CN101476163B

CN101476163B - RecQL4基因高表达作为新型的靶点在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN101476163B
Application number: CN2009100737318A
Authority: CN
Inventors: 赵永良
Original assignee: Individual
Current assignee: Beijing Institute of Genomics of CAS
Priority date: 2009-02-03
Filing date: 2009-02-03
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2029-02-03
Also published as: CN101476163A

Abstract

本发明涉及一种RecQL4基因高表达作为新型的靶点在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于将RecQL4基因高表达作为一种新的靶点来筛选新型的抗肿瘤药物，即特异的RecQL4基因高表达抑制剂。本发明的有益效果是RecQL高表达提供了一个非常有价值而且在药理上非常有前途的抗肿瘤靶位点，为研制新的抗肿瘤药物开拓了新思路，并且开创了抗肿瘤药物的新领域。

Description

RecQL4基因高表达作为新型的靶点在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域：

本发明涉及一种RecQL4(DNA双链解旋酶)基因高表达作为新型的靶点在制备抗肿瘤药物中的应用，属于基因新用途技术领域。

背景技术：

RecQL4是RecQ解旋酶家族中的一员。它是由Kitao等人在1998年克隆并以大肠杆菌(E.Coli)RecQ蛋白来命名的(见Genomics，1998，Cloning of two new human helicase genes of the RecQ family：Biological significance of multiple species in higher eukaryotes，54，443-452)。其主要功能是打开DNA双螺旋结构用于DNA转录、复制以及损伤修复(见Genetics in Medicine，2006，The versatile RecQL4，8(4)：213-216)，因此，RecQL4对于维持基因组的稳定性是非常重要的。而基因的不稳定性在肿瘤发生及发展中起重要作用。RecQL4功能缺失可引起人类基因组不稳定性疾病：Rothmund-Thomson综合症(RTS)，表现为皮肤红斑、骨骼异常、早衰和肿瘤特别是骨肉瘤高发(见J.Natl.Cancer Inst.，2003，Association between osteosarcoma and deleteriousmutations in the RecQL4 gene in Rothmund-Thomson syndrom，95：669-674)。除了RTS，RecQL4功能缺失也与RAPADILINO和BALLER-GEROLD综合症相关(见Hum Mol.Genet.，2003，Moleculardefect of RAPADILINO syndrome expands the phenotype spectrum ofRecQL diseases，12：2837-2844和J.Med.Genet.，2006，Revisiting thecraniosynostosis-radial ray hypoplasia association：Baller-Geroldsymdrom caused by mutations in the RecQL4 gene，43：148-152)。这三种临床疾病症候群的共同特征是个矮和骨骼异常，然而肿瘤高发只存在于RTS及RAPADILINO疾病症候群(见Hum Genet.，2008，Sensitivityof RecQL4-deficient fibroblasts from Rothmund-Thomson syndromepatients to genotoxic agents，123：643-653)。使用RecQL4基因毃除小鼠模型进一步证实了在人类中的发现。小鼠在RecQL4基因功能缺失之后，表现为生长迟缓、早死、以及其它的类似于人类Rothmund-Thomson综合症的缺陷(见Hum Mol Genet.，2003，Growthretardation and skin abnomalities of the RECQL4-deficient mouse，12：2293-2299和Hum Mol Genet，2005，Defective sister-chromatidcohesion，aneuploidy and cancer predisposition in amouse model of typeII Rothmund-Thomson syndrome，14：813-825)。所有这些研究都是关于RecQL4基因表达缺失与疾病发生发展的关系，而关于RecQL4高表达(over-expression)与人类肿瘤的关系目前在国内外还没有任何报道。

关于RecQL4的碱基序列、制备方法及鉴定方法如下：

1、RecQL4的碱基序列：

碱基序列：美国国立卫生院癌症研究所基因序列号：NM_004260；

网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nuccore。

2、RecQL4的制备方法：

全长RecQL4基因序列合成：利用胍类裂解试剂提取人类组织或细胞的核酸RNA，然后利用反转录酶将RNA反转录成模板cDNA。同时根据RecQL4基因的两端序列合成一对引物[引物1：

gcaagcgcggaggccgggcgggcgcgcgcgccatggagcggctg(位置1-44)；

引物2为反义序列：tattctgcattttggagcctcctcgttc(位置3753-3780)]。然后使用这对引物和前面合成的模板cDNA在PCR仪器上进行聚合酶链式反应。反应产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

3、RecQL4的鉴定方法：

(1)RecQL4全长基因序列鉴定：

可以使用聚合酶链式反应产物在测序仪上直接进行测序。其结果可与美国国立卫生院癌症研究所网址所公布的序列进行比较。即可确知所制备的RecQL4基因产物是否正确。

(2)肿瘤细胞RecQL4信息RNA(mRNA)水平鉴定(用定量的Real-Time RT-PCR方法)：

利用胍类裂解试剂提取肿瘤细胞的核酸RNA，然后利用反转录酶将RNA反转录成模板cDNA。然后利用Real-Time RT-PCR方法对RecQL4mRNA水平进行定量分析。

(3)肿瘤细胞RecQL4蛋白水平鉴定(Western Blot)：

将获取的人类组织或细胞在裂解缓冲液中进行匀浆，离心，获取蛋白上清。然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离。分离之后再转移到硝酸纤维素膜，并与RecQL4抗体(已经商业销售)进行孵育。然后再与RecQL4抗体相匹配的第二类抗体进行孵育，并用化学发光方法检测RecQL4在人类组织或细胞中的蛋白表达水平。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种RecQL4基因高表达作为新型的靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案：

本发明涉及RecQL4基因高表达作为新型的靶点在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于将RecQL4基因高表达作为一种新的靶点来筛选新型的抗肿瘤药物，即特异的RecQL4基因高表达抑制剂。

所述的特异的RecQL4基因高表达抑制剂的第一种筛选方法如下：

根据RecQL4蛋白ATP结合区三维结构图，通过计算机分析软件高通量地筛选小分子化合物文库以确定哪些化合物能全部或部分地结合到ATP活性位点，即找到ATP结合位点的拮抗剂；在筛选过程中，化合物和ATP结合位点相配合的质量通过形状匹配或相互作用来判断；一旦筛选到合适的小分子化合物，将通过化学的方法来合成它们，同时利用生物学的方法来检测它们对RecQL4酶活性的特异抑制。

所述特异的RecQL4基因高表达抑制剂的第二种筛选方法如下：

因为RecQL4蛋白N-末端的磷酸化对于DNA复制的起始是必须的；因此将根据RecQL4蛋白N-末端磷酸化位点的三维结构图来筛选这一磷酸化过程的特异阻断剂，这样通过阻断RecQL4蛋白磷酸化修饰而达到抑制DNA复制和肿瘤细胞生长的目的；这一抑制剂的筛选将利用RecQL4蛋白三维结构图和计算机分析软件高通量地筛选化合物文库而最终找到RecQL4蛋白N-末端磷酸化修饰的特异拮抗剂。

所述特异的RecQL4基因高表达抑制剂的第三种筛选方法如下：

以蛋白结构类似集群结合自然化合物引导的化合物文库建立的方法，此法是利用不同类型蛋白尽管其基因序列没有明显同源性，但其功能保守区蛋白三维结构都是类似的；这样只要发现一种自然化合物对集群蛋白中的一个成员具有明显抑制作用，那么就依据这一化合物作为引导结构，通过化学合成的方法来组建化合物文库，经筛选后最终找到特异的化合物抑制剂；通过计算机软件分析，解旋酶RecQL4和真核细胞DNA转录起始因子eIF4A以及切除核酸酶亚单位B被归类为蛋白结构类似集群，由于从珊瑚中提取的自然化合物Hippuristanol已经被证实为eIF4A的小分子抑制剂，因此将Hippuristanol作为导引结构来合成一系列的衍生化合物，从而形成自己的化合物文库，然后使用生物化学的方法逐一检测它们对RecQL4酶活性的抑制，只要化合物的IC₅₀≤10u M就被认为中标。

本发明的理论根据如下：

本发明是基于发现了RecQL4基因的新功能，这一新功能是RecQL4基因在人类肿瘤中的高表达可促进人类肿瘤的形成，并利用这一新功能而作出的用途发明。

RecQL4基因的这一新功能从以下四个方面得到实验证实：

(1)RecQL4蛋白水平在人乳腺上皮和前列腺上皮永生化细胞株中是增高的：

体细胞永生化即细胞获得无限增殖的能力是细胞癌变的前期阶段。经过对4例乳腺永生化细胞株(MCF-10F、HMEC-hT1、HMEC-hT2和HMEC-hT3)及2例前列腺永生化细胞株(RWEP1和PEHC-hT)的分析，发现所有6例细胞株尽管无致瘤性，但其RecQL4蛋白水平明显高于相对应的正常乳腺上皮细胞(HMEC)及前列腺上皮细胞(PHEC)，经定量分析，平均增高2.4-9.7倍。因此，在细胞癌变早期阶段，RecQL4水平是增高的(见图1)。

(2)RecQL4在大多数(4/6)体外培养的人乳腺癌肿瘤细胞株中也是增高的：

利用Western Blot技术，以正常人类乳腺上皮细胞为参照，对RecQL4在体外培养的乳腺癌细胞株中的蛋白表达水平进行了检测。总共检测了6例乳腺癌细胞株，其中4例包括MCF-7、MDA-MB-361、MDA-MB-436和MDA-MB453，其RecQL4蛋白表达水平比正常乳腺上皮细胞(HMEC)增高3.4-14.2倍(见图2)，因此，RecQL4在大多数的乳腺癌细胞株中也是高表达的。

(3)乳腺肿瘤细胞在其RecQL4表达水平受到抑制后可明显降低它在裸鼠中的肿瘤生长速度：

为了确定是否RecQL4高表达参与肿瘤细胞形成过程，申请人选择一例肿瘤细胞株MDA-MB453，通过反义RNA技术抑制RecQL4在其内的表达水平。实验流程如下：首先根据RecQL4mRNA序列设计一段含有21碱基序列的发夹式结构。通过DNA合成仪进行合成后，连接到表达载体(Vector)中.然后将载有RecQL4寡核苷酸序列的载体导入MDA-MB453肿瘤细胞中。因为载体本身含有抗生素筛选基因，因此，有载体表达的细胞就会在抗生素的筛选下存活下来，并形成细胞克隆，然后使用克隆环将每个细胞克隆分离出来，并扩增形成克隆细胞株。最后，通过Western blot技术对所有的克隆细胞株进行鉴定，结果有两株克隆细胞(MB453-ShRNA1和MB453-ShRNA2)其RecQL4蛋白水平受到了明显的抑制，而MDA-MB453和只导入空白载体(不含RecQL4寡核苷酸序列)的MDA-MB453-Vector细胞仍表达高水平的RecQL4蛋白(见图3)。

然后将这4种细胞株(MDA-MB453、MDA-MB453-vector、MB453-ShRNA1和MB453-ShRNA2)分别注射到裸鼠的皮下，每株细胞共注射5个点即5只裸鼠，每只裸鼠注射一个点，每点注射5×10⁶细胞，然后观察肿瘤的生长情况。结果证实：在第四周时，100％(5/5)的裸鼠在注射了MDA-MB453或是MDA-MB453-vector肿瘤细胞后都形成了持续生长的肿瘤结节，其肿瘤体积平均为240.5-272.8mm³。而与此相对比，尽管80％(4/5)裸鼠在注射了MB453-ShRNA1细胞，以及100％(5/5)的裸鼠在注射了MB453-ShRNA2细胞后也形成了肿瘤结节，但其平均体积只有19.7-37.6mm³，经统计学分析，其体积明显小于由MDA-MB453和MDA-MB453-vector肿瘤细胞形成的肿瘤体积(P＜0.01)。因此，MDA-MB453肿瘤细胞在其RecQL4蛋白水平受到抑制后可明显减缓和抑制其在裸鼠中的肿瘤生长速度(见附表1及图4)。

(4)RecQL4mRNA水平在88.4％乳腺癌组织中超过正常组织3倍以上，特别是在转移癌中，其水平超过正常组织46倍以上：

为了确定RecQL4在人类乳腺肿瘤中的表达水平，申请人利用定量Real-Time RT-PCR方法对5例正常乳腺组织以及43例乳腺癌标本中的RecQL4mRNA水平进行了定量检测。从临床病理分级来分，43例乳腺癌中包括11例I级，14例IIA-IIB，14例IIIA-IIIB和4例转移癌(IV级)。结果证实：(a)有88.4％(38/43)的乳腺癌组织其RecQL4mRNA水平超过正常组织3倍以上；(b)从病理分级上来分，72.7％(8/11)I级、92.9％(13/14)IIA-IIB级、92.9％(13/14)IIIA-IIIB级和100％(4/4)IV级其RecQL4mRNA水平增高3倍以上，因此，随着肿瘤恶性程度的升高，有更高比例的肿瘤组织发生RecQL4的高表达；(c)从增高程度上，I级平均增高7.5倍，IIA-IIB级平均增高16.65倍，IIIA-IIIB级平均增高13.14倍，转移癌(IV级)平均增高62.5倍。因此在转移性乳腺癌中，RecQL4mRNA水平是超乎异常地增高的(见图5)。

本发明的有益效果是RecQL基因高表达提供了一个非常有价值而且在药理上非常有前途的抗肿瘤靶位点，为研制新的抗肿瘤药物开拓了新思路，并且开创了抗肿瘤药物的新领域。

附图说明

图1-1为RecQL4在人乳腺和前列腺上皮永生化细胞株中蛋白表达水平的实验结果。

图1-2为图1-1中RecQL4蛋白表达水平的定量结果。

图2-1为RecQL4在人类乳腺癌细胞株中蛋白表达水平的实验结果。

图2-2为图2-1中RecQL4蛋白表达水平的定量结果。

图3为反义寡核苷酸(ShRNA)介导的RecQL4在人乳腺肿瘤细胞中受到抑制的实验结果。

图4为MDA-MB453肿瘤细胞在其RecQL4水平受到抑制后其肿瘤生长速度明显降低的实验结果。

图5为88.4％(38/45)的人乳腺癌标本其RecQL4mRNA水平超过正常组织3倍以上的实验结果。

在图1中，Y1为增加的倍数；HMEC为正常乳腺上皮细胞；MCF-10F为自发永生化的人乳腺上皮细胞；HMEC-hT1、HMEC-hT2和HMEC-hT3为端粒酶高表达介导的永生化人乳腺上皮细胞；PHEC为正常人前列腺上皮细胞；RWEP1为病毒SV40-large T抗原介导的人前列腺永生化上皮细胞株；PHEC-hT为端粒酶高表达介导的人前列腺永生化上皮细胞。

图1是利用Western blot的方法，分别提取每株细胞的蛋白上清，经变性聚丙烯酰胺电泳分离之后，转移到硝酸纤维素膜，然后与抗RecQL4一抗孵育，再与相匹配的二抗孵育后，用化学发光的方法来观察RecQL4蛋白条带的强弱。β-actin水平被用来标定每株细胞的蛋白加样量。

在图2中，Y2为增加的倍数；HMEC为正常人乳腺上皮细胞；MCF-10F为自发转化而且无致瘤性的人乳腺永生化上皮细胞；MCF-7、MDA-MB231、MDA-MB361、MDA-MB436、MDA-MB453和MDA-MB468为体外培养的人乳腺癌上皮细胞株。图2是分别提取每株细胞的蛋白上清，然后利用Western blot的方法对RecQL4的水平进行检测和定量。

在图3中，MDA-MB453为乳腺癌上皮细胞株；MB453-vector为只转染空载体的MDA-MB453乳腺癌上皮细胞；MB453-ShRNA1和MB453-sh-RNA2为MDA-MB453乳腺癌细胞在转染反义寡核苷酸后分离到的两个克隆细胞株，它们的RecQL4表达水平都受到了明显的抑制。

图4是将MDA-MB453、MB453-vector、MB453-ShRNA1和MB453-ShRNA2分别注射到裸鼠的皮下。裸鼠是具有免疫缺陷的种系，专门用于检测人类肿瘤细胞的致瘤性。在注射上述细胞之后，分别观察它们的肿瘤生长速度，并用电子刻度尺来测量肿瘤的直径。肿瘤的体积用下列公式来计算：肿瘤体积＝(最长直径-最短直径²)×0.5。

图5是利用定量的Real-Time RT-PCR方法来测定RecQL4在人类乳腺癌标本中的mRNA表达水平，结果证实：与正常人乳腺组织相比，43例肿瘤标本中有38例显示RecQL4mRNA水平超过正常组织三倍以上。如果按临床病理分级来区分，72.7％(8/11)I级、92.9％(13/14)IIA-IIB级、92.9％(13/14)IIIA-IIIB级和100％(4/4)IV级(转移癌)其RecQL4mRNA水平增高3倍以上，因此，随着肿瘤恶性程度的升高，有更高比例的肿瘤会发生RecQL4的高表达。如果从增高程度上来区分，转移瘤其RecQL4mRNA水平比正常组织超出至少46倍以上，因此，在转移瘤当中，RecQL4mRNA水平是异常增高的。在图5中，病理分级“0”代表正常人乳腺上皮组织。

具体实施方式

下述实施例的理论根据如下：

人类肿瘤发生发展是一个多步骤过程，大致分为起始、促进和进展三个阶段，在此过程中，上皮细胞要经过一系列的恶前表型的改变直到形成有浸润能力的肿瘤细胞。正常体细胞的分裂增殖是有限的，即经过一定次数的分裂增殖以后会老化死亡。因此，潜在的肿瘤细胞必须首先克服细胞老化控制机制而获得无限增殖能力，也可以说细胞永生化即细胞获得无限增殖的能力是肿瘤细胞形成的先决条件。同时，肿瘤转移和复发是造成肿瘤病人死亡的主要原因之一，然而临床上还缺少更为有效或新的治疗战略来预防或降低肿瘤转移所引起的癌症病人的高死亡率。尽管以前的研究结果证实了RecQL4功能缺失与人类早衰和骨肉瘤高发相关，但是，RecQL4高表达与人类肿瘤发生的关系目前还没有任何报道，因此，RecQL4高表达提供了一个非常有价值而且在药理上非常有前途的抗肿瘤靶位点，依据如下：(1)RecQL4蛋白水平在所有检测的永生化细胞株中都是高表达的，而细胞永生化是癌症发展过程中的早期阶段；(2)多数体外培养的乳腺癌肿瘤细胞株其RecQL4蛋白水平与正常相比也是异常增高的；(3)在乳腺癌肿瘤细胞中，通过RecQL4表达的下调将能抑制其肿瘤生长的速度；(4)在43例临床乳腺癌标本中，88.4％(38/43)的乳腺癌标本其RecQL4mRNA水平超过正常组织3倍以上，特别是在4例转移癌中，RecQL4mRNA水平增高至少46倍以上。因此，异常增高的RecQL4水平与肿瘤转移相关。因此，RecQL4高表达可作为一种新的靶位点来筛选新型的抗肿瘤药物，即特异的RecQL4高表达抑制剂。

实施例1：

DNA代谢过程中的一个共同特征是通过DNA解旋酶(Helicase)来打开互补的DNA双螺旋结构。所有的解旋酶家族成员都拥有一个非常保守的ATP结合功能区，解旋酶就利用水解ATP而获得的能量在基因重组、转录、DNA复制及修复中起重要作用，因此，有效且特异的针对RecQL4蛋白ATP结合位点的抑制剂就会成为潜在的有临床抗肿瘤作用的候选者。随着靶蛋白三维晶体结构的完成以及计算机新技术手段的发展，基于蛋白结构以及计算机分析软件辅助的新药设计已经成为当今寻找新的导引结构药的重要手段。RecQL4蛋白保守的ATP结合功能区的三维晶体结构已经完成，其结构图可在如下网站获取：Protein Data Bank(PDB ID：10YW)，http://www.rcsb.org(见EMBO J，2003，Structure of the RecQ Catalytic core，22：4910-4921)。然后，根据RecQL4的三维结构图，通过计算机分析软件高通量地筛选化合物小分子文库以确定哪些化合物能全部或部分地结合到ATP活性位点，即找到ATP结合位点的拮抗剂；在筛选过程中，化合物和ATP结合位点相配合的质量通过形状匹配或相互作用能量来判断(见Proteins，2004，A detailed comparison of current docking and scoringmethods on systems of pharmaceutical relevance 56(2)：235-49和Protein：Structure，Function，and Genetics，1990，Automated docking ofsubstrates to proteins by simulated annealing，8：195-202)；一旦筛选到合适的小分子化合物，即可通过化学的方法来合成它们，同时利用生物学的方法来检测它们对RecQL4ATP酶活性的特异抑制；只要化合物的IC₅₀≤10μM就可以被认为中标(hits)。IC₅₀(InhibitoryConcentration)是指当50％的RecQL4酶活性受到抑制时所需的化合物浓度。

实施例2：

目前实验结果证实RecQL4蛋白的N-末端与酵母Sld2/Drc1蛋白序列同源，它可以被细胞周期蛋白依赖的激酶磷酸化，而且这一修饰过程对于DNA复制过程的起始是必须的(见Mol Cell Biol.，2006，TheN-terminal noncatalytic region of Xenopus RecQL4 is required forchromatin binding of DNA polymerase alpha in the initiation of DNAreplication，26：4843-4852和Current Biol.，2002，CDK phosphorylationof Drc1 regulates DNA replication in fission yeast，12：599-605和Nature，2007，2007，Phosphorylation of Sld2 and Sld3 by cyclin-dependentkinases promotes DNA replication in budding yeast，445：281-285)。因此，只要筛选到这一磷酸化过程的特异阻断剂，那么就将通过阻断RecQL4蛋白N-末端的磷酸化修饰而达到抑制DNA复制的目的，DNA复制受到抑制后，相应的肿瘤细胞的生长也会受到抑制。同样的，此种特异抑制剂的寻找也可以通过RecQL4蛋白三维结构结合计算机分析软件的战略来完成。尽管RecQL4全长蛋白的三维结构图还未完成，但基于同一家族蛋白-RecQL1的三维晶体结构(PDB ID：2v1x)和蛋白结构分析软件(见Bioinformatics，2002，ESyPred3D：Prediction ofproteins 3D structures，18(9)：1250-1256)，将通过计算机分析软件来模拟RecQL4蛋白的三维结构，根据这一结构和实施例1中描述的方法来高通量地筛选化合物小分子文库以确定哪些化学物能全部或部分地结合到RecQL4的磷酸化位点，即找到RecQL4磷酸化位点的拮抗剂。因此，RecQL4ATP结合位点以及N-末端磷酸化位点的特异抑制剂都可以通过蛋白结构结合计算机分析软件辅助的高通量筛选战略来实现。

实施例3：

第三种寻找特异的化合物抑制剂的战略是以蛋白结构类似集群(Proteinstructure sililarity clustering，PSSC)结合自然化合物引导的化合物文库建立的方法(见Drug Discov Today，2005， Proteinstructure similarity clustering and natural product structure as guidingpronciples in drug

附表1：乳腺肿瘤细胞MDA-MB453在RecQL4受抑制后的肿瘤生长情况：

细胞类型	裸鼠肿瘤形成率	平均肿瘤体积(mm3)
				(肿瘤数/总裸鼠数)
MDA-MB453	5/5	272.8±59.4
			MDA-MB453-vector	5/5	240.5±62.1
MDA-MB453-ShRNA1	4/5	19.7±7.1^*
			MDA-MB453-ShRNA2	5/5	37.6±10.2^*

在附表中，*代表P＜0.01，t检验方法。

Claims

1.RecQL4基因抑制剂在制备新型抗乳腺肿瘤药物中的用途，其特征是该抑制剂是反义RNA。