JPWO2013089152A1 - カチオン性脂質の組み合わせを含有する脂質ナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
典型的には、カチオン性脂質は、単独で用いられるかまたはリン脂質などの中性脂質と組み合わされる。カチオン性脂質と中性脂質とを組み合わせることは、整列した脂質二重層を含む小胞を容易に形成できることから有用であることが知られている。カチオン性脂質が単独でまたは中性脂質と組み合わされて形成する小胞、またはリポソームは、表面に多数のプラス荷電を有し、この荷電により、ポリヌクレオチドまたはマイナスに帯電したたんぱく質などの他のアニオン分子と複合体を形成できる。ポリヌクレオチド/カチオン性脂質/中性脂質複合体の表面上の残りの総カチオン荷電により、細胞膜表面の主にマイナスの電荷と強い相互反応を起こすことが可能である。
多くの異なる種類のカチオン性脂質が、トランスフェクションに使用するために合成されており、現在市販されている。このようなカチオン性脂質には、例えば、Lipofectin、Lipofectin ACE、Lipofect AMINE、Transfeactam、DOTAP等がある。
特許文献1中で開示される、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)等は、初期に開発されたカチオン性脂質のひとつである。DOTMA等は、分子にカチオン部位を与える、第四級窒素を有するプロパナミニウム基、および分子のプロピルバックボーンにエーテル結合する一対の高級炭化水素により特徴付けられる。第四級窒素は、メチル基などの比較的短鎖のアルキル鎖で三置換されている。構造上類似のカチオン性脂質、N-(2,3-ジ-(9-(Z)-オクタデセノイルオキシ))-プロパ-1-イル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)は、エーテル結合したアルキル基ではなく、アシル基を含む。
特許文献2および3中で開示される、例えば、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシプロピル)]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチル臭化アンモニウム(DORIE)、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミニウムトリフルオロ酢酸(DOSPA)等は、分子にカチオン部位を与える、第四級窒素を有するプロパナミニウム基、および分子のプロピルバックボーンにエーテル結合する一対の高級炭化水素により特徴付けられ、さらに第四級窒素は、メチル基などの比較的短鎖のアルキル鎖とヒドロキシアルキルで三置換されていることにより特徴付けられる。
特許文献4中には、例えば、1,2-ジリノレイルオキシ- N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)等が開示されている。DLinDMA等は、より柔軟なカチオン性脂質を開発すること、それによりリポソーム等の膜流動性を高めることを目的に、構造上類似のカチオン性脂質であるDOTAPおよびDOTMAの高級アルキル基を、不飽和部位を少なくとも2ヵ所含む高級アルキル基としたことにより特徴付けられる。また、特許文献5中には、例えば、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)等が開示されている。
また、特許文献6中には、例えば、(3R,4R)-3,4-ビス((Z)-ヘキサデカ-9-エニルオキシ)-1-メチルピロリジン(化合物14)、N-メチル-N,N-ビス(2-((Z)-オクタデカ-6-エニルオキシ)エチル)アミン(化合物36)等が開示されている。
一方、特許文献7中には、N-メチル-N,N-ジオレイルアミン等の単純アルキルアミン型(の塩)のカチオン性脂質が開示されている。
(1) 式(I)
X1およびX2は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X3は存在しないか、炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、
X3が存在しない場合には、
Y1も存在せず、L1は単結合であり、R3は水素原子、炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであるか、あるいは
Y1も存在せず、L1は-CO-または-CO-O-であり、R3はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、
X3が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルの場合には、
Y1は製薬上許容し得る陰イオンであり、L1は単結合であり、R3は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質、および式(II)
X4およびX5は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X6は存在しないか、炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、
X6が存在しない場合には、
Y2も存在せず、aおよびbは0であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L2およびL3は-O-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、L4は単結合であり、R6は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L4は単結合であり、R6は水素原子であり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、あるいは
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L4は-CO-または-CO-O-であり、R6はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
X6が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルの場合には、
Y2は製薬上許容し得る陰イオンであり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-である)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子。
(2) R1およびR2が、ドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルである前記(1)記載の脂質ナノ粒子。
(3) R1およびR2が、ともにテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルである前記(1)記載の脂質ナノ粒子。
(4) L1が単結合であり、R3が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである前記(1)〜(3)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(5) L1が-CO-または-CO-O-であり、R3がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルである前記(1)〜(3)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(6) X1およびX2が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成する前記(1)〜(5)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(7) X1およびX2が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R3が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである前記(1)〜(5)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(8) X1およびX2が、水素原子であり、R3が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである前記(1)〜(5)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(9) X3が存在しない前記(1)〜(8)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(10) L2およびL3が、-O-または-O-CO-であり、R4およびR5が、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである前記(1)〜(9)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(11) L2およびL3が、-CO-O-であり、R4およびR5が、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルである前記(1)〜(9)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(12) L4が単結合であり、R6が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである前記(1)〜(11)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(13) L4が-CO-または-CO-O-であり、R6がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルである前記(1)〜(11)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(14) X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成する前記(1)〜(13)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(15) X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R6が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである前記(1)〜(13)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(16) X4およびX5が、水素原子であり、R6が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである前記(1)〜(13)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(17) X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R6が同一または異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシまたはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルである前記(1)〜(13)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(18) X4およびX5が、水素原子であり、R6が同一または異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシまたはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルである前記(1)〜(13)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(19) X6が存在しないか、メチルである前記(1)〜(18)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(20) 薬物として核酸を含有する前記(1)〜(19)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(21) カチオン性脂質が、該核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸との複合体を形成している、前記(20)記載の脂質ナノ粒子。
(22) カチオン性脂質が、該核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸との複合体を形成しており、該複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成された前記(20)記載の脂質ナノ粒子。
(23) 核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である前記(20)〜(22)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
(24) 標的遺伝子が、腫瘍または炎症に関連する遺伝子である前記(23)記載の脂質ナノ粒子。
(25) 前記(20)〜(24)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を用いて該核酸を細胞内に導入する方法。
(26) 細胞が、ほ乳類の腫瘍または炎症部位にある細胞である前記(25)記載の方法。
(27) 細胞が、ほ乳類の肝臓、肺、腎臓または脾臓にある細胞である前記(25)または(26)記載の方法。
(28) 細胞内に導入する方法が、静脈内投与によって細胞内に導入する方法である前記(26)または(27)記載の方法。
(29) 前記(1)〜(24)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法。
(30) 投与する方法が、静脈内投与である前記(29)記載の方法。
(31) 前記(1)〜(24)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を含む、疾患の治療に用いるための医薬。
(32) 静脈内投与用である前記(31)記載の医薬。
(33) 前記(1)〜(24)のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を含む、癌または炎症疾患の治療に用いるための癌または炎症疾患の治療剤。
(34) 静脈内投与用である前記(33)記載の癌または炎症疾患の治療剤。
X1およびX2は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X3は存在しないか、炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、
X3が存在しない場合には、
Y1も存在せず、L1は単結合であり、R3は水素原子、炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであるか、あるいは
Y1も存在せず、L1は-CO-または-CO-O-であり、R3はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、
X3が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルの場合には、
Y1は製薬上許容し得る陰イオンであり、L1は単結合であり、R3は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである)で表される化合物、および式(II)
X4およびX5は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X6は存在しないか、炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、
X6が存在しない場合には、
Y2も存在せず、aおよびbは0であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L2およびL3は-O-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、L4は単結合であり、R6は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L4は単結合であり、R6は水素原子であり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、あるいは
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L4は-CO-または-CO-O-であり、R6はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
X6が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルの場合には、
Y2は製薬上許容し得る陰イオンであり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-である)で表される化合物である。
以下、式(I)および式(II)で表される化合物を、それぞれ化合物(I)および化合物(II)ということもある。他の式番号の化合物についても同様である。
化合物(I)および化合物(II)において、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれ、窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位して、アンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオを形成していてもよく、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノは、それぞれアンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオを包含する。
本発明において、アミノ、モノアルキルアミノおよびジアルキルアミノの窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位したアンモニオ、モノアルキルアンモニオおよびジアルキルアンモニオ、ならびにトリアルキルアンモニオは、製薬上許容し得る陰イオン(前記と同義)と塩を形成していてもよい。
なお、X1およびX2が、水素原子である場合には、R3が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルがより好ましく、水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルがさらに好ましく、水素原子、メチル等が最も好ましい。
また、X1およびX2が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成する場合には、R3が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルがより好ましく、水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルがさらに好ましく、水素原子、メチル等が最も好ましい。
また、X1およびX2が、一緒になって単結合を形成する場合に、L1が-CO-または-CO-O-、好ましくは-CO-であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R3がアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル等がさらに好ましく、1,2-ジアミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチルであることが最も好ましく、R1およびR2は、同一もしくは異なってテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルであることが好ましく、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。
また、X1およびX2が、一緒になって単結合を形成する場合に、X3が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニル、好ましくはメチルであることも、本発明のより好ましい形態の1つである。
また、L1が単結合の場合には、R3は水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであることがより好ましく、水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシ-3-メトキシプロピル、アミノメチル、2-アミノエチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、2-カルバモイルエチル、2-ジメチルカルバモイルエチル、1-メチルピペリジン-4-イル等がさらに好ましく、水素原子、メチル等が最も好ましい。
なお、X3が存在せず、Y1も存在せず、L1が単結合で、R3が水素原子であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R1およびR2は、同一または異なってドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが好ましく、同一または異なって(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニルまたは(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-テトラデカ-7-エニルであることが最も好ましいうちの1つであり、また(Z)-ヘキサデカ-7-エニルであることが最も好ましいうちの1つであり、また(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルであることが最も好ましい。
また、X3が存在せず、Y1も存在せず、L1が単結合で、R3がメチルであることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R1およびR2は、同一または異なってドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが好ましく、同一または異なって(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-テトラデカ-7-エニルであることが最も好ましいうちの1つであり、また(Z)-ヘキサデカ-7-エニルであることが最も好ましいうちの1つであり、また(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニルであることが最も好ましいうちの1つであり、また(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。
また、L2およびL3の少なくとも1つが、-O-である場合には、-O-に結合するR4およびR5は、同一もしくは異なってドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニル、3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルであるか、またはR4およびR5が、一緒になってジアルキルメチレンもしくはジアルケニルメチレンを形成することがより好ましく、R4およびR5が、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであるか、またはR4およびR5が、一緒になってジ(テトラデシル)メチレン、ジ(ヘキサデシル)メチレン、ジ(オクタデシル)メチレン、ジ((Z)-ヘキサデカ-9-エニル)メチレン、ジ((Z)-オクタデカ-6-エニル)メチレン、ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)メチレン、ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)メチレンを形成することがさらに好ましく、R4およびR5が、同一または異なってテトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。なお、いずれの場合も、R4およびR5は、同一であるか、またはR4およびR5が、一緒になってアルキル、アルケニルもしくはアルキニル部分が同一であるジアルキルメチレン、ジアルケニルメチレンもしくはジアルキニルメチレンを形成することがさらに好ましい。
なお、aおよびbが、同時に1である場合には、X4およびX5は、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成することがより好ましい。また、aおよびbが、同時に1であり、L4が単結合の場合には、L2およびL3が、-CO-O-であることも本発明のより好ましい形態の一つである。
また、X4およびX5が、一緒になって単結合を形成する場合に、L4が-CO-または-CO-O-、好ましくは-CO-であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R6がアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル等がさらに好ましく、1,2-ジアミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、1,5-ジアミノペンチルであることが最も好ましい。
また、X4およびX5が、一緒になって単結合を形成する場合に、aおよびbは、同一または異なって1〜3、好ましくは1であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合に、L2およびL3が、同一の-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であり、R6がメチルであることも、本発明のさらに好ましい形態の1つであり、その場合には、R4およびR5は、同一もしくは異なって(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘプタデカ-8-エニルまたは(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニルであることが最も好ましい。
また、X4およびX5が、一緒になって単結合を形成する場合に、X6が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニル、好ましくはメチルであることも、本発明のより好ましい形態の1つである、この場合、L2およびL3は、同一の-CO-O-または-O-CO-であることがさらに好ましく、-CO-O-であることが最も好ましい。
また、L4が単結合の場合には、R6は水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであることがより好ましく、水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、2-ヒドロキシエチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-ヒドロキシ-3-メトキシプロピル、アミノメチル、2-アミノエチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、2-カルバモイルエチル、2-ジメチルカルバモイルエチル、1-メチルピペリジン-4-イル等がさらに好ましく、水素原子、メチル、2,3-ジヒドロキシプロピル、3-ヒドロキシプロピル、2-アミノエチル、3-アミノプロピル、4-アミノブチル、5-アミノペンチル、2-カルバモイルエチル等が最も好ましく、いずれの場合も、L2およびL3は、-O-であることがより好ましい。
なお、X6が存在せず、Y2も存在せず、L4が単結合で、R6が水素原子の場合には、L2およびL3が、同一の-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であることも、本発明のより好ましい形態の1つである。この場合には、R4およびR5は、同一もしくは異なって(Z)-ヘプタデカ-5-エニルまたは(Z)-ヘプタデカ-8-エニルであることがより好ましく、同一に(Z)-ヘプタデカ-5-エニルまたは(Z)-ヘプタデカ-8-エニルであることが最も好ましい。
また、L4が-CO-または-CO-O-の場合には、R6はピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルであることがより好ましく、R6はアミノメチル、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチル、(N,N-ジメチルアミノ)メチル、2-(N,N-ジメチルアミノ)エチル、3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル、1-アミノ-2-ヒドロキシエチル等がさらに好ましく、1,2-ジアミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチル等が最も好ましい。
L4が-CO-または-CO-O-の場合に、R6がアミノメチル、1-ヒドロキシ-2-アミノエチル、2-アミノエチル、1,3-ジアミノプロピル、3-アミノプロピル、1,4-ジアミノブチル、4-アミノブチル、1,5-ジアミノペンチル、5-アミノペンチルであり、L2およびL3は、同一の-O-であることも、本発明のさらに好ましい形態の1つである。この場合には、R4およびR5は、同一もしくは異なって(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることがより好ましく、同一に(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルであることが最も好ましい。
L5およびL6は、-CO-O-または-O-CO-、好ましくは-CO-O-であり、
aおよびbは、それぞれ前記と同義であり、好ましくは1であり、
R9はR6のうちの、水素原子、炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルである)で表される化合物(ii)が、より好ましい化合物(II)の1つとしてあげられる。
化合物(I)のうち、X1およびX2が水素原子であり、L1は単結合であり、X3およびY1は存在しない、化合物(Ia)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(IIIb)は、化合物(IIIa)と化合物(IVa)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間処理することにより製造することができる。さらに、化合物(Ia)は、化合物(IIIb)と化合物(IVb)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間処理し、単離することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
塩基としては、例えば炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)等があげられる。
化合物(IIIa)は、市販品または公知の方法(例えば、「実験化学講座14 有機化合物の合成II」、第5版、丸善、2005年、p.351)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(IVa)および化合物(IVb)は、市販品または公知の方法(例えば、「実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、丸善、2005年、p.374)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
R1とR2が同一の場合の化合物(Ia)は、工程1において、2当量以上の化合物(IVa)を用いることで得ることができる。
化合物(I)のうち、X1およびX2が、一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、L1は単結合であり、X3およびY1は存在しない、化合物(Ib)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(Vb)は、化合物(Va)と化合物(VIa)を溶媒中、1〜10当量の塩基の存在下、-100℃と100℃の間の温度で、5分間〜100時間処理することにより製造することができる。さらに、化合物(Vc)は、化合物(Vb)と化合物(VIb)を、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-100℃と100℃の間の温度で、5分間〜100時間処理し、単離することにより製造することができる。
溶媒としては、製造法1と同じものがあげられる。
塩基としては、例えば水素化ナトリウム、水素化カリウム、カリウムtert-ブトキシド、ナトリウムtert-ブトキシド、リチウムジイソプロピルアミド(LDA)、リチウムヘキサメチルジシラジド(LHMDS)などがあげられる。
化合物(Va)は、市販品または公知の方法(例えば、「実験化学講座16 有機化合物の合成IV」、第5版、丸善、2005年、p.146)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物(VIa)および化合物(VIb)は、市販品または公知の方法(例えば、「実験化学講座13 有機化合物の合成I」、第5版、丸善、2005年、p.374)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
R1とR2が同一の場合の化合物(Vc)は、工程3において、2当量以上の化合物(VIa)を用いることで得ることができる。
化合物(Ib)は、化合物(Vc)を溶媒中、1当量〜大過剰量の還元剤および必要により好ましくは0.1〜10当量の金属化合物の存在下、-100℃と100℃の間の温度で、5分間〜100時間処理することにより製造することができる。
還元剤としては、例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム等があげられる。
金属化合物としては、例えば塩化コバルト、塩化鉄、塩化アルミニウム等があげられる。
化合物(I)のうち、L1は単結合であり、R3は-CHRARB(RAおよびRBは、同一または異なって水素原子、炭素数1〜5のアルキル、炭素数2〜5のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜5のアルキルもしくは炭素数2〜5のアルケニルであるか、または隣接する炭素原子と一緒になってピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イルもしくはピペリジン-4-イルを形成し、RAおよびRBが、ともに水素原子である場合を除き、RAおよびRBのアルキル、置換されたアルキルのアルキル部分、アルケニルおよび置換されたアルケニルのアルケニル部分の炭素数の総和は1〜5であり、RAおよびRBのいずれかが、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルまたはモルホリン-3-イルである場合には、該RAおよびRBのもう一方は、水素原子、炭素数1〜5のアルキル、炭素数2〜5のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1つもしくは2つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜5のアルキルもしくは炭素数3〜5のアルケニルであり、RAおよびRBが、置換されたアルキルまたはアルケニルである場合には、該置換基の総数は2または3である)であり、X3およびY1が存在しない、化合物(Ic)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(Ic)は、化合物(Ia)および化合物(Ib)のうちのR3が水素原子である化合物(Id)を、好ましくは1〜10当量の化合物(VII)と、溶媒中、好ましくは1当量〜大過剰量の還元剤および必要により好ましくは1〜10当量の酸の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
還元剤としては、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム等があげられる。
酸としては、例えば塩酸、酢酸等があげられる。
化合物(I)のうち、L1が-CO-で、X3およびY1が存在しない、化合物(Ie)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(Ie)は、化合物(Id)と化合物(VIII)とを溶媒中で、-20℃と150℃の間の温度で、1当量〜大過剰量の縮合剤で5分間から100時間処理することにより製造することができる。このとき、必要により好ましくは0.01〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1当量〜大過剰量の塩基を加え、反応を促進させることもできる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
縮合剤としては、例えば1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスファート、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート、ヨウ化 2-クロロ-1-メチルピリジニウム等があげられる。
添加剤としては、例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、4-ジメチルアミノピリジン等があげられる。
塩基としては、例えば酢酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン等があげられる。
化合物(I)のうち、L1が-CO-O-で、X3およびY1が存在しない、化合物(If)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(If)は、化合物(Id)を、化合物(IX)と、無溶媒でまたは溶媒中、必要により好ましくは1〜10当量の添加剤の存在下、および/または必要により好ましくは1〜10当量の塩基の存在下、-20℃と150℃の間の温度で、5分間〜72時間反応させることにより製造することができる。
溶媒および添加剤としては、製造法4と同じものがあげられる。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン等があげられる。
化合物(I)のうち、L1は単結合であり、R3は-CH2-C(OH)RCRD(RCおよびRDは、同一または異なって水素原子、炭素数1〜4のアルキル、炭素数2〜4のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1つもしくは2つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜4のアルキルもしくは炭素数2〜4のアルケニルであり、RCおよびRDが、ともに水素原子である場合を除き、RCおよびRDのアルキル、置換されたアルキルのアルキル部分、アルケニルおよび置換されたアルケニルのアルケニル部分の炭素数の総和は1〜4であり、RCおよびRDのいずれかが、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イルまたはモルホリン-3-イルである場合には、該RCおよびRDのもう一方は水素原子、炭素数1〜4のアルキル、炭素数2〜4のアルケニル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは1つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜4のアルキルもしくは炭素数2〜4のアルケニルであり、RCおよびRDが、置換されたアルキルまたはアルケニルである場合には、該置換基の総数は2である)であり、X3およびY1が存在しない、化合物(Ig)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(Ig)は、化合物(Id)と化合物(X)を溶媒中または無溶媒で、0℃と230℃の間の温度で、5分間から100時間処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、1-プロパノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
化合物(I)のうち、L1が単結合であり、X3が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、Y1が製薬上許容し得る陰イオンである化合物(Ih)は以下の方法によって製造することができる。
化合物(Ii)は、化合物(Ia)または化合物(Ib)である。
化合物(Ih-A)は、化合物(Ii)と化合物(XI)を溶媒中または無溶媒で、0℃と230℃の間の温度で、5分間から100時間処理することにより製造することができる。化合物(Ih)は、化合物(Ih-A)をY型の陰イオン交換樹脂で処理することにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
また、ZとY1が同一の場合には、工程11を省略することにより(Ih)を製造することができる。
上記各製造法における中間体および目的化合物は、有機合成化学で常用される分離精製法、例えば、ろ過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等に付して単離精製することができる。また、中間体においては特に精製することなく次の反応に供することも可能である。
化合物(I)の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、化合物(I)は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
化合物(I)中の各原子の一部またはすべては、それぞれ対応する同位体原子で置き換わっていてもよく、化合物(I)は、これら同位体原子で置き換わった化合物も包含する。例えば、化合物(I)中の水素原子の一部またはすべては、原子量2の水素原子(重水素原子)であってもよい。
化合物(I)中の各原子の一部またはすべてが、それぞれ対応する同位体原子で置き換わった化合物は、市販のビルディングブロックを用いて、上記各製造法と同様な方法で製造することができる。また、化合物(I)中の水素原子の一部またはすべてが重水素原子で置き換わった化合物は、例えば、1)過酸化重水素を用い、塩基性条件下にカルボン酸などを重水素化する方法(米国特許第3849458号明細書参照)、2)イリジウム錯体を触媒として用い、重水を重水素源として用いてアルコール、カルボン酸などを重水素化する方法("ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ(J. Am. Chem. Soc.)"、(米国)、 2002年、124巻、10号、p.2092参照)、3)パラジウムカーボンを触媒として用い、重水素源として重水素ガスのみを用いて脂肪酸を重水素化する方法("リピッズ(LIPIDS)、(米国)、1974年、9巻、11号、p.913参照)、4)白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、イリジウムなどの金属を触媒として用い、重水または重水および重水素ガスを重水素源として用いて、アクリル酸、アクリル酸メチル、メタクリル酸、メタクリル酸メチルなどを重水素化する方法(特公平5-19536号公報、特開昭61-277648号公報および特開昭61-275241号公報参照)、5)パラジウム、ニッケル、銅または亜クロム酸銅などの触媒を用い、重水を重水素源として用いて、アクリル酸、メタクリル酸メチルなどを重水素化する方法(特開昭63-198638号公報参照)などを用いて合成することもできる。
なお、化合物(II)において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法(例えば、グリーン(T.W.Greene)著、"プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス(Protective Groups in Organic Synthesis)"、(米国)、第3版、ジョン・ウィリーアンドソンズ・インク(John Wiley&Sons Inc.)、1999年等に記載の方法)等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入などの反応工程の順序を変えることもできる。
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性を向上させるかもしくはその他の分解因子から安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基として、2’-シアノ、2’-ハロゲン、2’-O-シアノ、2’-アルキル、2’-置換アルキル、2’-O-アルキル、2’-O-置換アルキル、2’-O-アルケニル、2’-O-置換アルケニル、2’-Se-アルキル、2’-Se-置換アルキルが好ましく、2’-シアノ、2’-フルオロ、2’-クロロ、2’-ブロモ、2’-トリフルオロメチル、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-O-イソプロピル、2’-O-トリフルオロメチル、2'-O-[2-(メトキシ)エチル]、2'-O-(3-アミノプロピル)、2'-O-[2-(N,N-ジメチル)アミノオキシ]エチル、2'-O-[3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル]、2'-O-{2-[2-(N,N-ジメチルアミノ)エトキシ]エチル}、2'-O-[2-(メチルアミノ)-2-オキソエチル]、2’-Se-メチル等がより好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチル、2’-フルオロ等がさらに好ましく、2’-O-メチル、2’-O-エチルがもっとも好ましい。
また、糖部修飾ヌクレオチドの修飾基は、その大きさから好ましい範囲を定義することもでき、フルオロの大きさから-O-ブチルの大きさに相当するものが好ましく、-O-メチルの大きさから-O-エチルの大きさに相当する大きさのものがより好ましい。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるアルケニルは、化合物(I)における炭素数3〜6のアルケニルと同義である。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基におけるハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
アミノ酸残基におけるアミノ酸としては、例えば脂肪族アミノ酸(具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン等)、ヒドロキシアミノ酸(具体的には、セリン、トレオニン等)、酸性アミノ酸(具体的には、アスパラギン酸、グルタミン酸等)、酸性アミノ酸アミド(具体的には、アスパラギン、グルタミン等)、塩基性アミノ酸(具体的には、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン等)、含硫アミノ酸(具体的には、システイン、シスチン、メチオニン等)、イミノ酸(具体的には、プロリン、4-ヒドロキシプロリン等)等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドの修飾基における置換アルキルおよび置換アルケニルの置換基としては、例えば、ハロゲン(前記と同義)、ヒドロキシ、スルファニル、アミノ、オキソ、-O-アルキル(該-O-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-S-アルキル(該-S-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、-NH-アルキル(該-NH-アルキルのアルキル部分は前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノオキシ(該ジアルキルアミノオキシの2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノ(該ジアルキルアミノの2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義)、ジアルキルアミノアルキレンオキシ(該ジアルキルアミノアルキレンオキシの2つのアルキルは同一または異なって前記アルキルと同義であり、アルキレン部分は前記アルキルから水素原子が1つ除かれたものを意味する)等があげられ、置換数は好ましくは1〜3である。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基で置換されたもの、メチル基が水素原子もしくは炭素数2〜6のアルキル基で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基等の保護基で保護されたものがあげられる。
さらに、ヌクレオチド誘導体として、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素など、別の化学物質を付加したものもあげられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等があげられる。
また、ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
標的遺伝子のmRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸といい、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸ともいう。センス鎖核酸は、標的遺伝子の一部の塩基配列からなる核酸そのもの等、アンチセンス鎖核酸と対合して二重鎖形成部ができる核酸をいう。
二本鎖核酸とは、二本の鎖が対合し二重鎖形成部を有する核酸をいう。二重鎖形成部とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖形成部を構成する塩基対は、通常15〜27塩基対であり、15〜25塩基対が好ましく、15〜23塩基対がより好ましく、15〜21塩基対がさらに好ましく、15〜19塩基対が特に好ましい。
二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖、センス鎖のいずれか一方、または両方の核酸は、二重鎖形成部に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加の核酸を有してもよい。この二重鎖を形成しない部分を突出部(オーバーハング)ともいう。
突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜4塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、dTdTまたはUUからなる突出部を有するものがより好ましく用いられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。
また、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAと一部または全てが一致する配列、または、二重鎖形成部に続いて標的遺伝子のmRNAの相補鎖の塩基配列と一致する配列を用いてもよい。さらに、標的遺伝子の発現を抑制する核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により前記の二本鎖核酸を生成する核酸分子(国際公開第2005/089287号)や、3’末端や5’末端の突出部を有していない二本鎖核酸などを用いることもできる。
また、アンチセンス鎖およびセンス鎖の3’末端の塩基に結合する糖は、それぞれ3’位の水酸基が、リン酸基もしくは前記の修飾基、または生体内の核酸分解酵素等でリン酸基もしくは前記の修飾基に変換される基によって修飾されていてもよい。
一本鎖核酸として、上記の二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を、スペーサー配列(スペーサーオリゴヌクレオチド)を介して連結したものを用いてもよい。スペーサーオリゴヌクレオチドとしては6〜12塩基の一本鎖核酸分子が好ましく、その5’末端側の配列は2個のUであるのが好ましい。スペーサーオリゴヌクレオチドの例として、UUCAAGAGAの配列からなる核酸があげられる。スペーサーオリゴヌクレオチドによってつながれるアンチセンス鎖およびセンス鎖の順番はどちらが5’側になってもよい。該一本鎖核酸としては、ステムループ構造によって二重鎖形成部を有するshRNA等の一本鎖核酸であることが好ましい。shRNA等の一本鎖核酸は、通常50〜70塩基長である。
リボヌクレアーゼ等の作用により、上記の一本鎖核酸または二本鎖核酸を生成するように設計した、70塩基長以下、好ましくは50塩基長以下、さらに好ましくは30塩基長以下の核酸を用いてもよい。
また、本発明の脂質ナノ粒子としては、例えば化合物(I)と核酸等との複合体、または化合物(I)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子等もあげられる。この場合の脂質膜も、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。なお、該脂質膜に、化合物(I)、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、該複合体および/または該脂質膜に、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有していてもよい。
また、本発明の脂質ナノ粒子としては、例えば化合物(II)と核酸等との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)を含有する脂質ナノ粒子等もあげられる。この場合の脂質膜も、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。なお、該脂質膜に、化合物(II)、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、該複合体および/または該脂質膜に、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有していてもよい。
また、本発明の脂質ナノ粒子としては、例えば化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子等もあげられる。この場合の脂質膜も、脂質一重膜(脂質1分子膜)でも脂質二重膜(脂質2分子膜)であってもよい。なお、該脂質膜に、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質、中性脂質ならびに/または高分子を含有していてもよい。
複合体および該複合体を封入する脂質二重膜から構成された脂質ナノ粒子としては、該複合体および該複合体を封入する脂質二重膜から構成されたリポソーム等があげられる。
なお、本発明の脂質ナノ粒子は、薬物として例えば核酸を含有することができるが、核酸と化学的に近似した化合物も含有することもできる。
いずれの場合も、本発明の脂質ナノ粒子には、化合物(I)および化合物(II)をそれぞれ一種または複数種を使用してよく、また化合物(I)および/または化合物(II)には、化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を混合してもよい。
化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質としては、例えば、特開昭61-161246号公報(米国特許5049386号明細書)中で開示される、DOTMA、DOTAP等、国際公開第91/16024号および国際公開第97/019675号中で開示される、DORIE、DOSPA等、国際公開第2005/121348号中で開示される、DLinDMA等、国際公開第2009/086558号中で開示される、DLin-K-DMA等があげられ、好ましくはDOTMA、DOTAP、DORIE、DOSPA、DLinDMA、DLin-K-DMA等の2つの非置換アルキル基を有する3級アミン部位または3つの非置換アルキル基を有する4級アンモニウム部位を有するカチオン性脂質であることがあげられ、より好ましくは、該3級アミン部位を有するカチオン性脂質があげられる。該3級アミン部位および該4級アンモニウム部位の非置換アルキル基はメチル基であることがより好ましい。
本発明の脂質ナノ粒子のうち、化合物(I)および化合物(II)と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入した脂質二重膜から構成されたリポソームは、例えば、国際公開第02/28367号および国際公開第2006/080118号等に記載の製造方法に従って製造することができる。
いずれの場合も、脂質膜に化合物(I)と化合物(II)とを混合して使用することがより好ましい。すなわち、化合物(I)および化合物(II)と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)、ならびに/または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子、化合物(I)と核酸等との複合体、または化合物(I)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子、化合物(II)と核酸等との複合体、または化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子がより好ましく、化合物(I)および化合物(II)と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体ならびに該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)、化合物(II)、ならびに/または化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子、化合物(I)と核酸等との複合体、化合物(I)に中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子がさらに好ましく、化合物(I)と核酸等との複合体、または化合物(I)および化合物(II)と核酸等との複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成され、脂質膜に化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子が最も好ましい。
本発明の核酸を含有する脂質ナノ粒子において、複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成された脂質ナノ粒子中の化合物(I)の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して1〜15倍であるのが好ましく、2.5〜10倍であるのがより好ましく、3.5〜8倍であるのがさらに好ましい。また、該脂質ナノ粒子中の化合物(I)および化合物(I)以外のカチオン性脂質の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して1〜15倍であるのが好ましく、2.5〜10倍であるのがより好ましく、3.5〜8倍であるのがさらに好ましい。
また、本開示の該核酸と該リポソームとの複合体中のリポソームは、予め大きさを、平均粒子径10nm〜400nm、より好ましくは30nm〜110nm、さらに好ましくは40nm〜80nmに調節したリポソームが好ましい。また、該複合体および/または脂質膜に、中性脂質および/または高分子を含有していてもよい。また、A液は、リポソームと該核酸との複合体を形成させることができれば、エタノール濃度は、20〜40%であってもよい。
また、等量のA液とB液を混合する代わりに、A液とB液を混合後に複合体が溶解せず、かつB液中のカチオン性脂質が溶解しないエタノール濃度、好ましくは複合体が溶解せず、B液中のカチオン性脂質が溶解せず、かつエタノール濃度が30〜60%のエタノール水溶液になるような比でA液とB液を混合することに代えてもよく、あるいはA液とB液を混合後に複合体が溶解しないようなエタノール濃度になるような比でA液とB液を混合し、さらに水を加えることで、B液中のカチオン性脂質が溶解しなくなるエタノール濃度にすることにしてもよい。
本開示の該A液中での核酸とリポソームとの複合体は、A液とB液を混合し、さらに適宜に水を加えた後には、カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)と核酸との複合体に形態が変化している。本開示の製造方法で得られる該核酸と該カチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子は、好ましくはカチオン性脂質と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する脂質ナノ粒子であり、より好ましくは、カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)と核酸との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有し、該脂質膜にカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子であり、その製造性(収率および/または均一性)は優れている。
該A液中での核酸とリポソームとの複合体において、複合体中のカチオン性脂質の分子の総数は、核酸のリン原子の数に対して0.5〜8倍であるのが好ましく、1.5〜5倍であるのがより好ましく、2〜3倍であるのがさらに好ましい。
A液とB液を混合後の該核酸と該カチオン性脂質を含有する脂質一重層からなる膜(逆ミセル)との複合体および該複合体を封入する脂質膜を含有する脂質ナノ粒子においては、該複合体および該複合体を封入する脂質膜中のカチオン性脂質の分子の総数は、該核酸のリン原子の数に対して1〜15倍であるのが好ましく、2.5〜10倍であるのがより好ましく、3.5〜8倍であるのがさらに好ましい。
本発明の脂質ナノ粒子において中性脂質を含有する場合には、中性脂質の分子の総数は、化合物(I)および化合物(II)、ならびに化合物(I)および化合物(II)以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.1〜1.8倍であるのが好ましく、0.3〜1.2倍であるのがより好ましく、0.4〜0.9倍であるのがさらに好ましい。本発明における脂質ナノ粒子は、中性脂質を、複合体に含有していてもよく、該複合体を封入する脂質膜に含有していてもよく、少なくとも該複合体を封入する脂質膜に含有していることがより好ましく、該複合体および該該複合体を封入する脂質膜のどちらにも含有していることがさらに好ましい。
本発明の脂質ナノ粒子が、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体を含有する場合には、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる1つ以上の物質の脂質誘導体および脂肪酸誘導体の分子の総数は、化合物(I)、化合物(I)および化合物(I)以外のカチオン性脂質の分子の総数に対して0.05〜0.3倍であるのが好ましく、0.07〜0.25倍であるのがより好ましく、0.1〜0.2倍であるのがさらに好ましい。
また、標的化リガンドを、本発明の脂質ナノ粒子の脂質成分の極性ヘッド残基に共有結合することにより本発明の脂質ナノ粒子の表面に直接結合させることも任意に行うことができる(国際公開第2006/116107号参照)。
インビトロで本発明の脂質ナノ粒子を、ほ乳類の細胞に投与する方法は、インビトロにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。
本発明の脂質ナノ粒子中の核酸等が、RNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸であれば、インビボでほ乳類の細胞内に、遺伝子の発現を抑制する核酸等を導入することができ、遺伝子等の発現の抑制ができる。投与対象は、人であることが好ましい。
また、本発明の脂質ナノ粒子における標的遺伝子が、例えば腫瘍または炎症に関連する遺伝子であれば、本発明の脂質ナノ粒子を、癌または炎症疾患の治療剤または予防剤、好ましくは固形癌または血管もしくは血管近傍の炎症の治療剤または予防剤として使用することができる。具体的には、本発明の脂質ナノ粒子における標的遺伝子が、血管新生に関連する遺伝子等であれば、血管平滑筋の増殖や血管新生等を抑制できるので、本発明の脂質ナノ粒子を、例えば血管平滑筋の増殖や血管新生を伴う癌または炎症疾患の治療剤または予防剤として使用することができる。本発明のカチオン性脂質を、複数種を組み合わせて使用する場合または本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質と組み合わせて使用する場合には、個々のカチオン性脂質を単独で使用する場合と比べて減量できるので、カチオン性脂質が原因の好ましくない事象の発生率や程度を減らすことができる。
即ち、本発明は、上記説明した本発明の脂質ナノ粒子を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法も提供する。投与対象は、人であることが好ましく、癌または炎症疾患に罹患している人がより好ましい。
また、本発明の脂質ナノ粒子は、癌または炎症疾患の治療剤または予防剤に関するインビボの薬効評価モデルにおいて、標的遺伝子を抑制することの有効性を検証するためのツールとして使用することもできる。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路などによって異なるが、例えば核酸に換算した1日投与量が約0.1μg〜1000mgとなるように投与すればよい。
注射剤の場合、前記の脂質ナノ粒子の分散液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した脂質ナノ粒子に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
なお、参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。なお、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。
メチルジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン(化合物1)
メチルアミン(アルドリッチ(Aldrich)社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、10.5 mL、21.0 mmol)に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(ニューチェック・プレップ(Nu-Chek Prep,Inc)社製, 1.03 g, 3.00 mmol)を加え、マイクロ波反応装置を用いて150℃で90分間加熱撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、2 mol/L水酸化ナトリウム水溶液、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮することでメチル((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミンの粗生成物を得た。
得られた粗生成物に(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 0.93 g, 2.70 mmol)および50%水酸化ナトリウム水溶液(0.960 g, 12.0 mmol)を加え、油浴上135℃で60分間加熱撹拌した。室温まで冷却後、反応液を酢酸エチルで希釈し、水、ついで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=100/0〜97/3)で精製することにより化合物1(1.07 g, 67.2 %)を得た。
ESI-MS m/z: 529 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 32H), 1.40-1.51 (m, 4H), 1.97-2.06 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
メチルジ((Z)-ヘキサデカ-9-エニル)アミン (化合物2)
参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、10.0 mL、20.0 mmol)および(Z)-ヘキサデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 1.21 g, 3.80 mmol)を用い、化合物2(0.491 g, 51.6 %)を得た。
ESI-MS m/z: 477 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 36H), 1.46-1.57 (m, 4H), 1.97-2.05 (m, 8H), 2.33 (s, 3H), 2.45 (t, J = 7.9 Hz, 4H), 5.29-5.41 (m, 4H).
メチルジ((11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル)アミン (化合物3)
参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、16.0 mL、32.0 mmol)および(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.98 g, 8.00 mmol)を用い、化合物3(1.27 g, 54.4%)を得た。
ESI-MS m/z: 585 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.27 (br s, 40H), 1.39-1.51 (m, 4H), 2.01-2.09 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.79 (d, J = 6.3 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)アミン (化合物4)
参考例1と同様の方法で、アンモニア(東京化成工業社製、約2 mol/Lメタノール溶液、18.0 mL、36.0 mmol)および(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.79 g, 8.10 mmol)を用い、化合物4(0.838 g, 36.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 515 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.30 (br s, 33H), 1.41-1.54 (m, 4H), 2.01-2.09 (m, 8H), 2.59 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 2.77 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
ジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミン (化合物5)
参考例1と同様の方法で、アンモニア(東京化成工業社製、約2 mol/Lメタノール溶液、12.0 mL、24.0 mmol)および(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 1.87 g, 5.40 mmol)を用い、化合物5(0.562 g, 36.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 519 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 6H), 1.29 (br s, 45H), 1.41-1.52 (m, 4H), 1.97-2.05 (m, 8H), 2.58 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 5.28-5.40 (m, 4H).
メチルジ((Z)-オクタデカ-9-エニル)アミン (化合物6)
参考例1と同様の方法で、メチルアミン(Aldrich社製、約2 mol/Lテトラヒドロフラン溶液、11.2 mL、22.4 mmol)および(Z)-オクタデカ-9-エニル メタンスルホナート(Nu-Chek Prep,Inc社製, 2.11 g, 6.09 mmol)を用い、化合物6(1.20 g, 70.2 %)を得た。
ESI-MS m/z: 533 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27 (br s, 44H), 1.39-1.50 (m, 4H), 1.97-2.06 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 5.28-5.40 (m, 4H).
国際公開第2006/100036号を参考にして合成したtrans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチル(156 mg, 0.674 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解させ、オレイン酸(東京化成工業社製、419 mg, 1.48 mmol)、WSCD(国産化学社製、297 mg, 1.55 mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(東京化成工業社製、DMAP (20.6 mg, 0.169 mmol)を加え室温で終夜撹拌した。反応液に飽和重曹水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/クロロホルム=50/50〜0/100)で精製することにより化合物145 (280 mg, 54.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 761 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.25-1.46 (m, 36H), 1.46 (s, 9H), 1.46-1.66 (m, 8H), 1.97-2.04 (m, 8H), 2.27-2.38 (m, 6H), 3.10-3.23 (m, 2H), 3.53-3.66 (m, 2H), 4.03 (dd, J = 10.8, 6.0 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 10.8, 6.0 Hz, 2H), 5.28-5.40 (m, 4H).
参考例7と同様の方法で、国際公開第2006/100036号を参考にして合成したtrans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチル(150 mg, 0.674 mmol)およびリノール酸(アルドリッチ社製、400 mg, 1.48 mmol)を用い、化合物146 (351 mg, 71.7%)を得た。
ESI-MS m/z: 757 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.21-1.45 (m, 26H), 1.46 (s, 9H), 1.47-1.68 (m, 6H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 2.26-2.38 (m, 6H), 2.77 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 3.10-3.23 (m, 2H), 3.53-3.66 (m, 2H), 4.03 (dd, J = 11.0, 6.0 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 11.0, 6.0 Hz, 2H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例7で得られた化合物145 (278 mg, 0.366 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解させ、トリフルオロ酢酸(0.563 mL, 7.31 mmol)を加え室温で3時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣を少量のメタノールに溶解し、プラスチックカラムに充填したBONDESIL-SCX(ヴァリアン(VARIAN)社製、6 g)の上部に吸着させ、メタノールで洗浄し、次いでアンモニア・メタノール溶液(東京化成工業社製、2 mol/L)で目的物を溶出させた。目的物を含むフラクションを減圧下濃縮することで化合物110 (162 mg, 67.2%)を得た。
ESI-MS m/z: 661 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.27-1.35 (m, 40H), 1.56-1.64 (m, 4H), 2.01 (q, J = 5.9 Hz, 8H), 2.09-2.16 (m, 2H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.72 (dd, J = 11.3, 5.5 Hz, 2H), 3.11 (dd, J = 11.3, 7.1 Hz, 2H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.29-5.40 (m, 4H).
参考例9と同様の方法で、参考例8で得られた化合物146(350 mg, 0.463 mmol)を用い、化合物111 (224 mg, 73.6%)を得た。
ESI-MS m/z: 657 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.26-1.40 (m, 28H), 1.57-1.66 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.6 Hz, 8H), 2.09-2.17 (m, 2H), 2.31 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.72 (dd, J = 11.3, 6.0 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 6.2 Hz, 4H), 3.11 (dd, J = 11.3, 7.3 Hz, 2H), 3.99-4.13 (m, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例10で得られた化合物111 (80 mg, 0.12 mmol)を1,2-ジクロロエタン(1.5 mL)、メタノール(1.5 mL)に溶解させ、ホルムアルデヒド(0.091 mL, 1.22 mmol)、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(アクロス・オーガニクス(Acros Organics)社製、129 mg, 0.610 mmol)を複数回にわたって加え室温で1.5時間撹拌した。反応溶液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=100/0〜93/7)で精製することで化合物117 (66 mg, 81%)を得た。
ESI-MS m/z: 671 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H), 1.25-1.40 (m, 28H), 1.57-1.66 (m, 4H), 2.05 (q, J = 6.7 Hz, 8H), 2.13-2.24 (m, 2H), 2.27-2.37 (m, 9H), 2.66 (dd, J = 9.2, 7.3 Hz, 2H), 2.77 (t, J = 5.7 Hz, 4H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.28-5.43 (m, 8H).
参考例11と同様の方法で、参考例9で得られた化合物110 (50 mg, 0.076 mmol)を用い、化合物116 (47 mg, 92%)を得た。
ESI-MS m/z: 675 (M + H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.26-1.35 (m, 40H), 1.56-1.65 (m, 4H), 2.01 (q, J = 5.5 Hz, 8H), 2.15-2.24 (m, 2H), 2.27-2.37 (m, 9H), 2.67 (dd, J = 9.3, 7.1 Hz, 2H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.29-5.40 (m, 4H).
国際公開第2011/136368号記載の方法(参考例16)によって得られる(trans-1-ベンジルピロリジン-3,4-ジイル)ジメタノール(2.06 g, 9.31 mmol)のメタノール(3 mL)溶液にヨウ化メチル(東京化成工業社製、26.4 g, 186 mmol)を加え、室温で2時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮した。残渣を陰イオン交換樹脂(Dowex 1x-200 塩化物型(ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー(The Dow Chemical Company)社製)、約30 mL、水とメタノールでプレ洗浄したもの)にロードし、メタノールで溶出した。溶出液を減圧下濃縮した。残渣に酢酸エチルを加え、生じた結晶をろ取することでtrans-1-ベンジル-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)-1-メチルピロリジニウム塩化物(2.53 g, 定量的収率)を得た。
ESI-MS m/z: 236 M+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 2.67 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 3.28-3.45 (m, 4H), 3.53-3.98 (m, 6H), 4.63 (s, 2H), 7.49-7.63 (m, 5H).
得られたtrans-1-ベンジル-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)-1-メチルピロリジニウム塩化物(2.53 g, 9.31 mmol)にパラジウム炭素(約10%含水、0.495 g, 0.465 mmol)とメタノール(25 mL)を加えて、水素ガス雰囲気下50℃で3時間加熱攪拌した。反応液をセライトろ過し、メタノールで洗浄した。ろ液をあわせて減圧下濃縮することで、trans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)-1-メチルピロリジン塩酸塩(1.71 g, 定量的収率)を得た。
ESI-MS m/z: 146 (M+H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 2.42 (m, 2H), 2.89 (s, 3H), 3.22-3.42 (m, 4H), 3.44-3.69 (m, 6H).
得られたtrans-3,4-ビス(ヒドロキシメチル)-1-メチルピロリジン塩酸塩(200 mg, 1.10 mmol)のクロロホルム(8 ml)溶液に(Z)-ヘキサデカ-9-エン酸(東京化成工業社製, 616 mg, 2.422 mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩(同仁堂社製485 mg, 2.53 mmol)、トリエチルアミン(東京化成工業社製、0.614 ml, 4.40 mmol)および4-ジメチルアミノピリジン(東京化成工業社製33.6 mg, 0.275 mmol) を加えて室温で終夜撹拌した。反応液に飽和重曹水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール/クロロホルム=0/100〜2/98)で精製し、化合物118(163 mg, 24%)を得た。
ESI-MS m/z: 146 (M+H)+; 1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 6H), 1.26-1.31 (m, 34H), 1.56-1.64 (m, 4H), 1.97-2.03 (m, 8H), 2.15-2.23 (m, 2H), 2.27-2.38 (m, 9H), 2.67 (dd, J = 9.3, 7.1 Hz, 2H), 3.99-4.12 (m, 4H), 5.29-5.40 (m, 4H).
参考例1で得られた化合物1を用いて、以下のように製剤を製造した。用いた核酸は、センス鎖[5'-mGmGAAGCUGGCGAUUAUGCAGAUUmUmA-3'(mが付された塩基に結合する糖は、2’-O-メチルで置換されているリボースである)]と、アンチセンス鎖[5'-UAAAUCUGCAUAAUCGCCAGCUUCC-3'(5’末端をリン酸化してある)]の塩基配列からなる、CKAP5遺伝子の発現を抑制するCKAP5 siRNAであり、ニッポンイージーティー社、ジーンデザイン社、インビトロジェン社または北海道システムサイエンス社より、アニール済みの凍結乾燥siRNAを入手し、蒸留水で溶解させることによって24 mg/mLに調製した(以下CKAP5 siRNA溶液という)。
化合物1/1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DMPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)=57.26/5.521 mmol/Lとなるように塩酸およびエタノールを含有する水溶液に懸濁させ、vortex攪拌ミキサーで攪拌および、加温を繰り返して均一な懸濁液を得た。この懸濁液を室温下で0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルターおよび0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルターに通し、リード粒子の分散液を得た。Dynamic light scattering (DLS)で得られたリード粒子の平均粒子径を測定し、30 nmから100 nmの範囲内であることを確認した。得られたリード粒子の分散液に、CKAP5siRNA 溶液を、3:1の割合で混合し、さらに3倍量の蒸留水を加えて混合することでカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物1/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は86.0 nmであった。
比較例1と同様にしてCKAP5 siRNAならびにリード粒子から、カチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物1/化合物117/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=2.982/5.965/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。粒子径測定装置(Zetasizer Nano ZS、マルバーン(Malvern)社製)で製剤中の脂質ナノ粒子の粒子径を測定した結果、該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は93.9 nmであった。
実施例1で得られた製剤(化合物1、化合物117および核酸を含有する脂質ナノ粒子)および比較例1で得られた製剤(化合物1および核酸を含有する脂質ナノ粒子)を、それぞれ以下の方法によりインビボ mRNAノックダウン評価試験を実施した。
ヒト膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2はJCRB細胞バンクより受領し、10%非働化ウシ胎仔血清(GIBCO社製)及び1vol%ペニシリン‐ストレプトマイシン(ナカライテスク社製、26253-84)を含む高グルコース含有DMEM(GIBCO社製, 11995-073)で37℃、5%CO2条件下で培養した。MIA PaCa-2を(1×108 cells / mLの濃度となるようにPBSに懸濁し、この細胞懸濁液100 μLをSCIDマウス(日本クレアより入荷)の背部皮下に移植した(1×107 cells /0.1mL PBS /head)。移植6日後、腫瘍体積を指標に一群3匹として群分けを行い、実施例1および比較例1で得られた製剤を10 mg/kg(10mL/kg)でマウスに静脈内投与した。陰性対照として生理食塩水を使用し、10mL/kgで投与した。投与前及び投与48時間後にマウスの体重を測定した。体重測定後にマウスを安楽死させ、皮下腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍は直ちに液体窒素で凍結し、使用するまで-80℃に保存した。
得られた腫瘍サンプルについて、サンプルの入った2 mL丸底tubeに1 mLのTrizol reagent (インビトロジェン(Invitrogen)製, 15596-018)及び5mmのジルコニアビーズを添加し、Tissue lyser II (キアゲン(QIAGEN)製)にて1/25 freq, 1.5 min x 2回の条件で破砕した。破砕後遠心(10000 rpm, 10 min)し上清を回収、200 μLのクロロホルムを添加し激しく攪拌後再び遠心(15000 rpm, 15 min)した。得られた上清200 μLから自動核酸抽出機MagNA PURE 96 (ロシュ(Roche)製)にて、Cellular RNA Large Volume Kit (ロシュ(Roche)製, 5467535)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNA濃度を微量吸光光度計Dropsense96 (トリニアン(Trinean)製)にて測定、200-1000 ng相当のRNAをTranscriptor (ロシュ(Roche)製、4897030)を用いて逆転写を行った。反応液組成、反応条件は添付文書に従った。得られたcDNAサンプルをdH2Oで10倍希釈し、qPCRの鋳型として用いた。qPCR反応にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4369542), TaqMan Gene Expression Assays(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4331182)を用いた。PCR反応の条件はTaqMan Gene Expression添付の使用説明書に従った。検体のmRNA量は、生理食塩水投与群における、CKAP5のmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。
図1に、実施例1および比較例1で得られた各製剤について、それぞれsiRNA 10 mg/kg投与後48時間後の腫瘍中CKAP5 mRNA量を示す。縦軸は生理食塩水処置群を1としたCKAP5 mRNA量の相対値を示す。
また、図1から明らかなように、実施例1で得られた製剤(化合物1、化合物117および核酸を含有する脂質ナノ粒子)は、インビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする化合物1に、化合物117が混合されて、化合物1の使用量が減っているにもかかわらず、比較例1で得られた製剤(化合物1および核酸を含有する脂質ナノ粒子)と比べて、インビボで薬効評価試験した結果は、同程度に極めて強くCKAP5遺伝子の発現を抑制し、抗腫瘍作用が強い。
よって、化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子は、化合物(I)の使用量が減っているにもかかわらず、化合物(I)のインビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする作用を減弱しないという予想外の作用を有することが明らかとなった。また、インビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする作用を減弱せずに、化合物(I)の使用量が減らせることにより、化合物(I)に起因する毒性作用は減少することができるので、インビボの薬物送達のための脂質ナノ粒子としてより有用であるという、当業者が予想しない効果を有することが明らかとなった。
実施例1で得られた製剤(化合物1、化合物117および核酸を含有する脂質ナノ粒子)を、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
試験例1と同様にして、膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群6匹となるように群分けを実施(Day0)し、Day0及びDay7に実施例1で得られた製剤を10 mg/kg(10mL/kg)で静脈内投与した。生理食塩水は10mL/kgとして投与した。各個体の腫瘍径を、Day0からDay14まで測定し、以下の式を用いて腫瘍体積、体積比を算出した。
(数1)
腫瘍体積(mm3)= 長径(mm)×短径(mm)×短径(mm)× 0.5
(数2)
体積比(V/V0)=各時点の腫瘍体積(mm3)÷ Day0の腫瘍体積(mm3)
図2に、0日目および7日目に10 mg/kg投与した際の腫瘍体積の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。
よって、本発明の脂質ナノ粒子は、核酸を細胞内等に導入することができ、化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子は、インビボで細胞内に良好に薬物送達する、優れた脂質ナノ粒子であることが明らかとなった。
参考例1で得られた化合物1を用いて、以下のように製剤を製造した。用いた核酸は、市販のEg5遺伝子の発現を抑制するEg5 siRNA(インビトロジェン社製、カタログ番号 HSS105842)であり、センス鎖に5'-CCCAUCAACACUGGUAAGAACUGAA-3'の塩基配列を含み、アンチセンス鎖に5'-UUCAGUUCUUACCAGUGUUGAUGGG-3'の塩基配列を含む。インビトロジェン社より、アニール済みの凍結乾燥siRNAを入手し、蒸留水で溶解させることによって24 mg/mLに調製した(以下Eg5 siRNA溶液という)。
化合物1/1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DMPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)=57.26/5.521 mmol/Lとなるように塩酸およびエタノールを含有する水溶液に懸濁させ、vortex攪拌ミキサーで攪拌および、加温を繰り返して均一な懸濁液を得た。この懸濁液を室温下で0.2 μmのポリカーボネートメンブランフィルターおよび0.05 μmのポリカーボネートメンブランフィルターに通し、リード粒子の分散液を得た。Dynamic light scattering (DLS)で得られたリード粒子の平均粒子径を測定し、30 nmから100 nmの範囲内であることを確認した。得られたリード粒子の分散液に、Eg5siRNA 溶液を、3:1の割合で混合し、さらに3倍量の蒸留水を加えて混合することでカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物1/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は80.3 nmであった。
比較例2と同様にしてEg5 siRNAならびにリード粒子から、カチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物1/化合物117/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=2.982/5.965/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は80.5 nmであった。
比較例2と同様にしてEg5 siRNAならびにリード粒子から、カチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物117/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は79.6 nmであった。
比較例2と同様にしてEg5 siRNAならびにリード粒子から、カチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物116/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は77.6 nmであった。
比較例2と同様にしてEg5 siRNAならびにリード粒子から、カチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を調製した。
一方、化合物118/1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)ナトリウム塩(PEG-DSPE Na、N-(カルボニルメトキシポリエチレングリコール2000)-1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン=ナトリウム塩、日油社製)/ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、日油社製)/コレステロール(日油社製)=8.947/2.943/5.707/11.83 mmol/Lとなるように、各試料を秤量し90 vol%エタノールに溶解させ、脂質膜構成成分の溶液を調製した。
得られた脂質膜構成成分の溶液を加温した後、得られたカチオン性脂質/核酸複合体粒子の分散液を、1:1の割合で混合し、さらに数倍量の蒸留水を混合し、粗製剤を得た。
得られた粗製剤はアミコンウルトラ(Millipore社製)を用いて濃縮し、さらに生理食塩水(生食)に置換し、0.2 μmのフィルター(東洋濾紙社製)を用いてクリーンベンチ内でろ過した。さらに得られた製剤のsiRNA濃度を測定し、siRNA濃度で1.0 mg/mLとなるように生食を用いて希釈した。該製剤中の脂質ナノ粒子の平均粒子径は81.6 nmであった。
実施例2〜5で得られた製剤(化合物1、および化合物117、116または118ならびに核酸を含有する脂質ナノ粒子)および比較例2で得られた製剤(化合物1および核酸を含有する脂質ナノ粒子)を、それぞれ以下の方法によりインビボ mRNAノックダウン評価試験を実施した。
試験例1と同様にして、膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。移植6日後、腫瘍体積を指標に一群3匹として群分けを行い、実施例2〜5および比較例1で得られた製剤を10 mg/kg(10mL/kg)でマウスに静脈内投与した。陰性対照として生理食塩水を使用し、10mL/kgで投与した。投与前及び投与48時間後にマウスの体重を測定した。体重測定後にマウスを安楽死させ、皮下腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍は直ちに液体窒素で凍結し、使用するまで-80℃に保存した。
得られた腫瘍サンプルについて、サンプルの入った2 mL丸底tubeに1 mLのTrizol reagent (インビトロジェン(Invitrogen)製, 15596-018)及び5mmのジルコニアビーズを添加し、Tissue lyser II (キアゲン(QIAGEN)製)にて1/25 freq, 1.5 min x 2回の条件で破砕した。破砕後遠心(10000 rpm, 10 min)し上清を回収、200 μLのクロロホルムを添加し激しく攪拌後再び遠心(15000 rpm, 15 min)した。得られた上清200 μLから自動核酸抽出機MagNA PURE 96 (ロシュ(Roche)製)にて、Cellular RNA Large Volume Kit (ロシュ(Roche)製, 5467535)を用いてRNAを抽出した。抽出したRNA濃度を微量吸光光度計Dropsense96 (トリニアン(Trinean)製)にて測定、200-1000 ng相当のRNAをTranscriptor (ロシュ(Roche)製、4897030)を用いて逆転写を行った。反応液組成、反応条件は添付文書に従った。得られたcDNAサンプルをdH2Oで10倍希釈し、qPCRの鋳型として用いた。qPCR反応にはTaqMan Gene Expression Master Mix (アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4369542), TaqMan Gene Expression Assays(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)製, 4331182)を用いた。PCR反応の条件はTaqMan Gene Expression添付の使用説明書に従った。検体のmRNA量は、生理食塩水投与群における、Eg5のmRNA量を1としたときの相対的な割合として算出した。
図3に、実施例2〜5および比較例2で得られた各製剤について、それぞれsiRNA 10 mg/kg投与後48時間後の腫瘍中Eg5 mRNA量を示す。縦軸は生理食塩水処置群を1としたEg5 mRNA量の相対値を示す。
また、図3から明らかなように、実施例2〜5で得られた製剤(化合物1、および化合物117、116または118ならびに核酸を含有する脂質ナノ粒子)は、インビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする化合物1に、化合物117、116または118が混合されて、化合物1の使用量が減っているにもかかわらず、比較例1で得られた製剤(化合物1および核酸を含有する脂質ナノ粒子)と比べて、インビボで薬効評価試験した結果は、同程度に極めて強くEg5遺伝子の発現を抑制し、抗腫瘍作用が強い。
よって、化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子は、化合物(I)の使用量が減っているにもかかわらず、化合物(I)のインビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする作用を減弱しないという予想外の作用を有することが明らかとなった。また、インビボで腫瘍の細胞内に薬物送達することを容易にする作用を減弱せずに、化合物(I)の使用量が減らせることにより、化合物(I)に起因する毒性作用は減少することができるので、インビボの薬物送達のための脂質ナノ粒子としてより有用であるという、当業者が予想しない効果を有することが明らかとなった。
実施例2で得られた製剤(化合物1、化合物117および核酸を含有する脂質ナノ粒子)を、以下の方法により腫瘍増殖評価試験を実施した。
試験例1と同様にして、膵臓癌由来細胞株であるMIA PaCa-2をSCIDマウスに移植したゼノグラフトモデルを用いて実施した。腫瘍体積を指標に一群5匹となるように群分けを実施(Day0)し、実施例2で得られた製剤を10 mg/kg(10mL/kg)で静脈内投与した。生理食塩水は10 mL/kgとして投与した。各個体の腫瘍径を、Day0からDay15まで測定し、試験例2と同様に腫瘍体積、体積比を算出した。
図4に、0日目に10 mg/kg投与した際の腫瘍体積の推移を示す。縦軸は0日目を1とした腫瘍体積の相対値を示す。横軸は実験開始後の経過日数を示す。
よって、本発明の脂質ナノ粒子は、核酸を細胞内等に導入することができ、化合物(I)および化合物(II)を含有する脂質ナノ粒子は、インビボで細胞内に良好に薬物送達する、優れた脂質ナノ粒子であることが明らかとなった。
配列番号2-siRNA アンチセンス鎖
配列番号2-5'-リン酸化アデノシン(5'-phosphorylated Adenosine)
配列番号3-siRNA センス鎖
配列番号4-siRNA アンチセンス鎖
Claims (34)
- 式(I)
X1およびX2は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X3は存在しないか、炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、
X3が存在しない場合には、
Y1も存在せず、L1は単結合であり、R3は水素原子、炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであるか、あるいは
Y1も存在せず、L1は-CO-または-CO-O-であり、R3はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、
X3が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルの場合には、
Y1は製薬上許容し得る陰イオンであり、L1は単結合であり、R3は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである)で表されるカチオン性脂質、および式(II)
X4およびX5は、水素原子であるか、または一緒になって単結合もしくはアルキレンを形成し、
X6は存在しないか、炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルであり、
X6が存在しない場合には、
Y2も存在せず、aおよびbは0であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L2およびL3は-O-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、かつaとbがともに0ではなく、L4は単結合であり、R6は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L4は単結合であり、R6は水素原子であり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であるか、あるいは
Y2も存在せず、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L4は-CO-または-CO-O-であり、R6はピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-2-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イル、モルホリン-2-イル、モルホリン-3-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルまたはモルホリニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-であり、
X6が炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルの場合には、
Y2は製薬上許容し得る陰イオンであり、aおよびbは、同一または異なって0〜3であり、L4は単結合であり、R6は炭素数1〜6のアルキル、炭素数3〜6のアルケニル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、L2およびL3は、同一または異なって-O-、-CO-O-または-O-CO-である)で表されるカチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子。 - R1およびR2が、ドデシル、テトラデシル、(Z)-ドデカ-7-エニル、(Z)-テトラデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-4-エニル、(Z)-ヘキサデカ-7-エニル、(E)-ヘキサデカ-7-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(7Z,10Z)-ヘキサデカ-7,10-ジエニル、(7Z,10Z,13Z)-ヘキサデカ-7,10,13-トリエニル、(Z)-オクタデカ-9-エニルまたは(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルである請求項1記載の脂質ナノ粒子。
- R1およびR2が、ともにテトラデシル、ヘキサデシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニルまたは(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニルである請求項1記載の脂質ナノ粒子。
- L1が単結合であり、R3が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである請求項1〜3のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- L1が-CO-または-CO-O-であり、R3がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルである請求項1〜3のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X1およびX2が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成する請求項1〜5のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X1およびX2が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R3が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである請求項1〜5のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X1およびX2が、水素原子であり、R3が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである請求項1〜5のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X3が存在しない請求項1〜8のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- L2およびL3が、-O-または-O-CO-であり、R4およびR5が、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、(Z)-テトラデカ-9-エニル、(Z)-ヘキサデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-6-エニル、(Z)-オクタデカ-9-エニル、(E)-オクタデカ-9-エニル、(Z)-オクタデカ-11-エニル、(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル、(9Z,12Z,15Z)-オクタデカ-9,12,15-トリエニル、(Z)-イコサ-11-エニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、3,7,11-トリメチルドデカ-2,6,10-トリエニルまたは3,7,11,15-テトラメチルヘキサデカ-2-エニルである請求項1〜9のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- L2およびL3が、-CO-O-であり、R4およびR5が、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシル、ノナデシル、ヘニコシル、トリコシル、(Z)-トリデカ-8-エニル、(Z)-ペンタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-5-エニル、(Z)-ヘプタデカ-8-エニル、(E)-ヘプタデカ-8-エニル、(Z)-ヘプタデカ-10-エニル、(8Z,11Z)-ヘプタデカ-8,11-ジエニル、(8Z,11Z,14Z)-オクタデカ-8,11,14-トリエニル、(Z)-ノナデカ-10-エニル、(10Z,13Z)-ノナデカ-10,13-ジエニル、(11Z,14Z)-イコサ-11,14-ジエニル、2,6,10-トリメチルウンデカ-1,5,9-トリエニルまたは2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ-1-エニルである請求項1〜9のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- L4が単結合であり、R6が水素原子、メチル、ピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである請求項1〜11のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- L4が-CO-または-CO-O-であり、R6がピロリジン-3-イル、ピペリジン-3-イル、ピペリジン-4-イルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルバモイル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルであり、該置換基の少なくとも1つは、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニオ、ピロリジニル、ピペリジルもしくはモルホリニルである請求項1〜11のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成する請求項1〜13のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R6が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである請求項1〜13のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X4およびX5が、水素原子であり、R6が水素原子、メチルまたは同一もしくは異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシもしくはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルもしくは炭素数3〜6のアルケニルである請求項1〜13のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X4およびX5が、一緒になって単結合またはアルキレンを形成し、R6が同一または異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシまたはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルである請求項1〜13のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X4およびX5が、水素原子であり、R6が同一または異なって1〜3つのアミノ、ヒドロキシまたはカルバモイルで置換された炭素数1〜6のアルキルまたは炭素数3〜6のアルケニルである請求項1〜13のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- X6が存在しないか、メチルである請求項1〜18のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- 薬物として核酸を含有する請求項1〜19のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- カチオン性脂質が、該核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸との複合体を形成している、請求項20記載の脂質ナノ粒子。
- カチオン性脂質が、該核酸と複合体を形成しているか、または中性脂質および/もしくは高分子を組み合わせたものと該核酸との複合体を形成しており、該複合体および該複合体を封入する脂質膜から構成された請求項20記載の脂質ナノ粒子。
- 核酸がRNA干渉(RNAi)を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有する核酸である請求項20〜22のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
- 標的遺伝子が、腫瘍または炎症に関連する遺伝子である請求項23記載の脂質ナノ粒子。
- 請求項20〜24のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を用いて該核酸を細胞内に導入する方法。
- 細胞が、ほ乳類の腫瘍または炎症部位にある細胞である請求項25記載の方法。
- 細胞が、ほ乳類の肝臓、肺、腎臓または脾臓にある細胞である請求項25または26記載の方法。
- 細胞内に導入する方法が、静脈内投与によって細胞内に導入する方法である請求項26または27記載の方法。
- 請求項1〜24のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を哺乳動物に投与する癌または炎症疾患の治療方法。
- 投与する方法が、静脈内投与である請求項29記載の方法。
- 請求項1〜24のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を含む、疾患の治療に用いるための医薬。
- 静脈内投与用である請求項31記載の医薬。
- 請求項1〜24のいずれかに記載の脂質ナノ粒子を含む、癌または炎症疾患の治療に用いるための癌または炎症疾患の治療剤。
- 静脈内投与用である請求項33記載の癌または炎症疾患の治療剤。
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