JP2005502344A - 新規ｇタンパク質共役受容体およびそのｄｎａ配列 - Google Patents
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Abstract
この発明は、新たに同定されたポリペプチドおよび上記ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、診断および治療上有用な可能性のあるアゴニスト、アンタゴニストであり得る化合物の同定におけるそれらの使用、およびＧタンパク質共役受容体のクラスに属する、上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの製法に関するものである。
Description
【０００１】
発明の分野
この発明は、新たに同定されたポリペプチドおよび上記ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、診断、および治療において潜在的に有用なアゴニストまたはアンタゴニストであり得る化合物の同定におけるそれらの使用、およびＧタンパク質共役受容体(ＧＰＣＲ)との類似性を共有する上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの生産に関するものである。
【０００２】
発明の背景
創薬過程は、近年、それが「ファンクショナル・ゲノミクス(機能ゲノム解析)」、すなわち高スループットのゲノムまたは遺伝子に基いた生物学を取り入れていることから、根本的な変革を被っている。治療標的として遺伝子および遺伝子産物を同定する手段としてのこの方法は、急速に「ポジショナル・クローニング」に基いた初期の方法に取って代わっている。表現型、すなわち生物学的機能または遺伝病を同定し、次いで、その遺伝地図の位置に基いて、関与する遺伝子を突きとめる。ファンクショナル・ゲノミクスは、高スループットＤＮＡ配列決定技術および現時点で利用可能な多くの分子生物学データベースから潜在的興味の対象である遺伝子配列を同定するためのバイオインフォマティクスの様々なツールに大いなる信頼をおくものである。創薬標的としてのさらなる遺伝子およびそれらの関連ポリペプチド／タンパク質の同定および特性確認が依然として要望されている。
【０００３】
発明の要旨
本発明は、本明細書でヒトｍＧＲＲ１ａ、ｍＧＲＲ１ｂおよびｍＧＲＲ２(本明細書では３つともｍＧＲＲとして称す)として称しているヒト起源の精製代謝型グルタミン酸受容体関連膜受容体タンパク質に関するものである。代謝型グルタミン酸受容体とｍＧＲＲの類似性は、これらの受容体が同じくＧＰＣＲのファミリー３に属することを示唆している。この受容体ファミリーは、代謝型グルタミン酸受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ受容体、Ｃａ−知覚受容体、推定味覚受容体および嗅覚鋤骨鼻受容体のファミリーを包含する。公開ドメインデータベースにおいて本発明ポリペプチドと最も近いことが見出された哺乳類ＧＰＣＲ相同体は、配列番号２に記載されたｍＧＲＲ１ａのポリペプチドと２３％同一で４３％類似したアミノ酸残基を有する代謝型グルタミン酸受容体３型(受託番号Ｑ１１９２３)である。上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、限定されるわけではないが、中枢および末梢神経系に伴う疾患の処置を含むある種の疾患の処置方法に関して興味の対象となっている。特に、ｍＧＲＲ受容体アゴニストまたはアンタゴニストは、例えば、限定されるわけではないが、痴呆症、精神分裂病、うつ病、情動障害、癲癇および運動障害を含む神経学的および／または精神医学的疾患の処置に有用であり得、これらを以後「本発明の疾患」と称する。さらに別の態様において、本発明は、本発明で提供される材料を用いてｍＧＲＲに対するアゴニストおよびアンタゴニスト(例、阻害剤)を同定し、上記化合物の不均衡に伴う状態を処置する方法に関するものである。さらに別の態様において、本発明は、不適切なｍＧＲＲ活性またはレベルに伴う疾患を検出するための診断的検定法に関するものである。
【０００４】
発明の記載
(用語解説)
本明細書で使用されているある種の用語を理解し易くするため以下の定義を与える。
【０００５】
「単離(された)」は、その天然の状態から改変されていること、すなわちそれが天然で存する場合、そのもとの環境からそれを変化させたかまたは取り除いたこと、またはその両方を意味する。例えば、この語が本明細書で使用されているところによると、生きている生物体に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」おらず、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドでも、その天然状態の共存物質から分離されると、「単離された」ことになる。さらに、形質転換、遺伝子操作または他のあらゆる組換え方法により生物体へ導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それが依然として上記生物体に存在している場合でも「単離され」ており、その生物体は生きている場合も死んでいる場合もあり得る。
【０００６】
「ポリヌクレオチド」は、一般的にポリリボヌクレオチド(ＲＮＡ)またはポリデオキシリボヌクレオチド(ＤＮＡ)を包含し、それらは非修飾または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」は、１本および２本鎖ＤＮＡ、１本および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本および２本鎖ＲＮＡ、および１本および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本鎖または１本および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、限定はされない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域をいう。「ポリヌクレオチド」の語はまた、１個またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ並びに安定性または他の理由により修飾されたバックボーンをもつＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
【０００７】
「修飾(された)」塩基は、例えばトリチル化塩基および特異塩基、例えばイノシンを包含する。様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに加えられ得る、すなわち、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然で見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的修飾形態、並びにウイルスおよび細胞に特有なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと称されることが多い、比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【０００８】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターにより互いに連結された２個またはそれ以上のアミノ酸を含むポリペプチドをいう。「ポリペプチド」は、通常ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般的にタンパク質と称される長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは、２０遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」は、天然プロセス、例えば翻訳後プロセッシングにより、または当業界で公知の化学的修飾技術により修飾されたアミノ酸配列を含む。上記修飾は基本的テキストおよびより詳細なモノグラフ並びに当業者に馴染みのある多量の研究文献に詳述されている。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含むポリペプチドのいずれの場所でも加えられ得る。同じタイプの修飾が所定のポリペプチドにおける幾つかの部位で同程度または様々な程度で存在し得るものとする。また、所定のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含み得る。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝状であり得、それらは環状であり、分枝状形態を伴う場合も伴わない場合もあり得る。環状、分枝状および分枝状環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じ得るかまたは合成方法により生成され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、閉環、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ伝達付加、例えばアルギニル化およびユビキチン化がある(例えば、Proteins‐Structure and Molecular Properties、第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman アンド・カンパニー、ニューヨーク、１９９３、Wold,F.、Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects、１−１２、Post-translatinaol Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９８３、Seifter et al、“Analysis for protein modiifications and nonprotein cofactors”、Meth Enzymol、１８２、６２６−６４６、１９９０およびRattan et al、“Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging”、Ann NY Acad Sci、６６３、４８−６２、１９９２参照)。
【０００９】
ポリペプチド配列の「フラグメント」は、対照基準配列よりも短いが、対照基準ポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチド配列をいう。ポリヌクレオチド配列の「フラグメント」は、配列番号１、配列番号３または配列番号４の対照基準配列よりも短いポリヌクレオチド配列をいう。
【００１０】
「ｍＧＲＲ」は、２種のスプライス変異型ヒトｍＧＲＲ１ａおよびｍＧＲＲ１ｂおよびヒトｍＧＲＲ２をいう。ｍＧＲＲ１ｂのＮ−末端配列(アミノ酸１〜５３)は、ｍＧＲＲ１ａのＮ−末端配列(アミノ酸１〜８２)と著しい配列類似性は共有していない。ヒトｍＧＲＲ２アミノ酸配列は、ヒトｍＧＲＲ１ａと５９％同一性を有する(ｍＧＲＲ１ａの８１〜７６５とのｍＧＲＲ２の最適アラインメント残基６１−７３３)。
【００１１】
「変異型」は、対照基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。ポリヌクレオチドの典型的変異型は、対照基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異型のヌクレオチド配列における変化は、対照基準ポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドのアミノ酸配列を改変する場合もしない場合もあり得る。ヌクレオチド変化の結果、下記で検討しているように、対照基準配列によりコード化されるポリペプチドにおいてアミノ酸置換、付加、欠失、融合および先端切除が誘導され得る。ポリペプチドの典型的変異型は、対照基準ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に、改変は、対照基準ポリペプチドおよび変異型の配列が全体的には密接に類似しており、多くの領域が一致しているように制限される。変異型および対照基準ポリペプチドは、１個またはそれ以上の置換、挿入、欠失を組合わせたことによりアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコード化されるものである場合もそうではない場合もあり得る。典型的同類置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｉｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ−Ｉ Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＰｈｅおよびＴｙｒがある。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異型は、天然に存する例えば対立遺伝子であり得るか、または天然に存することが知られていない変異型であり得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異型は、突然変異導入技術または直接合成により生成され得る。また、１個またはそれ以上の翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＩＰリボシル化などを有するポリペプチドも変異型として包含される。例としては、Ｎ−末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびトレオニンのリン酸化およびＣ−末端グリシンの修飾がある。
【００１２】
「多型」は、集団内のゲノムでの所定の位置におけるヌクレオチド配列(および関連性がある場合、コード化されたポリペプチド配列)の変形をいう。
【００１３】
「一塩基多型」(ＳＮＰ)は、集団内での、ゲノムにおける単一ヌクレオチド位置でのヌクレオチド変異性の出現をいう。ＳＮＰは、遺伝子内またはゲノムの遺伝子間領域内で出現し得る。ＳＮＰは、対立遺伝子特異的増幅法(ＡＳＡ)を用いて検定され得る。このプロセスについては、少なくとも３プライマーが要求される。共通プライマーは、検定されている多型に対し逆相補型で使用される。この共通プライマーは、多型塩基からの５０と１５００ｂｐｓの間であり得る。最終３'塩基の揺らぎにより多型を構成する２(またはそれ以上)の対立遺伝子の１つと対合すること以外、他の２つ(またはそれ以上)のプライマーは互いに同一である。次いで、２つ(またはそれ以上)のＰＣＲ反応を、試料ＤＮＡにおいて、各々共通プライマーおよび対立遺伝子特異的プライマーの１つを用いて実施する。
【００１４】
本明細書で使用されている「スプライス変異型」は、同じゲノムＤＮＡ配列から最初に転写されたＲＮＡ分子から生成されてはいるが、オルターナティブ(選択的)ＲＮＡスプライシングが行なわれたｃＤＮＡ分子をいう。オルターナティブＲＮＡスプライシングが行なわれるのは、一次ＲＮＡ転写物に対してスプライシングが行なわれ、その過程で一般的にイントロンが除去され、その結果、各々異なるアミノ酸配列をコード化し得る複数のｍＲＮＡ分子がつくられる場合である。スプライス変異型の語はまた、上記ｃＤＮＡ分子によりコード化されたタンパク質をいう。
【００１５】
「同一性」は、配列比較により決定された、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間における関係を反映する。一般に、同一性は、それぞれ比較されている配列の長さ全体におよぶ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致をいう。
【００１６】
「同一性％」−正確な一致が存在しない配列については、「同一性％」が測定され得る。一般に、比較される２配列を平行整列させると配列間の最大相関関係が得られる。これは、一または両配列における「ギャップ」挿入を含むことにより、アラインメントの程度を高め得る。同一性％は、同一または非常に類似した長さの配列に特に適切である、比較されている配列の各々の全長にわたって(いわゆるグローバルアラインメント)決定され得るか、または長さが等しくない配列により適切である、短い特定された長さにわたって(いわゆるローカルアラインメント)決定され得る。
【００１７】
「類似性」は、２ポリペプチド配列間における関係のさらなる精巧な尺度である。一般的に、「類似性」は、比較(同一性について)されている各配列からの一つで、間にある残基対における正確な一致だけでなく、正確な一致が存在しない場合は、進化に基いて、一残基が他の残基の代用になる見込みがあるか否かを考慮しながら、一つ一つの残基を基にした２ポリペプチド鎖のアミノ酸間の比較を意味する。この見込みは関連「スコア」を有し、それから２配列の「類似性％」が測定され得る。
【００１８】
２またはそれ以上の配列の同一性および類似性の比較方法は、当業界では公知である。すなわち例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージバージョン９.１(Devereux J et al、Nucleic Acids Res、１２、３８７−３９５、１９８４、米国ウィスコンシン、マディソンのジェネティクス・コンピューター・グループから入手可能)で利用可能なプログラム、例えばＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰプログラムを用いることにより、２ポリヌクレオチド間の同一性％および２ポリペプチド配列間の同一性％および類似性％が測定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、SmithおよびWaterman(J Mol Biol、１４７、１９５−１９７、１９８１、Advances in Applied Mathematics、２、４８２−４８９、１９８１)の「局所ホモロジー」アルゴリズムを用い、２配列間における類似性の最適単一領域を見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが異なる２ポリヌクレオチドまたは２ポリペプチド配列の比較により適しており、このプログラムは短い方の配列が長い方の一部分を示すことを想定している。これに比べて、ＧＡＰは２配列を整列させ、NeddlemanおよびWunschのアルゴリズム(J Mol Biol、４８、４４３−４５３、１９７０)にしたがって「最大類似性」を見出す。ＧＡＰは、長さがほぼ同じである配列の比較により適しており、アラインメントは全長におよぶと予測される。好ましくは、各プログラムで使用されているパラメーター「ギャップ・ウェイト」および「レングス・ウェイト」は、それぞれポリヌクレオチド配列については５０および３、ポリペプチド配列については１２および４である。好ましくは、比較されている２配列が最適な形で整列されているときに同一性および類似性％を測定する。
【００１９】
配列間における同一性および／または類似性測定についての他のプログラムもまた当業界では公知であり、例えば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム(Altschul S F et al、J Mol Biol、２１５、４０３−４１０，１９９０、Altschul S F et al、Nucleic Acids Res.、２５：３８９−３４０２、１９９７、米国メリーランド、ベセズダのナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション(ＮＣＢＩ)から利用可能であり、ＮＣＢＩのホームページ、www.ncbi.nlm.nih.govによりアクセスできる)およびＦＡＳＴＡ(Pearson W R、Methods in Enzymology、１８３、６３−９９、１９９０、Pearson W RおよびLipman D J、Proc Nat Acad Sci USA、８５、２４４４−２４４８、１９８８、ウィスコンシン・シーケンス・アナリシス・パッケージの一部として利用可能)がある。
【００２０】
好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス(Henikoff SおよびHenikoff J G、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、８９、１０９１５−１０９１９、１９９２)は、ヌクレオチド配列が比較前に最初にアミノ酸配列に翻訳されている場合を含むポリペプチド配列比較で使用される。
【００２１】
好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴを用いて、対照基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する問題のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の同一性％を測定し、その場合上記の通り、問題配列および対照基準配列を最適な形で整列させ、プログラムのパラメーターをデフォルト値で設定する。
【００２２】
「同一性指数」は、候補配列(ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)および対照基準配列の比較に使用され得る配列関連性の尺度である。すなわち、例えば、対照基準ポリヌクレオチド配列に対し例えば０.９５の同一性指数を有する候補ポリヌクレオチド配列は、候補ポリヌクレオチド配列が対照基準配列の各１００ヌクレオチドにつき平均して５個以下の差異を含み得る点以外、対照基準配列と同一である。上記差異は、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入から成る群から選択される。これらの差異は、対照基準ポリヌクレオチド配列の５'または３'末端位置またはこれらの末端位置間におけるいずれかの場所に存し得、対照基準配列におけるヌクレオチド間で個々に、または対照基準配列内で１つまたはそれ以上の連続群として点在している。言い換えれば、対照基準ポリヌクレオチド配列に対し０.９５の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を得るためには、上記の通り、対照基準配列における１００ヌクレオチドごとに平均５〜２５個以下の割合で欠失、置換または挿入、またはそれらの組合わせが導入され得る。同じことが、必要な変更を加えて、同一性指数の他の値、例えば０.９６、０.９７、０.９８および０.９９についても適用される。
【００２３】
同様に、ポリペプチドの場合、例えば、対照基準ポリペプチド配列に対し０.９５の同一性指数を有する候補ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列が対照基準配列の各１００アミノ酸につき平均して５個以下の差異を含み得る点以外、対照基準配列と同一である。上記差異は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、同類および非同類置換を含む置換、または挿入から成る群から選択される。これらの差異は、対照基準ポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ−末端位置またはこれらの末端位置間におけるいずれかの場所に存し得、対照基準配列におけるアミノ酸間で個々に、または対照基準配列内で１つまたはそれ以上の連続群として点在している。言い換えれば、対照基準ポリペプチド配列に対し０.９５の同一性指数を有するポリペプチド配列を得るためには、上記の通り、対照基準配列における１００アミノ酸ごとに平均５以下の割合で欠失、置換または挿入、またはそれらの組合わせが導入され得る。同じことが、必要な変更を加えて、同一性指数の他の値、例えば０.９６、０.９７、０.９８および０.９９についても適用される。ヌクレオチドまたはアミノ酸差異の数および同一性指数間の関係は、以下の等式で表され得る：
ｎａ≦ｘａ−(ｘａ・Ｉ)
[式中、
ｎａは、ヌクレオチドまたはアミノ酸差異の数であり、
ｘａは、それぞれｍＧＲＲ１ａについては配列番号１または配列番号２、ｍＧＲＲ１ｂについては配列番号４または配列番号５におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の総数であり、
Ｉは同一性指数であり、
・は、掛け算演算子についての記号であり、ｘａとＩの積が整数ではないとき、ｘａから積を引く前に端数切り捨てにより最も近い整数にする]
【００２４】
「相同体」は、当業界で使用される一般用語であり、対照基準配列との高度の配列関連性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を示す。上記関連性は、上記の２配列間における同一性および／または類似性の度合を測定することにより定量され得る。「オーソログ」は、別種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的均等内容配列であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。「パラログ」は、同種内で機能的に類似しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
【００２５】
「融合タンパク質」は、２つの非関連融合遺伝子またはそのフラグメントによりコード化されるタンパク質をいう。例は米国特許第５５４１０８７、５７２６０４４号に開示されている。Ｆｃ−ｍＧＲＲの場合、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用いることが、Ｆｃ−ｍＧＲＲまたはｍＧＲＲのフラグメントの機能的発現を遂行させるのに有利であり、それによって治療に使用するとき上記融合タンパク質の薬物動態特性が改善され、２量体Ｆｃ−ｍＧＲＲが生成される。Ｆｃ−ｍＧＲＲ ＤＮＡ構築物は、５'〜３'方向で、分泌カセット、すなわち哺乳類細胞からの輸送を誘発するシグナル配列、融合相手として免疫グロブリンＦｃ領域フラグメントをコード化するＤＮＡ、およびＦｃ−ｍＧＲＲまたはそのフラグメントをコード化するＤＮＡを含み得る。使用する際、機能的Ｆｃ側鎖に突然変異を導入し、融合タンパク質の残りの部分は無傷のままにしておくかまたは完全に発現後Ｆｃ部分を欠失させることにより、内在的機能特性(補体結合性、Ｆｃ−受容体結合性)を改変できるのが望ましい場合もある。
【００２６】
第一の態様において、本発明はｍＧＲＲポリペプチドを提供する。
上記ポリペプチドは、以下のものを含む：
(ａ)配列番号１、配列番号３または配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドによりコード化される単離ｍＧＲＲポリペプチド、
(ｂ)配列番号２または配列番号５のポリペプチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するポリペプチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲの場合と類似した特性を示す単離ｍＧＲＲポリペプチド、
(ｃ)配列番号２または配列番号５のポリペプチド配列を含む単離ｍＧＲＲ１ａまたはｍＧＲＲ１ｂポリペプチド、
(ｄ)配列番号２または配列番号５のポリペプチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有し、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲの場合と類似した特性を示す単離ｍＧＲＲポリペプチド、
(ｅ)配列番号２または配列番号５のポリペプチド配列、
(ｆ)配列番号２または配列番号５のポリペプチド配列に対し０.８０、０.９０、０.９５、０.９８または０.９９の同一性指数を有するポリペプチド配列を有するかまたは含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲの場合と類似した特性を示す単離ｍＧＲＲポリペプチド、または
(ｇ)(ａ)〜(ｆ)による上記ポリペプチドのフラグメントまたは変異型。
【００２７】
リガンド結合検定法における類似特性とは、緩衝液、イオン、ｐＨおよび他の調節因子、例えばヌクレオチドについて同一条件下、検出可能シグナル対ノイズ比が、ｍＧＲＲポリペプチドのシグナルの＋／−３０％の範囲であることを意味する。
【００２８】
本発明ポリペプチドは、ポリペプチドのＧタンパク質共役受容体ファミリーの構成員である。観察されたｍＧＲＲ１ ｍＲＮＡの脳特異領域分布(表１)は、ｍＧＲＲリガンドについての指標に関する情報を提供する。ｍＧＲＲリガンドは、天然リガンド並びにｍＧＲＲ活性のモジュレーター、例えば抗ｍＧＲＲ抗体および／またはｍＧＲＲ介在シグナル伝達を高めるかまたはそれに拮抗する小分子を含む。ｍＧＲＲ ｍＲＮＡの脳特異領域分布は、正常な脳機能の調節におけるｍＧＲＲの重要性を示す。すなわち、これらのポリペプチドの発現、存在量または活性の異常は、広く多様な神経学的および／または精神医学的疾患、例えば限定はされないが痴呆症、精神分裂病、うつ病、情動障害、癲癇および運動障害をまねき得る。例えば、アルツハイマー病および他の痴呆症、例えば老年性記憶障害および多発脳梗塞性痴呆では、認知機能の喪失が脳における若干の神経伝達物質のレベル低下に伴う。ファミリー３ＧＰＣＲ、例えば代謝型グルタミン酸受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体はまたシナプス伝達を調節し、イオンチャンネルモジュレーターと比べて、それらの作用は永続性があり、調節的である。これらの指標は全て、以後ｍＧＲＲ１ａ、ｍＧＲＲ１ｂまたはｍＧＲＲ２の「生物活性」と称す。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ｍＧＲＲ１ａ、ｍＧＲＲ１ｂまたはｍＧＲＲ２に特有な少なくとも１つの生物活性を呈する。
【００２９】
本発明ポリペプチドはまた、対立遺伝子形態およびスプライス変異型を含め、前述のポリペプチドの変異型を含む。上記ポリペプチドは、挿入、欠失および同類的または非同類的であり得る置換またはそれらの組合わせにより対照基準ポリペプチドから変化している。
【００３０】
本発明ポリペプチドの好ましいフラグメントには、配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列からの少なくとも３０、５０または１００連続アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列から先頭化または欠失された少なくとも３０、５０または１００連続アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドがある。好ましいフラグメントは、ｍＧＲＲの生物活性を伝達する生物活性フラグメント、例えば類似活性または改善された活性を伴うかまたは望ましくない活性が低減化されたものである。また好ましいのは、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるフラグメントである。
【００３１】
本発明の配列番号４または配列番号６のヒトポリペプチドのフラグメントまたは変異型は、完全長ラットｃＤＮＡを単離するため低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションにおいてラットまたはヒトＤＮＡ配列(配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１６)を用いることにより対応する完全長ポリペプチドを製造するのに使用され得る。このｃＤＮＡにより、哺乳類発現系を用いてｍＧＲＲポリペプチドが生成され得る(実施例２参照)。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ポリ核酸ハイブリッドが安定している条件をいう。上記条件は、当業者には明らかなものである。当業者に公知の通り、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度(Ｔｍ)に反映され、配列相同性が１％減少するごとに約１〜１.５℃ずつ低下する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応を高ストリンジェンシー条件下で行ない、次いでストリンジェンシーを変えながら洗浄する。本明細書で使用されている高(い)ストリンジェンシーとは、６５〜６８℃、１ＭのＮａ＋中で安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう。高ストリンジェンシー条件は、例えば６×ＳＳＣ、５×デンハート、１％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)、０.１ピロリン酸ナトリウムおよび０.１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡを非特異的競合物質として含む水溶液中でのハイブリダイゼーションにより与えられ得る。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェンシー洗浄が幾つかの工程で行われ得、最終洗浄(約３０分)は０.２〜０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中ハイブリダイゼーション温度で行なわれる。中程度のストリンジェンシーとは、上記溶液中ではあるが、約６０〜６２℃でのハイブリダイゼーションと均等内容の条件をいう。その場合、最終洗浄は、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で行なわれる。低ストリンジェンシーとは、約５０〜５２℃で上記溶液中におけるハイブリダイゼーションと均等内容である条件をいう。その場合、最終洗浄は、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中においてハイブリダイゼーション温度で行なわれる。これらの条件は、様々な緩衝液、例えばホルムアミドベースの緩衝液および温度を用いて適合化およびデュプリケイトされ得るものとする。デンハート溶液およびＳＳＣは、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液の場合と同様当業界ではよく知られている(例えば、Sambrook et al編(１９８９)Molecular Cloning：A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨークまたはAusubel et al編(１９９０)Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、インコーポレイテッド参照)。特に、若干のパラメーター、主として塩濃度および温度を改変することにより、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが変えられ得ること、および得られた条件は上記パラメーターを全て合わせた作用の結果であることは、当業者であれば容易に理解できるはずである。プローブの長さおよびＧＣ含有率もまたある一定の役割を演じるため、最適なハイブリダイゼーション条件は経験的に決定されなければならない。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であり得るかまたは大型タンパク質、例えば前駆体または融合タンパク質の一部であり得る。分泌または先導配列、プロ配列、精製を助ける配列、例えば多ヒスチジン残基を含む追加アミノ酸配列、または組換え手順中安定させるための追加配列を含ませるのが多くの場合有利である。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、適切な方法で、例えば天然供給源から、発現系を含む遺伝子操作が加えられた宿主細胞(下記参照)からの単離により、または例えば自動ペプチド合成装置を用いた、化学的合成により、または上記方法の組み合わせにより製造され得る。上記ポリペプチド製造手段は、当業界では十分に理解されている。
【００３４】
さらに別の態様において、本発明は、ｍＧＲＲポリヌクレオチドに関するものである。上記ポリヌクレオチドは、以下のものを含む：
(ａ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ｍＧＲＲポリヌクレオチド、
(ｂ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド、
(ｃ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチドと少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｄ)配列番号１、配列番号３または配列番号５の単離ポリヌクレオチド、
(ｅ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリペプチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコード化するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｆ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、
(ｇ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリペプチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコード化するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｈ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｉ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチド配列に対し０.８０、０.９０、０.９５、０.９８または０.９９の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、または
(ｋ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリペプチド配列に対し０.８０、０.９０、０.９５、０.９８または０.９９の同一性指数を有するポリペプチド配列をコード化するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、または
(ｌ)上述のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変異型であるかまたはその全長にわたって上述のポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチド。
【００３５】
本発明ポリヌクレオチドの好ましいフラグメントには、配列番号１、配列番号３または配列番号５の配列からの少なくとも１５、３０、５０または１００連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、または配列番号１、配列番号３または配列番号５の配列から切頭化または欠失された少なくとも３０、５０または１００連続ヌクレオチドを有する配列を含む単離ポリヌクレオチドがある。
【００３６】
本発明ポリヌクレオチドの好ましい変異型には、スプライス変異型、対立遺伝子変異型、および１個またはそれ以上の一塩基多型(ＳＮＰ)を有するポリヌクレオチドを含む多型がある。
【００３７】
本発明ポリヌクレオチドはまた、配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド変異型をコード化するポリヌクレオチドを含む。
【００３８】
さらに別の態様において、本発明は、本発明ＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるポリヌクレオチドを提供する。したがって、
(ａ)配列番号２、配列番号４または配列番号６のポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含むか、
(ｂ)配列番号２、配列番号４または配列番号６のポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるか、
(ｃ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含むか、または
(ｄ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるか、または
(ｅ)それらと相補的であるＲＮＡポリヌクレオチド
を含むＲＮＡポリヌクレオチドが提供される。
【００３９】
配列番号２、配列番号４または配列番号６のポリペプチドは、ＧＰＣＲ−ＬＹＭＳＴとの相同性および／または構造類似性を有する、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーの他のタンパク質と関係がある(Jensen,C.P.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.９１：４８１６−４８２０、１９９４)。
【００４０】
本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特に、それらの相同性ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと類似した生物学的機能／特性を有すると予測される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ｍＧＲＲの少なくとも一活性を有する。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは、哺乳類脳の細胞におけるｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーからの標準クローニングおよびスクリーニング技術を用いて得られる(例えば、Sambrook et al、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８９)参照)。本発明ポリヌクレオチドはまた、天然供給源、例えばゲノムＤＮＡライブラリーから得られるか、または公知市販技術を用いて合成され得る。
【００４２】
本発明ポリヌクレオチドを本発明ポリペプチドの組換え的製造に使用するとき、ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドについてのコーディング配列を単独で、または他のコーディング配列、例えば先導または分泌配列、プレ−またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコード化する配列との読み枠における成熟ポリペプチドについてのコーディング配列を含み得る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコード化され得る。本発明のこの態様のある種の好ましい例において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター(キアゲン、キアゲンＡＧ、バーゼル、スイス国)で提供され、Gentz et al、Proc Natl Acad Sci USA(１９８９)８６：８２１−８２４に記載されているヘキサ−ヒスチジンペプチド、またはＨＡ標識である。ポリヌクレオチドはまた、非コーディング５'および３'配列、例えば転写された、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定させる配列を含み得る。
【００４３】
配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチド配列と同一であるか、または十分な同一性を有するポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用ハイブリダイゼーションプローブとしてまたは核酸増幅反応(例えばＰＣＲ)用プライマーとして使用され得る。上記プローブおよびプライマーは、本発明ポリペプチドをコード化する完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、配列番号１、配列番号３または配列番号５との高い配列類似性、典型的には少なくとも９５％の同一性を有する他の遺伝子(ヒト供給源からのパラログおよびヒト以外の種からのオーソログおよびパラログをコード化する遺伝子を含む)のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するのに使用され得る。好ましいプローブおよびプライマーは、一般的に少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは３０ヌクレオチドを含み、少なくとも５０、さもなくば少なくとも１００ヌクレオチドを有し得る。特に好ましいプローブは、３０〜５０のヌクレオチドを有する。特に好ましいプライマーは、２０〜２５のヌクレオチドを有する。
【００４４】
ヒト以外の種からの相同体を含む、本発明ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号５の配列または好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドのそのフラグメントを有する標識プローブによりストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングし、上記ポリヌクレオチド配列を含む完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程を含む方法により得られる。上記ハイブリダイゼーション技術は当業者には公知である。好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ７.６)、５×デンハート溶液、１０％デキストランスルフェート、および２０マイクログラム／ｍｌの変性剪断サケ精液ＤＮＡを含む溶液中４２℃での一晩インキュベーション、次いで約６５℃での０.１×ＳＳＣ中におけるフィルター洗浄を含む。すなわち本発明はまた、配列番号１、配列番号３または配列番号５の配列または好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドのそのフラグメントを有する標識プローブでのストリンジェントハイブリダイゼーション条件下におけるライブラリーのスクリーニングにより得られる、好ましくは少なくとも１００のヌクレオチド配列を伴う、単離ポリヌクレオチドを含む。ヒトおよび(部分的)ラット配列は、ヌクレオチドレベルで８９％の同一性およびアミノ酸レベルで８９％の同一性および９０％の類似性を示す。
【００４５】
当業者であれば、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域は５'末端まで完全に伸びているわけではないという点で、単離ｃＤＮＡ配列は不完全であることが容易に理解できるはずである。これは、逆転写酵素、すなわち本質的に「プロセシビティー」(酵素が重合反応中鋳型に結合したままでいる能力の尺度)が低く、第１鎖ｃＤＮＡ合成中にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完了し得ない酵素の結果である。
【００４６】
完全長ｃＤＮＡを得るかまたは短いｃＤＮＡを伸長させる、当業者に利用可能であって熟知されている幾つかの方法があり、例えばｃＤＮＡ末端の急速増幅(ＲＡＣＥ)法に基づく方法がある(例えば、Frohman et al.、Proc Nat Acad Sci USA ８５、８９９８−９００２、１９８８参照)。例えばＭＡＲＡＴＨＯＮ技術(クロンテック・ラボラトリーズ、インコーポレイテッド、ＢＤクロンテック、バーゼル、スイス国)が典型的に示すように、最近の技術改良により、長いｃＤＮＡについての検索は著しく簡易化された。ＭＡＲＡＴＨＯＮ技術では、選ばれた組織から抽出されたｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、「アダプター」配列を各端部にライゲーションした。次いで、核酸増幅(ＰＣＲ)を実施することにより、遺伝子特異的およびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いてｃＤＮＡの「失われた」５'末端を増幅する。次いで、「内側の」プライマー、すなわち増幅産物内でアニーリングするよう設計されたプライマー(典型的にはアダプター配列においてさらなる３'をアニーリングするアダプター特異的プライマーおよび既知遺伝子配列においてさらなる５'をアニーリングする遺伝子特異的プライマー)を用いて、ＰＣＲ反応を反復する。次いで、この反応の生成物をＤＮＡ配列決定により解析し、生成物を既存のｃＤＮＡに直接結合させて完全配列を得るか、または５'プライマーの設計に関する新たな配列情報を用いて別々の完全長ＰＣＲを実施することにより、完全長ｃＤＮＡが構築され得る。
【００４７】
本発明の組換えポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作が加えられた宿主細胞から当業界でよく知られている方法により調製され得る。したがって、さらに別の態様において、本発明は、本発明の一ポリヌクレオチドまたは複数ポリヌクレオチドを含む発現系、上記発現系により遺伝子操作が加えられた宿主細胞および組換え技術による本発明ポリペプチドの製法に関するものである。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いて上記タンパク質を製造するのに使用され得る。
【００４８】
組換え体を製造するため、宿主細胞には、本発明ポリヌクレオチドについての発現系またはその一部を組込むように遺伝子操作が加えられ得る。ポリヌクレオチドは、多くの標準的実験マニュアル、例えばDavis et al.、Basic Methods in Molecular Biology(１９８６)およびSambrook et al.(同書)に記載された方法により宿主細胞に導入され得る。
【００４９】
宿主細胞へのポリヌクレオチドの好ましい導入方法には、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、トランスフェクション、顕微注入、カチオン性脂質介在トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、切屑(スクレープ)ローディング、弾道導入または感染がある。
【００５０】
適切な宿主細胞の代表例には、細菌細胞、例えばストレプトコッカス(Streptococci)、スタフィロコッカス(Staphlococci)、エシェリキア・コリ(E.coli)、ストレプトマイシス(Streptomyces)およびバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)細胞、真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス(Aspergillus)細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ(ドロソフィラ、Drosophila)Ｓ２およびスポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９細胞、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ヒーラ、Ｃ１ ２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびボーズ黒色腫細胞および植物細胞がある。
【００５１】
非常に多様な発現系、例えば染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば細菌性プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバクロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから誘導されたベクター、およびそれらの組み合わせから誘導されたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント、例えばコスミドおよびファージミドから誘導されたものが使用され得る。発現系は、発現を調節し、生じさせる制御領域を含み得る。一般的に、宿主においてポリヌクレオチドを維持、増殖または発現することにより、ポリペプチドを生産し得る系またはベクターであれば全て使用され得る。適切なポリヌクレオチド配列は、様々な公知常用技術のいずれか、例えばSambrook et al(上記参照)に示されたものにより発現系へ挿入され得る。適切な分泌シグナルを所望のポリペプチドへ組込むことにより、小胞体のルーメン、周辺腔または細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌が行われ得る。これらのシグナルは、ポリペプチドにとって内在的であり得るかまたはそれらは異種シグナルであり得る。
【００５２】
本発明ポリペプチドをスクリーニング検定で使用するために発現させる場合、一般的にポリペプチドは細胞表面で生産されるのが好ましい。この事象において、細胞は、スクリーニング検定で使用する前に採取され得る。ポリペプチドが培地へ分泌される場合、培地を採取することにより、ポリペプチドが採取および精製され得る。細胞内で製造する場合、ポリペプチドを採取する前にまず細胞を溶解しなければならない。
【００５３】
本発明ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレシチンクロマトグラフィーを含む公知方法により組換え細胞培養物から採取および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製に使用する。ポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製中に変性したとき、公知タンパク質再生技術を用いることにより活性立体配座が復元され得る。
【００５４】
本発明ポリヌクレオチドは、関連遺伝子における突然変異の検出を通して診断試薬として使用され得る。ｃＤＮＡまたはゲノム配列において配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチドを特徴とし、機能不全に伴う遺伝子の突然変異形態の検出は、遺伝子の発現不足、過剰発現または空間的または時間的発現の改変から生じる病気または病気に対する感受性の診断に加えられるかまたはそれを特定し得る診断道具を提供する。遺伝子に突然変異をもつ個体は、当業界で公知の様々な技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。
【００５５】
診断用核酸は、対象の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料から入手され得る。ゲノムＤＮＡは検出に直接使用され得るか、またはそれは、ＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲの使用により酵素的に、または他の増幅技術により分析前に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様に使用され得る。検出および挿入は、正常表現型と比べた増幅産物の大きさの変化により検出され得る。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識ｍＧＲＲヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全対合配列は、リボヌクレアーゼ消化または融解温度差により誤対合二重らせんとは区別され得る。
【００５６】
ＤＮＡ配列差異はまた、変性剤の存在または非存在下でのゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動性の改変により、または直接ＤＮＡ配列決定により検出され得る(例えば、Myers et al、Science(１９８５)２３０：１２４２)。特異位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護検定法、例えばリボヌクレアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法により示され得る(Cotton et al.、Proc Natl Acad Sci USA(１９８５)８５：４３９７−４４０１参照)。
【００５７】
ｍＧＲＲポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することにより、例えば遺伝子突然変異の有効なスクリーニングが実施され得る。上記アレイは、好ましくは高密度アレイまたはグリッドである。アレイ技法は、公知で一般的適用性を有しており、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含む分子遺伝学における様々な問題と取組むのに使用され得る。例えばM.Chee et al.、Science、２７４、６１０−６１３(１９９６)およびそこに引用された他の参考文献参照。
【００５８】
ポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現レベルの異常な減少または増加の検出もまた、対象の本発明疾患易罹患性の診断または測定に使用され得る。発現の減少または増加は、ポリヌクレオチドの定量に関する当業界で公知の方法、例えば核酸増幅、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定され得る。宿主から誘導された試料中における、タンパク質、例えば本発明ポリペプチドのレベル測定に使用され得る検定技術は、当業者には公知である。上記検定方法には、ラジオイムノアッセイ、競争的結合検定法、ウエスタン・ブロット分析およびＥＬＩＳＡ検定法がある。
【００５９】
すなわち別の態様において、本発明は、以下のものを含む診断キットに関するものである：
(ａ)本発明ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１、配列番号３または配列番号５のヌクレオチド配列、またはそのフラグメントまたはＲＮＡ転写物、
(ｂ)(ａ)の配列と相補的なヌクレオチド配列、
(ｃ)本発明ポリペプチド、好ましくは配列番号２、配列番号４または配列番号６のポリペプチドまたはそのフラグメント、または
(ｄ)本発明ポリペプチド、好ましくは配列番号２、配列番号４または配列番号６のポリペプチドに対する抗体。
【００６０】
上記キットにおいて、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)または(ｄ)は、本質的な成分を含み得るものとする。かかるキットは、疾患または易罹患性、中でも特に本発明の疾患の診断において有用である。
【００６１】
本発明ポリヌクレオチド配列は染色体局在性試験にとって貴重である。本発明配列は、個々のヒト染色体における特定位置を特異的にターゲッティングし、それとハイブリダイズし得る。本発明による染色体への関連配列のマッピングは、遺伝子関連疾患とそれらの配列の相互関係を明らかにする上での重要な第一段階である。一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体における配列の物理的位置と遺伝地図データとの相互関係が明らかにされ得る。上記データは、例えばV.McKusick、Mendelian Inheritance in Man(ジョン・ホプキンス・ユニバーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリーを通じてオンライン入手可能)から見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子および疾患間の関係は、連鎖分析(物理的隣接遺伝子の共遺伝)を用いて同定される。ゲノム配列(遺伝子フラグメントなど)についての正確なヒト染色体局在性は、放射能ハイブリッド(ＲＨ)マッピング(Walter,M.et al.、(１９９４)A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes、Nature Genetics ７、２２−２８)を用いて測定され得る。若干のＲＨパネル、例えばＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４ ＲＨパネル(Gyapay G et al.、Hum Mol.Genet.１９９６年３月、５(３)：３３９−４６)がリサーチ・ジェネティクス(ハンツビル、アラバマ、米国)から入手できる。このパネルを用いて遺伝子の染色体位置を測定するため、ＲＨ ＩＤＮＡにおいて興味の対象である遺伝子から設計されたプライマーを用いて９３のＰＣＲを遂行する。これらのＤＮＡは各々、ハムスターバックグラウンド(ヒト／ハムスターハイブリッドセルライン)で維持されたランダムなヒトゲノムフラグメントを含む。これらのＰＣＲの結果、興味の対象である遺伝子のＰＣＲ産物の存在または非存在を示す９３のスコアが得られる。これらのスコアを、既知位置のゲノム配列からのＰＣＲ産物を用いて得られたスコアと比較する。この比較は、http://www.genome.wi.mit.edu/で行なわれる。
【００６２】
本発明ポリヌクレオチド配列はまた、組織発現試験用の貴重な道具である。上記試験により、組織でコード化されたポリペプチドの発現パターンに関する指標を与え得る本発明ポリヌクレオチドの発現パターンが、それらをコード化するｍＲＮＡを検出することにより測定され得る。使用される技術は当業界では公知であり、グリッド上に整列させたクローンへのin situハイブリダイゼーション技術、例えばｃＤＮＡマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション(Schena et al、Science、２７０、４６７−４７０、１９９５およびShalon et al.、Genomes Res、６、６３９−６４５、１９９６)およびヌクレオチド増幅技術、例えばＰＣＲが含まれる。好ましい方法は、パーキン・エルマーから入手できるＴＡＱＭＡＮ(登録商標)技術を使用する。これらの試験により得られた結果は、生物体におけるポリペプチドの正常機能の指標を提供し得る。さらに、ｍＲＮＡの正常発現パターンと同じ遺伝子の代替形態(例えば、ポリペプチドコーディング可能性の改変または調節的突然変異を有するもの)によりコード化されたｍＲＮＡのそれとの比較試験は、本発明ポリペプチドの役割、または疾患におけるその不適切な発現の場合についての貴重な洞察を提供し得る。上記の不適切な発現は、時間的、空間的または単に定量的性質を有し得る。
【００６３】
染色体局在性はまた、公開ドメインデータベース、例えばＥＮＳＥＭＢＬ(http://www.ensembl.org/)を用いて推論され得る。ヒト染色体１０ｐ１１.２−ｐ１２でのヒトｍＧＲＲ１遺伝子地図、ヒト染色体Ｃｈｒ１７ｑ１１.１でのヒトｍＧＲＲ２遺伝子地図。
【００６４】
本発明の別の態様は抗体に関するものである。本発明ポリペプチドまたはそれらのフラグメント、またはそれらを発現する細胞は、本発明ポリペプチドに免疫特異的である抗体を製造するための免疫原として使用され得る。「免疫特異的」の語は、抗体が、先行技術における他の関連ポリペプチドに対する親和力よりも本発明ポリペプチドに対して実質的に大きい親和力を有することを意味する。本発明ポリペプチドに対して産生した抗体は、常用プロトコルを用いて、ポリペプチドまたはエピトープ担持フラグメント、または細胞を動物、好ましくはヒト以外の動物に投与することにより得られる。モノクローナル抗体の製造については、連続セルライン培養物により製造される抗体を提供する技術であれば全て使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature(１９７５)２５６：４９５−４９７)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al.Immunology Today(１９８３)４：７２)およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、７７−９６、Alan R.Liss,Inc.１９８５)がある。
【００６５】
１本鎖抗体の製造技術、例えば米国特許第４９４６７７８号記載のものはまた、この発明のポリペプチドに対する１本鎖抗体の製造に適合化され得る。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物体、例えば他の哺乳類もヒト化抗体の発現に使用され得る。
【００６６】
上記抗体は、ポリペプチドを発現するクローンの単離または同定、またはアフィニティー・クロマトグラフィーによるポリペプチドの精製に使用され得る。本発明ポリペプチドに対する抗体はまた、特に本発明疾患の処置に使用され得る。
【００６７】
本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドはまた、ワクチンとしても使用され得る。したがって、別の態様において、本発明は、哺乳類における免疫学的応答の誘導方法であって、例えばサイトカイン生産性Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を含め、抗体産生および／またはＴ細胞免疫応答の誘導に十分なだけの本発明ポリペプチドを哺乳類に接種することにより、病気が個体内で既に確立されているにせよ、されていないにせよ、動物を病気から保護することを含む方法に関するものである。哺乳類における免疫学的応答はまた、インビボでポリヌクレオチドの発現を指令し、ポリペプチドをコードするベクターを介して本発明ポリペプチドを送達することを含む方法により誘導され得、かかる免疫学的応答の誘導により抗体が産生し、本発明の病気から動物を保護し得る。ベクターの一投与方法は、粒子上のコーティングとしてまたは他の形で所望の細胞へそれを加速することによるものである。上記核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含み得る。使用する場合、ワクチン、ポリペプチドまたは核酸ベクターは、通常、ワクチン処方物(組成物)として提供される。処方物は、さらに適切な担体を含み得る。ポリペプチドは胃で分解され得るため、それは好ましくは非経口的(例えば皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射)に投与される。非経口投与に適切な処方物は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および処方物を受容体の血液と等張性にする溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射溶液、並びに懸濁剤または増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。
【００６８】
処方物は、単位用量または多用量容器、例えば密閉アンプルおよびバイアルの形を呈し得、使用直前に滅菌液体担体を加えるだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵され得る。ワクチン製剤はまた、処方物の免疫原性を高めるアジュバント系、例えば水中油滴系および当業界で公知の他の系を含み得る。用量は、ワクチンの比活性により異なり、常用実験により容易に測定され得る。
【００６９】
本発明ポリペプチドは、１種またはそれ以上の病的状態、特に上述の本発明疾患において関連性がある１つまたはそれ以上の生物学的機能を有する。したがって、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定することは有用である。したがって、さらに別の態様において、本発明は、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害するものを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。上述した通り、上記方法は、本発明の上記疾患に関する治療および予防目的に使用され得るアゴニストまたはアンタゴニストを同定する。化合物は、様々な供給源、例えば細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、化学的化合物のコレクション、および天然産物混合物から同定され得る。かくして同定された上記アゴニストまたはアンタゴニストは、場合によってはポリペプチドの天然または修飾基質、リガンド、受容体、酵素など、その構造的または機能的ミメティック(模倣物質)(Coligan et al.、Current Protocols in Immunology １(２)：第５章(１９９１)参照)または小分子であり得る。
【００７０】
スクリーニング方法では、候補化合物に直接的または間接的に随伴させた標識手段により、ポリペプチド、またはポリペプチドを担持する細胞または膜、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を単に測定すればよい。別法として、スクリーニング方法は、標識した競争相手(例、アゴニストまたはアンタゴニスト)に対するポリペプチドへの候補化合物の競争的結合の測定または検出(定性的または定量的)を含み得る。さらに、これらのスクリーニング方法によると、ポリペプチドを担持する細胞に適切な検出系を用いることにより、候補化合物が、ポリペプチドの活性化または阻害により発せられるシグナルを誘導するか否かが試験され得る。活性化の阻害剤は、一般的に既知アゴニストの存在下で検定され、候補化合物の存在によるアゴニストによる活性化に対する影響が観察される。さらに、スクリーニング方法は、単に、本発明ポリペプチドを含む溶液と候補化合物を混合して混合物を形成させ、混合物中におけるＨＧＲＬ１０１活性を測定し、そして混合物のＨＧＲＬ１０１活性を、候補化合物を含まない対照混合物と比較する工程を含むだけである。
【００７１】
本発明のポリペプチドは、慣用的低受容力スクリーニング方法および高スループットスクリーニング(ＨＴＳ)フォーマットでも使用され得る。上記ＨＴＳフォーマットは、９６ウェル、さらに細菌では３８４ウェルのマイクロタイタープレートの十分に確立された使用だけでなく、新たに開発された方法、例えばSchllek et al、Anal Biochem.、２４６、２０−２９(１９９７)により報告されたナノウェル方法を含む。
【００７２】
同じく前記の通り、融合タンパク質、例えばＦｃ部分およびｍＧＲＲポリペプチドからつくられたものを、高スループットスクリーニング検定法に使用することにより、本発明ポリペプチドについてのアンタゴニストが同定され得る(D.Bennett et al、J Mol Recognition、８：５２−５８(１９９５)およびK.Johanson et al.、J Biol Chem、２７０(１６)：９４５９−９４７１(１９９５))。
【００７３】
また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリペプチドに対する抗体を用いることにより、細胞におけるｍＲＮＡおよびポリペプチドの生産に対する添加化合物の効果を検出するためのスクリーニング方法が形成され得る。例えば、ＥＬＩＳＡ検定法は、当業界で公知の標準的方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌または細胞会合レベルを測定するために構築され得る。これを用いることにより、適切に遺伝子操作された細胞または組織からのポリペプチド製造を阻害または促進し得る薬剤(それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる)が発見され得る。
【００７４】
本発明ポリペプチドは、当業界で公知の標準的受容体結合技術を通じて膜結合または可溶性受容体がある場合それらを同定するのに使用され得る。これらには、限定されるわけではないがリガンド結合および架橋検定法があり、それらの検定法ではポリペプチドを放射性同位元素(例えば125Ｉ)により標識するか、化学的修飾(例えばビオチニル化)を加えるか、または検出または精製に適切なペプチド配列に融合させ、推定的受容体の供給源(細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液)とインキュベーションする。他の方法には、生物物理学的技術、例えば表面プラスモン共鳴および分光器の使用がある。また、これらのスクリーニング方法を用いることにより、ポリペプチドのその受容体への結合で競合するポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストがある場合それらが同定され得る。上記検定法の標準的実施方法は、当業界では十分に理解されている。
【００７５】
本発明ポリペプチドのアンタゴニストの例には、抗体または場合によってはオリゴヌクレオチドまたはタンパク質があり、それらは場合によってはポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素等と密接に関連したもので、例えばリガンド、基質、受容体、酵素等のフラグメント、またはポリペプチドの活性が阻止されるように本発明ポリペプチドに結合はするが、応答を発しない小分子がある。
【００７６】
スクリーニング方法はまた、トランスジェニック技術およびｍＧＲＲ遺伝子の使用を含み得る。トランスジェニック動物の構築技術は十分に確立されている。例えば、ｍＧＲＲ遺伝子は、受精した卵母細胞の雄前核への顕微注入、着床前または着床後胚へのレトロウイルス移入、または例えば電気穿孔による遺伝的に修飾された胚性幹細胞の宿主胚盤胞への注入を通じて導入され得る。特に有用なトランスジェニック動物は、動物遺伝子がその動物のゲノム内でヒト均等内容遺伝子により置きかえられた、いわゆる「ノックイン」動物である。ノックイントランスジェニック動物は、化合物がヒト標的に特異的である場合、薬剤送達プロセスにおける標的確認について有用である。他の有用なトランスジェニック動物は、細胞において内在性ＤＮＡ配列によりコード化された本発明ポリペプチドの動物オーソログの発現が部分的または完全に無効にされた、いわゆる「ノックアウト」動物である。遺伝子ノックアウトは、特異的細胞または組織にターゲッティングされ得るか、技術の限界の結果としてある種の細胞または組織でのみ行われ得るか、または動物における全てまたは実質的に全ての細胞で行われ得る。トランスジェニック動物技術はまた、導入遺伝子を発現させることにより、大量の本発明ポリペプチドが得られる動物総体発現クローニング系を提供する。
【００７７】
上記方法で使用されるスクリーニングキットは、本発明のさらに別の態様を構成する。上記スクリーニングキットは、
(ａ)本発明ポリペプチド、
(ｂ)本発明ポリペプチドを発現する組換え細胞、
(ｃ)本発明ポリペプチドを発現する細胞膜、または
(ｄ)本発明ポリペプチドに対する抗体
を含むもので、上記ポリペプチドは、好ましくは配列番号２、配列番号４または配列番号６の配列を有するものとする。
上記キットにおいて、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)または(ｄ)は、本質的な成分を含み得るものとする。
【００７８】
本明細書で引用されている、限定はされないが特許および特許出願を含む出版物および参考文献は全て、個々の各出版物または参考文献が完全に示された形で具体的および個々に引用されているのと同じ効果をもつものとして出典明示で援用する。この出願が優先権を主張している特許出願についてもまた、出版物および参考文献について上述したのと同様に出典明示で援用する。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例により本発明を説明する。
実施例１：ヒトｍＧＲＲ1ａおよびヒトｍＧＲＲ1ｂのクローニング
Ｃｅｌｅｒａヒトゲノムデータベースのｔｂｌａｓｔｎ検索における問い合わせとしてＧＡＢＡ−Ｂ受容体(受入番号Ｙ１０３７０、ＡＪ０１１３１８)のアミノ酸配列を用いることにより、同定された配列(ＧＡ＿１５２３４４２２)は、ＧＡＢＡ−Ｂおよび代謝型グルタミン酸受容体の推定貫膜ドメインとの類似性は限られていた。
【００８０】
クローニングするため、本質的に製造業者による記載内容にしたがって、クロンテックのＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥｃＤＮＡ(ヒト脳、カタログ番号７４００−１、ＢＤクロンテック、バーゼル、スイス国)を用いて対応するｃＤＮＡ５'−および３'−ＲＡＣＥ反応を遂行する。クロンテックから購入(カタログ番号６５４３−１)したポリＡ(＋)ＲＮＡ(全ヒト脳)からｃＤＮＡを転写する。製造業者の使用説明書にしたがって、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ ｃＤＮＡ合成モジュール(ライフ・テクノロジーズ、バーゼル、スイス国)を使用する。オリゴ(ｄＴ)およびランダムプライマーの両方を別々の反応(２.５μｇの各ＲＮＡ、２０μｌ)で用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成する。ＰＣＲで使用する前、１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８.５(ＴＥ)を、ｃＤＮＡ合成反応物に加えて最終量を１００μｌとする。ＭＷＧプリマスサイクラーでＰＣＲを実施する。オリゴ(ｄＴ)およびランダムプライマーｃＤＮＡ合成反応物からの均等量を合わせる。１μｌのｃＤＮＡ混合物を、５０μｌ ＰＣＲ反応で使用する(Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８９))。
【００８１】
配列ＧＡ＿１５２３４４２２から設計されたＲＡＣＥプライマーは、5-RACE: 5-gcg ggg ctc atg gaa tgc cga tgg gac-3 (配列番号９) および 3-RACE: 5-gtc cca tcg gca ttc cat gag ccc cgc-3(配列番号１０)である。ＭＷＧバイオテックサイクラーで３５サイクル(初回変性９５℃で３秒間、９５℃で３０秒間(変性)、７２℃で４分間(アニーリングおよび伸長))実行する。クロンテックＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥキット説明書で概説されている有利なポリメラーゼを使用する。Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡキットにより供給されたＡＰ２プライマーと一緒に使用される内側遺伝子特異的プライマーセット(5-RACE: 5-ccg cac tgc ata gca gag ata aac acc-3 (配列番号７)および 3-RACE: 5-caa tga gct cat cat ctc tgc tat att cc-3 (配列番号８))を用いて、２回目のＰＣＲ増幅工程を実行する。上記条件を用いて３０ＰＣＲサイクルを実行する。ＲＡＣＥクローンを、ｐＣＲII−ｔｏｐｏ(インビトロゲン、グロニンゲン、オランダ国)へサブクローニングし、配列決定する。公開ドメインデータベース(ｇｅｎｂａｎｋ)のｂｌａｓｔｎ検索により、３'−ＲＡＣＥ配列の一部は、先に公開された配列、ＫＩＡＡ１１３６(受入番号ＡＢ０３２９６２)と同一であることが観察される。この配列は、脳からクローン化された未知機能の部分的ｃＤＮＡ配列としてｇｅｎｂａｎｋに提出された。
【００８２】
ＲＡＣＥクローンから得られた配列情報を用いて、全読み枠をクローン化するためのプライマー配列を設計する。ｍＧＲＲ１ａに使用されるＰＣＲプライマーは、5-CAC Cat ggc tta ccc ctt act cct ctg c-3 (配列番号１１) および 5-cgt tgt tgc tct tgc ccc cct ggt cct c-3' (配列番号１２)である。５'−プライマーは、最小Kozak共通配列ＣＡＣＣ(Kozak、Nucl Acid Res.、１９８７、１５、８１２５−８１３２)を推定開始コドン上流に含む。ｍＧＲＲ１b用のプライマーは、5'-gtg gga cca gct gtg ctg cca ttg atc-3' (配列番号１３)および 5'-cgt tgt tgc tct tgc ccc cct ggt cct c-3' (配列番号１４)である。鋳型として１μｌの全ヒト脳ｃＤＮＡ混合物(上記)を用いて、３５ＰＣＲサイクルを実行する：初回変性９５℃で３秒間、９５℃で３０秒間(変性)、６５℃で３０秒間、７２℃で８分間。プロメガ(ヴァリセレン、スイス国)からの校正Ｐｆｕポリメラーゼを使用する。ｃＤＮＡを配列決定し(配列番号１、配列番号３)、哺乳類発現ベクター(ｐｃＤＮＡ３.１−ｔｏｐｏ、インビトロゲン)へ挿入する。
【００８３】
本発明の一ポリペプチド(ｍＧＲＲ１ａ、対応するＤＮＡ配列、配列番号１)は、１２１２アミノ酸(配列番号２)のタンパク質についての読み枠を含む。推定シグナルペプチド配列(MAYPLLLCLLLAQLGLG (配列番号１５))が、配列番号２のＮ末端そのものに位置するということから、Ｎ末端タンパク質配列は細胞外に位置することが示唆される。ｍＧＲＲ１ｂと呼ばれるｍＧＲＲ１のＮ−末端スプライス変異型に対応する配列(配列番号４)は、１１８３アミノ酸(配列番号５)の読み枠を含む。演繹されたタンパク質配列は、ファミリー３ Ｇタンパク質共役受容体に特有な構造的特徴を有する。すなわち、１)疎水性プロットは、７つの推定貫膜ドメインをもつタンパク質を予測させる。２)ファミリー３ ＧＰＣＲとの類似性は、ｂｌａｓｔｐ検索(推定貫膜領域の局所アラインメント)により実証されている：ドロソフィラ・メラノガスター(drosophila melanogaster)代謝型グルタミン酸受容体(受入番号Ｐ９１６８５)と比較すると、ｍＧＲＲ１ａについては２１％の同一性および４５％の類似性を示す残基が見出される。推定ドロソフィラ・メラノガスター(drosophila melanogaster)(推定)代謝型ＧＡＢＡ−Ｂ受容体サブタイプ３(受入番号ＡＦ３１８２７４、推定貫膜領域の局所アラインメント)と比較すると、ｍＧＲＲ１ａについては２２％の同一性および４３％の類似性を示す残基が見出される。ショウジョウバエ(ドロソフィラ、drosophila)ゲノムにおいてｍＧＲＲ１ａに最も近い相同体は、推定遺伝子産物ＣＧ１１９２３(フライベース受入番号ＦＢｇｎ００３１６４２)であり、２７％の同一性および４３％の類似性を示す残基を有する(ＣＧ１１９２３の残基１０９−５８８を伴う配列番号２のｂｌａｓｔｐ局所アラインメント残基２４１−７４５)。ＣＧ１１９２３の機能は、Ｇタンパク質共役受容体として分類された。公開ドメインデータベースにおいて最も近い哺乳類ＧＰＣＲ相同体は、代謝型グルタミン酸受容体３型(受入番号Ｑ１４８３２)であり、２３％の同一性および４１％の類似性を示す残基をもつ(ｍＧｌｕＲ３の残基５４０−８０１を伴う配列番号２の局所アラインメント残基３８５−６４０)。ファミリー３ ＧＰＣＲとのｍＧＲＲの類似性は、推定貫膜スパンニング領域に限定される。ｍＧＲＲのＮ−末端推定的細胞外ドメインについても、Ｃ−末端推定的細胞内ドメインについても、既知タンパク質との顕著な類似性は見出されない。
【００８４】
【表１】
表２：ｍＧＲＲ１ａの推定貫膜領域
【００８５】
実施例２：ヒトｍＧＲＲ２のクローニング
Ｃｅｌｅｒａヒトゲノムデータベースのｔｂｌａｓｔｎ検索における問い合わせとしてＧＡＢＡ−Ｂ受容体(受入番号Ｙ１０３７０、ＡＪ０１１３１８)のアミノ酸配列を用いることにより、同定された配列(ＧＡ＿１５０９１９５５)は、ＧＡＢＡ−Ｂおよび代謝型グルタミン酸受容体の推定貫膜ドメインとの類似性が限られていた。
【００８６】
クローニングするため、本質的に製造業者による説明にしたがって、クロンテックのＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥｃＤＮＡ(ヒト脳、カタログ番号７４００−１、ＢＤクロンテック、バーゼル、スイス国)を用いて対応するｃＤＮＡ５'−および３'−ＲＡＣＥ反応を遂行する。クロンテックから購入(カタログ番号６５４３−１)したポリＡ(＋)ＲＮＡ(全ヒト脳)からｃＤＮＡを転写する。製造業者の使用説明書にしたがって、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ ｃＤＮＡ合成モジュール(ライフ・テクノロジーズ、バーゼル、スイス国)を使用する。オリゴ(ｄＴ)およびランダムプライマーの両方を別々の反応(２.５μｇの各ＲＮＡ、２０μｌ)で用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成する。ＰＣＲで使用する前、１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８.５(ＴＥ)を、ｃＤＮＡ合成反応物に加えて最終量を１００μｌとする。ＭＷＧプリマスサイクラーでＰＣＲを実施する。オリゴ(ｄＴ)およびランダムプライマーｃＤＮＡ合成反応物からの均等量を合わせる。１μｌのｃＤＮＡ混合物を、５０μｌ ＰＣＲ反応で使用する(Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８９))。
【００８７】
配列ＧＡ＿１５０９１９５５から設計されたＲＡＣＥプライマーは、5-RACE: 5-ccc gct gct cag aag ggc act ccg ctg g-3 (配列番号２４)および 3-RACE: 5-tgg acc gtg ggc gcc ctg gag cga ggc-3(配列番号２５)である。ＭＷＧバイオテックサイクラーで３５サイクル(初回変性９５℃で３秒間、９５℃で３０秒間(変性)、７２℃で４分間(アニーリングおよび伸長))実行する。クロンテックＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥキット説明書に記載されている実験手順を使用する。Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡキットにより供給されたＡＰ２プライマーと一緒に使用される内側遺伝子特異的プライマーセット(5-RACE: 5'-ggg ccg ttc gag aca gaa aca gct gca g -3 (配列番号２７)および 3-RACE: 5-gct ggg act aca tca tgg ttg tgg ctg -3(配列番号２６)を用いて、２回目のＰＣＲ増幅工程を実行する。上記条件を用いて３０ＰＣＲサイクルを実行する。ＲＡＣＥクローンを、ｐＣＲII−ｔｏｐｏ(インビトロゲン、グロニンゲン、オランダ国)へサブクローニングし、配列決定する。
【００８８】
ＲＡＣＥクローンから得られた配列情報を用いて、対応するゲノム配列およびヒトＣｈｒ１７ｑ１１.１におけるｍＧＲＲ２遺伝子座を同定する(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human)。転写配列をｇｅｎｓｃａｎプログラム(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)により予測し、推定読み枠を包含するＰＣＲプライマーを設計する。プライマー対は、5'-CAC CGC CTC TGC CTG GGC TCT CCT G-3'(F1) (配列番号28) および 5'-CGC TGC TCA GAA GGG CAC TCC GCT GG-3' (配列番号 29); 5'- GGA TTC CTG CTG CTT TAC TTT CCT GTC-3' (配列番号 30)および 5'-CCA CAG ACA CAC TTC AGC AAT GCC-3' (配列番号31); 5'-CCA GGA AGG TGG AGA AGC CTG GGT GGG-3' (配列番号 32)および 5'- cta act tgc cct gta gca ctc ctc-3' (r1) (配列番号 33)である。鋳型として１μｌの全ヒト脳ｃＤＮＡ混合物(上記)を用いて、３５ＰＣＲサイクルを実行する：初回変性９５℃で３秒間、９５℃で３０秒間(変性)、６２〜６８℃で３０秒間、７２℃で８分間。プロメガ(ヴァリセレン、スイス国)からの校正Ｐｆｕポリメラーゼを使用する。上記と同様(２５のＰＣＲサイクルを実行する：初回変性９５℃で３秒間、９５℃で３０秒間(変性)、６８℃で３０秒間、７２℃で１４分間)ＰｆｕポリメラーゼおよびプライマーＦ１およびＲ１を用いるＰＣＲ反応においてオーバーラップ伸長を通してスプライシングすることにより(Methods Enzymol.１９９３、２１７：２７０−２７９)、完全長配列を構築し、ｃＤＮＡ配列を哺乳類発現ベクター(ｐｃＤＮＡ３.１−zeｏ、インビトロゲン)へ挿入する。
【００８９】
本発明の一ポリペプチド(ｍＧＲＲ２、対応するＤＮＡ配列、配列番号５)は、２３６７アミノ酸(配列番号６)のタンパク質についての読み枠を含む。推定シグナルペプチド配列(MGTRGAVMPPPMWGLLGCCFVCAWALG (配列番号３４))が、ｍＧＲＲ２ポリペプチド(配列番号６)のＮ末端そのものに位置するということから、Ｎ末端タンパク質配列は細胞外に位置することが示唆される。ｈｍＧＲＲ２のアミノ酸配列は、ｍＧＲＲａと５１％の同一性を示し、５８％の類似残基を伴う(ｍＧＲＲ２の残基６１〜７３７を伴うｍＧＲＲａのアミノ酸残基８１〜７７０のｂｅｓｔｆｉｔアラインメント)。
【００９０】
異なる脳領域に由来するｃＤＮＡ(クロンテック)および上記ＲＡＣＥプライマーを用いたＰＣＲによる発現プロファイリングは、ｍＧＲＲ１ａ／ｂに対するオーバーラップ発現プロファイルと共に脳におけるｍＧＲＲ２ ｍＲＮＡの広範な分布を示す。
【００９１】
実施例３：部分的ラットｍＧＲＲ１のクローニング
ラットｍＧＲＲ１ ｃＤＮＡクローンは、ｂｌａｓｔｎ検索における問い合わせとしてヒトｍＧＲＲ１ａ配列(配列番号１)を用いることにより、整列させた後根ガングリオンｃＤＮＡライブラリー(ノヴァリティス起源)で同定される。このクローンからのプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡ挿入体を部分的に配列決定する(配列番号１６)。ヌクレオチド配列は、対応するヒトｍＧＲＲ１およびｂ配列(配列番号１、配列番号３)と８０％同一である。
【００９２】
実施例４：哺乳類細胞発現(In situハイブリダイゼーション)
３２Ｐ−ＵＴＰセンスおよびアンチセンスリボプローブの合成用鋳型として、ラットｍＧＲＲ ｃＤＮＡ(配列番号１６)のフラグメントを、Ｔ７プロモーター配列が結合されたプライマーを用いるＰＣＲにより増幅する。プライマー配列は、5-AAT GGA AGT CAG TTG TAC AC-3 (配列番号 17)および5-TTA tac act cac tat agg gaA ATG TCC CTT TAA CAG GCT G-3(配列番号 18) (アンチセンス鋳型)および 5-taa tac gac tca cta tag gga AAT GGA AGT CAG TTG TAC AC-3(配列番号 19)および 5-AAT GTC CCT TTA ACA GGC TG-3(配列番号２０)(センス鋳型)である。５０ｎｇの鋳型プラスミド(ラットｍＧＲＲ、配列番号１６)を用いて、ＭＷＧプリマスサイクラーにおいて２５のＰＣＲサイクルを実行する。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間(変性)、６８℃で１分間(アニーリング)および７２℃で１分間(伸長)である。予測サイズ(５９０ｂｐ)のＰＣＲ産物が得られ、これをスピンカラム(ロシェ・ディアグノスティクス、インディアナポリス、米国、カタログ番号１７３２６６８)により精製し、３５Ｓ−標識ＲＮＡプローブの合成に使用する。
【００９３】
プローブ合成を、ＲＮＡ転写キット(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア、米国)により以下の要領で実施する。６μｌの[α−３５Ｓ]ＵＴＰおよび６μｌの[α−３５Ｓ]ＡＴＰ(比活性１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ、米国)を、１.５ｍｌ管中で濃縮する。その後、２μｌの５×転写緩衝液、１μｌの１００ｍＭのＤＴＴ、３μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ、１μｌの溶液(１０μｌの１００ｍＭのＣＴＰ、１０μｌの１００ｍＭのＧＴＰ、３０μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ含有)、１μｌのＲＮアシン、１μｌのＴ７またはＴ３ポリメラーゼおよび２００ｎｇのＰＣＲ産物を加える。３７℃で１〜１.５時間のインキュベーション後、５０μｌのＳＤＳ２０％、１００μｌの０.１ＭのＤＤＴおよび８５０μｌの１０ｍＭトリス−１ｍＭのＥＤＴＡ(ｐＨ７.４)を含む溶液９０μｌを加えることにより、反応を停止させる。セファデックスＧ−５０スピン−カラム(ベーリンガー、マンハイム、ドイツ国)で精製後、シンチレーション計数法により放射能を測定する。ハイブリダイゼーション混合物を、２種の別々の溶液から調製する。すなわち、溶液Ａは、１０ｍｌのホルムアミド、４ｍｌの５０％デキストランスルフェート、４００μｌの５０×デンハート溶液(５００ｍｌのＨ２Ｏ中、５ｇのフィコル、５ｇのポリビニルピロリドンおよび５ｇのウシ血清アルブミン)、４０μｌの０.５ＭのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、２００μｌの１Ｍのトリス(ｐＨ８.０)および１.２ｍｌの５ＭのＮａＣｌを含む。溶液Ｂは、１〜５μｌの３５Ｓ標識プローブ(正確な量は、最終培地中で１０７ｃｐｍ／ｍｌの濃度に達するように特定される)、１００μｌのｔＲＮＡ、１００μｌの０.１ＭのＤＴＴおよび最終的に２ｍｌにするための適量のＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏを含み、これを６５℃で５分間加熱する。最終ハイブリダイゼーション混合物を、十分に混合した８ｍｌの溶液Ａおよび２ｍｌの溶液Ｂにより調製し、注射器濾過し、５分間６５℃で再加熱し、５分間１００００ｇで遠心分離することにより、気泡を除去する。
【００９４】
ラット脳を、−２０〜−２５℃の低温保持装置で８〜１６μｍ厚さの冠状片に切断し、ゼラチン−ポリ−Ｌ−リシン−コーティングしたスライドに載せる。断片を室温で一晩真空乾燥し、４％(ｗ／ｖ)氷冷パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、１×ＰＢＳ中で１分３回洗浄する。それらを同日ハイブリダイゼーションに使用するか、または−７０℃の密閉スライド箱中で貯蔵する。
【００９５】
ハイブリダイゼーション当日、冷凍したスライド箱を室温に達するまで密閉したままにしておく。次いで、スライドを、２５０ｍｌの０.３Ｍのトリエタノールアミンを含む染色皿に連続的に浸し、６２５μｌの無水酢酸が加えられた同じエタノールアミンでアセチル化し、等級付けしたエタノール(５０、７０、９５、１００、１００％)中で脱水し、１〜３時間真空乾燥する。７５μｌのハイブリダイゼーション混合物をピペットでカバーグラスに移す。ガラススライドとの接触時、溶液は毛管現象により断片全体に均一に拡散する。一旦ＤＰＸで密閉し、スライドを置き、１６〜２０時間５６℃に保つ。次いで、スライドを室温で冷却し、硬化ＤＰＸを除去し、カバーグラスがはずれるまでスライドを２０分間またはそれ以上４×ＳＳＣ緩衝液に浸す。０.１×ＳＳＣ中における高ストリンジェンシー洗浄を６８℃で行う。エマルジョン−浸漬のため、断片を９５％エタノール中で５分、１００％エタノール中で５分を３回、キシレン中で５分を１回、１００％エタノール中で３０秒を１回および再び３回(前と同じ溶液)脱脂し、少なくとも１時間真空乾燥する。次いで、暗室中で、液体核エマルジョン(コダック、ＮＴＢ２、インテグラ・バイオサイエンシーズＡＧ、ヴァリセレン、スイス、州／国)を、５２℃に予熱しておいた蒸留水中で１：１に希釈する。混合物を５２℃の水浴中で１５分間溶解させる。次いで、溶液を１８０°回転により非常に静かに攪拌し、十分ではあるが、発泡を回避しながら混合し、さらに１５分間静置する。均一混合物を特製浸漬フラスコ中に注ぎ、再び１５分間置いて泡を除く。次いで、スライドをエマルジョン中に１回浸漬し、３時間暗いチャンバーに入れたホルダーで乾燥する。スライドを、暗室中４℃の密閉スライド箱で貯蔵する。１６〜６０ｄ暴露後、スライドを現像処理する。標準濃度で使用される現像液Ｄ−１９および定着液(コダック)を、氷中で１５℃に冷却する。次いでスライドを現像液に３.５分間浸し、１５℃の水で１５秒間洗浄し、６分間定着させる。最後に、それらを脱塩水で１時間洗浄する。断片を対比染色するかまたは、カバーグラスを置く前にスライドを３滴の組織封入剤(パーマウント、フィッシャー・サイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルベニア、米国)と共に顕微鏡検査用に固定し、カバーグラスが強く接着するまで数日間スライド箱で乾燥する。
【００９６】
ｍＧＲＲ ｍＲＮＡの観察された脳特異領域分布は、ｍＧＲＲリガンドについての可能な指標に関する情報を提供する。ｍＧＲＲリガンドは、天然リガンドおよびｍＧＲＲ活性のモジュレーター、例えば抗ｍＧＲＲ抗体および／またはｍＧＲＲ介在シグナル伝達を促進または打ち消す小分子である。ファミリー３ ＧＰＣＲ、例えば代謝型グルタミン酸受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体は、シナプス伝達を調節し、イオンチャンネルと比べてそれらの効果は永続性があり、調節的である。ｍＧＲＲの脳におけるｍＲＮＡ発現パターンは、ｍＧＲＲ相互作用分子が、神経学的および／または精神医学的疾患、例えば限定されるわけではないが、痴呆、精神分裂病、うつ病、情動障害、癲癇および運動障害の処置に有用であることの指標を提供する。
【００９７】
本発明ポリペプチドは、全主要脳構造で発現される(表１)。
【表２】
【表３】
【表４】
【００９８】
表１：ラット脳全体にわたるｍＧＲＲ１をコードするｍＲＮＡの分布。使用されるハイブリダイゼーションプローブは、ｍＧＲＲ１ａおよびｍＧＲＲ１ｂに共通したＣ−末端配列に対応する(パンプローブ)。１０日間核エマルジョンに暴露した後、暗視野顕微鏡下で発現レベルを冠状および矢状方向脳断片について評価した。０＝検出可能な発現は無し、＋＝弱い、＋＋＝中ぐらい、＋＋＋＝高い、＋＋＋＋＝非常に高い。
【００９９】
ｍＧＲＲ ｍＲＮＡの観察された脳特異領域分布は、ｍＧＲＲリガンドについての可能な指標に関する情報を提供する。ｍＧＲＲリガンドは、天然リガンドおよびｍＧＲＲ活性のモジュレーター、例えば抗ｍＧＲＲ抗体および／またはｍＧＲＲ介在シグナル伝達を促進または打ち消す小分子である。ファミリー３ ＧＰＣＲ、例えば代謝型グルタミン酸受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体は、シナプス伝達を調節し、イオンチャンネルと比べてそれらの効果は永続性があり、調節的である。
【０１００】
実施例５：免疫ブロット
ＨＡ標識ｍＧＲＲ１ａの生成。Ｃ−末端血球凝集素(ＨＡ)エピトープ(ヌクレオチド配列5'-TATCCATATGATGTTCCAGATTATGCT(配列番号２１))を、ｍＧＲＲ１ａのＣ−末端配列に付加した。この末端に対し、鋳型として(５０ｎｇ)ｐｃＤＮＡ３.１ｔｏｐｏにおけるヒトｍＧＲＲ１ａを用いてプライマー5'-CAAGACTCCAGTTCTCCCAGAG (配列番号22)および5'- TCTAGATCTAGACTAAGCATAATCTGGAACATCATATGGATACACTTTAAAACTATCCCAGATC (配列番号23)によりＰＣＲ反応を実行した。９５℃(３０秒)、６８℃(３０秒)、７２℃(３０秒)で２５のＰＣＲサイクルを実行した。予想サイズ(４１７ｂｐ)のＰＣＲ産物が得られ、これをＢｓｇＩおよびＸｂａＩで二重消化し、ゲル精製(Ｑｉａｅｘ、キアゲン)し、ｐｃＤＮＡ３ｔｏｐｏにおける野生型ｈｍＧＲＲ１ａのＢｓｇＩ／ＸｂａＩフラグメントの置換に用いた。両鎖の配列決定により構築物を確認した。
【０１０１】
免疫ブロット。トランスフェクションされたＣＯＳ１細胞からの膜を解凍し、遠心分離にかけ、ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ(１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０.６ｍＭのＭｇＣｌ２、１.８ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６ｍＭのデキストロース；(ライフ・テクノロジーズ＃０４３−９０１７４Ｍ))、５０μｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩに再懸濁し、試料緩衝液(１２５ｍＭのトリスｐＨ６.８、１％ＳＤＳ、２５ｍＭのＤＴＴ、５％のグリセリン／ブロムフェノールブルー)中で希釈した。タンパク質(１レーン当たり２０μｇ)を、４〜１５％勾配ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、電気泳動によりイモビロン−Ｐ ＰＶＤＦメンブラン(ミリポアＡＧ、フォルケツビル、スイス国)へ移動させた。ＮＥＴ−Ｇ緩衝液(１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ ｐＨ７.４、５ｍＭのＥＤＴＡ、０.０５％(ｖ／ｖ)のトリトンＸ１００、０.２５％ｗ／ｖのゼラチン)中で一晩インキュベーションすることにより非特異的結合を減少させた。それに続いて、膜を、室温で４５分間ＮＥＴ−Ｇ中(１：５００)においてモノクローナルラット抗ＨＡ−ペルオキシダーゼ高アフィニティー抗体(３Ｆ１０、ロシェカタログ番号２０１３８１９)とインキュベーションした。ＮＥＴ−Ｇにより３回洗浄(各１０分)後、強化化学発光ウエスタンブロット試薬(アマーシャム・ライフ・サイエンシーズ＃２１０６)を用いて結合抗体を検出し、膜をバイオマックスＭＲ(コダック)フィルムに露出した。ｐｃＤＮＡ３.１−ｔｏｐｏ(ギブコ・ライフ・サイエンシーズ)におけるヒトＧＲＲ−ＨＡでトランスフェクション後のＣＯＳ−１細胞からの膜のウェスタンブロットは、１３４ｋＤａ(そのタンパク質配列から予測された通り)のところにタンパク質バンドを示す。免疫ブロットは、細胞膜により為されているためｍＧＲＲが細胞膜で見出されることを示す。
【０１０２】
実施例６：機能分析
ｍＧＲＲ１ａ、ｍＧＲＲ１ｂおよびｍＧＲＲ２は、推定相互作用受容体タンパク質と一緒に組換え発現系、例えばＨＥＫ２９３細胞またはＣＯＳ細胞において共発現され得る。ｃＤＮＡ発現構築物のコトランスフェクションは、例えばエフェクテントランスフェクション剤(キアゲン)により行われ得る。機能的リードアウトは、アゴニスト誘導ＧＴＰｙＳ結合、例えばGalvez et al.、Mol.Pharmacol.、５７、４１９−４２６(２０００)またはカリウムチャンネルの活性化(Lingenhoehl et al.、Neuropharmacology、３８、１６６７−１６７３(１９９９))の分析を含み得る。Ｇタンパク質またはキメラＧタンパク質のコトランスフェクションを用いることにより、報告された要領(Galvez et al.、EMBO J、２０、２１５２−２１５９(２００１))で測定され得るカルシウムシグナル(イノシトールリン酸蓄積)を発生させ得る。別法として、放射性標識候補リガンドの結合は、トランスフェクション細胞から誘導された膜調製物を用いて測定され得る。さらに、以下の実験により、ｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２の機能が解明され得る。
【０１０３】
ａ)遺伝子ノックアウト
ネズミｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２遺伝子は、それぞれ近位Ｃｈｒ２および遠位Ｃｈｒ１１に局在している。ネズミｍＧＲＲ遺伝子およびそれらの構造についての知識を用いて、ｍＧＲＲａおよび／またはｍＧＲＲ２遺伝子の機能が除去されたマウスを製造する目的で遺伝子ターゲッティング構築物を設計する。ノックアウト動物は、構成的または誘導性ノックアウトを含めて報告された(Neuron.２００１：３１、４７−５８)標準的方法により製造される。同型接合ノックアウトマウスの表現型を生化学、薬理学および電気生理学的範例で研究することにより、既知生化学的および受容体経路が被り得る損傷を試験する。また上記動物は、様々な行動的範例でも研究されている(Neuron.２００１；３１、４７−５８)。
【０１０４】
ＣＧ１１９２３により、哺乳類ｍＧＲＲの推定ショウジョウバエ(ドロソフィラ、drosophila)相同体が同定された。ＣＧ１１９２３の機能がＰエレメント突然変異導入手段により破壊されたショウジョウバエの表現型が研究されている。結果は、インビボでのｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２の機能の解明に役立つものであると予測される。
【０１０５】
ｂ)相互作用タンパク質
ベイト(おとり)としてＣまたはＮ末端配列を用いることにより、ｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２の相互作用タンパク質が同定される。これは、脳ｃＤＮＡライブラリーの酵母２ハイブリッドスクリーンおよびＧＳＴ融合タンパク質の生成を伴うもので、後続の脳抽出物を用いたプルダウン解析法およびタンパク質の質量分光法に使用される。また上述の方法を使用することにより、ｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２についての可能なヘテロ二量体相互作用を調べる。潜在的相互作用タンパク質を、トランスフェクション細胞およびニューロン培養物における共局在性実験で調べる。ヒトｍＧＲＲ１ａ／ｂのＣ末端そのものにおいて、推定II型ＰＤＺタンパク質結合モチーフ(J Biol Chem.２００２、２７７、１５２２１−４)が同定されることから、ｍＧＲＲ１a／bと既知ＰＤＺモチーフ結合タンパク質、例えばＰＩＣＫ１との相互作用は、ｍＧＲＲを既知ＧＰＣＲシグナル伝達経路に指向させ得ることが示唆される(EMBO J.２００２、２１、２９９０−９)。ＰＩＣＫ１とヒトｍＧＲＲ１の推定相互作用を、上記共局在性および共免疫沈降試験を用いて調べる。
【０１０６】
ｃ)リガンド・フィッシングスクリーン
推定ＧＰＣＲリガンドのコレクションは、研究室において確立されている。推定受容体リガンドのバンクがスクリーニング用に構築された。バンクは、伝達物質、ホルモンおよびケモカイン、ヒト受容体についての推定アゴニストであり得る天然化合物、哺乳類対応物質がまだ同定されていない非哺乳類生物活性ペプチド、および天然では見出されないが、未知天然リガンドを伴う受容体を活性化する化合物を含む。このバンクは、機能性(すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理現象など、下記参照)および結合検定法の両方を用いて既知リガンドについての受容体を最初にスクリーニングするのに使用される。ｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２を、組換え発現系、例えばＨＥＫ２９３細胞またはＣＯＳ細胞で推定相互作用受容体タンパク質(上記)と共発現させる。これはまた、ｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２の発現を含み得る。ｃＤＮＡ発現構築物のコトランスフェクションは、例えばエフェクテントランスフェクション剤(キアゲン)により行なわれる。機能的リードアウトは、アゴニスト誘導ＧＴＰｙＳ結合、例えばGalvez et al.、Mol.Pharmacol.、５７、４１９−４２６(２０００)またはカリウムチャンネルの活性化(Lingenhoehl et al.、Neuropharmacology、３８、１６６７−１６７３(１９９９))の分析を含み得る。Ｇタンパク質またはキメラＧタンパク質のコトランスフェクションを用いることにより、報告された要領(Galvez et al.、EMBO J、２０、２１５２−２１５９(２００１))で測定されるカルシウムシグナル(イノシトールリン酸蓄積)を発生させ得る。別法として、放射性標識候補リガンドの結合を、トランスフェクション細胞から誘導された膜調製物を用いて測定する。
【０１０７】
ｄ)抽出物／細胞上清スクリーニング
現在までのところ、同族活性化リガンド(アゴニスト)が存しないままの多数の哺乳類受容体が存在する。すなわち、これらの受容体についての活性リガンドは、現在までに同定されたリガンドバンク内には含まれ得ない。
【０１０８】
したがって、また本発明受容体を、組織抽出物に対する機能性スクリーニング(カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理現象など、機能性スクリーン)にかけることにより、天然リガンドが同定される。正の機能性応答を生じる抽出物は、活性化リガンドが単離同定されるまで連続的にサブフラクション化され得る。
【０１０９】
ｅ)抗体およびペプチド
抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)は、ｍＧＲＲのＮおよびＣ末端エピトープに対して産生される。同定された推定相互作用タンパク質(例えば上記ＰＩＣＫ１)とｍＧＲＲタンパク質の会合を破壊することが予測されるペプチドを設計する。内在的に発現されたｍＧＲＲタンパク質の機能を破壊する目的で抗体および／ペプチドを培養ニューロン細胞に適用する。抗体および／またはペプチド処理細胞の電気生理学的特性を未処理細胞と比較研究する。
【０１１０】
実施例７：リガンド結合検定法
リガンド結合検定法は、受容体薬理学についての直接確認方法を提供するもので、高スループットフォーマットに適用可能である。結合試験用に、受容体についての精製リガンドを、高比活性(５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ)に放射性標識する。次いで、放射性標識方法がその受容体に向かうリガンドの活性を減じることはないという測定がなされる。緩衝液、イオン、ｐＨおよび他のモジュレーター、例えばヌクレオチドについての検定条件を最適化することにより、膜および全細胞受容体供給源の両方にとって実行可能なシグナル対ノイズ比を確立する。これらの検定法については、放射能合計−過剰の非標識競合リガンドの存在下で測定された放射能として、特異的受容体結合を定義する。可能な場合、複数の競合リガンドを用いて、残留非特異的結合を特定する。
【０１１１】
ｍＧＲＲ１ａ、ｍＧＲＲ１ｂおよびｍＧＲＲ２は、本質的に同じリガンドを有し得る。
【０１１２】
実施例８：染色体局在性
慣用技術を用い、公開ドメインデータベース、例えばＥＮＳＥＭＢＬ(http://www.ensembl.org/)を用いて染色体局在性を推測する。ヒトＣｈｒ１０ｐ１１.２−ｐ１２におけるヒトｍＧＲＲ地図、ヒトＣｈｒ１７ｑ１１.１におけるｍＧＲＲ２遺伝子座地図。
発明の分野
この発明は、新たに同定されたポリペプチドおよび上記ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、診断、および治療において潜在的に有用なアゴニストまたはアンタゴニストであり得る化合物の同定におけるそれらの使用、およびＧタンパク質共役受容体(ＧＰＣＲ)との類似性を共有する上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの生産に関するものである。
【０００２】
発明の背景
創薬過程は、近年、それが「ファンクショナル・ゲノミクス(機能ゲノム解析)」、すなわち高スループットのゲノムまたは遺伝子に基いた生物学を取り入れていることから、根本的な変革を被っている。治療標的として遺伝子および遺伝子産物を同定する手段としてのこの方法は、急速に「ポジショナル・クローニング」に基いた初期の方法に取って代わっている。表現型、すなわち生物学的機能または遺伝病を同定し、次いで、その遺伝地図の位置に基いて、関与する遺伝子を突きとめる。ファンクショナル・ゲノミクスは、高スループットＤＮＡ配列決定技術および現時点で利用可能な多くの分子生物学データベースから潜在的興味の対象である遺伝子配列を同定するためのバイオインフォマティクスの様々なツールに大いなる信頼をおくものである。創薬標的としてのさらなる遺伝子およびそれらの関連ポリペプチド／タンパク質の同定および特性確認が依然として要望されている。
【０００３】
発明の要旨
本発明は、本明細書でヒトｍＧＲＲ１ａ、ｍＧＲＲ１ｂおよびｍＧＲＲ２(本明細書では３つともｍＧＲＲとして称す)として称しているヒト起源の精製代謝型グルタミン酸受容体関連膜受容体タンパク質に関するものである。代謝型グルタミン酸受容体とｍＧＲＲの類似性は、これらの受容体が同じくＧＰＣＲのファミリー３に属することを示唆している。この受容体ファミリーは、代謝型グルタミン酸受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ受容体、Ｃａ−知覚受容体、推定味覚受容体および嗅覚鋤骨鼻受容体のファミリーを包含する。公開ドメインデータベースにおいて本発明ポリペプチドと最も近いことが見出された哺乳類ＧＰＣＲ相同体は、配列番号２に記載されたｍＧＲＲ１ａのポリペプチドと２３％同一で４３％類似したアミノ酸残基を有する代謝型グルタミン酸受容体３型(受託番号Ｑ１１９２３)である。上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、限定されるわけではないが、中枢および末梢神経系に伴う疾患の処置を含むある種の疾患の処置方法に関して興味の対象となっている。特に、ｍＧＲＲ受容体アゴニストまたはアンタゴニストは、例えば、限定されるわけではないが、痴呆症、精神分裂病、うつ病、情動障害、癲癇および運動障害を含む神経学的および／または精神医学的疾患の処置に有用であり得、これらを以後「本発明の疾患」と称する。さらに別の態様において、本発明は、本発明で提供される材料を用いてｍＧＲＲに対するアゴニストおよびアンタゴニスト(例、阻害剤)を同定し、上記化合物の不均衡に伴う状態を処置する方法に関するものである。さらに別の態様において、本発明は、不適切なｍＧＲＲ活性またはレベルに伴う疾患を検出するための診断的検定法に関するものである。
【０００４】
発明の記載
(用語解説)
本明細書で使用されているある種の用語を理解し易くするため以下の定義を与える。
【０００５】
「単離(された)」は、その天然の状態から改変されていること、すなわちそれが天然で存する場合、そのもとの環境からそれを変化させたかまたは取り除いたこと、またはその両方を意味する。例えば、この語が本明細書で使用されているところによると、生きている生物体に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」おらず、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドでも、その天然状態の共存物質から分離されると、「単離された」ことになる。さらに、形質転換、遺伝子操作または他のあらゆる組換え方法により生物体へ導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それが依然として上記生物体に存在している場合でも「単離され」ており、その生物体は生きている場合も死んでいる場合もあり得る。
【０００６】
「ポリヌクレオチド」は、一般的にポリリボヌクレオチド(ＲＮＡ)またはポリデオキシリボヌクレオチド(ＤＮＡ)を包含し、それらは非修飾または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」は、１本および２本鎖ＤＮＡ、１本および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本および２本鎖ＲＮＡ、および１本および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本鎖または１本および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、限定はされない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域をいう。「ポリヌクレオチド」の語はまた、１個またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ並びに安定性または他の理由により修飾されたバックボーンをもつＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
【０００７】
「修飾(された)」塩基は、例えばトリチル化塩基および特異塩基、例えばイノシンを包含する。様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに加えられ得る、すなわち、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然で見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的修飾形態、並びにウイルスおよび細胞に特有なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと称されることが多い、比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【０００８】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターにより互いに連結された２個またはそれ以上のアミノ酸を含むポリペプチドをいう。「ポリペプチド」は、通常ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般的にタンパク質と称される長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは、２０遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」は、天然プロセス、例えば翻訳後プロセッシングにより、または当業界で公知の化学的修飾技術により修飾されたアミノ酸配列を含む。上記修飾は基本的テキストおよびより詳細なモノグラフ並びに当業者に馴染みのある多量の研究文献に詳述されている。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含むポリペプチドのいずれの場所でも加えられ得る。同じタイプの修飾が所定のポリペプチドにおける幾つかの部位で同程度または様々な程度で存在し得るものとする。また、所定のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含み得る。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝状であり得、それらは環状であり、分枝状形態を伴う場合も伴わない場合もあり得る。環状、分枝状および分枝状環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じ得るかまたは合成方法により生成され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、閉環、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有交差結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ伝達付加、例えばアルギニル化およびユビキチン化がある(例えば、Proteins‐Structure and Molecular Properties、第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman アンド・カンパニー、ニューヨーク、１９９３、Wold,F.、Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects、１−１２、Post-translatinaol Covalent Modification of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９８３、Seifter et al、“Analysis for protein modiifications and nonprotein cofactors”、Meth Enzymol、１８２、６２６−６４６、１９９０およびRattan et al、“Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging”、Ann NY Acad Sci、６６３、４８−６２、１９９２参照)。
【０００９】
ポリペプチド配列の「フラグメント」は、対照基準配列よりも短いが、対照基準ポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチド配列をいう。ポリヌクレオチド配列の「フラグメント」は、配列番号１、配列番号３または配列番号４の対照基準配列よりも短いポリヌクレオチド配列をいう。
【００１０】
「ｍＧＲＲ」は、２種のスプライス変異型ヒトｍＧＲＲ１ａおよびｍＧＲＲ１ｂおよびヒトｍＧＲＲ２をいう。ｍＧＲＲ１ｂのＮ−末端配列(アミノ酸１〜５３)は、ｍＧＲＲ１ａのＮ−末端配列(アミノ酸１〜８２)と著しい配列類似性は共有していない。ヒトｍＧＲＲ２アミノ酸配列は、ヒトｍＧＲＲ１ａと５９％同一性を有する(ｍＧＲＲ１ａの８１〜７６５とのｍＧＲＲ２の最適アラインメント残基６１−７３３)。
【００１１】
「変異型」は、対照基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。ポリヌクレオチドの典型的変異型は、対照基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異型のヌクレオチド配列における変化は、対照基準ポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドのアミノ酸配列を改変する場合もしない場合もあり得る。ヌクレオチド変化の結果、下記で検討しているように、対照基準配列によりコード化されるポリペプチドにおいてアミノ酸置換、付加、欠失、融合および先端切除が誘導され得る。ポリペプチドの典型的変異型は、対照基準ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に、改変は、対照基準ポリペプチドおよび変異型の配列が全体的には密接に類似しており、多くの領域が一致しているように制限される。変異型および対照基準ポリペプチドは、１個またはそれ以上の置換、挿入、欠失を組合わせたことによりアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコード化されるものである場合もそうではない場合もあり得る。典型的同類置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｉｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ−Ｉ Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＰｈｅおよびＴｙｒがある。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異型は、天然に存する例えば対立遺伝子であり得るか、または天然に存することが知られていない変異型であり得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異型は、突然変異導入技術または直接合成により生成され得る。また、１個またはそれ以上の翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＩＰリボシル化などを有するポリペプチドも変異型として包含される。例としては、Ｎ−末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびトレオニンのリン酸化およびＣ−末端グリシンの修飾がある。
【００１２】
「多型」は、集団内のゲノムでの所定の位置におけるヌクレオチド配列(および関連性がある場合、コード化されたポリペプチド配列)の変形をいう。
【００１３】
「一塩基多型」(ＳＮＰ)は、集団内での、ゲノムにおける単一ヌクレオチド位置でのヌクレオチド変異性の出現をいう。ＳＮＰは、遺伝子内またはゲノムの遺伝子間領域内で出現し得る。ＳＮＰは、対立遺伝子特異的増幅法(ＡＳＡ)を用いて検定され得る。このプロセスについては、少なくとも３プライマーが要求される。共通プライマーは、検定されている多型に対し逆相補型で使用される。この共通プライマーは、多型塩基からの５０と１５００ｂｐｓの間であり得る。最終３'塩基の揺らぎにより多型を構成する２(またはそれ以上)の対立遺伝子の１つと対合すること以外、他の２つ(またはそれ以上)のプライマーは互いに同一である。次いで、２つ(またはそれ以上)のＰＣＲ反応を、試料ＤＮＡにおいて、各々共通プライマーおよび対立遺伝子特異的プライマーの１つを用いて実施する。
【００１４】
本明細書で使用されている「スプライス変異型」は、同じゲノムＤＮＡ配列から最初に転写されたＲＮＡ分子から生成されてはいるが、オルターナティブ(選択的)ＲＮＡスプライシングが行なわれたｃＤＮＡ分子をいう。オルターナティブＲＮＡスプライシングが行なわれるのは、一次ＲＮＡ転写物に対してスプライシングが行なわれ、その過程で一般的にイントロンが除去され、その結果、各々異なるアミノ酸配列をコード化し得る複数のｍＲＮＡ分子がつくられる場合である。スプライス変異型の語はまた、上記ｃＤＮＡ分子によりコード化されたタンパク質をいう。
【００１５】
「同一性」は、配列比較により決定された、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間における関係を反映する。一般に、同一性は、それぞれ比較されている配列の長さ全体におよぶ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致をいう。
【００１６】
「同一性％」−正確な一致が存在しない配列については、「同一性％」が測定され得る。一般に、比較される２配列を平行整列させると配列間の最大相関関係が得られる。これは、一または両配列における「ギャップ」挿入を含むことにより、アラインメントの程度を高め得る。同一性％は、同一または非常に類似した長さの配列に特に適切である、比較されている配列の各々の全長にわたって(いわゆるグローバルアラインメント)決定され得るか、または長さが等しくない配列により適切である、短い特定された長さにわたって(いわゆるローカルアラインメント)決定され得る。
【００１７】
「類似性」は、２ポリペプチド配列間における関係のさらなる精巧な尺度である。一般的に、「類似性」は、比較(同一性について)されている各配列からの一つで、間にある残基対における正確な一致だけでなく、正確な一致が存在しない場合は、進化に基いて、一残基が他の残基の代用になる見込みがあるか否かを考慮しながら、一つ一つの残基を基にした２ポリペプチド鎖のアミノ酸間の比較を意味する。この見込みは関連「スコア」を有し、それから２配列の「類似性％」が測定され得る。
【００１８】
２またはそれ以上の配列の同一性および類似性の比較方法は、当業界では公知である。すなわち例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージバージョン９.１(Devereux J et al、Nucleic Acids Res、１２、３８７−３９５、１９８４、米国ウィスコンシン、マディソンのジェネティクス・コンピューター・グループから入手可能)で利用可能なプログラム、例えばＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰプログラムを用いることにより、２ポリヌクレオチド間の同一性％および２ポリペプチド配列間の同一性％および類似性％が測定され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、SmithおよびWaterman(J Mol Biol、１４７、１９５−１９７、１９８１、Advances in Applied Mathematics、２、４８２−４８９、１９８１)の「局所ホモロジー」アルゴリズムを用い、２配列間における類似性の最適単一領域を見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが異なる２ポリヌクレオチドまたは２ポリペプチド配列の比較により適しており、このプログラムは短い方の配列が長い方の一部分を示すことを想定している。これに比べて、ＧＡＰは２配列を整列させ、NeddlemanおよびWunschのアルゴリズム(J Mol Biol、４８、４４３−４５３、１９７０)にしたがって「最大類似性」を見出す。ＧＡＰは、長さがほぼ同じである配列の比較により適しており、アラインメントは全長におよぶと予測される。好ましくは、各プログラムで使用されているパラメーター「ギャップ・ウェイト」および「レングス・ウェイト」は、それぞれポリヌクレオチド配列については５０および３、ポリペプチド配列については１２および４である。好ましくは、比較されている２配列が最適な形で整列されているときに同一性および類似性％を測定する。
【００１９】
配列間における同一性および／または類似性測定についての他のプログラムもまた当業界では公知であり、例えば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム(Altschul S F et al、J Mol Biol、２１５、４０３−４１０，１９９０、Altschul S F et al、Nucleic Acids Res.、２５：３８９−３４０２、１９９７、米国メリーランド、ベセズダのナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション(ＮＣＢＩ)から利用可能であり、ＮＣＢＩのホームページ、www.ncbi.nlm.nih.govによりアクセスできる)およびＦＡＳＴＡ(Pearson W R、Methods in Enzymology、１８３、６３−９９、１９９０、Pearson W RおよびLipman D J、Proc Nat Acad Sci USA、８５、２４４４−２４４８、１９８８、ウィスコンシン・シーケンス・アナリシス・パッケージの一部として利用可能)がある。
【００２０】
好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス(Henikoff SおよびHenikoff J G、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、８９、１０９１５−１０９１９、１９９２)は、ヌクレオチド配列が比較前に最初にアミノ酸配列に翻訳されている場合を含むポリペプチド配列比較で使用される。
【００２１】
好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴを用いて、対照基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する問題のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の同一性％を測定し、その場合上記の通り、問題配列および対照基準配列を最適な形で整列させ、プログラムのパラメーターをデフォルト値で設定する。
【００２２】
「同一性指数」は、候補配列(ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)および対照基準配列の比較に使用され得る配列関連性の尺度である。すなわち、例えば、対照基準ポリヌクレオチド配列に対し例えば０.９５の同一性指数を有する候補ポリヌクレオチド配列は、候補ポリヌクレオチド配列が対照基準配列の各１００ヌクレオチドにつき平均して５個以下の差異を含み得る点以外、対照基準配列と同一である。上記差異は、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入から成る群から選択される。これらの差異は、対照基準ポリヌクレオチド配列の５'または３'末端位置またはこれらの末端位置間におけるいずれかの場所に存し得、対照基準配列におけるヌクレオチド間で個々に、または対照基準配列内で１つまたはそれ以上の連続群として点在している。言い換えれば、対照基準ポリヌクレオチド配列に対し０.９５の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を得るためには、上記の通り、対照基準配列における１００ヌクレオチドごとに平均５〜２５個以下の割合で欠失、置換または挿入、またはそれらの組合わせが導入され得る。同じことが、必要な変更を加えて、同一性指数の他の値、例えば０.９６、０.９７、０.９８および０.９９についても適用される。
【００２３】
同様に、ポリペプチドの場合、例えば、対照基準ポリペプチド配列に対し０.９５の同一性指数を有する候補ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列が対照基準配列の各１００アミノ酸につき平均して５個以下の差異を含み得る点以外、対照基準配列と同一である。上記差異は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、同類および非同類置換を含む置換、または挿入から成る群から選択される。これらの差異は、対照基準ポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ−末端位置またはこれらの末端位置間におけるいずれかの場所に存し得、対照基準配列におけるアミノ酸間で個々に、または対照基準配列内で１つまたはそれ以上の連続群として点在している。言い換えれば、対照基準ポリペプチド配列に対し０.９５の同一性指数を有するポリペプチド配列を得るためには、上記の通り、対照基準配列における１００アミノ酸ごとに平均５以下の割合で欠失、置換または挿入、またはそれらの組合わせが導入され得る。同じことが、必要な変更を加えて、同一性指数の他の値、例えば０.９６、０.９７、０.９８および０.９９についても適用される。ヌクレオチドまたはアミノ酸差異の数および同一性指数間の関係は、以下の等式で表され得る：
ｎａ≦ｘａ−(ｘａ・Ｉ)
[式中、
ｎａは、ヌクレオチドまたはアミノ酸差異の数であり、
ｘａは、それぞれｍＧＲＲ１ａについては配列番号１または配列番号２、ｍＧＲＲ１ｂについては配列番号４または配列番号５におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の総数であり、
Ｉは同一性指数であり、
・は、掛け算演算子についての記号であり、ｘａとＩの積が整数ではないとき、ｘａから積を引く前に端数切り捨てにより最も近い整数にする]
【００２４】
「相同体」は、当業界で使用される一般用語であり、対照基準配列との高度の配列関連性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を示す。上記関連性は、上記の２配列間における同一性および／または類似性の度合を測定することにより定量され得る。「オーソログ」は、別種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的均等内容配列であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。「パラログ」は、同種内で機能的に類似しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
【００２５】
「融合タンパク質」は、２つの非関連融合遺伝子またはそのフラグメントによりコード化されるタンパク質をいう。例は米国特許第５５４１０８７、５７２６０４４号に開示されている。Ｆｃ−ｍＧＲＲの場合、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用いることが、Ｆｃ−ｍＧＲＲまたはｍＧＲＲのフラグメントの機能的発現を遂行させるのに有利であり、それによって治療に使用するとき上記融合タンパク質の薬物動態特性が改善され、２量体Ｆｃ−ｍＧＲＲが生成される。Ｆｃ−ｍＧＲＲ ＤＮＡ構築物は、５'〜３'方向で、分泌カセット、すなわち哺乳類細胞からの輸送を誘発するシグナル配列、融合相手として免疫グロブリンＦｃ領域フラグメントをコード化するＤＮＡ、およびＦｃ−ｍＧＲＲまたはそのフラグメントをコード化するＤＮＡを含み得る。使用する際、機能的Ｆｃ側鎖に突然変異を導入し、融合タンパク質の残りの部分は無傷のままにしておくかまたは完全に発現後Ｆｃ部分を欠失させることにより、内在的機能特性(補体結合性、Ｆｃ−受容体結合性)を改変できるのが望ましい場合もある。
【００２６】
第一の態様において、本発明はｍＧＲＲポリペプチドを提供する。
上記ポリペプチドは、以下のものを含む：
(ａ)配列番号１、配列番号３または配列番号４の配列を含むポリヌクレオチドによりコード化される単離ｍＧＲＲポリペプチド、
(ｂ)配列番号２または配列番号５のポリペプチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するポリペプチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲの場合と類似した特性を示す単離ｍＧＲＲポリペプチド、
(ｃ)配列番号２または配列番号５のポリペプチド配列を含む単離ｍＧＲＲ１ａまたはｍＧＲＲ１ｂポリペプチド、
(ｄ)配列番号２または配列番号５のポリペプチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有し、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲの場合と類似した特性を示す単離ｍＧＲＲポリペプチド、
(ｅ)配列番号２または配列番号５のポリペプチド配列、
(ｆ)配列番号２または配列番号５のポリペプチド配列に対し０.８０、０.９０、０.９５、０.９８または０.９９の同一性指数を有するポリペプチド配列を有するかまたは含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲの場合と類似した特性を示す単離ｍＧＲＲポリペプチド、または
(ｇ)(ａ)〜(ｆ)による上記ポリペプチドのフラグメントまたは変異型。
【００２７】
リガンド結合検定法における類似特性とは、緩衝液、イオン、ｐＨおよび他の調節因子、例えばヌクレオチドについて同一条件下、検出可能シグナル対ノイズ比が、ｍＧＲＲポリペプチドのシグナルの＋／−３０％の範囲であることを意味する。
【００２８】
本発明ポリペプチドは、ポリペプチドのＧタンパク質共役受容体ファミリーの構成員である。観察されたｍＧＲＲ１ ｍＲＮＡの脳特異領域分布(表１)は、ｍＧＲＲリガンドについての指標に関する情報を提供する。ｍＧＲＲリガンドは、天然リガンド並びにｍＧＲＲ活性のモジュレーター、例えば抗ｍＧＲＲ抗体および／またはｍＧＲＲ介在シグナル伝達を高めるかまたはそれに拮抗する小分子を含む。ｍＧＲＲ ｍＲＮＡの脳特異領域分布は、正常な脳機能の調節におけるｍＧＲＲの重要性を示す。すなわち、これらのポリペプチドの発現、存在量または活性の異常は、広く多様な神経学的および／または精神医学的疾患、例えば限定はされないが痴呆症、精神分裂病、うつ病、情動障害、癲癇および運動障害をまねき得る。例えば、アルツハイマー病および他の痴呆症、例えば老年性記憶障害および多発脳梗塞性痴呆では、認知機能の喪失が脳における若干の神経伝達物質のレベル低下に伴う。ファミリー３ＧＰＣＲ、例えば代謝型グルタミン酸受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体はまたシナプス伝達を調節し、イオンチャンネルモジュレーターと比べて、それらの作用は永続性があり、調節的である。これらの指標は全て、以後ｍＧＲＲ１ａ、ｍＧＲＲ１ｂまたはｍＧＲＲ２の「生物活性」と称す。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ｍＧＲＲ１ａ、ｍＧＲＲ１ｂまたはｍＧＲＲ２に特有な少なくとも１つの生物活性を呈する。
【００２９】
本発明ポリペプチドはまた、対立遺伝子形態およびスプライス変異型を含め、前述のポリペプチドの変異型を含む。上記ポリペプチドは、挿入、欠失および同類的または非同類的であり得る置換またはそれらの組合わせにより対照基準ポリペプチドから変化している。
【００３０】
本発明ポリペプチドの好ましいフラグメントには、配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列からの少なくとも３０、５０または１００連続アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列から先頭化または欠失された少なくとも３０、５０または１００連続アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドがある。好ましいフラグメントは、ｍＧＲＲの生物活性を伝達する生物活性フラグメント、例えば類似活性または改善された活性を伴うかまたは望ましくない活性が低減化されたものである。また好ましいのは、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるフラグメントである。
【００３１】
本発明の配列番号４または配列番号６のヒトポリペプチドのフラグメントまたは変異型は、完全長ラットｃＤＮＡを単離するため低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションにおいてラットまたはヒトＤＮＡ配列(配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１６)を用いることにより対応する完全長ポリペプチドを製造するのに使用され得る。このｃＤＮＡにより、哺乳類発現系を用いてｍＧＲＲポリペプチドが生成され得る(実施例２参照)。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ポリ核酸ハイブリッドが安定している条件をいう。上記条件は、当業者には明らかなものである。当業者に公知の通り、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度(Ｔｍ)に反映され、配列相同性が１％減少するごとに約１〜１.５℃ずつ低下する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応を高ストリンジェンシー条件下で行ない、次いでストリンジェンシーを変えながら洗浄する。本明細書で使用されている高(い)ストリンジェンシーとは、６５〜６８℃、１ＭのＮａ＋中で安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう。高ストリンジェンシー条件は、例えば６×ＳＳＣ、５×デンハート、１％ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)、０.１ピロリン酸ナトリウムおよび０.１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精液ＤＮＡを非特異的競合物質として含む水溶液中でのハイブリダイゼーションにより与えられ得る。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェンシー洗浄が幾つかの工程で行われ得、最終洗浄(約３０分)は０.２〜０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中ハイブリダイゼーション温度で行なわれる。中程度のストリンジェンシーとは、上記溶液中ではあるが、約６０〜６２℃でのハイブリダイゼーションと均等内容の条件をいう。その場合、最終洗浄は、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で行なわれる。低ストリンジェンシーとは、約５０〜５２℃で上記溶液中におけるハイブリダイゼーションと均等内容である条件をいう。その場合、最終洗浄は、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中においてハイブリダイゼーション温度で行なわれる。これらの条件は、様々な緩衝液、例えばホルムアミドベースの緩衝液および温度を用いて適合化およびデュプリケイトされ得るものとする。デンハート溶液およびＳＳＣは、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液の場合と同様当業界ではよく知られている(例えば、Sambrook et al編(１９８９)Molecular Cloning：A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨークまたはAusubel et al編(１９９０)Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、インコーポレイテッド参照)。特に、若干のパラメーター、主として塩濃度および温度を改変することにより、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが変えられ得ること、および得られた条件は上記パラメーターを全て合わせた作用の結果であることは、当業者であれば容易に理解できるはずである。プローブの長さおよびＧＣ含有率もまたある一定の役割を演じるため、最適なハイブリダイゼーション条件は経験的に決定されなければならない。
【００３２】
本発明のポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であり得るかまたは大型タンパク質、例えば前駆体または融合タンパク質の一部であり得る。分泌または先導配列、プロ配列、精製を助ける配列、例えば多ヒスチジン残基を含む追加アミノ酸配列、または組換え手順中安定させるための追加配列を含ませるのが多くの場合有利である。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、適切な方法で、例えば天然供給源から、発現系を含む遺伝子操作が加えられた宿主細胞(下記参照)からの単離により、または例えば自動ペプチド合成装置を用いた、化学的合成により、または上記方法の組み合わせにより製造され得る。上記ポリペプチド製造手段は、当業界では十分に理解されている。
【００３４】
さらに別の態様において、本発明は、ｍＧＲＲポリヌクレオチドに関するものである。上記ポリヌクレオチドは、以下のものを含む：
(ａ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ｍＧＲＲポリヌクレオチド、
(ｂ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド、
(ｃ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチドと少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｄ)配列番号１、配列番号３または配列番号５の単離ポリヌクレオチド、
(ｅ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリペプチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコード化するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｆ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、
(ｇ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリペプチド配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコード化するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｈ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｉ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチド配列に対し０.８０、０.９０、０.９５、０.９８または０.９９の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、または
(ｋ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリペプチド配列に対し０.８０、０.９０、０.９５、０.９８または０.９９の同一性指数を有するポリペプチド配列をコード化するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、または
(ｌ)上述のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変異型であるかまたはその全長にわたって上述のポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチド。
【００３５】
本発明ポリヌクレオチドの好ましいフラグメントには、配列番号１、配列番号３または配列番号５の配列からの少なくとも１５、３０、５０または１００連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、または配列番号１、配列番号３または配列番号５の配列から切頭化または欠失された少なくとも３０、５０または１００連続ヌクレオチドを有する配列を含む単離ポリヌクレオチドがある。
【００３６】
本発明ポリヌクレオチドの好ましい変異型には、スプライス変異型、対立遺伝子変異型、および１個またはそれ以上の一塩基多型(ＳＮＰ)を有するポリヌクレオチドを含む多型がある。
【００３７】
本発明ポリヌクレオチドはまた、配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド変異型をコード化するポリヌクレオチドを含む。
【００３８】
さらに別の態様において、本発明は、本発明ＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるポリヌクレオチドを提供する。したがって、
(ａ)配列番号２、配列番号４または配列番号６のポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含むか、
(ｂ)配列番号２、配列番号４または配列番号６のポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるか、
(ｃ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含むか、または
(ｄ)配列番号１、配列番号３または配列番号５のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるか、または
(ｅ)それらと相補的であるＲＮＡポリヌクレオチド
を含むＲＮＡポリヌクレオチドが提供される。
【００３９】
配列番号２、配列番号４または配列番号６のポリペプチドは、ＧＰＣＲ−ＬＹＭＳＴとの相同性および／または構造類似性を有する、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーの他のタンパク質と関係がある(Jensen,C.P.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.９１：４８１６−４８２０、１９９４)。
【００４０】
本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特に、それらの相同性ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと類似した生物学的機能／特性を有すると予測される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ｍＧＲＲの少なくとも一活性を有する。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは、哺乳類脳の細胞におけるｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーからの標準クローニングおよびスクリーニング技術を用いて得られる(例えば、Sambrook et al、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８９)参照)。本発明ポリヌクレオチドはまた、天然供給源、例えばゲノムＤＮＡライブラリーから得られるか、または公知市販技術を用いて合成され得る。
【００４２】
本発明ポリヌクレオチドを本発明ポリペプチドの組換え的製造に使用するとき、ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドについてのコーディング配列を単独で、または他のコーディング配列、例えば先導または分泌配列、プレ−またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコード化する配列との読み枠における成熟ポリペプチドについてのコーディング配列を含み得る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコード化され得る。本発明のこの態様のある種の好ましい例において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター(キアゲン、キアゲンＡＧ、バーゼル、スイス国)で提供され、Gentz et al、Proc Natl Acad Sci USA(１９８９)８６：８２１−８２４に記載されているヘキサ−ヒスチジンペプチド、またはＨＡ標識である。ポリヌクレオチドはまた、非コーディング５'および３'配列、例えば転写された、非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定させる配列を含み得る。
【００４３】
配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチド配列と同一であるか、または十分な同一性を有するポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用ハイブリダイゼーションプローブとしてまたは核酸増幅反応(例えばＰＣＲ)用プライマーとして使用され得る。上記プローブおよびプライマーは、本発明ポリペプチドをコード化する完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、配列番号１、配列番号３または配列番号５との高い配列類似性、典型的には少なくとも９５％の同一性を有する他の遺伝子(ヒト供給源からのパラログおよびヒト以外の種からのオーソログおよびパラログをコード化する遺伝子を含む)のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するのに使用され得る。好ましいプローブおよびプライマーは、一般的に少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは３０ヌクレオチドを含み、少なくとも５０、さもなくば少なくとも１００ヌクレオチドを有し得る。特に好ましいプローブは、３０〜５０のヌクレオチドを有する。特に好ましいプライマーは、２０〜２５のヌクレオチドを有する。
【００４４】
ヒト以外の種からの相同体を含む、本発明ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号５の配列または好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドのそのフラグメントを有する標識プローブによりストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングし、上記ポリヌクレオチド配列を含む完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程を含む方法により得られる。上記ハイブリダイゼーション技術は当業者には公知である。好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ７.６)、５×デンハート溶液、１０％デキストランスルフェート、および２０マイクログラム／ｍｌの変性剪断サケ精液ＤＮＡを含む溶液中４２℃での一晩インキュベーション、次いで約６５℃での０.１×ＳＳＣ中におけるフィルター洗浄を含む。すなわち本発明はまた、配列番号１、配列番号３または配列番号５の配列または好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドのそのフラグメントを有する標識プローブでのストリンジェントハイブリダイゼーション条件下におけるライブラリーのスクリーニングにより得られる、好ましくは少なくとも１００のヌクレオチド配列を伴う、単離ポリヌクレオチドを含む。ヒトおよび(部分的)ラット配列は、ヌクレオチドレベルで８９％の同一性およびアミノ酸レベルで８９％の同一性および９０％の類似性を示す。
【００４５】
当業者であれば、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域は５'末端まで完全に伸びているわけではないという点で、単離ｃＤＮＡ配列は不完全であることが容易に理解できるはずである。これは、逆転写酵素、すなわち本質的に「プロセシビティー」(酵素が重合反応中鋳型に結合したままでいる能力の尺度)が低く、第１鎖ｃＤＮＡ合成中にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完了し得ない酵素の結果である。
【００４６】
完全長ｃＤＮＡを得るかまたは短いｃＤＮＡを伸長させる、当業者に利用可能であって熟知されている幾つかの方法があり、例えばｃＤＮＡ末端の急速増幅(ＲＡＣＥ)法に基づく方法がある(例えば、Frohman et al.、Proc Nat Acad Sci USA ８５、８９９８−９００２、１９８８参照)。例えばＭＡＲＡＴＨＯＮ技術(クロンテック・ラボラトリーズ、インコーポレイテッド、ＢＤクロンテック、バーゼル、スイス国)が典型的に示すように、最近の技術改良により、長いｃＤＮＡについての検索は著しく簡易化された。ＭＡＲＡＴＨＯＮ技術では、選ばれた組織から抽出されたｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、「アダプター」配列を各端部にライゲーションした。次いで、核酸増幅(ＰＣＲ)を実施することにより、遺伝子特異的およびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いてｃＤＮＡの「失われた」５'末端を増幅する。次いで、「内側の」プライマー、すなわち増幅産物内でアニーリングするよう設計されたプライマー(典型的にはアダプター配列においてさらなる３'をアニーリングするアダプター特異的プライマーおよび既知遺伝子配列においてさらなる５'をアニーリングする遺伝子特異的プライマー)を用いて、ＰＣＲ反応を反復する。次いで、この反応の生成物をＤＮＡ配列決定により解析し、生成物を既存のｃＤＮＡに直接結合させて完全配列を得るか、または５'プライマーの設計に関する新たな配列情報を用いて別々の完全長ＰＣＲを実施することにより、完全長ｃＤＮＡが構築され得る。
【００４７】
本発明の組換えポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作が加えられた宿主細胞から当業界でよく知られている方法により調製され得る。したがって、さらに別の態様において、本発明は、本発明の一ポリヌクレオチドまたは複数ポリヌクレオチドを含む発現系、上記発現系により遺伝子操作が加えられた宿主細胞および組換え技術による本発明ポリペプチドの製法に関するものである。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いて上記タンパク質を製造するのに使用され得る。
【００４８】
組換え体を製造するため、宿主細胞には、本発明ポリヌクレオチドについての発現系またはその一部を組込むように遺伝子操作が加えられ得る。ポリヌクレオチドは、多くの標準的実験マニュアル、例えばDavis et al.、Basic Methods in Molecular Biology(１９８６)およびSambrook et al.(同書)に記載された方法により宿主細胞に導入され得る。
【００４９】
宿主細胞へのポリヌクレオチドの好ましい導入方法には、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、トランスフェクション、顕微注入、カチオン性脂質介在トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、切屑(スクレープ)ローディング、弾道導入または感染がある。
【００５０】
適切な宿主細胞の代表例には、細菌細胞、例えばストレプトコッカス(Streptococci)、スタフィロコッカス(Staphlococci)、エシェリキア・コリ(E.coli)、ストレプトマイシス(Streptomyces)およびバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)細胞、真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス(Aspergillus)細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ(ドロソフィラ、Drosophila)Ｓ２およびスポドプテラ(Spodoptera)Ｓｆ９細胞、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ヒーラ、Ｃ１ ２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびボーズ黒色腫細胞および植物細胞がある。
【００５１】
非常に多様な発現系、例えば染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば細菌性プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバクロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから誘導されたベクター、およびそれらの組み合わせから誘導されたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント、例えばコスミドおよびファージミドから誘導されたものが使用され得る。発現系は、発現を調節し、生じさせる制御領域を含み得る。一般的に、宿主においてポリヌクレオチドを維持、増殖または発現することにより、ポリペプチドを生産し得る系またはベクターであれば全て使用され得る。適切なポリヌクレオチド配列は、様々な公知常用技術のいずれか、例えばSambrook et al(上記参照)に示されたものにより発現系へ挿入され得る。適切な分泌シグナルを所望のポリペプチドへ組込むことにより、小胞体のルーメン、周辺腔または細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌が行われ得る。これらのシグナルは、ポリペプチドにとって内在的であり得るかまたはそれらは異種シグナルであり得る。
【００５２】
本発明ポリペプチドをスクリーニング検定で使用するために発現させる場合、一般的にポリペプチドは細胞表面で生産されるのが好ましい。この事象において、細胞は、スクリーニング検定で使用する前に採取され得る。ポリペプチドが培地へ分泌される場合、培地を採取することにより、ポリペプチドが採取および精製され得る。細胞内で製造する場合、ポリペプチドを採取する前にまず細胞を溶解しなければならない。
【００５３】
本発明ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレシチンクロマトグラフィーを含む公知方法により組換え細胞培養物から採取および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製に使用する。ポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製中に変性したとき、公知タンパク質再生技術を用いることにより活性立体配座が復元され得る。
【００５４】
本発明ポリヌクレオチドは、関連遺伝子における突然変異の検出を通して診断試薬として使用され得る。ｃＤＮＡまたはゲノム配列において配列番号１、配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチドを特徴とし、機能不全に伴う遺伝子の突然変異形態の検出は、遺伝子の発現不足、過剰発現または空間的または時間的発現の改変から生じる病気または病気に対する感受性の診断に加えられるかまたはそれを特定し得る診断道具を提供する。遺伝子に突然変異をもつ個体は、当業界で公知の様々な技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。
【００５５】
診断用核酸は、対象の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料から入手され得る。ゲノムＤＮＡは検出に直接使用され得るか、またはそれは、ＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲの使用により酵素的に、または他の増幅技術により分析前に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様に使用され得る。検出および挿入は、正常表現型と比べた増幅産物の大きさの変化により検出され得る。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識ｍＧＲＲヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全対合配列は、リボヌクレアーゼ消化または融解温度差により誤対合二重らせんとは区別され得る。
【００５６】
ＤＮＡ配列差異はまた、変性剤の存在または非存在下でのゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動性の改変により、または直接ＤＮＡ配列決定により検出され得る(例えば、Myers et al、Science(１９８５)２３０：１２４２)。特異位置での配列変化はまた、ヌクレアーゼ保護検定法、例えばリボヌクレアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法により示され得る(Cotton et al.、Proc Natl Acad Sci USA(１９８５)８５：４３９７−４４０１参照)。
【００５７】
ｍＧＲＲポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することにより、例えば遺伝子突然変異の有効なスクリーニングが実施され得る。上記アレイは、好ましくは高密度アレイまたはグリッドである。アレイ技法は、公知で一般的適用性を有しており、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含む分子遺伝学における様々な問題と取組むのに使用され得る。例えばM.Chee et al.、Science、２７４、６１０−６１３(１９９６)およびそこに引用された他の参考文献参照。
【００５８】
ポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現レベルの異常な減少または増加の検出もまた、対象の本発明疾患易罹患性の診断または測定に使用され得る。発現の減少または増加は、ポリヌクレオチドの定量に関する当業界で公知の方法、例えば核酸増幅、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定され得る。宿主から誘導された試料中における、タンパク質、例えば本発明ポリペプチドのレベル測定に使用され得る検定技術は、当業者には公知である。上記検定方法には、ラジオイムノアッセイ、競争的結合検定法、ウエスタン・ブロット分析およびＥＬＩＳＡ検定法がある。
【００５９】
すなわち別の態様において、本発明は、以下のものを含む診断キットに関するものである：
(ａ)本発明ポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１、配列番号３または配列番号５のヌクレオチド配列、またはそのフラグメントまたはＲＮＡ転写物、
(ｂ)(ａ)の配列と相補的なヌクレオチド配列、
(ｃ)本発明ポリペプチド、好ましくは配列番号２、配列番号４または配列番号６のポリペプチドまたはそのフラグメント、または
(ｄ)本発明ポリペプチド、好ましくは配列番号２、配列番号４または配列番号６のポリペプチドに対する抗体。
【００６０】
上記キットにおいて、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)または(ｄ)は、本質的な成分を含み得るものとする。かかるキットは、疾患または易罹患性、中でも特に本発明の疾患の診断において有用である。
【００６１】
本発明ポリヌクレオチド配列は染色体局在性試験にとって貴重である。本発明配列は、個々のヒト染色体における特定位置を特異的にターゲッティングし、それとハイブリダイズし得る。本発明による染色体への関連配列のマッピングは、遺伝子関連疾患とそれらの配列の相互関係を明らかにする上での重要な第一段階である。一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体における配列の物理的位置と遺伝地図データとの相互関係が明らかにされ得る。上記データは、例えばV.McKusick、Mendelian Inheritance in Man(ジョン・ホプキンス・ユニバーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリーを通じてオンライン入手可能)から見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子および疾患間の関係は、連鎖分析(物理的隣接遺伝子の共遺伝)を用いて同定される。ゲノム配列(遺伝子フラグメントなど)についての正確なヒト染色体局在性は、放射能ハイブリッド(ＲＨ)マッピング(Walter,M.et al.、(１９９４)A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes、Nature Genetics ７、２２−２８)を用いて測定され得る。若干のＲＨパネル、例えばＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４ ＲＨパネル(Gyapay G et al.、Hum Mol.Genet.１９９６年３月、５(３)：３３９−４６)がリサーチ・ジェネティクス(ハンツビル、アラバマ、米国)から入手できる。このパネルを用いて遺伝子の染色体位置を測定するため、ＲＨ ＩＤＮＡにおいて興味の対象である遺伝子から設計されたプライマーを用いて９３のＰＣＲを遂行する。これらのＤＮＡは各々、ハムスターバックグラウンド(ヒト／ハムスターハイブリッドセルライン)で維持されたランダムなヒトゲノムフラグメントを含む。これらのＰＣＲの結果、興味の対象である遺伝子のＰＣＲ産物の存在または非存在を示す９３のスコアが得られる。これらのスコアを、既知位置のゲノム配列からのＰＣＲ産物を用いて得られたスコアと比較する。この比較は、http://www.genome.wi.mit.edu/で行なわれる。
【００６２】
本発明ポリヌクレオチド配列はまた、組織発現試験用の貴重な道具である。上記試験により、組織でコード化されたポリペプチドの発現パターンに関する指標を与え得る本発明ポリヌクレオチドの発現パターンが、それらをコード化するｍＲＮＡを検出することにより測定され得る。使用される技術は当業界では公知であり、グリッド上に整列させたクローンへのin situハイブリダイゼーション技術、例えばｃＤＮＡマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション(Schena et al、Science、２７０、４６７−４７０、１９９５およびShalon et al.、Genomes Res、６、６３９−６４５、１９９６)およびヌクレオチド増幅技術、例えばＰＣＲが含まれる。好ましい方法は、パーキン・エルマーから入手できるＴＡＱＭＡＮ(登録商標)技術を使用する。これらの試験により得られた結果は、生物体におけるポリペプチドの正常機能の指標を提供し得る。さらに、ｍＲＮＡの正常発現パターンと同じ遺伝子の代替形態(例えば、ポリペプチドコーディング可能性の改変または調節的突然変異を有するもの)によりコード化されたｍＲＮＡのそれとの比較試験は、本発明ポリペプチドの役割、または疾患におけるその不適切な発現の場合についての貴重な洞察を提供し得る。上記の不適切な発現は、時間的、空間的または単に定量的性質を有し得る。
【００６３】
染色体局在性はまた、公開ドメインデータベース、例えばＥＮＳＥＭＢＬ(http://www.ensembl.org/)を用いて推論され得る。ヒト染色体１０ｐ１１.２−ｐ１２でのヒトｍＧＲＲ１遺伝子地図、ヒト染色体Ｃｈｒ１７ｑ１１.１でのヒトｍＧＲＲ２遺伝子地図。
【００６４】
本発明の別の態様は抗体に関するものである。本発明ポリペプチドまたはそれらのフラグメント、またはそれらを発現する細胞は、本発明ポリペプチドに免疫特異的である抗体を製造するための免疫原として使用され得る。「免疫特異的」の語は、抗体が、先行技術における他の関連ポリペプチドに対する親和力よりも本発明ポリペプチドに対して実質的に大きい親和力を有することを意味する。本発明ポリペプチドに対して産生した抗体は、常用プロトコルを用いて、ポリペプチドまたはエピトープ担持フラグメント、または細胞を動物、好ましくはヒト以外の動物に投与することにより得られる。モノクローナル抗体の製造については、連続セルライン培養物により製造される抗体を提供する技術であれば全て使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature(１９７５)２５６：４９５−４９７)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al.Immunology Today(１９８３)４：７２)およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、７７−９６、Alan R.Liss,Inc.１９８５)がある。
【００６５】
１本鎖抗体の製造技術、例えば米国特許第４９４６７７８号記載のものはまた、この発明のポリペプチドに対する１本鎖抗体の製造に適合化され得る。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物体、例えば他の哺乳類もヒト化抗体の発現に使用され得る。
【００６６】
上記抗体は、ポリペプチドを発現するクローンの単離または同定、またはアフィニティー・クロマトグラフィーによるポリペプチドの精製に使用され得る。本発明ポリペプチドに対する抗体はまた、特に本発明疾患の処置に使用され得る。
【００６７】
本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドはまた、ワクチンとしても使用され得る。したがって、別の態様において、本発明は、哺乳類における免疫学的応答の誘導方法であって、例えばサイトカイン生産性Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を含め、抗体産生および／またはＴ細胞免疫応答の誘導に十分なだけの本発明ポリペプチドを哺乳類に接種することにより、病気が個体内で既に確立されているにせよ、されていないにせよ、動物を病気から保護することを含む方法に関するものである。哺乳類における免疫学的応答はまた、インビボでポリヌクレオチドの発現を指令し、ポリペプチドをコードするベクターを介して本発明ポリペプチドを送達することを含む方法により誘導され得、かかる免疫学的応答の誘導により抗体が産生し、本発明の病気から動物を保護し得る。ベクターの一投与方法は、粒子上のコーティングとしてまたは他の形で所望の細胞へそれを加速することによるものである。上記核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含み得る。使用する場合、ワクチン、ポリペプチドまたは核酸ベクターは、通常、ワクチン処方物(組成物)として提供される。処方物は、さらに適切な担体を含み得る。ポリペプチドは胃で分解され得るため、それは好ましくは非経口的(例えば皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射)に投与される。非経口投与に適切な処方物は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および処方物を受容体の血液と等張性にする溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射溶液、並びに懸濁剤または増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。
【００６８】
処方物は、単位用量または多用量容器、例えば密閉アンプルおよびバイアルの形を呈し得、使用直前に滅菌液体担体を加えるだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵され得る。ワクチン製剤はまた、処方物の免疫原性を高めるアジュバント系、例えば水中油滴系および当業界で公知の他の系を含み得る。用量は、ワクチンの比活性により異なり、常用実験により容易に測定され得る。
【００６９】
本発明ポリペプチドは、１種またはそれ以上の病的状態、特に上述の本発明疾患において関連性がある１つまたはそれ以上の生物学的機能を有する。したがって、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定することは有用である。したがって、さらに別の態様において、本発明は、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害するものを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。上述した通り、上記方法は、本発明の上記疾患に関する治療および予防目的に使用され得るアゴニストまたはアンタゴニストを同定する。化合物は、様々な供給源、例えば細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、化学的化合物のコレクション、および天然産物混合物から同定され得る。かくして同定された上記アゴニストまたはアンタゴニストは、場合によってはポリペプチドの天然または修飾基質、リガンド、受容体、酵素など、その構造的または機能的ミメティック(模倣物質)(Coligan et al.、Current Protocols in Immunology １(２)：第５章(１９９１)参照)または小分子であり得る。
【００７０】
スクリーニング方法では、候補化合物に直接的または間接的に随伴させた標識手段により、ポリペプチド、またはポリペプチドを担持する細胞または膜、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を単に測定すればよい。別法として、スクリーニング方法は、標識した競争相手(例、アゴニストまたはアンタゴニスト)に対するポリペプチドへの候補化合物の競争的結合の測定または検出(定性的または定量的)を含み得る。さらに、これらのスクリーニング方法によると、ポリペプチドを担持する細胞に適切な検出系を用いることにより、候補化合物が、ポリペプチドの活性化または阻害により発せられるシグナルを誘導するか否かが試験され得る。活性化の阻害剤は、一般的に既知アゴニストの存在下で検定され、候補化合物の存在によるアゴニストによる活性化に対する影響が観察される。さらに、スクリーニング方法は、単に、本発明ポリペプチドを含む溶液と候補化合物を混合して混合物を形成させ、混合物中におけるＨＧＲＬ１０１活性を測定し、そして混合物のＨＧＲＬ１０１活性を、候補化合物を含まない対照混合物と比較する工程を含むだけである。
【００７１】
本発明のポリペプチドは、慣用的低受容力スクリーニング方法および高スループットスクリーニング(ＨＴＳ)フォーマットでも使用され得る。上記ＨＴＳフォーマットは、９６ウェル、さらに細菌では３８４ウェルのマイクロタイタープレートの十分に確立された使用だけでなく、新たに開発された方法、例えばSchllek et al、Anal Biochem.、２４６、２０−２９(１９９７)により報告されたナノウェル方法を含む。
【００７２】
同じく前記の通り、融合タンパク質、例えばＦｃ部分およびｍＧＲＲポリペプチドからつくられたものを、高スループットスクリーニング検定法に使用することにより、本発明ポリペプチドについてのアンタゴニストが同定され得る(D.Bennett et al、J Mol Recognition、８：５２−５８(１９９５)およびK.Johanson et al.、J Biol Chem、２７０(１６)：９４５９−９４７１(１９９５))。
【００７３】
また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリペプチドに対する抗体を用いることにより、細胞におけるｍＲＮＡおよびポリペプチドの生産に対する添加化合物の効果を検出するためのスクリーニング方法が形成され得る。例えば、ＥＬＩＳＡ検定法は、当業界で公知の標準的方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌または細胞会合レベルを測定するために構築され得る。これを用いることにより、適切に遺伝子操作された細胞または組織からのポリペプチド製造を阻害または促進し得る薬剤(それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる)が発見され得る。
【００７４】
本発明ポリペプチドは、当業界で公知の標準的受容体結合技術を通じて膜結合または可溶性受容体がある場合それらを同定するのに使用され得る。これらには、限定されるわけではないがリガンド結合および架橋検定法があり、それらの検定法ではポリペプチドを放射性同位元素(例えば125Ｉ)により標識するか、化学的修飾(例えばビオチニル化)を加えるか、または検出または精製に適切なペプチド配列に融合させ、推定的受容体の供給源(細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液)とインキュベーションする。他の方法には、生物物理学的技術、例えば表面プラスモン共鳴および分光器の使用がある。また、これらのスクリーニング方法を用いることにより、ポリペプチドのその受容体への結合で競合するポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストがある場合それらが同定され得る。上記検定法の標準的実施方法は、当業界では十分に理解されている。
【００７５】
本発明ポリペプチドのアンタゴニストの例には、抗体または場合によってはオリゴヌクレオチドまたはタンパク質があり、それらは場合によってはポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素等と密接に関連したもので、例えばリガンド、基質、受容体、酵素等のフラグメント、またはポリペプチドの活性が阻止されるように本発明ポリペプチドに結合はするが、応答を発しない小分子がある。
【００７６】
スクリーニング方法はまた、トランスジェニック技術およびｍＧＲＲ遺伝子の使用を含み得る。トランスジェニック動物の構築技術は十分に確立されている。例えば、ｍＧＲＲ遺伝子は、受精した卵母細胞の雄前核への顕微注入、着床前または着床後胚へのレトロウイルス移入、または例えば電気穿孔による遺伝的に修飾された胚性幹細胞の宿主胚盤胞への注入を通じて導入され得る。特に有用なトランスジェニック動物は、動物遺伝子がその動物のゲノム内でヒト均等内容遺伝子により置きかえられた、いわゆる「ノックイン」動物である。ノックイントランスジェニック動物は、化合物がヒト標的に特異的である場合、薬剤送達プロセスにおける標的確認について有用である。他の有用なトランスジェニック動物は、細胞において内在性ＤＮＡ配列によりコード化された本発明ポリペプチドの動物オーソログの発現が部分的または完全に無効にされた、いわゆる「ノックアウト」動物である。遺伝子ノックアウトは、特異的細胞または組織にターゲッティングされ得るか、技術の限界の結果としてある種の細胞または組織でのみ行われ得るか、または動物における全てまたは実質的に全ての細胞で行われ得る。トランスジェニック動物技術はまた、導入遺伝子を発現させることにより、大量の本発明ポリペプチドが得られる動物総体発現クローニング系を提供する。
【００７７】
上記方法で使用されるスクリーニングキットは、本発明のさらに別の態様を構成する。上記スクリーニングキットは、
(ａ)本発明ポリペプチド、
(ｂ)本発明ポリペプチドを発現する組換え細胞、
(ｃ)本発明ポリペプチドを発現する細胞膜、または
(ｄ)本発明ポリペプチドに対する抗体
を含むもので、上記ポリペプチドは、好ましくは配列番号２、配列番号４または配列番号６の配列を有するものとする。
上記キットにおいて、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)または(ｄ)は、本質的な成分を含み得るものとする。
【００７８】
本明細書で引用されている、限定はされないが特許および特許出願を含む出版物および参考文献は全て、個々の各出版物または参考文献が完全に示された形で具体的および個々に引用されているのと同じ効果をもつものとして出典明示で援用する。この出願が優先権を主張している特許出願についてもまた、出版物および参考文献について上述したのと同様に出典明示で援用する。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例により本発明を説明する。
実施例１：ヒトｍＧＲＲ1ａおよびヒトｍＧＲＲ1ｂのクローニング
Ｃｅｌｅｒａヒトゲノムデータベースのｔｂｌａｓｔｎ検索における問い合わせとしてＧＡＢＡ−Ｂ受容体(受入番号Ｙ１０３７０、ＡＪ０１１３１８)のアミノ酸配列を用いることにより、同定された配列(ＧＡ＿１５２３４４２２)は、ＧＡＢＡ−Ｂおよび代謝型グルタミン酸受容体の推定貫膜ドメインとの類似性は限られていた。
【００８０】
クローニングするため、本質的に製造業者による記載内容にしたがって、クロンテックのＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥｃＤＮＡ(ヒト脳、カタログ番号７４００−１、ＢＤクロンテック、バーゼル、スイス国)を用いて対応するｃＤＮＡ５'−および３'−ＲＡＣＥ反応を遂行する。クロンテックから購入(カタログ番号６５４３−１)したポリＡ(＋)ＲＮＡ(全ヒト脳)からｃＤＮＡを転写する。製造業者の使用説明書にしたがって、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ ｃＤＮＡ合成モジュール(ライフ・テクノロジーズ、バーゼル、スイス国)を使用する。オリゴ(ｄＴ)およびランダムプライマーの両方を別々の反応(２.５μｇの各ＲＮＡ、２０μｌ)で用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成する。ＰＣＲで使用する前、１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８.５(ＴＥ)を、ｃＤＮＡ合成反応物に加えて最終量を１００μｌとする。ＭＷＧプリマスサイクラーでＰＣＲを実施する。オリゴ(ｄＴ)およびランダムプライマーｃＤＮＡ合成反応物からの均等量を合わせる。１μｌのｃＤＮＡ混合物を、５０μｌ ＰＣＲ反応で使用する(Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８９))。
【００８１】
配列ＧＡ＿１５２３４４２２から設計されたＲＡＣＥプライマーは、5-RACE: 5-gcg ggg ctc atg gaa tgc cga tgg gac-3 (配列番号９) および 3-RACE: 5-gtc cca tcg gca ttc cat gag ccc cgc-3(配列番号１０)である。ＭＷＧバイオテックサイクラーで３５サイクル(初回変性９５℃で３秒間、９５℃で３０秒間(変性)、７２℃で４分間(アニーリングおよび伸長))実行する。クロンテックＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥキット説明書で概説されている有利なポリメラーゼを使用する。Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡキットにより供給されたＡＰ２プライマーと一緒に使用される内側遺伝子特異的プライマーセット(5-RACE: 5-ccg cac tgc ata gca gag ata aac acc-3 (配列番号７)および 3-RACE: 5-caa tga gct cat cat ctc tgc tat att cc-3 (配列番号８))を用いて、２回目のＰＣＲ増幅工程を実行する。上記条件を用いて３０ＰＣＲサイクルを実行する。ＲＡＣＥクローンを、ｐＣＲII−ｔｏｐｏ(インビトロゲン、グロニンゲン、オランダ国)へサブクローニングし、配列決定する。公開ドメインデータベース(ｇｅｎｂａｎｋ)のｂｌａｓｔｎ検索により、３'−ＲＡＣＥ配列の一部は、先に公開された配列、ＫＩＡＡ１１３６(受入番号ＡＢ０３２９６２)と同一であることが観察される。この配列は、脳からクローン化された未知機能の部分的ｃＤＮＡ配列としてｇｅｎｂａｎｋに提出された。
【００８２】
ＲＡＣＥクローンから得られた配列情報を用いて、全読み枠をクローン化するためのプライマー配列を設計する。ｍＧＲＲ１ａに使用されるＰＣＲプライマーは、5-CAC Cat ggc tta ccc ctt act cct ctg c-3 (配列番号１１) および 5-cgt tgt tgc tct tgc ccc cct ggt cct c-3' (配列番号１２)である。５'−プライマーは、最小Kozak共通配列ＣＡＣＣ(Kozak、Nucl Acid Res.、１９８７、１５、８１２５−８１３２)を推定開始コドン上流に含む。ｍＧＲＲ１b用のプライマーは、5'-gtg gga cca gct gtg ctg cca ttg atc-3' (配列番号１３)および 5'-cgt tgt tgc tct tgc ccc cct ggt cct c-3' (配列番号１４)である。鋳型として１μｌの全ヒト脳ｃＤＮＡ混合物(上記)を用いて、３５ＰＣＲサイクルを実行する：初回変性９５℃で３秒間、９５℃で３０秒間(変性)、６５℃で３０秒間、７２℃で８分間。プロメガ(ヴァリセレン、スイス国)からの校正Ｐｆｕポリメラーゼを使用する。ｃＤＮＡを配列決定し(配列番号１、配列番号３)、哺乳類発現ベクター(ｐｃＤＮＡ３.１−ｔｏｐｏ、インビトロゲン)へ挿入する。
【００８３】
本発明の一ポリペプチド(ｍＧＲＲ１ａ、対応するＤＮＡ配列、配列番号１)は、１２１２アミノ酸(配列番号２)のタンパク質についての読み枠を含む。推定シグナルペプチド配列(MAYPLLLCLLLAQLGLG (配列番号１５))が、配列番号２のＮ末端そのものに位置するということから、Ｎ末端タンパク質配列は細胞外に位置することが示唆される。ｍＧＲＲ１ｂと呼ばれるｍＧＲＲ１のＮ−末端スプライス変異型に対応する配列(配列番号４)は、１１８３アミノ酸(配列番号５)の読み枠を含む。演繹されたタンパク質配列は、ファミリー３ Ｇタンパク質共役受容体に特有な構造的特徴を有する。すなわち、１)疎水性プロットは、７つの推定貫膜ドメインをもつタンパク質を予測させる。２)ファミリー３ ＧＰＣＲとの類似性は、ｂｌａｓｔｐ検索(推定貫膜領域の局所アラインメント)により実証されている：ドロソフィラ・メラノガスター(drosophila melanogaster)代謝型グルタミン酸受容体(受入番号Ｐ９１６８５)と比較すると、ｍＧＲＲ１ａについては２１％の同一性および４５％の類似性を示す残基が見出される。推定ドロソフィラ・メラノガスター(drosophila melanogaster)(推定)代謝型ＧＡＢＡ−Ｂ受容体サブタイプ３(受入番号ＡＦ３１８２７４、推定貫膜領域の局所アラインメント)と比較すると、ｍＧＲＲ１ａについては２２％の同一性および４３％の類似性を示す残基が見出される。ショウジョウバエ(ドロソフィラ、drosophila)ゲノムにおいてｍＧＲＲ１ａに最も近い相同体は、推定遺伝子産物ＣＧ１１９２３(フライベース受入番号ＦＢｇｎ００３１６４２)であり、２７％の同一性および４３％の類似性を示す残基を有する(ＣＧ１１９２３の残基１０９−５８８を伴う配列番号２のｂｌａｓｔｐ局所アラインメント残基２４１−７４５)。ＣＧ１１９２３の機能は、Ｇタンパク質共役受容体として分類された。公開ドメインデータベースにおいて最も近い哺乳類ＧＰＣＲ相同体は、代謝型グルタミン酸受容体３型(受入番号Ｑ１４８３２)であり、２３％の同一性および４１％の類似性を示す残基をもつ(ｍＧｌｕＲ３の残基５４０−８０１を伴う配列番号２の局所アラインメント残基３８５−６４０)。ファミリー３ ＧＰＣＲとのｍＧＲＲの類似性は、推定貫膜スパンニング領域に限定される。ｍＧＲＲのＮ−末端推定的細胞外ドメインについても、Ｃ−末端推定的細胞内ドメインについても、既知タンパク質との顕著な類似性は見出されない。
【００８４】
【表１】
【００８５】
実施例２：ヒトｍＧＲＲ２のクローニング
Ｃｅｌｅｒａヒトゲノムデータベースのｔｂｌａｓｔｎ検索における問い合わせとしてＧＡＢＡ−Ｂ受容体(受入番号Ｙ１０３７０、ＡＪ０１１３１８)のアミノ酸配列を用いることにより、同定された配列(ＧＡ＿１５０９１９５５)は、ＧＡＢＡ−Ｂおよび代謝型グルタミン酸受容体の推定貫膜ドメインとの類似性が限られていた。
【００８６】
クローニングするため、本質的に製造業者による説明にしたがって、クロンテックのＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥｃＤＮＡ(ヒト脳、カタログ番号７４００−１、ＢＤクロンテック、バーゼル、スイス国)を用いて対応するｃＤＮＡ５'−および３'−ＲＡＣＥ反応を遂行する。クロンテックから購入(カタログ番号６５４３−１)したポリＡ(＋)ＲＮＡ(全ヒト脳)からｃＤＮＡを転写する。製造業者の使用説明書にしたがって、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ ｃＤＮＡ合成モジュール(ライフ・テクノロジーズ、バーゼル、スイス国)を使用する。オリゴ(ｄＴ)およびランダムプライマーの両方を別々の反応(２.５μｇの各ＲＮＡ、２０μｌ)で用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成する。ＰＣＲで使用する前、１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８.５(ＴＥ)を、ｃＤＮＡ合成反応物に加えて最終量を１００μｌとする。ＭＷＧプリマスサイクラーでＰＣＲを実施する。オリゴ(ｄＴ)およびランダムプライマーｃＤＮＡ合成反応物からの均等量を合わせる。１μｌのｃＤＮＡ混合物を、５０μｌ ＰＣＲ反応で使用する(Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８９))。
【００８７】
配列ＧＡ＿１５０９１９５５から設計されたＲＡＣＥプライマーは、5-RACE: 5-ccc gct gct cag aag ggc act ccg ctg g-3 (配列番号２４)および 3-RACE: 5-tgg acc gtg ggc gcc ctg gag cga ggc-3(配列番号２５)である。ＭＷＧバイオテックサイクラーで３５サイクル(初回変性９５℃で３秒間、９５℃で３０秒間(変性)、７２℃で４分間(アニーリングおよび伸長))実行する。クロンテックＭａｒａｔｈｏｎＲＡＣＥキット説明書に記載されている実験手順を使用する。Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡキットにより供給されたＡＰ２プライマーと一緒に使用される内側遺伝子特異的プライマーセット(5-RACE: 5'-ggg ccg ttc gag aca gaa aca gct gca g -3 (配列番号２７)および 3-RACE: 5-gct ggg act aca tca tgg ttg tgg ctg -3(配列番号２６)を用いて、２回目のＰＣＲ増幅工程を実行する。上記条件を用いて３０ＰＣＲサイクルを実行する。ＲＡＣＥクローンを、ｐＣＲII−ｔｏｐｏ(インビトロゲン、グロニンゲン、オランダ国)へサブクローニングし、配列決定する。
【００８８】
ＲＡＣＥクローンから得られた配列情報を用いて、対応するゲノム配列およびヒトＣｈｒ１７ｑ１１.１におけるｍＧＲＲ２遺伝子座を同定する(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human)。転写配列をｇｅｎｓｃａｎプログラム(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)により予測し、推定読み枠を包含するＰＣＲプライマーを設計する。プライマー対は、5'-CAC CGC CTC TGC CTG GGC TCT CCT G-3'(F1) (配列番号28) および 5'-CGC TGC TCA GAA GGG CAC TCC GCT GG-3' (配列番号 29); 5'- GGA TTC CTG CTG CTT TAC TTT CCT GTC-3' (配列番号 30)および 5'-CCA CAG ACA CAC TTC AGC AAT GCC-3' (配列番号31); 5'-CCA GGA AGG TGG AGA AGC CTG GGT GGG-3' (配列番号 32)および 5'- cta act tgc cct gta gca ctc ctc-3' (r1) (配列番号 33)である。鋳型として１μｌの全ヒト脳ｃＤＮＡ混合物(上記)を用いて、３５ＰＣＲサイクルを実行する：初回変性９５℃で３秒間、９５℃で３０秒間(変性)、６２〜６８℃で３０秒間、７２℃で８分間。プロメガ(ヴァリセレン、スイス国)からの校正Ｐｆｕポリメラーゼを使用する。上記と同様(２５のＰＣＲサイクルを実行する：初回変性９５℃で３秒間、９５℃で３０秒間(変性)、６８℃で３０秒間、７２℃で１４分間)ＰｆｕポリメラーゼおよびプライマーＦ１およびＲ１を用いるＰＣＲ反応においてオーバーラップ伸長を通してスプライシングすることにより(Methods Enzymol.１９９３、２１７：２７０−２７９)、完全長配列を構築し、ｃＤＮＡ配列を哺乳類発現ベクター(ｐｃＤＮＡ３.１−zeｏ、インビトロゲン)へ挿入する。
【００８９】
本発明の一ポリペプチド(ｍＧＲＲ２、対応するＤＮＡ配列、配列番号５)は、２３６７アミノ酸(配列番号６)のタンパク質についての読み枠を含む。推定シグナルペプチド配列(MGTRGAVMPPPMWGLLGCCFVCAWALG (配列番号３４))が、ｍＧＲＲ２ポリペプチド(配列番号６)のＮ末端そのものに位置するということから、Ｎ末端タンパク質配列は細胞外に位置することが示唆される。ｈｍＧＲＲ２のアミノ酸配列は、ｍＧＲＲａと５１％の同一性を示し、５８％の類似残基を伴う(ｍＧＲＲ２の残基６１〜７３７を伴うｍＧＲＲａのアミノ酸残基８１〜７７０のｂｅｓｔｆｉｔアラインメント)。
【００９０】
異なる脳領域に由来するｃＤＮＡ(クロンテック)および上記ＲＡＣＥプライマーを用いたＰＣＲによる発現プロファイリングは、ｍＧＲＲ１ａ／ｂに対するオーバーラップ発現プロファイルと共に脳におけるｍＧＲＲ２ ｍＲＮＡの広範な分布を示す。
【００９１】
実施例３：部分的ラットｍＧＲＲ１のクローニング
ラットｍＧＲＲ１ ｃＤＮＡクローンは、ｂｌａｓｔｎ検索における問い合わせとしてヒトｍＧＲＲ１ａ配列(配列番号１)を用いることにより、整列させた後根ガングリオンｃＤＮＡライブラリー(ノヴァリティス起源)で同定される。このクローンからのプラスミドＤＮＡを単離し、ｃＤＮＡ挿入体を部分的に配列決定する(配列番号１６)。ヌクレオチド配列は、対応するヒトｍＧＲＲ１およびｂ配列(配列番号１、配列番号３)と８０％同一である。
【００９２】
実施例４：哺乳類細胞発現(In situハイブリダイゼーション)
３２Ｐ−ＵＴＰセンスおよびアンチセンスリボプローブの合成用鋳型として、ラットｍＧＲＲ ｃＤＮＡ(配列番号１６)のフラグメントを、Ｔ７プロモーター配列が結合されたプライマーを用いるＰＣＲにより増幅する。プライマー配列は、5-AAT GGA AGT CAG TTG TAC AC-3 (配列番号 17)および5-TTA tac act cac tat agg gaA ATG TCC CTT TAA CAG GCT G-3(配列番号 18) (アンチセンス鋳型)および 5-taa tac gac tca cta tag gga AAT GGA AGT CAG TTG TAC AC-3(配列番号 19)および 5-AAT GTC CCT TTA ACA GGC TG-3(配列番号２０)(センス鋳型)である。５０ｎｇの鋳型プラスミド(ラットｍＧＲＲ、配列番号１６)を用いて、ＭＷＧプリマスサイクラーにおいて２５のＰＣＲサイクルを実行する。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間(変性)、６８℃で１分間(アニーリング)および７２℃で１分間(伸長)である。予測サイズ(５９０ｂｐ)のＰＣＲ産物が得られ、これをスピンカラム(ロシェ・ディアグノスティクス、インディアナポリス、米国、カタログ番号１７３２６６８)により精製し、３５Ｓ−標識ＲＮＡプローブの合成に使用する。
【００９３】
プローブ合成を、ＲＮＡ転写キット(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア、米国)により以下の要領で実施する。６μｌの[α−３５Ｓ]ＵＴＰおよび６μｌの[α−３５Ｓ]ＡＴＰ(比活性１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ、米国)を、１.５ｍｌ管中で濃縮する。その後、２μｌの５×転写緩衝液、１μｌの１００ｍＭのＤＴＴ、３μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ、１μｌの溶液(１０μｌの１００ｍＭのＣＴＰ、１０μｌの１００ｍＭのＧＴＰ、３０μｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ含有)、１μｌのＲＮアシン、１μｌのＴ７またはＴ３ポリメラーゼおよび２００ｎｇのＰＣＲ産物を加える。３７℃で１〜１.５時間のインキュベーション後、５０μｌのＳＤＳ２０％、１００μｌの０.１ＭのＤＤＴおよび８５０μｌの１０ｍＭトリス−１ｍＭのＥＤＴＡ(ｐＨ７.４)を含む溶液９０μｌを加えることにより、反応を停止させる。セファデックスＧ−５０スピン−カラム(ベーリンガー、マンハイム、ドイツ国)で精製後、シンチレーション計数法により放射能を測定する。ハイブリダイゼーション混合物を、２種の別々の溶液から調製する。すなわち、溶液Ａは、１０ｍｌのホルムアミド、４ｍｌの５０％デキストランスルフェート、４００μｌの５０×デンハート溶液(５００ｍｌのＨ２Ｏ中、５ｇのフィコル、５ｇのポリビニルピロリドンおよび５ｇのウシ血清アルブミン)、４０μｌの０.５ＭのＥＤＴＡ(ｐＨ８.０)、２００μｌの１Ｍのトリス(ｐＨ８.０)および１.２ｍｌの５ＭのＮａＣｌを含む。溶液Ｂは、１〜５μｌの３５Ｓ標識プローブ(正確な量は、最終培地中で１０７ｃｐｍ／ｍｌの濃度に達するように特定される)、１００μｌのｔＲＮＡ、１００μｌの０.１ＭのＤＴＴおよび最終的に２ｍｌにするための適量のＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏを含み、これを６５℃で５分間加熱する。最終ハイブリダイゼーション混合物を、十分に混合した８ｍｌの溶液Ａおよび２ｍｌの溶液Ｂにより調製し、注射器濾過し、５分間６５℃で再加熱し、５分間１００００ｇで遠心分離することにより、気泡を除去する。
【００９４】
ラット脳を、−２０〜−２５℃の低温保持装置で８〜１６μｍ厚さの冠状片に切断し、ゼラチン−ポリ−Ｌ−リシン−コーティングしたスライドに載せる。断片を室温で一晩真空乾燥し、４％(ｗ／ｖ)氷冷パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、１×ＰＢＳ中で１分３回洗浄する。それらを同日ハイブリダイゼーションに使用するか、または−７０℃の密閉スライド箱中で貯蔵する。
【００９５】
ハイブリダイゼーション当日、冷凍したスライド箱を室温に達するまで密閉したままにしておく。次いで、スライドを、２５０ｍｌの０.３Ｍのトリエタノールアミンを含む染色皿に連続的に浸し、６２５μｌの無水酢酸が加えられた同じエタノールアミンでアセチル化し、等級付けしたエタノール(５０、７０、９５、１００、１００％)中で脱水し、１〜３時間真空乾燥する。７５μｌのハイブリダイゼーション混合物をピペットでカバーグラスに移す。ガラススライドとの接触時、溶液は毛管現象により断片全体に均一に拡散する。一旦ＤＰＸで密閉し、スライドを置き、１６〜２０時間５６℃に保つ。次いで、スライドを室温で冷却し、硬化ＤＰＸを除去し、カバーグラスがはずれるまでスライドを２０分間またはそれ以上４×ＳＳＣ緩衝液に浸す。０.１×ＳＳＣ中における高ストリンジェンシー洗浄を６８℃で行う。エマルジョン−浸漬のため、断片を９５％エタノール中で５分、１００％エタノール中で５分を３回、キシレン中で５分を１回、１００％エタノール中で３０秒を１回および再び３回(前と同じ溶液)脱脂し、少なくとも１時間真空乾燥する。次いで、暗室中で、液体核エマルジョン(コダック、ＮＴＢ２、インテグラ・バイオサイエンシーズＡＧ、ヴァリセレン、スイス、州／国)を、５２℃に予熱しておいた蒸留水中で１：１に希釈する。混合物を５２℃の水浴中で１５分間溶解させる。次いで、溶液を１８０°回転により非常に静かに攪拌し、十分ではあるが、発泡を回避しながら混合し、さらに１５分間静置する。均一混合物を特製浸漬フラスコ中に注ぎ、再び１５分間置いて泡を除く。次いで、スライドをエマルジョン中に１回浸漬し、３時間暗いチャンバーに入れたホルダーで乾燥する。スライドを、暗室中４℃の密閉スライド箱で貯蔵する。１６〜６０ｄ暴露後、スライドを現像処理する。標準濃度で使用される現像液Ｄ−１９および定着液(コダック)を、氷中で１５℃に冷却する。次いでスライドを現像液に３.５分間浸し、１５℃の水で１５秒間洗浄し、６分間定着させる。最後に、それらを脱塩水で１時間洗浄する。断片を対比染色するかまたは、カバーグラスを置く前にスライドを３滴の組織封入剤(パーマウント、フィッシャー・サイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルベニア、米国)と共に顕微鏡検査用に固定し、カバーグラスが強く接着するまで数日間スライド箱で乾燥する。
【００９６】
ｍＧＲＲ ｍＲＮＡの観察された脳特異領域分布は、ｍＧＲＲリガンドについての可能な指標に関する情報を提供する。ｍＧＲＲリガンドは、天然リガンドおよびｍＧＲＲ活性のモジュレーター、例えば抗ｍＧＲＲ抗体および／またはｍＧＲＲ介在シグナル伝達を促進または打ち消す小分子である。ファミリー３ ＧＰＣＲ、例えば代謝型グルタミン酸受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体は、シナプス伝達を調節し、イオンチャンネルと比べてそれらの効果は永続性があり、調節的である。ｍＧＲＲの脳におけるｍＲＮＡ発現パターンは、ｍＧＲＲ相互作用分子が、神経学的および／または精神医学的疾患、例えば限定されるわけではないが、痴呆、精神分裂病、うつ病、情動障害、癲癇および運動障害の処置に有用であることの指標を提供する。
【００９７】
本発明ポリペプチドは、全主要脳構造で発現される(表１)。
【表２】
表１：ラット脳全体にわたるｍＧＲＲ１をコードするｍＲＮＡの分布。使用されるハイブリダイゼーションプローブは、ｍＧＲＲ１ａおよびｍＧＲＲ１ｂに共通したＣ−末端配列に対応する(パンプローブ)。１０日間核エマルジョンに暴露した後、暗視野顕微鏡下で発現レベルを冠状および矢状方向脳断片について評価した。０＝検出可能な発現は無し、＋＝弱い、＋＋＝中ぐらい、＋＋＋＝高い、＋＋＋＋＝非常に高い。
【００９９】
ｍＧＲＲ ｍＲＮＡの観察された脳特異領域分布は、ｍＧＲＲリガンドについての可能な指標に関する情報を提供する。ｍＧＲＲリガンドは、天然リガンドおよびｍＧＲＲ活性のモジュレーター、例えば抗ｍＧＲＲ抗体および／またはｍＧＲＲ介在シグナル伝達を促進または打ち消す小分子である。ファミリー３ ＧＰＣＲ、例えば代謝型グルタミン酸受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体は、シナプス伝達を調節し、イオンチャンネルと比べてそれらの効果は永続性があり、調節的である。
【０１００】
実施例５：免疫ブロット
ＨＡ標識ｍＧＲＲ１ａの生成。Ｃ−末端血球凝集素(ＨＡ)エピトープ(ヌクレオチド配列5'-TATCCATATGATGTTCCAGATTATGCT(配列番号２１))を、ｍＧＲＲ１ａのＣ−末端配列に付加した。この末端に対し、鋳型として(５０ｎｇ)ｐｃＤＮＡ３.１ｔｏｐｏにおけるヒトｍＧＲＲ１ａを用いてプライマー5'-CAAGACTCCAGTTCTCCCAGAG (配列番号22)および5'- TCTAGATCTAGACTAAGCATAATCTGGAACATCATATGGATACACTTTAAAACTATCCCAGATC (配列番号23)によりＰＣＲ反応を実行した。９５℃(３０秒)、６８℃(３０秒)、７２℃(３０秒)で２５のＰＣＲサイクルを実行した。予想サイズ(４１７ｂｐ)のＰＣＲ産物が得られ、これをＢｓｇＩおよびＸｂａＩで二重消化し、ゲル精製(Ｑｉａｅｘ、キアゲン)し、ｐｃＤＮＡ３ｔｏｐｏにおける野生型ｈｍＧＲＲ１ａのＢｓｇＩ／ＸｂａＩフラグメントの置換に用いた。両鎖の配列決定により構築物を確認した。
【０１０１】
免疫ブロット。トランスフェクションされたＣＯＳ１細胞からの膜を解凍し、遠心分離にかけ、ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ(１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０.６ｍＭのＭｇＣｌ２、１.８ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６ｍＭのデキストロース；(ライフ・テクノロジーズ＃０４３−９０１７４Ｍ))、５０μｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩに再懸濁し、試料緩衝液(１２５ｍＭのトリスｐＨ６.８、１％ＳＤＳ、２５ｍＭのＤＴＴ、５％のグリセリン／ブロムフェノールブルー)中で希釈した。タンパク質(１レーン当たり２０μｇ)を、４〜１５％勾配ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、電気泳動によりイモビロン−Ｐ ＰＶＤＦメンブラン(ミリポアＡＧ、フォルケツビル、スイス国)へ移動させた。ＮＥＴ−Ｇ緩衝液(１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ ｐＨ７.４、５ｍＭのＥＤＴＡ、０.０５％(ｖ／ｖ)のトリトンＸ１００、０.２５％ｗ／ｖのゼラチン)中で一晩インキュベーションすることにより非特異的結合を減少させた。それに続いて、膜を、室温で４５分間ＮＥＴ−Ｇ中(１：５００)においてモノクローナルラット抗ＨＡ−ペルオキシダーゼ高アフィニティー抗体(３Ｆ１０、ロシェカタログ番号２０１３８１９)とインキュベーションした。ＮＥＴ−Ｇにより３回洗浄(各１０分)後、強化化学発光ウエスタンブロット試薬(アマーシャム・ライフ・サイエンシーズ＃２１０６)を用いて結合抗体を検出し、膜をバイオマックスＭＲ(コダック)フィルムに露出した。ｐｃＤＮＡ３.１−ｔｏｐｏ(ギブコ・ライフ・サイエンシーズ)におけるヒトＧＲＲ−ＨＡでトランスフェクション後のＣＯＳ−１細胞からの膜のウェスタンブロットは、１３４ｋＤａ(そのタンパク質配列から予測された通り)のところにタンパク質バンドを示す。免疫ブロットは、細胞膜により為されているためｍＧＲＲが細胞膜で見出されることを示す。
【０１０２】
実施例６：機能分析
ｍＧＲＲ１ａ、ｍＧＲＲ１ｂおよびｍＧＲＲ２は、推定相互作用受容体タンパク質と一緒に組換え発現系、例えばＨＥＫ２９３細胞またはＣＯＳ細胞において共発現され得る。ｃＤＮＡ発現構築物のコトランスフェクションは、例えばエフェクテントランスフェクション剤(キアゲン)により行われ得る。機能的リードアウトは、アゴニスト誘導ＧＴＰｙＳ結合、例えばGalvez et al.、Mol.Pharmacol.、５７、４１９−４２６(２０００)またはカリウムチャンネルの活性化(Lingenhoehl et al.、Neuropharmacology、３８、１６６７−１６７３(１９９９))の分析を含み得る。Ｇタンパク質またはキメラＧタンパク質のコトランスフェクションを用いることにより、報告された要領(Galvez et al.、EMBO J、２０、２１５２−２１５９(２００１))で測定され得るカルシウムシグナル(イノシトールリン酸蓄積)を発生させ得る。別法として、放射性標識候補リガンドの結合は、トランスフェクション細胞から誘導された膜調製物を用いて測定され得る。さらに、以下の実験により、ｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２の機能が解明され得る。
【０１０３】
ａ)遺伝子ノックアウト
ネズミｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２遺伝子は、それぞれ近位Ｃｈｒ２および遠位Ｃｈｒ１１に局在している。ネズミｍＧＲＲ遺伝子およびそれらの構造についての知識を用いて、ｍＧＲＲａおよび／またはｍＧＲＲ２遺伝子の機能が除去されたマウスを製造する目的で遺伝子ターゲッティング構築物を設計する。ノックアウト動物は、構成的または誘導性ノックアウトを含めて報告された(Neuron.２００１：３１、４７−５８)標準的方法により製造される。同型接合ノックアウトマウスの表現型を生化学、薬理学および電気生理学的範例で研究することにより、既知生化学的および受容体経路が被り得る損傷を試験する。また上記動物は、様々な行動的範例でも研究されている(Neuron.２００１；３１、４７−５８)。
【０１０４】
ＣＧ１１９２３により、哺乳類ｍＧＲＲの推定ショウジョウバエ(ドロソフィラ、drosophila)相同体が同定された。ＣＧ１１９２３の機能がＰエレメント突然変異導入手段により破壊されたショウジョウバエの表現型が研究されている。結果は、インビボでのｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２の機能の解明に役立つものであると予測される。
【０１０５】
ｂ)相互作用タンパク質
ベイト(おとり)としてＣまたはＮ末端配列を用いることにより、ｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２の相互作用タンパク質が同定される。これは、脳ｃＤＮＡライブラリーの酵母２ハイブリッドスクリーンおよびＧＳＴ融合タンパク質の生成を伴うもので、後続の脳抽出物を用いたプルダウン解析法およびタンパク質の質量分光法に使用される。また上述の方法を使用することにより、ｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２についての可能なヘテロ二量体相互作用を調べる。潜在的相互作用タンパク質を、トランスフェクション細胞およびニューロン培養物における共局在性実験で調べる。ヒトｍＧＲＲ１ａ／ｂのＣ末端そのものにおいて、推定II型ＰＤＺタンパク質結合モチーフ(J Biol Chem.２００２、２７７、１５２２１−４)が同定されることから、ｍＧＲＲ１a／bと既知ＰＤＺモチーフ結合タンパク質、例えばＰＩＣＫ１との相互作用は、ｍＧＲＲを既知ＧＰＣＲシグナル伝達経路に指向させ得ることが示唆される(EMBO J.２００２、２１、２９９０−９)。ＰＩＣＫ１とヒトｍＧＲＲ１の推定相互作用を、上記共局在性および共免疫沈降試験を用いて調べる。
【０１０６】
ｃ)リガンド・フィッシングスクリーン
推定ＧＰＣＲリガンドのコレクションは、研究室において確立されている。推定受容体リガンドのバンクがスクリーニング用に構築された。バンクは、伝達物質、ホルモンおよびケモカイン、ヒト受容体についての推定アゴニストであり得る天然化合物、哺乳類対応物質がまだ同定されていない非哺乳類生物活性ペプチド、および天然では見出されないが、未知天然リガンドを伴う受容体を活性化する化合物を含む。このバンクは、機能性(すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理現象など、下記参照)および結合検定法の両方を用いて既知リガンドについての受容体を最初にスクリーニングするのに使用される。ｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２を、組換え発現系、例えばＨＥＫ２９３細胞またはＣＯＳ細胞で推定相互作用受容体タンパク質(上記)と共発現させる。これはまた、ｍＧＲＲ１およびｍＧＲＲ２の発現を含み得る。ｃＤＮＡ発現構築物のコトランスフェクションは、例えばエフェクテントランスフェクション剤(キアゲン)により行なわれる。機能的リードアウトは、アゴニスト誘導ＧＴＰｙＳ結合、例えばGalvez et al.、Mol.Pharmacol.、５７、４１９−４２６(２０００)またはカリウムチャンネルの活性化(Lingenhoehl et al.、Neuropharmacology、３８、１６６７−１６７３(１９９９))の分析を含み得る。Ｇタンパク質またはキメラＧタンパク質のコトランスフェクションを用いることにより、報告された要領(Galvez et al.、EMBO J、２０、２１５２−２１５９(２００１))で測定されるカルシウムシグナル(イノシトールリン酸蓄積)を発生させ得る。別法として、放射性標識候補リガンドの結合を、トランスフェクション細胞から誘導された膜調製物を用いて測定する。
【０１０７】
ｄ)抽出物／細胞上清スクリーニング
現在までのところ、同族活性化リガンド(アゴニスト)が存しないままの多数の哺乳類受容体が存在する。すなわち、これらの受容体についての活性リガンドは、現在までに同定されたリガンドバンク内には含まれ得ない。
【０１０８】
したがって、また本発明受容体を、組織抽出物に対する機能性スクリーニング(カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理現象など、機能性スクリーン)にかけることにより、天然リガンドが同定される。正の機能性応答を生じる抽出物は、活性化リガンドが単離同定されるまで連続的にサブフラクション化され得る。
【０１０９】
ｅ)抗体およびペプチド
抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)は、ｍＧＲＲのＮおよびＣ末端エピトープに対して産生される。同定された推定相互作用タンパク質(例えば上記ＰＩＣＫ１)とｍＧＲＲタンパク質の会合を破壊することが予測されるペプチドを設計する。内在的に発現されたｍＧＲＲタンパク質の機能を破壊する目的で抗体および／ペプチドを培養ニューロン細胞に適用する。抗体および／またはペプチド処理細胞の電気生理学的特性を未処理細胞と比較研究する。
【０１１０】
実施例７：リガンド結合検定法
リガンド結合検定法は、受容体薬理学についての直接確認方法を提供するもので、高スループットフォーマットに適用可能である。結合試験用に、受容体についての精製リガンドを、高比活性(５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ)に放射性標識する。次いで、放射性標識方法がその受容体に向かうリガンドの活性を減じることはないという測定がなされる。緩衝液、イオン、ｐＨおよび他のモジュレーター、例えばヌクレオチドについての検定条件を最適化することにより、膜および全細胞受容体供給源の両方にとって実行可能なシグナル対ノイズ比を確立する。これらの検定法については、放射能合計−過剰の非標識競合リガンドの存在下で測定された放射能として、特異的受容体結合を定義する。可能な場合、複数の競合リガンドを用いて、残留非特異的結合を特定する。
【０１１１】
ｍＧＲＲ１ａ、ｍＧＲＲ１ｂおよびｍＧＲＲ２は、本質的に同じリガンドを有し得る。
【０１１２】
実施例８：染色体局在性
慣用技術を用い、公開ドメインデータベース、例えばＥＮＳＥＭＢＬ(http://www.ensembl.org/)を用いて染色体局在性を推測する。ヒトＣｈｒ１０ｐ１１.２−ｐ１２におけるヒトｍＧＲＲ地図、ヒトＣｈｒ１７ｑ１１.１におけるｍＧＲＲ２遺伝子座地図。
Claims (10)
- (ａ)配列番号３または配列番号５の配列を含むポリヌクレオチドによりコード化される単離ｍＧＲＲポリペプチド、
(ｂ)配列番号４または配列番号６のポリペプチド配列と少なくとも９６％の同一性を有するポリペプチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲの場合と類似した特性を示す単離ｍＧＲＲポリペプチド、
(ｃ)配列番号４または配列番号６のポリペプチド配列を含む単離ｍＧＲＲ１ｂまたはｍＧＲＲ２ポリペプチド、
(ｄ)配列番号４または配列番号６のポリペプチド配列と少なくとも９６％の同一性を有し、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲの場合と類似した特性を示す単離ｍＧＲＲポリペプチド、
(ｅ)配列番号４または配列番号６のポリペプチド配列、
(ｆ)配列番号４または配列番号６のポリペプチド配列と比べて０.９６の同一性指数を有するポリペプチド配列を有するかまたは含む単離ｍＧＲＲポリペプチド、
(ｇ)(ａ)〜(ｆ)記載の上記ポリペプチドのフラグメントまたは変異型
から成る群の一つから選択される単離ｍＧＲＲポリペプチド。 - 配列番号４または配列番号６のポリペプチド配列である、請求項１記載の単離ポリペプチド。
- (ａ)配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ｍＧＲＲポリヌクレオチド、
(ｂ)配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド、
(ｃ)配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチドと少なくとも９６％の同一性を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｄ)配列番号３または配列番号５の単離ポリヌクレオチド、
(ｅ)配列番号４または配列番号６のポリペプチド配列と少なくとも９６％の同一性を有するポリペプチド配列をコード化するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｆ)配列番号３または配列番号５のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、
(ｇ)配列番号４または配列番号６のポリペプチド配列と少なくとも９６％の同一性を有するポリペプチド配列をコード化するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｈ)配列番号４または配列番号６のポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、
(ｉ)配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチド配列に対し０.９６の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、または
(ｋ)配列番号４または配列番号６のポリペプチド配列に対し０.９６の同一性指数を有するポリペプチド配列をコード化するポリヌクレオチド配列を含み、リガンド結合検定法においてｍＧＲＲと類似した特性を示すポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド、または上述のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変異型であるかまたはその全長にわたって上述のポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチド
から成る群の一つから選択される単離ｍＧＲＲポリヌクレオチド。 - (ａ)配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド、
(ｂ)配列番号３または配列番号５の単離ポリヌクレオチド
(ｃ)配列番号４または配列番号６のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、および
(ｄ)配列番号４または配列番号６のポリペプチドをコード化する単離ポリヌクレオチド
から成る群から選択される、請求項３記載の単離ポリヌクレオチド。 - 発現ベクターが適合し得る宿主細胞に存在するとき、請求項１記載のポリペプチドを生産し得るポリヌクレオチドを含む発現系。
- 請求項５記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞または請求項１記載のポリペプチドを発現するその膜。
- ポリペプチドの生産に十分な条件下で請求項６記載の宿主細胞を培養し、培養培地からポリペプチドを採取する工程を含む、請求項１記載のポリペプチドの製造方法。
- 免疫グロブリンＦｃ領域および請求項１のいずれか一つのポリペプチドから成る融合タンパク質。
- 請求項１〜２のいずれか１項記載のポリペプチドについて免疫特異性を示す抗体。
- 請求項１記載のポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
(ａ)候補化合物に直接的または間接的に随伴した標識手段によりポリペプチドへの(またはポリペプチドを発現する細胞または膜への)またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を定量的または定性的に測定または検出する、
(ｂ)標識競合体の存在下において、ポリペプチドへの(またはポリペプチドを発現する細胞または膜への)またはその融合タンパク質への候補化合物の結合の競合を測定する、
(ｃ)ポリペプチドを発現する細胞または細胞膜に適切な検出系を用いて、候補化合物がポリペプチドの活性化または阻害によりシグナルを発生させるか否かを試験する、
(ｄ)請求項１記載のポリペプチドを含む溶液と候補化合物を混合して混合物を形成させ、混合物におけるポリペプチドの活性を測定し、そして候補化合物を含まない対照混合物と上記混合物の活性を比較するか、または
(ｅ)例えばＥＬＩＳＡ検定法を用いて、細胞における上記ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡまたは上記ポリペプチドの生産に対する候補化合物の影響を検出し、そして
(ｆ)バイオテクノロジー的または化学的標準技術にしたがって上記化合物を生産させる
工程から成る群から選択される方法を含む方法。
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