CN110199024A

CN110199024A - 治疗nsclc患者的药剂和预测反应的方法

Info

Publication number: CN110199024A
Application number: CN201780084269.4A
Authority: CN
Inventors: N·鲍狄埃; C·科费兹; G·萨瓦里; E·德瓦尔兹; C·范德华尔特; B·马里
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Lille 2 Droit et Sante; Centre Hospitalier Regional Universitaire de Lille CHRU; Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Lille 2 Droit et Sante; Centre Hospitalier Universitaire de Lille CHU; Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2019-09-03
Also published as: EP3545091A1; US20220389420A1; WO2018096060A1; JP2020502263A

Abstract

本发明属于非小细胞肺癌的治疗领域。本发明提供了治疗患有非小细胞肺癌的患者的药剂和相关的诊断方法，包括预测患有或疑似患有非小细胞肺癌的患者对铂类化疗的反应的方法。

Description

治疗NSCLC患者的药剂和预测反应的方法

技术领域

背景技术

肺癌是全球死亡的主要原因，每年造成超过130万人死亡(Jemal等，2008年)。大多数(>80％)肺癌可归因于吸烟，并且认为总共有九分之一的吸烟者在其一生中会患上肺癌(Jemal等，2008年)。肺癌是发生在支气管、气管或肺组织中的原发性恶性肿瘤，肺癌可分为两个不同的主要病种(entity)：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，它们发展自不同类型的肺细胞，并且它们在生长特征和在患者体内扩散方面表现不同。此区别在临床以及肿瘤遗传学和生物学方面均至关重要(Goldstraw等，2011年)。

非小细胞肺癌(NSCLC)占在许多国家最常见形式的肺腺癌(LUAD)病例的至少80％(世界卫生组织，2012年)。在诊断时，NSCLC患者可分为反映疾病程度的4个时期(stage)，从而治疗。I期患者的预后最好，5年生存率为60％以上。II期和IIIA期包括患有局部(locally)或区域(regionally)晚期肺癌的患者。这些患者的5年生存率的范围为10％至50％。最后一组包括有或没有远处转移(distant metastase)的晚期疾病患者(IIIB期和IV期)。这些患者预后最差，5年生存率低于10％。值得注意的是，大多数患有早期疾病的患者最终将经历肿瘤复发并死于肺癌。最后，估计患有NSCLC的患者的总体5年生存率仅为16％(Goldstraw等，2011年)。

在过去十年中，尽管在NSCLC的治疗方面取得了显著进展，这种恶性肿瘤仍然与大多数患者的不良治疗反应率以及不良预后有关(Chang，2011年)。据认为，手术是早期NSCLC治疗的关键组成部分，并且最新的指南建议在新辅助(neoadjuvant)或辅助(adjuvant)治疗(setting)中使用与手术或放射治疗联合的一线铂类(platinum-based)联合治疗(Friboulet等，2013年；Goldstraw等，2011年)。大多数患者被诊断为NSCLC晚期并且不适合手术切除，在该组患者中铂类联合治疗为一线治疗(first-line treatment)。患者中NSCLC药物反应和毒性的差异性是多因素的，包括遗传(表观遗传)决定因素和疾病决定因素或环境因素(如缺氧)(Chang，2011年)。因此，阐明癌细胞对当前治疗的耐受性的分子机制对于防止这些逃逸途径的精确定位策略是至关重要的。虽然在理解NSCLC耐药性方面取得了重大进展，但非编码RNA(特别是miRNA)的作用记录很少。因此，发明人揭示了miR-24-3p簇的miRNA的先前未报道的作用，并开发出了用于诊断和治疗NSCLC的有用方法和产品。更具体地，发明人揭示了miR-24-3p在预后不良的患者中以较高水平表达，并且miR-24-3p的抑制可以使(患者)对铂类化疗敏感。

发明内容

因此，发明人提供了一种miR-24-3p抑制剂，特别是用于治疗患者，特别是人类患者，更特别是患有非小细胞肺癌(NSCLC)(特别是肺腺癌(LUAD)，更特别是III期或IV期NSCLC或LUAD)的人类患者。该抑制剂还与铂类化疗剂组合提供，和/或提供用于用铂类化疗治疗的患者(特别是如上所述的患者)，特别是当所述化疗治疗与使用抑制剂的治疗同时进行或在使用抑制剂的治疗之后进行。

在本文中，发明人还提供了一种预测患者(特别是人类患者，更特别是患有非小细胞肺癌(NSCLC)(特别是肺腺癌(LUAD)，更特别是III期或IV期NSCLC)的人类患者)对铂类化疗的反应可能性的体外方法，所述方法包括以下步骤：(i)从所述患者获得生物样品；(ii)评估至少一种选自miR-24-3p、miR-23a-3p和miR-27a-3p的miRNA的表达水平。还提供了一种具有类似步骤的选择患者的方法，所述患者可能受益于使用miR-24-3p抑制剂(可能与铂类化疗相联合)的治疗。

发明人还提供了一种用于患者的miR-24-3p抑制剂，其中，测量至少一种选自miR-24-3p、miR-23a-3p和miR-27a-3p的miRNA的表达水平，特别是其中，发现所述患者中所述miRNA的表达水平等于或高于参考水平。特别地，提供该抑制剂用于与铂类化疗剂组合用于此类患者，和/或提供该抑制剂用于经铂类化疗治疗的此类患者。

发明人还提供了用于患者(特别是人类患者，更特别是患有非小细胞肺癌(NSCLC)(特别是肺腺癌(LUAD)，更特别是III期或IV期NSCLC)的人类患者)的铂类化疗剂，其中，测量所述患者中至少一种选自miR-24-3p、miR-23a-3p和miR-27a-3p的miRNA的表达水平，特别是其中，发现所述患者中的所述miRNA的表达水平低于参考水平。

具体实施方式

测定给定miRNA表达水平的方法和诊断方法

发明人在此提供的方法包括评估或测定生物样品中miRNA的表达水平的步骤。评估表达水平特别指所述miRNA的绝对量的直接测量。评估表达水平还可以指所述水平的相对测量，特别是测定所述miRNA的量相对于其他RNA(特别是其他miRNA)的量的方法步骤。

该值可以以技术人员公知的任何合适的单位表示。特别地，所述单位与细胞中或给定量的样品中miRNA的量呈线性或对数关系。所述单位还可以与miRNA相对于样品中另一分子或生物实体(或其他实体)的摩尔比或重量比呈线性或对数关系，所述生物实体特别是一种或几种蛋白质(或蛋白质的总量)或一种或几种RNA(或RNA的总量)，更特别是一种或几种miRNA。所述单位也可以不直接与miRNA的量相关，而是与随所述miRNA的量变化的参数(例如在qPCR-型步骤中获得显著扩增的循环数)相关。所述单位可以是任意的，在某种意义上，它们仅与给定实验步骤中miRNA的量有关，该量通常不能与在独立步骤中测定的量进行比较：必须将该量与其他量(例如其他miRNA的量)进行比较，所述其他量在相同的步骤中测定并以相似的任意单位表示，因此可以进行比较。

在某些实施方式中，本发明的诊断方法包括测定至少一种miRNA的表达水平的步骤，所述miRNA选自miR-24-3p、miR-23a-3p和miR-27a-3p。miR-24-3p、miR-23a-3p和miR-27a-3p统称为“miR-24-2簇的miRNA”，并且“miR-24-2簇的miRNA”表示至少一种(即一种、两种或三种)miRNA，所述miRNA选自miR-24-2簇的miRNA组。要测定表达水平的miRNA在本文中称为“目标miRNA”。这不包括如下文详述的测定其量用于校准或归一化目的的miRNA。miR24-2簇的三种miRNA同时表达并形成相同转录实体的一部分。

在某些实施方式中，测试来自该组中一种miRNA的表达水平。在具体实施方式中，测试miR-24-3p的表达水平。在某些实施方式中，测试两种miRNA的表达水平。在某些实施方式中，测试miR-24-3p和miR-23a-3p，或miR-24-3p和miR-27a-3p或miR-23a-3p和miR-27a-3p的表达水平。在某些实施方式中，测试miR-24-2簇的所有三种miRNA的表达水平。

在某些实施方式(其中，测定几种miRNA的表达水平；和/或其中，相同miRNA的表达水平被测定数次)中，特别地，可以将若干值组合在单个值中以用于比较(或评分)目的。如本文所使用的“组合值(Combining value)”意味着使用所述值来进行运算(特别是数学运算)，以获得与原始值直接相关的组合值。特别地，组合值是原始值的平均值，或中值，或原始值的总和。特别地，如果对相同的miRNA进行多次测定，则这些测定的组合值(特别是平均值)可用于表示该miRNA的表达水平。类似地，可以使用几种目标miRNA的表达水平的平均值。可以使用中值、总和或任何其他组合值来代替平均值。

在某些实施方式中，表达水平被归一化。使用本领域技术人员已知的方法进行归一化。特别地，可以将该水平相对于一种或几种miRNA或其他RNA(如snRNA或“跟踪标定(spike-in)”RNA)的表达水平进行归一化。优选地，这种miRNA与miR-24-3p无关，并且优选地，这种miRNA与miR-24-2簇的任何miRNA无关。

在某些实施方式中，本发明的诊断方法包括将目标miRNA的表达水平与参考水平(或参考表达水平)进行比较的步骤。

在某些实施方式中，参考表达水平由在相同的实验条件下的相同miRNA的表达水平的测定(“参考测定(reference determination)”)来确定。优选地，对参考测定的表达水平与样品测定的表达水平进行相同的数值变换。特别地，使用相同的规则对表达进行归一化。与目标样品中的表达水平类似，可以组合参考测定(其中，该测定进行数次)的表达水平。总之，将对表达水平和参考表达水平进行相同的运算。

在将测量的miR-24-2簇的miRNA的表达水平与参考表达水平进行比较的实施方式中，当测量的水平以任何量高于参考水平时，可以称所述测量的表达水平比所述参考表达水平“更高”，或者可选地，仅当差异足够显著时，可以称所述测量的水平比所述参考水平“更高”。特别地，当比率(测量/参考)大于1时，或当比率大于1.1时，优选当比率大于1.5时，可以称所述测量的表达水平高于所述参考表达水平。相反，在以下情况下，可以称测量的表达水平低于参考表达水平：(i)当测量的表达水平根据上述标准之一不是更高时，或者(ii)当测量的表达水平以任何量低于参考水平时，或者(iii)当测量的表达水平以显著量低于参考水平时，特别是当比率(测量/参考)低于1，或低于0.9，或低于0.5，或低于0.1时。

优选地，本文提供的测试方法在体外进行。一般而言，技术人员知晓用于测试来自患者的样品中miRNA的表达水平的体外方法。可以在实施例部分和本文引用的参考文献中找到指导。

在某些实施方式中，样品为肿瘤样品(即，取自包含癌细胞的组织的样品)，更特别地，样品为来自原发性肿瘤或来自转移(metastasis)的样品。在具体的实施方式中，样品为来自肺活检(lung biopsy)的样品。可以使用穿刺活检(needle biopsy)或由本领域已知的任何其他方法获得的活组织检查。在某些实施方式中，样品为流体样品(即，来自生物流体的样品)，特别是血液样品，特别是血清样品或血浆样品。在某些实施方式中，样品包含或由循环肿瘤细胞(即，在血流中发现的肿瘤细胞)组成。技术人员知道从血液样品中分离(或浓缩)此类细胞的方法，并且特别地，样品可以是分离的循环肿瘤细胞的样品。

在某些实施方式中，参考表达是同一患者的非肿瘤细胞中的表达水平。特别地，参考表达是所述患者的非肿瘤组织中的表达水平。在某些实施方式中，参考水平由参考群体中测量的表达水平建立。在某些实施方式中，参考表达水平被确定为参考群体中所进行的测量的平均值。在某些实施方式中，参考表达水平是参考群体中的中值表达水平。

在某些实施方式中，特别地，参考群体包含至少10个个体，优选至少50个个体，更优选至少100个个体，甚至更优选至少250个个体。在某些实施方式中，参考群体是非选定的群体(即，群体中的个体不是根据任何特定标准选择的)。在某些实施方式中，参照群体包含大多数或仅包含未患有任何经诊断的癌症的个体。在某些实施方式中，参考群体包含大多数或仅包含患有肺癌(特别是NSCLC，更特别是LUAD)的个体。在某些实施方式中，参考群体包含大多数或仅包含患有NSCLC(更特别是LUAD)的个体，并且所述个体的选择不依赖于是否对化疗有反应(即，对铂类化疗有反应或没有反应不是选择因素)，或者所述参考群体是选定的无应答(non-responder)患者，即，参考群体中包括的患者对铂类化疗没有反应(和/或获得性耐药性)。

本发明的诊断方法通常用于帮助评估患者的病情、所述病情的演变(evolution)、所述病情的可预测的演变、患者对治疗(特别是铂类化疗)的反应(即，当在所述治疗下时病情的演变)，和/或对所述治疗的可预测的反应中的至少一个。本文提供了适合和/或旨在用于此类用途的方法。在本领域技术人员对术语的最广泛解释中，此类方法在本文中统称为“诊断方法”。特别地，在狭义上，诊断方法包括在以下方面的诊断：测定患者病理状态的存在和性质，以及预后(确定病情的可预测演变)、分期(确定病情的严重性和/或演变程度)，伴随诊断(确定对治疗的反应或反应的可能性)，易感性(predisposition)测试等。

在优选的实施方式中，患者是人类患者，特别是患有非小细胞肺癌(特别是肺腺癌)的患者。在某些实施方式中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施方式中，癌症是肺腺癌(LUAD)。在某些实施方式中，癌症是III期或IV期NSCLC和/或LUAD。

在优选的实施方式中，该方法旨在预测耐药可能性的增加，或对铂类化疗治疗的反应可能性的增加。对(对治疗的反应和/或耐药的)可能性的预测旨在表示提供关于所述可能性的任何信息，其中，所述信息不能通过(或者来自除下述提供的信息之外)患者的临床状态以及与miR-24-2簇的miRNA表达不直接相关的任何参数而获得。特别地，基于患者的临床观察、医学成像、生物学测试(与miR-24-2簇的miRNA的表达没有直接关系)等，在进行本发明的方法之前(或独立于本发明的方法)，建立反应和/或耐药可能性的“基线”，并且考虑使用本发明的方法测量的表达水平，调整(增加或减少，有或没有对这种增加或减少的程度的定量评估)所获得的基线值(或估计值)。

更具体地，当测定miR-24-2簇的miRNA的所述表达水平低于参考值时，独立于本发明方法所确定的反应可能性的基线增加，和/或当测定所述表达水平等于或高于参考值时，耐药可能性增加。

特别地，当患者对所述化疗的反应可能性(或概率)高于癌症患者(或者更具体是患有相同或类似类型和/或相同或相似阶段的癌症的患者，特别是患有NSCLC(特别是LUAD，更特别是III期或IV期NSCLC或LUAD)的患者)的平均反应可能性时，则称该患者预期对铂类化疗有反应。

因此，本文提供的方法包括以下步骤：

(i)评估预先从患者获得的生物样品(优选肿瘤样品)中至少一种miRNA的表达水平，所述miRNA选自miR-24-3p、miR-23a-3p和miR-27a-3P；可选地，(ii)将所述miRNA的表达水平与参考水平进行比较；并且可选地，(iv)如果在患者中测量的表达水平等于或高于所述参考水平，则得出结论：该患者对铂类化疗具有耐药性的可能性增加。

在具体实施方式中，该方法还包括：(v)如果在来自患者的样品中测量的表达水平低于所述参考水平，则用铂类化疗来治疗患者。

在具体实施方式中，该方法还包括：(v')如果在来自患者的样品中测量的表达水平等于或高于所述参考水平，则用非铂类疗法来治疗患者。

在具体实施方式中，该方法还包括：(v”)如果在来自患者的样品中测量的表达水平等于或高于所述参考水平，则用miR-24-3p抑制剂治疗患者，可选地与铂类化疗组合。

因此，本文提供了用于患者的铂类化疗剂，其中，特别是根据本文公开的任何方法，评估了来自miR-24-2簇的至少一种miRNA的表达水平，并且特别地，其中发现至少一种miRNA的表达水平和/或目标miRNA的组合表达水平等于或高于参考值，特别地，所述值如本文所提供的那样测定。

本文还提供了用于患者的miR-24-3p的抑制剂，其中，特别是根据本文公开的任何方法，评估了来自miR-24-2簇的至少一种miRNA的表达水平，并且特别地，其中发现至少一种miRNA的表达水平和/或目标miRNA的组合表达水平等于或高于参考值，特别地，所述值如本文所提供的那样测定。特别地，提供此类抑制剂与铂类化疗剂联合用于治疗。

当一种治疗剂与另一种治疗剂被施用于同一患者以用于治疗相同的疾病(或源自相同病因的疾病)时，在本文称两种药剂联合使用。特别地，这种联合使用包括如下应用：表明两种药剂的作用同时发生，和/或一种药剂的作用使得另一种药剂的治疗作用成为可能、促进和/或增加。特别地，在相同处方上列出的用于治疗患者的相同疾病的药剂被认为是联合使用。类似地，当施用于患者时，在治疗疾病的相同治疗方案(特别是监管机构或医学协会制定的治疗指南)中建议施用的药剂被认为是联合使用。

用于治疗癌症的铂类化疗剂

本文提供了用于患有癌症的患者的铂类化疗剂，其中，根据本文公开的任何方法，评估来自所述患者的样品中miR-24-3p和/或miR-24-2簇的miRNA的表达水平，并且特别地，其中所述水平被测定为低于参考值。

本文提供的方法、产品和所述产品的用途旨在用于患有癌症的患者(或疑似患有癌症的患者，和/或具有遗传易感性的患者，或正在生活或已经生活在有利于发展癌症的环境条件下的患者)。

在一些情况下，本文的方法、产品和用途是证实患者确实患有癌症(特别是非小细胞肺癌，更特别是肺腺癌)的诊断过程的一部分。在一些实施方式中，所述方法、产品和用途旨在为诊断患有癌症的患者选择疗法。在一些实施方式中，所述方法、产品和用途旨在测定或参与测定患者对铂类化疗的反应可能性和/或患者的预后。

因此，本文提供了治疗方法，所述治疗方法包括：根据本文公开的任何方法，评估来自miR-24-2簇的miRNA的表达水平的步骤，特别地，测定所述水平低于参考值，则得出患者可能对铂类化疗有反应的结论，并用铂类化疗剂治疗该患者。本文还提供了铂类化疗剂在制备治疗患者的药物中的用途，其中，根据本文公开的任何方法，评估来自miR-24-2簇的一种以上miRNA的表达水平，特别地，其中测定所述水平低于参考值。

在某些实施方式中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些实施方式中，癌症是肺腺癌(LUAD)。在某些实施方式中，癌症是III期或IV期NSCLC。铂类化疗是用于治疗癌症的疗法，其包括施用包含至少一个铂原子的DNA嵌入剂(intercalating agent)和/或交联剂(cross-linking agent)和/或DNA损伤诱导化学剂。更具体地，铂类化疗剂是铂的配位化合物(coordination complex)，并且具体包括顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)、奈达铂(nedaplatin)和脂铂(lipoplatin)。

特别用于治疗癌症的miR-24-3p抑制剂以及包含此类抑制剂的组合物

发明人揭示了miR-24-3p的过表达与对铂类化疗剂的耐药直接相关。因此，发明人于此提供了改善对此类化疗剂的反应的方法，所述方法包括抑制miR-24-3p的过表达或过表达的效果。

因此，本文提供了用于治疗患者(特别是患有癌症的人类患者，更特别是患有NSCLC(特别是LUAD，更特别是III期或IV期NSCLC和/或LUAD)的患者)的miR-24-3p的抑制剂。在具体实施方式中，提供此种抑制剂用于改善此类患者对铂类化疗的反应。

本文所使用的“改善对铂类化疗的反应”指获得所述化疗的增加的治疗效果。技术人员知道此类化疗的预期治疗效果和监测此种效果的方法。此种效果的改善可以是实际观察到这样的效果：该效果在所述改善之前没有被观察到；或者该效果在没有所述改善的情况下预期不会发生。改善还可以包括观察到的效果的幅度的增加(相对于预期效果或之前观察到的效果)。

优选地，抑制剂与铂类化疗剂联合使用用于治疗此类患者。因此，本文提供了一种化合物的组合物或试剂盒，所述化合物的组合物或试剂盒包含miR-24-3p的抑制剂和铂类化疗剂。在具体实施方式中，如本文公开的，提供此种化合物的组合物或试剂盒(下文中简称为化合物的组合(combination of compounds))用于治疗患者，特别是患有III或IV期NSCLC和/或LUAD的人类患者。

在某些实施方式中，化合物的组合适于同时施用miR-24-3p抑制剂和化疗剂。在某些实施方式中，化合物的试剂盒适于分开施用(特别是在时间上分开施用)miRNA-24-3p抑制剂和化疗剂。

本文还提供了治疗方法，所述治疗方法包括在诸如本文公开的患者(特别是患有III或IV期NSCLC和/或LUAD的人类患者)中施用miR-24-3p抑制剂。优选地，此类方法另外包括施用铂类化疗剂。在具体实施方式中，miR-24-3p抑制剂和化疗剂的施用是同时的。在具体实施方式中，抑制剂和化疗剂的施用在时间上是分开的。

在本文中，特别是当两种药剂在同一天内(更特别是在同一小时内)施用时，药剂的施用被认为是同时的。同时施用特别是指在时间上同时施用。在具体实施方式中，同时施用从某种意义上是进行单次施用(例如，通过注射包含两种药剂的溶液和/或通过一起口服施用两种药剂)。当两种药剂没有一起施用(例如，通过不同途径施用或以两次单独的注射施用)时，认为两种药剂的施用是分开的。特别是当间隔至少一小时(更特别是在不同的两天)施用药剂时，认为施用在时间上是分开的。

本文公开的方法和用途(包括施用miR-24-3p抑制剂和铂类化疗剂)可以与公开的方法(包括评估来自miR-24-2簇的miRNA的表达水平)组合。在本文的具体实施方式中，治疗方法(包括施用此种抑制剂)中的患者和/或使用抑制剂的患者已成为本文公开的任何测试方法的受试者，并且特别地，已经测定来自所述患者的生物样品中miR-24-2簇的miRNA的表达水平等于或高于参考值。

本文公开的miR-24-3p抑制剂旨在抑制miR-24-3p活性，即通过降低细胞中存在的miR-24-3p的量和/或干扰细胞中miR-24-3p的活性来降低miR-24-3p的活化水平。特别地，在过表达miR-24-3p miRNA的细胞中，活性(特别是miR-24-3p对所述miRNA控制下的基因的调控作用)的抑制使得恢复细胞对铂类化疗剂的敏感性。

抑制miR-24-3p活性的药剂可以是，例如，小分子、核酸、核酸类似物、肽、蛋白质、抗体或它们的变体和片段。在一些实施方式中，核酸药剂可以是DNA、RNA、核酸类似物、肽核酸(PNA)、假互补PNA(pcPNA，pseudo-complementary PNA)、锁核酸(LNA)或它们的类似物。在一些实施方式中，核酸药剂可以是在基因沉默方面有效的小抑制RNA(RNAi，smallinhibitory RNA)、siRNA、微小RNA(microRNA)、shRNA、miRNA、pri-mi RNA及它们的类似物和同源物和变体。

在一些实施方式中，药剂是寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与miR-24-3p核苷酸序列的至少一部分基本上互补的核苷酸序列。例如，寡核苷酸可包含与前体-miR-24(pre-miR-24)核苷酸序列(例如，miR-24-1(登录号MI0000080)和/或miR-24-2茎-环(stem-loop)序列(登录号MI0000081))的至少一部分基本上互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸可包含与成熟miR-24-3p序列(UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG(SEQ ID No：1))的至少一部分基本上互补的核苷酸序列，或与所述序列完全互补的核苷酸序列。

在一些实施方式中，药剂是寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与miR-24-3p的种子序列(seed sequence)基本上互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸包含与miR-24-3p的GGCUCA(参见SEQ ID No：2)基本上互补的核苷酸序列。

在一些实施方式中，寡核苷酸包含核酸修饰。示例性核酸修饰包括但不限于核碱基(nucleobase)修饰、糖修饰、糖间键(inter-sugar linkage)修饰、骨架(backbone)修饰及它们的任何组合。以下将更详细地描述核酸修饰。

在一些实施方式中，所述药剂是拮抗剂(antagomir)、完全2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-F/MOE混合体(mixmer)、完全LNA、LNA/DNA混合体、微小(tiny)LNA或它们的组合。在一些实施方式中，所述药剂是微小LNA寡核苷酸。如本文所用，术语“微小LNA”是指完全由锁核酸单体组成的短的寡核苷酸，例如7、8、9、10、11或12-mer寡核苷酸。已证明微小LNA能在体内有效抑制miRNA介导的基因抑制，并且描述于Obad等，Nature Genetics，2010，43(4)：371-380，其内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，药剂是短聚体(shortmer)。如本文所用，术语“短聚体”指完全由2'-MOE修饰的核酸单体组成的短的寡核苷酸，例如7、8、9、10、11或12-mer寡核苷酸。

在一些实施方式中，寡核苷酸药剂可以由表达载体编码。

附图说明

图1：miRNA(其表达增加会诱导A549细胞的顺铂耐药性)的高通量筛选。

用前体miR(pre-miR)文库转染A549细胞两天，然后将转染的细胞暴露于顺铂(60μM)3天。使用Cell Titer Glow测定法在单孔中测量细胞活力(viability)。

(A)：在A549细胞中所有过表达的miRNA的归一化活力与log₁₀(FDR校正的P值)的图。垂直虚线表示选定的归一化活力截止值(cutoff)，而水平线表示0.01选定的FDR校正的P值截止值。各个点代表一个miRNA。右上象限中包围的点代表在所选定的截止值处与顺铂耐药相关的miRNA。据估算，miR-24-3p miRNA的标准化残差活力为4.9512。

(B)维恩图显示了在功能获得(gain-of-function)筛选中识别的miRNA与在A549细胞中表达的miRNA之间的重叠。通过SOLiD 5500WFTechnology上的小(small)RNA测序分析来测定表达。表达的阈值为在至少一种实验条件下的至少100个读数/数百万个成熟miRNA总读数。

图2：A549细胞中miR-24-3p过表达对顺铂诱导的或长春瑞滨(vinorelbin)诱导的细胞死亡的影响。

用前体miR-24-3p(pre-miR-24-3p)转染A549细胞2天，然后将转染的细胞暴露于顺铂或长春瑞滨。

(A)：过表达miR-24-3p的A549细胞的膜联蛋白V/PI染色，并暴露于60μM的顺铂24小时。

(B)：过表达miR-24-3p的A549细胞的长春瑞滨剂量反应(dose response)分析。使用基于ATP的测定来评估细胞活力。

图3：鉴定顺铂耐药中涉及的miR-24-3p靶标的策略。

图4：BIM和PUMA是miR-24-3p的直接靶标：HEK293细胞中前体miR-24-3p或前体miR-Neg与人BIM 3'UTR或PUMA 3'UTR衍生的psiCHECK-2构建体(construct)的共转染。

(A)：psiCHECK-2上XhoI和NotI限制位点之间的克隆的序列；

(B)：用指定构建体和前体miR-24-3p或对照miRNA转染的HEK293细胞中荧光素酶检测的结果。

转染后两天收获细胞并分析荧光素酶活性。用萤火虫(firefly)荧光素酶活性对所有海肾(renilla)荧光素酶活性进行归一化。**p<0.01。

图5：过表达miR-24-3p的A549细胞的顺铂诱导的DNA损伤反应(DNA damageresponse)。

将过表达miR-24-3p的A549细胞暴露于顺铂7小时，并且通过共聚焦显微镜评估(i)在SER139位点的磷酸化组蛋白H2A.X(γ-HAX)和(ii)在Ser1981位点的磷酸化ATM(p-ATM)的核灶(nuclear foci)。

(A)：γ-HAX的代表性免疫荧光显微照片；

(B)：p-ATM的代表性免疫荧光显微照片；

(C)：在miR-24-3p过表达后，暴露于顺铂且含有分别超过5个γ-HAX核灶和p-ATM核灶的细胞(n＝3)的百分比。

图6：Western Blot显示了A549细胞中miR-24-3p过表达对(A)BIM和PUMA、(B)PNPO和PDXK、(C)顺铂诱导的caspase 3依赖性凋亡反应的影响。

图7：(A)BIM、(B)PUMA、(C)PDXK和(D)PNPO沉默对顺铂诱导的caspase3依赖性细胞凋亡反应的影响。

图8：miR-24-3p抑制对(A)BIM和PUMA、(B)PNPO和PDXK、(C)顺铂诱导的caspase 3依赖性细胞凋亡反应的影响。

图9：TP53突变状态对miR-24-3p诱导的顺铂耐药的影响。

(A)：过表达miR-24-3p或miRNA对照并暴露于增加剂量的顺铂的H1299细胞(具有TP53基因的纯合性部分缺失(homozygous partial deletion))的杀伤曲线；

(B)：验证顺铂在两种LUAD细胞系中的作用，H1299(具有TP53基因的纯合性部分缺失)和H1975(TP53基因的纯合突变(c.818G<A))。

图10：体内实验。LNA修饰的寡核苷酸(SEQ ID No：11和SEQ ID No：12)对miR-24-3p的抑制。对肺的总RNA进行RT-qPCR后获得结果。

图11：A549细胞中miR-24-3p、miR-27a-3p和miR-23a-3p过表达对顺铂敏感性的影响。

图12：miR-24-3p、miR-27a-3p和miR-23a-3p的预测靶标的网络。维恩图总结了由miR-24-3p、miR-23a-3p和miR-27a-3p显著下调的基因和预测靶标(以粗体*表示)。

图13：来自TCGA数据库的miR-23a-27a-24-2簇的表达和Kaplan-Meier生存曲线。

图A、C和E：框图显示了，通过小RNA测序(Small RNA-Seq)在早期LUAD患者中测量的mir-24-2*(A)、miR-23a(C)和miR-27a(E)的表达水平，所述表达水平取决于患者诊断后5年的生存状态(N＝293)。各图标示了相应的P值。A：活；D：死。

图B、D、F和G：根据mir-24-2*(B)、miR-23a(D)、miR-27a(E)的表达和3种成熟miRNA的平均表达(F)，得到的LUAD患者的总生存率的Kaplan-Meier曲线(按中值分层)。在所有情况下，归一化值低于中值的患者的总生存率更高。对于各图，标示了P值：(B)p值＝0.073；(D)p值＝0.0052；(F)p值＝0.02；(G)p值＝0.0365。

(*名称miR-24-2指基因，而名称miR-24-3p指miRNA)

图14：建立qPCR检测用于检测生物流体中循环的miR-23a-27a-24-2簇。

(A)：对照患者的血浆中分析的miRNA的概要；

(B)：2次独立实验中来自相同样品的选定miRNA的归一化表达的相关性；

(C)：2次独立实验中分析的相同系列的14个对照血浆中miR-24归一化表达值的相关性；

(D)：该系列对照血浆中miR-24归一化表达值的直方图；

(E)：框图显示了来自对照患者的血浆中miR-21-5p、miR-23a-3p、miR-24-3p和miR-27a-3p的表达。

图15：来自健康捐献者和LUAD患者的血浆中循环的miRNA水平的比较。框图显示了来自健康捐献者(n＝14)和LUAD患者(n＝20)的血浆中miR-21-5p(A)、miR-23a-3p(B)、miR-24-3p(C)和miR-27a-3p(D)的归一化表达。

实施例

实施例1：使用功能基因筛选(functional genetic screening)鉴定与肺腺癌顺铂耐药相关的miRNA。

功能基因筛选是癌症耐药基因发现和验证的极其有效的方法(Iorns等，2007年)。因此，发明人使用此方法用miRNA模拟物文库(对应于miRbase版本16)来全面鉴定miRNA(其表达增加会诱导肺腺癌细胞的顺铂耐药性)。功能获得数据表明，约10种miRNA的过表达可重复地诱导顺铂耐药(使用模拟文库一式两份进行2次独立筛选)(图1A)。重要的是，目前没有一种在筛选中鉴定的miRNA(其表达增加与顺铂耐药最相关)被描述为影响LUAD的顺铂反应。此外，筛选中鉴定的10种miRNA中的5种也在A549细胞中表达(图1B)。因此，发明人选择首先关注miR-24-3p(一种在A549细胞中表达的miRNA)，并根据miR-24-3p过表达得到的统计学和耐药程度，确定miR-24-3p为最佳miRNA候选物。重要的是，还已知miR-24-3p在NSCLC中被上调(Zhao等，2015年)。

为确保这些发现的可靠性，在A549细胞系中独立验证了miR-24-3p对顺铂敏感性的影响(图2)。这些结果显示，在用前体miR-24-3p转染(并因此过表达miR-24-3p)的A549细胞中，对顺铂的反应低于未过表达miR-24-3p的细胞。此外，过表达miR-24-3p的A549细胞对铂类化合物(包括第二代铂类似物：奥沙利铂)具有特异性(与长春瑞滨治疗相比)和强耐药性(即对顺铂、卡铂和奥沙利铂具有耐药性；图2和未显示的数据)。

实施例2：相关miR-24-3p靶基因的鉴定。

为鉴定相关miR-24-3p靶基因，发明人使用了两种不同的互补方法(图3)：

1、使用生物信息学和实验方法的组合来鉴定miR-24-3p靶标候选物。为此，发明人测定了过表达或未过表达该miRNA的A549细胞的全基因表达谱，并对以下基因进行了生物信息学检索：(i)3'UTR含有一个以上miR-24-3p结合位点的基因；和(ii)使用发明人开发的工具，注释对应于与细胞死亡、细胞凋亡、细胞生存、细胞周期或衰老相关的GO术语的基因。这使得发明人使用BIM和PUMA的荧光素酶构建体(两种促凋亡的BH3-only蛋白)对miR-24-3p靶标进行鉴定和验证(图4)。

2、通过全基因组siRNA筛选研究(Galluzzi等，2012年)所获得数据的比较分析，鉴定以下基因：(i)在A549细胞中表达降低而诱导顺铂耐药的基因；和(ii)3'UTR含有一个以上miR-24-3p结合位点的基因。在通过全基因组siRNA筛选方法揭示的32个基因中，仅一个基因在它的3'UTR中含有miR-24-3p结合位点：PDXK(一种使维生素B6磷酸化的激酶，维生素B6是顺铂反应的中枢调节剂)(Galluzzi等，2012年)。值得注意的是，发现另一个参与维生素B6代谢的基因(PNPO)也在它的3'UTR中含有潜在的miR-24-3p位点，并且还发现PNPO在上述miR-24-3p特征谱中被抑制。

实施例3：miR-24-3p是顺铂诱导的LUAD细胞死亡的有效调节剂

由于顺铂通过诱导DNA损伤引发细胞死亡，发明人研究了暴露于顺铂的A549细胞中miR-24-3p的过表达是否影响在凋亡发生之前由ATM介导的DNA损伤应答。发明人的结果显示，过表达miR-24-3p的A549细胞表现出较少的DNA损伤(通过磷酸-γH2AX核灶评估)以及暴露于顺铂后7小时减少的ATM信号传导(signaling)，而不影响肿瘤细胞中的顺铂分布(图5)。

为进一步了解miR-24-3p介导的抗细胞凋亡作用，发明人进一步研究了miR-24-3p调节对这4种靶标以及顺铂诱导的caspase 3依赖性细胞凋亡反应的影响(图6-图8)。总之，这些结果表明：miR-24-3p很可能通过靶向4种基因(BIM、PUMA、PDXK和PNPO)强烈地抑制由顺铂诱导的caspase 3依赖性细胞凋亡反应。

为评估各个miR-24-3p靶标对A549细胞对顺铂敏感性的贡献，用针对BIM、PUMA、PDXK、PNPO或siRNA对照的单个siRNA转染这些细胞。用切割的caspase 3(cleaved caspase3)的表达来评估顺铂诱导的细胞凋亡反应。图7显示的结果表明，siRNA介导的各个转录物的耗竭(depletion)减少了顺铂诱导的细胞凋亡，并因此证明miR-24-3p通过直接靶向BIM、PUMA、PDXK和PNPO促进顺铂耐药。

用miR-24-3p抑制剂或对照转染A549细胞24小时，然后暴露或不暴露于顺铂24小时。结果显示，miR-24-3p的抑制增加了顺铂诱导的A549细胞的凋亡反应，这通过切割的半胱天冬酶3和切割的PARP(凋亡过程的两个特征标志物)的表达增加来证明(图8)。这些结果证明了使用miR-24-3p抑制剂增加耐药细胞对顺铂敏感性的可能性。

值得注意的是，在另外两种LUAD细胞系中独立验证了该数据：H1299(具有TP53基因的纯合性部分缺失)和H1975(TP53基因的纯合突变(c.818G>A))，这表明miR-24-3p独立于p53地促进顺铂耐药(图9)。

例4：体内实验

使用9-12周龄雄性C57BL/6小鼠和/或针对miR-24-3p设计的LNA-修饰的寡核苷酸小鼠进行体内实验。这些miR-24-3p抑制剂购自Exiqon：LNA miR-24-3p抑制剂1，其序列为TGCTGAACTGAGCC(SEQ ID NO：11)和LNA miR-24-3p抑制剂2，其序列为GCTGAACTGAGCC(SEQID NO：12)。

如图10所示，当LNA抗miR-24-3p寡核苷酸以局部途径(气管内施用)施用时，以及当它们用于全身途径(systemic route)施用(腹膜内施用)时，该两种LNA抗miR-24-3p寡核苷酸均有效抑制miR-24-3p。这些结果证明了体内miR-24-3p抑制的可行性，并表明这些抑制剂可用于改善体内顺铂活性。

实施例5：LUAD癌症患者中miR-24-2簇的miRNA表达水平与预后

发明人从TCGA数据库收集了293例LUAD肿瘤患者的小RNA测序数据。发明人根据患者诊断后5年的存活状态分析了2个亚组患者中miR-24-3p的表达，并发现存活患者和死亡患者的总体表达显著不同(图13的图A)。值得注意的是，发明人发现了来自相同簇的2种其他成熟miRNA的类似数据(图13的图B和图C)。Kaplan-Meier生存分析显示：与低表达组相比，这3种miRNA中的每一种均高表达的患者组具有更低的生存率(图13的图D、图E和图F)。使用该簇的3种miRNA的平均表达值也证实了这些数据(图13的图G)。

这些数据显示miR-24-3p的高表达水平与LUAD癌症患者的不良预后相关。因此，在临床上，测量miR-24-3p(和该簇的其他两个成员)的表达水平可能与患者分层并选择有对顺铂疗法的治疗反应不良的风险的患者相关。

此类检测包括接触从受试者获得的生物样品以检测miR-23a-3p、miR-24-3p和miR-27a-3p中的至少一种(例如，一种、两种、三种)的水平(或这3种miRNA的平均水平)；其中，这些miRNA的表达水平高于预定的参考水平，鉴定了预测有治疗反应不良的风险的受试者。

可以在从受试者获得的生物样品的细胞中测量至少一种miR基因产物的水平。例如，可以在肺手术后或通过常规活组织检查技术从受试者中取出组织样品。在另一个实例中，可以从受试者中取出血液样品，并且可以通过标准技术分离循环RNA。可以在开始任何治疗性治疗(放射疗法或化疗)之前(优选在诊断时)从受试者获得血液或组织样品。可以从受试者的未受影响的组织(在肺手术的情况下匹配的正常相邻组织)获得相应的对照肺组织样品。然后将对照组织或血液样品与来自受试者的样品一起处理，使得来自受试者样品的成熟miRNA的水平可以与来自对照样品的相应水平进行比较。相对于对照样品中相应的miRNA基因产物的水平，从受试者获得的样品中miR-23a-3p/miR-24-3p/miR-27a-3p表达水平的增加可以指示肿瘤侵袭性和顺铂耐药性。可以通过对符合RECIST标准的已知化疗(包括铂类化疗剂)初始反应的LUAD患者的前瞻性队列(prospective cohort)进行表达分析，来获得用于识别另一方面有风险的LUAD患者的阈值。目前，在尼斯医院肿瘤生物库(PrPaul Hofman)的支持下，正在选择100个患者样本(肿瘤组织和匹配的正常邻近组织和血浆)，并且使用下文描述的方法检测miR-23a-3p/miR-24-3p/miR-27a-3p的表达水平，以进一步支持从TCGA队列获得的数据。

可以使用适合于检测生物样品中RNA表达水平的任何技术测量样品中miRNA基因产物的水平。用于检测来自生物样品的细胞中RNA表达水平的合适技术(例如，qRT-PCR、原位杂交、小RNA测序、微阵列)是本领域技术人员熟知的。

实施例6：miR-23a-27a-24-2簇促进LUAD的顺铂耐药

由于miR-24-3p是一种miRNA簇(其被转录为单个初始miRNA并随后被加工成三种成熟miRNA：miR-23a-3p、miR-27a-3p和miR-24-3p)的一部分，发明人评估了miR-23a-3p和/或miR-27a-3p是否也促进顺铂耐药。发明人的结果显示，在A549LUAD细胞系中，尽管miR-23a-p的过表达程度小于miR-24-3p，但miR-23a-3p的过表达能够诱导A549细胞的顺铂耐药性(图11)。值得注意的是，发明人发现：这些miRNA的几种常见的预测靶标，它们中的几种与凋亡/坏死细胞死亡和DNA损伤(如PPIF和NEK6)有关(图12)。

实施例7：miR-24-3p作为预测顺铂耐药的生物标志物

来自TCGA的数据分析表明，miR-24-3p和该簇的其他成员的高表达水平与LUAD癌症患者的不良预后相关(图13)。发明人建立了局部前瞻性队列(P.Hofman和C-HMarquette，CHU Nice)以特异性评估来自LUAD患者的组织或血浆中miR-24-3p表达的预测值，以预测顺铂耐药。为此目的，建立了多重qPCR方案用于检测生物流体中的循环miR-23a-27a-24-2簇(图14)。数据表明，发明人可以可重复地测量超过60种miRNA候选物(包括来自14个健康供体组的血浆中的miR-23a-27a-24-2簇)的水平。从来自LUAD患者(处于诊断的不同阶段)的第一组20个血清获得的初步数据表明：与健康供体相比，LUAD中miR-23a-27a-24-2簇的循环水平上调(图15)。

方法

RNA分离。用TRIzol溶液(Invitrogen)从肺组织和细胞样品中提取总RNA。使用Agilent BioAnalyser 2100(Agilent Technologies)评估RNA的完整性(RIN高于7)。

成熟miRNA的表达。根据其方案说明，使用TaqMan MicroRNA Assay(AppliedBiosystems)评估MiR-24-3p表达。使用Universal Master Mix(Applied Biosystems)和ABI7900HT实时PCR仪进行实时PCR。使用比较CT法(2-deltaCT)评估成熟microRNA的表达水平。使用miScript Microfluidics PCR Kit(Qiagen)在Biomark machin(Fluidigm)上对miRNA纯化的血浆进行多重qPCR测定。在从200μl血浆中提取RNA之前，使用添加的跟踪标定(spike-in)对照进行归一化。

表达微阵列。对于基因表达阵列，使用供应商推荐的低RNA输入QuickAmp试剂盒(Agilent)，用Cy3染料标记RNA样品。将825ng标记的cRNA探针在8×60K高密度人类Agilent微阵列上杂交。每个比较进行两次生物学重复。在R编程环境中使用循环LOESS算法(cyclicloess algorithm)对数据进行log2变换和归一化。

转染。前体miR-24-3p和对照miRNA(miR-Neg#1)购自Life technologies。对于miR-24-3p敲除实验，从Exiqon订购LNA抗miR-24-3p和LNA阴性对照。针对BIM、PUMA、PNPO和PDXK的siRNA购自Life technologies。A549和H1299细胞在10％FCS的DMEM中生长，并使用加有前体miRNA、siRNA LNA抑制剂(除非另有说明，否则为5nM)的Lipofectamin RNAi MAX^TM(Life technologies)在6孔、12孔或96孔板中以30-40％融合度(confluency)转染。

荧光素酶测定。通过在海肾荧光素酶后克隆，用XhoI和NotI限制位点来制备psiCHECK-2(Promega)分子构建体，退火的寡核苷酸来自BIM、PUMA的3'UTR。将HEK293细胞接种到96孔中，并使用含有0.2μg的psiCHECK-2质粒构建体的脂质体(lipofectamin)2000(Invitrogen)和不同浓度的前体miR-24-3p或对照miRNA共转染。转染后48小时，使用Dual-Glo Luciferase assay(Promega)测量萤火虫和海肾荧光素酶活性。

膜联蛋白V检测。用膜联蛋白-V-FITC凋亡检测试剂盒(Life technologies)来检测细胞凋亡活性。收集细胞并重新悬浮于结合缓冲液中，并与膜联蛋白-V-FITC和碘化丙啶一起避光孵育15分钟。使用FITC信号检测器(FL1)通过流式细胞术(激发波长488nm；发射波长530nm)测定膜联蛋白-V-FITC结合，并通过藻红蛋白发射信号检测器(FL2)检测碘化丙啶染色。

功能基因筛选。以96孔板形式在经鉴定的A549肺腺癌细胞系中转染模拟物。转染后48小时，将细胞暴露于60μM的顺铂(2倍DL50；DL50对应于使50％肿瘤细胞致死的药物浓度)3天。使用细胞滴度glo测定法(Promega)评估活力。通过将各个样品值除以孔板上所有样品的中值来进行归一化(因此大多数样品孔将用作参考)。使用秩(rank)-产品方法识别命中(hit)。将使用R软件环境进行归一化和统计。

miRNA候选物选择。基于统计学显著性(p<0.01)和诱导的耐药性程度(通过评估暴露于药物后的活力，归一化的活力高于3)，选择miRNA候选物用于进一步分析。

miR-24-3p的功能基因筛选验证。在不同的肺腺癌细胞系(H1299)上独立地确认数据。使用多西紫杉醇和长春瑞滨评估对顺铂耐药的特异性。

miRNA靶标分析。MiRonTop是一个在线Java网络工具(可从http://www.microarray.fr:8080/miRonTop/index获得)，MiRonTop集成了DNA微阵列数据，以确定miRNA在特定生物系统中的潜在影响(Lebrigand等，2010年)。简言之，根据表达水平和差异表达的阈值，MiRonTop将转录物分为2类(“上调”和“下调”)。然后根据所选择的预测软件(Targetscan，MiRBase，PicTar，精确种子搜索：miRNA的2-7或1-8个第一核苷酸，TarBase版本1)，计算每组基因中各个miRNA的预测靶标的数量。然后使用超几何功能检测各个类别中miRNA靶标的富集。

蛋白质提取和免疫印迹。在裂解缓冲液(M-PER蛋白质提取试剂)和蛋白酶抑制剂混合物(Pierce)中裂解细胞。使用Bradford法(Biorad)定量裂解物的蛋白质浓度。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质(每个样品10μg)并转移到硝酸纤维素膜(GE Healthcare)上。用5％脱脂奶的Tris缓冲盐水(TBS)(含有0.1％Tween-20(TBS-T))封闭膜，随后在4℃下与一抗孵育过夜。在室温下用TBS-T洗涤30分钟后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗进一步孵育1.5小时，然后用TBS-T洗涤30分钟。用Amersham ECL底物(GE Healthcare)显现蛋白质条带。

免疫荧光分析。A549细胞生长于直径为16mm的Round Glass Coverslips(Thermo Scientific)(置于12多孔板内)上。在磷酸盐缓冲盐水中洗涤Coverslips玻片，在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后使用0.1％的Triton X-102(Agilent Technologies)渗透细胞10分钟。用含有BSA(3％)的PBS溶液封闭30分钟。在封闭溶液BSA(1％)中37℃孵育一抗1小时。用PBS洗涤三次后，用二抗孵育细胞。5分钟后，使用含DAPI的ProLong GoldAntifade Reagent(Invitrogen)将Coverslips玻片固定在显微镜载玻片上。用FV10iOlympus共聚焦扫描显微镜观察荧光。

细胞内铂的定量。对于总细胞铂累积实验，用冰冷的PBS充分洗涤细胞后，在RIPA裂解缓冲液中裂解细胞，并使细胞在培养箱中沉降过夜。通过原子吸收光谱法(AA光谱仪)测定铂的细胞内定量。将铂的水平相对于蛋白质水平归一化。

顺铂-GG DNA加合物的检测。基本上如前所述(Liedert等，Nucleic Acids Res，2006，34，e47)，使用特异性识别CDDP-GG DNA加合物的大鼠一抗(RC-18)进行免疫荧光染色和特异DNA斑(platination)产物的测量。

体内实验使用购自Charles River的9-12周龄雄性C57BL/6小鼠进行。针对miR-24-3p设计的LNA修饰的寡核苷酸购自Exiqon：LNA miR-24-3p抑制剂1，其序列为TGCTGAACTGAGCC(SEQ ID NO：11)和LNA miR-24-3p抑制剂2，其序列为GCTGAACTGAGCC(SEQID NO：12)。将所述LNA miR-24-3p抑制剂溶解在PBS中，然后使用MicroSprayer雾化器(单剂量5mg/kg)气管内注射或使用胰岛素注射器(单剂量10mg/kg)腹膜内注射。miR-24-3p抑制剂注射后3天，收集肺并使用酚-氯仿法提取总RNA。

RT qPCR：根据制造商说明，使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit和TaqMan MicroRNA Assays(Thermo Fisher Scientific)评估miRNA表达。使用UniversalMaster Mix II(Thermo Fisher Scientific)和ABI 7900HT实时PCR仪进行实时PCR。使用比较CT法评估成熟microRNA的表达水平。为了归一化，将SNO251(小鼠样品)的转录物水平用作miRNA实时PCR的内源对照。

参考文献

Chang A.Chemotherapy,chemoresistance and the changing treatment landscapefor NSCLC.Lung Cancer.2011.71:3-10.

Friboulet L等.ERCC1isoform expression and DNA repair in non-small-celllung cancer.N Engl J Med.2013.368:1101-10.

Galluzzi L等.Prognostic impact of vitamin B6metabolism in lungcancer.Cell Rep.2012.2:257-69

Goldstraw P等.Non-small-cell lung cancer.Lancet.2011.378:1727-40.

Iorns E等.Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery.NatRev Drug Discov.2007.6:556-68.

Jemal等.Combinatorial microRNA target predictions.Nat Genet 2005.37:495-500.

Le Brigand K等.MiRonTop:mining microRNAs targets across large scale geneexpression studies.Bioinformatics.2010.26:3131-2.

Zhao G等.Upregulation of miR-24promotes cell proliferation by targetingNAIF1in non-small cell lung cancer.Tumour Biol.2015.36:3693-701.

序列表

<110> 法国国家科学研究中心（CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE）

里尔大学（UNIVERSITE DE LILLE）

尼斯大学（UNIVERSITE DE NICE SOPHIA ANTIPOLIS）

里尔大学中心医院（CENTRE HOSPITALIER ET UNIVERSITAIRE DE LILLE ）

<120> 治疗NSCLC患者的药剂和预测反应的方法

<130> B11753A/AD/DP

<140> PCT/EP2017/080266

<141> 2017-11-23

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miR-24-3p

<400> 1

uggcucaguu cagcaggaac ag 22

<210> 2

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miR-24-3p的一部分

<400> 2

ggcuca 6

<210> 3

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人BIM位点1

<400> 3

ccccugcagu ggaaacugag ccagcuaacu 30

<210> 4

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 小鼠BIM位点1

<400> 4

acccugcagu gggaacugag ccagcugauu 30

<210> 5

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人BIM位点2

<400> 5

cauauuacuu aucaacugag ccaaaugu 28

<210> 6

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 小鼠BIM位点2

<400> 6

uguuucacuc gucaacugag ccaaaugu 28

<210> 7

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人PUMA位点1

<400> 7

cccgugaaga gcaaaugagc caaacguga 29

<210> 8

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 小鼠PUMA位点1

<400> 8

ucugugaaga gcaaaugagc caaaccuga 29

<210> 9

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人PUMA位点2

<400> 9

gcccagccau cuucccugag ccagccggc 29

<210> 10

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 小鼠PUMA位点2

<400> 10

gcccagccau cuucccugag ccgccggcg 29

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LNA miR-24-3p抑制剂1

<400> 11

tgctgaactg agcc 14

<210> 12

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LNA miR-24-3p抑制剂2

<400> 12

gctgaactga gcc 13

Claims

1.一种miR-24-3p抑制剂，特别是一种锁核酸，用于治疗患有肺癌的人类患者。

2.根据权利要求1所述的miR-24-3p抑制剂，其中，所述患者患有非小细胞肺癌NSCLC，特别是肺腺癌LUAD，更特别是III或IV期NSCLC和/或LUAD。

3.根据权利要求1或2所述的miR-24-3p抑制剂，其中，所述miR-24-3p抑制剂与铂类化疗剂联合使用。

4.一种miR-24-3p抑制剂，特别是一种锁核酸，用于改善患有肺癌的人类患者、特别是患有非小细胞肺癌NSCLC和/或肺腺癌LUAD的人类患者、更特别是患有III期或IV期NSCLC和/或LUAD的人类患者对铂类化疗的反应。

5.一种化合物的组合，其中，所述化合物包含miR-24-3p抑制剂和铂类化疗剂，所述miR-24-3p抑制剂特别是锁核酸。

6.根据权利要求5所述的化合物的组合，其中，所述化合物的组合适于同时施用miR-24-3p抑制剂和化疗剂。

7.根据权利要求5或6所述的化合物的组合，其中，所述化合物的组合适于在时间上分开施用miR24-3p抑制剂和化疗剂。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的化合物的组合，其中，所述化合物的组合用于治疗患有肺癌的人类患者，特别是患有NSCLC和/或LUAD的人类患者，更特别是患有III期或IV期NSCLC和/或LUAD的人类患者。

9.一种测定患有肺癌的人类患者对铂类化疗的反应可能性的体外方法，其中，所述方法包括评估至少一种miRNA在预先从患者获得的生物样品中的表达水平的步骤，所述miRNA选自miR-24-3p、miR-23a-3p和miR-27a-3p。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述患者患有非小细胞肺癌NSCLC，特别是肺腺癌LUAD。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述患者患有III期或IV期NSCLC和/或LUAD。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是来自所述患者的肿瘤的样品，或者其中，所述生物样品是来自所述患者的血液样品。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中，评估一种、两种或三种miRNA的表达水平，所述miRNA选自miR-24-3p、miR-23a-3p和miR-27a-3p。

14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中，使用选自定量PCR即qPCR、实时qPCR和表达微阵列的至少一种方法测量所述miRNA的表达水平。

15.根据权利要求9至14中任一项所述的方法，其中，将所述miRNA的表达水平与预先建立的参考水平进行比较，所述参考水平特别是在患有LUAD癌症的一组患者中测量的平均表达水平或中值表达水平，其中，所述组中的患者的选择不依赖于是否对铂类化疗有反应或者所述组中的患者是选定的无应答患者。

16.根据权利要求9至15中任一项所述的方法，其中，将所述miRNA在来自所述患者的肿瘤的生物样品中的表达水平与参考水平进行比较，所述参考水平是在来自所述患者的非肿瘤组织的生物样品中的表达水平。

17.根据权利要求9至16中任一项所述的方法，其中，至少两种miRNA的表达水平被用于比较，所述miRNA选自miR-24-3p、miR-23a-3p和miR-27a-3p，以及可选地，miRNA的平均表达水平被用于比较。

18.根据权利要求9至17中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：如果在所述患者的生物样品中测量的表达水平等于或高于所述参考水平，那么得出如下结论：所述患者对铂类化疗具有耐药性的可能性增加。

19.根据权利要求1至4中任一项所述的miR-24-3p抑制剂，或根据权利要求6至8中任一项所述的化合物的组合，其中，特别是根据权利要求9至18中任一项所述的方法，在所述患者的生物样品中评估来自miR-24-2簇的至少一种miRNA的表达水平，更特别地，在所述患者的生物样品中，已测定来自miR-24-2簇的至少一种miRNA的表达水平等于或高于参考值。