln Leu His Ser Glu Lys Arg Leu Asp Ser Pro Thr Ala Ser Met 355 360 365 Ala Lys Tyr Trp Ala Ser Asp Leu Gln Asn Ser Val Ala Thr Gln Cys 370 375 380 Val Gln Leu His Gly Gly Ser Gly Tyr Met Trp Glu Tyr Pro Ile Ala 385 390 395 400 Lys Ala Phe Val Asp Ala Arg Val Gln Pro Ile Tyr Gly Gly Thr Asn 405 410 415 Glu Ile Met Lys Glu Leu Ile Ala Arg Glu Ile Val Gly Asp Asn 420 425 430 <210> 13 <211> 301 <212> PRT <213> ECHS1 <400> 13 Met Ala Ala Ser Leu Arg Ala Leu Leu Arg Pro Ser Ala Gly Ala Cys 1 5 10 15 Ala Asp Ala Ala Arg Arg Arg Ala Phe Leu Ala Ala Leu Arg Pro Leu 20 25 30 Val Ala Gly Arg Gly Cys Ser Asp Gly Pro Pro Phe Arg Phe Leu Gln 35 40 45 Val Gln Lys Ala Gly Ala Gly Gly Ser Val Gly Leu Ile Arg Leu Gln 50 55 60 Arg Pro Glu Ala Leu Asn Ala Leu Cys Ala Gly Leu Met Glu Glu Leu 65 70 75 80 Arg Arg Ala Leu Asp Ala Phe Glu Ala Asp Gly Gln Val Gly Ala Ile 85 90 95 Val Ile Thr Gly Ser Glu Lys Ala Phe Ala Ala Gly Ala Asp Ile Lys 100 105 110 Glu Met Gln Asn Lys Thr Phe Gln Glu Cys Tyr Ala Gly Gly Phe Leu 115 120 125 Ala Gly Trp Asp Arg Val Ala Thr Val Arg Lys Pro Thr Ile Ala Ala 130 135 140 Val Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly Cys Glu Leu Ala Met Met Cys 145 150 155 160 Asp Ile Ile Tyr Ala Gly Glu Lys Ala Gln Phe Gly Gln Pro Glu Ile 165 170 175 Leu Leu Gly Thr Ile Pro Gly Ala Gly Gly Thr Gln Arg Leu Thr Arg 180 185 190 Ala Val Gly Lys Ser Leu Ala Met Glu Met Val Leu Thr Gly Glu Arg 195 200 205 Ile Ser Ala Ala Glu Ala Lys Ala Ala Gly Leu Val Ser Lys Val Phe 210 215 220 Pro Val Asp Lys Leu Leu Asp Ala Ala Ile Gly Cys Ala Glu Lys Ile 225 230 235 240 Ala Ala Asn Ser Lys Leu Val Val Ala Met Ala Lys Glu Ser Val Asn 245 250 255 Ala Ala Phe Glu Thr Thr Leu Thr Glu Gly Asn Arg Thr Glu Lys Arg 260 265 270 Leu Phe Tyr Ala Thr Phe Ala Thr Asp Asp Arg Lys Glu Gly Met Thr 275 280 285 Ala Phe Val Glu Lys Arg Lys Ala Asn Phe Thr Asp Ser 290 295 300 <210> 14 <211> 551 <212> PRT <213> ALDH4A1 <400> 14 Met Trp Arg Ala Leu Arg Gly Arg Gly Arg Arg Cys Leu His His Ala 1 5 10 15 Ala Ile Gln Val Thr Asn Glu Pro Ile Leu Glu Phe Lys Pro Gly Ser 20 25 30 Pro Glu Arg Ala Ala Leu Gln Lys Ala Leu Ala Glu Leu Lys Gly Arg 35 40 45 Thr Glu Ser Ile Pro Cys Val Val Gly Gly Glu Glu Val Trp Thr Ser 50 55 60 Ala Val Arg Tyr Gln Leu Ser Pro Phe Asn His Ala His Lys Val Ala 65 70 75 80 Lys Phe Cys Tyr Ala Asp Lys Asp Leu Ile Asn Lys Ala Ile Asn Ala 85 90 95 Ala Val Ala Ala Arg Lys Glu Trp Asp Leu Lys Pro Ile Gln Asp Arg 100 105 110 Ala Gln Ile Phe Leu Lys Ala Ala Asp Met Leu Ser Gly Pro Arg Arg 115 120 125 Ala Glu Val Leu Ala Lys Thr Met Val Gly Gln Gly Lys Thr Val Ile 130 135 140 Gln Ala Glu Ile Asp Ala Ala Ala Glu Leu Ile Asp Phe Phe Arg Phe 145 150 155 160 Asn Ala Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Gly Ser Gln Pro Leu Ser Val 165 170 175 Glu Ala Ser Thr Asn Ser Met Val Tyr Arg Gly Leu Glu Gly Phe Val 180 185 190 Ala Ala Val Ser Pro Phe Asn Phe Thr Ala Ile Gly Gly Asn Leu Ala 195 200 205 Gly Thr Pro Ala Leu Met Gly Asn Val Val Leu Trp Lys Pro Ser Asp 210 215 220 Thr Ala Leu Leu Ser Ser Tyr Ala Val Tyr Lys Ile Leu Leu Glu Ala 225 230 235 240 Gly Leu Pro Pro Asn Val Ile Gln Phe Val Pro Ala Asp Gly Pro Val 245 250 255 Phe Gly Asp Ala Val Thr Ser Ser Glu His Phe Cys Gly Leu Asn Phe 260 265 270 Thr Gly Ser Val Pro Thr Phe Lys Arg Leu Trp Lys Gln Ala Ser Glu 275 280 285 Asn Leu Asp Arg Tyr Arg Ser Phe Pro Arg Leu Ala Gly Glu Cys Gly 290 295 300 Gly Lys Asn Phe His Leu Val His Ser Ser Ala Asp Val Ser Ser Val 305 310 315 320 Val Asn Gly Thr Leu Arg Ser Ala Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Lys Cys 325 330 335 Ser Ala Cys Ser Arg Leu Tyr Ala Pro Arg Ser Leu Trp Pro Gln Ile 340 345 350 Lys Glu Lys Leu Leu Glu Glu Thr Lys Lys Ile Lys Val Gly Asp Pro 355 360 365 Val Gln Asp Phe Gly Thr Phe Phe Ser Ala Val Ile Asp Asp Lys Ser 370 375 380 Phe Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Glu His Ala Lys Thr Ser Pro Asn 385 390 395 400 Leu Ser Ile Leu Ala Gly Gly Gly Cys Asp Asp Ser Val Gly Tyr Phe 405 410 415 Val Glu Pro Cys Ile Val Glu Ser Gln Asp Pro Thr Asp Pro Ile Met 420 425 430 Lys Glu Glu Ile Phe Gly Pro Ile Leu Thr Val Tyr Val Tyr Pro Glu 435 440 445 Glu Arg Tyr Gln Glu Val Leu Glu Leu Ile Asp Thr Thr Thr Pro Tyr 450 455 460 Gly Leu Thr Gly Ala Val Phe Ala Gln Glu Arg Ser Ile Ile Glu Glu 465 470 475 480 Ala Arg Ser Arg Leu Arg Asn Ala Ala Gly Asn Phe Tyr Ile Asn Asp 485 490 495 Lys Ser Thr Gly Ala Val Val Ala Gln Gln Pro Phe Gly Gly Ser Arg 500 505 510 Ile Ser Gly Thr Asn Asp Lys Pro Gly Gly Pro His Tyr Ile Leu Arg 515 520 525 Trp Thr Ser Pro Gln Ala Ile Lys Glu Thr His Val Pro Leu Ser Asp 530 535 540 Trp Arg Tyr Ala Tyr Met Gln 545 550 <210> 15 <211> 450 <212> PRT <213> GDA <400> 15 Met Gly Ser Pro Gln Arg Pro Pro Leu Ala His Val Phe Arg Gly Thr 1 5 10 15 Phe Val His Ser Arg Pro Asp Val Pro Met Glu Ile Leu His Gly Arg 20 25 30 Leu Leu Gly Val Asp Asp Asp Gly Thr Ile Val Phe Leu Glu Glu Ala 35 40 45 Asp Gln Gln Gln Gln Leu Ala Lys Lys Trp Gly Phe Lys Thr Ser Asp 50 55 60 Ile Arg Glu Leu Thr His His Glu Phe Phe Met Pro Gly Leu Val Asp 65 70 75 80 Thr His Ile His Ala Pro Gln Tyr Leu Phe Ala Gly Thr Arg Val Asp 85 90 95 Leu Pro Leu Leu Gln Trp Leu Thr Thr Tyr Thr Phe Pro Thr Glu Ala 100 105 110 Arg Tyr Lys Asp Ser Asp Phe Ala Glu Glu Val Tyr Thr Arg Val Val 115 120 125 Arg Arg Thr Leu Lys Asn Gly Thr Thr Thr Ala Cys Tyr Phe Ala Thr 130 135 140 Ile Tyr Thr Asp Thr Ser Leu Leu Leu Ala Asp Ile Ile Asp Lys Phe 145 150 155 160 Gly Gln Arg Ala Phe Val Gly Lys Val Cys Met Asp Met Asn Asp Ala 165 170 175 Val Pro His Tyr Lys Glu Thr Thr Ala Asp Ser Val Gln Glu Met Glu 180 185 190 Arg Phe Val Lys Glu Leu Leu Glu Arg Gln Tyr Pro Arg Val Leu Pro 195 200 205 Ile Val Thr Pro Arg Phe Gly Pro Ser Cys Thr Glu Asp Leu Leu Arg 210 215 220 Ala Leu Gly Asp Leu Ala Gln Thr His Asp Leu His Val Gln Ser His 225 230 235 240 Ile Ser Glu Thr Glu Glu Glu Leu Lys Val Val Glu Asn Met Phe Pro 245 250 255 Ala Tyr Gln Asn Tyr Thr Asp Leu Tyr Asp Lys Asn Lys Leu Leu Thr 260 265 270 Ser Lys Thr Val Met Ala His Ala Cys His Leu Ser Glu Glu Glu Leu 275 280 285 Glu Leu Phe Asn Leu Arg Gly Ala Ala Val Ala His Cys Pro Ser Ser 290 295 300 Asn Phe Ser Leu His Ser Gly Ile Leu Asn Val Lys Lys Val Leu Lys 305 310 315 320 His Asn Val Lys Val Gly Leu Gly Thr Asp Val Ala Gly Gly Tyr Ser 325 330 335 Ala Ser Met Leu Asp Ala Ile Arg Lys Thr Val Val Ala Ser Asn Ala 340 345 350 Leu Lys Ile Asn Lys Val Ser Glu Ala Gly Leu Thr Leu Lys Glu Ala 355 360 365 Phe Arg Leu Ala Thr Leu Gly Gly Ser Gln Ala Leu Gly Leu Asp Asp 370 375 380 Val Ile Gly Asn Phe Glu Val Gly Lys Glu Phe Asp Ala Leu Leu Ile 385 390 395 400 Asn Thr Lys Ala Ser Asp Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ser Ala Asp Thr 405 410 415 Phe Glu Asp Cys Leu Gln Lys Phe Leu Tyr Leu Gly Asp Asp Arg Asn 420 425 430 Ile Ser Glu Val Tyr Val Ala Gly Lys Gln Val Val Pro Phe Ser Ser 435 440 445 Ser Val 450

Claims

가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물에 있어서,
서열번호 1의 Vinculin(VCL), 서열번호 2의 Glutathione S-transferase omega-1(GSTO1), 서열번호 3의 UDP-glucose 4-epimerase isoformX2(GALE), 서열번호 4의 Argininosuccinate synthase(ASS1), 서열번호 5의 Pyridoxal kinase isoform 1(PDXK), 서열번호 6의 Chromosome 1 open reading frame, human C11orf54(C11orf54) 및 서열번호 7의 UPF0553 protein C9orf64 isoform 1(C9orf64)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 자궁 단백질이 환경 스트레스 가능성이 높을 때 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물.
제1항의 가금류의 환경 스트레스 특이적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 조성물.
제1항의 가금류의 환경 스트레스 특이적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 키트.
가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물에 있어서,
서열번호 8의 Acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex(DLAT), 서열번호 9의 Alpha-enolase(ENO1), 서열번호 10의 Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial precursor(PDHA1), 서열번호 11의 Succinyl-CoA:3-ketoacid-coenzym A transferase 1, mitochondrial(SCAKCA), 서열번호 12의 Long-chain specific acryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial(ACADL), 서열번호 13의 Enonyl-CoA hydratase, mitochondrial precursor(ECHS1), 서열번호 14의 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydogenase, mitochondrial(ALDH4A1) 및 서열번호 15의 Guanine deaminase(GDA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 자궁 단백질이 환경 스트레스 가능성이 높을 때 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 마커 조성물.
제5항의 가금류의 환경 스트레스 특이적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 조성물.
제5항의 가금류의 환경 스트레스 특이적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 가금류의 환경 스트레스 진단용 키트.