CN104975099A - Hedgehog抑制剂治疗的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

一种通过测定获自受试者的生物样品中至少一种生物标志物的表达水平，为进行Hedgehog信号转导抑制剂治疗来选择患癌受试者的方法。

Description

HEDGEHOG抑制剂治疗的生物标志物
技术领域
本发明涉及个性化治疗的方法。
发明背景
已知HEDGEHOG信号转导调节广泛的生物学过程，如细胞增殖、分化和采用组织特异及剂量依赖性方式的器官形成。通常，HEDGEHOG信号转导在细胞增殖、分化和胚胎模式形成期间严格受控。然而，HEDGEHOG信号通路的异常活性(其归因于，例如，组成型激活所述通路的突变)可产生病理学后果。举例来说，Patched的功能丧失型突变在Gorlin综合征(有高皮肤和脑癌风险的遗传性综合症，也称为基底细胞痣综合征(BCNS))中发现；Smo和GIi的功能获得型突变与基底细胞癌和成胶质细胞瘤相关联。基底细胞癌(BCC)是最常见的皮肤癌形式，在美国每年影响超过90,000人。
发现Hedgehog的组成型激活在BCC、成神经管细胞瘤(最常见的儿童脑瘤)、横纹肌肉瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌和乳腺癌中促进肿瘤发生。除了在肿瘤发生中的作用，HEDGEHOG信号转导还参与前列腺癌转移。HEDGEHOG信号转导可涉及许多其他肿瘤类型且预期持续发现所述关联；这是全世界许多癌症中心主动研究的领域。
发明内容
本发明基于以下发现：特定生物标志物能用于选择可能响应HEDGEHOG信号转导抑制剂治疗的患癌个体。特别发现与对照相比，获自患癌个体的样品中表1所列生物标志物的表达水平如表1所列生物标志物的mRNA表达水平和/或表1所列生物标志物编码的蛋白产物量出现增加或减少能用于预测所述个体是否响应HEDGEHOG信号通路抑制剂的治疗。
一方面，本发明包括为进行HEDGEHOG信号转导抑制剂治疗来选择患癌受试者的方法，所述方法包括测定获自该受试者的生物样品中表1所列至少一种生物标志物，如SHROOM 2或SPHK1的表达水平，从而预测响应HEDGEHOG信号转导抑制剂的可能性增加。在一个实施方式中，本发明包括选择表1中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个生物标志物。本发明方法中，所述HEDGEHOG信号转导抑制剂是环巴胺、蒜藜芦碱、GANT61、purmorphamine(2,6,9-三取代嘌呤化合物)、SAG、SANT-2、番茄碱、花姜酮、GDC-0449；XL139、IPI926、IPI609(IPI269609)或BMS-833923/XL139、或其衍生物。在一个实施方式中，所述HEDGEHOG信号转导抑制剂是甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺(化合物I)或2-[(R)-4-(6-苄基-4,5-二甲基-哒嗪-3-基)-2-甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']二吡嗪-5'-基]-丙-2-醇化合物II。本发明方法中，所述癌症可以是BCC、慢性髓性白血病(CML)、骨肉瘤、软组织肉瘤、成神经管细胞瘤、横纹肌肉瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、Gorlin综合征、胃食管癌、骨髓增生性瘤和急性白血病或乳腺癌。在一个实施方式中，所述生物样品是肿瘤样品，如新鲜冷冻样品或福尔马林固定石蜡包埋组织样品。
另一方面，本发明包括为进行HEDGEHOG信号转导抑制剂治疗来选择患肿瘤受试者的方法，所述方法包括测定获自患成神经管细胞瘤受试者的生物样品中表1所列至少一种生物标志物的表达水平，从而预测响应甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺的可能性增加。
用本发明方法的表达水平可以包括测定mRNA的表达水平或测定蛋白水平。
另一方面，本发明包括为进行HEDGEHOG信号转导抑制剂治疗来选择患癌受试者的方法，所述方法包括测定获自该患癌受试者的生物样品中表1所列HEDGEHOG信号转导生物标志物的表达水平；测定表2所列一种或多种参照/标准化基因的mRNA水平；和根据所述参照基因标准化HEDGEHOG信号转导生物标志物的表达水平。
另一方面，本发明包括用于确定肿瘤是否响应HEDGEHOG信号转导抑制剂治疗的药盒，所述药盒包含提供一种或多种探针或引物以检测表1所列至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个生物标志物的表达水平。本发明的药盒包括测定表1所列一个或多个生物标志物水平的多种试剂，还可选包括测定表2所列一个或多个生物标志物表达水平的试剂和使用说明书。
一方面，本发明的药盒可以是预测癌症受试者是否受益于HEDGEHOG信号转导抑制剂治疗的药盒，所述药盒包括：测定表1所列一个或多个生物标志物的mRNA表达水平的多种试剂；分析所述表达并生成评分以预测患者是否受益于HEDGEHOG信号转导抑制剂治疗的方式。测定mRNA表达的试剂可以包括一批与表1所鉴定一个或多个生物标志物互补的多核苷酸。测量mRNA表达的试剂包括多种PCR探针和/或qRT-PCR引物。
另一方面，本发明可包括含多核苷酸探针的微阵列，所述探针与表1所列至少一个生物标志物互补且可杂交。
另一方面，本发明可包括含多种分离的核酸序列的组合物，其中各分离的核酸序列与选自下列基因的至少一种RNA产物杂交：GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20，其中所述组合物用于测量所述基因的mRNA表达水平。
另一方面，本发明可包括计算机产品，其用于为进行SMO抑制剂药物治疗来选择患有或疑似患有成神经管细胞瘤的受试者：接受对应来自受试者样品中表1所列至少一个基因表达水平的数据的方式；针对各基因产生表达值的方式；和基于将表达值输入数据库来产生评分的方式，所述数据库包含与选择相关的参照表达概况，其中评分预测所述受试者是否受益于SMO抑制剂治疗。所述计算机产品能用于上述任何方法。
“生物标志物”是用作受试者中生物状态指示物的分子。关于本主题，本文公开的生物标志物可以是显示表达变化，从而预测受试者是否受益于接受hedgehog信号转导抑制剂如SMO抑制剂的治疗的分子。
“Hedgehog”一般指果蝇(Drosophila)hedgehog蛋白的任何哺乳动物同源物，包括至少音猬因子(Sonic hedgehog，SHedgehog)、沙漠刺猬(Deserthedgehog，DHedgehog)和印度刺猬(Indian hedgehog，Hedgehog)。
本文所用的“Hedgehog信号通路”指由hedgehog和其受体(或其下游)介导的信号级联，其引起基因表达变化和hedgehog活性典型的其他表型变化。信号通路活化可以归因于正面影响Hedgehog信号传送，即在Hedgehog存在时刺激下游生物事件的Hedgehog信号转导组成部分。所述组成部分的示例是Hedgehog、Ptch、Smo和Gli。Hedgehog阳性(Hh+)肿瘤是有遗传改变且引起组成型hedgehog通路活化的肿瘤，此Hedgehog活化看来是肿瘤形成和生长的主要驱动者。
发明详述
越来越多的证据提示患者的基因档案可能对患者响应治疗性处理有决定性作用。考虑到多种疗法可用于治疗癌症，确定影响例如对特定药物响应的遗传因素能用于向患者提供个体化治疗方案。所述个体化治疗方案提供使患者治疗益处最大化的潜能，同时尽量减少可能与替代性治疗方案关联的相关副作用。因此，需要鉴定能用于预测患者是否可能响应特定治疗的因子。
为了使接受Hedgehog信号转导抑制剂的患者的潜在临床益处最大，能够选择有激活的Hedgehog信号通路的肿瘤患者是重要的。本文所述方法部分基于鉴定表1所列一个或多个生物标志物，所述生物标志物能用于确定患者受益于Hedgehog信号转导抑制剂如SMO抑制剂治疗的可能性。
对本发明的生物标志物进行目的性优化，以用于福尔马林固定、石蜡包埋组织(FFPE)样本，使得其能用于常规临床测试。
Hedgehog信号转导抑制剂
用于本发明的Hedgehog信号转导抑制剂是已知抑制Hedgehog信号通路的试剂。所述试剂可以是抑制表型所引起异常生长状态的试剂，所述表型如Ptch或Sufu的功能丧失型突变，或者Hedgehog、Smoothened或Gli的功能获得型突变。Hedgehog抑制剂为本领域已知，包括例如小分子化合物、小肽、抗体、反义寡核苷酸、siRNA等。
在一些实施方式中，所述hedgehog信号转导抑制剂是小分子化合物。在一些实施方式中，所述hedgehog信号转导抑制剂是环巴胺或其衍生物。在一些实施方式中，所述hedgehog信号转导抑制剂是蒜藜芦碱、GANT61、purmorphamine(2,6,9-三取代嘌呤化合物)、SAG、SANT-2、番茄碱、花姜酮、或其衍生物。在一些实施方式中，所述hedgehog信号转导抑制剂是GDC-0449(可获自基因泰克(Genentech)和/或库里斯公司(Curis))；XL139、IPI926(可获自无限制药公司(Infinity Pharmaceuticals))、IPI609(IPI269609)、BMS-833923/XL139(可获自百时美施贵宝(Bristol-MyersSquibb)和/或Exelixis)、TAK-441(千年制药公司(Millennium))或PF-04449913(辉瑞(Pfizer))。
其他hedgehog信号转导抑制剂参见PCT/US2010/038568、PCT/US2010/044168、PCT/US2009/061573、PCT/US2009/063696、PCT/US2009/039065，所有这些都通过引用全文纳入本文。
本文所述hedgehog信号转导抑制剂可以是试剂本身、其药学上可接受盐、其药学上可接受酯以及立体异构体、对映体、外消旋混合物等。在一个实施方式中，所述hedgehog信号转导抑制剂是SMO抑制剂，如2-甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺，也称为N-[6-(顺-2,6-二甲基吗啉-4-基)吡啶-3-基]-2-甲基-4’-(三氟甲氧基)[1,1’-联苯]-3-甲酰胺，其公开于国际专利申请号WO 2007/131201和WO2008/154259，所有这些都通过引用全文纳入本文。在另一个实施方式中，所述hedgehog信号转导抑制剂是WO 2010/007120公开的2-[(R)-4-(6-苄基-4,5-二甲基-哒嗪-3-基)-2-甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']二吡嗪-5'-基]-丙-2-醇，其都通过引用全文纳入本文。
所述hedgehog信号转导抑制剂包括式I的化合物：
其中
Y选自N和CR10；其中R10选自氢、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基和-OXNR10aR10b；其中R10a和R10b独立选自氢和C1-6烷基；
R1选自氰基、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、C6-10芳基、二甲基-氨基、C1-6烷基-硫烷基和C3-8杂环烷基，可选由多至2个C1-6烷基取代；
R2和R5独立选自氢、氰基、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基和二甲基氨基；
R3和R4独立选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基；或者R1和R2或R1和R5与其都结合的苯基一起形成C5-10杂芳基；
R6和R7独立选自氢、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基；附加条件是R6和R7不都为氢；
R8选自氢、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基；
R9选自–S(O)2R11和–R11；其中R11选自芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基；
其中R9的所述芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基能可选地由1-3个独立选自以下的基团取代：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基和C3-8杂环烷基；
其中R9的所述芳基-烷基取代基可选地由1-3个独立选自以下的基团取代：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基和甲基-哌嗪基；和其药学上可接受的盐。
在另一个实施方式中，本发明包括式I(a)的hedgehog信号转导抑制剂：
或其药学上可接受的盐，其中
R11是C1-8烷基、C2-8烯基、C3-14环烷基、C6-14芳基、5-14元杂芳基、3-14元环杂烷基、C1-8烷氧基、卤素、NR13R14、C(O)OR13、C(O)NR13R14、C1-8卤代烷基、甲酰基、烷酯基、C1-8烷基OH、C(O)R13、SO2R13、C(O)NHC1-8烷基R13、NR13R14、SO2NR13R14、OCF3、NHC(O)R13、CH2OC(O)NR13R14、CH2NR13R14、NHC(O)OR13、NHC(O)NR13R14、CH2NHSO2R13、CH2NHC(O)OR13、OC(O)R13或NHC(O)R13，其可以是取代的或未取代的；
R12是H,C1-8烷基、C6-14芳基、C1-8卤代烷基、C1-8烷氧基、卤素、NH2、CN、OCF3、OH、C(O)NR13R14、C(O)R13、NR13R14、NHC(O)R13、SO2R13、SO2NR13R14；
R13和R14独立地是H、C1-8烷基、C2-8烯基、C3-14环烷基、C6-14芳基、5-14元杂芳基、3-14元环杂烷基、C1-8卤代烷基、C1-8烷基OH、C1-8烷氧基、或一个原子上的R13和R14能形成含环的杂原子，和
其中R11、R13和R14可以未取代或由C1-8烷基、C3-14环烷基、C6-14芳基、5-14元杂芳基、3-14元环杂烷基、C1-8烷基OH、OH、氧络、C1-8卤代烷基、羧C1-8烷基、或SO2C1-8烷基、卤素、-OCH3、-OCF3、-OH、-NH2中的一个或多个取代。
生物标志物
本发明的生物标志物包括表1所列一个或多个基因或者其基因产物。通过分析表1所鉴定一种或多种生物标志物的表达水平，能选择hedgehog通路被活化并因而可能响应Hedgehog信号通路抑制剂如Smoothened(SMO)拮抗剂治疗的患癌个体。
本发明的生物标志物包括GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20。GLI-1、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1和APBA2上调(mRNA表达增加)，而OTX-2和SPATA20下调(mRNA表达减少)。在一个示例中，所述表达概况可以是代表一个或多个下列基因GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20的mRNA水平的一组值。在另一个示例中，所述表达概况可以是代表一个或多个下列基因GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3和SPHK1的mRNA水平的一组值。在另一个示例中，所述表达概况可以包括表示一个或多个由GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20所编码蛋白或多肽的一组值。短语“mRNA表达”可表示患癌个体样品的mRNA表达量相较对照样品增加或减少。通常，mRNA表达增加或减少指与对照(如从对照测定的正常水平)相比，1.5倍或更多(如2、3、4或5倍)的表达差异。
样品制备
可以使用取自患有增生性疾病个体的任何合适细胞测试样品。一般，所述细胞测试样品或组织样品通过活检或手术切除获自癌症受试者。细胞、组织或液体样品可通过针吸取活检移出。为此，将连接注射器的细针经皮肤插入目标组织。所述针通常用超声或计算机断层扫描(CT)成像引导至目标区域。一旦针插入组织，用注射器产生真空，从而细胞或液体可经针吸入并收集于注射器中。细胞或组织的样品还可通过切开性活检或空芯针活检移出。为此，从目标区域移出圆锥形、圆柱形或少量组织。CT成像、超声或内窥镜一般用于指导此类活检。更特定地，完整癌病灶可通过切除性活检或手术切除来移出。本发明中，所述测试样品典型是作为手术切除一部分移出的细胞样品。
例如，组织的测试样品也可保存于例如RNAlater(安碧公司(Ambion)；得克萨斯州奥斯丁)或速冻并-80℃保存，供以后使用。活检的组织样品还可用固定剂如甲醛、多聚甲醛或乙酸/乙醇固定。固定的组织样品可包埋于蜡(石蜡)或塑料树脂。包埋的组织样品(或冷冻组织样品)可切成薄切片。还可从固定或蜡包埋组织样品或冷冻组织样品中提取RNA或蛋白。一旦细胞样品或组织样品从癌症受试者中移出，可以使用本领域熟知以及下述技术对其分离RNA或蛋白。
从取自癌症患者的活检中提取RNA的一个示例可以包括例如硫氰酸胍裂解然后CsCl离心(Chirgwin等,Biochemistry 18:5294-5299,1979)。可如从单细胞制备cDNA库的方法所述，获得来自单细胞的RNA(参见例如Dulac,Curr.Top.Dev.Biol.36:245,1998；Jena等,J.Immunol.Methods190:199,1996)。在一个实施方式中，可针对目标序列富集所述RNA群，如表1和2所详述。例如，可通过随机六聚体和引物特异性cDNA合成、或多轮基于cDNA合成和模板导向体外转录的线性扩增来完成富集(参见例如Wang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9717,1989；Dulac等,同上；Jena等,同上)。其它从样品分离RNA的方法为本领域已知且包括Trizol(英杰公司(Invitrogen))、硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取、PureLink微到中等总RNA纯化系统(英杰公司)、RNeasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen))、Oligotex试剂盒(凯杰公司)、PureYieldTM RNA Midiprep(普洛麦格公司(Promega))、PolyATtract系统1000(普洛麦格公司)、Maxwell(R)16系统(普洛麦格公司)、SV总RNA分离(普洛麦格公司)、ToTALLY RNATM试剂盒(安碧公司)、Poiy(A)PuristTM试剂盒(安碧公司)和任何其他方法。提取和分析RNA样品的方法公开于Molecular Cloning,A Laboratory Manual(《分子克隆，实验室手册》)(Sambrook和Russell(编),第3版(2001),美国纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。
Hedgehog表达概况能在取自受试者的活检如新鲜组织、冷冻组织、福尔马林(FFPE)或其他固定剂处理的组织上进行。特定地，当所述样品是FFPE样品时，用Qiagen RNeasy FFPE提取试剂盒(凯杰公司)从FFPE切片中提取RNA，并用随机六聚体和ABI大容量cDNA库试剂盒(加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司(Applied Biosystems))反转录成cDNA。
患有肿瘤或癌症的受试者一般是哺乳动物受试者，如灵长类动物。在一个示例性实施方式中，所述受试者是人。如本文所用，术语患者和受试者是同义的。
任何癌症或肿瘤能根据本发明方法筛选，且包括但不限于结肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、和肝细胞癌、基底细胞癌、乳腺癌、骨肉瘤、软组织肉瘤、慢性髓性白血病、急性髓性白血病、血液学癌症,成神经管细胞瘤、横纹肌肉瘤,神经母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、脑膜瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、黑素瘤、胃癌、食管癌,胆管癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质细胞癌、多发性骨髓瘤、结肠癌、神经外胚层肿瘤、神经内分泌瘤、肥大细胞瘤和Gorlin综合征、胶质瘤、结直肠癌、GIST、胃食管癌、骨髓增生性瘤和急性白血病。
生物标志物表达的检测
在一个示例中，所述方法包括测定基因GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20中一个或多个的表达。目标基因序列可以用试剂检测，所述试剂可用于特异性检测所述基因，如从该基因转录的RNA或该基因编码的多肽。
在一个实施方式中，所述方法包括：提供含核苷酸序列，例如至少10、15、25或40个核苷酸，和多至全部或几乎全部编码序列的核酸探针，所述编码序列与GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20核酸序列的一部分编码序列互补；从有癌细胞的哺乳动物中获得组织样品；将所述核酸探针在严谨条件下与获自成神经管细胞瘤患者活检的RNA接触(如在Northern印迹、原位杂交试验、PCR等中)；测定所述探针与RNA杂交的量。核酸可在RNA富集和/或扩增期间或之后进行标记。
生物标志物GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20也意在包括天然产生的序列，所述序列包括等位基因变体和其他家族成员。本发明的生物标志物还包括与密码子简并引起的所列序列互补的序列以及足够同源的序列和在严谨条件下与本发明基因杂交的序列。
杂交条件为本领域技术人员已知且可参见Current Protocols inMolecular Biology(《新编分子生物学实验指南》),纽约的约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons)(1989),6.3.1-6.3.6。高度严谨杂交条件的优选、非限制性示例是在约45摄氏度于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50-65摄氏度于0.2X SSC,0.1％SDS中洗涤一次或多次。“足够同源的”指某一生物标志物的氨基酸或核苷酸序列，其相对第二氨基酸或核苷酸序列含有足够或最少数目的相同或等同(如有相似侧链的氨基酸残基)氨基酸残基或核苷酸，从而第一和第二氨基酸或核苷酸序列有共同结构域或基序和/或共同功能活性。例如，有共同结构域的氨基酸或核苷酸序列在结构域的氨基酸序列上有至少约50％同源性、至少约60％同源性、至少约70％同源性、至少约80％同源性、和至少约90-95％同源性，在本文中定义为足够同源的。此外，有至少约50％同源性、至少约60-70％同源性、至少约70-80％同源性、至少约80-90％同源性、和至少约90-95％同源性且有共同功能活性的氨基酸或核苷酸序列在本文中定义为足够同源的。
比较序列和确定2种序列间的百分比同源性能用数学算法完成。用于比较序列的优选、非限制性数学算法示例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77所改良。将这种算法纳入Altschul等.(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)。BLAST核苷酸搜索能用NBLAST程序进行，评分＝100，字长＝12，以获得与本发明TRL核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索能用XBLAST程序进行，评分＝50，字长＝3，以获得与表1、表2和/或表3所列基因和/或寡核苷酸编码的蛋白序列同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对(gapped alignment)，间隙BLAST(Gapped BLAST)能如Altschul等,(1997)Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402所述使用。使用BLAST和间隙BLAST程序时，能使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的另一优选、非限制性数学算法示例是Myers和Miller,CABIOS(1989)的ALIGN算法。使用ALIGN程序以比较氨基酸序列时，能使用PAMl 20权重残基表，缺口长度罚分为12和缺口罚分为4。
本发明包括测量患有hedgehog通路活化所引起癌症的受试者的肿瘤活检中一个或多个基因GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20的表达。可分析所述表达水平并用于产生某一评分，所述评分能用于区分显示hedgehog通路活化的肿瘤患者与不显示的患者。
在一个实施方式中，本发明的方法包括测量表1所列GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20中的任意一种。在另一个实施方式中，本发明的方法包括测量表1中至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个基因。
在一个示例中，测量来自表1的一个基因如GLI-1的表达水平。在另一个示例中，测量来自表1的2个基因如GLI-1、OTX-2的表达水平。在另一个示例中，测量来自表1的3个基因GLI-1、OTX-2和SHROOM2的表达水平。在另一个示例中，测量来自表1的4个基因GLI-1、OTX-2、SHROOM2或PDLIM3的表达水平。在另一个示例中，测量来自表1的5个基因GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3和SPHK1的表达水平。
基因名称 登录#Uni Gene ID
GLI-1 UGID:2139596
OTX-2 UGID:178376
SHROOM2 UGID:1782725
PDLIM3 UGID:237739
SPHK1 UGID:139253
SFRP1 UGID:164788
APBA2 UGID:2087123
SPATA20 UGID:143131
表1
本发明的生物标志物还包括表1所鉴定基因的任何组合，其表达水平或基因产物用作预测性生物标志物。本发明的生物标志物，包括其基因序列是本领域已知的(如上所提供)，或例如，用于GLI-1((GLI家族锌指1；Nature 332:371-374(1988))，用于OTX-2(正小齿同源异形盒2；EBO J.12:2735-2747(1993))，用于SHROOM2(Shroom家族成员2；Hum.Mol.Genet.4:373-382(1995))，用于PDLIM3(PDZ和LIM结构域3；J.Cell Biol.139:507-515(1997))，用于SPHK1(鞘氨醇激酶1；Gene 251:19-26(2000))，用于SFRP1(分泌性卷曲相关蛋白1；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:6770-6775(1997))，用于APBA2(β淀粉样(A4)前体蛋白结合蛋白A家族；J.Biol.Chem.272:31459-31464(1997))，用于SPATA20(精子发生相关基因20；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26),16899-16903(2002))。
本发明方法中，测量表1所述一个或多个基因的表达水平并分析和与对照作比较。用于比较的对照能由本领域技术人员确定。在一个示例中，通过选择作为截留值的值来确定对照。例如，所述值可以是区分以下的值：如区分hedgehog活化(hedgehog+)的测试样品与不显示hedgehog活化(hedgehog-)的测试样品。在另一个示例中，本发明生物标志物的基因表达概况与对照(在取自健康人或hedgehog活化肿瘤的样品中存在所述生物标志物的表达)作比较。
在本发明的特定实施方式中，预先确定对照并产生某一评分，所述评分能用于选择有hedgehog通路活化所引起的肿瘤的那些受试者。所述表达阈值可用于选择响应hedgehog信号转导抑制剂的个体。
在另一个示例中，对照可包括一个或多个标准化基因(如下所述)，所述基因显示相对恒定的基因表达水平。所述标准化基因校正(标准化)RNA测定量以及所用RNA品质变化的差异。因此，所述试验通常测量并纳入某些标准化基因，如表2所示的标准化基因的表达。
基因名称 登录#
HUWE1 UGID:150675
LARP1 UGID:179374
SOD1 UGID:238951
YME1L1 UGID:714304
表2
本发明的一种方法中，测量表1中一个或多个基因(如2、3、4、5、6、7或8个基因)的表达且一般在由表2所述单个对照基因的表达水平或者4个或3个或2个对照基因均值标准化后转变成表达值。然后，这些表达值会用于产生随后与截留值作比较的评分，以选择有Hedgehog活化肿瘤并因而可能受益于Hedgehog信号转导抑制剂治疗的受试者。在一个示例中，测量GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3和SPHK1中至少2个、3个、4个或所有5个基因的mRNA水平，所述mRNA值在由表2所述单个对照基因的表达水平或者4个或3个或2个对照基因均值标准化后转变成表达值。本发明的标准化基因含UBA和WWE结构域的基因1(UBA andWWE domain containing 1)(HUWEI)、La核糖核蛋白结构域家族,成员1(LARP1)、本发明的超氧化物歧化酶1,可溶性(SOD1)、YME1样1(YME1L1)(包括其基因序列)为本领域已知，例如上面提供了NCBI所提供的基因序列登录号。
本发明的生物标志物能用本领域已知的任何方法如逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测量。所述方法包括用本领域已知和如上所述的任何技术，例如使用来自商业生产商如凯杰公司(Qiagen)的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶来分离mRNA。逆转录步骤通常根据环境和表达概况分析的目标用特异引物、随机六聚体、或寡dT引物引发，所得cDNA可随后用作后续PCR反应的模板。然后，可以利用例如市售可得设备进行TaqMan(R)RT-PCR。
然后，所分离的mRNA可以用本领域已知的任何方法如微阵列分析、定量(‘实时’)PCR、northern印迹和核酸酶保护分析进一步分析。在一个示例中，使用经双重标记荧光生成探针(如用TaqMan(R)探针)测量PCR产物累积的实时定量PCR。实时PCR与以下2种定量竞争PCR都相容：前者中使用各靶序列的内部竞争物进行标准化，后者用样品所含标准化基因或用于RT-PCR的管家基因。更多详述参见例如Held等,Genome Research6:986-994(1996)。在实时PCR测定中，通过荧光信号积累检测阳性反应。Ct(循环阈值)定义为荧光信号跨越阈值(即超过背景水平)所需的循环数。Ct水平与样品中的靶核酸量成反比(即Ct水平越低，样品中的靶核酸量越高)。大部分实时测定经历40个扩增循环。
在另一个示例中，使用微阵列，其包括与基因GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20中一个或多个对应的一个或多个探针。微阵列的应用在阵列表面生成经标记靶核酸的杂交模式。所得经标记核酸的杂交模式可通过多种方法呈现或检测，特定检测方式根据靶核酸的特定标记进行选择。代表性检测方式包括闪烁计数、放射自显影、荧光测量、热量测定、光发射测量、光散射等。
在另一个示例中，能使用低密度阵列(TLDA)，其可包括与基因GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20中一个或多个对应的一个或多个探针。此方法使用进行同步实时PCR反应的微流体卡。
在一个示例中，检测方法采用市售可得的阵列扫描仪(加利福尼亚州圣克拉拉的昂飞(Affymetrix))，例如417点样仪(417.TM.Arrayer)、418阵列扫描仪(418.TM.Array Scanner)、或安捷伦(Agilent)基因阵列扫描仪(GeneArray.TM.Scanner)。此扫描仪由系统计算机控制，所述计算机有界面和易用软件工具。输出可直接输入多种软件应用或通过多种软件应用来直接读取。扫描装置描述于例如美国专利号5,143,854和5,424,186。
生物标志物基因产物的表达检测
检测由GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20中一个或多个所编码蛋白产物的存在能用本领域已知的任何合适方法完成。例如，可以用于检测目标特定蛋白的目标试剂，如使用抗体。与本发明所用多肽特异性结合的多克隆和/或单克隆抗体的生成方法为本领域技术人员已知，可参见例如Dymecki等(J.Biol.Chem.267:4815,1992)；Boersma和Van Leeuwen(J.Neurosci.Methods 51:317,1994)；Green等(Cell 28:477,1982)；和Arnheiter等(Nature 294:278,1981)。在一个实施方式中，免疫测定能用于定量细胞样品中的蛋白水平。本发明不限于特定测定过程，因此意在包括同类和非同类过程。
可根据本发明进行的示例性免疫测定包括荧光偏振免疫测定(FPIA)、荧光免疫测定(FIA)、酶免疫测定(EIA)、抑制免疫散射浊度分析(NIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。指示部分或标记基团可与所述抗体相连，并进行选择以满足对所述方法多种应用的需求，所述应用通常由测定设备和相容免疫测定过程可用性决定。待用于进行多种上述免疫测定的一般技术为本领域普通技术人员已知。
或者，能使用其他方法如Western印迹分析，包括在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离蛋白，和在对经分离蛋白染色后，各蛋白的相对量可以通过评价其光密度来定量。或者，能使用其他方法如点印迹法、FACS或免疫组化。
通常，针对本发明生物标志物产生的抗体能用于呈现可标记的目标蛋白的存在，例如使用报道分子如荧光团、酶、生物素、化学发光分子、生物发光分子、异羟基洋地黄毒甙元、抗生物素蛋白、链霉亲和素或放射性同位素。
在另一个实施方式中，本发明考虑使用针对本发明标记多肽产生的抗体组。
数据分析
为促进样品分析操作，从所述装置读取器获得的数据可用数字计算机分析。通常，所述计算机进行适当编程以从所述装置接收和保存数据，以及分析和报告集成数据，例如减去背景、验证对照执行正确、标准化信号、解释荧光数据以确定杂交靶标的量、标准化背景等。
药盒
本发明还提供确定本文所述生物标志物表达水平的药盒。所述药盒可用于确定谁能受益于Hedgehog信号转导抑制剂治疗。含表1所鉴定基因探针的药盒能用于测量测试样品的基因表达。在一个实施方式中，所述药盒包括计算机可读介质，所述介质包括能加载到计算机系统存储器中的表达概况分析软件且可将所测表达值转变成危险评分。药盒还包括核酸对照、缓冲液和使用说明书。
给予
本文所述hedgehog信号转导抑制剂能通过本领域已知的常用和可接受模式中任一种选择性给予治疗有效量，根据已确定有本文所述活化hedgehog信号通路的个体而单独使用或与一种或多种治疗剂联用。治疗有效量可根据疾病严重性、受试者年龄和相对健康、所用化合物效力和其他因素而广泛变化。
本领域技术人员会认识到许多与本文所述相似或等同的方法和材料能用于实施本发明。确实，本发明不以任何方式局限于所述方法和材料。出于本发明目的，下列术语如下定义。
实施例
实施例1
多基因Hedgehog标签最初通过分析40FFPE成神经管细胞瘤(MB)样本来开发。来自相同病例的匹配新鲜冷冻样本先前如Y-J Cho和同事(Y-JCho等,JCO,2010)所述进行概况分析，各单独病例根据其基因表达概况确定为Hedgehog活化或非Hedgehog活化。从可用概况分析研究的综合数据库中选择一组32个候选基因和另外22个潜在标准化基因，所述候选基因在hedgehog阳性(Hh+)与hedgehog阴性(Hh-)肿瘤中差异性表达。显示差异性Hh+与Hh-表达的所有候选基因在所评估的全部概况分析研究中一致。开发用于这些候选基因的RT-PCR测定并就FFPE样本应用进行优化。进一步应用中去除在FFPE样本类型内不显示稳健表达的候选基因。就Hedgehog+与Hedgehog-肿瘤中10个上调和8个下调基因加上5个对照基因而言，进一步选择在FFPE中性能稳健的测定并组装到TLDA卡上，其提供相较单一测定模式更经济的组织消耗。然后，在Hedgehog活化状态已知的40个FFPE样本中分析此组23个候选基因。
用Elastic Net方法(J.Friedman、T.Hastie和R.Tibshirani,J.ofStatistical Software,2008)选择在预测Hedgehog活化状态方面误差最小且包括最少基因数的最优模型。2个最优模型在5倍交叉验证中显示相似性能，其中一个有5-基因标签且另一个有8-基因标签。这些模型容许分别根据5个或8个基因的表达水平，计算给定样品是Hedgehog+的概率评分。根据概率评分确立截留值以确定测试样品的Hedgehog+或Hedgehog-状态。
另外，探索使用单一基因(SPHK1、OTX2、SFRP1、PDLIM3或SHROOM2)预测Hedgehog活化状态和用此组40个成神经管细胞瘤肿瘤确立作出Hedgehog+或Hedgehog-判定的各所述基因的截留值。
5-基因和8-基因模型以及单一基因模型都在25个成神经管细胞瘤肿瘤的独立样品组中进一步实施外部验证。所有25名患者都有病理学上确认的诊断，包括13个有经典组织学，9个有结节性/促结缔组织增生性组织学，2个有大细胞/未分化组织学。25名患者中，13个为男性且12个为女性。在诊断时从24个患者收集组织样本并在化疗治疗后从1个患者收集组织样本。这25名患者在诊断时的年龄中位数是3岁，范围为6个月-16岁。来自这25个成神经管细胞瘤病例的FFPE样本通过本发明方法分析以由5-基因和8-基因模型确定Hedgehog活化状态。来自相同25名患者的匹配新鲜冷冻肿瘤样本与FFPE样品在相同时间点收集，用GeneChip人基因组U133Plus 2.0阵列(加利福尼亚州圣克拉拉的昂飞)对其进行基因表达概况分析。所述25名患者根据基于基因概况的成神经管细胞瘤分子亚类分成子群c3(Hedgehog活化亚类)或非子群c3肿瘤，如Y-J Cho和其同事所述(YJ Cho等.JCO,2010)。
25名患者中的8个确定有子群c3、Hedgehog活化肿瘤，而17个有非Hedgehog活化肿瘤。在通过本发明方法分析FFPE肿瘤样本前进行所述25名成神经管细胞瘤患者的分子分类。因此，通过本发明方法分析的FFPE样本被视作有已知的Hedgehog活化状态。根据8个基因(GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20)的表达水平，预测模型用于计算给定样品是Hedgehog+的概率评分(0-100％)。根据预指定的概率截留值，确定各样本是Hedgehog活化或是非Hedgehog活化。8个样本判定为Hedgehog活化且剩余17个判定为非Hedgehog活化，显示与这些样品的已知Hedgehog活化状态100％一致。另外，17个非Hedgehog活化肿瘤的中位概率评分为0.9％，范围为0.2％-3.1％。8个Hedgehog活化肿瘤的中位概率评分为87.0％，范围为70.9％-96.6％。阴性和阳性病例间中位概率评分的显著差异表明通过8-基因模型确定Hedgehog+或Hedgehog-的稳健性。
根据5个基因(GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1)的表达水平和相关预测模型，就25个样本各自计算概率评分并与预指定截留值作比较。然后就各肿瘤确定Hedgehog活化状态，再次与已知Hedgehog活化状态100％一致。17个非Hedgehog活化肿瘤的中位概率评分为0.7％，范围为0.1％-3.0％，8个Hedgehog活化肿瘤的中位概率评分为87.9％，范围为69.1％-97.6％，显示使用5-基因模型时Hedgehog状态确定的相似稳健性。
根据单一基因SPHK1、OTX2、SFRP1、PDLIM3或SHROOM2的表达水平，基于各基因的预指定阈值对25个成神经管细胞瘤病例作出Hedgehog+或Hedgehog-判定。就25个肿瘤各由SPHK1、OTX2或SFRP1作出的Hedgehog判定与已知Hedgehog活化状态完全一致，有8个Hedgehog+判定和17个Hedgehog-判定。根据PDLIM3，作出24/25的正确判定。一个Hedgehog+肿瘤被错误判定为Hedgehog-，产生87.5％的预测敏感性和100％的预测特异性。根据SHROOM2作出的预测显示75％敏感性和94％特异性，有22/25的正确判定。二个Hedgehog+肿瘤被错误判定为Hedgehog-且一个Hedgehog-肿瘤判定为Hedgehog+。因此，除了依赖所涉及基因综合测量的多基因模型以外，多基因Hedgehog标签内的单一基因在就成神经管细胞瘤确定Hedgehog活化状态方面自身显示显著预测能力。本研究提供以下验证：本发明方法中这些基因的每一个可以用于确定成神经管细胞瘤中的Hedgehog活化状态。
选择对照基因HUWE1、LAPR1、SOD1和YME1L1以使基因表达标准化，所述基因根据hedgehog活化状态分类成神经管细胞瘤(MB)肿瘤。理想地，对照基因应在研究的所有肿瘤组织中稳定并以相似水平表达。数个研究表明甚至广泛使用的对照基因如β-肌动蛋白和GAPDH在某些情况中不适合。另外，在新鲜冷冻MB肿瘤样本的可用外部概况分析研究的综合数据库中，这些广泛使用的对照基因显示大于lg2>11的极高表达水平，相比之下hedgehog通路基因的表达水平约为lg2>8。因此，选择表达水平与hedgehog通路基因相似的对照基因。在我们的研究中，表达水平为lg2<8的任何探针组不能通过RT-PCR分析成功检测。
选择对照的重要标准主要是基于所有分析数据集中基因的不变性。变异系数百分比设定为小于4％。根据以下进一步选择标准化基因：设计扩增子尺寸<80bp的测定是否可行，然后稳健表达是否能使用优化测定在FFPE样品中得到证实。
可用的示例性探针如表3所示。
基因 ABI测定ID ReqSeq 外显子边界 标签功能
GLI1 Hs00171790_m1 NM_005269.2 11和12 上
PDLIM3 Hs01062534_m1 NM_014476.3 6和7 上
SHROOM2 Hs01113636_m1 NM_001649.2 9和10 上
SPHK1 Hs00184211_m1 NM_182965.2 5和6 上
OTX2 Hs00222238_m1 NM_021728.2 4和5 下
APBA2 Hs01125385_m1 NM_005503.3 8和9 上
HUWE1 Hs00948075_m1 NM_031407.4 67和68 对照
YME1L1 Hs00204609_m1 NM_139312.1 1和2 对照
SOD1 Hs00533490_m1 NM_000454.4 1和2 对照
LARP1 Hs00391726_m1 NM_015315.3 3和4 对照
表3
SFRP1的示例性探针包括正向引物5’-CCAATGCCACCGAAGCC-3’(SEQ ID NO:1)和反向引物5-TCACAGGGAGGACACACCG-3’(SEQID NO:2)以及FAM。SPATA20的示例性探针包括正向引物5’-CAAGGCCAGGAAGGAAAACA-3’(SEQ ID NO:3)和反向引物5’-CACCAGTGGCAGGTGGAGTA3’(SEQ ID NO:4)以及FAM。
实施例2
将包括成神经管细胞瘤在内的成年癌症患者招募入正在进行的甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺的剂量递增试验I期，以评估甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺的安全性和耐受性并评价就成年患者而言甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺的最大耐受剂量。试验开始前收集的归档FFPE肿瘤样本可用于通过本发明方法从3个此试验中招募的成神经管细胞瘤患者分析。一个用日剂量200mg甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺处理的患者在治疗2个月后达到RECIST标准的部分响应(PR)，所述响应在疾病发展前维持4个月。另一个没有可测量病灶的转移性成神经管细胞瘤患者用1500mg日剂量处理并显示通过正电子放射断层造影术(PET)测量的代谢性部分响应，所述响应在疾病复发前持续7个月。第三个患者在日剂量200mg的甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺处理仅52天后发展迅速。
根据8-基因和5-基因预测模型，本发明方法用于确定这3个患者的肿瘤Hedgehog活化状态。2个应答者确定有Hedgehog活化肿瘤，而无应答者的肿瘤判定为非Hedgehog活化。另外，单一基因SPHK1、OTX2、SFRP1、PDLIM3或SHROOM2各用于根据各基因的预确立截留值确定Hedgehog活化状态。通过各单一基因，分别对2个应答者和1个无应答者作出相同Hedgehog活化和非Hedgehog活化判定。3个患者中，仅1个患者有合适的肿瘤组织样品可用于额外突变分析PTCH1和SMO基因。发现达到代谢性部分响应且由本发明方法判定为Hedgehog+的患者具有PTCH1基因体细胞突变。PTCH1突变失活被鉴定为成神经管细胞瘤中组成型活化Hedgehog通路的主要机制。因此，鉴定此PTCH1突变提供了所述患者中Hedgehog通路活化的机制基础和观察到针对Hedgehog信号转导抑制剂的临床活性，进一步证实本发明方法的所述发现。
实施例3
本发明方法用于就另一组有病理学上确认诊断的40个成神经管细胞瘤证实Hedgehog活化状态。40个病例中，26个有经典成神经管细胞瘤组织学，12个有结节性/促结缔组织增生性组织学，1个有大细胞/未分化组织学。其他与这些病例相关的人口数据不可用。这些肿瘤的Hedgehog活化状态先前通过affymetric基因表达概况分析方法如Y-J Cho和其同事所述(YJCho等.JCO,2010)进行表征。15个病例中的Hedgehog活化判定和剩余25个病例中的非Hedgehog活化判定通过本发明方法根据8-基因模型、5-基因模型和各单一基因SPHK1、OTX2、SFRP1、PDLIM3或SHROOM2在FFPE肿瘤样本中确认。
实施例4
除了Hedgehog活化成神经管细胞瘤以外，基底细胞癌(BCC)是主要由Hedgehog通路基因突变或遗传损伤(其导致Hedgehog通路组成型活化)驱动的另一癌症类型。发现超过90％的BCC(最普遍的皮肤癌)患者在PTCH1基因中有失活突变或其他Hedgehog通路基因的遗传损伤如激活SMO突变的频率较低。在正在进行的甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺(拮抗SMO的Hedgehog信号转导抑制剂)的剂量递增试验I期中，在其他实体瘤患者中招募成年BCC患者。通过直接测序对从所招募BCC患者诊断时收集的归档肿瘤样本进行PTCH1和SMO的突变分析。发现6个BCC患者有PTCH或SMO突变，包括2个鉴定有种系PTCH1突变的Gorlin综合征患者。本发明方法用于确定这些患者的BCC肿瘤的Hedgehog活化状态。用5-基因和8-基因模型，所有6个病例的概率评分高于预指定截留值，因此，都判定为Hedgehog活化。这6名患者中，2个获得针对甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺治疗的部分响应，2个疾病稳定超过6个月，另2个患者在治疗小于2个月后由于不良事件而中断甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺，这可能太简短而无法观察任何临床活性。所述正突变中显示的一致性引起PTCH1/SMO和由本发明方法作出的Hedgehog+判定，尽管在另一癌症类型中，进一步验证了本发明方法。本发明方法能用于鉴定具有相同潜在Hedgehog-突变驱动病因学的其他肿瘤类型，其可能优先受益于Hedgehog信号转导抑制剂治疗。
实施例5
GLI-1和SFRP-1表达在蛋白水平的免疫组化(IHC)分析描述于PANorthcott等,JCO,2010。表明来自这2个蛋白标志物的阳性IHC染色的存在能用作鉴定Hh+成神经管细胞瘤的方法。GLI-1和SFRP-1都是本发明方法所述的个体基因。使用针对GLI-1(马萨诸塞州贝弗利的细胞信号转导公司(Cell Signaling))和SFRP-1(马萨诸塞州剑桥的阿柏堪穆公司(Abcam))的蛋白产物的抗体，由本发明方法确定Hh活化状态的40个成神经管细胞瘤FFPE组织样本接受IHC分析。玻片上肿瘤内容物中有任何水平的Gli-1核染色或SFRP-1胞质染色的样本被判定为Hh阳性。合适细胞位置中2个标志物染色都没有的样本被判定为Hh阴性。由IHC方法和本发明方法确定的Hh活化状态在所有测试病例中一致，导致所述2种方法间100％一致性。另外，观察到Gli-1和SFRP-1IHC染色之间高度一致。此数据不仅进一步验证本发明方法，还确认本发明方法所述的个体标志物在转录物水平以及蛋白水平都能表达。

Claims (15)

1.一种分析癌症受试者的生物样品的方法，所述方法包括测定取自所述受试者的生物样品中生物标志物GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、和SPHK1的表达水平，其中所述生物标志物相较对照的表达水平提供所述受试者是否具有增加的响应甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺或2-[(R)-4-(6-苄基-4,5-二甲基-哒嗪-3-基)-2-甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']二吡嗪-5'-基]-丙-2-醇的可能性的诊断指示物。
2.一种为进行Hedgehog信号转导抑制剂治疗来选择患癌受试者的方法，所述方法包括测定获自所述受试者的生物样品中至少3个选自由以下组成的组的生物标志物的表达水平：GLI-1、OTX-2、SHROOM2、PDLIM3、SPHK1、SFRP1、APBA2和SPATA20，从而预测响应Hedgehog信号转导抑制剂治疗的增加的可能性。
3.如权利要求2所述的方法，所述方法包括测定至少4个生物标志物的水平。
4.如权利要求2所述的方法，所述方法包括测定至少5个生物标志物的水平。
5.一种为进行甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺或2-[(R)-4-(6-苄基-4,5-二甲基-哒嗪-3-基)-2-甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']二吡嗪-5'-基]-丙-2-醇治疗来选择患癌受试者的方法，所述方法包括测定获自所述受试者的生物样品中SHROOM2的水平，从而预测响应甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺或2-[(R)-4-(6-苄基-4,5-二甲基-哒嗪-3-基)-2-甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']二吡嗪-5'-基]-丙-2-醇的增加的可能性。
6.一种为进行甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺或2-[(R)-4-(6-苄基-4,5-二甲基-哒嗪-3-基)-2-甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']二吡嗪-5'-基]-丙-2-醇治疗来选择患癌受试者的方法，所述方法包括测定获自所述受试者的生物样品中SPHK1的水平，从而预测响应甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺或2-[(R)-4-(6-苄基-4,5-二甲基-哒嗪-3-基)-2-甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']二吡嗪-5'-基]-丙-2-醇的增加的可能性。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述hedgehog信号转导抑制剂是甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺或2-[(R)-4-(6-苄基-4,5-二甲基-哒嗪-3-基)-2-甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']二吡嗪-5'-基]-丙-2-醇。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述测定是mRNA的表达水平。
9.一种药盒，所述药盒包括测定样品中权利要求1或2所列生物标志物表达水平的多种试剂和使用说明书。
10.一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，所述方法包括根据患者具有上升水平的生物标志物GLI-1、SHROOM2、PDLIM3和SPHK1表达以及减少水平的生物标志物OTX-2表达，向所述患者选择性给予Hedgehog信号转导抑制剂。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，测定所述患者样品的所述生物标志物表达且所述样品是福尔马林固定、石蜡包埋的组织(FFPE)。
12.如权利要求1-8和10-11所述的方法，其特征在于，所述癌症是BCC、成神经管细胞瘤、横纹肌肉瘤、CML、骨肉瘤、软组织肉瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、Gorlin综合征或乳腺癌。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述癌症是成神经管细胞瘤。
14.如权利要求1-8或10-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是甲基-4'-三氟甲氧基-联苯-3-羧酸[6-(顺-2,6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺。
15.如权利要求1-8或10-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是2-[(R)-4-(6-苄基-4,5-二甲基-哒嗪-3-基)-2-甲基-3,4,5,6-四氢-2H-[1,2']二吡嗪-5'-基]-丙-2-醇。
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