CN108434169A - 一种Mir-218-2在胶质细胞瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Mir‑218‑2在胶质细胞瘤中的应用，首先本发明运用定量PCR验证了Mir‑218‑2高度表达于胶质细胞瘤的组织标本和细胞系中；然后通过Transwell小室、划痕实验、细胞骨架染色发现，Mir‑218‑2的过表达能够增加胶质瘤细胞的迁移侵袭能力；接着通过细胞成球、流式检测实验上调Mir‑218‑2能够诱导的胶质细胞瘤在体外和体内的增殖，同时降低β‑lap在胶质瘤细胞中的化学敏感性；最后通过一系列的蛋白实验和在Mir‑218‑2过表达细胞系中重新表达CDC27等试验证明，CDC27是Mir‑218‑2的目的靶基因，并对其可能作用机制进行了研究。

Description

一种Mir-218-2在胶质细胞瘤中的应用

技术领域：

本发明涉及一种Mir-218-2在胶质细胞瘤中的应用，尤其涉及一种Mir-218-2通过靶向抑制CDC27促进胶质细胞瘤生长、转移和耐药的研究及方法。

背景技术：

鉴于高发病率、高复发率以及相对较低的生存预后率，胶质瘤(Glioma)已成为最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，其临床症状主要取决于肿瘤发生部位和肿瘤的占位性病变的体积大小。常见的症状主要有头痛、呕吐、恶心、眩晕、颈部的局部疼痛、行走时容易摔倒，甚至是由于占位性病变导致的失语、偏瘫和精神障碍等。迄今为止，手术，辅以术后的化疗和放疗是胶质瘤的标准治疗方案。对于肿瘤体积较小者，可在保存神经功能完整的前提下，做完全性切除，但对于一般的患者，由于诊断时间较晚，肿瘤呈浸润性生长并与其他正常脑组织间的边界消失，故难以达到完全切除，因此一般都主张标准治疗方案，即术后配合以放射性治疗和化学药物治疗，可延缓复发及延长生存期。对于放射性治疗，不同类型的胶质细胞肿瘤对治疗的敏感性有所不同。对于化学药物治疗，由于血脑屏障的作用，一般以选取能透过血脑屏障的高脂溶性化疗药物为宜。但与此同时，耐药性已成为胶质瘤治疗中的一个显著问题。事实上，尽管这些目前的癌症治疗方法逐年有所提高，但胶质瘤的预后十分恶劣，首次诊断后的五年存活率至今仍然不超过5%。另一个重要问题在于，胶质瘤发病和进展中所潜在的分子机制还未曾得到较为明确的阐明。胶质瘤的显著特点主要包括：由各种细胞遗传学异常和分子遗传变化引起的持续的无序性增殖，特异性激活的侵袭和转移能力，对细胞凋亡机制的逃逸等。因此，探明其中相关的分子机制、找出更多的临床治疗新靶点，成为当今胶质瘤治疗突破的当务之急。生物学标志是隶属于临床症候的子范畴，具有可测量、精确再现以及影响预后的特点。目前主要通过组织、细胞以及体液来确定生物学标志的生物作用和相关过程。系统性的生物学标志可应用于动态性监控和判定特定疾病的易感性和疾病变化进程，从而大大减轻手术和治疗的成本。目前为止，恶性程度较高的胶质瘤的生物学标志物主要有4类： 1p/19q缺失， O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的启动子失活，异柠檬酸脱氢酶1/2的基因突变和微小核糖核酸。

微小核糖核酸(microRNAs)是内源性、大约20个核苷酸的非编码小RNA分子。经由cDNA转录后，长度约为200-300个核苷酸的RNA片段在一系列RNA聚合酶的催化下发生剪切和变形，成为较短的单链非编码microRNA，与目的基因互补配对，构成由RNA诱导的沉默复合体(RISC)，从而在转录水平上影响蛋白的合成，产生系列的作用效应。目的基因与互补配对的microrna结合发生在信使RNA（mRNA）的3’端非编码区域，形成RISC诱导靶基因沉默，使mRNA剪切、翻译受到抑制抑或mRNA转录延迟。因此，通过干扰mRNA导致蛋白翻译的水平下降，并引发一系列的细胞生物程序改变，如增殖、侵袭、转移和细胞凋亡等。在胶质瘤的实体瘤样本中，与正常脑组织相比，几个microRNA已经被报道出异常表达。Mir-34a和Mir-21在胶质瘤中显著高表达，而人为干预的降低其表达量能够有效的抑制胶质瘤的恶性程度。然而，Mir-7和Mir128则被发现在胶质瘤细胞系和肿瘤样本中均受到表达抑制，恢复其表达能够直接作用于明确的靶基因从而间接调节那些已知的原癌基因或抑癌基因。Mir-10b是广泛报道在胶质瘤组织中呈高表达且在正常脑组织中不表达的microRNA。人为地抑制Mir-10b的表达，可在胶质瘤细胞系中引起多方面的作用：一方面其抑制了动物模型中胶质瘤移植瘤的生长，另一方面，对于正常的神经细胞和胶质细胞，它不具有任何的影响。实验表明，Mir-10b有可能通过在转录水平上抑制p21WAF1/Cip1抗肿瘤复合体的表达从而抑制细胞周期中S期所必需的蛋白合成，使细胞停留在S期。这表明Mir-10b具有作为胶质瘤靶向治疗的潜力。因此，microRNA对于胶质瘤的治疗具有巨大的潜力。Mir-218已经被报道在某些肿瘤组织高度下调，并同时参与多个肿瘤恶化的病理进程。Meng等报道在189组结直肠癌病例和30组正常组织的对照试验中，Mir-218在结直肠癌患者组的癌组织和血清中呈低表达，同时Mir-218的表达与TNM分期和淋巴转移及分化紧密相关。Mir-218表达较低的病人，其预后生存期较表达高者明显缩短(P < 0.05)。以上表明Mir-218在结直肠癌的诊断和预后方面都将具有一定的生物学标志作用。在头颈部鳞状细胞癌组织中，Mir-218也呈现低表达水平。在细胞系中恢复其表达，能够明显抑制细胞迁移和侵袭活力。 通过基因组表达分析显示，Mir-218可以调节癌细胞中的黏着斑通路及其层粘连蛋白，后者对于为基膜的重要组成部分，广泛参与细胞分化、迁移、粘附以及增殖和存活等重要的生物学功能。LAMB3是Mir-218直接作用的一个靶基因，并且在头颈部鳞状细胞癌组织中呈现高表达。恢复Mir-218的表达能够通过抑制黏着斑通路，尤其是LAMB3，从而抑制癌细胞的迁移和侵袭能力。此外，在口腔癌症中，Mir-218被报道可抑制mTOR复合体以及AKT的磷酸化通路从而达到抗肿瘤的作用；在肝细胞癌中，Mir-218能够受到1,6,7-三羟基氧杂蒽酮治疗的诱导表达上调，靶向抑制Bmi-1的表达，活化肿瘤抑制分子P16Ink4a和P14ARF的表达，从而发挥抗肿瘤的作用。 Mir- 218是由两个不同基因编码的内源性微小RNA，分别为Mir-218-1和Mir-218 -2，分属于内含子的slit2和slit3。然而，目前对于Mir-218-1和Mir-218-2在胶质瘤中的表达及其相关的功能和意义的研究，很大程度上仍然是空白的。阐明Mir-218-1和Mir-218-2的区别和功能差异，对于肿瘤的分子靶向质量，是十分有意义的。

CDC27是12个不同的亚基组成的细胞周期后期促进复合体(APC/C)的其中一个亚基，后者主要经泛素化作用水解周期蛋白（Cyclins）和分离酶抑制蛋白（Securin）以调节细胞周期和有丝分裂的进程。周期蛋白为一组与真核生物细胞周期同步分泌的大分子蛋白家族，主要包括：周期蛋白质A1/2、B1/2、D1等。它们能分别同各自所对应的的蛋白质激酶（细胞周期蛋白依赖性激酶，CDKs）相结合，从而对细胞周期进行一定的推动和协调作用。在肿瘤组织中，Securin和各种Cyclins都曾被报道过分布异常，导致细胞周期紊乱、肿瘤组织异常增殖。Cyclin A、Cyclin B 以及Cyclin D在肿瘤组织中发生过表达、染色体易位、基因扩增或其他异常激活，均可通过与相应的周期蛋白依赖性激酶结合，导致细胞周期和DNA复制的紊乱。在乳腺癌、前列腺癌等癌症的相关研究中，Cyclin A被报道表达上调；而Cyclin B可作为抑制肝细胞癌增殖的靶向治疗位点；同时，Cyclin D被证实参与前列腺癌、乳腺癌中多通路调节下肿瘤细胞的增殖。Securin属于调节细胞周期的相关因子，主要作用为组织细胞分裂中期到后期的转换，直到姐妹染色单体分离完成为止。但越来越多的证据表明，在肿瘤组织中，尤其是在乳腺癌中，Securin参与了肿瘤的某些重要的生理进程，调节Securin的表达水平及其亚细胞定位，能够对某些肿瘤起到治疗和预后的作用。最近的研究表明,残留在CDC27 重复四聚肽序列(TPRs)，能够帮助APC/C与CDC20和CDH1的连接，从而共同活化促进APC/C泛素化进程，对分离酶抑制蛋白和细胞周期蛋白进行泛素化水解。生物信息学的表明，CDC27的3′UTR区域包含两个潜在的包含7个碱基的结合区域能够与Mir - 218 – 2互补配对。该信息提示，Mir - 218 – 2可以通过靶向结合CDC27并在转录后的水平抑制其表达，从而导致APC/C的功能紊乱并最终引起肿瘤进展异常。

本发明拟在胶质瘤细胞中验证CDC27是否是Mir-218-2的靶基因，并探讨Mir-218-2在胶质瘤的生长、转移中的调控机制，为胶质瘤的临床治疗提供理论依据。

发明内容：

本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种Mir-218-2基因作为CDC27靶基因的调控者在制备调节胶质瘤癌症细胞中CDC27表达水平药物中的应用，具体的，调节胶质瘤癌症细胞中CDC27表达水平为Mir-218-2抑制CDC27的表达，本发明还提供了一种验证胶质瘤癌症细胞中CDC27是Mir-218-2靶基因的方法；检测Mir-218-2在胶质瘤中的表达情况的方法；检测Mir-218-2对胶质瘤细胞系迁移侵袭能力及增殖耐药的影响的方法。

本发明的目的可以通过如下措施来达到：一种Mir-218-2基因作为CDC27靶基因的调控者在制备调节胶质瘤癌症细胞中CDC27表达水平药物中的应用。其中调节胶质瘤癌症细胞中CDC27表达水平为Mir-218-2抑制CDC27的表达。

为了进一步实现本发明的目的，一种验证胶质瘤癌症细胞中CDC27是Mir-218-2靶基因的方法，其特征在于具体包括如下步骤：

1）CDC27是Mir-218-2的靶基因

通过生物信息的预测发现，Mir-218-2能够与CDC27的两个3’UTR区域形成互补配对，即CDC27可能为Mir-218-2的靶基因；通过Western Blotting对HA-1800、U251、U87和U118中CDC27的表达含量进行对比，发现胶质瘤细胞中CDC27的表达减少；其次，在Mir-218-2过表达和敲除的细胞系中，CDC27的表达分别为下调和上升，可推断CDC27为Mir-218-2的靶基因；

2 ）在Mir-218-2过表达细胞系中重新表达CDC27

通过补救实验来证实CDC27是Mir-218-2的目的靶基因，首先通过在Mir-218-2过表达的细胞系中用质粒重新表达CDC27，并经由实时定量PCR和Western Blotting验证，然后通过细胞周期检测发现，重新恢复CDC27表达的细胞系表现同Mir-218-2敲除时类似，G0/1期增长，而S期减少，说明Mir-218-2是通过CDC27发挥作用。

为了进一步实现本发明的目的，一种检测Mir-218-2在胶质瘤中的表达情况的方法，其特征在于具体包括如下步骤：

1）实时定量PCR检测Mir-218-2在胶质瘤组织中的表达情况

为了明确Mir-218-1和Mir-218-2在胶质瘤组织中的表达，分别取5例正常脑组织作为阴性对照，8例Ⅰ-Ⅱ的胶质瘤和11例Ⅲ-Ⅳ的胶质瘤组织进行实时定量PCR检测，结果表明：Mir-218-2在胶质瘤组织中为高表达，而Mir-218-1为低表达；

2）实时定量PCR检测Mir-218-2在胶质瘤细胞内的表达情况

为了明确Mir-218-1和Mir-218-2在胶质瘤细胞内表达的情况，对HA、U87、U251和U118细胞进行实时定量RT-PCR检测；结果表明：Mir-218-2在胶质瘤细胞中为高表达，而Mir-218-1为低表达。

为了进一步实现本发明的目的，一种检测Mir-218-2对胶质瘤细胞系迁移侵袭能力的影响的方法，其特征在于具体包括如下步骤：

1） Transwell小室实验

通过Transwell小室培养观察Mir-218-2对照组和病毒感染组细胞侵袭和迁移的影响；结果表明，与空载体对照组相比，过表达组细胞迁移侵袭能力增加，而敲除组细胞明显减少，即抑制Mir-218-2能有效抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移的能力；

2）划痕实验

通过划痕实验来比较对照组和病毒感染组胶质瘤细胞迁移能力；结果表明，与对照组相比，过表达组侵袭能力增加，而敲除组明显减少，即抑制Mir-218-2能有效抑制胶质瘤细胞迁移的能力；

3）细胞骨架染色

通过罗丹明鬼笔环肽显示感染组和对照组细胞骨架的形态变化；结果表明，与对照组相比，过表达组细胞骨架染色深，细胞周边可见较多细胞足状突起，而敲除组明显少甚至无，且过表达组细胞中央可以明显应力纤维，即抑制Mir-218-2能有效抑制胶质瘤细胞骨架的形成。

为了进一步实现本发明的目的，一种检测Mir-218-2对胶质瘤细胞增殖耐药的影响的方法，其特征在于具体包括如下步骤：

1） Mir-218-2对胶质瘤细胞的增殖作用

分别采用细胞活力实验、细胞周期检测和软琼脂糖凝胶实验检测感染组和对照组肿瘤细胞的增值能力；结果表明，与对照组相比，过表达组的增殖能力较强，而敲除组的增值能力较弱，即Mir-218-2对胶质瘤细胞具有促进增殖作用；

2） Mir-218-2对胶质瘤细胞的耐药影响

分别对Mir-218-2过表达组、抑制组及其相对应的对照组，按照浓度梯度和时间梯度给予抗肿瘤药物Beta-lapachone(β-lap)；结果显示，相对于对照组，Mir-218-2过表达细胞对β-lap具有时间依赖和浓度依赖的化学敏感性下降，说明Mir-218-2对β-lap的耐药具有调节作用；

3）Mir-218-2对胶质瘤细胞的活性氧形成的影响

通过活性氧检测发现，与对照组相比，在Mir-218-2过表达的细胞系活性氧释放减少，说明Mir-218-2能够抑制β-lap对活性氧的释放作用。

本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：1．本发明运用定量PCR验证了Mir-218-2高度表达于胶质细胞瘤的组织标本和细胞系中。2. 本发明通过Transwell、划痕实验、细胞骨架染色发现，Mir-218-2的过表达能够增加胶质瘤细胞的迁移侵袭能力。3.本发明通过细胞成球、流式检测实验上调Mir-218-2能够诱导的胶质细胞瘤在体外和体内的增殖，同时降低β-lap在胶质瘤细胞中的化学敏感性。4. 本发明通过一系列的蛋白实验和在Mir-218-2过表达细胞系中重新表达CDC27等试验证明，CDC27是Mir-218-2的目的靶基因。

附图说明：

图1.Mir-218-1和Mir-218-2在胶质瘤中的表达及细胞系的构建；

图2.Transwell实验中Mir-218-2对胶质瘤细胞迁移侵袭能力的作用 ；

图3.划痕实验中Mir-218-2对胶质瘤细胞迁移能力的作用；

图4.F-actin荧光染色中Mir-218-2对胶质瘤细胞骨架重构的作用；

图5.Mir-218-2对胶质瘤细胞增殖能力的作用；

图6. 细胞毒性试验中Mir-218-2影响胶质瘤细胞对β-lap的敏感性；

图7. Mir-218-2对胶质瘤细胞ROS产生的影响；

图8. CDC27为Mir-218-2靶基因的验证；

图9. 重新恢复Mir-218-2过表达细胞系中CDC27的表达对细胞周期的影响；

图10. Mir-218-2对CDC27-APC/C泛素化通路的下游蛋白的作用；

图11. Mir-218-2对细胞粘附相关蛋白的作用；

图12. Mir-218-2通过CDC27的作用通路图。

具体实施方式：下面结合实施例进一步描述本发明：

本发明中，首先观察Mir-218-2在胶质瘤中的表达情况，然后通过Transwell小室、划痕实验观察Mir-218-2对细胞迁移侵袭能力的影响，F-actin染色观察细胞骨架情况；CCK-8法绘制细胞增殖曲线观察Mir-218-2对细胞增殖的影响，流式检测观察Mir-218-2对细胞周期的影响，软琼脂凝胶实验观察Mir-218-2对细胞成球情况的影响；CCK-8细胞毒性试验和流式ROS检测观察Mir-218-2对药物敏感性的影响；Western Blotting和Rescue实验验证观察Mir-218-2发挥作用时下游通路的分子变化。进一步揭示Mir-218-2对肿瘤药物治疗的作用和机制。

实施例1：Mir-218-2在胶质瘤中的表达情况

1.1实时定量PCR检测Mir-218-2在胶质瘤组织中的表达情况

为了明确Mir-218-1和Mir-218-2在胶质瘤组织中的表达，分别取5例正常脑组织作为阴性对照，8例Ⅰ-Ⅱ的胶质瘤和11例Ⅲ-Ⅳ的胶质瘤组织进行实时定量PCR检测。结果表明：Mir-218-2在胶质瘤组织中为高表达，而Mir-218-1为低表达，参见图1A，图1A为Mir-218-2在胶质瘤组织和正常人组织中的表达差异，箱式图底部和顶部分别为数值25%和75%。*P <0.05, **P < 0.01。

1.2实时定量PCR检测Mir-218-2在胶质瘤细胞内的表达情况

为了明确Mir-218-1和Mir-218-2在胶质瘤细胞内表达的情况，对HA、U87、U251和U118细胞进行实时定量RT-PCR检测。结果表明：Mir-218-2在胶质瘤细胞中为高表达，而Mir-218-1为低表达。参见图1B，图1B为Mir-218-2在胶质瘤细胞系和正常人星形胶质细胞系中的表达差异。) *P < 0.05, **P < 0.01***P < 0.001。

实施例2：Mir-218-2对胶质瘤细胞系迁移侵袭能力的影响

2.1 Transwell小室实验

通过Transwell小室培养观察Mir-218-2对照组和病毒感染组细胞侵袭和迁移的影响。结果表明，与空载体对照组相比，过表达组细胞迁移侵袭能力增加，而敲除组细胞明显减少，即抑制Mir-218-2能有效抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移的能力，参见图2 ，图2A和图2B为显示胶质瘤细胞侵袭能力(100×)。570nm处的OD值为穿过膜的细胞数的间接指标。 *P <0.05， **P < 0.01。图2C和图2D 显示胶质瘤细胞迁移能力(100×)。 570nm处的OD值为穿过膜的细胞数的间接指标。 *P < 0.05，**P < 0.01。

2.2划痕实验

通过划痕实验来比较对照组和病毒感染组胶质瘤细胞迁移能力。结果表明，与对照组相比，过表达组侵袭能力增加，而敲除组明显减少，即抑制Mir-218-2能有效抑制胶质瘤细胞迁移的能力，参见图3，图3A和图3B为划痕实验显示胶质瘤细胞迁移能力(100×)。 *P <0.05， **P < 0.01。

2.3细胞骨架染色

通过罗丹明鬼笔环肽显示感染组合对照组细胞骨架的形态变化。结果表明，与对照组相比，过表达组细胞骨架染色深，细胞周边可见较多细胞足状突起，而敲除组明显少甚至无，且过表达组细胞中央可以见明显应力纤维，即抑制Mir-218-2能有效抑制胶质瘤细胞骨架的形成。参见图4A和图4B，图4A和图4B为细胞的纤维骨架(600×)。 *P < 0.05， **P <0.01。

实施例3：Mir-218-2对胶质瘤细胞增殖耐药的影响

3.1 Mir-218-2对胶质瘤细胞的增殖作用

分别采用细胞活力实验、细胞周期检测和软琼脂糖凝胶实验检测感染组和对照组肿瘤细胞的增值能力。结果表明，与对照组相比，过表达组的增殖能力较强，而敲除组的增值能力较弱，即Mir-218-2对胶质瘤细胞具有促进增殖作用。参见图5, 图5A为细胞增殖曲线。*P< 0.05, **P < 0.01***P < 0.001。图5B和图5C 为流式检测细胞周期，主要变化在G0/1期和S期。 *P < 0.05, **P < 0.01。图5D和图5E为软琼脂凝胶集落形成实验，显示Mir-218-2过表达组成球数量多且体积大。*P < 0.05, **P < 0.01。

3.2 Mir-218-2对胶质瘤细胞的耐药影响

分别对Mir-218-2过表达组、抑制组及其相对应的对照组按照浓度梯度和时间梯度给药抗肿瘤药物Beta-lapachone(β-lap)。结果显示，相对于对照组，Mir-218-2过表达细胞对β-lap具有时间依赖和浓度依赖的化学敏感性下降，说明Mir-218-2对β-lap的耐药具有调节作用。参见图6，图6A，图6B为Mir-218-2分别从时间和剂量上抑制胶质瘤细胞对β-lap的敏感性。*P < 0.05, **P < 0.01。

3.3 Mir-218-2对胶质瘤细胞的活性氧形成的影响

鉴于β-lap主要通过促进活性氧的释放发挥作用，通过活性氧检测发现，与对照组相比，在Mir-218-2过表达的细胞系活性氧释放减少，说明Mir-218-2能够抑制β-lap对活性氧的释放作用。参见图7。

实施例4：CDC27是Mir-218-2的靶基因

4.1 CDC27是Mir-218-2的靶基因

通过生物信息的预测发现，Mir-218-2能够与CDC27的两个3’UTR区域形成互补配对，即CDC27可能为Mir-218-2的靶基因，参见图8A，图8A为Mir-218-2靶基因预测结果。通过Western Blotting对HA-1800、U251、U87和U118中CDC27的表达含量进行对比，发现胶质瘤细胞中CDC27的表达减少，参见图8B，图8B为CDC27在胶质瘤细胞与正常人星形胶质细胞中的表达异常，*P < 0.05, **P < 0.01***P < 0.001。其次，在Mir-218-2过表达和敲除的细胞系中，CDC27的表达分别为下调和上升，参见图8C，图8C 为CDC27在Mir-218-2过表达或抑制组中的表达情况，*P < 0.05, **P < 0.01***P < 0.001。综上，可推断CDC27为Mir-218-2的靶基因。

4.2 在Mir-218-2过表达细胞系中重新表达CDC27

进一步通过补救实验来证实CDC27是Mir-218-2的目的靶基因。首先通过在Mir-218-2过表达的细胞系中用质粒重新表达CDC27，并经由实时定量PCR和Western Blotting验证，参见图9A、图9B，图9A和图9B为在Mir-218-2过表达细胞系中恢复CDC27表达的验证。*P <0.05, **P < 0.01***P < 0.001。然后通过细胞周期检测发现，重新恢复CDC27表达的细胞系表现同Mir-218-2敲除时类似，G0/1期增长，而S期减少，参见图9C、图9D，图9C和图9D为恢复CDC27表达对细胞周期的影响。*P < 0.05。进一步说明Mir-218-2是通过CDC27发挥作用。

实施例5：Mir-218-2通过CDC27调节下游的信号通路

5.1 Mir-218-2通过CDC27调节APC/C泛素化水解Cyclins和Securin

通过Western Blotting发现，与对照组相比，Mir-218-2过表达的细胞系中Securin和大部分Cyclins表达升高，而恢复CDC27的表达及敲除Mir-218-2的细胞系中，Securin和大部分Cyclins表达减少，Cyclin B2变化不大，参见图10，说明Mir-218-2是通过CDC27调节APC/C泛素化通路。图10A、图10B、图10C、图10D、图10E分别为Securin, CyclinA1/2,CyclinB1, CyclinB2, CyclinD1在Mir-218-2过表达或抑制细胞系中的表达。*P < 0.05,**P < 0.01***P < 0.001。

5.2 Mir-218-2通过调节表皮钙黏蛋白、黏着斑相关蛋白调节细胞活动能力

通过Western Blotting发现，与对照组相比，Mir-218-2过表达的细胞系中βcatenin、磷酸化FAK和Vinsulin表达升高，其余表达减少，而恢复CDC27的表达及敲除Mir-218-2的细胞系中，表皮钙黏蛋白、磷酸化βcatenin、FAK均升高，而其余均下降，提示细胞粘附性增加，活动性下降。这表明Mir-218-2可通过直接或者间接的方式调节细胞间粘附和活动性。参见图11，图11A、图11B、图11C、图11D分别为Ecadherin, βcatenin, p-βcatenin, FAK, p-FAK和vinculin在Mir-218-2过表达或抑制细胞系中的表达。*P < 0.05, **P < 0.01***P <0.001。

5.3 参见图12， Mir-218-2通过CDC27所在APC/C泛素化通路以及TGFβ通路发挥作用。

应当理解的是，本说明书未详细阐述的部分都属于现有技术。上述针对较佳实施例的描述较细致，但不能因此认为是对本发明专利保护范围的限制。

Claims (6)

1.一种Mir-218-2基因作为CDC27靶基因的调控者在制备调节胶质瘤癌症细胞中CDC27表达水平药物中的应用。

2.根据权利要求1中所述应用，其中调节胶质瘤癌症细胞中CDC27表达水平为Mir-218-2抑制CDC27的表达。

3.一种验证胶质瘤癌症细胞中CDC27是Mir-218-2靶基因的方法，其特征在于具体包括如下步骤：

1）CDC27是Mir-218-2的靶基因

通过生物信息的预测发现，Mir-218-2能够与CDC27的两个3’UTR区域形成互补配对，即CDC27可能为Mir-218-2的靶基因；通过Western Blotting对HA-1800、U251、U87和U118中CDC27的表达含量进行对比，发现胶质瘤细胞中CDC27的表达减少；其次，在Mir-218-2过表达和敲除的细胞系中，CDC27的表达分别为下调和上升，可推断CDC27为Mir-218-2的靶基因；

2 ）在Mir-218-2过表达细胞系中重新表达CDC27

通过补救实验来证实CDC27是Mir-218-2的目的靶基因，首先通过在Mir-218-2过表达的细胞系中用质粒重新表达CDC27，并经由实时定量PCR和Western Blotting验证，然后通过细胞周期检测发现，重新恢复CDC27表达的细胞系表现同Mir-218-2敲除时类似，G0/1期增长，而S期减少，说明Mir-218-2是通过CDC27发挥作用。

4.一种检测Mir-218-2在胶质瘤中的表达情况的方法，其特征在于具体包括如下步骤：

1）实时定量PCR检测Mir-218-2在胶质瘤组织中的表达情况

为了明确Mir-218-1和Mir-218-2在胶质瘤组织中的表达，分别取5例正常脑组织作为阴性对照，8例Ⅰ-Ⅱ的胶质瘤和11例Ⅲ-Ⅳ的胶质瘤组织进行实时定量PCR检测，结果表明：Mir-218-2在胶质瘤组织中为高表达，而Mir-218-1为低表达；

2）实时定量PCR检测Mir-218-2在胶质瘤细胞内的表达情况

为了明确Mir-218-1和Mir-218-2在胶质瘤细胞内表达的情况，对HA、U87、U251和U118细胞进行实时定量RT-PCR检测；结果表明：Mir-218-2在胶质瘤细胞中为高表达，而Mir-218-1为低表达。

5.一种检测Mir-218-2对胶质瘤细胞系迁移侵袭能力的影响的方法，其特征在于具体包括如下步骤：

1） Transwell小室实验

通过Transwell小室培养观察Mir-218-2对照组和病毒感染组细胞侵袭和迁移的影响；结果表明，与空载体对照组相比，过表达组细胞迁移侵袭能力增加，而敲除组细胞明显减少，即抑制Mir-218-2能有效抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移的能力；

2）划痕实验

通过划痕实验来比较对照组和病毒感染组胶质瘤细胞迁移能力；结果表明，与对照组相比，过表达组侵袭能力增加，而敲除组明显减少，即抑制Mir-218-2能有效抑制胶质瘤细胞迁移的能力；

3）细胞骨架染色

通过罗丹明鬼笔环肽显示感染组和对照组细胞骨架的形态变化；结果表明，与对照组相比，过表达组细胞骨架染色深，细胞周边可见较多细胞足状突起，而敲除组明显少甚至无，且过表达组细胞中央可以明显应力纤维，即抑制Mir-218-2能有效抑制胶质瘤细胞骨架的形成。

6.一种检测Mir-218-2对胶质瘤细胞增殖耐药的影响的方法，其特征在于具体包括如下步骤：

1） Mir-218-2对胶质瘤细胞的增殖作用

分别采用细胞活力实验、细胞周期检测和软琼脂糖凝胶实验检测感染组和对照组肿瘤细胞的增值能力；结果表明，与对照组相比，过表达组的增殖能力较强，而敲除组的增值能力较弱，即Mir-218-2对胶质瘤细胞具有促进增殖作用；

2） Mir-218-2对胶质瘤细胞的耐药影响

分别对Mir-218-2过表达组、抑制组及其相对应的对照组，按照浓度梯度和时间梯度给予抗肿瘤药物Beta-lapachone(β-lap)；结果显示，相对于对照组，Mir-218-2过表达细胞对β-lap具有时间依赖和浓度依赖的化学敏感性下降，说明Mir-218-2对β-lap的耐药具有调节作用；

3）Mir-218-2对胶质瘤细胞的活性氧形成的影响

通过活性氧检测发现，与对照组相比，在Mir-218-2过表达的细胞系活性氧释放减少，说明Mir-218-2能够抑制β-lap对活性氧的释放作用。