JP2002542765A - 新規化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＤＫＣＮ１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびに組み換え法によりかかるポリペプチドを製造する方法を開示する。診断アッセイにおけるＤＫＣＮ１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、新たに同定されたポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、診断におけるそれらの使用、および治療において潜在的
に有用なアゴニスト、アンタゴニストである可能性のある化合物の同定における
それらの使用、ならびにかかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの製造に関
する。

【０００２】 発明の背景 薬剤発見のプロセスは「機能遺伝学」、すなわち高処理量ゲノム−またはゲノ
ムに基づく生物学をを採用しているので、現在、根本的な改革の最中にある。治
療標的としての遺伝子および遺伝子産物を同定するための手段としてのこのアプ
ローチは、「位置クローニング」に基づく初期のアプローチに急速に取って代わ
ろうとしている。表現型、すなわち生物学的機能または遺伝病が同定されること
により、遺伝学的マップ位置に基づいてさかのぼって原因遺伝子が追跡されるで
あろう。 機能遺伝学は、高処理量ＤＮＡ配列決定法ならびに現在利用可能な多くの分子
生物学的データベースから潜在的な対象である遺伝子配列を同定するためのバイ
オフォーマチクス（bioformatics）の種々のツールに大いに依存している。薬剤
発見の標的としてのさらなる遺伝子およびそれらの関連ポリペプチド／蛋白を同
定し、特徴づける必要が引き続き存在する。

【０００３】 発明の概要 本発明は、ＤＫＣＮ１、詳細には、ＤＫＣＮ１ポリペプチドおよびＤＫＣＮポ
リヌクレオチド、組み換え材料およびそれらの製造のための方法に関する。かか
るポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ガン、肺疾患、心臓血管系の疾患、
炎症性疾患、腎臓疾患、痛み、精神病（うつ病および分裂病を包含）、神経変性
疾患（アルツハイマー病、卒中および頭部外傷を包含）、および神経学的疾患（
偏頭痛、てんかん、認知機能障害／強化、注意力欠損疾患、嗜癖を包含）、運動
障害（パーキンソン病およびハンチントン舞踏病を包含）、脳性小児まひ、不安
症／対人恐怖症、睡眠関連疾患、睡眠の誘導、失禁、勃起不全、脱毛症（これら
の疾病に限らない）を包含する特定の疾病（以下、「本発明の疾病」という）の
治療方法との関連において興味深い。さらなる態様において、本発明は、本発明
により提供される材料を用いてアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、阻害
剤）を同定する方法、ならびに同定された物質を用いてＤＫＣＮ１バランス不良
に関連した症状の治療方法にも関する。さらなる態様において、本発明は、不適
切なＤＫＣＮ１活性またはレベルに関連した疾病の検出のための診断アッセイに
も関する。

【０００４】 発明の説明 第１の態様において、本発明は、ＤＫＣＮ１ポリペプチドに関する。かかるポ
リペプチドは下記のものを包含する： （ａ）配列番号：１の配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリ
ペプチド； （ｂ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離ポリ
ペプチド； （ｃ）配列番号：２のポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド； （ｄ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％の同一性を有する単離ポリペプチド； （ｅ）配列番号：２のポリペプチド配列；および （ｆ）配列番号：２のポリペプチド配列と比較して、０．９５、０．９６、０．
９７、０．９８、または０．９９の同一性指数（Identity Index）を有するポリ
ペプチド配列を有するあるいは含む単離ポリペプチド； （ｇ）（ａ）から（ｆ）までのかかるポリペプチドのフラグメントおよび変異体
。 本発明のポリペプチドはカリウムチャンネルファミリーのポリペプチドのメン
バーである考えられる。それゆえ、カリウムチャンネルは、興奮度の制御および
分泌プロセスのモジュレーションにおいて重要な一群のイオンチャンネルである
ので、それらは興味深いものである。それらは、神経形成、体積調節、静止膜電
位の維持、ならびに活動電位の頻度および持続時間の決定における重要な役割を
包含する多くの役割を有している。カリウムチャンネルのモジュレーション後の
細胞興奮性の変化は、かかるモジュレーターの広範な潜在的な治療的用途を生じ
させる。

【０００５】 以下、本明細書においてＤＫＣＮ１の生物学的特性を「ＤＫＣＮ１の生物学的
活性」または「ＤＫＣＮ１活性」という。好ましくは、本発明のポリペプチドは
ＤＫＣＮ１の少なくとも１の生物学的活性を示す。

【０００６】 また本発明のポリペプチドは、上記ポリペプチドの変異体も包含し、すべての
アリール形態およびスプライス変異体を含む。かかるポリペプチドは、保存的ま
たは非保存的であってよい挿入、欠失および置換、あるいはそれらのいずれかの
組み合わせによって、対照のポリペプチドとは異なる。特に好ましい変異体は、
数個、例えば、５０ないし３０個、３０ないし２０個、２０ないし１０個、１０
ないし５個、５ないし３個、３ないし２個、２ないし１個または１個のアミノ酸
が、いずれかの組み合わせで挿入、置換または欠失している変異体である。 本発明のポリペプチドの好ましいフラグメントは、配列番号：２のアミノ酸配
列に由来する少なくとも３０、５０または１００個の連続したアミノ酸を有する
アミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、あるいは配列番号：２のアミノ酸配列か
ら末端切断または欠失された少なくとも３０、５０または１００個の連続したア
ミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを包含する。好ましいフラ
グメントは、ＤＫＣＮ１の生物学的活性を媒介する生物学的に活性のあるフラグ
メントであり、類似の活性または改善された活性を有するフラグメント、あるい
は望ましくない活性が減じられたフラグメントを包含する。動物、特にヒトにお
いて抗原性または免疫原性であるフラグメントも好ましい。

【０００７】 本発明のポリペプチドのフラグメントを、ペプチド合成による対応全長ポリペ
プチドの製造に使用してもよい。それゆえ、これらの変異体を、本発明の全長ポ
リペプチドの製造のための中間体として使用してもよい。本発明のポリペプチド
は「成熟」蛋白の形態であってもよく、あるいは前駆体または融合蛋白のごとき
より大きな蛋白の一部であってもよい。分泌配列またはリーダー配列、プロ−配
列、精製を助ける配列、例えば、複数のヒスチジン残基、または組み換え製造中
の安定性のための付加的配列を含むさらなるアミノ酸配列を含むことがしばしば
有利である。 いずれかの適当な方法で、例えば、天然ソースから、発現系を含む遺伝子操作
された宿主細胞から単離することにより（下記参照）、あるいは例えば自動ペプ
チド合成装置を用いる化学合成により、あるいはそれらの方法の組み合わせによ
り、本発明のポリペプチドを製造することができる。かかるポリペプチドの製造
手段は当該分野においてよく知られている。

【０００８】 さらなる態様において、本発明はＤＫＣＮ１ポリヌクレオチドにも関する。か
かるポリヌクレオチドは下記のものを包含する： （ａ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、９６％
、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む
単離ポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：１のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：１のポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％の同一性を有する単離ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：１の単離ポリヌクレオチド； （ｅ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポ
リヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｆ）配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単
離ポリヌクレオチド； （ｇ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポ
リヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド； （ｈ）配列番号：２のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド； （ｉ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列と比較して、０．９５、０．９６、
０．９７、０．９８、または０．９９の同一性指数（Identity Index）を有する
ポリヌクレオチド配列を有するあるいは含む単離ポリヌクレオチド； （ｊ）配列番号：２のポリペプチド配列と比較して、０．９５、０．９６、０．
９７、０．９８、または０．９９の同一性指数（Identity Index）を有するポリ
ペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するあるいは含む単離ポリ
ヌクレオチド；および 上記ポリヌクレオチドのフラグメントまたは変異体であるポリヌクレオチド、あ
るいは上記ポリヌクレオチドに対してそれらの全長にわたって相捕的であるポリ
ヌクレオチド。

【０００９】 本発明のポリヌクレオチドの好ましいフラグメントは、配列番号：１の配列に
由来する少なくとも１５、３０、５０または１００個の連続したヌクレオチドを
有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、あるいは配列番号：１の
配列から末端切断または欠失された少なくとも３０、５０または１００個の連続
したヌクレオチドを有する配列を含む単離ポリヌクレオチドを包含する。 本発明のポリヌクレオチドの好ましい変異体は、スプライス変異体、アリール
変異体、ならびに１またはそれ以上の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）を包含
する多型を包含する。 また本発明のポリヌクレオチドは、例えば５０ないし３０個、３０ないし２０
個、２０ないし１０個、１０ないし５個、５ないし３個、３ないし２個、２ない
し１個または１個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付
加されている配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプチド変異体をコードす
る単離ポリヌクレオチドも包含する。

【００１０】 さらなる態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物である
ポリヌクレオチドを提供する。したがって、下記のＲＮＡポリヌクレオチドが提
供される： （ａ）配列番号：２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含
むＲＮＡポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であ
るＲＮＡポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：１のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含むＲＮＡポリヌクレオチド
；または （ｄ）配列番号：１のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるＲＮＡポリヌクレオチド
； ならびにそれらのＲＮＡポリヌクレオチドに対して相補的なＲＮＡポリヌクレオ
チド。

【００１１】 配列番号：１のポリヌクレオチド配列はＴＷＩＫ−関連酸−感受性カリウムチ
ャンネル（D. Leonoudfakis et al., J. Neuroscience 18: 868-877, 1998）と
の相同性を示す。配列番号：１のポリヌクレオチド配列は、配列番号：２のポリ
ペプチドをコードするｃＤＮＡ配列である。配列番号：２のポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列はポリペプチドをコードする配列番号：１の配列で
あってもよく、あるいは遺伝学的コードの縮重の結果として配列番号：１以外の
配列となっているが、やはり配列番号：２のポリペプチドをコードする配列であ
ってもよい。配列番号：２のポリペプチドは、ラットＴＷＩＫ−関連酸−感受性
カリウムチャンネル（D. Leonoudfakis et al., J. Neuroscience 18: 868-877,
1998）との配列相同性および／または構造類似性を有するカリウムチャンネル
ファミリーの他の蛋白に関連するものである。 本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それら
の相同的ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対して類似の生物学的機能／特
性を有すると考えられる。さらにそのうえ、本発明の好ましいポリペプチドおよ
びポリヌクレオチドは少なくとも１のＤＫＣＮ１活性を有する。また本発明は、
配列番号：１および配列番号：２の対応全長配列の決定に先立ってはじめて同定
された部分または他のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列にも関する。

【００１２】 したがって、さらなる態様において、本発明は下記の単離ポリヌクレオチドを
提供する： （ａ）配列番号：３の全長にわたって、配列番号：３に対して少なくとも９５％
の同一性、好ましくは少なくとも９７−９９％の同一性をを有するヌクレオチド
配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：３の全長にわたって、配列番号：３に対して少なくとも９５％
の同一性、好ましくは少なくとも９７−９９％の同一性をを有するヌクレオチド
配列を有する単離ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：３のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：４の全長にわたって、配列番号：４のアミノ酸配列に対して少
なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９７−９９％の同一性を
有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチ
ド； ならびに配列番号：３のポリヌクレオチド。

【００１３】 さらに本発明は下記のポリペプチドを提供する： （ａ）配列番号：４の全長にわたって、配列番号：４のアミノ酸配列に対して少
なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７−９９％の同一性を有するアミノ酸
配列を含むポリペプチド； （ｂ）配列番号：４の全長にわたって、配列番号：４のアミノ酸配列に対して少
なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７−９９％の同一性を有するアミノ酸
配列を有するポリペプチド； （ｃ）配列番号：４のアミノ酸を含むポリペプチド； （ｄ）配列番号：４のポリペプチドであるポリペプチド； ならびに配列番号：３中に含まれる配列を含むポリヌクレオチドによりコードさ
れるポリペプチド。

【００１４】 配列番号：３のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるペプチド配列
はＥＳＴ（発現配列タグ）配列からのものである。ＥＳＴ配列中にはいくつかの
ヌクレオチド配列の読み間違いが不可避的に存在することが当業者により認識さ
れている（Adams, M. D. et al., Nature 377 (supp) 3, 1995参照）。したがっ
て、配列番号：３のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるペプチド配
列は配列の正確さにおいて同じ固有の限界を有する。さらにそのうえ、配列番号
：３によりコードされるペプチドは、最も相同的または構造的に類似した蛋白に
対して同一性のある領域または高い相同性のある領域および／または高い構造類
似性のある領域（例えば、保存的なアミノ酸の相違による）を含む。 標準的なクローニングおよびスクリーニング方法を用いて、ヒト幼児脳の細胞
中のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーから本発明のポリヌクレオチドを
得てもよい（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)
参照）。ゲノムＤＮＡライブラリーのごとき天然の源から本発明のポリヌクレオ
チドを得ることもでき、あるいはよく知られた方法および市販されている方法を
用いて本発明のポリヌクレオチドを得ることもできる。

【００１５】 本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組み換え製造に使用する
場合、ポリヌクレオチドはそれ自体成熟ポリペプチドのコーディング配列を含ん
でいてもよく、あるいはリーダー配列または分泌配列、プレ−、またはプロ−ま
たはプレプロ−蛋白配列または他の融合ペプチド部分をコードする配列のごとき
他のコーディング配列を伴った読み枠中の成熟ポリペプチドのコーディング配列
を含んでいてもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易ならしめるマーカ
ー配列がコードされていてもよい。本発明のある好ましい具体例において、マー
カー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen, Inc.）中に提供され、Gentz et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 821-824に記載されているようなヘキサ
−ヒスチジンペプチドであり、あるいはＨＡタグである。ポリヌクレオチドは、
転写、非転写配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム
結合部位およびｍＲＮＡ安定化配列のごとき非コーディング５’および３’配列
を含んでいてもよい。

【００１６】 配列番号：１のポリヌクレオチド配列に対して同一または十分な同一性を有す
るポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプ
ローブとして、あるいは核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）用プライマーとして使
用してもよい。かかるプローブおよびプライマーを用いて本発明のポリペプチド
をコードしている全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、配列番号：１に
対して高い配列類似性、典型的には少なくとも９５％の同一性を有するｃＤＮＡ
および他の遺伝子（ヒト起源のパラログならびにヒト以外の種に由来するオーソ
ログおよびパラログをコードする遺伝子を含む）のゲノムクローンを単離しても
よい。一般的には、好ましいプローブおよびプライマーは少なくとも１５個のヌ
クレオチド、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドを含み、少なくとも１
００個のヌクレオチドではないとしても少なくとも５０個のヌクレオチドを有し
ていてもよい。特に好ましいプローブは３０個ないし５０個のヌクレオチドを有
するであろう。特に好ましいプライマーは２０個ないし２５個のヌクレオチドを
有するであろう。

【００１７】 ヒト以外の種に由来するホモログを包含する、本発明のポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを、配列番号：１またはそのフラグメントの配列を有する
標識プローブ、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドのものを用いてスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下にてライブラリーをスクリーニン
グし、次いで、該ポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡおよびゲノムクロー
ンを単離する工程を含むプロセスにより得てもよい。かかるハイブリダイゼーシ
ョン方法は当業者によく知られている。好ましいストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ
、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６
）、５ｘデンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０マイクログラム
／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩、次いで、約６５
℃での０．１ｘＳＳＣ中での洗浄といった条件を包含する。よって、本発明は、
配列番号：１またはそのフラグメントの配列を有する標識プローブ、好ましくは
少なくとも１５個のヌクレオチドのものを用いてストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下にてライブラリーをスクリーニングすることにより得られる
単離ポリヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチドの配列を
有する単離ポリヌクレオチドも包含する。

【００１８】 多くの場合において、ポリペプチドをコードする領域が５’末端にまで伸長し
ていないという点で、単離ｃＤＮＡ配列が不完全なものであることを、当業者は
理解するであろう。このことは、本質的に低い「プロセッシビティー」（ポリマ
ー化反応中に酵素が鋳型に結合したままである能力の測定値）を有する酵素であ
る逆転写酵素によるものであり、第１鎖ｃＤＮＡ合成の間にｍＲＮＡ鋳型のＤＮ
Ａコピーを完成することができない。 全長ｃＤＮＡを得るための、あるいは短いｃＤＮＡを伸長させるための、例え
ば、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）法に基づく方法のごとき、利用可能で
当業者によく知られた方法がいくつかある（例えば、Frohman et al., Proc. Na
t. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, (1988)）。例えば、Marathon（商標）法（C
lontech Laboratories Inc.）により代表される当該方法の最近の変法は、より
長いｃＤＮＡの検索をかなり単純化させた。Marathon（商標）法において、選択
された組織から抽出されたｍＲＮＡおよび各末端上の「アダプター」配列からｃ
ＤＮＡが調製される。次いで、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよ
びアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅（ＰＣＲ）
を行って、ｃＤＮＡの「失われた」５’末端を増幅する。次いで、「ネステッド
」プライマー、すなわち、増幅生成物中でアニールするように設計されたプライ
マー（典型的には、アダプター配列中のさらに３’側にアニールするアダプター
特異的プライマーおよび既知遺伝子配列中のさらに５’側にアニールする遺伝子
特異的プライマー）ＰＣＲ反応を繰り返す。次いで、この反応の生成物をＤＮＡ
配列決定により分析し、存在しているｃＤＮＡに生成物を直接連結して完全配列
を得ることにより、あるいは５’プライマーの設計のための新たな配列の情報を
用いて別個の全長ＰＣＲを行うことにより、全長ｃＤＮＡを構築する。

【００１９】 当該分野においてよく知られた方法により、発現系を含む遺伝学的に処理され
た宿主細胞から本発明の組み換えポリペプチドを調製してもよい。したがって、
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド（複数も可）を含
む発現系、かかる発現系で遺伝学的に処理された宿主細胞、および組み換え法に
よる本発明のポリペプチドの製造に関する。無細胞翻訳系を用い、本発明のＤＮ
Ａ構築物由来のＲＮＡを用いてかかる蛋白を得ることもできる。 組み換え製造のために、宿主細胞を遺伝学的に処理して発現系またはその部分
を含ませて本発明のポリヌクレオチドを発現させることができる。Davis et al.
, Basic Methods in Molecular Biology (1986)およびSambrook et al（上記）
のごとき多くの標準的な研究室マニュアルに記載された方法によりポリヌクレオ
チドを宿主細胞に導入することができる。宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導
入のための好ましい方法としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション
、マイクロインジェクション、カチオン性脂質により媒介されるトランスフェク
ション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレイプローディン
グ（scrape loading）、バリスティック導入（ballistic introduction）または
感染等がある。

【００２０】 適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えば連鎖球菌属（Streptococci
）、ブドウ球菌属（Staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミセス（S
treptomyces）および枯草菌（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞例えば酵母細
胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞例えばショウジョウ
バエＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）細胞
；動物細胞例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９
３およびボウズ（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞等がある。

【００２１】 非常に多くの発現系を使用できる。かかる系は、染色体、エピソームおよびウ
イルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、
トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エ
レメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワ
クシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよび
レトロウイルス等のウイルス由来のベクター、ならびにそれらを組み合わせた物
に由来するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝学的エレ
メント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミドを包含する。発現系
は、発現を制御ならびに発生させる制御領域を含有していてもよい。一般的には
、宿主中でポリヌクレオチドを保持、伸長または発現してポリペプチドを発現す
るのに適した系またはベクターを用いてもよい。例えばSambrookら、Molecular
Cloning，A Laboratory Manual（上述）に記載されているような周知のおよび常
套的な種々の技術により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入できる。翻訳蛋白を
、小胞体内腔、ペリプラスミックスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために
、適当な分泌シグナルを所望ポリペプチド中に含ませてもよい。これらのシグナ
ルはポリペプチドに本来的なものであってもく、あるいは異種性のシグナルでも
よい。

【００２２】 本発明のポリペプチドをスクリーニングアッセイのために発現させる場合、一
般的には、細胞表面にポリペプチドを生成させるのが好ましい。この場合、スク
リーニングアッセイに使用する前に細胞を集めてもよい。本発明のポリペプチド
を培地中でスクリーニングする場合、培地を回収してポリペプチドを回収し精製
することができる。細胞内に生成される場合、まず細胞を溶解し、次いで、ポリ
ペプチドを回収しなければならない。 本発明のポリペプチドは周知の方法により、組換え細胞培養物から回収および
精製でき、その方法には例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出
、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマト
グラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、
ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー
等がある。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製に用いるのが最
も好ましい。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性した場合、再び活
性なコンホーメーションにするために、蛋白再生のためのよく知られた技法を用
いてもよい。

【００２３】 関連遺伝子中の変異を検出することによる診断試薬として本発明のポリヌクレ
オチドを使用してもよい。ｃＤＮＡまたはゲノム配列中の配列番号：１により特
徴づけられる遺伝子の変異形態であって、機能不全に関連している変異形態の検
出は、遺伝子のの発現低下、過剰発現または変化した発現から生じる疾病または
かかる疾病に対する感受性の診断のための手段を提供する。遺伝子中に変異を有
する個体を、種々の方法によりＤＮＡレベルで検出できる。 診断用の核酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば、血液、尿、唾液、
組織生検または剖検材料より得ることができる。ゲノムＤＮＡを検出に直接使用
してもよく、または分析の前にＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲもしくはその他
の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも
同様の方法で用いることができる。正常な遺伝子型と比較した場合の増幅生成物
のサイズの変化により、欠失および挿入を検出することができる。点突然変異は
、増幅ＤＮＡを標識ＤＫＣＮ１ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることに
より同定できる。好ましくは、完全に対合した配列は、ＲＮａｓｅ消化または融
解温度の差により、誤対合二重らせんから区別できる。ＤＮＡ配列の差はまた、
変性剤含有または不含のゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の変化
を検出することにより、または直接的なＤＮＡの配列決定により検出できる。例
えばMeyers et. al. Science，230:1242（1985）参照。特異的な位置での配列の
変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または
化学的切断法によっても明らかにすることができる。例えばCotton et al. Proc
. Natl. Acad. Sci. USA，85: 4397-4401（1985）参照。

【００２４】 ＤＫＣＮ１ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むオリゴヌクレ
オチドプローブのアレイ（array）を構築して、例えば遺伝学的変異の有効なス
クリーニングを行うことができる。好ましくは、かかるアレイは高密度アレイま
たはグリッドである。アレイ法はよく知られており、広い適用範囲があり、遺伝
子発現、遺伝学的連関および遺伝学的変化を包含する分子遺伝学における種々の
問題を解明するためにこの方法を用いることができる（例えば、M. Chee et al.
, Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)）。 ポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現の異常に低下または上昇したレベルの検出を
用いて、本発明の疾病または本発明の疾病に対する感受性を診断または決定する
ことができる。発現の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として当該
分野で周知の方法、例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノー
ザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレ
ベルで測定できる。宿主由来のサンプル中の本発明のポリペプチドのごとき蛋白
のレベルを決定するために用いることができるアッセイ法は、当業者に周知であ
る。このようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウ
ェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。

【００２５】 よって、もう１つの態様において、本発明は、 （ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号：１またはそのフラグ
メントもしくはＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列； （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列； （ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは、配列番号：２またはそのフラグメン
ト；あるいは （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号：２のポリペプ
チドに対する抗体 を含む診断キットに関する。 かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が重要成分を含
んでいてもよいことが理解されよう。かかるキットは、疾病、特に本発明の疾病
またはそれに対する感受性の診断において有用であろう。

【００２６】 本発明のポリヌクレオチド配列は染色体位置の研究にとり貴重である。個々の
ヒト染色体の特定位置に配列を特に標的化させ、ハイブリダイゼーションさせる
ことができる。本発明による重要配列の染色体に対するマッピングは、それらの
配列と疾病関連遺伝子とを関連づけることにおいて重要な第１工程である。配列
を正確な染色体位置にマッピングしたならば、染色体上の配列の物理的位置を遺
伝学的マップのデータと関係づけることができる。。かかるデータは、例えば、
V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopkins University Weich
Medical Libraryからオンラインで利用できる）に見いだされる。次いで、連関
（物理的に近接した遺伝子の同時遺伝）の分析により、同じ染色体領域にマッピ
ングされた遺伝子と疾病との関係を同定する。放射ハイブリッド（ＲＨ）マッピ
ング（Walter, M., Spillett, D., Thomas, P., Weissenbach, J., and Goodfel
low, P., (1994) A method for constructing radiation hybrid maps of whole
genomes, Nature Genetics 7, 22-28）を用いてゲノム配列（遺伝子フラグメン
ト等）の正確なヒト染色体位置を決定することができる。多くのＲＨパネルがRe
aearch Genetics（Huntsville, AL, USA）から利用可能であり、例えば、GeneBr
idge4 RH パネル（Hum Mol Genet 1996 Mar; 5(3):339-46 A radiation hybrid
map of the human genome. Gyapay G, Schmitt K, Fizames C, Jones H, Vega-C
zarny N, Spillet D, Muselet, D, Rrud'Homme JF, Dib D, Auffray C, Morisse
tte J, Weissenbach J, Goodfellow PN）がある。このパネルを用いて染色体位
置を決定するために、ＲＨ ＤＮＡに関して目的遺伝子から設計されたプライマ
ーを用いて９３のＰＣＲを行う。これらの各遺伝子は、ハムスターバックグラウ
ンド（ヒト／ハムスターハイブリッド細胞系）中に維持されたランダムなヒトゲ
ノムフラグメントを含む。これらのＰＣＲは、目的遺伝子のＰＣＲ生成物の存在
または不存在を示す９３のスコアを生じる。これらのスコアを、既知の位置のゲ
ノム配列からのＰＣＲ生成物を用いて得られたスコアと比較する。http://www.g
enome.wi.mit.edu/.においてこの比較を行う。本発明の遺伝子はヒト染色体８ｑ
２４．２−ｑｔｅｌにマッピングされる。

【００２７】 本発明のポリヌクレオチド配列は組織の発現に関する研究にとっても貴重であ
る。かかる研究は、本発明のポリヌクレオチドの発現パターンの決定を可能にし
、それらをコードするｍＲＮＡを検出することにより組織中のコードされたポリ
ペプチドの発現パターンに関する指示を得てもよい。使用する方法は当該分野に
おいてよく知られており、グリッド上でアレイになっているクローンに対するin
situハイブリダイゼーション法、例えば、ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイ
ゼーション（Schena et al., Science, 270, 467-470, 1995およびShalon et al
., Genome Res, 639-645, 1996）およびＰＣＲのごときヌクレオチド増幅法等が
ある。好ましい方法は、Perkin Elmerから市販されているＴＡＱＭＡＮ（商標）
法を用いるものである。これらの研究からの結果は、生物中のポリペプチドの正
常な機能に関する指示を提供する。さらに、ｍＲＮＡの正常な発現パターンを、
その遺伝子の別形態（例えば、ポリペプチドコーディング能の変化または調節的
変異を有するもの）によりコードされるｍＲＮＡの発現パターンと比較する研究
は、本発明のポリペプチドの役割、あるいは疾病におけるそれらの不適切な発現
の役割に関する貴重な洞察を提供する。かかる不適切な発現は時間的、空間的あ
るいは単に量的な性質のものであるかもしれない。 本発明のさらなる態様は抗体に関する。本発明のポリペプチドまたはそれらの
フラグメントもしくはアナログ、またはそれらを発現する細胞は、本発明のポリ
ペプチドに対して免疫特異的な抗体を産生する免疫原として用いることができる
。本明細書で用いる「免疫特異的」とは、抗体が、先行技術における他の関連ポ
リペプチドに対してよりも、本発明のポリペプチドに対して実質的に大きいアフ
ィニティーを有することを意味する。

【００２８】 本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ
が付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくはヒトはでない動物に
、通常の実験法を用いて投与することにより得ることができる。連続的細胞系培
養により産生される抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モノクローナ
ル抗体を調製することができる。例としては、Kohler,G. and Milstein,C.，Nat
ure，256:495-497（1975）；Kozbor et al.Immunology Today，4:72（1983）；C
ole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.,77-9
6頁（1985）に記載されるような種々の技法がある。 一本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号に記
載のごとき）は、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用
できる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物は
ヒト化抗体等の抗体を発現するのに用いることができる。 上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定しても
よく、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製し
てもよい。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、特に、本発明の疾病を
治療してもよい。

【００２９】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドをワクチンとして使用してもよ
い。したがって、さらなる態様において、本発明は、哺乳動物において免疫学的
応答を誘導するための方法に関し、該方法は、疾病が個体中ですでに確立されて
いるか否かにかかわらず、抗体および／または例えばサイトカイン−産生Ｔ細胞
または細胞毒性Ｔ細胞を包含するＴ細胞免疫応答を生じさせるに十分な本発明の
ポリペプチドを哺乳動物に接種して、該動物を疾病から防御することを特徴とす
る。ポリヌクレオチドの発現に指向され、ポリペプチドをコードしているベクタ
ーを介してインビボにおいて本発明のポリペプチドをデリバリーして、かかる免
疫学的応答を誘導し、動物を本発明の疾病から防御することを特徴とする方法に
より、哺乳動物における免疫学的応答を誘導してもよい。迅速にベクターを所望
細胞中に投与する方法としては、粒子上にコーディングすること等がある。かかる
核酸ベクターとしてはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブ
リッド等がある。ワクチンを使用するために、ポリペプチドまたは核酸ベクター
は、通常には、ワクチン処方（組成物）として提供される。処方はさらに適当な
担体を含んでいてもよい。ポリペプチドは胃で分解され得るので、好ましくは、
それを非経口的に投与する（例えば、非か、筋肉内、静脈内、または皮内注射）
。非経口投与に適した処方としては、抗酸化剤、バッファー、静細菌剤および処
方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよい水性または非水性
滅菌注射溶液；ならびに懸濁剤または増粘剤を含んでいてもよい水性または非水
性滅菌懸濁液等がある。１回分また多回分の容器に入れて、例えば、密封アンプ
ルおよバイアルとして処方を提供してもよく、使用直前に滅菌液体担体を添加す
ることのみを必要とする凍結乾燥状態として保存してもよい。またワクチン処方
は、処方の免疫原性を増大させるためのアジュバント系、例えば、水中油計およ
び当該分野で知られた他の系のごときアジュバント系を含んでいてもよい。用量
はワクチンの個々の活性に依存し、常套的な実験により容易に決定できる。

【００３０】 本発明のポリペプチドは、１またはそれ以上の疾病状態、特に、上記の本発明
の疾病において重要な１またはそれ以上の生物学的機能を有する。それゆえ、ポ
リペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定することは有
用である。したがって、さらなる態様において、本発明は、ポリペプチドの機能
またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定するために化合物をスクリーニ
ングする方法を提供する。かかる方法は、上記の本発明の疾病に関して治療的お
よび予防的目的で使用されうるアゴニストまたはアンタゴニストを同定するもの
である。種々のソースから、例えば、細胞、無細胞調合物、化学的ライブラリー
、化合物のコレクション、および天然生成物混合物から化合物を同定してもよい
。かかるいわゆるアゴニストおよびアンタゴニストは天然または修飾された基質
、リガンド、受容体、酵素等、あるいは本発明ポリペプチドの構造または機能を
模倣したもの（Coligan et al.,Current Protocols in Immunology 1(2):Chapte
r5(1991)参照）あるいは小型分子であってもよい。好ましくは、かかる小型分子
は２０００ダルトン未満の分子量、より好ましくは３００ないし１０００ダルト
ンの分子量、最も好ましくは４００ないし７００ダルトンの分子量を有する。こ
れらの小型分子が有機分子であるのが好ましい。

【００３１】 スクリーニング方法は、候補化合物に直接または間接的に結合した標識を用い
て、ポリペプチドあるいはポリペプチドを有する細胞または膜、あるいはその融
合蛋白に対する候補化合物の結合を試験するだけのものであってもよい。あるい
はまた、スクリーニング方法は、標識競争物質（例えば、アゴニストまたはアン
タゴニスト）に対する、ポリペプチドへの候補化合物の競争的結合を測定または
検出（定性的または定量的に）することを含むものであってもよい。さらに、こ
れらのスクリーニング方法は、ポリペプチドを有する細胞に適した検出系を用い
て、候補化合物がポリペプチドの活性化または阻害により発生するシグナルを生
じさせるかどうかを試験するものであってもよい。一般的には、既知アゴニスト
の存在下において活性化の阻害剤をアッセイし、候補化合物の存在による、アゴ
ニストによる活性化に対する影響を観察する。さらに、スクリーニング方法は、
本発明のポリペプチドを含む溶液と候補化合物とを混合して混合物を作成し、混
合物中のＤＫＣＮ１活性を測定し、次いで、混合物のＤＫＣＮ１活性を、候補化
合物不含の対照混合物と比較する工程を含むだけのものであってもよい。 本発明のポリペプチドを慣用的な低処理量スクリーニング法に使用してもよく
、高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）フォーマットに使用してもよい。かかるＨ
ＴＳフォーマットは十分に確立された９６ウェルの、より最近になって３８４ウ
ェルのマイクロタイタープレートのみならず、Schullek et al., Anal. Biochem
., 246, 20-29, (1997)により記載されたナノウェル法のごときエマージング法
（emerging method）をも使用する。

【００３２】 上記のＦｃ部分およびＤＫＣＮ１ポリペプチドから作成されるような融合蛋白
を高処理量スクリーニングアッセイに使用して、本発明のポリペプチドのアンタ
ゴニストを同定することもできる（D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:
52-58 (1995);およびK. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (
1995)参照）。

【００３３】 好ましい具体例において、一時的または安定にＤＫＣＮ１カリウムチャンネル
を発現する細胞を、培地中、標識ルビジウム（８６Ｒｂ）存在下で３時間培養す
る。細胞をタイロード溶液で洗浄して、細胞により取り込まれなかった８６Ｒｂ
を除去する。次いで、潜在的なチャンネルブロッカーまたはオープナーを含むあ
るいは含まないタイロードを適用し、５分間隔で試料を集める。アッセイの終わ
りに細胞を可溶化させた後、細胞中に残っている全８６Ｒｂを測定し、Cherenko
vカウンティングによりすべての試料を測定する。タイロード中でのみインキュ
ベーションされた細胞からの８６Ｒｂ流出分数（fractional）速度の減少または
増加によりオープナーまたはブロッカーを同定することができる。

【００３４】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリペプチドに対する抗体を
用いて、細胞におけるｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生に対する添加化合物の
影響を検出するスクリーニング方法を行ってもよい。例えば、当該分野で知られ
た標準的方法によりモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いてポリ
ペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのＥＬＩＳＡアッセ
イを構築してもよい。これを用いて、適当に処理された細胞または組織からポリ
ペプチドの産生を阻害または促進しうる作用剤（それぞれアンタゴニストまたは
アゴニストとも呼ばれる）を発見することができる。 本発明のポリペプチドを用いて、当該分野で知られた標準的な受容体結合方に
より、膜結合または可溶性受容体（存在するならば）を同定してもよい。これら
の方法、リガンド結合およびクロスリンキングアッセイを包含するが、これらに
限らない。これらの方法において、ポリペプチドを放射性標識（例えば^１２５Ｉ
）、化学修飾（例えばビオチン化）または検出および精製に適したペプチド配列
に融合され、推定上の受容体（例えば細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、身
体材料）の源とともにインキュベーションする。他の方法は表面プラスモン共鳴
および分光学的法法を包含する。これらのスクリーニング方法を用いて、ポリペ
プチドのその受容体への結合と競争するポリペプチドのアゴニストおよびアンタ
ゴニストを同定してもよい。かかるアッセイを行うための標準的方法は当該分野
においてよく知られている。 潜在的なポリペプチドアンタゴニストの他の例は抗体を包含し、あるいはいく
つかの場合には、ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素等の密接に関連
したオリゴヌクレオチドまたは蛋白、あるいは例えばリガンド、基質、受容体、
酵素等のフラグメント、あるいは本発明ポリペプチドに結合するが応答を誘発せ
ず、その結果ポリペプチドの活性を阻害することとなる小型分子を包含する。 スクリーニング法は遺伝子導入法およびＤＫＣＮ１遺伝子の使用を包含する。
トランスジェニック動物の構築の技術は十分に確立されている。例えば、ＤＫＣ
Ｎ１遺伝子をマイクロインジェクションにより受精卵母細胞の雄性前核中に導入
してもよく、移植の前または後の胚にレトロウイルスにより移入させてもよく、
あるいはエレクトロポレーションのごとき手段により遺伝学的に処理された胚性
幹細胞を宿主胚盤胞中に注入してもよい。特に有用なトランスジェニック動物は
いわゆる「ノック−イン」動物であり、当該動物のゲノム中において動物遺伝子
がヒト同等物により置きかえられている。ノック−イントランスジェニック動物
は薬剤発見プロセス、標的確認に有用であり、その場合、化合物はヒト標的に特
異的である。他の有用なトランスジェニック動物はいわゆる「ノック−アウト」
動物であり、該動物において本発明のポリペプチドの動物オーソログであって内
在性ＤＮＡ配列によりコードされているオーソログの発現が不完全または完全に
無くなっている。遺伝子ノック−アウトは特定細胞または組織に対して標的化さ
れてもよく、あるいは当該方法の限界のために特定の細胞または組織中にのみ存
在してもよく、あるいは動物中のすべてまたは実質的にすべての細胞に存在して
もよい。トランスジェニック動物法は全動物発現−クローニング系も提供し、該
系において導入された遺伝子が発現されて大量の本発明のポリペプチドが生じる
。

【００３５】 上記方法に使用されるスクリーニングキットは本発明のさらなる態様を形成す
る。かかるスクリーニングキットは （ａ）本発明のポリペプチド； （ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組み換え細胞； （ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；あるいは （ｄ）好ましくは配列番号：２のポリペプチドである本発明のポリペプチドに対
する抗体 を含む。 いずれかのかかるキットにおいて（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が重要
成分を含んでいてもよいことが理解されるであろう。

【００３６】 用語 下記定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするため
のものである。 本明細書の用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメ
ラ、１本鎖、ならびにヒト化抗体、さらにはＦａｂフラグメントを包含し、Ｆａ
ｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物も包含する。

【００３７】 「単離」とは、「人の手によって」天然の状態から変化させられた、すなわち
、天然物の場合、その本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行われ
たことを意味する。例えば、天然において生体に存在するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質から
分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用いる用語
としての「単離」がなされている。そのうえ、形質転換、遺伝子操作または他の
組み換え法により生物中に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、
生きたあるいは生きていない該生物中にそれが存在しているとしても、「単離」
されたものである。

【００３８】 「ポリヌクレオチド」とは、一般的には、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）ま
たはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を意味し、未修飾または修飾され
たＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および
二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖および三
本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖お
よび二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖も
しくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡお
よびＲＮＡを含むハイブリッド分子を意味するが、これらに限定するものではな
い。さらに、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、ま
たはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。１個またはそれ以上の
修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに安定性またはその他の理由で修飾
した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書の用語「ポリヌクレオチド」
に含まれる。トリチル化塩基およびイノシン等の通常でない塩基は「修飾」され
た塩基に含まれる。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡについて行われているので
、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然において見いだされるようなポリヌク
レオチドのかかる化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイ
ルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、
「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される短いポリヌク
レオチドを包含する。

【００３９】 「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾したペプチド結合により互いに
結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白を意味す
る。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴ
マーとも称される短鎖のもの、および一般的に蛋白と称される長鎖のものの両方
を意味する。ポリペプチドは遺伝子によりコードされた２０種のアミノ酸とは異
なるアミノ酸を含有していてもよい。「ポリペプチド」には、プロセッシングお
よびその他の翻訳後修飾のような天然プロセスにより修飾されたものが含まれる
が、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾される。かかる修飾は基礎的な
参考書およびさらに詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されてお
り、これらは当業者に周知である。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖および
アミノまたはカルボキシル末端等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。同
一の型の修飾は該ポリペプチドのいくつかの部位で、同一または異なる程度で存
在し得ることが理解されよう。また、ポリペプチドは多くの型の修飾をも含み得
る。ポリペプチドは、ユビキチネーションの結果として分枝状となったものであ
ってもよく、ポリペプチドは分枝ありまたはなしの環状のものであってもよい。
環状、分枝状および分枝状かつ環状のポリペプチドは翻訳後の天然プロセスによ
り生じたものであってもよく、あるいは合成的方法により製造されたものであっ
てもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、
フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘
導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール
の共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、交差架橋共
有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カル
ボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化
、ミリストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化
、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カ
ルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギ
ニル化のごときトランスファーＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸の添加、ならびに
ユビキチネーションなどがある。例えばProteins-Structure and Molecular Pro
perties、第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1
993）およびPosttranslational Covalent Modification of Proteins、B.C.John
son編、アカデミックプレス、ニューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslation
al Protein Modifications ：Perspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら
、Meth.Enzymol.182:626-646（1990）およびRattanら、Protein Synthesis：Pos
ttranslational Modifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62（1992
）を参照されたい。

【００４０】 ポリペプチド配列の「フラグメント」とは、対照配列より短いが、対照ポリペ
プチドと同じ生物学的機能または活性を本質的に保持しているポリペプチド配列
をいう。ポリヌクレオチドの「フラグメント」とは、配列番号：１の対照配列よ
りも短いポリヌクレオチド配列をいう。

【００４１】 本明細書中で使用される「変種」なる語は、各々、対照のポリヌクレオチドま
たはポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持しているポリヌクレオチドま
たはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変種は、別の対照のポリ
ヌクレオチドとヌクレオチド配列において異なっている。変種のヌクレオチド配
列における変化は、対照のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド
のアミノ酸配列と変わっていてもよいし、または変わっていなくてもよい。ヌク
レオチドの変化は、後述するように、対照の配列によってコードされたポリペプ
チドにおいて、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断をもたらしうる
。ポリペプチドの典型的な変種は、別の対照のポリペプチドとはアミノ酸配列に
おいて異なっている。一般に、差異は、対照のポリペプチドとその変種の配列が
全体的に非常に類似しており、多くの領域においては同一であるように限定され
る。変種および対照のポリペプチドは、一またはそれ以上の置換、付加、欠失の
いずれかの組み合わせによって、アミノ酸配列において異なってもよい。置換ま
たは挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものであって
もよく、そうでなくてもよい。典型的な保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；
Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ、Ａｒｇ；ならびにＰｈｅおよびＴｙｒ等がある。ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの変種は、対立遺伝子変種のような天然に存在するものであって
もよく、または天然に存在することが知られていない変種であってもよい。ポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変種は、変異誘発法または
直接合成法によって作られてもよい。１またはそれ以上の翻訳後修飾、例えば糖
鎖付加、リン酸化、メチル化、ＡＤＰリボシル化等を有していてもよい。具体例
としてはＮ−末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびスレオニンのリン酸化なら
びにＣ−末端グリシンの修飾等がある。

【００４２】 「対立遺伝子」は、ゲノム中のある位置に存在する２またはそれ以上の別形態
の遺伝子のうちの１つをいう。 「単一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）は、１の集団におけるゲノム中の単一の
ヌクレオチド位置におけるヌクレオチド変化の存在をいう。ＳＮＰは遺伝子中ま
たはゲノムの遺伝子間領域中で起こってもよい。対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ
）を用いてＳＮＰをアッセイすることができる。そのプロセスのためには少なく
とも３個のプライマーが必要である。共通のプライマーをアッセイすべき多型に
対する逆相補物中に使用する。この共通のプライマーは多型塩基から５０ないし
１５００塩基対のところにあってよい。他の２つ（またはそれ以上）のプライマ
ーは、多型を構成している２（またはそれ以上）の対立遺伝子の１つに合致する
ように最後の３’塩基が変化していることを除き、互いに同一である。次いで、
試料ＤＮＡに対して２（またはそれ以上）のＰＣＲ反応を、それぞれ共通のプラ
イマーおよび１の対立遺伝子特異的プライマーを用いて行う。

【００４３】 本明細書の「スプライス変種」とは、最初に同じゲノムＤＮＡ配列から転写さ
れたＲＮＡ分子から生じたｃＤＮＡであるが、別のＲＮＡスプライシングを受け
ているものをいう。一次ＲＮＡ転写物がスプライシングを受ける場合に、別のＲ
ＮＡスプライシングが起こってイントロンが除去され、１以上のｍＲＮＡ分子が
生じ、それぞれ異なるアミノ酸配列をコードしうる。用語「スプライス変種」は
、上記ｃＤＮＡ分子によりコードされる蛋白もいう。

【００４４】 「同一性」は、配列の比較で決定されるような、２またはそれ以上のポリペプ
チド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。
一般的には、同一性は、比較される２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペ
プチド配列の、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の
対応をいう。 「％同一性」−正確な対応がない配列に関して、「％同一性」を決定してもよ
い。一般的には、比較される２つの配列を並置比較して配列間に最大の相関関係
が生じるようにする。並置比較の程度を向上させるために、一方または両方の配
列中に「ギャップ」を挿入してこれを行ってもよい。比較すべき配列の全長にわ
たって％同一性を決定してもよく（いわゆる全体的並置比較）、それは同じまた
は非常に近い長さの配列に適するものであり、一方、短く区切られた長さにも適
するものであり（いわゆる局部的並置比較）、それは等しくない長さの配列にさ
らに適するものである。

【００４５】 「類似性」は、さらに、２つのポリペプチド配列間の関連性についてのより洗
練された尺度である。一般的には、「同一性」は、２つのポリペプチドのアミノ
酸間の残基ベースの比較の尺度を意味し、比較される配列の各残基のペアー間の
正確な対応（同一性に関するもの）のみならず、正確な対応がない場合には進化
論的な根拠に基づいて１の残基が他の残基に置換されているかどうかをも考慮し
たものである。この可能性は関連した「スコア」を有し、それより２つの配列の
「％類似性」を決定することができる。

【００４６】 ２つまたはそれ以上の配列の同一性および類似性を比較する方法は当該分野に
おいてよく知られている。例えば、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Pack
age, version 9.1（Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984
, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USAから利用可能）、BESTFI
TおよびGAPを用いて２つのポリヌクレオチド間の％同一性ならびに２つのポリペ
プチド配列間の％同一性および％類似性を決定してもよい。BESTFITはSmith and
Waterman（J Mol Biol, 147, 195-197, 1981, Advances in Applied Mathemati
cs, 2, 482-489, 1981）の「局部的相同性」アルゴリズムを用い、２つの配列間
の最大同一性を有する１つの領域を見出すものである。BESTFITは、長さが同様
でない２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の比較により適し
たものであり、該プログラムは、短いほうの配列が長いほうの一部であると仮定
するものである。これと比較して、GAPは２つの配列を並置比較し、Needleman a
nd Wunschのアルゴリズム（J Mol Biol, 48, 443-453, 1970）に従って「最大類
似性」を見出すものである。GAPはほぼ同じ長さの配列の比較により適したもの
であり、全長にわたり並置比較が予測される。好ましくは、各プログラムに使用
されるパラメーター「Gap Weight」および「Length Weight」は、ヌクレオチド
配列の場合にはそれぞれ５０および３であり、ポリペプチド配列の場合にはそれ
ぞれ１２および４である。好ましくは、比較される２つの配列が最適に並置比較
される場合に、％同一性および類似性を決定する。 配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムも当該
分野において知られており、例えば、National Center for Biotechnology Info
rmation (NCBI), Bethesda, Maryland, USAから利用可能であり、NCBIのwww.ncb
i.nlm.nih.govからアクセス可能なBLASTファミリーのプログラム（Altschul S F
et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altshul S F et al, Nucleic Acids
Res., 25: 389-3402, 1997）およびWisconsin Sequence Analysis Packageの一
部として利用可能なFASTA（Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99,
1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,
1998)がある。 好ましくは、BLOSUM62アミノ酸置換マトリックス（Henikoff S and Henikoff
J G, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992）を、ヌクレオチド
配列が先ずアミノ酸配列に翻訳され、次いで、比較されることを特徴とするポリ
ペプチド配列比較に使用する。 好ましくは、BESTFITを用いて、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配
列に対して問題となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの％同一性を決定す
る。問題となる配列と対照配列とを最適に並置比較し、上記プログラムのパラメ
ーターをデフォールト値にセットする。

【００４７】 「同一性指数」は配列関連性の尺度であり、これを用いて候補配列（ポリヌク
レオチドまたはポリペプチド）と対照配列を比較してもよい。よって、例えば、
対象ポリヌクレオチド配列と比較して同一性指数０．９５を有する候補ポリヌク
レオチド配列は、候補ポリヌクレオチド配列が対照配列の各１００個のヌクレオ
チドにつき平均して５個までの相違を含んでいてもよいこと以外は、対照配列と
同一である。かかる相違は少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トラン
ジションおよびトランスバージョンを含む）、または挿入からなる群より選択さ
れる。これらの相違は対照ポリヌクレオチド配列の５’または３’末端位置にあ
ってもよく、あるいはこれらの末端位置間のいずれの位置にあってもよく、対照
配列中のヌクレオチドの中に個々にまたは散在してもよく、あるいは対照配列中
の１またはそれ以上の連続した群として存在してもよい。換言すれば、対照ポリ
ヌクレオチド配列と比較して同一性指数０．９５を有するポリヌクレオチド配列
を得るには、上記のごとく、対照配列中のヌクレオチド１００個ごとに平均５個
までのヌクレオチドを欠失、置換または挿入してもよく、あるいはそれらの組み
合わせを行ってもよい。他の同一性指数、例えば０．９６、０．９７、０．９８
および０．９９についても準用して適用できる。 同様に、対象ポリペプチド配列と比較して同一性指数０．９５を有する候補ポ
リペプチド配列は、候補ポリペプチド配列が対照配列の各１００個のアミノ酸に
つき平均して５個までの相違を含んでいてもよいこと以外は、対照配列と同一で
ある。かかる相違は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的および非保
存的置換を含む）、または挿入からなる群より選択される。これらの相違は対照
ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端位置にあってもよく、あるいは
これらの末端位置間のいずれの位置にあってもよく、対照配列中のアミノ酸の中
に個々にまたは散在してもよく、あるいは対照配列中の１またはそれ以上の連続
した群として存在してもよい。換言すれば、対照ポリペプチド配列と比較して同
一性指数０．９５を有するポリペプチド配列を得るには、上記のごとく、対照配
列中のアミノ酸１００個ごとに平均５個までのアミノ酸を欠失、置換または挿入
してもよく、あるいはそれらの組み合わせを行ってもよい。他の同一性指数、例
えば０．９６、０．９７、０．９８および０．９９についても準用して適用でき
る。

【００４８】 ヌクレオチドまたはアミノ酸の相違の数と同一性指数との間の関係を、以下の
等式で表してもよい： ｎ_ａ<ｘ_ａ−（ｘ_ａ・Ｉ） 式中、ｎ_ａはヌクレオチドまたはアミノ酸の相違の数であり、 ｘ_ａは配列番号：１または配列番号：２中のそれぞれヌクレオチドまたはアミノ
酸の総数であり、 Ｉは同一性指数であり、 ・は積の演算子であり、 ｘ_ａとｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘ_ａから差
し引く。

【００４９】 「ホモログ」は、対照配列に対する高度な配列関連性を有するポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチド配列を示すために当該分野において用いられる一般的用語
である。上記の２つの配列間の同一性および／または類似性の程度を決定するこ
とによりかかる関連性を定量してもよい。用語「オーソログ」および「パラログ
」はこの一般的用語に包含される。「オーソログ」は、別の種のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドの機能的同等物であるポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドをいう。「パラログ」は、機能的に類似した同じ種のポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドをいう。

【００５０】 「融合蛋白」は、２種の、しばしば関係のない融合遺伝子またはそのフラグメ
ントによりコードされた蛋白をいう。一例において、ＥＰ−Ａ−０４６４５３３
−Ａには、別のヒト蛋白またはその一部と一緒になった免疫グロブリン分子の不
変領域の種々の部分を含む融合蛋白が開示されている。多くの場合、免疫グロブ
リンのＦｃ領域を融合蛋白の一部分として用いることは治療および診断における
使用に有利であり、例えば、改善された薬物動態学的特性が得られる（例えば、
ＥＰ−Ａ ０２３２２６２参照）。一方、いくつかの用途には、融合蛋白が発現
、検出および精製された後、Ｆｃ部分を欠失できることが望ましいであろう。

【００５１】 本明細書にて引用した特許および特許出願（これらに限らない）を包含するす
べての刊行物および文献を、出典明示により、それぞれが個々に詳細に示されて
いるものとして本明細書に一体化させる。本願が優先権を主張している特許出願
も同様に、出典明示により本明細書に一体化させる。

【００５２】 実施例 実施例１：ｍＲＮＡ分布についてのＴａｑＭａｎ分析 ＴａｑＭａｎ蛍光ＰＣＲ（Perkin Elmer）ならびに種々の脳領域および末梢組
織から調製したヒトｃＤＮＡを用いてＤＫＣＮ１の発現パターンを調べた。製造
者の指示に従って下記オリゴヌクレオチドを用いてすべてのＴａｑＭａｎ分析を
行った： 順プライマー：５’−ＣＣＣ ＡＴＣ ＧＣＣ ＴＡＴ ＴＡＧ ＣＴＣ ＣＡ 逆プライマー：５’−ＣＧＧ ＣＧＴ ＴＴＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＴａｑＭａｎプローブ：５’−ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＴ ＴＡＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＣＣＧ ＡＣＣ ＡＣ ＴａｑＭａｎ実験にて調べた２０種の組織は：脳^＊、下垂体、心臓、肺、肝臓
、胎児肝臓、腎臓、骨格筋、胃、小腸／大腸、脾臓、リンパ球（ＰＢＭＣ）、マ
クロファージ、脂肪、膵臓、前立腺（４人の男性）、胎盤、軟骨、骨（１人の男
性、３人の女性）および骨髄であった。 （^＊脳＝１８の最も異なる脳領域を同じ割合で混合したもので試料の７５％を占
め、試料の２５％が脊髄であった。このアプローチは、小脳サブ領域で特異的に
発現された遺伝子の検出機会を最大にするように設計された。） １９の脳領域をＴａｑＭａｎ実験にて試験した（２人の男性、２人の女性、あ
るいは指示されたごとし）。領域は：扁桃体、尾状核、小脳、帯状回、淡蒼球、
海馬、視床下部、青斑核、内側前頭回、延髄、側座核、海馬傍回、果核、線状、
黒質、上前頭回、視床、脊髄および後根神経節（１人の対照女性、１人の多発性
硬化症の男性、２人の多発性硬化症の女性）であった。 結果は、ＤＫＣＮ１は下垂体および脳、主に小脳において見られ、他の組織に
おいては非常に低レベルであることを示す。

【００５３】 実施例２：卵母細胞における電気生理学的記録 標準的方法を用いて、Xenopus laevisの卵母細胞を取り、解離させ、脱濾胞さ
せた。次いで、個々の脱濾胞卵母細胞の核中にＤＫＣＮ１に関する適当なｃＤＮ
Ａ構築物０．５−１．５ｎｇを注入した。使用したｃＤＮＡ構築物は、ｈ−ＤＫ
ＣＮ１を含むあるいは欠くｐｃＤＮＡ３．１プラスミドであり、後者を対照記録
目的で使用した。注入後、ゲンタマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を補足したBart
hの溶液（ＭＢＳ）中、２２℃で卵母細胞をインキュベーションし、１−４日以
内に電気生理学的記録のために使用した。 電気生理学的記録のために、卵母細胞を記録チャンバ中に入れ、ＮａＣｌ ９
３ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ ５ｍＭ、ＭｇＣｌ_２ １ｍＭおよびＣａ
Ｃｌ_２ １．８ｍＭを含有する溶液を連続的に流した。電極は低抵抗（０．５−
３ＭΩ）であり、３Ｍ ＫＣｌで満たした。ＨＥＫ２９３細胞についての電気生
理学には全細胞パッチクランプ法を用いた。この細胞を倒立顕微鏡のステージに
乗せ、ＮａＣｌ １３０ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、グルコース ３０ｍＭ、ＨＥＰ
ＥＳ １５ｍＭ、ＣａＣｌ_２ ２ｍＭおよびＭｇＣｌ_２ １ｍＭを含有し、Ｎａ
ＯＨでｐＨ７．３とした溶液を連続的に流した。記録ピペット溶液はＫＣｌ１
４０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２ ４ｍＭおよびＥＧＴＡ １０ｍ
Ｍを含有し、ＫＯＨでｐＨ７．３とした。 ｈ−ＤＫＣＮ１を発現する卵母細胞の静止膜電位は−７８．９±４．７ｍＶ（
ｎ＝９）であり、対照ｐｃＤＮＡ３．１を注入された卵母細胞の静止膜電位−３
４．２±２．３ｍＶ（ｎ＝１１）よりも約４４ｍＶ多く分極していた。静止膜電
位の同様の負のシフトがｈ−ＤＫＣＮ１を発現するＨＥＫ２９３細胞においても
観察された。よって、ヒトＤＫＣＮ１チャンネルの発現は静止膜電位をより負の
値にする。このことは、静止膜電位の発生、それゆえ細胞の電気的興奮度の制御
におけるこのチャンネルの役割を示すものである。 このチャンネルを発現する卵母細胞に関して行った電位−クランプ実験におい
てＤＫＣＮ１コンダクタンスの特性をさらに調べた。保持電位−８０ｍＶから、
脱分極的な５００ｍｓの電位パルスは外側への電流の活性化を生じさせた。これ
らの電流はまったく不活性化させるものではなかったが、非常に正の電位（すな
わち、＋５０ｍＶ）であり、わずかな不活性化が見られた。同様の電流は対照の
ｐｃＤＮＡ３．１−注入卵母細胞においては観察されなかった。 ＤＫＣＮ１注入卵母細胞中に存在する電流は、［Ｋ^＋］_０を５ｍＭないし９８
ｍＭの間で変化させること（これを行うためには、Ｎａ^＋をＫ^＋で直接置換した
）により、主にＫ^＋選択的であることが示された。５ｍＭから９８ｍＭへと［Ｋ ^＋ ］を増加させると、電流逆転電位が０ｍＶへとシフトした。逆電位における５
１．１±１．８ｍＶの変化は、［Ｋ^＋］_０における１０倍の変化により得られた
−その値は純粋にカリウム選択的なチャンネルに関するネルンスト等式により予
想された値（５８．２ｍＶ）に近かった。 卵母細胞から記録されたｈ−ＤＫＣＮ１により媒介される電流は、細胞外ｐＨ
を７．４未満に低下させることにより阻害された。ｐＨ５．０付近で最大に近い
阻害が観察された。この効果は、−５０ｍＶないし＋５０ｍＶの間の膜電位にお
いては電位依存性ではなかった。

【００５４】 実施例３：ＨＥＫ２９３細胞における電気生理学的記録 標準的条件下でＨＥＫ２９３細胞を培養し、リポフェクタミンプラス試薬を用
いてｐｃＤＮＡ３．１−h−ＤＫＣＮ１で一時的にトランスフェクションした。
トランスフェクション成功のマーカーとして、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）遺伝子を
含むプラスミドをｐｃＤＮＡ３．１−ｈ−ＤＫＣＮ１と同時トランスフェクショ
ンした。未トランスフェクションおよびＧＦＰのみでトランスフェクションした
ＨＥＫ２９３細胞から対照記録を作成した。 ｈ−ＤＫＣＮ１でトランスフェクションされた卵母細胞（実施例１）と同様の
静止膜電位の負のシフトが、ｈ−ＤＫＣＮ１を発現するＨＥＫ２９３細胞におい
て観察された。よって、ヒトＤＫＣＮ１チャンネルの発現は静止膜電位をより負
の値にする。このことは、静止膜電位を生じさせ、それゆえ細胞の電気的興奮度
を制御することにおけるこのチャンネルの役割を示すものである。 ＤＫＣＮ１でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞からの電位クラン
プ記録を用いて、このチャンネルのキネティクスをさらに特徴づけた。これらの
記録において、保持電位−８０ｍＶから＋６０ｍＶの電位への１００ｍｓの脱分
極試験パルスは非常に迅速な活性化フェーズを伴う電流を誘発し、次いで、時定
数１０．９ １．３ｍｓのよりゆっくりとした活性化コンポーネントを誘発した
。この電流は試験パルス期間において著しく不活性化させるものではなかった。
＋６０ｍＶの試験電位において、これらの電流（１９１８．６ｐＡ ３４４．３
（ｎ＝１１））は、ＧＦＰでトランスフェクションされた野生型ＨＥＫ２９３細
胞から記録された電流（１７９．６ｐＡ ２６．３（ｎ＝８））よりも振幅がか
なり大きかった。

【００５５】 配列の情報

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｃ０８４ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８５ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 33/50 45/00 // Ａ６１Ｋ 39/00 48/00 45/00 Ａ６１Ｐ 9/00 48/00 11/00 Ａ６１Ｐ 9/00 13/12 11/00 15/10 13/12 17/14 15/10 25/00 17/14 25/02 25/00 25/04 25/02 25/06 25/04 25/08 25/06 25/14 25/08 25/16 25/14 25/18 25/16 25/20 25/18 25/22 25/20 25/24 25/22 25/28 25/24 29/00 25/28 29/02 29/00 35/00 29/02 43/00 １１１ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 43/00 １１１ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ (72)発明者 デイビッド・マルコム・ダックワース イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 ロバート・ジェイムズ・ゴッデン イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 コンラッド・ジェラルド・チャップマン イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 ヘレン・ジェーン・メドーズ イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB20 CB01 DA13 DA36 FA16 GC18 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 DA02 DA03 HA15 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ08 QQ53 QQ79 QR36 QR48 QR62 QR77 QS25 QX02 QX05 4B064 AG01 CA19 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93X AA93Y AB01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 AA17 BA44 MA17 MA22 MA23 MA44 MA55 MA66 NA14 ZA022 ZA052 ZA062 ZA082 ZA122 ZA152 ZA162 ZA182 ZA202 ZA222 ZA362 ZA592 ZA812 ZA922 ZB112 ZC412 4C085 AA03 BB11 DD62 EE06 FF24 GG02 GG03 GG04 GG05 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA45 EA21 EA50 FA74

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：１の配列を含むポリヌクレオチドによりコ
   ードされる単離ポリペプチド； （ｂ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を
   有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド； （ｃ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を
   有する単離ポリペプチド；および （ｄ）（ａ）から（ｃ）に記載のポリペプチドのフラグメントおよび変異体 からなる群より選択される単離ポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号：２のポリペプチド配列を含む請求項１記載の単離
   ポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号：２のポリペプチド配列である請求項１記載の単離
   ポリペプチド。
4. 【請求項４】 （ａ）配列番号：１のポリヌクレオチド配列に対して少なく
   とも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド
   ； （ｂ）配列番号：１のポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％の同一性を
   有する単離ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を
   有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌク
   レオチド； （ｄ）配列番号：２のポリペプチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を
   有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する単離ポリヌ
   クレオチド； （ｅ）ストリンジェントな条件下において配列番号：１の配列を有する標識プ
   ローブを用いてスクリーニングすることにより得られる少なくとも１００ヌクレ
   オチドのヌクレオチド配列を伴う単離ポリヌクレオチドまたは少なくとも１５ヌ
   クレオチドを有するそのフラグメント； （ｆ）（ａ）から（ｅ）までに記載のポリヌクレオチドのＲＮＡ同等物である
   ポリヌクレオチド； あるいは上記単離ポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド配列 ならびに上記ポリヌクレオチドの変異体およびフラグメントであるポリヌクレオ
   チドあるいは上記ポリヌクレオチドに対してその全長にわたり相補的なポリヌク
   レオチド からなる群より選択される単離ポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 （ａ）配列番号：１のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌク
   レオチド； （ｂ）配列番号：１の単離ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む
   単離ポリヌクレオチド；および （ｄ）配列番号：２のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド からなる群より選択される請求項４記載の単離ポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 発現ベクターが適合する宿主細胞中に存在する場合に請求項
   １のポリペプチドを生じさせうるポリヌクレオチドを含む発現系。
7. 【請求項７】 請求項６の発現ベクターを含む組み換え宿主細胞または請求
   項１のポリペプチドを発現するその膜。
8. 【請求項８】 請求項１のポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチ
   ドの産生に十分な条件下で請求項７記載の宿主細胞を培養し、次いで、該ポリペ
   プチドを培地から回収することを特徴とする方法。
9. 【請求項９】 請求項１ないし３のいずれかのポリペプチドに対して免疫特
   異的な抗体。
10. 【請求項１０】 請求項１のポリペプチドの機能またはレベルを刺激または
    阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、 （ａ）候補化合物に直接的または間接的に結合した標識を用いることにより、
    ポリペプチド（またはポリペプチドを発現する細胞もしくは膜）またはその融合
    蛋白への候補化合物の結合を定量的または定性的に測定または検出すること； （ｂ）標識競争物質の存在下においてポリペプチド（またはポリペプチドを発
    現する細胞もしくは膜）またはその融合蛋白への候補化合物の結合に対する競争
    を測定すること； （ｃ）ポリペプチドを発現する細胞または細胞膜に適した検出系を用いて、候
    補化合物が、ポリペプチドの活性化または阻害により発生するシグナルを生じさ
    せるかどうかを試験すること； （ｄ）請求項１のポリペプチドを含有する溶液と候補化合物とを混合して混合
    物を得て、混合物中のポリペプチドの活性を測定し、混合物の活性を、候補化合
    物を含まない対照混合物と比較すること；あるいは （ｅ）例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、細胞における該ポリペプチドを
    コードするｍＲＮＡまたは該ポリペプチドの産生に対する候補化合物の影響を検
    出すること からなる群より選択される方法を特徴とする方法。
11. 【請求項１１】 （ａ）配列番号：３の全長にわたり配列番号：３に対して
    少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチ
    ド； （ｂ）配列番号：３のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド；あるい
    は （ｃ）配列番号：３のポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号：４の全長にわたり配列番号：４のアミノ酸配列に対して少な
    くとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含
    む単離ポリヌクレオチド からなる群より選択される単離ポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 （ａ）配列番号：４の全長にわたり配列番号：４のアミノ
    酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプ
    チド； （ｂ）アミノ酸配列が、配列番号：４の全長にわたり配列番号：４のアミノ酸
    配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するものであるポリペプチド； （ｃ）配列番号：４のアミノ酸を含むポリペプチド； （ｄ）配列番号：４のポリペプチドであるポリペプチド；あるいは （ｅ）配列番号：３中に含まれる配列を含むポリヌクレオチドによりコードさ
    れるポリペプチド からなる群より選択されるポリペプチド。