WO2013089152A1 - カチオン性脂質の組み合わせを含有する脂質ナノ粒子 - Google Patents
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- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
Definitions
- the present invention relates to, for example, lipid nanoparticles containing a combination of cationic lipids that facilitate introduction of nucleic acid into cells and the like.
- Cationic lipids are amphiphilic molecules having a lipophilic region containing one or more hydrocarbon groups and a hydrophilic region containing at least one positively charged polar head group.
- Cationic lipids and macromolecules such as nucleic acids form a positively charged complex, making it easier for macromolecules such as nucleic acids to pass through the plasma membrane of the cell and enter the cytoplasm.
- Lipids are useful. This process, which can be performed in vitro and in vivo, is known as transfection.
- cationic lipids are used alone or in combination with neutral lipids such as phospholipids. Combining cationic and neutral lipids is known to be useful because vesicles containing aligned lipid bilayers can be readily formed.
- Many different types of cationic lipids have been synthesized for use in transfection and are currently commercially available. Examples of such cationic lipids include Lipofectin, Lipofectin ACE, Lipofect AMINE, Transfeactam, and DOTAP.
- N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and the like disclosed in Patent Document 1 are cationic lipids that were developed earlier.
- DOTMA and others are characterized by a propanaminium group with a quaternary nitrogen that gives the molecule a cationic site, and a pair of higher hydrocarbons that are ether linked to the propyl backbone of the molecule.
- the quaternary nitrogen is trisubstituted with a relatively short alkyl chain such as a methyl group.
- Structurally similar cationic lipid N- (2,3-di- (9- (Z) -octadecenoyloxy))-prop-1-yl-N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTAP)
- DOTAP N-trimethylammonium chloride
- -Dioleyloxy-N- [2- (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetic acid (DOSPA) etc. provides a quaternary nitrogen that gives the molecule a cationic site It is characterized by having a propanaminium group and a pair of higher hydrocarbons ether-linked to the propyl backbone of the molecule, and the quaternary nitrogen is trisubstituted with a relatively short alkyl chain such as a methyl group and a hydroxyalkyl.
- Patent Document 4 discloses, for example, 1,2-dilinoleyloxy-N, N-dimethylaminopropane (DLinDMA) and the like.
- DLinDMA and others have developed higher functional alkyl groups of DOTAP and DOTMA, which are structurally similar cationic lipids, with the aim of developing more flexible cationic lipids and thereby enhancing membrane fluidity of liposomes. Characterized by a higher alkyl group containing at least two sites.
- Patent Document 5 discloses, for example, 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl- [1,3] -dioxolane (DLin-K-DMA) and the like.
- Patent Document 6 for example, (3R, 4R) -3,4-bis ((Z) -hexadec-9-enyloxy) -1-methylpyrrolidine (Compound 14), N-methyl-N, N -Bis (2-((Z) -octadeca-6-enyloxy) ethyl) amine (compound 36) and the like are disclosed.
- Patent Document 7 discloses a cationic lipid of a simple alkylamine type (a salt thereof) such as N-methyl-N, N-dioleylamine.
- JP 61-161246 A (US Pat. No. 5,049,386) International Publication No. 91/16024 International Publication No. 97/019675 International Publication No. 2005/121348 International Publication No. 2009/086558 International Publication No. 2011/136368 International Publication No. 1998/051278
- An object of the present invention is to provide, for example, lipid nanoparticles for drug delivery containing a cationic lipid that facilitate introduction of a nucleic acid into a cell or the like.
- the present invention relates to the following (1) to (34).
- R 1 and R 2 are the same or different and are linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 10 to 24 carbon atoms, X 1 and X 2 are hydrogen atoms or together form a single bond or alkylene, X 3 is absent or is alkyl having 1 to 6 carbons or alkenyl having 3 to 6 carbons; If X 3 does not exist, Y 1 is not present, L 1 is a single bond, R 3 is a hydrogen atom, alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl having 3 to 6 carbon atoms, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidine -4-yl or the same or different carbon substituted with 1 to 3 amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, pipe
- R 4 and R 5 are the same or different and are linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms, or R 4 and R 5 together are dialkyl.
- X 4 and X 5 are hydrogen atoms or together form a single bond or alkylene,
- X 6 is absent or is alkyl having 1 to 6 carbons or alkenyl having 3 to 6 carbons; If X 6 does not exist, Y 2 is also absent, a and b are 0, L 4 is a single bond, R 6 is alkyl having 1 to 6 carbons, alkenyl having 3 to 6 carbons, pyrrolidin-3-yl, piperidine- 3-yl, piperidin-4-yl or the same or different 1 to 3 amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alk
- R 1 and R 2 are dodecyl, tetradecyl, (Z) -dodec-7-enyl, (Z) -tetradec-7-enyl, (Z) -hexadec-4-enyl, (Z) -hexadeca- 7-enyl, (E) -hexadec-7-enyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (7Z, 10Z) -hexadec-7,10-dienyl, (7Z, 10Z, 13Z) -hexadec-7,
- the lipid nano particles according to (1) above which are 10,13-trienyl, (Z) -octadeca-9-enyl or (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl.
- R 1 and R 2 are both tetradecyl, hexadecyl, (Z) -tetradec-9-enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadec-6-enyl, (Z) -octadeca -9-enyl, (E) -octadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-11-enyl, (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (9Z, 12Z, 15Z) -octadeca-9 , 12,15-trienyl, (Z) -icosa-11-enyl or (11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl.
- L 1 is a single bond
- R 3 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different 1 to 3 amino, monoalkylamino , Dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted alkyl of 1 to 6 carbon atoms or alkenyl of 3 to 6 carbon atoms
- the lipid nano particles according to any one of 1) to (3).
- L 1 is —CO— or —CO—O—
- R 3 is pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different one to three amino, mono Alkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted alkyl of 1 to 6 carbons or alkenyl of 3 to 6 carbons
- the lipid nanoparticles according to any one of (1) to (3), wherein at least one of the substituents is amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl.
- X 1 and X 2 are a hydrogen atom, and R 3 is a hydrogen atom, methyl, or the same or different alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or carbon number substituted with 1 to 3 amino, hydroxy or carbamoyl
- R 3 is a hydrogen atom, methyl, or the same or different alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or carbon number substituted with 1 to 3 amino, hydroxy or carbamoyl
- L 2 and L 3 are —O— or —O—CO—
- R 4 and R 5 are dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, octadecyl, icosyl, docosyl, tetracosyl, (Z) -tetradeca-9 -Enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (E) -octadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-11 -Enyl, (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (9Z, 12Z, 15Z) -octadeca-9,12,15-trienyl, (Z) -icosa-11-enyl, (11Z, 14Z) -Icosa
- L 2 and L 3 are -CO-O-, and R 4 and R 5 are tridecyl, pentadecyl, heptadecyl, nonadecyl, henicosyl, tricosyl, (Z) -tridec-8-enyl, (Z) -Pentadec-8-enyl, (Z) -heptadeca-5-enyl, (Z) -heptadeca-8-enyl, (E) -heptadeca-8-enyl, (Z) -heptadeca-10-enyl, (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl, (8Z, 11Z, 14Z) -octadeca-8,11,14-trienyl, (Z) -nonadec-10-enyl, (10Z, 13Z) -nonadec-10,13 -Dienyl, (11Z, 14Z) -ico
- L 4 is a single bond
- R 6 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different 1 to 3 amino, monoalkylamino , Dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted alkyl of 1 to 6 carbon atoms or alkenyl of 3 to 6 carbon atoms 1.
- the lipid nanoparticle according to any one of (1) to (11).
- L 4 is —CO— or —CO—O—
- R 6 is pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different one to three amino, mono Alkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted alkyl of 1 to 6 carbons or alkenyl of 3 to 6 carbons
- the lipid nanoparticles according to any one of (1) to (11), wherein at least one of the substituents is amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl.
- X 4 and X 5 are each a hydrogen atom, and R 6 is a hydrogen atom, methyl, or the same or different alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or 1 to 6 alkyls or carbon atoms substituted with 1 to 3 amino, hydroxy, or carbamoyl
- R 6 is a hydrogen atom, methyl, or the same or different alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or 1 to 6 alkyls or carbon atoms substituted with 1 to 3 amino, hydroxy, or carbamoyl
- the lipid nanoparticle according to any one of (1) to (13), wherein the lipid nanoparticle is 3 to 6 alkenyl.
- X 4 and X 5 are taken together to form a single bond or alkylene, and R 6 is the same or different and is substituted with 1 to 3 amino, hydroxy, or carbamoyl alkyl having 1 to 6 carbon atoms or
- X 4 and X 5 are hydrogen atoms, and R 6 is the same or different and is substituted with 1 to 3 amino, hydroxy, or carbamoyl, substituted with 1 to 6 carbons or alkenyl with 3 to 6 carbons
- RNA interference RNA interference
- the method according to the above (26) or (27), wherein the method of introducing into cells is a method of introducing into cells by intravenous administration.
- the method according to (29) above, wherein the method of administration is intravenous administration.
- (31) A medicament for use in the treatment of a disease, comprising the lipid nanoparticles according to any one of (1) to (24).
- a therapeutic agent for cancer or inflammatory disease for use in the treatment of cancer or inflammatory disease comprising the lipid nanoparticles according to any one of (1) to (24).
- the nucleic acid can be easily introduced into a cell, for example.
- the amount of CKAP5 mRNA in the tumor 48 hours after administration of the preparations obtained in Example 1 and Comparative Example 1 to MIA PaCa-2 xenograft mice, each corresponding to CKAP5 siRNA 10 mg / kg, is shown.
- the vertical axis shows the relative value of the amount of CKAP5 mRNA with the physiological saline treatment group as 1.
- FIG. 3 shows the change in tumor volume when the preparation obtained in Example 1 was administered to MIA ⁇ ⁇ PaCa-2 xenograft mice on day 0 and day 7 at an amount equivalent to CKAP5 siRNA 10 mg / kg.
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- the horizontal axis indicates the number of days that have passed since the experiment started.
- the amount of Eg5 mRNA in the tumor 48 hours after administration of the preparations obtained in Examples 2 to 5 and Comparative Example 2 to MIA PaCa-2 xenograft mice corresponding to Eg5 siRNA 10 mg / kg is shown.
- the vertical axis shows the relative value of the amount of Eg5 mRNA, taking the physiological saline treatment group as 1.
- FIG. 6 shows the change in tumor volume when the preparation obtained in Example 2 was administered to MIA ⁇ PaCa-2 xenograft mice on the 0th day in an amount equivalent to Eg5 siRNAg10 mg / kg.
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- the horizontal axis indicates the number of days that have passed since the experiment started.
- the symbol ⁇ represents the physiological saline administration group, and the symbol ⁇ represents the administration group of the preparation obtained in Example 2.
- the cationic lipid contained in the lipid nanoparticles of the present invention has the formula (I)
- R 1 and R 2 are the same or different and are linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 10 to 24 carbon atoms, X 1 and X 2 are hydrogen atoms or together form a single bond or alkylene, X 3 is absent or is alkyl having 1 to 6 carbons or alkenyl having 3 to 6 carbons; If X 3 does not exist, Y 1 is not present, L 1 is a single bond, R 3 is a hydrogen atom, alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl having 3 to 6 carbon atoms, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidine -4-yl or the same or different carbon substituted with 1 to 3 amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, pipe
- R 4 and R 5 are the same or different and are linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms, or R 4 and R 5 together are dialkyl.
- X 4 and X 5 are hydrogen atoms or together form a single bond or alkylene,
- X 6 is absent or is alkyl having 1 to 6 carbons or alkenyl having 3 to 6 carbons; If X 6 does not exist, Y 2 is also absent, a and b are 0, L 4 is a single bond, R 6 is alkyl having 1 to 6 carbons, alkenyl having 3 to 6 carbons, pyrrolidin-3-yl, piperidine- 3-yl, piperidin-4-yl or the same or different 1 to 3 amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alk
- examples of the linear or branched alkyl having 10 to 24 carbon atoms include decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, 6,10-dimethylundec-2-yl, Examples include tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, 6,10,14-trimethylpentadecan-2-yl, nonadecyl, icosyl, henicosyl, docosyl, tricosyl, tetracosyl and the like.
- the linear or branched alkenyl having 10 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 10 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 double bonds.
- the linear or branched alkynyl having 10 to 24 carbon atoms is linear or branched having 10 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 triple bonds.
- R 1 and R 2 are more preferably the same linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 10 to 24 carbon atoms.
- R 1 and R 2 are the same or different, linear or branched alkyl or alkenyl having 10 to 24 carbon atoms is more preferable, and linear alkenyl having 10 to 24 carbon atoms is more preferable. preferable.
- examples of the linear or branched alkyl having 12 to 24 carbon atoms include dodecyl, tridecyl, tetradecyl, 2,6,10-trimethylundecyl, pentadecyl, 3, 7,11-trimethyldodecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, 6,10,14-trimethylpentadecan-2-yl, nonadecyl, 2,6,10,14-tetramethylpentadecyl, icosyl, 3,7,11,15 -Tetramethylhexadecyl, henicosyl, docosyl, tricosyl, tetracosyl, etc.
- the linear or branched alkenyl having 12 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 12 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 double bonds.
- the linear or branched alkynyl having 12 to 24 carbon atoms is a straight or branched chain having 12 to 24 carbon atoms containing 1 to 3 triple bonds.
- R 4 and R 5 are more preferably the same linear or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms.
- R 4 and R 5 are the same or different, linear or branched alkyl or alkenyl having 12 to 24 carbon atoms is more preferable, and linear alkenyl having 12 to 24 carbon atoms is more preferable. preferable.
- alkylene examples include methylene, ethylene, propylene and the like.
- alkyl having 1 to 6 carbon atoms examples include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, cyclopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, cyclobutyl, cyclopropylmethyl, pentyl, isopentyl, sec-pentyl, neopentyl, tert-pentyl, cyclopentyl, hexyl, cyclohexyl and the like, preferably methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, sec-pentyl, tert-pentyl, neopentyl, Hexyl and the like, more preferably methyl, ethyl, propyl and the like.
- alkenyl having 3 to 6 carbon atoms examples include allyl, 1-propenyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, and preferably allyl.
- the alkyl moiety in the substituted alkyl having 1 to 6 carbon atoms and the alkenyl moiety in the substituted alkenyl having 3 to 6 carbon atoms have the same meanings as the alkyl having 1 to 6 carbon atoms and the alkenyl having 3 to 6 carbon atoms, respectively. is there.
- alkyl, alkenyl and alkynyl moieties in dialkylmethylene, dialkenylmethylene, dialkynylmethylene or alkylalkenylmethylene are the above linear or branched alkyl having 12 to 24 carbon atoms and linear chain having 12 to 24 carbon atoms, respectively. These are synonymous with linear or branched alkenyl and linear or branched alkynyl having 12 to 24 carbon atoms. It is more preferable that the alkyl, alkenyl and alkynyl moieties in dialkylmethylene, dialkenylmethylene and dialkynylmethylene are the same.
- examples of pharmaceutically acceptable anions include inorganic ions such as chloride ion, bromide ion, nitrate ion, sulfate ion and phosphate ion, acetate ion, oxalate ion, Examples thereof include organic acid ions such as maleate ion, fumarate ion, citrate ion, benzoate ion, and methanesulfonate ion.
- pyrrolidin-2-yl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-2-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, morpholin-2-yl and morpholine-3 -Il includes those in which a hydrogen atom bonded on a nitrogen atom in the ring is converted to methyl or ethyl, respectively.
- Monoalkylamino and dialkylamino are each 1 and the same or different two alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above), or amino, methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidyl or Any amino substituted with morpholinyl-substituted alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above) may be used.
- amino, monoalkylamino, and dialkylamino each represent an ammonio, a monoalkylammonio, and a dialkylammonio, in which a hydrogen ion is coordinated to a lone pair of electrons on the nitrogen atom.
- amino, monoalkylamino and dialkylamino include ammonio, monoalkylammonio and dialkylammonio, respectively.
- Trialkylammonio is the same or different and is substituted with 3 or 1 alkyl (as defined above), or amino, methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl.
- ammonio substituted with alkyl having 1 to 6 carbon atoms for example, trimethylammonio, ethyldimethylammonio, diethylmethylammonio, triethylammonio, tripropylammonio, tributylammonio, Examples include tripentylammonio, trihexylammonio, tris (aminoethyl) ammonio, (aminoethyl) dimethylammonio, bis (aminoethyl) methylammonio, and the like, preferably trimethylammonio, triethylammonio, tris ( Aminoethyl ) Ammonio, (aminoethyl) dimethylammonio, bis (aminoethyl) methylammonio and the like.
- ammonio, monoalkylammonio and dialkylammonio, and trialkylammonio in which a hydrogen ion is coordinated to a lone electron pair on the nitrogen atom of amino, monoalkylamino and dialkylamino are pharmaceutically acceptable.
- a salt may be formed with the obtained anion (as defined above).
- Alkoxy includes alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above), or alkyl having 1 to 6 carbon atoms substituted with amino, methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl (as described above). Hydroxy) substituted with the same meaning), for example, methoxy, ethoxy, propyloxy, butyloxy, pentyloxy, hexyloxy, aminoethoxy, methylaminoethoxy and the like, preferably methoxy, ethoxy, aminoethoxy, methylamino And ethoxy.
- monoalkylcarbamoyl and dialkylcarbamoyl one each and the same or different two alkyl having 1 to 6 carbon atoms (as defined above), or amino, methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, pyrrolidinyl, piperidyl
- any carbamoyl substituted with morpholinyl-substituted alkyl having 1 to 6 carbon atoms for example, methylcarbamoyl, ethylcarbamoyl, propylcarbamoyl, butylcarbamoyl, pentylcarbamoyl, hexylcarbamoyl, dimethylcarbamoyl, Diethylcarbamoyl, ethylmethylcarbamoyl, methylpropylcarbamoyl, butylmethylcarbamoyl, methylp
- X 1 and X 2 are more preferably hydrogen atoms.
- R 1 and R 2 are the same or different and dodecyl, tetradecyl, (Z) -dodec-7-enyl, (Z) -tetradec-7-enyl, (Z) -hexadec-4-enyl, (Z) -hexadec-7-enyl, (E) -hexadeca-7-enyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (7Z, 10Z) -hexadec-7,10-dienyl, (7Z, 10Z, 13Z ) -Hexadeca-7,10,13-trienyl, (Z) -octadeca-9-enyl or (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, preferably the same or different (Z) -tetradeca -7-enyl
- R 3 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different 1 to 3 1 to 6 carbon atoms or 3 to 6 carbon atoms substituted with two amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl More preferably, a hydrogen atom, methyl or alkyl having 1 to 6 carbon atoms or alkenyl having 3 to 6 carbon atoms, which is the same or different and substituted with 1 to 3 amino, hydroxy or carbamoyl, more preferably a hydrogen atom, Most preferred is methyl.
- R 1 and R 2 are the same or different and are tetradecyl, hexadecyl, (Z) -tetradec-9-enyl, ( (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (E) -octadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-11-enyl, ( (9Z, 12Z) -Octadeca-9,12-dienyl, (9Z, 12Z, 15Z) -octadeca-9,12,15-trienyl, (Z) -icosa-11-enyl or (11Z, 14Z) -icosa-11 , 14-dienyl, more preferably (Z) -octadeca-9-
- R 3 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl or 1 to 6 carbon atoms substituted with 1 to 3 amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl, the same or different Alkyl or alkenyl having 3 to 6 carbon atoms is more preferable, and alkyl having 1 to 6 carbon atoms or alkenyl having 3 to 6 carbon atoms substituted with 1 to 3 amino, hydroxy or carbamoyl which is the same or different and is hydrogen atom, methyl or the same or different.
- L 1 is —CO— or —CO—O—, preferably —CO—.
- R 3 is aminomethyl, 1,2-diaminoethyl, 2-aminoethyl, 1,3-diaminopropyl, 1,4-diaminobutyl, 1,5-diaminopentyl, 3-aminopropyl, 4 -Aminobutyl, 5-aminopentyl and the like are more preferred, and most preferred are 1,2-diaminoethyl, 1,3-diaminopropyl, 1,4-diaminobutyl, 1,5-diaminopentyl, R 1 and R 2 may be the same or different from tetradecyl, hexadecyl, (Z) -tetradec-9-enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadec-6-enyl, (Z) -octadeca-9- Enyl, (E) -octadeca-9
- X 3 is alkyl having 1 to 6 carbons or alkenyl having 3 to 6 carbons, preferably methyl. This is one of the more preferable forms.
- L 1 is more preferably a single bond.
- R 3 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different 1 to 3 amino, monoalkyl Amino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted C1-6 alkyl or C3-6 alkenyl Are more preferred, hydrogen atom, methyl, hydroxymethyl, 2-hydroxyethyl, 2,3-dihydroxypropyl, 2-hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl, 2-hydroxy-3-methoxypropyl, aminomethyl, 2-aminoethyl , 3-aminopropyl, 4-aminobutyl, 5-aminopentyl, 2- (N, N-di
- R 3 is pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different 1 to 3 amino groups, Monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted 1-6 alkyl or alkenyl having 3-6 carbons More preferably, at least one of the substituents is amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl, R 3 is aminomethyl, 1,2-diaminoethyl, 2-aminoethyl, 1,3-diaminopropyl, 3-aminopropyl, 1,4-diaminobut
- X 3 does not exist, more preferably methyl, X 3, it is more preferred not to exist.
- R 3 is more preferably methyl.
- One of the more preferred embodiments of the present invention is that X 3 does not exist, Y 1 does not exist, L 1 is a single bond, and R 3 is a hydrogen atom.
- R 1 and R 2 are the same or different and dodecyl, tetradecyl, (Z) -dodec-7-enyl, (Z) -tetradec-7-enyl, (Z) -hexadec-4-enyl, (Z) -hexadec-7-enyl, (E) -hexadec-7-enyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (7Z, 10Z) -hexadec-7,10-dienyl, (7Z, 10Z, 13Z ) -Hexadeca-7,10,13-trienyl, (Z) -octadeca-9-enyl or (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, preferably the same or different (Z) -tetradeca -7-enyl, (Z) -hexadec-7-enyl, or (7Z,
- One of the most preferred and (Z) -hexadec-7-enyl is one of the most preferred and (7Z, 10Z) -hexadec-7,10-dienyl. Most preferred. Further, X 3 is not present, Y 1 is not present, L 1 is a single bond, and R 3 is methyl, which is one of the more preferable embodiments of the present invention.
- R 1 and R 2 are the same or different and dodecyl, tetradecyl, (Z) -dodec-7-enyl, (Z) -tetradec-7-enyl, (Z) -hexadec-4-enyl, (Z) -hexadec-7-enyl, (E) -hexadec-7-enyl, (Z) -hexadec-9-enyl, (7Z, 10Z) -hexadec-7,10-dienyl, (7Z, 10Z, 13Z ) -Hexadeca-7,10,13-trienyl, (Z) -octadeca-9-enyl or (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, preferably the same or different (Z) -tetradeca -7-enyl, (Z) -hexadec-7-enyl, (7Z, 10
- (Z) -tetradec-7-enyl is one of the most preferred and (Z) -hexadeca-7-enyl is one of the most preferred, and (7Z, 10Z) -hexadec-7,10-dienyl It is one of the most preferred, also (9Z, 12Z) - and most preferably octadeca-9,12-dienyl.
- L 2 and L 3 are more preferably the same —O—, —CO—O— or —O—CO—.
- R 4 and R 5 bonded to —O— are the same or different and are dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, octadecyl, icosyl, docosyl, Tetracosyl, (Z) -tetradec-9-enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (E) -octadeca-9- Enyl, (Z) -octadec-11-enyl, (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (9Z, 12Z, 15Z) -octa
- R 4 and R 5 are the same, or R 4 and R 5 together are a dialkylmethylene, dialkenylmethylene or dialkynyl having the same alkyl, alkenyl or alkynyl moiety. More preferably, methylene is formed.
- R 4 and R 5 bonded to —O—CO— are the same or different and are dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, octadecyl, Icosyl, docosyl, tetracosyl, (Z) -tetradec-9-enyl, (Z) -hexadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-6-enyl, (Z) -octadeca-9-enyl, (E)- Octadeca-9-enyl, (Z) -octadeca-11-enyl, (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl, (9Z, 12Z, 15Z) -octadeca-9,12,15-trienyl, (Z ) -Icosa-11-enyl, (11Z
- R 4 and R 5 bonded to —CO—O— are the same or different and are tridecyl, pentadecyl, heptadecyl, nonadecyl, Henicosyl, tricosyl, (Z) -tridec-8-enyl, (Z) -pentadeca-8-enyl, (Z) -heptadeca-5-enyl, (Z) -heptadeca-8-enyl, (E) -heptadeca- 8-enyl, (Z) -heptadeca-10-enyl, (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl, (8Z, 11Z, 14Z) -octadeca-8,11,14-trienyl, (Z)- Nonadeca-10-enyl, (10Z, 13Z) -Nonadeca-10,
- R 4 and R 5 are the same, or R 4 and R 5 together are a dialkylmethylene, dialkenylmethylene or dialkynyl having the same alkyl, alkenyl or alkynyl moiety. More preferably, methylene is formed.
- X 4 and X 5 together form a single bond or alkylene.
- R 6 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl or 1 to 6 carbon atoms substituted with 1 to 3 amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl, the same or different Alkyl or alkenyl having 3 to 6 carbon atoms is more preferable, and alkyl having 1 to 6 carbon atoms or alkenyl having 3 to 6 carbon atoms substituted with 1 to 3 amino, hydroxy or carbamoyl which is the same or different and is hydrogen atom, methyl or the same or different
- hydrogen atom methyl, 2,3-dihydroxypropyl , 3-hydroxypropyl, aminomethyl, 1,2-diaminoethyl, 2-aminoethyl, 1,3-diaminopropyl, 1,4-diaminobutyl, 1,5-diaminopentyl, 3-aminopropyl, 4-amino Most preferred are butyl, 5-aminopentyl, 2-carbamoylethyl and the like. It is also a more preferred form of the invention that when X 4 and X 5 together form a single bond, L 4 is —CO— or —CO—O—, preferably —CO—. One of them.
- L 2 and L 3 are the same —CO—O— or —O—CO—, preferably —CO—O—, and R 6 is methyl.
- R 4 and R 5 are the same or different and are more preferably (Z) -heptadeca-8-enyl or (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl.
- the same (Z) -heptadeca-8-enyl or (8Z, 11Z) -heptadeca-8,11-dienyl is most preferred.
- X 6 is alkyl having 1 to 6 carbons or alkenyl having 3 to 6 carbons, preferably methyl.
- L 2 and L 3 are more preferably the same —CO—O— or —O—CO—, most preferably —CO—O—. preferable.
- R 6 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different 1 to 3 1 to 6 carbon atoms or 3 to 6 carbon atoms substituted with two amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl And more preferably a hydrogen atom, methyl or the same or different alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or alkenyl having 3 to 6 carbon atoms substituted with 1 to 3 amino, hydroxy or carbamoyl, a hydrogen atom, Methyl, 2,3-dihydroxypropyl, 3-hydroxypropyl, amino Til, 1,2-diaminoethyl
- L 4 is more preferably a single bond.
- L 2 and L 3 are more preferably —O—.
- R 6 is a hydrogen atom, methyl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different 1 to 3 amino, monoalkyl Amino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted C1-6 alkyl or C3-6 alkenyl Are more preferred, hydrogen atom, methyl, hydroxymethyl, 2-hydroxyethyl, 2,3-dihydroxypropyl, 2-hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl, 2-hydroxy-3-methoxypropyl, aminomethyl, 2-aminoethyl , 3-aminopropyl, 4-
- R 4 is a single bond
- R 6 is a hydrogen atom
- L 2 and L 3 are the same —CO—O— or —O -CO-, preferably -CO-O- is also one of the more preferred embodiments of the present invention.
- R 4 and R 5 are the same or different and are more preferably (Z) -heptadeca-5-enyl or (Z) -heptadeca-8-enyl, and identically (Z) -heptadeca- Most preferred is 5-enyl or (Z) -heptadeca-8-enyl.
- L 4 is —CO— or —CO—O—
- L 2 and L 3 are more preferably the same —CO—O— or —O—CO—, and —CO—O -Is more preferable.
- R 6 is pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, or the same or different 1 to 3 amino groups, Monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl substituted 1-6 alkyl or alkenyl having 3-6 carbons More preferably, at least one of the substituents is amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl, R
- 1,2-diaminoethyl, 2-aminoethyl, 1,3-diaminopropyl, 3-aminopropyl, 1,4-diaminobutyl, 4-aminobutyl 1,5-diaminopentyl, 5-aminopentyl and the like are most preferable.
- R 6 is aminomethyl, 1-hydroxy-2-aminoethyl, 2-aminoethyl, 1,3-diaminopropyl, 3-aminopropyl, 1,
- 4-diaminobutyl, 4-aminobutyl, 1,5-diaminopentyl, 5-aminopentyl, and L 2 and L 3 are the same —O—.
- R 4 and R 5 are preferably the same or different and are (Z) -octadeca-9-enyl or (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl. Most preferred is) -octadeca-9-enyl or (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl.
- X 6 is preferably absent or methyl.
- R 6 is more preferably methyl
- L 2 and L 3 are more preferably the same —CO—O— or —O—CO—, More preferably, it is CO-O-.
- R 7 and R 8 are the same or different straight or branched alkyl, alkenyl or alkynyl having 12 to 24 carbon atoms of R 4 and R 5 , L 5 and L 6 are —CO—O— or —O—CO—, preferably —CO—O—, a and b are each as defined above, preferably 1.
- R 9 is a hydrogen atom, an alkyl having 1 to 6 carbon atoms or an alkenyl having 3 to 6 carbon atoms of R 6 ), and one of the more preferred compounds (II) is can give.
- X 1 and X 2 are hydrogen atoms, L 1 is a single bond, and X 3 and Y 1 are not present.
- Compound (Ia) can be produced by the following method.
- R 1 , R 2 and R 3 are as defined above, and Z is a chlorine atom, bromine atom, iodine atom, trifluoromethanesulfonyloxy, methanesulfonyloxy, benzenesulfonyloxy, p-toluenesulfonyl (Represents a leaving group such as oxy)
- Step 1 and 2 Compound (IIIb) is obtained by reacting Compound (IIIa) and Compound (IVa) in the absence of a solvent or in a solvent, preferably in the presence of 1 to 10 equivalents of a base, at a temperature between room temperature and 200 ° C. for 5 minutes. It can be produced by processing for up to 100 hours. Furthermore, compound (Ia) is obtained by reacting compound (IIIb) and compound (IVb) in the absence of solvent or in a solvent, and preferably in the presence of 1 to 10 equivalents of a base, at a temperature between room temperature and 200 ° C. It can be produced by treating and isolating for 5 minutes to 100 hours.
- solvent examples include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide, N, N -Dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, pyridine, water and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
- Examples of the base include potassium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium methoxide, potassium tert-butoxide, triethylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7- Undecene (DBU).
- Compound (IIIa) is commercially available or can be obtained by a known method (for example, “Experimental Chemistry Lecture 14 Synthesis of Organic Compounds II”, 5th edition, Maruzen, 2005, p.351) or a method analogous thereto. .
- Compound (IVa) and Compound (IVb) are commercially available products or known methods (for example, ⁇ Experimental Chemistry Course 13 Synthesis of Organic Compounds I '', 5th edition, Maruzen, 2005, p. 374) or a method analogous thereto. Can be obtained at Compound (Ia) in the case where R 1 and R 2 are the same can be obtained by using 2 equivalents or more of compound (IVa) in Step 1.
- Step 3 and 4 Compound (Vb) is obtained by treating compound (Va) and compound (VIa) in a solvent in the presence of 1 to 10 equivalents of a base at a temperature between ⁇ 100 ° C. and 100 ° C. for 5 minutes to 100 hours. Can be manufactured. Further, compound (Vc) is obtained by reacting compound (Vb) and compound (VIb) in the absence of solvent or in a solvent, preferably in the presence of 1 to 10 equivalents of a base, at a temperature between ⁇ 100 ° C. and 100 ° C. And can be produced by treatment for 5 minutes to 100 hours and isolation. Examples of the solvent are the same as those in Production Method 1.
- Examples of the base include sodium hydride, potassium hydride, potassium tert-butoxide, sodium tert-butoxide, lithium diisopropylamide (LDA), lithium hexamethyldisilazide (LHMDS) and the like.
- Compound (Va) is commercially available or can be obtained by a known method (for example, ⁇ Experimental Chemistry Course 16 Synthesis of Organic Compounds IV '', 5th edition, Maruzen, 2005, p. 146) or a method analogous thereto. .
- Compound (VIa) and Compound (VIb) are commercially available products or publicly known methods (for example, ⁇ Experimental Chemistry Course 13 Synthesis of Organic Compounds I '', 5th edition, Maruzen, 2005, p. 374) or a method analogous thereto.
- Can be obtained at Compound (Vc) in the case where R 1 and R 2 are the same can be obtained by using 2 equivalents or more of compound (VIa) in Step 3.
- Process 5 Compound (Ib) is obtained by reacting compound (Vc) in a solvent at a temperature between ⁇ 100 ° C. and 100 ° C. in the presence of 1 equivalent to a large excess of a reducing agent and preferably 0.1 to 10 equivalents of a metal compound. Can be produced by treating for 5 minutes to 100 hours.
- a reducing agent include lithium aluminum hydride, sodium borohydride, sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride and the like.
- the metal compound include cobalt chloride, iron chloride, aluminum chloride and the like.
- L 1 is a single bond
- R 3 is —CHR A R B
- R A and R B are the same or different and each represents a hydrogen atom, alkyl having 1 to 5 carbon atoms, 2 to 5 alkenyl, pyrrolidin-2-yl, pyrrolidin-3-yl, piperidin-2-yl, piperidin-3-yl, piperidin-4-yl, morpholin-2-yl, morpholin-3-yl or the same or different 1 to 5 carbon atoms or carbon atoms substituted with 1 to 3 amino, monoalkylamino, dialkylamino, trialkylammonio, hydroxy, alkoxy, carbamoyl, monoalkylcarbamoyl, dialkylcarbamoyl, pyrrolidinyl, piperidyl or morpholinyl 2-5 alkenyl, or together with adjacent carbon atoms to form pyrrolidin-3-yl, piperidin-3-
- Compound (Ic) is a compound (Id) in which R 3 is a hydrogen atom among compound (Ia) and compound (Ib), preferably 1 to 10 equivalents of compound (VII), and preferably 1 It can be produced by reacting at a temperature between ⁇ 20 ° C. and 150 ° C. for 5 minutes to 72 hours in the presence of an equivalent to a large excess of a reducing agent and preferably 1 to 10 equivalents of an acid.
- Examples of the solvent include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide, N, N -Dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, water and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
- Examples of the reducing agent include sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride and the like.
- Examples of the acid include hydrochloric acid and acetic acid.
- Compound (VII) is a commercially available product or a known method (for example, “Experimental Chemistry Course 15: Synthesis of Organic Compounds III”, 5th Edition, Maruzen, 2005, p. 1, “Experimental Chemistry Course 15: Synthesis of Organic Compounds III” ", 5th edition, Maruzen, 2005, p.153) or equivalent.
- Process 7 Compound (Ie) is obtained by treating Compound (Id) and Compound (VIII) in a solvent at a temperature between ⁇ 20 ° C. and 150 ° C. with 1 equivalent to a large excess of a condensing agent for 5 minutes to 100 hours. Can be manufactured. At this time, the reaction can be promoted by adding preferably 0.01 to 10 equivalents of an additive and / or preferably 1 equivalent to a large excess of a base if necessary.
- solvent examples include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide, N, N -Dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, dimethyl sulfoxide, water and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
- condensing agent examples include 1,3-dicyclohexylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide / hydrochloride, carbonyldiimidazole, benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexaflurane.
- examples thereof include fluorophosphate, O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate, 2-chloro-1-methylpyridinium iodide, and the like.
- the additive include 1-hydroxybenzotriazole, 4-dimethylaminopyridine and the like.
- Examples of the base include potassium acetate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, sodium methoxide, potassium tert-butoxide, triethylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, 1,8-diazabicyclo [ 5.4.0] -7-Undecene.
- Compound (VIII) can be obtained from a commercial product or a known method (for example, “Experimental Chemistry Lecture 16 Synthesis of Organic Compounds IV”, 5th edition, Maruzen, 2005, p. 1) or a similar method.
- Process 8 Compound (If) is compound (Id), compound (IX), in the absence of solvent or in a solvent, preferably in the presence of 1 to 10 equivalents of an additive, and / or preferably 1 to 10 It can be produced by reacting at a temperature between ⁇ 20 ° C. and 150 ° C. for 5 minutes to 72 hours in the presence of an equivalent amount of base.
- the solvent and additive include the same as those in Production Method 4.
- the base include triethylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene and the like.
- Compound (IX) is a commercially available product or a known method (for example, “J. Am. Chem. Soc.” ”(USA), 1981, 103, p.4194. -4199) or a similar method.
- L 1 is a single bond
- R 3 is —CH 2 —C (OH)
- R C R D are the same or different and each represents a hydrogen atom having 1 to 4 carbon atoms.
- Step 9 Compound (Ig) can be produced by treating compound (Id) and compound (X) in a solvent or without solvent at a temperature between 0 ° C. and 230 ° C. for 5 minutes to 100 hours.
- the solvent include methanol, ethanol, 1-propanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide. , N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, dimethyl sulfoxide and the like, and these may be used alone or in combination.
- Compound (X) can be obtained from a commercially available product or a known method (for example, “Experimental Chemistry Course 17: Synthesis of Organic Compounds V”, 5th Edition, Maruzen, 2005, p. 186) or in conformity thereto.
- Compound (Ii) is compound (Ia) or compound (Ib).
- Compound (Ih-A) can be produced by treating compound (Ii) and compound (XI) in a solvent or without solvent at a temperature between 0 ° C. and 230 ° C. for 5 minutes to 100 hours.
- Compound (Ih) can be produced by treating compound (Ih-A) with a Y-type anion exchange resin.
- solvent examples include methanol, ethanol, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, toluene, ethyl acetate, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, dioxane, N, N-dimethylformamide, N, N -Dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, pyridine and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
- Compound (XI) can be obtained from a commercially available product or a known method (for example, Experimental Chemistry Lecture 13, Synthesis of Organic Compounds I ”, 5th Edition, Maruzen, 2005, p. 374) or the like. If Z and Y 1 are the same, (Ih) can be produced by omitting step 11.
- Conversion of the functional group contained in R 1 , R 2 or R 3 in compound (I) can be carried out by a known method (for example, by RC Larock, “Comprehensive Organic Transformations” ", (USA), 2nd edition, method described in Vch Verlagsgesellschaft Mbh, 1999, etc.) or in accordance therewith.
- the intermediates and target compounds in the above production methods are isolated and purified by separation and purification methods commonly used in organic synthetic chemistry, such as filtration, extraction, washing, drying, concentration, recrystallization, and various chromatography. be able to.
- the intermediate can be subjected to the next reaction without any particular purification.
- a hydrogen ion may coordinate to a lone pair on the nitrogen atom in the structure, and the nitrogen atom forms a salt with a pharmaceutically acceptable anion (as defined above).
- Compound (I) also includes a compound in which a hydrogen ion is coordinated to a lone electron pair on the nitrogen atom.
- the case where X 3 does not exist includes the case where hydrogen ions are coordinated.
- Some compounds (I) may have stereoisomers such as geometric isomers and optical isomers, tautomers, etc., but compound (I) includes all possible It includes isomers and mixtures thereof.
- each atom in the compound (I) may be replaced with a corresponding isotope atom, and the compound (I) also includes a compound replaced with these isotope atoms.
- some or all of the hydrogen atoms in compound (I) may be hydrogen atoms having an atomic weight of 2 (deuterium atoms).
- a compound in which a part or all of each atom in compound (I) is replaced with the corresponding isotope atom can be produced by a method similar to the above production methods using commercially available building blocks.
- the compound in which some or all of the hydrogen atoms in the compound (I) are replaced with deuterium atoms is, for example, 1) a method of deuterating carboxylic acid or the like under basic conditions using deuterium peroxide. (See U.S. Pat. No. 3,849,458), 2) A method of deuterating alcohol, carboxylic acid, etc. using iridium complex as a catalyst and deuterium as a deuterium source ("Journal of American Chemical Society” (See J. Am. Chem. Soc.) "(USA), 2002, Vol. 124, No. 10, p. 2092), 3) Using palladium carbon as a catalyst and using only deuterium gas as a deuterium source.
- Compound (II) can be obtained by a method similar to the production method described in International Publication No. 2011/136368.
- a method for introducing and removing a protective group commonly used in organic synthetic chemistry can be used to produce the target compound. Further, the order of reaction steps such as introduction of substituents can be changed as necessary.
- the nucleic acid used in the present invention may be any molecule as long as it is a molecule in which nucleotides and / or molecules having functions equivalent to the nucleotides are polymerized, such as RNA that is a polymer of ribonucleotides, Examples include DNA, which is a polymer of deoxyribonucleotides, chimeric nucleic acids composed of RNA and DNA, and nucleotide polymers in which at least one nucleotide of these nucleic acids is substituted with a molecule having a function equivalent to that of the nucleotide.
- a derivative containing at least one molecule obtained by polymerizing a nucleotide and / or a molecule having a function equivalent to that of the nucleotide is also included in the nucleic acid of the present invention.
- PNA peptide nucleic acid
- OPNA oxypeptide nucleic acid
- PRNA peptide ribonucleic acid
- uridine U in RNA and thymine T in DNA Can be read as different.
- nucleotide derivatives examples include nucleotide derivatives.
- the nucleotide derivative may be any molecule as long as it is a modified molecule, but for example, to improve nuclease resistance or stabilize from other degradation factors compared to RNA or DNA, In order to increase affinity with complementary strand nucleic acid, to increase cell permeability, or to visualize, a molecule in which ribonucleotides or deoxyribonucleotides are modified is preferably used.
- nucleotide derivatives include sugar-modified nucleotides, phosphodiester bond-modified nucleotides, base-modified nucleotides, and the like. As the sugar-modified nucleotide, any or all of the chemical structure of the sugar of the nucleotide may be modified or substituted with any substituent, or substituted with any atom. '-Modified nucleotides are preferably used.
- Examples of the modifying group of the sugar-modified nucleotide include 2′-cyano, 2′-alkyl, 2′-substituted alkyl, 2′-alkenyl, 2′-substituted alkenyl, 2′-halogen and 2′-O-cyano.
- a crosslinked structure-type artificial nucleic acid having a structure in which the modifying group at the 2 ′ position is crosslinked to the carbon atom at the 4 ′ position, more specifically, the oxygen atom at the 2 ′ position and the 4 ′ position Locked Nucleic Acid (LNA) in which the carbon atom at the position is cross-linked via methylene, and Ethylene bridged nucleic acid (ENA) ("Nucleic Acids Research ) ", (UK), 2004, 32, p.e175) and the like are also included in the ribose substituted with a modifying group at the 2'-position in the present invention.
- BNA crosslinked structure-type artificial nucleic acid
- the modifying group of the sugar moiety-modified nucleotide can also define a preferred range based on its size, and the size corresponding to the size of -O-butyl is preferred from the size of fluoro, and the size of -O-methyl To a size corresponding to the size of -O-ethyl is more preferable.
- alkyl in the modifying group of the sugar moiety-modified nucleotide has the same meaning as the alkyl having 1 to 6 carbon atoms in the compound (I).
- Alkenyl in the modifying group of the sugar moiety-modified nucleotide is synonymous with alkenyl having 3 to 6 carbon atoms in compound (I).
- Examples of the halogen in the modifying group of the sugar moiety-modified nucleotide include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
- amino acids in amino acid residues include aliphatic amino acids (specifically, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, etc.), hydroxy amino acids (specifically, serine, threonine, etc.), acidic amino acids (specifically, Is aspartic acid, glutamic acid, etc.), acidic amino acid amide (specifically, asparagine, glutamine, etc.), basic amino acid (specifically, lysine, hydroxylysine, arginine, ornithine, etc.), sulfur-containing amino acid (specifically Cysteine, cystine, methionine, etc.), imino acids (specifically, proline, 4-hydroxyproline, etc.) and the like.
- aliphatic amino acids specifically, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, etc.
- hydroxy amino acids specifically, serine, threonine, etc.
- acidic amino acids specifically, Is aspartic acid
- substituent of the substituted alkyl and the substituted alkenyl in the modified group of the sugar moiety-modified nucleotide include, for example, halogen (as defined above), hydroxy, sulfanyl, amino, oxo, -O-alkyl (the alkyl portion of the -O-alkyl is -S-alkyl (the alkyl part of the -S-alkyl is the same as the alkyl), -NH-alkyl (the alkyl part of the -NH-alkyl is the same as the alkyl), dialkylaminooxy ( Two alkyls of the dialkylaminooxy are the same or different and are the same as the above alkyl), dialkylamino (the two alkyls of the dialkylamino are the same or different and are the same as the alkyl), dialkylaminoalkyleneoxy (the dialkylaminoalkyleneoxy And the two alkyls are the same or different
- the phosphodiester bond-modified nucleotide is any nucleotide that has been modified or substituted with an arbitrary substituent for a part or all of the chemical structure of the phosphodiester bond of the nucleotide, or with any atom.
- a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorothioate bond a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorodithioate bond
- a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with an alkylphosphonate bond or a phosphate
- Examples thereof include nucleotides in which a diester bond is substituted with a phosphoramidate bond.
- any or all of the nucleotide base chemical structure modified or substituted with an arbitrary substituent or substituted with an arbitrary atom may be used.
- oxygen atoms are substituted with sulfur atoms
- hydrogen atoms are substituted with alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms
- methyl groups are substituted with hydrogen atoms or alkyl groups with 2 to 6 carbon atoms
- the amino group is protected with a protecting group such as an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms.
- nucleotide derivative a nucleotide, sugar moiety, a phosphodiester bond or a nucleotide derivative modified with at least one of a base, lipid, phospholipid, phenazine, folate, phenanthridine, anthraquinone, acridine, fluorescein, rhodamine, coumarin, Examples include dyes and other chemical substances added.
- 5′-polyamine addition nucleotide derivatives examples include addition nucleotide derivatives, Cy3 addition nucleotide derivatives, 6-FAM addition nucleotide derivatives, and biotin addition nucleotide derivatives.
- the nucleotide derivative may form a cross-linked structure such as an alkylene structure, a peptide structure, a nucleotide structure, an ether structure, an ester structure, or a structure combining at least one of these with other nucleotides or nucleotide derivatives in the nucleic acid. Good.
- the nucleic acid used in the present invention is preferably a nucleic acid that suppresses the expression of the target gene, and more preferably a nucleic acid that has an action of suppressing the expression of the target gene using RNA interference (RNAi).
- RNAi RNA interference
- the target gene used in the present invention is not particularly limited as long as it is a gene that produces and expresses mRNA, for example, a gene related to tumor or inflammation is preferable, for example, vascular endothelial growth factor (vascular endothelial growth factor, hereinafter (Abbreviated VEGF), vascular endothelial growth factor receptor (vascular endothelial growth factor receptor, hereafter abbreviated as VEGFR), fibroblast growth factor, fibroblast growth factor receptor, platelet-derived growth factor, platelet-derived growth factor receptor, Hepatocyte growth factor, hepatocyte growth factor receptor, Kruppel-like factor (KLF), Ets transcription factor, nuclear factor, hypoxia-inducible factor, cell cycle-related factor, chromosome replication-related factor, chromosome Genes encoding proteins such as repair-related factors, microtubule-related factors, growth signal pathway-related factors, growth-related transcription factors, apoptosis-related factors, etc.
- VEGF vascular endot
- VEGF gene VEGFR gene, fibroblast growth factor gene, fibroblast growth factor receptor gene, platelet-derived growth factor gene, platelet-derived growth factor receptor gene, hepatocyte growth factor gene, liver Cell growth factor receptor gene, KLF gene, Ets transcription factor gene, nuclear factor gene, hypoxia inducible factor gene, cell cycle related factor gene, chromosome replication related factor gene, chromosome repair related factor gene, microtubule related factor gene (e.g. , CKAP5 gene, etc.), growth signal pathway related factor gene (eg, KRAS gene etc.), growth related transcription factor gene, apoptosis related factor (eg, BCL-2 gene etc.) and the like.
- a gene expressed in the liver, lung, kidney or spleen is preferable.
- the above-mentioned gene related to tumor or inflammation hepatitis B virus genome, hepatitis C virus genome , Apolipoprotein (APO), hydroxymethylglutaryl (HMG) CoA reductase, kexin type 9 serine protease (PCSK9), factor 12, glucagon receptor, glucocorticoid receptor, leukotriene receptor, thromboxane A2 receptor,
- APO hydroxymethylglutaryl
- PCSK9 kexin type 9 serine protease
- factor 12 glucagon receptor
- glucocorticoid receptor glucocorticoid receptor
- leukotriene receptor thromboxane A2 receptor
- examples thereof include genes encoding proteins such as histamine H1 receptor, carbonic anhydrase, angiotensin converting enzyme, renin, p53, tyros
- the nucleic acid that suppresses the expression of the target gene includes, for example, a nucleic acid that includes a base sequence complementary to a part of the base sequence of a gene encoding a protein (target gene) and suppresses the expression of the target gene.
- a nucleic acid such as a double-stranded nucleic acid such as siRNA (short interference RNA) or miRNA (micro RNA), a single-stranded nucleic acid such as shRNA (short hairpin RNA), antisense nucleic acid, or ribozyme may be used.
- double-stranded nucleic acids are preferred.
- a nucleic acid containing a base sequence complementary to a part of the base sequence of mRNA of a target gene is called an antisense strand nucleic acid
- a nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence of an antisense strand nucleic acid is a sense strand.
- a sense strand nucleic acid refers to a nucleic acid capable of forming a double strand forming part by pairing with an antisense strand nucleic acid, such as a nucleic acid itself consisting of a partial base sequence of a target gene.
- a double-stranded nucleic acid refers to a nucleic acid in which two strands are paired and have a duplex forming part.
- the duplex forming part refers to a part where nucleotides constituting the double-stranded nucleic acid or a derivative thereof constitute a base pair to form a duplex.
- the base pair constituting the duplex forming part is usually 15 to 27 base pairs, preferably 15 to 25 base pairs, more preferably 15 to 23 base pairs, further preferably 15 to 21 base pairs, and 15 to 19 base pairs. Base pairs are particularly preferred.
- a nucleic acid comprising a partial sequence of the mRNA of the target gene, or 1 to 3 bases, preferably 1 to 2 bases, more preferably 1 base is substituted or missing in the nucleic acid.
- a nucleic acid that is lost or added and has an activity of suppressing the expression of the target protein is preferably used.
- the length of the single-stranded nucleic acid constituting the double-stranded nucleic acid is usually 15 to 30 bases, preferably 15 to 29 bases, more preferably 15 to 27 bases, still more preferably 15 to 25 bases, and 17 to 23 bases. Bases are particularly preferred, with 19-21 bases being most preferred.
- the antisense strand, the sense strand, or both of the nucleic acids constituting the double-stranded nucleic acid have an additional nucleic acid that does not form a duplex on the 3 ′ side or 5 ′ side following the duplex forming part. May be.
- the part that does not form a double chain is also referred to as a protrusion (overhang).
- the double-stranded nucleic acid having a protruding portion one having a protruding portion consisting of 1 to 4 bases, usually 1 to 3 bases at the 3 ′ end or 5 ′ end of at least one strand is used.
- the overhang can have only the antisense strand, only the sense strand, and both the antisense strand and the sense strand, but a double-stranded nucleic acid having an overhang on both the antisense strand and the sense strand is preferably used.
- nucleic acid that suppresses the expression of a target gene for example, a nucleic acid molecule that generates the above double-stranded nucleic acid by the action of a ribonuclease such as Dicer (International Publication No. 2005/089287), a 3 ′ end or a 5 ′ end It is also possible to use a double-stranded nucleic acid that does not have the protruding portion.
- the antisense strand has a sequence of at least the 1st to 17th bases from the 5 ′ end to the 3 ′ end, and the target gene mRNA is continuous 17 It is a base sequence complementary to the base sequence.
- the antisense strand has a sequence of the 1st to 19th bases from the 5 ′ end side to the 3 ′ end side, and the mRNA of the target gene is continuous.
- the base sequence complementary to the 19 base sequence, the base sequence from 1 to 21 is the base sequence complementary to the continuous 21 base sequence of the target gene mRNA, or 1 to The 25th base sequence is a base sequence complementary to the 25 base sequence of the mRNA of the target gene.
- nucleic acid used in the present invention is siRNA
- preferably 10 to 70%, more preferably 15 to 60%, and still more preferably 20 to 50% of the sugar in the nucleic acid is modified at the 2 ′ position.
- Ribose substituted with substituted with a modifying group at the 2′-position of ribose means that the hydroxyl group at the 2′-position is substituted with the modifying group, and the configuration is the same as the hydroxyl group at the 2′-position of ribose. However, the configuration is preferably the same as that of the hydroxyl group at the 2 ′ position of ribose.
- the ribose substituted with the modifying group at the 2 ′ position is included in the 2′-modified nucleotide in the sugar modified nucleotide, and the ribose modifying group substituted with the modifying group at the 2 ′ position is modified with the 2′-modified nucleotide. Synonymous with group.
- the nucleic acid used in the present invention includes a derivative in which an oxygen atom or the like contained in a phosphoric acid part or an ester part in the structure of the nucleic acid is substituted with another atom such as a sulfur atom.
- the sugar that binds to the 5 ′ terminal base of the antisense strand and the sense strand has a 5′-position hydroxyl group, a phosphate group or the aforementioned modifying group, or a phosphate group or a nucleolytic enzyme in vivo. It may be modified by a group that is converted to the above-mentioned modifying group.
- the sugar that binds to the 3 ′ terminal base of the antisense strand and the sense strand has a phosphate group or the above-mentioned modifying group, or a phosphate group or a nucleolytic enzyme in vivo in each 3 ′ position. It may be modified by a group that is converted to the above-mentioned modifying group.
- the single-stranded nucleic acid consists of 15 to 27 bases of the target gene, preferably 15 to 25 bases, more preferably 15 to 23 bases, still more preferably 15 to 21 bases, and particularly preferably 15 to 19 bases.
- a nucleic acid comprising a complementary sequence of the sequence, or a nucleic acid in which 1 to 3 bases, preferably 1 to 2 bases, more preferably 1 base is substituted, deleted or added in the nucleic acid and has an activity of suppressing the expression of the target protein. Any may be used.
- the single-stranded nucleic acid length is 15 to 30 bases or less, preferably 15 to 29 bases, more preferably 15 to 27 bases, still more preferably 15 to 25 bases, particularly preferably 15 to 23 bases. Are preferably used.
- the single-stranded nucleic acid one obtained by linking the antisense strand and the sense strand constituting the double-stranded nucleic acid via a spacer sequence (spacer oligonucleotide) may be used.
- the spacer oligonucleotide is preferably a 6- to 12-base single-stranded nucleic acid molecule, and the sequence at the 5 ′ end is preferably 2 Us.
- An example of the spacer oligonucleotide is a nucleic acid having the sequence UUCAAGAGA. Either the antisense strand or the sense strand connected by the spacer oligonucleotide may be on the 5 ′ side.
- the single-stranded nucleic acid is preferably a single-stranded nucleic acid such as shRNA having a double-strand formation portion with a stem-loop structure.
- Single-stranded nucleic acids such as shRNA are usually 50 to 70 bases in length.
- a nucleic acid having a length of 70 bases or less, preferably 50 bases or less, more preferably 30 bases or less, designed to produce the above single-stranded nucleic acid or double-stranded nucleic acid by the action of ribonuclease or the like may be used. Good.
- the nucleic acid used in the present invention may be produced using a known RNA or DNA synthesis method and RNA or DNA modification method.
- the lipid nanoparticle of the present invention is a lipid nanoparticle containing compound (I) and compound (II).
- the lipid membrane may be a lipid single membrane (lipid monomolecular membrane) or a lipid bilayer membrane (lipid bimolecular membrane).
- the lipid membrane may contain compound (I), compound (II), neutral lipid and / or polymer.
- the complex and / or the lipid membrane may contain a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II).
- the lipid nanoparticles of the present invention include, for example, a complex of a compound (I) and a nucleic acid or the like, or a combination of a compound (I) with a neutral lipid and / or polymer and a nucleic acid and the like. Examples also include lipid nanoparticles composed of a lipid membrane encapsulating the complex and containing the compound (II) in the lipid membrane.
- the lipid membrane in this case may also be a lipid monolayer (lipid monomolecular membrane) or a lipid bilayer membrane (lipid bimolecular membrane).
- the lipid membrane may contain compound (I), neutral lipid and / or polymer. Further, the complex and / or the lipid membrane may contain a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II).
- the lipid nanoparticles of the present invention include, for example, a complex of a compound (II) and a nucleic acid or the like, or a combination of a compound (II) with a neutral lipid and / or polymer and a nucleic acid or the like and Examples also include lipid nanoparticles composed of a lipid membrane encapsulating the complex and containing the compound (I) in the lipid membrane.
- the lipid membrane in this case may also be a lipid monolayer (lipid monomolecular membrane) or a lipid bilayer membrane (lipid bimolecular membrane).
- the lipid membrane may contain compound (II), neutral lipid and / or polymer.
- the complex and / or the lipid membrane may contain a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II).
- the lipid nanoparticles of the present invention include, for example, a complex of a cationic lipid other than compound (I) and compound (II) and a nucleic acid, or a cationic lipid other than compound (I) and compound (II).
- a lipid nanoparticle comprising a complex of a combination of a neutral lipid and / or polymer and a nucleic acid and the like, and a lipid membrane encapsulating the complex, and containing the compound (I) and the compound (II) in the lipid membrane Etc.
- the lipid membrane in this case may also be a lipid monolayer (lipid monomolecular membrane) or a lipid bilayer membrane (lipid bimolecular membrane).
- the lipid membrane may contain a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II), a neutral lipid, and / or a polymer.
- lipid nanoparticles containing a complex of compound (I) and compound (II) and nucleic acid or the like, compound (I) or compound (I) and compound (II) and nucleic acid or the like A lipid nanoparticle comprising a complex and a lipid membrane encapsulating the complex, the compound containing the compound (II) in the lipid membrane, and the compound (I), the compound (II), the compound (I) and the compound (II), Alternatively, a lipid comprising a complex of a cationic lipid other than compound (I) and compound (II) and a nucleic acid and the like and a lipid membrane encapsulating the complex, the lipid membrane containing (I) and compound (II) Nanoparticles are more preferable, lipid nanoparticles containing a complex of compound (I) and compound (II) and nucleic acid, or compound (I), or compound (I) and compound (II) and
- the lipid nanoparticles containing the compound are composed of a complex of the compound (I) and a nucleic acid and the like and a lipid membrane encapsulating the complex, and the lipid membrane contains the compound (I) and the compound (II) Nanoparticles are most preferred.
- the lipid membrane may contain neutral lipid and / or polymer. Further, the complex and / or the lipid membrane may contain a cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II).
- the form of the complex includes a complex of a nucleic acid or the like and a membrane (reverse micelle) composed of a lipid monolayer, a complex of a nucleic acid or the like and a liposome, a complex of a nucleic acid or the like and a micelle, etc.
- a complex of a nucleic acid or the like and a membrane composed of a lipid monolayer or a complex of a nucleic acid or the like and a liposome can be mentioned.
- lipid nanoparticles composed of a complex and a lipid bilayer encapsulating the complex include liposomes composed of the complex and a lipid bilayer encapsulating the complex.
- the lipid nanoparticle of this invention can contain a nucleic acid as a drug, for example, it can also contain the compound chemically approximated with the nucleic acid.
- the lipid nanoparticles of the present invention may use one or more of compound (I) and compound (II), and compound (I) and / or compound (II) Cationic lipids other than compound (I) and compound (II) may be mixed.
- the cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II) include, for example, DOTMA, DOTAP, etc. disclosed in JP-A-61-161246 (US Pat.
- a tertiary amine moiety having two unsubstituted alkyl groups such as DOTMA, DOTAP, DORIE, DOSPA, DLinDMA, DLin-K-DMA, or three unsubstituted alkyl groups.
- a cationic lipid having a quaternary ammonium moiety more preferably a cationic lipid having the tertiary amine moiety.
- the unsubstituted alkyl group at the tertiary amine moiety and the quaternary ammonium moiety is more preferably a methyl group.
- the lipid nanoparticles in the present invention can be produced by a known production method or a similar method, and may be produced by any production method.
- a known liposome preparation method can be applied to the production of a liposome that is one of lipid nanoparticles.
- a known method for preparing liposomes for example, Bangham et al. (“J. Mol. Biol.”), 1965, Vol. 13, p.238-252 ), Ethanol injection method (see “J. Cell” Biol. ”, 1975, 66, pp. 621-634), French press method (“ FB Letters ( FEBS (Lett.) ", 1979, 99, p. 210-214), freeze-thaw method (" Arch. Biochem.
- liposomes for example, an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), for example, an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride can be added. is there.
- an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)
- EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
- isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride
- Liposomes can also be produced by dissolving lipids or the like in an organic solvent such as ethanol and distilling off the solvent, and then adding physiological saline or the like and stirring to form liposomes.
- the lipid nanoparticles of the present invention are, for example, compound (I) and compound (II), or a mixture of compound (I) and compound (II) and a cationic lipid other than compound (I) and compound (II).
- the chloroform layer is further taken out, and polyethylene glycolated phospholipid and neutral Add a lipid and water to form a water-in-oil (W / O) emulsion and process it by reverse-phase evaporation (see Special Table 2002-508765), nucleic acids, etc.
- lipid nanoparticles of the present invention a complex of compound (I) and compound (II) and nucleic acid or the like, or a combination of compound (I) and compound (II) with neutral lipid and / or polymer Liposomes composed of a complex with a nucleic acid and the like and a lipid bilayer membrane encapsulating the complex are produced, for example, according to the production method described in WO 02/28367 and WO 2006/080118. be able to.
- lipid nanoparticles of the present invention for example, a complex of compound (I) and compound (II) and a nucleic acid or the like, or a combination of compound (I) and compound (II) with a neutral lipid and / or polymer And a lipid membrane encapsulating the complex, and the lipid membrane contains a compound (I), a compound (II), and / or a cation other than the compound (I) and the compound (II).
- Lipid nanoparticles containing a functional lipid, a complex of a compound (I) and a nucleic acid, or a combination of a neutral lipid and / or polymer combined with the compound (I) and a nucleic acid, and the complex A lipid membrane containing compound (II) or compound (I) and compound (II), a complex of compound (II) and nucleic acid, or compound (II) Compound of neutral lipid and / or polymer combined with nucleic acid
- lipid nanoparticles containing compound (I) or compound (I) and compound (II) in the lipid membrane, and cations other than compound (I) and compound (II) A complex of a functional lipid and a nucleic acid, or a combination of a cationic lipid other than the compounds (I) and (II) with a neutral lipid and / or a polymer and a nucleic acid, and the complex Lipid nanoparticles comprising a lipid membrane to be
- each complex disperse the complex in water or 0-20% ethanol aqueous solution without dissolving it (solution A), and separately dissolve each lipid membrane component in the ethanol aqueous solution. (Liquid B), mix equal amounts of liquid A and liquid B, and The addition of water can be obtained.
- the compound (I), the compound (II), and the cationic lipid other than the compound (I) and the compound (II) in the liquid A and the liquid B may be used singly or in combination, and each may be combined. You may mix and use.
- a lipid membrane that encapsulates the complex and the lipid membrane contains compound (I), compound (II), and / or a cationic lipid other than compound (I) and compound (II)
- From a nanoparticle a complex of compound (I) and nucleic acid, or a combination of compound (I) with neutral lipid and / or polymer and nucleic acid and a lipid membrane encapsulating the complex
- a lipid nanoparticle comprising a compound (II) or compound (I) and compound (II) in a lipid membrane, a complex of compound (II) and a nucleic acid, etc., or neutral lipid and / or compound (II)
- a complex of a combination of polymers and a nucleic acid or
- a mixture of compound (I) and compound (II) in the lipid membrane that is, a complex of compound (I) and compound (II) and nucleic acid or the like, or a combination of compound (I) and compound (II) with neutral lipid and / or polymer and nucleic acid or the like, and Lipid nanoparticles comprising a lipid membrane encapsulating the complex, and containing a cationic lipid other than compound (I), compound (II), and / or compound (I) and compound (II) in the lipid membrane, compound A complex of (I) and a nucleic acid or the like, or a combination of a compound (I) with a neutral lipid and / or polymer and a nucleic acid or the like, and a lipid membrane encapsulating the complex, and a lipid Lipid nanoparticles containing compound (I) and compound (II) in the membrane, complex of compound (II) and nucle
- a combination of a combination of a neutral lipid and / or polymer with compound (I) and a nucleic acid and the like, and a lipid membrane encapsulating the complex, and the lipid membrane contains compound (I) and compound (II Lipid nanoparticles containing the compound (I) and a nucleic acid or the like, or a compound (I) or a compound (II) and a nucleic acid or the like, and a lipid membrane encapsulating the complex.
- the total number of molecules of the compound (I) in the complex is preferably 0.5 to 8 times the number of phosphorous atoms of the nucleic acid, and 1.5 to 5 times. More preferably, it is 2 to 3 times. Further, the total number of molecules of the cationic lipid other than the compound (I) and the compound (I) in the complex is preferably 0.5 to 8 times the number of phosphorus atoms of the nucleic acid, and 1.5 to 5 It is more preferable that the ratio is 2 times, and it is more preferable that the ratio is 2 to 3 times.
- the total number of molecules of compound (I) in the lipid nanoparticle composed of the complex and the lipid membrane encapsulating the complex is equal to the number of phosphorus atoms in the nucleic acid.
- it is preferably 1 to 15 times, more preferably 2.5 to 10 times, and further preferably 3.5 to 8 times.
- the total number of molecules of the cationic lipid other than the compound (I) and the compound (I) in the lipid nanoparticles is preferably 1 to 15 times the number of phosphorus atoms of the nucleic acid, 2.5 to It is more preferably 10 times, and even more preferably 3.5 to 8 times.
- a nucleic acid (as defined above), preferably a double-stranded nucleic acid and any cationic lipid, preferably compound (I) and / Or a complex with a liposome containing a cationic lipid other than the compound (I) in the present invention is produced, and the complex is dispersed in water or a 0-20% aqueous ethanol solution without dissolving (solution A ),
- any cationic lipid, preferably compound (I) and / or a cationic lipid other than compound (I) in the present invention is dissolved in an aqueous ethanol solution (solution B), and an equivalent amount or volume ratio of 1 : Mixing the A solution and the B solution of 1: or adding water appropriately, lipid nanoparticles containing the nucleic acid and the cationic lipid can be obtained.
- the lipid nanoparticle is preferably a lipid nanoparticle containing a complex of a cationic lipid and a nucleic acid and a lipid membrane encapsulating the complex, and more preferably a lipid nanoparticle containing the nucleic acid and the cationic lipid. It is a lipid nanoparticle containing a complex with a multilayered membrane (reverse micelle) and a lipid membrane encapsulating the complex.
- the lipid membrane in these cases may be a lipid monolayer (lipid monomolecular membrane) or a lipid bilayer membrane (lipid bimolecular membrane).
- the liposome in the complex of the nucleic acid of the present disclosure and the liposome is preferably a liposome whose size is adjusted in advance to an average particle size of 10 nm to 400 nm, more preferably 30 nm to 110 nm, still more preferably 40 nm to 80 nm.
- the complex and / or lipid membrane may contain a neutral lipid and / or a polymer.
- the solution A may have an ethanol concentration of 20 to 40% as long as it can form a complex of liposomes and the nucleic acid.
- the solution may be mixed with solution A and solution B in such a ratio that the aqueous ethanol solution has an ethanol concentration of 30 to 60%. Mixing liquid A and liquid B at a ratio that will result in an ethanol concentration that does not dissolve the complex after mixing liquid and liquid B, and adding water further prevents the cationic lipid in liquid B from dissolving
- the density may be set.
- the complex of a nucleic acid and a liposome in the liquid A of the present disclosure is prepared by mixing a liquid A and a liquid B, and further adding water appropriately, and then a membrane composed of a lipid monolayer containing a cationic lipid ( The morphology is changed to a complex of reverse micelle) and nucleic acid.
- the lipid nanoparticle containing the nucleic acid and the cationic lipid obtained by the production method of the present disclosure is preferably a lipid nanoparticle containing a complex of a cationic lipid and a nucleic acid and a lipid membrane encapsulating the complex.
- the lipid membrane contains a cationic lipid.
- the lipid nanoparticles are excellent in manufacturability (yield and / or homogeneity).
- the total number of cationic lipid molecules in the complex is preferably 0.5 to 8 times the number of phosphorus atoms in the nucleic acid, and 1.5 to 5 It is more preferable that the ratio is twice, and it is more preferable that the ratio is 2 to 3 times.
- the total number of cationic lipid molecules in the complex and the lipid membrane encapsulating the complex is preferably 1 to 15 times, and preferably 2.5 to 10 times the number of phosphorus atoms of the nucleic acid. More preferably, it is 3.5 to 8 times.
- the neutral lipid may be any of simple lipids, complex lipids or derived lipids, and examples thereof include, but are not limited to, phospholipids, glyceroglycolipids, sphingoglycolipids, sphingoids, and sterols.
- the total number of neutral lipid molecules is compound (I) and compound (II), and cationic other than compound (I) and compound (II). It is preferably 0.1 to 1.8 times the total number of lipid molecules, more preferably 0.3 to 1.2 times, and even more preferably 0.4 to 0.9 times.
- the lipid nanoparticles in the present invention may contain a neutral lipid in a complex, may be contained in a lipid membrane that encapsulates the complex, or at least contained in a lipid membrane that encapsulates the complex. More preferably, it is contained in both the complex and the lipid membrane encapsulating the complex.
- phospholipids in neutral lipids include phosphatidylcholine (specifically soybean phosphatidylcholine, egg yolk phosphatidylcholine (EPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), palmitoyloleoylphosphatidylcholine (POPC), dimyristoylphosphatidylcholine).
- EPC egg yolk phosphatidylcholine
- DSPC distearoylphosphatidylcholine
- DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
- POPC palmitoyloleoylphosphatidylcholine
- dimyristoylphosphatidylcholine dimyristoylphosphatidylcholine
- DMPC dioleoylphosphatidylcholine
- phosphatidylethanolamine specifically distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE), dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE), dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE)), Dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE), 16-0-monomethyl PE, 16-0-dimethyl PE, 18-1-trans PE, palmitoyl oleoyl-phosphatidylethanolamine ( POPE), 1 -stearoyl-2-oleoyl-phosphatidylethanolamine (SOPE), etc.), glycerophospholipids (specifically phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, palmitoyloleoylphosphatidylglycerol (POPG), lyso) Phosphati
- Examples of the glyceroglycolipid in the neutral lipid include sulfoxyribosyl glyceride, diglycosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, galactosyl diglyceride, glycosyl diglyceride and the like.
- glycosphingolipid in the neutral lipid examples include galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside, ganglioside, and the like.
- Examples of the sphingoid in the neutral lipid include sphingan, icosasphingan, sphingosine, and derivatives thereof.
- Derivatives include, for example, —NH 2 such as sphingan, icosasphingan, or sphingosine —NHCO (CH 2 ) xCH 3 (wherein x is an integer of 0 to 18, among which 6, 12 or 18 is preferred) And the like converted to.
- sterols in neutral lipids include cholesterol, dihydrocholesterol, lanosterol, ⁇ -sitosterol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, ergocasterol, fucosterol or 3 ⁇ - [N- (N ', N'-dimethyl Aminoethyl) carbamoyl] cholesterol (DC-Chol) and the like.
- macromolecules include proteins, albumin, dextran, polyfect, chitosan, dextran sulfate, such as poly-L-lysine, polyethyleneimine, polyaspartic acid, styrene maleic acid copolymer, isopropylacrylamide-acrylpyrrolidone copolymer
- examples include micelles composed of one or more polymers such as a polymer, a polyethylene glycol-modified dendrimer, polylactic acid, polylactic acid polyglycolic acid or polyethylene glycolated polylactic acid, or a salt thereof.
- the salts in the polymer include, for example, metal salts, ammonium salts, acid addition salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts and the like.
- the metal salt include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt and zinc salt.
- the ammonium salt include salts such as ammonium and tetramethylammonium.
- the acid addition salt include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate or phosphate, and organic acid salts such as acetate, maleate, fumarate or citrate.
- organic amine addition salts include addition salts such as morpholine and piperidine.
- amino acid addition salts include addition salts such as glycine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid or lysine.
- the lipid nanoparticles in the present invention preferably contain a lipid derivative or fatty acid derivative of one or more substances selected from, for example, sugars, peptides, nucleic acids, and water-soluble polymers, or surfactants.
- the lipid derivative or fatty acid derivative or surfactant of one or more substances selected from the sugar, peptide, nucleic acid and water-soluble polymer may be contained in the complex and contained in the lipid membrane encapsulating the complex. More preferably, it is contained in both the complex and the lipid membrane encapsulating the complex.
- the lipid nanoparticles of the present invention contain a lipid derivative or fatty acid derivative of one or more substances selected from saccharides, peptides, nucleic acids, and water-soluble polymers
- the saccharides, peptides, nucleic acids, and water-soluble polymers The total number of molecules of lipid derivatives and fatty acid derivatives of one or more substances selected is 0.05 to 0.3 times the total number of molecules of cationic lipids other than Compound (I), Compound (I) and Compound (I) It is preferably 0.07 to 0.25 times, more preferably 0.1 to 0.2 times.
- the lipid derivative or fatty acid derivative of one or more substances selected from sugars, peptides, nucleic acids, and water-soluble polymers, or the surfactant is preferably a glycolipid or a lipid derivative or fatty acid derivative of a water-soluble polymer. More preferred are lipid derivatives or fatty acid derivatives of water-soluble polymers.
- a lipid derivative or fatty acid derivative of one or more substances selected from sugars, peptides, nucleic acids, and water-soluble polymers, or a surfactant is a part of the molecule with other components of lipid nanoparticles, such as hydrophobic affinity, Substances that have the property of binding by electrostatic interaction, etc., and the other part has the property of binding to the solvent at the time of production of lipid nanoparticles, for example, hydrophilic affinity, electrostatic interaction, etc. Is preferred.
- lipid derivatives or fatty acid derivatives of sugars, peptides, or nucleic acids include sugars such as sucrose, sorbitol, and lactose, such as casein-derived peptides, egg white-derived peptides, soybean-derived peptides, peptides such as glutathione, or DNA, RNA, plasmids, etc.
- Nucleic acids such as siRNA and ODN and neutral lipids mentioned in the definition of lipid nanoparticles or cationic lipids of the present invention or fatty acids such as stearic acid, palmitic acid, myristic acid, lauric acid, etc. And the like.
- examples of the sugar lipid derivative or fatty acid derivative include glyceroglycolipid and glycosphingolipid mentioned in the definition of the lipid nanoparticles.
- water-soluble polymer lipid derivative or fatty acid derivative examples include polyethylene glycol, polyglycerin, polyethyleneimine, polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, polyacrylamide, oligosaccharide, dextrin, water-soluble cellulose, dextran, chondroitin sulfate, polyglycerin, Chitosan, polyvinylpyrrolidone, polyaspartic acid amide, poly-L-lysine, mannan, pullulan, oligoglycerol, etc.
- lipid nanoparticles or the cationic lipids of the present invention neutral lipids mentioned in the definition of the lipid nanoparticles or the cationic lipids of the present invention Or, for example, those formed by binding with fatty acids such as stearic acid, palmitic acid, myristic acid or lauric acid, and salts thereof, more preferably polyethylene glycol derivatives, polyglycerin derivatives.
- fatty acids such as stearic acid, palmitic acid, myristic acid or lauric acid, and salts thereof, more preferably polyethylene glycol derivatives, polyglycerin derivatives.
- lipid derivative or fatty acid derivative of the body such as, more preferably, a lipid derivative or a fatty acid derivative of a polyethylene glycol derivatives and salts thereof.
- lipid derivatives or fatty acid derivatives of polyethylene glycol derivatives include polyethylene glycolated lipids (specifically, polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine (more specifically, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine).
- polyethylene glycol -2000 -N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000] (PEG-DSPE), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000] (PEG-DMPE Etc.), polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, Cremophor EL, etc.), polyethylene glycol sorbitan fatty acid esters (specifically polyoxyethylene sorbitan monooleate, etc.) or polyethylene glycol fatty acid esters, etc. More preferably, polyethylene glycolated lipids are mentioned. .
- lipid derivatives or fatty acid derivatives of polyglycerin derivatives include polyglycerinized lipids (specifically polyglycerin-phosphatidylethanolamine) and polyglycerin fatty acid esters, and more preferably polyglycerinized lipids. can give.
- surfactant examples include polyoxyethylene sorbitan monooleate (specifically, polysorbate 80), polyoxyethylene polyoxypropylene glycol (specifically, Pluronic F68), sorbitan fatty acid ester (specifically, sorbitan) Monolaurate, sorbitan monooleate, etc.), polyoxyethylene derivatives (specifically polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyoxyethylene lauryl alcohol, etc.), glycerin fatty acid ester or polyethylene glycol alkyl ether, etc. are preferred, Examples thereof include polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, glycerin fatty acid ester or polyethylene glycol alkyl ether.
- the lipid nanoparticles of the present invention can be optionally subjected to surface modification with, for example, a polymer, a polyoxyethylene derivative, etc.
- a polymer a polyoxyethylene derivative, etc.
- Rosulic edited by F. Martin, “Stealth Liposomes”. (See Stealth Liposomes) "(USA), CRC Press Inc, 1995, p. 93-102).
- the polymer that can be used for the surface modification include dextran, pullulan, mannan, amylopectin, and hydroxyethyl starch.
- the polyoxyethylene derivative include polysorbate 80, Pluronic F68, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, polyoxyethylene lauryl alcohol, and PEG-DSPE.
- Lipid nanoparticles or fatty acid derivatives of one or more substances selected from sugars, peptides, nucleic acids and water-soluble polymers in the lipid nanoparticles of the present invention, complexes in lipid nanoparticles and lipid membranes by the surface modification, or A surfactant can be contained.
- the targeting ligand can be arbitrarily bonded directly to the surface of the lipid nanoparticle of the present invention by covalently bonding to the polar head residue of the lipid component of the lipid nanoparticle of the present invention (International Publication). (See 2006/116107).
- the average particle size of the lipid nanoparticles in the present invention can be freely selected as desired, but is preferably the following average particle size.
- a method for adjusting the average particle size for example, an extrusion method, a method of mechanically crushing large multilamellar liposomes (MLV) or the like (specifically using a manton gourin, a microfluidizer, etc.) (Müller (RH Muller), S. Benita, B. Bohm, "Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs) ", Scientific Publishers Stuttgart, 1998, p.267-294).
- MLV large multilamellar liposomes
- the average size of the lipid nanoparticles in the present invention is preferably about 10 nm to 1000 nm, more preferably about 30 nm to 300 nm, and further preferably about 50 nm to 200 nm.
- the nucleic acid or the like in the lipid nanoparticles of the present invention can be introduced into the cells.
- the method for administering the lipid nanoparticles of the present invention to mammalian cells in vitro may be performed according to known transfection procedures that can be performed in vitro.
- a method for administering the lipid nanoparticles of the present invention to mammalian cells in vivo may be performed according to known transfection procedures that can be performed in vivo.
- the lipid nanoparticles of the present invention are intravenously administered to mammals including humans, and are delivered to, for example, organs or sites where cancer or inflammation has occurred. Nucleic acids and the like in the particles can be introduced.
- the organ or site where cancer or inflammation has occurred is not particularly limited, and examples thereof include stomach, large intestine, liver, lung, spleen, pancreas, kidney, bladder, skin, blood vessel, and eyeball.
- the lipid nanoparticles of the present invention are intravenously administered to mammals including humans, so that the lipid nanoparticles are delivered to, for example, blood vessels, liver, lungs, spleen and / or kidneys. Nucleic acids and the like in lipid nanoparticles can be introduced. Liver, lung, spleen and / or kidney cells may be normal cells, cells associated with cancer or inflammation or cells associated with other diseases. If the nucleic acid or the like in the lipid nanoparticle of the present invention is a nucleic acid having an inhibitory effect on the expression of a target gene utilizing RNA interference (RNAi), a nucleic acid or the like that suppresses the expression of the gene in a mammalian cell in vivo.
- RNAi RNA interference
- the administration subject is preferably a human.
- the target gene in the lipid nanoparticle of the present invention is a gene related to, for example, a tumor or inflammation
- the lipid nanoparticle of the present invention is used as a therapeutic or preventive agent for cancer or inflammatory disease, preferably a solid cancer or blood vessel.
- it can be used as a therapeutic or prophylactic agent for inflammation in the vicinity of blood vessels.
- the target gene in the lipid nanoparticle of the present invention is a gene related to angiogenesis, the proliferation of vascular smooth muscle and angiogenesis can be suppressed.
- the present invention can be used as a therapeutic or prophylactic agent for cancer or inflammatory diseases accompanied by proliferation of vascular smooth muscle and angiogenesis.
- the cationic lipid of the present invention is used in combination of plural kinds or when used in combination with a cationic lipid other than the cationic lipid of the present invention, compared with the case of using individual cationic lipids alone. Therefore, it is possible to reduce the incidence and degree of undesirable events caused by cationic lipids. That is, the present invention also provides a method for treating cancer or inflammatory diseases, wherein the lipid nanoparticles of the present invention described above are administered to a mammal.
- the administration subject is preferably a person, more preferably a person suffering from cancer or an inflammatory disease.
- the lipid nanoparticles of the present invention can also be used as a tool for verifying the effectiveness of suppressing a target gene in an in vivo drug efficacy evaluation model relating to a therapeutic or preventive agent for cancer or inflammatory diseases.
- the lipid nanoparticle of the present invention is a drug to a tissue or organ containing a stabilization of the nucleic acid, reduction of side effects, or target gene expression site in biological components such as blood components (for example, blood, digestive tract, etc.) It can also be used as a preparation for the purpose of increasing accumulation.
- lipid nanoparticles of the present invention are used as a therapeutic agent or prophylactic agent for pharmaceutical cancer or inflammatory disease, it is desirable to use the most effective administration route for treatment.
- parenteral or oral administration such as internal, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous, preferably intravenous or intramuscular administration, and more preferably intravenous administration.
- the dose varies depending on the disease state, age, administration route, etc. of the administration subject, but may be administered so that the daily dose converted to nucleic acid is about 0.1 ⁇ g to 1000 mg, for example.
- preparations suitable for intravenous administration or intramuscular administration include injections, and the dispersion of lipid nanoparticles prepared by the above-described method can be used as it is, for example, in the form of injections.
- the dispersion can be used after removing the solvent, for example, by filtration, centrifugation, etc., and the dispersion can be used after lyophilization, and / or an excipient such as mannitol, lactose, trehalose, maltose or glycine It is also possible to use the dispersion with lyophilized lyophilized.
- injections for example, water, acid, alkali, various buffers, physiological saline or amino acid infusion, etc.
- an injection can be prepared by adding an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or EDTA or an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride. Moreover, it can also be cryopreserved by adding a cryopreservation agent such as glycerin.
- an antioxidant such as citric acid, ascorbic acid, cysteine or EDTA or an isotonic agent such as glycerin, glucose or sodium chloride.
- a cryopreservation agent such as glycerin.
- Methyldi ((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl) amine (Compound 1) Methylamine (Aldrich, about 2 mol / L tetrahydrofuran solution, 10.5 mL, 21.0 mmol) was added to (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc), 1.03 g, 3.00 mmol) was added, and the mixture was heated and stirred at 150 ° C. for 90 minutes using a microwave reactor.
- reaction solution is diluted with ethyl acetate, washed with 2 mol / L aqueous sodium hydroxide solution and then with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give methyl ((9Z, 12Z) -octadeca A crude product of -9,12-dienyl) amine was obtained.
- the obtained crude product was added to (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc., 0.93 g, 2.70 mmol) and 50% aqueous sodium hydroxide (0.960 g, 12.0 mmol) was added, and the mixture was heated and stirred at 135 ° C. for 60 minutes in an oil bath. After cooling to room temperature, the reaction mixture was diluted with ethyl acetate, washed with water and then saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
- Reference example 2 Methyldi ((Z) -hexadec-9-enyl) amine (Compound 2)
- methylamine manufactured by Aldrich, about 2 mol / L tetrahydrofuran solution, 10.0 mL, 20.0 mmol
- (Z) -hexadec-9-enyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc. (Company, 1.21 g, 3.80 mmol) was used to obtain Compound 2 (0.491 g, 51.6%).
- Reference example 3 Methyldi ((11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl) amine (Compound 3)
- methylamine manufactured by Aldrich, about 2 mol / L tetrahydrofuran solution, 16.0 mL, 32.0 mmol
- (11Z, 14Z) -icosa-11,14-dienyl methanesulfonate (Nu- Chek Prep, Inc., 2.98 g, 8.00 mmol) was used to obtain compound 3 (1.27 g, 54.4%).
- Reference example 4 Di ((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl) amine (Compound 4)
- ammonia manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., approximately 2 mol / L methanol solution, 18.0 mL, 36.0 mmol
- (9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienyl methanesulfonate (Nu -Chek Prep, Inc., 2.79 g, 8.10 mmol) was used to obtain compound 4 (0.838 g, 36.2%).
- Reference Example 5 Di ((Z) -octadeca-9-enyl) amine (Compound 5)
- ammonia manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., about 2 mol / L methanol solution, 12.0 mL, 24.0 mmol
- Z) -octadeca-9-enyl methanesulfonate (Nu-Chek Prep, Inc., 1.87 g, 5.40 mmol) was used to obtain compound 5 (0.562 g, 36.2%).
- Reference Example 9 trans-3,4-bis (((Z) -octadeca-9-enoyloxy) methyl) pyrrolidine (Compound 110)
- Compound 145 (278 mg, 0.366 mmol) obtained in Reference Example 7 was dissolved in dichloromethane (6 mL), trifluoroacetic acid (0.563 mL, 7.31 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours.
- a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added to the reaction mixture, and the aqueous layer was extracted with chloroform. The organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
- the obtained residue was dissolved in a small amount of methanol, adsorbed on the top of BONDESIL-SCX (manufactured by VARIAN, 6 g) packed in a plastic column, washed with methanol, and then ammonia / methanol solution (Tokyo Kasei).
- the target product was eluted with 2 mol / L manufactured by Kogyo Co., Ltd.
- the fraction containing the desired product was concentrated under reduced pressure to obtain Compound 110 (162 mg, 67.2%).
- Reference Example 11 trans-1-methyl-3,4-bis (((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienoyloxy) methyl) pyrrolidine (Compound 117)
- Compound 111 80 mg, 0.12 mmol obtained in Reference Example 10 was dissolved in 1,2-dichloroethane (1.5 mL) and methanol (1.5 mL), formaldehyde (0.091 mL, 1.22 mmol), sodium triacetoxyborohydride (Acros Organics, 129 mg, 0.610 mmol) was added several times and stirred at room temperature for 1.5 hours.
- Comparative Example 1 Using Compound 1 obtained in Reference Example 1, a preparation was produced as follows.
- the nucleic acid used is a sense strand [5′-mGmGAAGCUGGCGAUUAUGCAGAUUmUmA-3 ′ (the sugar attached to the base to which m is attached is a ribose substituted with 2′-O-methyl)] and an antisense strand [ 5′-UAAAUCUGCAUAAUCGCCAGCUUCC-3 ′ (5 ′ end is phosphorylated)], a CKAP5 siRNA that suppresses the expression of the CKAP5 gene, Nippon Easy Co., Gene Design, Invitrogen, or Hokkaido Annealed freeze-dried siRNA was obtained from System Science and prepared to 24 mg / mL by dissolving in distilled water (hereinafter referred to as CKAP5 siRNA solution).
- This suspension was passed through a 0.2 ⁇ m polycarbonate membrane filter and a 0.05 ⁇ m polycarbonate membrane filter at room temperature to obtain a dispersion of lead particles.
- the average particle size of the lead particles obtained by dynamic light scattering (DLS) was measured and confirmed to be within the range of 30 nm to 100 nm.
- DLS dynamic light scattering
- DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, NOF
- the resulting dispersion of cationic lipid / nucleic acid complex particles is mixed at a ratio of 1: 1, and then several times the amount of distilled water is mixed.
- a crude preparation was obtained.
- the obtained crude preparation was concentrated using Amicon Ultra (manufactured by Millipore), further substituted with physiological saline (saline), and filtered in a clean bench using a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.). Further, the siRNA concentration of the obtained preparation was measured, and diluted with a saline solution so that the siRNA concentration was 1.0 mg / mL.
- the average particle size of the lipid nanoparticles in the preparation was 86.0 nm.
- compound 1 / compound 117 / 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (methoxy (polyethylene glycol) -2000) sodium salt PEG-DSPE Na, N- (carbonylmethoxypolyethylene) Glycol 2000
- the resulting dispersion of cationic lipid / nucleic acid complex particles is mixed at a ratio of 1: 1, and then several times the amount of distilled water is mixed.
- a crude preparation was obtained.
- the obtained crude preparation was concentrated using Amicon Ultra (manufactured by Millipore), further substituted with physiological saline (saline), and filtered in a clean bench using a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.). Further, the siRNA concentration of the obtained preparation was measured, and diluted with a saline solution so that the siRNA concentration was 1.0 mg / mL.
- the average particle size of the lipid nanoparticles in the preparation was 93.9 nm.
- Test example 1 The preparations obtained in Example 1 (lipid nanoparticles containing Compound 1, Compound 117 and nucleic acid) and the preparations obtained in Comparative Example 1 (lipid nanoparticles containing Compound 1 and nucleic acid) were respectively subjected to the following methods.
- In vivo mRNA knockdown evaluation test was performed.
- MIA PaCa-2 a human pancreatic cancer-derived cell line, received from JCRB cell bank, contains 10% inactivated fetal calf serum (GIBCO) and 1vol% penicillin-streptomycin (Nacalai Tesque 26253-84)
- the cells were cultured in DMEM (GIBCO, 11995-073) containing high glucose at 37 ° C. and 5% CO 2 .
- MIA PaCa-2 was suspended in PBS to a concentration of 1 ⁇ 10 8 cells / mL, and 100 ⁇ L of this cell suspension was transplanted subcutaneously to the back of SCID mice (received from CLEA Japan) (1 ⁇ 10 7 cells / 0.1mL PBS / head) 6 days after transplantation, the tumor volume was used as an index for grouping as 3 mice, and the preparations obtained in Example 1 and Comparative Example 1 were 10 mg / kg (10 mL / kg).
- mice Intravenously administered to mice using physiological saline as a negative control, administered at 10 mL / kg.Weighed mice before administration and 48 hours after administration.After body weight measurement, mice were euthanized and subcutaneous tumors The removed tumor was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at ⁇ 80 ° C. until use. For the obtained tumor sample, add 1 mL Trizol reagent (Invitrogen, 15596-018) and 5 mm zirconia beads to the 2 mL round-bottom tube containing the sample, and Tissue lyser II (QIAGEN) Crushed under the conditions of 1/25 freq, 1.5 min x 2 times.
- Trizol reagent Invitrogen, 15596-018
- 5 mm zirconia beads 5 mm zirconia beads
- the obtained cDNA sample was diluted 10-fold with dH2O and used as a template for qPCR.
- TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, 4369542) and TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems, 4331182) were used for the qPCR reaction.
- the conditions for the PCR reaction were in accordance with the instruction manual attached to TaqMan Gene Expression.
- the amount of mRNA of the specimen was calculated as a relative ratio when the amount of CKAP5 mRNA was 1 in the physiological saline administration group.
- FIG. 1 shows the amount of CKAP5 mRNA in the tumor 48 hours after administration of siRNA 10 mg / kg for each of the preparations obtained in Example 1 and Comparative Example 1.
- the vertical axis shows the relative value of the amount of CKAP5 mRNA when the physiological saline treatment group is 1.
- Example 1 the preparations obtained in Example 1 and Comparative Example 1 were evaluated in vivo, and the results showed that the CKAP5 gene expression was remarkably suppressed, and the in vivo effect was unexpected. Strongly, it has become clear that those skilled in the art have an unexpected effect that both are useful as lipid nanoparticles for in vivo drug delivery. In particular, it has been shown to have a more unexpected effect of being useful as lipid nanoparticles for in vivo drug delivery to tumors. Also, as is clear from FIG. 1, the formulation obtained in Example 1 (lipid nanoparticles containing compound 1, compound 117 and nucleic acid) facilitates drug delivery into tumor cells in vivo.
- Test example 2 The preparation obtained in Example 1 (lipid nanoparticles containing Compound 1, Compound 117 and nucleic acid) was subjected to a tumor growth evaluation test by the following method.
- the test was carried out using a xenograft model in which MIA PaCa-2, a pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice. Grouping was carried out so that there were 6 mice per group using the tumor volume as an index (Day 0), and the formulation obtained in Example 1 was intravenously administered at 10 mg / kg (10 mL / kg) on Day 0 and Day 7. Saline was administered as 10 mL / kg.
- FIG. 2 shows the change in tumor volume when 10 mg / kg was administered on day 0 and day 7.
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
- the results of the in vivo drug efficacy test of the preparation obtained in Example 1 are The anti-tumor action was strong. Therefore, the lipid nanoparticles of the present invention can introduce nucleic acid into cells and the like, and lipid nanoparticles containing compound (I) and compound (II) deliver drugs well into cells in vivo. It became clear that it was an excellent lipid nanoparticle.
- Comparative Example 2 Using Compound 1 obtained in Reference Example 1, a preparation was produced as follows.
- the nucleic acid used is Eg5 siRNA that suppresses the expression of a commercially available Eg5 gene (manufactured by Invitrogen, catalog number HSS105842). -Contains the base sequence of UUCAGUUCUUACCAGUGUUGAUGGG-3 '.
- An annealed freeze-dried siRNA was obtained from Invitrogen and dissolved in distilled water to prepare 24 mg / mL (hereinafter referred to as Eg5 siRNA solution).
- This suspension was passed through a 0.2 ⁇ m polycarbonate membrane filter and a 0.05 ⁇ m polycarbonate membrane filter at room temperature to obtain a dispersion of lead particles.
- the average particle size of the lead particles obtained by dynamic light scattering (DLS) was measured and confirmed to be within the range of 30 nm to 100 nm.
- DLS dynamic light scattering
- DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, NOF
- the resulting dispersion of cationic lipid / nucleic acid complex particles is mixed at a ratio of 1: 1, and then several times the amount of distilled water is mixed.
- a crude preparation was obtained.
- the obtained crude preparation was concentrated using Amicon Ultra (manufactured by Millipore), further substituted with physiological saline (saline), and filtered in a clean bench using a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.). Further, the siRNA concentration of the obtained preparation was measured, and diluted with a saline solution so that the siRNA concentration was 1.0 mg / mL.
- the average particle size of the lipid nanoparticles in the preparation was 80.3 nm.
- compound 1 / compound 117 / 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (methoxy (polyethylene glycol) -2000) sodium salt PEG-DSPE Na, N- (carbonylmethoxypolyethylene) Glycol 2000
- the resulting dispersion of cationic lipid / nucleic acid complex particles is mixed at a ratio of 1: 1, and then several times the amount of distilled water is mixed.
- a crude preparation was obtained.
- the obtained crude preparation was concentrated using Amicon Ultra (manufactured by Millipore), further substituted with physiological saline (saline), and filtered in a clean bench using a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.). Further, the siRNA concentration of the obtained preparation was measured, and diluted with a saline solution so that the siRNA concentration was 1.0 mg / mL.
- the average particle size of the lipid nanoparticles in the preparation was 80.5 nm.
- DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, NOF
- the resulting dispersion of cationic lipid / nucleic acid complex particles is mixed at a ratio of 1: 1, and then several times the amount of distilled water is mixed.
- a crude preparation was obtained.
- the obtained crude preparation was concentrated using Amicon Ultra (manufactured by Millipore), further substituted with physiological saline (saline), and filtered in a clean bench using a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.). Further, the siRNA concentration of the obtained preparation was measured, and diluted with a saline solution so that the siRNA concentration was 1.0 mg / mL.
- the average particle size of the lipid nanoparticles in the preparation was 79.6 nm.
- the resulting dispersion of cationic lipid / nucleic acid complex particles is mixed at a ratio of 1: 1, and then several times the amount of distilled water is mixed.
- a crude preparation was obtained.
- the obtained crude preparation was concentrated using Amicon Ultra (manufactured by Millipore), further substituted with physiological saline (saline), and filtered in a clean bench using a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.). Further, the siRNA concentration of the obtained preparation was measured, and diluted with a saline solution so that the siRNA concentration was 1.0 mg / mL.
- the average particle size of the lipid nanoparticles in the preparation was 77.6 nm.
- DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
- the resulting dispersion of cationic lipid / nucleic acid complex particles is mixed at a ratio of 1: 1, and then several times the amount of distilled water is mixed.
- a crude preparation was obtained.
- the obtained crude preparation was concentrated using Amicon Ultra (manufactured by Millipore), further substituted with physiological saline (saline), and filtered in a clean bench using a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Toyo Roshi Kaisha, Ltd.). Further, the siRNA concentration of the obtained preparation was measured, and diluted with a saline solution so that the siRNA concentration was 1.0 mg / mL.
- the average particle size of the lipid nanoparticles in the preparation was 81.6 nm.
- Test example 3 Formulations obtained in Examples 2 to 5 (compound 1 and lipid nanoparticles containing compound 117, 116 or 118 and nucleic acid) and preparations obtained in Comparative Example 2 (lipid nanoparticles containing compound 1 and nucleic acid) ), An in vivo mRNA knockdown evaluation test was carried out by the following methods. In the same manner as in Test Example 1, the test was carried out using a xenograft model in which MIA PaCa-2, a pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice.
- mice Six days after transplantation, the mice were divided into groups of 3 animals using the tumor volume as an index, and the preparations obtained in Examples 2 to 5 and Comparative Example 1 were intravenously administered to mice at 10 mg / kg (10 mL / kg). Saline was used as a negative control and was administered at 10 mL / kg. Mice were weighed before administration and 48 hours after administration. After body weight measurement, the mice were euthanized and the subcutaneous tumors were removed. The excised tumor was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at ⁇ 80 ° C. until use.
- FIG. 3 shows the amount of Eg5 mRNA in the tumor 48 hours after administration of siRNA 10 mg / kg for each of the preparations obtained in Examples 2 to 5 and Comparative Example 2.
- the vertical axis represents the relative value of the Eg5 mRNA amount, with the physiological saline treatment group being 1.
- Test example 4 The preparation obtained in Example 2 (lipid nanoparticles containing compound 1, compound 117 and nucleic acid) was subjected to a tumor growth evaluation test by the following method.
- the test was carried out using a xenograft model in which MIA PaCa-2, a pancreatic cancer-derived cell line, was transplanted into SCID mice. Grouping was performed (Day 0) so that there were 5 mice per group using the tumor volume as an index, and the preparation obtained in Example 2 was intravenously administered at 10 mg / kg (10 mL / kg). Saline was administered as 10 mL / kg.
- FIG. 4 shows the change in tumor volume when 10 mg / kg was administered on day 0.
- the vertical axis shows the relative value of the tumor volume with 1 on day 0.
- the horizontal axis indicates the number of days that have elapsed since the start of the experiment.
- the results of the in vivo drug efficacy test of the preparation obtained in Example 2 are as follows: The anti-tumor action was strong. Therefore, the lipid nanoparticles of the present invention can introduce nucleic acid into cells and the like, and lipid nanoparticles containing compound (I) and compound (II) deliver drugs well into cells in vivo. It became clear that it was an excellent lipid nanoparticle.
- the lipid nanoparticles containing the novel cationic lipid and nucleic acid of the present invention are administered to mammals and the like, whereby the nucleic acid can be easily introduced into, for example, cells.
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Abstract
Description
典型的には、カチオン性脂質は、単独で用いられるかまたはリン脂質などの中性脂質と組み合わされる。カチオン性脂質と中性脂質とを組み合わせることは、整列した脂質二重層を含む小胞を容易に形成できることから有用であることが知られている。カチオン性脂質が単独でまたは中性脂質と組み合わされて形成する小胞、またはリポソームは、表面に多数のプラス荷電を有し、この荷電により、ポリヌクレオチドまたはマイナスに帯電したたんぱく質などの他のアニオン分子と複合体を形成できる。ポリヌクレオチド/カチオン性脂質/中性脂質複合体の表面上の残りの総カチオン荷電により、細胞膜表面の主にマイナスの電荷と強い相互反応を起こすことが可能である。
多くの異なる種類のカチオン性脂質が、トランスフェクションに使用するために合成されており、現在市販されている。このようなカチオン性脂質には、例えば、Lipofectin、Lipofectin ACE、Lipofect AMINE、Transfeactam、DOTAP等がある。
特許文献1中で開示される、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)等は、初期に開発されたカチオン性脂質のひとつである。DOTMA等は、分子にカチオン部位を与える、第四級窒素を有するプロパナミニウム基、および分子のプロピルバックボーンにエーテル結合する一対の高級炭化水素により特徴付けられる。第四級窒素は、メチル基などの比較的短鎖のアルキル鎖で三置換されている。構造上類似のカチオン性脂質、N-(2,3-ジ-(9-(Z)-オクタデセノイルオキシ))-プロパ-1-イル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)は、エーテル結合したアルキル基ではなく、アシル基を含む。
特許文献2および3中で開示される、例えば、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DORIE)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸(DOSPA)等は、分子にカチオン部位を与える、第四級窒素を有するプロパナミニウム基、および分子のプロピルバックボーンにエーテル結合する一対の高級炭化水素により特徴付けられ、さらに第四級窒素は、メチル基などの比較的短鎖のアルキル鎖とヒドロキシアルキルで三置換されていることにより特徴付けられる。
特許文献4中には、例えば、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)等が開示されている。DLinDMA等は、より柔軟なカチオン性脂質を開発すること、それによりリポソーム等の膜流動性を高めることを目的に、構造上類似のカチオン性脂質であるDOTAPおよびDOTMAの高級アルキル基を、不飽和部位を少なくとも2ヵ所含む高級アルキル基としたことにより特徴付けられる。また、特許文献5中には、例えば、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)等が開示されている。
また、特許文献6中には、例えば、(3R,4R)-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)-1-メチルピロリジン(化合物14)、N-メチル-N,N-ビス(2-((Z)-オクタデカ-6-エニルオキシ)エチル)アミン(化合物36)等が開示されている。
一方、特許文献7中には、N-メチル-N,N-ジオレイルアミン等の単純アルキルアミン型(の塩)のカチオン性脂質が開示されている。
(1) 式(I)
X1およびX2は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X3は存在しないか、炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルであり、
X3が存在しない場合には、
Y1も存在せず、L1は単結合であり、R3は水素原子、炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであるか、あるいは
Y1も存在せず、L1は-CO-または-CO-O-であり、R3はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、
X3が炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルの場合には、
Y1は製薬上許容し得る陰イオンであり、L1は単結合であり、R3は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質、および式(II)
X4およびX5は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X6は存在しないか、炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルであり、
X6が存在しない場合には、
Y2も存在せず、aおよびbは0であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、L2およびL3は-O-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、かつaとbがともに0ではなく、L4は単結合であり、R6は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、L4は単結合であり、R6は水素原子であり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、あるいは
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、L4は-CO-または-CO-O-であり、R6はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
X6が炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルの場合には、
Y2は製薬上許容し得る陰イオンであり、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-である)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子。
(2) R1およびR2が、ドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルである前記(1)記載の脂質ナノ粒子。
(3) R1およびR2が、ともにテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルである前記(1)記載の脂質ナノ粒子。
(4) L1が単結合であり、R3が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである前記(1)~(3)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(5) L1が-CO-または-CO-O-であり、R3がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルである前記(1)~(3)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(6) X1およびX2が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成する前記(1)~(5)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(7) X1およびX2が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R3が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである前記(1)~(5)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(8) X1およびX2が、水素原子であり、R3が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである前記(1)~(5)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(9) X3が存在しない前記(1)~(8)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(10) L2およびL3が、-O-または-O-CO-であり、R4およびR5が、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである前記(1)~(9)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(11) L2およびL3が、-CO-O-であり、R4およびR5が、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルである前記(1)~(9)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(12) L4が単結合であり、R6が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである前記(1)~(11)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(13) L4が-CO-または-CO-O-であり、R6がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルである前記(1)~(11)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(14) X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成する前記(1)~(13)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(15) X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R6が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである前記(1)~(13)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(16) X4およびX5が、水素原子であり、R6が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである前記(1)~(13)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(17) X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R6が同一または異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシまたはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルである前記(1)~(13)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(18) X4およびX5が、水素原子であり、R6が同一または異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシまたはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルである前記(1)~(13)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(19) X6が存在しないか、メチルである前記(1)~(18)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(20) 薬物として核酸を含有する前記(1)~(19)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(21) カチオン性脂質が、該核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸との複合体を形成している、前記(20)記載の脂質ナノ粒子。
(22) カチオン性脂質が、該核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸との複合体を形成しており、該複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成された前記(20)記載の脂質ナノ粒子。
(23) 核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である前記(20)~(22)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(24) 標的遺伝子が、腫瘍または炎症に関連する遺伝子である前記(23)記載の脂質ナノ粒子。
(25) 前記(20)~(24)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を用いて該核酸を細胞内に導入する方法。
(26) 細胞が、ほ乳類の腫瘍または炎症部位にある細胞である前記(25)記載の方法。
(27) 細胞が、ほ乳類の肝臓、肺、腎臓または脾臓にある細胞である前記(25)または(26)記載の方法。
(28) 細胞内に導入する方法が、静脈内投与によって細胞内に導入する方法である前記(26)または(27)記載の方法。
(29) 前記(1)~(24)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法。
(30) 投与する方法が、静脈内投与である前記(29)記載の方法。
(31) 前記(1)~(24)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を含む、疾患の治療に用いるための医薬。
(32) 静脈内投与用である前記(31)記載の医薬。
(33) 前記(1)~(24)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を含む、癌または炎症疾患の治療に用いるための癌または炎症疾患の治療剤。
(34) 静脈内投与用である前記(33)記載の癌または炎症疾患の治療剤。
X1およびX2は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X3は存在しないか、炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルであり、
X3が存在しない場合には、
Y1も存在せず、L1は単結合であり、R3は水素原子、炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであるか、あるいは
Y1も存在せず、L1は-CO-または-CO-O-であり、R3はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、
X3が炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルの場合には、
Y1は製薬上許容し得る陰イオンであり、L1は単結合であり、R3は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである)で表される化合物、および式(II)
X4およびX5は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X6は存在しないか、炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルであり、
X6が存在しない場合には、
Y2も存在せず、aおよびbは0であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、L2およびL3は-O-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、かつaとbがともに0ではなく、L4は単結合であり、R6は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、L4は単結合であり、R6は水素原子であり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、あるいは
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、L4は-CO-または-CO-O-であり、R6はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
X6が炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルの場合には、
Y2は製薬上許容し得る陰イオンであり、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-である)で表される化合物である。
以下、式(I)および式(II)で表される化合物を、それぞれ化合物(I)および化合物(II)ということもある。他の式番号の化合物についても同様である。
化合物(I)および化合物(II)において、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれ、窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位して、アンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオを形成していてもよく、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれアンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオを包含する。
本発明において、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノの窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位したアンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオ、ならびにトリアルキルアンモニオは、製薬上許容し得る陰イオン(前記と同義)と塩を形成していてもよい。
なお、X1およびX2が、水素原子である場合には、R3が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルがより好ましく、水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルがさらに好ましく、水素原子、メチル等が最も好ましい。
また、X1およびX2が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成する場合には、R3が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルがより好ましく、水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルがさらに好ましく、水素原子、メチル等が最も好ましい。
また、X1およびX2が、一緒になって単結合を形成する場合に、L1が-CO-または-CO-O-、好ましくは-CO-であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R3がアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル等がさらに好ましく、1,2-ジアミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチルであることが最も好ましく、R1およびR2は、同一もしくは異なってテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであることが好ましく、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。
また、X1およびX2が、一緒になって単結合を形成する場合に、X3が炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニル、好ましくはメチルであることも、本発明のより好ましい形態の1つである。
また、L1が単結合の場合には、R3は水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであることがより好ましく、水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシ-3-メトキシプロピル、アミノメチル、2-アミノエチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、2-カルバモイルエチル、2-ジメチルカルバモイルエチル、1-メチルピペリジン-4-イル等がさらに好ましく、水素原子、メチル等が最も好ましい。
なお、X3が存在せず、Y1も存在せず、L1が単結合で、R3が水素原子であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R1およびR2は、同一または異なってドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが好ましく、同一または異なって(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニルまたは(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-テトラデカ-7-エニルであることが最も好ましいうちの1つであり、また(Z)-ヘキサデカ-7-エニルであることが最も好ましいうちの1つであり、また(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルであることが最も好ましい。
また、X3が存在せず、Y1も存在せず、L1が単結合で、R3がメチルであることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R1およびR2は、同一または異なってドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが好ましく、同一または異なって(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-テトラデカ-7-エニルであることが最も好ましいうちの1つであり、また(Z)-ヘキサデカ-7-エニルであることが最も好ましいうちの1つであり、また(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルであることが最も好ましいうちの1つであり、また(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。
また、L2およびL3の少なくとも1つが、-O-である場合には、-O-に結合するR4およびR5は、同一もしくは異なってドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルであるか、またはR4およびR5が、一緒になってジアルキルメチレンもしくはジアルケニルメチレンを形成することがより好ましく、R4およびR5が、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであるか、またはR4およびR5が、一緒になってジ(テトラデシル)メチレン、ジ(ヘキサデシル)メチレン、ジ(オクタデシル)メチレン、ジ((Z)-ヘキサデカ-9-エニル)メチレン、ジ((Z)-オクタデカ-6-エニル)メチレン、ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)メチレン、ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)メチレンを形成することがさらに好ましく、R4およびR5が、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。なお、いずれの場合も、R4およびR5は、同一であるか、またはR4およびR5が、一緒になってアルキル、アルケニルもしくはアルキニル部分が同一であるジアルキルメチレン、ジアルケニルメチレンもしくはジアルキニルメチレンを形成することがさらに好ましい。
なお、aおよびbが、同時に1である場合には、X4およびX5は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成することがより好ましい。また、aおよびbが、同時に1であり、L4が単結合の場合には、L2およびL3が、-CO-O-であることも本発明のより好ましい形態の一つである。
また、X4およびX5が、一緒になって単結合を形成する場合に、L4が-CO-または-CO-O-、好ましくは-CO-であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R6がアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル等がさらに好ましく、1,2-ジアミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチルであることが最も好ましい。
また、X4およびX5が、一緒になって単結合を形成する場合に、aおよびbは、同一または異なって1~3、好ましくは1であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合に、L2およびL3が、同一の-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であり、R6がメチルであることも、本発明のさらに好ましい形態の1つであり、その場合には、R4およびR5は、同一もしくは異なって(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることが最も好ましい。
また、X4およびX5が、一緒になって単結合を形成する場合に、X6が炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニル、好ましくはメチルであることも、本発明のより好ましい形態の1つである、この場合、L2およびL3は、同一の-CO-O-または-O-CO-であることがさらに好ましく、-CO-O-であることが最も好ましい。
また、L4が単結合の場合には、R6は水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであることがより好ましく、水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシ-3-メトキシプロピル、アミノメチル、2-アミノエチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、2-カルバモイルエチル、2-ジメチルカルバモイルエチル、1-メチルピペリジン-4-イル等がさらに好ましく、水素原子、メチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-アミノエチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-カルバモイルエチル等が最も好ましく、いずれの場合も、L2およびL3は、-O-であることがより好ましい。
なお、X6が存在せず、Y2も存在せず、L4が単結合で、R6が水素原子の場合には、L2およびL3が、同一の-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R4およびR5は、同一もしくは異なって(Z)-ヘプタデカ-5-エニルまたは(Z)-ヘプタデカ-8-エニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘプタデカ-5-エニルまたは(Z)-ヘプタデカ-8-エニルであることが最も好ましい。
また、L4が-CO-または-CO-O-の場合には、R6はピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルであることがより好ましく、R6はアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチル、(N,N-ジメチルアミノ)メチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、1-アミノ-2-ヒドロキシエチル等がさらに好ましく、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチル等が最も好ましい。
L4が-CO-または-CO-O-の場合に、R6がアミノメチル、1-ヒドロキシ-2-アミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチルであり、L2およびL3は、同一の-O-であることも、本発明のさらに好ましい形態の1つである。この場合には、R4およびR5は、同一もしくは異なって(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。
L5およびL6は、-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であり、
aおよびbは、それぞれ前記と同義であり、好ましくは1であり、
R9はR6のうちの、水素原子、炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルである)で表される化合物(ii)が、より好ましい化合物(II)の1つとしてあげられる。
化合物(I)のうち、X1およびX2が水素原子であり、L1は単結合であり、X3およびY1は存在しない、化合物(Ia)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(IIIb)は、化合物(IIIa)と化合物(IVa)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1~10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間~100時間処理することにより製造することができる。さらに、化合物(Ia)は、化合物(IIIb)と化合物(IVb)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1~10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間~100時間処理し、単離することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)等があげられる。
化合物(IIIa)は、市販品または公知の方法(例えば、「実験化学講座14 有機化合物の合成II」、第5版、丸善、2005年、p.351)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(IVa)および化合物(IVb)は、市販品または公知の方法(例えば、「実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、丸善、2005年、p.374)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
R1とR2が同一の場合の化合物(Ia)は、工程1において、2当量以上の化合物(IVa)を用いることで得ることができる。
化合物(I)のうち、X1およびX2が、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、L1は単結合であり、X3およびY1は存在しない、化合物(Ib)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(Vb)は、化合物(Va)と化合物(VIa)を溶媒中、1~10当量の塩基の存在下、-100℃と100℃の間の温度で、5分間~100時間処理することにより製造することができる。さらに、化合物(Vc)は、化合物(Vb)と化合物(VIb)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1~10当量の塩基の存在下、-100℃と100℃の間の温度で、5分間~100時間処理し、単離することにより製造することができる。
溶媒としては、製造法1と同じものがあげられる。
塩基としては、例えば水素化ナトリウム、水素化カリウム、カリウムtert-ブトキシド、ナトリウムtert-ブトキシド、リチウムジイソプロピルアミド(LDA)、リチウムヘキサメチルジシラジド(LHMDS)などがあげられる。
化合物(Va)は、市販品または公知の方法(例えば、「実験化学講座16 有機化合物の合成IV」、第5版、丸善、2005年、p.146)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(VIa)および化合物(VIb)は、市販品または公知の方法(例えば、「実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、丸善、2005年、p.374)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
R1とR2が同一の場合の化合物(Vc)は、工程3において、2当量以上の化合物(VIa)を用いることで得ることができる。
化合物(Ib)は、化合物(Vc)を溶媒中、1当量~大過剰量の還元剤および必要により好ましくは0.1~10当量の金属化合物の存在下、-100℃と100℃の間の温度で、5分間~100時間処理することにより製造することができる。
還元剤としては、例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム等があげられる。
金属化合物としては、例えば塩化コバルト、塩化鉄、塩化アルミニウム等があげられる。
化合物(I)のうち、L1は単結合であり、R3は-CHRARB(RAおよびRBは、同一または異なって水素原子、炭素数1~5のアルキル、炭素数2~5のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~5のアルキルもしくは炭素数2~5のアルケニルであるか、または隣接する炭素原子と一緒になってピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イルもしくはピペリジン-4-イルを形成し、RAおよびRBが、ともに水素原子である場合を除き、RAおよびRBのアルキル、置換されたアルキルのアルキル部分、アルケニルおよび置換されたアルケニルのアルケニル部分の炭素数の総和は1~5であり、RAおよびRBのいずれかが、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルまたはモルホリン-3-イルである場合には、該RAおよびRBのもう一方は、水素原子、炭素数1~5のアルキル、炭素数2~5のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1つもしくは2つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~5のアルキルもしくは炭素数3~5のアルケニルであり、RAおよびRBが、置換されたアルキルまたはアルケニルである場合には、該置換基の総数は2または3である)であり、X3およびY1が存在しない、化合物(Ic)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(Ic)は、化合物(Ia)および化合物(Ib)のうちのR3が水素原子である化合物(Id)を、好ましくは1~10当量の化合物(VII)と、溶媒中、好ましくは1当量~大過剰量の還元剤および必要により好ましくは1~10当量の酸の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間~72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
還元剤としては、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム等があげられる。
酸としては、例えば塩酸、酢酸等があげられる。
化合物(I)のうち、L1が-CO-で、X3およびY1が存在しない、化合物(Ie)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(Ie)は、化合物(Id)と化合物(VIII)とを溶媒中で、-20℃と150℃の間の温度で、1当量~大過剰量の縮合剤で5分間から100時間処理することにより製造することができる。このとき、必要により好ましくは0.01~10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1当量~大過剰量の塩基を加え、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
縮合剤としては、例えば1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスファート、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート、ヨウ化 2-クロロ-1-メチルピリジニウム等があげられる。
添加剤としては、例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、4-ジメチルアミノピリジン等があげられる。
塩基としては、例えば酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン等があげられる。
化合物(I)のうち、L1が-CO-O-で、X3およびY1が存在しない、化合物(If)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(If)は、化合物(Id)を、化合物(IX)と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1~10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1~10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間~72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒および添加剤としては、製造法4と同じものがあげられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン等があげられる。
化合物(I)のうち、L1は単結合であり、R3は-CH2-C(OH)RCRD(RCおよびRDは、同一または異なって水素原子、炭素数1~4のアルキル、炭素数2~4のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1つもしくは2つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~4のアルキルもしくは炭素数2~4のアルケニルであり、RCおよびRDが、ともに水素原子である場合を除き、RCおよびRDのアルキル、置換されたアルキルのアルキル部分、アルケニルおよび置換されたアルケニルのアルケニル部分の炭素数の総和は1~4であり、RCおよびRDのいずれかが、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルまたはモルホリン-3-イルである場合には、該RCおよびRDのもう一方は水素原子、炭素数1~4のアルキル、炭素数2~4のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは1つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~4のアルキルもしくは炭素数2~4のアルケニルであり、RCおよびRDが、置換されたアルキルまたはアルケニルである場合には、該置換基の総数は2である)であり、X3およびY1が存在しない、化合物(Ig)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(Ig)は、化合物(Id)と化合物(X)を溶媒中または無溶媒で、0℃と230℃の間の温度で、5分間から100時間処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
化合物(I)のうち、L1が単結合であり、X3が炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルであり、Y1が製薬上許容し得る陰イオンである化合物(Ih)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(Ii)は、化合物(Ia)または化合物(Ib)である。
化合物(Ih-A)は、化合物(Ii)と化合物(XI)を溶媒中または無溶媒で、0℃と230℃の間の温度で、5分間から100時間処理することにより製造することができる。化合物(Ih)は、化合物(Ih-A)をY型の陰イオン交換樹脂で処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
また、ZとY1が同一の場合には、工程11を省略することにより(Ih)を製造することができる。
上記各製造法における中間体および目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、ろ過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
化合物(I)の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、化合物(I)は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
化合物(I)中の各原子の一部またはすべては、それぞれ対応する同位体原子で置き換わっていてもよく、化合物(I)は、これら同位体原子で置き換わった化合物も包含する。例えば、化合物(I)中の水素原子の一部またはすべては、原子量2の水素原子(重水素原子)であってもよい。
化合物(I)中の各原子の一部またはすべてが、それぞれ対応する同位体原子で置き換わった化合物は、市販のビルディングブロックを用いて、上記各製造法と同様な方法で製造することができる。また、化合物(I)中の水素原子の一部またはすべてが重水素原子で置き換わった化合物は、例えば、1)過酸化重水素を用い、塩基性条件下にカルボン酸などを重水素化する方法(米国特許第3849458号明細書参照)、2)イリジウム錯体を触媒として用い、重水を重水素源として用いてアルコール、カルボン酸などを重水素化する方法("ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ(J. Am. Chem. Soc.)"、(米国)、 2002年、124巻、10号、p.2092参照)、3)パラジウムカーボンを触媒として用い、重水素源として重水素ガスのみを用いて脂肪酸を重水素化する方法("リピッズ(LIPIDS)、(米国)、1974年、9巻、11号、p.913参照)、4)白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウムなどの金属を触媒として用い、重水または重水および重水素ガスを重水素源として用いて、アクリル酸、アクリル酸メチル、メタクリル酸、メタクリル酸メチルなどを重水素化する方法(特公平5-19536号公報、特開昭61-277648号公報および特開昭61-275241号公報参照)、5)パラジウム、ニッケル、銅または亜クロム酸銅などの触媒を用い、重水を重水素源として用いて、アクリル酸、メタクリル酸メチルなどを重水素化する方法(特開昭63-198638号公報参照)などを用いて合成することもできる。
なお、化合物(II)において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法(例えば、グリーン(T.W.Greene)著、"プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(Protective Groups in Organic Synthesis)"、(米国)、第3版、ジョン・ウィリーアンドソンズ・インク(John Wiley&Sons Inc.)、1999年等に記載の方法)等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入などの反応工程の順序を変えることもできる。
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性を向上させるかもしくはその他の分解因子から安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基として、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキルが好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチル)アミノオキシ]エチル、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2’-Se-メチル等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ等がさらに好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチルがもっとも好ましい。
また、糖部修飾ヌクレオチドの修飾基は、その大きさから好ましい範囲を定義することもでき、フルオロの大きさから-O-ブチルの大きさに相当するものが好ましく、-O-メチルの大きさから-O-エチルの大きさに相当する大きさのものがより好ましい。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるアルケニルは、化合物(I)における炭素数3~6のアルケニルと同義である。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
アミノ酸残基におけるアミノ酸としては、例えば脂肪族アミノ酸(具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等)、ヒドロキシアミノ酸(具体的には、セリン、トレオニン等)、酸性アミノ酸(具体的には、アスパラギン酸、グルタミン酸等)、酸性アミノ酸アミド(具体的には、アスパラギン、グルタミン等)、塩基性アミノ酸(具体的には、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン等)、含硫アミノ酸(具体的には、システイン、シスチン、メチオニン等)、イミノ酸(具体的には、プロリン、4-ヒドロキシプロリン等)等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基における置換アルキルおよび置換アルケニルの置換基としては、例えば、ハロゲン(前記と同義)、ヒドロキシ、スルファニル、アミノ、オキソ、-O-アルキル(該-O-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-S-アルキル(該-S-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-NH-アルキル(該-NH-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノオキシ(該ジアルキルアミノオキシの2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノ(該ジアルキルアミノの2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノアルキレンオキシ(該ジアルキルアミノアルキレンオキシの2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義であり、アルキレン部分は前記アルキルから水素原子が1つ除かれたものを意味する)等があげられ、置換数は好ましくは1~3である。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1~6のアルキル基で置換されたもの、メチル基が水素原子もしくは炭素数2~6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1~6のアルキル基、炭素数1~6のアルカノイル基等の保護基で保護されたものがあげられる。
さらに、ヌクレオチド誘導体として、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を付加したものもあげられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
また、ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
標的遺伝子のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸といい、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸ともいう。センス鎖核酸は、標的遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸そのもの等、アンチセンス鎖核酸と対合して二重鎖形成部ができる核酸をいう。
二本鎖核酸とは、二本の鎖が対合し二重鎖形成部を有する核酸をいう。二重鎖形成部とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖形成部を構成する塩基対は、通常15~27塩基対であり、15~25塩基対が好ましく、15~23塩基対がより好ましく、15~21塩基対がさらに好ましく、15~19塩基対が特に好ましい。
二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖、センス鎖のいずれか一方、または両方の核酸は、二重鎖形成部に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加の核酸を有してもよい。この二重鎖を形成しない部分を突出部(オーバーハング)ともいう。
突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1~4塩基、通常は1~3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、dTdTまたはUUからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。
また、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAと一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの相補鎖の塩基配列と一致する配列を用いてもよい。さらに、標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により前記の二本鎖核酸を生成する核酸分子(国際公開第2005/089287号)や、3’末端や5’末端の突出部を有していない二本鎖核酸などを用いることもできる。
また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の3’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ3’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
一本鎖核酸として、上記の二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を、スペーサー配列(スペーサーオリゴヌクレオチド)を介して連結したものを用いてもよい。スペーサーオリゴヌクレオチドとしては6~12塩基の一本鎖核酸分子が好ましく、その5’末端側の配列は2個のUであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、UUCAAGAGAの配列からなる核酸があげられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれるアンチセンス鎖およびセンス鎖の順番はどちらが5’側になってもよい。該一本鎖核酸としては、ステムループ構造によって二重鎖形成部を有するshRNA等の一本鎖核酸であることが好ましい。shRNA等の一本鎖核酸は、通常50~70塩基長である。
リボヌクレアーゼ等の作用により、上記の一本鎖核酸または二本鎖核酸を生成するように設計した、70塩基長以下、好ましくは50塩基長以下、さらに好ましくは30塩基長以下の核酸を用いてもよい。
また、本発明の脂質ナノ粒子としては、例えば化合物(I)と核酸等との複合体、または化合物(I)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子等もあげられる。この場合の脂質膜も、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。なお、該脂質膜に、化合物(I)、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、該複合体および/または該脂質膜に、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有していてもよい。
また、本発明の脂質ナノ粒子としては、例えば化合物(II)と核酸等との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)を含有する脂質ナノ粒子等もあげられる。この場合の脂質膜も、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。なお、該脂質膜に、化合物(II)、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、該複合体および/または該脂質膜に、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有していてもよい。
また、本発明の脂質ナノ粒子としては、例えば化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子等もあげられる。この場合の脂質膜も、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。なお、該脂質膜に、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質、中性脂質ならびに/または高分子を含有していてもよい。
複合体および該複合体を封入する脂質二重膜から構成された脂質ナノ粒子としては、該複合体および該複合体を封入する脂質二重膜から構成されたリポソーム等があげられる。
なお、本発明の脂質ナノ粒子は、薬物として例えば核酸を含有することができるが、核酸と化学的に近似した化合物も含有することもできる。
いずれの場合も、本発明の脂質ナノ粒子には、化合物(I)および化合物(II)をそれぞれ一種または複数種を使用してよく、また化合物(I)および/または化合物(II)には、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を混合してもよい。
化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質としては、例えば、特開昭61-161246号公報(米国特許5049386号明細書)中で開示される、DOTMA、DOTAP等、国際公開第91/16024号および国際公開第97/019675号中で開示される、DORIE、DOSPA等、国際公開第2005/121348号中で開示される、DLinDMA等、国際公開第2009/086558号中で開示される、DLin-K-DMA等があげられ、好ましくはDOTMA、DOTAP、DORIE、DOSPA、DLinDMA、DLin-K-DMA等の2つの非置換アルキル基を有する3級アミン部位または3つの非置換アルキル基を有する4級アンモニウム部位を有するカチオン性脂質であることがあげられ、より好ましくは、該3級アミン部位を有するカチオン性脂質があげられる。該3級アミン部位および該4級アンモニウム部位の非置換アルキル基はメチル基であることがより好ましい。
本発明の脂質ナノ粒子のうち、化合物(I)および化合物(II)と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入した脂質二重膜から構成されたリポソームは、例えば、国際公開第02/28367号および国際公開第2006/080118号等に記載の製造方法に従って製造することができる。
いずれの場合も、脂質膜に化合物(I)と化合物(II)とを混合して使用することがより好ましい。すなわち、化合物(I)および化合物(II)と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)、ならびに/または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子、化合物(I)と核酸等との複合体、または化合物(I)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子、化合物(II)と核酸等との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子がより好ましく、化合物(I)および化合物(II)と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)、ならびに/または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子、化合物(I)と核酸等との複合体、化合物(I)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子がさらに好ましく、化合物(I)と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)と核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子が最も好ましい。
本発明の核酸を含有する脂質ナノ粒子において、複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成された脂質ナノ粒子中の化合物(I)の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して1~15倍であるのが好ましく、2.5~10倍であるのがより好ましく、3.5~8倍であるのがさらに好ましい。また、該脂質ナノ粒子中の化合物(I)および化合物(I)以外のカチオン性脂質の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して1~15倍であるのが好ましく、2.5~10倍であるのがより好ましく、3.5~8倍であるのがさらに好ましい。
また、本開示の該核酸と該リポソームとの複合体中のリポソームは、予め大きさを、平均粒子径10nm~400nm、より好ましくは30nm~110nm、さらに好ましくは40nm~80nmに調節したリポソームが好ましい。また、該複合体および/または脂質膜に、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、A液は、リポソームと該核酸との複合体を形成させることができれば、エタノール濃度は、20~40%であってもよい。
また、等量のA液とB液を混合する代わりに、A液とB液を混合後に複合体が溶解せず、かつB液中のカチオン性脂質が溶解しないエタノール濃度、好ましくは複合体が溶解せず、B液中のカチオン性脂質が溶解せず、かつエタノール濃度が30~60%のエタノール水溶液になるような比でA液とB液を混合することに代えてもよく、あるいはA液とB液を混合後に複合体が溶解しないようなエタノール濃度になるような比でA液とB液を混合し、さらに水を加えることで、B液中のカチオン性脂質が溶解しなくなるエタノール濃度にすることにしてもよい。
本開示の該A液中での核酸とリポソームとの複合体は、A液とB液を混合し、さらに適宜に水を加えた後には、カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)と核酸との複合体に形態が変化している。本開示の製造方法で得られる該核酸と該カチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子は、好ましくはカチオン性脂質と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する脂質ナノ粒子であり、より好ましくは、カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜にカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子であり、その製造性(収率および/または均一性)は優れている。
該A液中での核酸とリポソームとの複合体において、複合体中のカチオン性脂質の分子の総数は、核酸のリン原子の数に対して0.5~8倍であるのが好ましく、1.5~5倍であるのがより好ましく、2~3倍であるのがさらに好ましい。
A液とB液を混合後の該核酸と該カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する脂質ナノ粒子においては、該複合体および該複合体を封入する脂質膜中のカチオン性脂質の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して1~15倍であるのが好ましく、2.5~10倍であるのがより好ましく、3.5~8倍であるのがさらに好ましい。
本発明の脂質ナノ粒子において中性脂質を含有する場合には、中性脂質の分子の総数は、化合物(I)および化合物(II)、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.1~1.8倍であるのが好ましく、0.3~1.2倍であるのがより好ましく、0.4~0.9倍であるのがさらに好ましい。本発明における脂質ナノ粒子は、中性脂質を、複合体に含有していてもよく、該複合体を封入する脂質膜に含有していてもよく、少なくとも該複合体を封入する脂質膜に含有していることがより好ましく、該複合体および該該複合体を封入する脂質膜のどちらにも含有していることがさらに好ましい。
本発明の脂質ナノ粒子が、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体を含有する場合には、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体および脂肪酸誘導体の分子の総数は、化合物(I)、化合物(I)および化合物(I)以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.05~0.3倍であるのが好ましく、0.07~0.25倍であるのがより好ましく、0.1~0.2倍であるのがさらに好ましい。
また、標的化リガンドを、本発明の脂質ナノ粒子の脂質成分の極性ヘッド残基に共有結合することにより本発明の脂質ナノ粒子の表面に直接結合させることも任意に行うことができる(国際公開第2006/116107号参照)。
インビトロで本発明の脂質ナノ粒子を、ほ乳類の細胞に投与する方法は、インビトロにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。
本発明の脂質ナノ粒子中の核酸等が、RNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸であれば、インビボでほ乳類の細胞内に、遺伝子の発現を抑制する核酸等を導入することができ、遺伝子等の発現の抑制ができる。投与対象は、人であることが好ましい。
また、本発明の脂質ナノ粒子における標的遺伝子が、例えば腫瘍または炎症に関連する遺伝子であれば、本発明の脂質ナノ粒子を、癌または炎症疾患の治療剤または予防剤、好ましくは固形癌または血管もしくは血管近傍の炎症の治療剤または予防剤として使用することができる。具体的には、本発明の脂質ナノ粒子における標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子等であれば、血管平滑筋の増殖や血管新生等を抑制できるので、本発明の脂質ナノ粒子を、例えば血管平滑筋の増殖や血管新生を伴う癌または炎症疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。本発明のカチオン性脂質を、複数種を組み合わせて使用する場合または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質と組み合わせて使用する場合には、個々のカチオン性脂質を単独で使用する場合と比べて減量できるので、カチオン性脂質が原因の好ましくない事象の発生率や程度を減らすことができる。
即ち、本発明は、上記説明した本発明の脂質ナノ粒子を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法も提供する。投与対象は、人であることが好ましく、癌または炎症疾患に罹患している人がより好ましい。
また、本発明の脂質ナノ粒子は、癌または炎症疾患の治療剤または予防剤に関するインビボの薬効評価モデルにおいて、標的遺伝子を抑制することの有効性を検証するためのツールとして使用することもできる。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路などによって異なるが、例えば核酸に換算した1日投与量が約0.1μg~1000mgとなるように投与すればよい。
注射剤の場合、前記の脂質ナノ粒子の分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した脂質ナノ粒子に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
なお、参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。
メチルジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン(化合物1)
メチルアミン(アルドリッチ(Aldrich)社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、10.5 mL、21.0 mmol)に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(ニューチェック・プレップ(Nu-Chek Prep,Inc)社製, 1.03 g, 3.00 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて150℃で90分間加熱撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮することでメチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミンの粗生成物を得た。
得られた粗生成物に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 0.93 g, 2.70 mmol)および50%水酸化ナトリウム水溶液(0.960 g, 12.0 mmol)を加え、油浴上135℃で60分間加熱撹拌した。室温まで冷却後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0~97/3)で精製することにより化合物1(1.07 g, 67.2 %)を得た。
ESI-MS m/z: 529 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 32H), 1.40-1.51 (m, 4H), 1.97-2.06 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
メチルジ((Z)-ヘキサデカ-9-エニル)アミン (化合物2)
参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、10.0 mL、20.0 mmol)および(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 1.21 g, 3.80 mmol)を用い、化合物2(0.491 g, 51.6 %)を得た。
ESI-MS m/z: 477 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 36H), 1.46-1.57 (m, 4H), 1.97-2.05 (m, 8H), 2.33 (s, 3H), 2.45 (t, J = 7.9 Hz, 4H), 5.29-5.41 (m, 4H).
メチルジ((11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル)アミン (化合物3)
参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、16.0 mL、32.0 mmol)および(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.98 g, 8.00 mmol)を用い、化合物3(1.27 g, 54.4%)を得た。
ESI-MS m/z: 585 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.27 (br s, 40H), 1.39-1.51 (m, 4H), 2.01-2.09 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.79 (d, J = 6.3 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン (化合物4)
参考例1と同様の方法で、アンモニア(東京化成工業社製、約2 mol/Lメタノール溶液、18.0 mL、36.0 mmol)および(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.79 g, 8.10 mmol)を用い、化合物4(0.838 g, 36.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 515 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.30 (br s, 33H), 1.41-1.54 (m, 4H), 2.01-2.09 (m, 8H), 2.59 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミン (化合物5)
参考例1と同様の方法で、アンモニア(東京化成工業社製、約2 mol/Lメタノール溶液、12.0 mL、24.0 mmol)および(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 1.87 g, 5.40 mmol)を用い、化合物5(0.562 g, 36.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 519 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 45H), 1.41-1.52 (m, 4H), 1.97-2.05 (m, 8H), 2.58 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 5.28-5.40 (m, 4H).
メチルジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミン (化合物6)
参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、11.2 mL、22.4 mmol)および(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.11 g, 6.09 mmol)を用い、化合物6(1.20 g, 70.2 %)を得た。
ESI-MS m/z: 533 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27 (br s, 44H), 1.39-1.50 (m, 4H), 1.97-2.06 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 5.28-5.40 (m, 4H).
国際公開第2006/100036号を参考にして合成したtrans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチル(156 mg, 0.674 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解させ、オレイン酸(東京化成工業社製、419 mg, 1.48 mmol)、WSCD(国産化学社製、297 mg, 1.55 mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(東京化成工業社製、DMAP (20.6 mg, 0.169 mmol)を加え室温で終夜撹拌した。反応液に飽和重曹水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/クロロホルム=50/50~0/100)で精製することにより化合物145 (280 mg, 54.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 761 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.25-1.46 (m, 36H), 1.46 (s, 9H), 1.46-1.66 (m, 8H), 1.97-2.04 (m, 8H), 2.27-2.38 (m, 6H), 3.10-3.23 (m, 2H), 3.53-3.66 (m, 2H), 4.03 (dd, J = 10.8, 6.0 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 10.8, 6.0 Hz, 2H), 5.28-5.40 (m, 4H).
参考例7と同様の方法で、国際公開第2006/100036号を参考にして合成したtrans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチル(150 mg, 0.674 mmol)およびリノール酸(アルドリッチ社製、400 mg, 1.48 mmol)を用い、化合物146 (351 mg, 71.7%)を得た。
ESI-MS m/z: 757 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.21-1.45 (m, 26H), 1.46 (s, 9H), 1.47-1.68 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 2.26-2.38 (m, 6H), 2.77 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 3.10-3.23 (m, 2H), 3.53-3.66 (m, 2H), 4.03 (dd, J = 11.0, 6.0 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.0, 6.0 Hz, 2H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例7で得られた化合物145 (278 mg, 0.366 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解させ、トリフルオロ酢酸(0.563 mL, 7.31 mmol)を加え室温で3時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣を少量のメタノールに溶解し、プラスチックカラムに充填したBONDESIL-SCX(ヴァリアン(VARIAN)社製、6 g)の上部に吸着させ、メタノールで洗浄し、次いでアンモニア・メタノール溶液(東京化成工業社製、2 mol/L)で目的物を溶出させた。目的物を含むフラクションを減圧下濃縮することで化合物110 (162 mg, 67.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 661 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27-1.35 (m, 40H), 1.56-1.64 (m, 4H), 2.01 (q, J = 5.9 Hz, 8H), 2.09-2.16 (m, 2H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.72 (dd, J = 11.3, 5.5 Hz, 2H), 3.11 (dd, J = 11.3, 7.1 Hz, 2H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.29-5.40 (m, 4H).
参考例9と同様の方法で、参考例8で得られた化合物146(350 mg, 0.463 mmol)を用い、化合物111 (224 mg, 73.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 657 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.40 (m, 28H), 1.57-1.66 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.6 Hz, 8H), 2.09-2.17 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.72 (dd, J = 11.3, 6.0 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.2 Hz, 4H), 3.11 (dd, J = 11.3, 7.3 Hz, 2H), 3.99-4.13 (m, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例10で得られた化合物111 (80 mg, 0.12 mmol)を1,2-ジクロロエタン(1.5 mL)、メタノール(1.5 mL)に溶解させ、ホルムアルデヒド(0.091 mL, 1.22 mmol)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(アクロス・オーガニクス(Acros Organics)社製、129 mg, 0.610 mmol)を複数回にわたって加え室温で1.5時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=100/0~93/7)で精製することで化合物117 (66 mg, 81%)を得た。
ESI-MS m/z: 671 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.25-1.40 (m, 28H), 1.57-1.66 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 2.13-2.24 (m, 2H), 2.27-2.37 (m, 9H), 2.66 (dd, J = 9.2, 7.3 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 5.7 Hz, 4H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例11と同様の方法で、参考例9で得られた化合物110 (50 mg, 0.076 mmol)を用い、化合物116 (47 mg, 92%)を得た。
ESI-MS m/z: 675 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.26-1.35 (m, 40H), 1.56-1.65 (m, 4H), 2.01 (q, J = 5.5 Hz, 8H), 2.15-2.24 (m, 2H), 2.27-2.37 (m, 9H), 2.67 (dd, J = 9.3, 7.1 Hz, 2H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.29-5.40 (m, 4H).
国際公開第2011/136368号記載の方法(参考例16)によって得られる(trans-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジイル)ジメタノール(2.06 g, 9.31 mmol)のメタノール(3 mL)溶液にヨウ化メチル(東京化成工業社製、26.4 g, 186 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を陰イオン交換樹脂(Dowex 1x-200 塩化物型(ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー(The Dow Chemical Company)社製)、約30 mL、水とメタノールでプレ洗浄したもの)にロードし、メタノールで溶出した。溶出液を減圧下濃縮した。残渣に酢酸エチルを加え、生じた結晶をろ取することでtrans-1-ベンジル-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)-1-メチルピロリジニウム塩化物(2.53 g, 定量的収率)を得た。
ESI-MS m/z: 236 M+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 2.67 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 3.28-3.45 (m, 4H), 3.53-3.98 (m, 6H), 4.63 (s, 2H), 7.49-7.63 (m, 5H).
得られたtrans-1-ベンジル-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)-1-メチルピロリジニウム塩化物(2.53 g, 9.31 mmol)にパラジウム炭素(約10%含水、0.495 g, 0.465 mmol)とメタノール(25 mL)を加えて、水素ガス雰囲気下50℃で3時間加熱攪拌した。反応液をセライトろ過し、メタノールで洗浄した。ろ液をあわせて減圧下濃縮することで、trans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)-1-メチルピロリジン塩酸塩(1.71 g, 定量的収率)を得た。
ESI-MS m/z: 146 (M+H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 2.42 (m, 2H), 2.89 (s, 3H), 3.22-3.42 (m, 4H), 3.44-3.69 (m, 6H).
得られたtrans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)-1-メチルピロリジン塩酸塩(200 mg, 1.10 mmol)のクロロホルム(8 ml)溶液に(Z)-ヘキサデカ-9-エン酸(東京化成工業社製, 616 mg, 2.422 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩(同仁堂社製485 mg, 2.53 mmol)、トリエチルアミン(東京化成工業社製、0.614 ml, 4.40 mmol)および4-ジメチルアミノピリジン(東京化成工業社製33.6 mg, 0.275 mmol) を加えて室温で終夜撹拌した。反応液に飽和重曹水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール/クロロホルム=0/100~2/98)で精製し、化合物118(163 mg, 24%)を得た。
ESI-MS m/z: 146 (M+H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.26-1.31 (m, 34H), 1.56-1.64 (m, 4H), 1.97-2.03 (m, 8H), 2.15-2.23 (m, 2H), 2.27-2.38 (m, 9H), 2.67 (dd, J = 9.3, 7.1 Hz, 2H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.29-5.40 (m, 4H).
参考例1で得られた化合物1を用いて、以下のように製剤を製造した。用いた核酸は、センス鎖[5'-mGmGAAGCUGGCGAUUAUGCAGAUUmUmA-3'(mが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)]と、アンチセンス鎖[5'-UAAAUCUGCAUAAUCGCCAGCUUCC-3'(5’末端をリン酸化してある)]の塩基配列からなる、CKAP5遺伝子の発現を抑制するCKAP5 siRNAであり、ニッポンイージーティー社、ジーンデザイン社、インビトロジェン社または北海道システムサイエンス社より、アニール済みの凍結乾燥siRNAを入手し、蒸留水で溶解させることによって24 mg/mLに調製した(以下CKAP5 siRNA溶液という)。
化合物1/1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DMPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)=57.26/5.521 mmol/Lとなるように塩酸およびエタノールを含有する水溶液に懸濁させ、vortex攪拌ミキサーで攪拌および、加温を繰り返して均一な懸濁液を得た。この懸濁液を室温下で0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルターおよび0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルターに通し、リード粒子の分散液を得た。Dynamic light scattering (DLS)で得られたリード粒子の平均粒子径を測定し、30 nmから100 nmの範囲内であることを確認した。得られたリード粒子の分散液に、CKAP5siRNA 溶液を、3:1の割合で混合し、さらに3倍量の蒸留水を加えて混合することでカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物1/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は86.0 nmであった。
比較例1と同様にしてCKAP5 siRNAならびにリード粒子から、カチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物1/化合物117/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=2.982/5.965/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。粒子径測定装置(Zetasizer Nano ZS、マルバーン(Malvern)社製)で製剤中の脂質ナノ粒子の粒子径を測定した結果、該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は93.9 nmであった。
実施例1で得られた製剤(化合物1、化合物117および核酸を含有する脂質ナノ粒子)および比較例1で得られた製剤(化合物1および核酸を含有する脂質ナノ粒子)を、それぞれ以下の方法によりインビボ mRNAノックダウン評価試験を実施した。
ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2はJCRB細胞バンクより受領し、10%非働化ウシ胎仔血清(GIBCO社製)及び1vol%ペニシリン‐ストレプトマイシン(ナカライテスク社製、26253-84)を含む高グルコース含有DMEM(GIBCO社製, 11995-073)で37℃、5%CO2条件下で培養した。MIA PaCa-2を(1×108 cells / mLの濃度となるようにPBSに懸濁し、この細胞懸濁液100 μLをSCIDマウス(日本クレアより入荷)の背部皮下に移植した(1×107 cells /0.1mL PBS /head)。移植6日後、腫瘍体積を指標に一群3匹として群分けを行い、実施例1および比較例1で得られた製剤を10 mg/kg(10mL/kg)でマウスに静脈内投与した。陰性対照として生理食塩水を使用し、10mL/kgで投与した。投与前及び投与48時間後にマウスの体重を測定した。体重測定後にマウスを安楽死させ、皮下腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍は直ちに液体窒素で凍結し、使用するまで-80℃に保存した。
得られた腫瘍サンプルについて、サンプルの入った2 mL丸底tubeに1 mLのTrizol reagent (インビトロジェン(Invitrogen)製, 15596-018)及び5mmのジルコニアビーズを添加し、Tissue lyser II (キアゲン(QIAGEN)製)にて1/25 freq, 1.5 min x 2回の条件で破砕した。破砕後遠心(10000 rpm, 10 min)し上清を回収、200 μLのクロロホルムを添加し激しく攪拌後再び遠心(15000 rpm, 15 min)した。得られた上清200 μLから自動核酸抽出機MagNA PURE 96 (ロシュ(Roche)製)にて、Cellular RNA Large Volume Kit (ロシュ(Roche)製, 5467535)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNA濃度を微量吸光光度計Dropsense96 (トリニアン(Trinean)製)にて測定、200-1000 ng相当のRNAをTranscriptor (ロシュ(Roche)製、4897030)を用いて逆転写を行った。反応液組成、反応条件は添付文書に従った。得られたcDNAサンプルをdH2Oで10倍希釈し、qPCRの鋳型として用いた。qPCR反応にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4369542), TaqMan Gene Expression Assays(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4331182)を用いた。PCR反応の条件はTaqMan Gene Expression添付の使用説明書に従った。検体のmRNA量は、生理食塩水投与群における、CKAP5のmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。
図1に、実施例1および比較例1で得られた各製剤について、それぞれsiRNA 10 mg/kg投与後48時間後の腫瘍中CKAP5 mRNA量を示す。縦軸は生理食塩水処置群を1としたCKAP5 mRNA量の相対値を示す。
また、図1から明らかなように、実施例1で得られた製剤(化合物1、化合物117および核酸を含有する脂質ナノ粒子)は、インビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする化合物1に、化合物117が混合されて、化合物1の使用量が減っているにもかかわらず、比較例1で得られた製剤(化合物1および核酸を含有する脂質ナノ粒子)と比べて、インビボで薬効評価試験した結果は、同程度に極めて強くCKAP5遺伝子の発現を抑制し、抗腫瘍作用が強い。
よって、化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子は、化合物(I)の使用量が減っているにもかかわらず、化合物(I)のインビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする作用を減弱しないという予想外の作用を有することが明らかとなった。また、インビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする作用を減弱せずに、化合物(I)の使用量が減らせることにより、化合物(I)に起因する毒性作用は減少することができるので、インビボの薬物送達のための脂質ナノ粒子としてより有用であるという、当業者が予想しない効果を有することが明らかとなった。
実施例1で得られた製剤(化合物1、化合物117および核酸を含有する脂質ナノ粒子)を、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
試験例1と同様にして、膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群6匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0及びDay7に実施例1で得られた製剤を10 mg/kg(10mL/kg)で静脈内投与した。生理食塩水は10mL/kgとして投与した。各個体の腫瘍径を、Day0からDay14まで測定し、以下の式を用いて腫瘍体積、体積比を算出した。
(数1)
腫瘍体積(mm3)= 長径(mm)×短径(mm)×短径(mm)× 0.5
(数2)
体積比(V/V0)=各時点の腫瘍体積(mm3)÷ Day0の腫瘍体積(mm3)
図2に、0日目および7日目に10 mg/kg投与した際の腫瘍体積の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。
よって、本発明の脂質ナノ粒子は、核酸を細胞内等に導入することができ、化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子は、インビボで細胞内に良好に薬物送達する、優れた脂質ナノ粒子であることが明らかとなった。
参考例1で得られた化合物1を用いて、以下のように製剤を製造した。用いた核酸は、市販のEg5遺伝子の発現を抑制するEg5 siRNA(インビトロジェン社製、カタログ番号 HSS105842)であり、センス鎖に5'-CCCAUCAACACUGGUAAGAACUGAA-3'の塩基配列を含み、アンチセンス鎖に5'-UUCAGUUCUUACCAGUGUUGAUGGG-3'の塩基配列を含む。インビトロジェン社より、アニール済みの凍結乾燥siRNAを入手し、蒸留水で溶解させることによって24 mg/mLに調製した(以下Eg5 siRNA溶液という)。
化合物1/1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DMPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)=57.26/5.521 mmol/Lとなるように塩酸およびエタノールを含有する水溶液に懸濁させ、vortex攪拌ミキサーで攪拌および、加温を繰り返して均一な懸濁液を得た。この懸濁液を室温下で0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルターおよび0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルターに通し、リード粒子の分散液を得た。Dynamic light scattering (DLS)で得られたリード粒子の平均粒子径を測定し、30 nmから100 nmの範囲内であることを確認した。得られたリード粒子の分散液に、Eg5siRNA 溶液を、3:1の割合で混合し、さらに3倍量の蒸留水を加えて混合することでカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物1/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は80.3 nmであった。
比較例2と同様にしてEg5 siRNAならびにリード粒子から、カチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物1/化合物117/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=2.982/5.965/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は80.5 nmであった。
比較例2と同様にしてEg5 siRNAならびにリード粒子から、カチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物117/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は79.6 nmであった。
比較例2と同様にしてEg5 siRNAならびにリード粒子から、カチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物116/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は77.6 nmであった。
比較例2と同様にしてEg5 siRNAならびにリード粒子から、カチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物118/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は81.6 nmであった。
実施例2~5で得られた製剤(化合物1、および化合物117、116または118ならびに核酸を含有する脂質ナノ粒子)および比較例2で得られた製剤(化合物1および核酸を含有する脂質ナノ粒子)を、それぞれ以下の方法によりインビボ mRNAノックダウン評価試験を実施した。
試験例1と同様にして、膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。移植6日後、腫瘍体積を指標に一群3匹として群分けを行い、実施例2~5および比較例1で得られた製剤を10 mg/kg(10mL/kg)でマウスに静脈内投与した。陰性対照として生理食塩水を使用し、10mL/kgで投与した。投与前及び投与48時間後にマウスの体重を測定した。体重測定後にマウスを安楽死させ、皮下腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍は直ちに液体窒素で凍結し、使用するまで-80℃に保存した。
得られた腫瘍サンプルについて、サンプルの入った2 mL丸底tubeに1 mLのTrizol reagent (インビトロジェン(Invitrogen)製, 15596-018)及び5mmのジルコニアビーズを添加し、Tissue lyser II (キアゲン(QIAGEN)製)にて1/25 freq, 1.5 min x 2回の条件で破砕した。破砕後遠心(10000 rpm, 10 min)し上清を回収、200 μLのクロロホルムを添加し激しく攪拌後再び遠心(15000 rpm, 15 min)した。得られた上清200 μLから自動核酸抽出機MagNA PURE 96 (ロシュ(Roche)製)にて、Cellular RNA Large Volume Kit (ロシュ(Roche)製, 5467535)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNA濃度を微量吸光光度計Dropsense96 (トリニアン(Trinean)製)にて測定、200-1000 ng相当のRNAをTranscriptor (ロシュ(Roche)製、4897030)を用いて逆転写を行った。反応液組成、反応条件は添付文書に従った。得られたcDNAサンプルをdH2Oで10倍希釈し、qPCRの鋳型として用いた。qPCR反応にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4369542), TaqMan Gene Expression Assays(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4331182)を用いた。PCR反応の条件はTaqMan Gene Expression添付の使用説明書に従った。検体のmRNA量は、生理食塩水投与群における、Eg5のmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。
図3に、実施例2~5および比較例2で得られた各製剤について、それぞれsiRNA 10 mg/kg投与後48時間後の腫瘍中Eg5 mRNA量を示す。縦軸は生理食塩水処置群を1としたEg5 mRNA量の相対値を示す。
また、図3から明らかなように、実施例2~5で得られた製剤(化合物1、および化合物117、116または118ならびに核酸を含有する脂質ナノ粒子)は、インビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする化合物1に、化合物117、116または118が混合されて、化合物1の使用量が減っているにもかかわらず、比較例1で得られた製剤(化合物1および核酸を含有する脂質ナノ粒子)と比べて、インビボで薬効評価試験した結果は、同程度に極めて強くEg5遺伝子の発現を抑制し、抗腫瘍作用が強い。
よって、化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子は、化合物(I)の使用量が減っているにもかかわらず、化合物(I)のインビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする作用を減弱しないという予想外の作用を有することが明らかとなった。また、インビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする作用を減弱せずに、化合物(I)の使用量が減らせることにより、化合物(I)に起因する毒性作用は減少することができるので、インビボの薬物送達のための脂質ナノ粒子としてより有用であるという、当業者が予想しない効果を有することが明らかとなった。
実施例2で得られた製剤(化合物1、化合物117および核酸を含有する脂質ナノ粒子)を、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
試験例1と同様にして、膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群5匹となるように群分けを実施(Day0)し、実施例2で得られた製剤を10 mg/kg(10mL/kg)で静脈内投与した。生理食塩水は10 mL/kgとして投与した。各個体の腫瘍径を、Day0からDay15まで測定し、試験例2と同様に腫瘍体積、体積比を算出した。
図4に、0日目に10 mg/kg投与した際の腫瘍体積の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。
よって、本発明の脂質ナノ粒子は、核酸を細胞内等に導入することができ、化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子は、インビボで細胞内に良好に薬物送達する、優れた脂質ナノ粒子であることが明らかとなった。
配列番号2-siRNA アンチセンス鎖
配列番号2-5'-リン酸化アデノシン(5'-phosphorylated Adenosine)
配列番号3-siRNA センス鎖
配列番号4-siRNA アンチセンス鎖
Claims (34)
- 式(I)
X1およびX2は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X3は存在しないか、炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルであり、
X3が存在しない場合には、
Y1も存在せず、L1は単結合であり、R3は水素原子、炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであるか、あるいは
Y1も存在せず、L1は-CO-または-CO-O-であり、R3はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、
X3が炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルの場合には、
Y1は製薬上許容し得る陰イオンであり、L1は単結合であり、R3は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質、および式(II)
X4およびX5は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X6は存在しないか、炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルであり、
X6が存在しない場合には、
Y2も存在せず、aおよびbは0であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、L2およびL3は-O-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、かつaとbがともに0ではなく、L4は単結合であり、R6は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、L4は単結合であり、R6は水素原子であり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、あるいは
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、L4は-CO-または-CO-O-であり、R6はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
X6が炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルの場合には、
Y2は製薬上許容し得る陰イオンであり、aおよびbは、同一または異なって0~3であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1~6のアルキル、炭素数3~6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-である)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子。 - R1およびR2が、ドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルである請求項1記載の脂質ナノ粒子。
- R1およびR2が、ともにテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルである請求項1記載の脂質ナノ粒子。
- L1が単結合であり、R3が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである請求項1~3のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- L1が-CO-または-CO-O-であり、R3がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルである請求項1~3のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X1およびX2が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成する請求項1~5のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X1およびX2が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R3が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである請求項1~5のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X1およびX2が、水素原子であり、R3が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである請求項1~5のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X3が存在しない請求項1~8のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- L2およびL3が、-O-または-O-CO-であり、R4およびR5が、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである請求項1~9のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- L2およびL3が、-CO-O-であり、R4およびR5が、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルである請求項1~9のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- L4が単結合であり、R6が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである請求項1~11のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- L4が-CO-または-CO-O-であり、R6がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルである請求項1~11のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成する請求項1~13のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R6が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである請求項1~13のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X4およびX5が、水素原子であり、R6が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルもしくは炭素数3~6のアルケニルである請求項1~13のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R6が同一または異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシまたはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルである請求項1~13のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X4およびX5が、水素原子であり、R6が同一または異なって1~3つのアミノ、ヒドロキシまたはカルバモイルで置換された炭素数1~6のアルキルまたは炭素数3~6のアルケニルである請求項1~13のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X6が存在しないか、メチルである請求項1~18のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- 薬物として核酸を含有する請求項1~19のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- カチオン性脂質が、該核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸との複合体を形成している、請求項20記載の脂質ナノ粒子。
- カチオン性脂質が、該核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸との複合体を形成しており、該複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成された請求項20記載の脂質ナノ粒子。
- 核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である請求項20~22のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- 標的遺伝子が、腫瘍または炎症に関連する遺伝子である請求項23記載の脂質ナノ粒子。
- 請求項20~24のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を用いて該核酸を細胞内に導入する方法。
- 細胞が、ほ乳類の腫瘍または炎症部位にある細胞である請求項25記載の方法。
- 細胞が、ほ乳類の肝臓、肺、腎臓または脾臓にある細胞である請求項25または26記載の方法。
- 細胞内に導入する方法が、静脈内投与によって細胞内に導入する方法である請求項26または27記載の方法。
- 請求項1~24のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法。
- 投与する方法が、静脈内投与である請求項29記載の方法。
- 請求項1~24のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を含む、疾患の治療に用いるための医薬。
- 静脈内投与用である請求項31記載の医薬。
- 請求項1~24のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を含む、癌または炎症疾患の治療に用いるための癌または炎症疾患の治療剤。
- 静脈内投与用である請求項33記載の癌または炎症疾患の治療剤。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2014013995A1 (ja) * | 2012-07-16 | 2014-01-23 | 協和発酵キリン株式会社 | KRAS遺伝子発現抑制RNAi医薬組成物 |
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CA3055653A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticle formulation |
EP3638215A4 (en) | 2017-06-15 | 2021-03-24 | Modernatx, Inc. | RNA FORMULATIONS |
JP7275111B2 (ja) | 2017-08-31 | 2023-05-17 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | 脂質ナノ粒子の生成方法 |
JPWO2019131770A1 (ja) * | 2017-12-27 | 2020-12-24 | 武田薬品工業株式会社 | 核酸含有脂質ナノ粒子及びその用途 |
WO2020246581A1 (ja) * | 2019-06-07 | 2020-12-10 | 富士フイルム株式会社 | 脂質組成物 |
EP4031524A1 (en) | 2019-09-19 | 2022-07-27 | ModernaTX, Inc. | Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents |
EP4229208A1 (en) * | 2020-10-14 | 2023-08-23 | George Mason Research Foundation, Inc. | Methods of lipid nanoparticle manufacture and compostions derived therefrom |
US11524023B2 (en) | 2021-02-19 | 2022-12-13 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same |
CN115197078B (zh) * | 2021-04-08 | 2024-06-04 | 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 | 一种聚乙二醇化脂质及其修饰的脂质体、含该脂质体的药物组合物及其制剂和应用 |
EP4321504A1 (en) * | 2021-04-08 | 2024-02-14 | Xiamen Sinopeg Biotech Co., Ltd. | Pegylated lipid and liposome modified thereby, and pharmaceutical composition comprising liposome and preparation and use thereof |
CN113372226B (zh) * | 2021-06-08 | 2023-05-26 | 深圳市人民医院 | 一种脂质分子、脂质纳米粒及其制备方法和应用 |
WO2023044333A1 (en) * | 2021-09-14 | 2023-03-23 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Cyclic lipids and methods of use thereof |
CN115925604A (zh) * | 2021-09-22 | 2023-04-07 | 广州谷森制药有限公司 | 吡咯烷类新型脂质化合物、其制备方法、组合物及应用 |
WO2023178065A2 (en) * | 2022-03-15 | 2023-09-21 | Broadpharm Inc. | Lipid compounds and lipid nanoparticles |
CN116535381B (zh) * | 2023-07-06 | 2023-10-17 | 北京悦康科创医药科技股份有限公司 | 具有五元环缩醛结构的阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途 |
Citations (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3849458A (en) | 1966-01-21 | 1974-11-19 | Incentive Res & Dev Ab | Method for deuterating organic compounds |
JPS61161246A (ja) | 1985-01-07 | 1986-07-21 | シンテツクス(ユー・エス・エイ)インコーポレイテツド | 置換アルキルートリ置換アンモニウム界面活性剤 |
JPS61275241A (ja) | 1985-05-29 | 1986-12-05 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 重水素化アクリル酸又は重水素化メタクリル酸の製造方法 |
JPS61277648A (ja) | 1985-06-03 | 1986-12-08 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 重水素化アクリル酸又は重水素化メタクリル酸の製造方法 |
JPS63198638A (ja) | 1987-01-17 | 1988-08-17 | ヘキスト・アクチエンゲゼルシャフト | 重水素化した有機化合物の製造方法 |
US5049386A (en) | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
WO1991016024A1 (en) | 1990-04-19 | 1991-10-31 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
JPH0519536B2 (ja) | 1984-12-21 | 1993-03-17 | Mitsubishi Rayon Co | |
JP2572554B2 (ja) | 1984-08-08 | 1997-01-16 | ザ リポソーム カンパニー、インコーポレーテッド | リポソームからの薬剤の放出速度低減方法 |
WO1997019675A2 (en) | 1995-11-30 | 1997-06-05 | Vical Incorporated | Complex cationic lipids |
JP2659136B2 (ja) | 1988-09-28 | 1997-09-30 | イッサム リサーチ デベロップメント カンパニー オブ ザ ヒーブルー ユニバーシティー オブ エルサレム | 両親媒性分子を有効に充填かつ制御放出するリポソーム |
JPH10152461A (ja) * | 1996-10-22 | 1998-06-09 | F Hoffmann La Roche Ag | 新規なカチオン性脂質 |
JPH10509418A (ja) * | 1994-09-30 | 1998-09-14 | イネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション | 細胞へのポリアニオン性材料の導入のための新規組成物 |
WO1998051278A2 (en) | 1997-05-14 | 1998-11-19 | Inex Pharmaceuticals Corporation | High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles |
WO2000030444A1 (en) * | 1998-11-25 | 2000-06-02 | Vanderbilt University | Cationic liposomes for gene transfer |
JP2002508765A (ja) | 1997-06-23 | 2002-03-19 | アルザ コーポレイション | リポソーム被包ポリヌクレオチド組成物および方法 |
WO2002028367A1 (fr) | 2000-10-04 | 2002-04-11 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de revetement de particules fines avec un film de lipides |
WO2005089287A2 (en) | 2004-03-15 | 2005-09-29 | City Of Hope | Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna |
WO2005121348A1 (en) | 2004-06-07 | 2005-12-22 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Lipid encapsulated interfering rna |
WO2006080118A1 (ja) | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
WO2006100036A1 (en) | 2005-03-23 | 2006-09-28 | Novartis Ag | 3, 4-substituted pyrrolidine derivatives for the treatment of hypertension |
WO2006116107A2 (en) | 2005-04-22 | 2006-11-02 | Alza Corporation | Immunoliposome composition for targeting to a her2 cell receptor |
JP2008505131A (ja) * | 2004-07-07 | 2008-02-21 | スタテンス セールム インスティトゥート | 糖脂質を用いた、脂質系アジュバント製剤を安定化する組成物及び方法 |
WO2009086558A1 (en) | 2008-01-02 | 2009-07-09 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
WO2011136368A1 (ja) | 2010-04-28 | 2011-11-03 | 協和発酵キリン株式会社 | カチオン性脂質 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE219660T1 (de) * | 1994-09-30 | 2002-07-15 | Inex Pharmaceuticals Corp | Mittel zum einbringen polyanionischer materialien in zellen |
US5883069A (en) * | 1996-05-02 | 1999-03-16 | The Procter & Gamble Company | Dryer-activated fabric conditioning articles with improved substrate |
AU2001247951A1 (en) * | 2000-02-07 | 2001-08-14 | Roche Diagnostics Corporation | Novel cationic amphiphiles |
WO2005120152A2 (en) * | 2004-06-07 | 2005-12-22 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods of use |
WO2010054384A1 (en) * | 2008-11-10 | 2010-05-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipids and compositions for the delivery of therapeutics |
-
2012
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- 2012-12-12 CN CN201280069481.0A patent/CN104159615B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3849458A (en) | 1966-01-21 | 1974-11-19 | Incentive Res & Dev Ab | Method for deuterating organic compounds |
JP2572554B2 (ja) | 1984-08-08 | 1997-01-16 | ザ リポソーム カンパニー、インコーポレーテッド | リポソームからの薬剤の放出速度低減方法 |
JPH0519536B2 (ja) | 1984-12-21 | 1993-03-17 | Mitsubishi Rayon Co | |
JPS61161246A (ja) | 1985-01-07 | 1986-07-21 | シンテツクス(ユー・エス・エイ)インコーポレイテツド | 置換アルキルートリ置換アンモニウム界面活性剤 |
US5049386A (en) | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
JPS61275241A (ja) | 1985-05-29 | 1986-12-05 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 重水素化アクリル酸又は重水素化メタクリル酸の製造方法 |
JPS61277648A (ja) | 1985-06-03 | 1986-12-08 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 重水素化アクリル酸又は重水素化メタクリル酸の製造方法 |
JPS63198638A (ja) | 1987-01-17 | 1988-08-17 | ヘキスト・アクチエンゲゼルシャフト | 重水素化した有機化合物の製造方法 |
JP2659136B2 (ja) | 1988-09-28 | 1997-09-30 | イッサム リサーチ デベロップメント カンパニー オブ ザ ヒーブルー ユニバーシティー オブ エルサレム | 両親媒性分子を有効に充填かつ制御放出するリポソーム |
WO1991016024A1 (en) | 1990-04-19 | 1991-10-31 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
JPH10509418A (ja) * | 1994-09-30 | 1998-09-14 | イネックス ファーマシューティカルズ コーポレイション | 細胞へのポリアニオン性材料の導入のための新規組成物 |
WO1997019675A2 (en) | 1995-11-30 | 1997-06-05 | Vical Incorporated | Complex cationic lipids |
JPH10152461A (ja) * | 1996-10-22 | 1998-06-09 | F Hoffmann La Roche Ag | 新規なカチオン性脂質 |
WO1998051278A2 (en) | 1997-05-14 | 1998-11-19 | Inex Pharmaceuticals Corporation | High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles |
JP2002501511A (ja) | 1997-05-14 | 2002-01-15 | イネックス ファーマスーティカルズ コーポレイション | 脂質小胞への荷電した治療剤の高率封入 |
JP2002508765A (ja) | 1997-06-23 | 2002-03-19 | アルザ コーポレイション | リポソーム被包ポリヌクレオチド組成物および方法 |
WO2000030444A1 (en) * | 1998-11-25 | 2000-06-02 | Vanderbilt University | Cationic liposomes for gene transfer |
WO2002028367A1 (fr) | 2000-10-04 | 2002-04-11 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de revetement de particules fines avec un film de lipides |
WO2005089287A2 (en) | 2004-03-15 | 2005-09-29 | City Of Hope | Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna |
WO2005121348A1 (en) | 2004-06-07 | 2005-12-22 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Lipid encapsulated interfering rna |
JP2008505131A (ja) * | 2004-07-07 | 2008-02-21 | スタテンス セールム インスティトゥート | 糖脂質を用いた、脂質系アジュバント製剤を安定化する組成物及び方法 |
WO2006080118A1 (ja) | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 標的遺伝子の発現を抑制する組成物 |
WO2006100036A1 (en) | 2005-03-23 | 2006-09-28 | Novartis Ag | 3, 4-substituted pyrrolidine derivatives for the treatment of hypertension |
WO2006116107A2 (en) | 2005-04-22 | 2006-11-02 | Alza Corporation | Immunoliposome composition for targeting to a her2 cell receptor |
WO2009086558A1 (en) | 2008-01-02 | 2009-07-09 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
WO2011136368A1 (ja) | 2010-04-28 | 2011-11-03 | 協和発酵キリン株式会社 | カチオン性脂質 |
Non-Patent Citations (30)
Title |
---|
"Synthesis of Organic Compounds I, 5th edition", 2005, MARUZEN, pages: 374 |
"Synthesis of Organic Compounds II", 5th edition,", 2005, MARUZEN, pages: 351 |
"Synthesis of Organic Compounds II, 5th edition", 2005, MARUZEN, pages: 146 |
"Synthesis of Organic Compounds III, 5th edition", 2005, MARUZEN |
"Synthesis of Organic Compounds III, 5th edition", 2005, MARUZEN, pages: 153 |
"Synthesis of Organic Compounds IV, 5th Ed.,", 2005, MARUZEN, pages: 1 |
"Synthesis of Organic Compounds V, 5th edition,", 2005, MARUZEN, pages: 186 |
ACC. CHEM. RES., vol. 32, 1999, pages 624 |
ARCH. BIOCHEM. BIOPHYS., vol. 212, 1981, pages 186 - 194 |
BANGHAM ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 13, 1965, pages 238 - 252 |
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1510, 2001, pages 152 - 166 |
D.D. LASIC, F. MARTIN,: "Stealth Liposomes", 1995, CRC PRESS INC., pages: 93 - 102 |
FEBS LETT., vol. 99, 1979, pages 210 - 214 |
J. AM. CHEM. SOC., vol. 122, 2000, pages 6900 |
J. AM. CHEM. SOC., vol. 123, 2001, pages 4653 |
J. AM. CHEM. SOC., vol. 124, no. 10, 2002, pages 2092 |
J. CELL BIOL., vol. 66, 1975, pages 621 - 634 |
JIKKEN KAGAKU KOUZA: "Courses in Experimental Chemistry , 5th Ed.,", vol. 17 |
JIKKEN KAGAKU KOUZA: "Courses in Experimental Chemistry , 5th edition", vol. 15 |
JIKKEN KAGAKU KOUZA: "Courses in Experimental Chemistry 5th edition,", vol. 14 |
JIKKEN KAGAKU KOUZA: "Courses in Experimental Chemistry", vol. 13 |
JIKKEN KAGAKU KOUZA: "Courses in Experimental Chemistry, 5th edition", vol. 16 |
JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 103, 1981, pages 4194 - 4199 |
LIPIDS, vol. 9, no. 11, 1974, pages 913 |
NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 32, 2004, pages E175 |
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 75, 1978, pages 4194 - 4198 |
R. H. MULLER, S. BENITA AND B. BOHM,: "Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs", 1998, SCIENTIFIC PUBLISHERS, pages: 267 - 294 |
R.C. LAROCK: "Comprehensive Organic Transformations 2nd edition,", 1999, VERLAGSGESELLSCHAFT |
See also references of EP2792368A4 * |
T.W. GREENE: "Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition,", 1999, JOHN WILEY & SONS INC. |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014007398A1 (ja) * | 2012-07-06 | 2014-01-09 | 協和発酵キリン株式会社 | カチオン性脂質 |
EP2871178A4 (en) * | 2012-07-06 | 2016-05-11 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | CATIONIC LIPID |
US10342758B2 (en) | 2012-07-06 | 2019-07-09 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Cationic lipid |
WO2014013995A1 (ja) * | 2012-07-16 | 2014-01-23 | 協和発酵キリン株式会社 | KRAS遺伝子発現抑制RNAi医薬組成物 |
US9913907B2 (en) | 2012-07-16 | 2018-03-13 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | RNAi pharmaceutical composition for suppressing expression of KRAS gene |
WO2018062413A1 (ja) * | 2016-09-28 | 2018-04-05 | 協和発酵キリン株式会社 | 核酸含有脂質ナノ粒子 |
WO2018074568A1 (ja) * | 2016-10-20 | 2018-04-26 | 協和発酵キリン株式会社 | 脂肪族3級アミン化合物の製造方法 |
WO2018074566A1 (ja) * | 2016-10-20 | 2018-04-26 | 協和発酵キリン株式会社 | ピロリジン化合物の製造方法 |
JP2020514366A (ja) * | 2017-03-15 | 2020-05-21 | モデルナティエックス インコーポレイテッドModernaTX,Inc. | 治療剤の細胞内送達のための化合物及び組成物 |
JP7167049B2 (ja) | 2017-03-15 | 2022-11-08 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | 治療剤の細胞内送達のための化合物及び組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104159615A (zh) | 2014-11-19 |
JP6182458B2 (ja) | 2017-08-16 |
AU2012353463A1 (en) | 2014-07-10 |
KR20140111272A (ko) | 2014-09-18 |
CA2858694A1 (en) | 2013-06-20 |
EP2792368A4 (en) | 2015-09-30 |
JPWO2013089152A1 (ja) | 2015-04-27 |
AU2012353463B2 (en) | 2017-08-24 |
CN104159615B (zh) | 2017-08-18 |
US20140045913A1 (en) | 2014-02-13 |
EP2792368A1 (en) | 2014-10-22 |
TW201330874A (zh) | 2013-08-01 |
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