JPH10152461A - 新規なカチオン性脂質 - Google Patents

新規なカチオン性脂質

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JPH10152461A
JPH10152461A JP9285925A JP28592597A JPH10152461A JP H10152461 A JPH10152461 A JP H10152461A JP 9285925 A JP9285925 A JP 9285925A JP 28592597 A JP28592597 A JP 28592597A JP H10152461 A JPH10152461 A JP H10152461A
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lipid
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ポーラ・ナネット・ベローニ
Roy Hirshfeld Donald
ドナルド・ロイ・ヒルシュフェルド
Otto Link John
ジョン・オットー・リンク
Joseph Nester John Jr
ジョン・ヨセフ・ネスター・ジュニア
Allen Pertz Gaely
ゲーリー・アレン・ペルツ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 生物学的に活性な物質の細胞への進入を容易
にする、より高い取り込み効率、より高い特異性および
低下した毒性を提供するさらなる脂質担体を開発するこ
と。 【解決手段】 本発明は、新規なカチオン性脂質、特に
グアニジノ脂質、およびそれらの調製方法を提供する。
また、本発明の脂質を含むポリアニオン−脂質複合体、
それらの調製、および生物学的に活性な物質、特に核酸
を細胞に送達するためのそれらの用途も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、グアニジンのカチ
オン性脂質誘導体、それらの調製および用途、ならびに
そのような誘導体を用いる医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】脂質を基にした多くの物質、例えば、リ
ポソームが、担体として、いくつかの医薬および生物学
的状況において生物学的に活性な物質、例えば、薬物、
放射線治療薬、酵素、ウイルス、核酸（例えば、プラス
ミド、ＤＮＡおよびＲＮＡ構築物、転写因子および他の
細胞性ベクター）を細胞系および動物に誘導するために
効果的に用いられてきた。例えば、いくつかの脂質をカ
プセル化した薬物、例えば、ダウノルビシン（DaunoXom
e （登録商標))およびアンホテリシンＢ（Abelcet （登
録商標）、Ambisome（登録商標）、Amphotec（登録商
標))は、最近食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可さ
れ、あるいはＮＤＡファイリングの対象として現在ＦＤ
Ａによって検討されている。
【０００３】この雰囲気の中で、遺伝物質を効率的かつ
効果的に生物学的細胞に直接送達するための脂質仲介性
の方法を開発することに多くの努力が傾注されてきた。
例えば、遺伝子治療技術は、治療的に望ましい様式で遺
伝子複製、転写および翻訳の過程に影響を及ぼすことの
できる核酸構築物により患者の標的細胞をトランスフェ
クションすることにより疾患状態を緩和する。代表的に
は、これらの核酸構築物は高分子量のポリアニオン性分
子であり、そのポリアニオン性分子のために担体仲介性
送達がin vivo 、ex vivo またはin vitroのいずれにお
いても細胞の上首尾なトランスフェクションに通常必要
とされる。例えば、米国特許第５，２６４，６１８号
は、脂質を基にした担体を用いるための多くの技術およ
び臨床的な設定のそのような医薬組成物を記載している
ので参照されたい。そのようなトランスフェクション法
はまた化学的に重要なタンパク質を産生する新規な細胞
系および動物の開発にも用いられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】いくつかの脂質担体が
プラスミド送達について最近開示された。Felgner らに
対する米国特許第４，８９７，３５５号；同４，９４
６，７８７号；同５，０４９，３８６号；同５，３６
６，７３７号；同５，５４５，４１２号、米国特許第
５，２６４，６１８号；同５，２８３，１８５号（ＤＣ
−cholを記載したEpandらに対するもの）；同５，３３
４，７６１号；ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１４３８１号；同
ＷＯ９６／０１８４０号；同ＷＯ９６／１８４１；およ
び同ＷＯ９６／１８３７２号、ならびにFelgner et a
l., Methods in Enzymology, 5, 67-75 (1993)参照され
たい。上記の参考文献に記載された化合物は生物学的に
活性な物質の細胞への進入を容易にするが、より高い取
り込み効率、より高い特異性および低下した毒性を提供
するさらなる脂質担体を開発することが依然として所望
されている。本発明はこの必要性および関連する必要性
を満足するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の一つの局面は、
式Ｉのグアニジンのカチオン性脂質誘導体： Ｒ1 Ｒ2 Ｎ−Ｃ（Ｏ）−Ａ−Ｘ 式Ｉ 式中、Ｒ1 およびＲ2 は、同じかまたは異なって、Ｃ10
〜Ｃ26のヒドロカルビル基であり；Ａは、１以上のメチ
レン基が場合によりＹ基で置き換わっている（ただし、
Ｙ基のいずれも互いに隣接していない）ヒドロカルビレ
ン基であって、ここで各Ｙは独立して、示した向きであ
り、−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ
5 −、−ＮＲ5 Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ5 −、−Ｎ
Ｒ5 Ｃ（Ｏ）ＮＲ5−、−ＮＲ5 Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ
（Ｏ）ＮＲ5 −、−Ｓ（Ｏ)n−（ここでｎは０、１もし
くは２である）または−ＮＺ−Ｃ（＝ＮＺ）ＮＺ−、こ
こで各Ｚは独立してＨもしくは−（ＣＨ2)m ＮＲ5 −Ｃ
（＝ＮＲ5)ＮＲ5 で、ｍは１〜１０の整数であり、そし
て各Ｒ5 は独立してＨもしくは低級アルキルであり；Ｘ
は；（１）各ヒドロカルビル基が他と同じかもしくは異
なるトリヒドロカルビルアンモニウム基であるか、
（２）−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ3)ＮＨＲ4 であって、Ｒ3 お
よびＲ4 が独立してヒドロカルビル、ハロアルキル、ヒ
ドロキシアルキル、Ｏ−保護ヒドロキシアルキル、アル
コキシアルキル、ハロアルコキシアルキル、アリールオ
キシアルキル、アミノアルキル、モノ−もしくはジ−置
換アミノアルキル、Ｎ−保護アミノアルキル、アシル、
アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、−
Ｃ（Ｏ）ＮＲ6 Ｒ7 （ここで、Ｒ6 およびＲ7 は独立し
てＨまたはヒドロカルビルである）、窒素保護基である
か、あるいは、Ｒ3 およびＲ4 がそれが付着している原
子と一緒になって場合により置換されている単環式のも
しくは二環式の環を形成するが；ただし：Ｒ1 およびＲ
2 がどちらも同じＣ16アルキル基であり、かつＸが−Ｎ
Ｈ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2 であり、Ａがブチレン鎖ではな
い；ならびにそれらの塩、溶媒和物、分割したもしくは
分割していないエナンチオマー、ジアステレオマーおよ
び混合物、に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】好ましくは、Ｘは−ＮＨ−Ｃ（＝
ＮＲ3)ＮＨＲ4 である。他の好ましい局面においては、
Ｒ1 およびＲ2 は同一であり、モノ不飽和アルケニルで
ある。
【０００７】他の好ましい局面において、Ｒ3 およびＲ
4 は同一であり、かつＨ、窒素保護基、アミノアルキル
もしくはＮ−保護アミノアルキル、ヒドロキシアルキル
もしくはＯ−保護ヒドロキシアルキルである。しばし
ば、Ｒ3 およびＲ4 は、−（ＣＨ2)p −ＮＨ2 （式中ｐ
は２〜１０の整数である）で表されるアミノアルキル基
である。このアミノ基はまた、好ましくはtert−ブチル
オキシカルボニル基により保護されている。アルキルア
ミノ基が四級化され得るか対応するＮ−オキサイドとし
て存在し得るということも認識される。
【０００８】関連する局面において、本発明は、式Ｉの
カチオン性脂質を含むポリアニオン−脂質複合体、それ
らの調製方法、および生物学的に活性な物質の細胞への
送達におけるそれらの用途を提供する。
【０００９】別の局面において、本発明は、治療的に有
効量の核酸、式Ｉのカチオン性脂質、および場合により
薬学的に受容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００１０】定義および一般的なパラメーター Ａ．定義 以下の定義は、本明細書中の発明を記載するために用い
られる種々の用語の意味および範囲を例示し定義するた
めに記載される。
【００１１】用語「ヒドロカルビル」とは、それに水素
原子が付着している最大２６個の炭素原子の炭素鎖もし
くは環からなる一価の炭化水素基をいう。この用語は、
アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキ
ニル基およびアリール基、飽和結合および不飽和結合の
混在を有する基、炭素環式環を含み、かつそのような基
の組合せも含む。それは直鎖、分岐鎖、環式構造もしく
はそれらの組合せをいうこともできる。
【００１２】用語「ヒドロカルビレン」とは、二価のヒ
ドロカルビル基をいう。代表的な例は、アルキレン、フ
ェニレン、シクロへキシレン、ジメチレンシクロヘキシ
ル、２−ブテン−１，４−ジイルなどを含む。好ましく
は、このヒドロカルビレン鎖は十分に飽和しているか、
および／または１〜１０個の炭素原子の鎖を有する。
【００１３】用語「トリヒドロカルビルアンモニウム」
とは、（Ｒ)3Ｎ+ −をいい、式中各Ｒは独立してヒドロ
カルビル基、好ましくは低級アルキルである。
【００１４】脂肪族の鎖は、下記で定義するアルキル、
アルケニル、およびアルキニルのクラスを含む。直鎖状
脂肪族鎖は、分岐していない炭素鎖基に限られる。
【００１５】アルキル基とは、特定された炭素原子数も
しくは特定がなされない場合には最大２６個の炭素原子
を有する十分に飽和した分岐したもしくは分岐していな
い炭素鎖基をいう。例えば、１〜８個の炭素原子のアル
キルとは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチ
ル、ヘキシル、ヘプチル、およびオクチルのような基、
およびこれらの基の位置異性体である基をいう。低級ア
ルキルとは、１〜６個の炭素原子のアルキル、例えば、
メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブ
チル、イソブチル、sec −ブチル、およびtert−ブチル
をいう。６〜２６個の炭素原子のアルキルには、ヘキシ
ル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシ
ル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシ
ル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナ
デシル、エイコシル、ヘネイコシル、ドコシル、トリコ
シルおよびテトラコシルがある。
【００１６】アルケニルとは、特定された数の炭素原子
を有するか、炭素原子の数が特定されていない場合には
最大２６個の炭素原子を有し、１以上の二重結合を基内
に有する任意の分岐したもしくは分岐していない不飽和
の炭素鎖基をいう。炭素原子６〜２６のアルケニルは、
ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセ
ニル、ウンデセニル、ドデニル、トリデセニル、テトラ
デセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデ
セニル、オクタデセニル、ノナデセニル、エイコセニ
ル、ヘネイコソエニル、ドコセニル、トリコセニル、お
よびテトラコセニルにより、それらの種々の異性体型で
例示され、不飽和結合は基内の任意の場所に位置するこ
とができ、二重結合については（Ｚ）もしくは（Ｅ）配
置を有することができる。
【００１７】アルキニルとは、アルケニルの範囲である
が１以上の三重結合を基内に有する炭化水素基をいう。
【００１８】用語「低級アルコキシ」とは、−Ｏ−Ｒ′
基をいい、式中Ｒ′は低級アルキルである。
【００１９】用語「ポリメチレン」とは、−（ＣＨ2)n
−基をいい、式中ｎは２〜１０の整数である。
【００２０】用語「メチレン」とは、−ＣＨ2 −基をい
う。
【００２１】用語「ブチレン」とは、−（ＣＨ2)4 −基
をいう。
【００２２】用語「アルキレン」とは、二価の飽和脂肪
族基をいう。
【００２３】用語「カルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）−基
をいう。
【００２４】用語「ヒドロキシカルボニル」もしくは
「カルボキシ」とは、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ基をいう。
【００２５】用語「低級アルコキシカルボニル」とは、
−Ｃ（Ｏ）ＯＲ′基をいい、式中Ｒ′は低級アルキルで
ある。
【００２６】用語「アシル」とは、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ′基
をいい、式中Ｒ′は水素もしくはヒドロカルビル、例え
ば、メチルカルボニル、エチルカルボニル、ベンゾイ
ル、ナフトイルなどである。
【００２７】用語「カルバモイル」とは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ
Ｒ′Ｒ基をいい、式中ＲおよびＲ′は、独立して水素も
しくは低級アルキル、例えば、Ｒが水素でありＲ′が低
級アルキルである場合、この基は低級アルキルカルバモ
イルであり、ＲおよびＲ′が低級アルキルである場合、
この基はジ−低級−アルキルカルバモイルである。
【００２８】用語「モノ置換アミノ」とは、−ＮＨＲ基
をいい、式中Ｒはヒドロカルビルもしくはアシルであ
る。
【００２９】用語「ジ置換アミノ」とは、ＮＲ′Ｒ″基
をいい、式中Ｒ′およびＲ″は独立してヒドロカルビル
もしくはアシルである。
【００３０】用語「ハロ」とは、フルオロ、ブロモ、ク
ロロおよびヨードをいう。
【００３１】用語「アリール」とは、芳香族の一価のモ
ノもしくはポリ炭素環式基をいう。
【００３２】用語「（低級−アルキル）−ヒドロキシル
メチル」とは、−ＣＨ（ＯＨ）−（低級−アルキル）基
をいう。
【００３３】用語「アリールメチル」とは、アリール−
ＣＨ2 −基をいう。
【００３４】アラルキルとは、アルキル基から誘導され
た有機基をいい、そこで、水素原子がアリール基により
置換されているものをいう。代表的な例は、ベンジル、
フェネチル、３−フェニルプロピルなどである。
【００３５】単環式環は一般に３〜８個の環原子（ring
atom)を有する。
【００３６】二環式環は一般に７〜１４個の環状原子を
有する。
【００３７】炭素環はすべての環原子が炭素である環系
である。
【００３８】複素環式環（複素環、ヘテロシクロなど）
は、少なくとも１つの環原子がヘテロ原子であり、代表
的にはＯ、Ｎ、もしくはＳ（Ｏ)n（ここでｎは０、１ま
たは２）である。
【００３９】用語「保護基」とは、分子内の反応基に付
着された場合にその反応性を遮蔽、低下もしくは妨害す
る原子群をいう。保護基の例はT. W. Greene et al., P
rotective Groups in Organic Chemistry, (Wiley, 2nd
ed. 1991)およびHarrison and Harrison et al., Comp
endium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8,(Jo
hn Wiley and Sons, 1971-1996)において見られる。代
表的なアミン保護基には、ホルミル基、もしくは２〜６
個の炭素原子の低級アルカノイル基、特に、アセチルも
しくはプロピオニル基、トリチルもしくは置換トリチル
基、例えば、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリ
チル基、例えば、４，４′−ジメトキシトリチルもしく
は４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル基、トリフ
ルオロアセチル基、アリルオキシカルボニル、ｔ−ブチ
ルカルバメート（ｔ−ＢＯＣ）、１−アダマンチルカル
バメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、９−フル
オレニルメチルカルバメート（ＦＭＯＣ）、ニトロ−ベ
ラトリールオキシカルバメート（ＮＶＯＣ）、フタリル
基などがある。代表的なヒドロキシル保護基は、ヒドロ
キシルがアシル化されているかもしくはアルキル化され
ているかのいずれかであり、ベンジルおよびトリチルエ
ーテルならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニ
ルエーテル、トリアルキルシリルエーテル、およびアリ
ルエーテルを含む。
【００４０】生物学的に活性な物質とは、in vitroおよ
び／またはin vivo で生物学的効力を発揮する任意の分
子もしくは分子の混合物もしくは複合体をいい、医薬、
薬物、タンパク質、ビタミン、ステロイド、ポリアニオ
ン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、
核酸などを含む。
【００４１】この開示において言及される緩衝液には、
「Tris」、「Hepes」および「PBS」がある。「Tris」は、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンであり、この
発明の好ましい実施態様の目的のため、約pH７で用いら
れる。「Hepes」は、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸であり、本明細書中で
緩衝液として約pH７で用いられる。リン酸緩衝生理食塩
水、もしくは「PBS」は、１０mMリン酸ナトリウムおよび
０．９重量％ＮａＣｌで、等張性の生理学的緩衝液とし
て約pH７．４で用いられる。
【００４２】ポリアニオンは、生物学的に活性なポリマ
ー性構造で、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチ
ド、核酸、もしくは１以上の単位のポリマーが負の電荷
を有し、そのポリマーの正味の電荷が負である他の巨大
分子である。
【００４３】複合体（もしくはリポソーム複合体）は、
式Ｉの脂質を含む予備形成されたリポソームのポリアニ
オンとの混合により作製された生成物として定義され
る。そのような複合体はポリアニオンと脂質成分との間
の相互作用によって特徴付けられる。その相互作用の結
果、ポリアニオンとリポソームは実質的に一つの実体と
なってストークス半径に基づくゲルろ過カラムを通っ
て、もしくは他の分離手法によって、一緒に溶出する。
【００４４】電荷比率(charge ratio)とは、複合体中の
脂質による正味の正電荷とポリアニオンによる正味の負
電荷との間の定量的な関係をいう。本明細書中の電荷比
率は負電荷に対する正電荷として表され、すなわち、
５：１とはポリアニオン上の正味の負電荷当たりの脂質
上の正味の正電荷が５であることを意味する。
【００４５】リポソーム−ポリアニオン複合体は、ポリ
アニオンの溶液を式Ｉの脂質から産生されたリポソーム
調製物（適切には任意のコリピッドを伴う）に接触させ
ることにより産生される構成物である。
【００４６】任意のもしくは任意に（場合により）と
は、続いて記載される事象もしくは状況が、生じ得るか
もしくは生じ得ないこと、およびその記載がその事象も
しくは状況が生じる場合およびそれが生じない場合を含
む。任意の置換基は、アルキル、シクロアルキル、アル
ケニル、アルキニル、アリール、ハロアルキル、ヒドロ
キシ、アミノ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カ
ルバモイル、アルコキシ、ハロアルコキシ、モノ−およ
びジ−置換アミノ、アシル、アルコキシアシル、アリー
ルオキシアシルなどを含む。
【００４７】任意のコリピッドは、安定なリポソームを
単独で、もしくは本発明のカチオン性グアニジノ脂質を
含む他の脂質成分と組み合わされて産生することができ
る構造として理解される。それは中性、正に帯電もしく
は負に帯電し得る。
【００４８】二重に被覆された複合体は、正味の正の電
荷を有するリポソーム複合体から調製される。正味の正
の電荷を有するリポソーム複合体は、ポリアニオンによ
り負に帯電しているモル量より正に帯電している脂質の
モル量をより多く用いて調製される。これらの正に帯電
した複合体を負に帯電した脂質と混合して二重に被覆さ
れた複合体を産生する。十分に負に帯電した脂質が添加
される場合、最終複合体は正味の負の電荷を有する。こ
の定義は、表面上にさらなる改変、例えば、抗体もしく
は抗原のそれへの取り込み、を有するリポソームを含
む。
【００４９】ＤＮＡは、デオキシリボ核酸を表し、任意
に非天然のヌクレオチドを含んでもよい。ＤＮＡは、一
本鎖、二本鎖、もしくは三重らせん形態であり得る。
【００５０】ＲＮＡは、任意に非天然のヌクレオチドを
含んでもよいリボ核酸である。ＲＮＡは、一本鎖もしく
は二本鎖であり得る。
【００５１】ポリヌクレオチドは、１以上のヌクレオチ
ドを含むＤＮＡもしくはＲＮＡである。ポリヌクレオチ
ドは、当業者に公知の化学合成法により、あるいは組換
えＤＮＡ技術の使用により、あるいはこれら２つの組合
せにより作製することができ、そして非天然のヌクレオ
チドを組み込んでいるポリヌクレオチドを含むことがで
きる。
【００５２】アンチセンスとは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ
中のヌクレオチドの特定の配列に相補的なヌクレオチド
配列をいう。
【００５３】用語核酸とは、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、リボゾ
ームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）、リボザ
イム、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ
とＲＮＡの混合二本鎖および三重鎖、プラスミド、発現
ベクターなど、非天然のヌクレオチドを含むそれらの配
列も含めたものをいう。
【００５４】薬物とは、ヒトもしくは動物における疾患
の予防、診断、軽減、処置、もしくは治療において用い
られる食物以外の任意の治療的もしくは予防的物質をい
う（治療的に有用なポリヌクレオチド、核酸、およびポ
リペプチドは薬物についてのこの定義の範囲内にあ
る）。
【００５５】医薬製剤は、ヒトもしくは動物への治療的
投与のための薬物を含む組成物である。
【００５６】薬学的に受容可能なアニオンとは、それ自
身が非毒性であるかそうでなければ薬学的に受容可能で
あり、かつ化合物を薬学的に受容不能にすることのない
アニオンである。そのようなアニオンの例には、ハライ
ドアニオン、すなわちクロリド、ブロミド、およびヨー
ジドがある。無機アニオン、例えば、スルフェート、ホ
スフェートおよびナイトレートもまた用いることができ
る。有機アニオンは、単純な有機酸、例えば、酢酸、プ
ロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リ
ンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、
酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、
メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンス
ルホン酸、トリフルオロ酢酸などから誘導することがで
きる。
【００５７】安定なトランスフェクタントは、それにＤ
ＮＡが導入され、そのＤＮＡがその細胞のゲノムＤＮＡ
に組み込まれるようになった生細胞である。
【００５８】局所的投与は、目への投与および任意の体
腔表面への投与を含む身体の任意の表面への適用を含
む。
【００５９】経皮投与は、全身的効果を伴う皮膚を通じ
ての投与である。
【００６０】トランスフェクションとは、この開示の目
的のために、ＤＮＡもしくはＲＮＡの生細胞への導入を
いう。
【００６１】非天然のヌクレオチドは、市販のもしくは
当業者に公知の手段により容易に作成することができる
ヌクレオチドを含む。
【００６２】用語「薬学的に受容可能な塩」とは、無機
もしくは有機の酸または塩基から誘導される任意の塩を
いう。
【００６３】本明細書中で用いられるように、哺乳動物
における状態および／または疾患の「処置」もしくは
「処置すること」という用語は： （ｉ）その状態もしくは疾患を防止すること、すなわち
この疾患のいかなる臨床的な症状も回避すること （ii）その状態もしくは疾患を抑制すること、すなわ
ち、臨床的な症状の発達もしくは進行を止めるかもしく
は減少させること；および／または （iii)その状態もしくは疾患を緩和すること、すなわ
ち、臨床的な症状の後退を引き起こすことを意味する。
【００６４】本明細書中で用いられるように、用語「治
療的に有効な量」とは、それを必要としている哺乳動物
に対して投与された場合に処置を行うのに十分である生
物学的に活性な物質の量をいう。「治療的に有効な量」
を構成する量は物質、条件もしくは疾患およびその重篤
度、ならびに処置される哺乳動物に応じて変化するが、
当業者により当今の知識およびこの開示に関連してルー
ティンに決定され得る。
【００６５】すべての温度はセ氏（すなわち、℃）で与
えられる。
【００６６】反対の特定がない限り、本明細書中に記載
される反応は、約−７８℃〜約１５０℃の範囲、より好
ましくは約１０℃〜約５０℃、そして最も好ましくは約
室温（もしくは「周囲の」）温度、例えば、約２０℃の
温度で、大気圧で生じる。反対の特定がない限り、本明
細書中に記載される時間および温度の範囲、例えば、
「１０℃〜１００℃で８〜２４時間」は、およそ、約１
０℃〜約１００℃で約８〜約２４時間を意味する。
【００６７】本明細書中に記載された化合物および中間
体の単離および精製は、所望ならば、任意の適切な分離
もしくは精製手法、例えば、濾過、抽出、結晶化、カラ
ムクロマトグラフィー、調製的高圧液体クロマトグラフ
ィー（調製的ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィーもし
くは厚層クロマトグラフィー、またはこれらの手法の組
合せ、により行うことができる。適切な分離および単離
手法の特定の例示は以下の実施例への参照によって行わ
れる。しかし、他の等価の分離もしくは単離手法もまた
用いることができる。
【００６８】いくつかの代表的な化合物を以下の例に示
す。
【００６９】
【化１】
【００７０】化合物はまた、図１および２に示された構
造に関して表され、確認される。この表示において、化
合物は、カチオン性頭部基Ｘに付着したリポアミド尾部
基として表される。図１は、代表的なリポアミド尾部基
１〜１４を示し、図２は、代表的なカチオン性頭部基Ａ
〜Ｕの構造を示す。したがって、１Ｂとして定義された
化合物は、リポアミド尾部基１がカチオン性頭部基Ｂに
付着した化合物、すなわち、２−グアニジノ−Ｎ，Ｎ−
ジ−オクタデカ−９−エニル−アセトアミドをいう。
【００７１】式Ｉの化合物の合成 反応スキームにおいて用いられるように、Ｒ1 、Ｒ2 、
Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 およびＲ7 は、本発明の要旨に
記載されたのと同じである。
【００７２】反応スキームＡは、グアニジンの新規なカ
チオン性脂質誘導体、すなわち、式Ｉの化合物の調製の
ための代表的なスキームを表す。
【００７３】
【化２】
【００７４】
【化３】
【００７５】出発材料 反応スキームＡおよびＢ については、出発材料は、Aldr
ich Chemicals Co., Inc. 、Fluka Chemical Corporati
on、K & K Chemicals 、Eastman Kodak Chemicals 、 L
ancaster Synthesis Ltd. 、 Karl Industries、 Maybr
idge ChemicalCo. Ltd., またはTokyo Kasai Internati
onal から入手することができる。鎖の長い酸は、Nu Ch
ek Prep Inc., (Elysian, MN)から好んで入手した。市
販されていない化合物は、"Fieser and Fieser's Reage
nts for Organic Synthesis", Volumes 1-15, John Wil
ey and Sons, 1991; "Rodd's Chemistry of Carbon Com
pounds", Volumes 1-5 and Supplementals, Elsevier S
cience Publishers, 1989；および"Organic Reaction
s", Volumes 1-40, John Wiley and Sons, 1991の様な
参考書に記載されている手法に従って当業者が調製する
ことができる。
【００７６】アミンＲ 1 Ｒ 2 ＮＨの調製 反応スキームＢ については、構造Ｒ1 Ｒ2 ＮＨの中間体
は、最初に式ＲＮＨ2のアミンを式Ｒ1 ＣＯＯＨのカル
ボン酸に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロ
フェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロ
フェノールなどのような活性化基およびジクロロヘキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジ
イミド（ＤＩＣ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（ＨＢＯＴ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールホス
ホリルクロリデート、イソブチルクロロホルメート、
Ｎ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾールなどのカップリン
グ試薬存在下でカップリングさせることにより合成する
ことができる。このカップリングは一般に無水の非水酸
性有機溶媒中で行われる。次いで、得られたアミドを、
金属の水素化物（例えば、水素化アンモニウムリチウ
ム、ジボランなど）のような還元剤で還元して所望のア
ミンＲ1 Ｒ2 ＮＨを得る。
【００７７】アミンＲＮＨ2 および酸Ｒ1 ＣＯＯＨは、
一般に、市販されている。アミンＲＮＨ2 はまた前駆体
カルボキシアミドの還元（対応する酸から酸塩化物を経
て順番に入手できる）によって調製してもよい。酸Ｒ1
ＣＯＯＨは、購入してもよいし、簡単に入手できる前駆
体アルコールの酸化により入手できる。
【００７８】式Ｉの化合物の調製 一方の端にアミンを有し、他方の端にカルボン酸を有し
ている二官能性リンカーＨＯＣ（Ｏ）−Ａ−ＮＨ2 （Ａ
ははじめに定義したとおり）は、Sigma Chemical Compa
ny (St. Louis, MO)のような供給者から市販されている
し、あるいは当業者に公知の標準的な方法を用いて調製
してもよい。反応スキームＡに関しては、アミンが保護
されており、得られたＮ−保護リンカーのカルボキシル
基を、次に、工程１において、式Ｒ1 Ｒ2 ＮＨのアミン
に上記のと同様の条件下でカップリングさせる。工程２
において、窒素保護基を適切な条件下で除去し（酸処
理、水素化分解、光分解など）、そして得られた遊離ア
ミンを、工程３において、チオウレアもしくはイソチオ
ウロニウム塩と縮合させて式Ｉの化合物を得る。チオウ
レアおよびイソチオウロニウム塩は、市販されている
か、あるいは、Org. Syn. Coll., Vol. II（Ｓ−メチル
イソチオウレアスルフェート）、Org. Syn. Coll., Vo
l. III （Ｓ−エチルチオウレア）およびChem. Review
s, 55, 181 (1955)に記載された合成手法を用いて調製
することができる。Ｘがトリヒドロカルビルアンモニウ
ムである式Ｉの化合物は、工程２で得た遊離のアミン
を、必要なアルキル化剤、例えば、トリヒドロカルビル
ヨウ化物、ｐ−トルエンスルホネート、メシレートなど
で必要ならば連続的にアルキル化することによって入手
することができる。
【００７９】本発明の化合物は、好都合には、カチオン
性頭部基Ｘに付着したリポアミド尾部基として表され
る。代表的なリポアミド尾部基を、図１に示し、図中、
Ｘはカチオン性頭部基を示す。代表的なカチオン性頭部
基Ｘを図２に示す。よくあるのは、カチオン性頭部基が
グアニジノ部分の場合である。図１および２の表示を用
いて、表１は、上記および実施例に記載した方法を用い
て調製した代表的な本発明の化合物のサンプリングを示
す。
【００８０】
【表１】
【００８１】好ましい化合物 現在のところ好ましいのは、式Ｉの化合物であり、式中
Ｒ1 およびＲ2 がＣＨ3(ＣＨ2)7 ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2)8
−である。
【００８２】特に好ましいのは、式Ｉの化合物であっ
て、式中Ｒ3 およびＲ4 がアルキルアミノ（場合により
Ｎ−保護）もしくはtert−ブチルオキシカルボニルであ
り、Ｒ1 およびＲ2 がＣＨ3 （ＣＨ2)7 ＣＨ＝ＣＨ（Ｃ
Ｈ2)8 −である。
【００８３】本発明のカチオン性脂質は、代表的には、
薬物もしくは核酸のような種々の生物学的に活性な物質
の担体として用いられる。特に、このカチオン性脂質
は、そのような生物学的に活性な物質の細胞内送達用の
脂質複合体を調製するための処方物において、単独でも
しくは他の脂質と組み合わせて用いることができる。本
発明のカチオン性グアニジノ脂質に対して意図される用
途には、Lipofectin（登録商標）のような現在市販され
ているカチオン性脂質調製物を用いて行われている手
法、および従来のカチオン性脂質送達技術を用いる他の
公開された技術に対応するトランスフェクション手法が
ある。本発明のカチオン性脂質は、所望の治療効果を達
成するため、種々の経路で、すなわち、in vivo もしく
はex vivo で、かつ哺乳動物の種々の部位に、治療的物
質を送達する医薬製剤において用いることができる。本
発明のカチオン性脂質はまた、商業的に重要なタンパク
質を発現する細胞系をトランスフェクションしかつ調製
するためにin vitroで用いてもよい。
【００８４】脂質複合体の調製 本発明のカチオン性脂質を含むリポソームは当業者に公
知の方法により調製される。一般に、有機溶媒中のカチ
オン性脂質の溶液（１以上の任意のコリピッドを伴う）
を乾燥させて脂質フィルムを得る。次いで、このフィル
ムを再水和してリポソームの懸濁物を得る。所望の脂質
成分から乾燥脂質フィルムを調製するのに適切な溶媒
は、すべての成分を溶解することができ、そして次に蒸
発乾固もしくは凍結乾燥により好都合に除去され得る溶
媒ならいかなるものであってもよいと理解される。例示
的な溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチル
エーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼ
ン、トルエン、メタノール、あるいはプロパノール、イ
ソプロパノール、ブタノール、tert−ブタノール、イソ
ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノールのような
他の脂肪族アルコールである。２以上の溶媒の混合物を
本発明の実施において用いてもよい。
【００８５】乾燥脂質フィルムからリポソームを形成す
るために適切な水性媒質は、例えば、水、水性緩衝液、
もしくは組織培養上清であると理解される。例えば、適
切な緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水、すなわち０．９
％ＮａＣｌ溶液中でpH７．４を有する１０mMリン酸カリ
ウムである。媒質のpHは約２〜約１２の範囲にあるべき
であるが、好ましくは約５〜約９、そして最も好ましく
は約７である。ある状況においては、生物学的に活性な
物質は再水和媒質に含まれるが、他の場合には、核酸の
ように、リポソームの再水和／形成に続いて添加され
る。
【００８６】任意のコリピッドの例は、リン脂質関連物
質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトー
ル、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピ
ン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフ
ェート、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰ
Ｃ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、（ＤＰＰ
Ｃ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯ
ＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノール
アミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファ
チジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジオ
レオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マ
レイミド−メチル) シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）である。別の非リン含有脂質
は、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキ
サデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロール
リシノレエート、ヘキサデシルステアレート、イソプロ
ピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノ
ールアミン−ラウリルスルフェート、アルキル−アリー
ルスルフェートポリエチルオキシレート化脂肪酸アミ
ド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、お
よびコレステロール、エルゴステロール、エルゴステロ
ールＢ１、Ｂ２およびＢ３、アンドロステロン、コール
酸、デスオキシコール酸、ケノデスオキシコール酸、リ
トコール酸のようなステロイドである。好ましいコリピ
ッドは、コレステロールおよび／またはＤＯＰＥであ
る。
【００８７】場合により、この懸濁物に、音波処理、逆
相蒸発、凍結−解凍もしくは押し出し処理を行って特定
の大きさの範囲のリポソームを産生することができる。
好ましくは、直径約５０〜約２００μM の単層リポソー
ム(unilamellar liposome)を調製する。次いで、送達さ
れる生物学的に活性な物質を、リポソーム性懸濁物と混
合して生物学的物質の脂質複合体を産生する。
【００８８】この複合体上の正味の電荷は、リポソーム
上の電荷、生物学的物質上の電荷、および用いられる各
々の相対量により決定される。それにより、カチオン性
およびアニオン性脂質複合体のどちらも調製することが
できる。複合体を調製する場合、特にそれらが核酸のin
vivo 送達のために調製される場合には、一般に、中性
であることは避けることが好ましい。代表的に、これ
は、少ない方の成分（電荷を基にした場合の）を、局部
的な濃度勾配を避けるために穏やかに撹拌しながら多い
方の成分に添加することにより達成される。したがっ
て、アニオン性複合体を調製する場合、カチオン性リポ
ソーム懸濁物を核酸に添加し、一方カチオン性複合体を
調製する場合には、添加の順序は逆になる。アニオン性
複合体は核酸の気管による送達により適しており、一方
静脈による送達はカチオン性複合体により、より効果的
に達成されるということが一般に観察される。
【００８９】医薬製剤 本発明は、上で定義したカチオン性脂質および１以上の
生物学的に活性な物質を含む医薬組成物を提供する。そ
のような医薬組成物は、生物学的に活性な分子の、気管
上皮、肺、心臓、胃腸粘膜、および固形腫瘍のような組
織もしくは器官への細胞内進入を容易にする。さらに、
これらの組成物は、in vitroで維持されている細胞への
生物学的物質の進入を容易にする。
【００９０】生物学的に活性な物質 本発明の医薬製剤中に含まれる生物学的に活性な物質に
は、薬物および核酸がある。本明細書に記載するよう
に、核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲ
ＮＡ、リボゾームＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザ
イム、ＲＮＡおよびＤＮＡの混合二本鎖および三重鎖な
らびにプラスミドがある。核酸はまた、天然に生じる塩
基、炭水化物残基および／またはホスホジエステル結合
がペプチド核酸のように改変されている種も含む。その
ような改変には、ホスホロチオエート、非天然塩基の置
換など、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１８４０およびＷＯ９６
／１８４１パンフレットに開示された種を含むがそれら
に限定されないものがある。
【００９１】よくあるのは、核酸が治療的もしくは診断
的に重要なタンパク質をコードする場合である。そのよ
うなタンパク質には、組織適合性抗原、細胞接着分子、
成長因子（例えば、末梢動脈疾患の血管上皮成長因
子）、組換えヒト第VIII因子、ホルモン（インスリン、
成長ホルモン、成長ホルモン放出因子）、サイトカイン
（例えば、ＩＬ−１２）、ケモカイン、抗体、抗体フラ
グメント、細胞レセプター、細胞内酵素、転写因子（例
えば、ＮＦ−κＢ、ＩκＢ）、傷害性ペプチド（例え
ば、リシンＡ鎖、ジフテリアトキシンなど、疾患に罹っ
たもしくは悪性の細胞を排除することができるもの）、
またはこれらのうちの任意のもののフラグメントもしく
は改変物がある。そのようなタンパク質には短縮物およ
び野生型タンパク質の変異タンパク質が含まれ、治療的
必要に応じて野生型変種のアゴニストもしくはアンタゴ
ニストとして作用し得る。
【００９２】核酸はまた、発現制御配列を含んでもよ
く、そして一般に、転写プロモーター、エンハンサー、
転写ターミネーター、オペレーターもしくは他の制御配
列を含む転写ユニットを有している。よく所望されるの
は、そのタンパク質を標的組織内で特異的に発現させる
ことを確かなものにする組織特異的プロモーターを有し
ていることである。診断的に重要なタンパク質をコード
する核酸は、しばしば、選択マーカーもしくは診断マー
カー（例えば、lacZ、βガラクトシダーゼ、クロラムフ
ェニコールトランスフェラーゼなど）をコードする他の
配列を有している。
【００９３】本発明のカチオン性脂質−核酸複合体はま
た、細胞の成分に結合することができるリガンドおよび
／またはレセプターを含んでもよい。リガンドは、レセ
プターといわれる別の分子に特異的に結合することがで
きる任意の目的の化合物であり、このリガンドとレセプ
ターは相補的な対を形成する。例えば、リガンドは、主
要組織適合性複合体、ＨＬＡ−Ａのような細胞表面レセ
プターに対する抗体であってもよい。そのような処方物
により、表面にレセプターを発現する特定の細胞のサブ
セットに対して核酸を特異的に標的化させることができ
る。あるいは、リガンドは、アンジオテンシン転換酵素
のような細胞内酵素の阻害剤のような小分子であっても
よい。リガンドは、共有結合的にカチオン性脂質に結合
してもよいし、あるいはリポソーム性の膜に非共有結合
的に固定されてもよい。
【００９４】トランスフェクション 本発明のカチオン性脂質−核酸複合体を用いてin vitro
およびin vivo の両方において細胞をトランスフェクシ
ョンした。In vitro実験は血清存在下および非存在下の
両方で行った。トランスフェクション効率は、Lipofect
in（登録商標）、DOTMA （登録商標）のような市販のカ
チオン性脂質処方物、ならびにより最近開示されたCyto
fectin GS-2888 (J. G. Lewis et al., Proc. Natl. Ac
ad. Sci.(USA), Vol. 93, 3176-3181 (1996))のような
カチオン性脂質と比較して決定した。トランスフェクシ
ョン効率は、lacZ／β−ガラクトシダーゼ検出用マーカ
ーを有するＰＣＭＶβプラスミドを用いて決定した。実
施例のところでより詳細に示すように、血清存在下での
対象のカチオン性脂質のトランスフェクション効率は他
のLipofectin（登録商標）もしくはGS-2888 と比べて一
貫して高かった。特定の理論に縛られるわけではない
が、本明細書中で開示されたカチオン性のグアニジノ脂
質によって可能になったこの驚くべき優位性は、グアニ
ジノ頭部基がよりしっかりとＤＮＡに結合していること
によるもので、したがって、血清タンパク質への結合に
利用されることが少ないと考えられる。
【００９５】本発明のカチオン性脂質を用いる脂質仲介
性送達を用いてトランスフェクションされ得る細胞のタ
イプには、内皮細胞、上皮細胞（特に、肺上皮細胞）、
胚胞、気管支細胞、ケラチノサイト、および滑液分泌細
胞があるがそれらに限定されない。
【００９６】驚くべきことに、グアニジノ頭部基をリポ
アミド部分に接続しているリンカーの長さがトランスフ
ェクション効率において役割を果たしており、リポアミ
ンのアミド基とグアニジノ頭部基との間の２もしくは３
炭素原子のスペーサーは、３もしくは４炭素原子のスペ
ーサーより高いトランスフェクション効率を与えるとい
うことが観察された。
【００９７】表１は、１〜４炭素の長さのリンカー鎖を
有するオレイル尾部基およびグアニジノ頭部基を持つカ
チオン性脂質の、ネズミ線維芽（３Ｔ３）細胞、上皮細
胞（ＨＢＥ）および血管上皮細胞（ＩＶＥＣ）における
トランスフェクション効率を示す。トランスフェクショ
ン効率はDOTMA （登録商標）について観察される効率と
比較して表す。
【００９８】
【表２】
【００９９】驚くべきことに、グアニジノ頭部基のアミ
ノ基上の置換基もまた予期せぬ高いトランスフェクショ
ン効率を与えるということも観察された。表２は、オレ
イル尾部、エチレンリンカー鎖およびグアニジノ頭部基
上に種々の置換基を有するカチオン性脂質の、ネズミ線
維芽（３Ｔ３）細胞、上皮細胞（ＨＢＥ）および血管上
皮細胞（ＩＶＥＣ）におけるトランスフェクション効率
を示す。トランスフェクション効率はDOTMA （登録商
標）について観察される効率と比較して表す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】トランスフェクション手法は、in vivo で
は動物の細胞への直接注入により行うことができる。あ
るいは、トランスフェクションは、in vitroで、動物か
ら外植された細胞に対して行ってもよく、その後その細
胞を動物に再導入する（ex vivo 法）。臨床的設定にお
けるin vivo およびex vivo トランスフェクションのプ
ロトコールは、Human Gene Therapy, 7, 1621-1642 (19
96) において見ることができる。in vivo でトランスフ
ェクションされ得る組織には、気管上皮および血管上皮
がある。
【０１０２】投与は、任意の許容された全身経路もしく
は局部経路によることができ、例えば、非経口的、経口
的（特に、幼児の処方物では）、静脈内、鼻腔内、気管
支吸入（すなわち、エーロゾル処方物）、経皮もしくは
局所的経路により、固体、半固体もしくは液体用量形態
で、例えば、錠剤、坐薬、ピル、カプセル、粉末、溶
液、懸濁液、エーロゾル、乳濁液など、好ましくは正確
な用量を簡単に投与するのに適した単位用量形態であり
得る。組成物は、従来の薬学的担体もしくは賦形剤、生
物学的に活性な物質、式Ｉのカチオン性脂質を含み、さ
らに、他の医療用物質、医薬物質、担体、アジュバント
などを含んでもよい。担体は、石油、動物、植物もしく
は合成起源のもの、例えば、ピーナツ油、ダイズ油、ミ
ネラルオイル、ゴマ油などの種々の油から選択すること
ができる。水、生理食塩水、水性デキストロース、およ
びグリコールは好ましい液体担体であり、特に注射可能
な溶液にとって好ましい。適切な薬学的担体には、デン
プン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、
スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、白亜
（chalk)、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ス
テアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロー
ル、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピ
レングリコール、水、エタノールなどがある。他の適切
な薬学的担体およびそれらの処方物は、E. W. Martinに
よる"Remington's Pharmaceutical Sciences" に記載さ
れている。
【０１０３】所望ならば、投与される医薬組成物は少量
の非毒性の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、
例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、ト
リエタノールアミンオレエートなどのようなpH緩衝剤な
どを含んでもよい。
【０１０４】本発明の脂質−ポリアニオン複合体もま
た、一般に、薬学的賦形剤をポリアニオンおよび式Ｉの
カチオン性脂質と組み合わせて含む医薬組成物として投
与される。これより前に記載されたように、それは、治
療的に重要なタンパク質をコードする核酸を送達するの
に特に有用である。処方物中の核酸およびカチオン性脂
質のレベルは、当業者によって用いられる範囲全体で変
化する。in vitro投与については、核酸は約０．５〜１
００μM の範囲であり得、好ましくは約１．５〜３０μ
M の範囲であり、そしてカチオン性脂質は約１〜２００
μM の範囲であり、好ましくは約５〜１２０μM であ
る。in vivo の投与については、核酸は約０．１〜１０
mMの範囲であり得、好ましくは約０．２〜２mMの範囲で
あり、そしてカチオン性脂質は約０．１〜２０mMの範囲
であり、好ましくは約０．２〜１０mMである。
【０１０５】静脈内投与 静脈内投与は、治療物質の投与の重要な経路であること
が証明された。本発明のカチオン性脂質を含む医薬製剤
は、例えば、上記のようにしてそして受容可能な点滴用
流体に分散させて脂質複合体を調製することによりこの
経路を介して投与することができる。本発明の化合物の
代表的な一日当たりの用量は、１回の点滴により、ある
いは周期的な間隔をあける一連の点滴により投与するこ
とができる。
【０１０６】注射もしくは経口投与用の制御された放出
のリポソーム液体医薬製剤が、米国特許第４，０１６，
１００号に記載されている。腸カプセルに詰められた凍
結乾燥したリポソーム／ペプチド薬物混合物の経口薬物
送達のためのリポソーム適用もまた示唆されており、米
国特許第４，３４８，３８４号を参照されたい。以上の
ものを参考として本明細書中に援用する。
【０１０７】エーロゾル投与 エーロゾル投与は、治療物質を直接気道に送達するため
の効果的な手段である。この方法のいくつかの利点は：
１）それは酵素分解の影響、胃腸管からの不十分な吸
収、もしくは治療物質の肝臓の最初の通過という損失を
迂回する；２）それは、その分子量、電荷もしくは肺以
外の部位への親和性のせいで気道内の標的部位に到達で
きない治療用物質を投与する；３）それは、肺の肺胞を
介した体内への素早い吸収を与える；および４）それ
は、他の器官系をその治療物質へ曝露することを回避
し、そのことは、曝露が望ましくない副作用を起こし得
る場合には重要なことである。このような理由により、
エーロゾル投与は特に、喘息、肺の局部的感染、および
肺および気道の疾患および疾患的状態の処置にとって利
点がある。
【０１０８】３つのタイプの医薬用吸入装置、すなわち
ネブライザー吸入器、用量調節吸入器（ＭＤＩ）および
乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）がある。ネブライザー装置
は、高速の空気の流れを作りだし、それにより治療物質
（液体の形態で処方されている）が、患者の気道に送り
込まれるミストとして噴霧される。ＭＤＩは、代表的に
は圧縮ガスと一緒にパッケージされた処方物を有してい
る。発動作用時に、この装置は適度な量の治療物質を圧
縮ガスによって発射し、それにより設定量の物質を投与
する信頼のおける方法を可能にする。従来、ＭＤＩは、
クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）を治療物質を推進す
る圧縮ガスとして用いてきた。最近では、ＣＦＣは、地
球のオゾン層の破壊に結びついている。この結果、オゾ
ンに脅威を与えない代替的プロペラントが可能性のある
ＣＦＣの置換物として探索されている。
【０１０９】ＤＰＩは、治療物質を、その装置によって
呼吸している間は、患者の呼吸気流中に分散され得る自
由な流動粉末の形態で投与する。自由な流動粉末を得る
ため、治療物質はラクトースのような賦形剤と一緒に処
方される。適量の治療薬はカプセルの形態で保管され、
各作動時に分配される。用いられているＤＰＩの例は、
Spinhaler （登録商標）（クロモグリク酸二ナトリウム
の投与用）、Rotahaler （登録商標）（アルブテロール
用）およびTurbuhaler（登録商標）（テルブタリンスル
フェート用）である。上記のすべての方法を本発明の投
与に、特に喘息および他の類似のもしくは関連した気道
障害の処置のために使うことができる。
【０１１０】坐薬 坐薬による全身投与用には、従来の結合体および担体に
は、例えば、ポリアルキレングリコールもしくはトリグ
リセリド〔例えば、ＰＥＧ１０００（９６％）およびＰ
ＥＧ４０００（４％）〕がある。そのような坐薬は、約
０．５wt/wt ％〜約１０wt/wt ％の、好ましくは約１wt
/wt ％〜約２wt/wt ％の範囲の活性成分を含む混合物か
ら形成することができる。
【０１１１】液体 液体の医薬的に投与可能な組成物は、上記のような活性
化合物（約０．５％〜〜約２０％）、およびそれにより
溶液もしくは懸濁液を形成する担体、例えば、水、生理
食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノー
ルなど中の任意の薬学的アジュバントを、例えば、溶
解、分散などをすることにより調製することができる。
【０１１２】そのような投与形態を調製する実際の方法
は、当業者に公知であるか、あるいは、明らかであろ
う; 例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, M
ack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 16th
Ed., 1980を参照されたい。投与される組成物は、どの
ような場合でも、本発明の教示により処置される特定の
状態を軽減するための薬学的に効果的な量で、ある量の
活性な化合物を有する。
【０１１３】
【実施例】以下の実施例は、当業者が本発明をより明確
に理解し、実施することを可能にするために呈される。
それらは、本発明の範囲を限定すると見なされるべきで
はないし、それらの例示および代表的なものであるだけ
である。
【０１１４】略語： ＢＯＣ：tert−ブチルオキシカルボニル ＣＤＩ：カルボニルジイミダゾール thio−ＣＤＩ：チオカルボニルジイミダゾール ＰＹＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）
トリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェ
ート ＤＩＥＡ：ジ−イソプロピルエチルアミン
【０１１５】実施例１−式Ｉの化合物の調製 Ａ．３−〔Ｎ′，Ｎ″−ビス（２−tertブチルオキシカ
ルボニルアミノエチル)グアニジノ〕−Ｎ，Ｎ−ジオク
タデカ−９−エニル−プロピオンアミド（図１および２
に関して化合物２−Ｏ） ２Ｂの合成のための特定の反応順序を反応スキームＣお
よびＤに示す。以下の実験手順に記載された中間体はこ
れらの反応スキームのように番号付けされている。
【０１１６】
【化４】
【０１１７】
【化５】
【０１１８】化合物１ 塩化メチレン（２００ml）中の室温のオレイン酸の溶液
（９９＋％、１２．４８gm.,４４．２mmol）に、１，
１′−カルボニルジイミダゾール（８．２４ｇ、５０．
２mmol）を添加した。３０分撹拌した後、濃縮水酸化ア
ンモニウム（５０ml）およびテトラブチルアンモニウム
ブロミド（１．４２ｇ、４．４２mmol）を添加し、得ら
れた混合物を２時間急速に撹拌した。水（１００ml）と
撹拌した後、有機層を分離し、水で２回洗浄し、乾燥さ
せ（硫酸マグネシウム）、そして減圧下でストリッピン
グした。粗生成物（１２．８８ｇ）をヘキサンから再結
晶化させ、１２．３５ｇの化合物１を白色の固体として
得た。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】化合物２ アルゴン下の乾燥テトラヒドロフラン（１００ml）中の
室温の化合物１（１０ｇ、３５．５mmol）の溶液に、１
分間にわたりシリンジにより水素化アルミニウムリチウ
ム（３９ml、３９mmolＴＨＦ中１モル）を滴下した。わ
ずかな発熱があった。乳状の混合物を１時間室温で撹拌
し、次いで、５０℃で６時間撹拌した。急速に撹拌した
氷冷混合物に注意深く水（１．５ml）、次いで水性の水
酸化ナトリウム（１５％、１．５ml）、そして水（３．
５ml）を滴下した。得られた白色粒状固体を濾過し、塩
化メチレン（３０ml）で洗浄した。塩化メチレン溶液を
ストリッピングした後、得られた無色の液体（９．７
ｇ）をシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフにかけ
（塩化メチレン中メタノール５％〜７％〜１０％で溶
出）、無色の液体７．４ｇを得た。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】化合物３ 塩化メチレン（４００ml）中の室温のオレイン酸の溶液
（９９％、２８．２５ｇ、１００mmol）に、１，１′−
カルボニルジイミダゾール（１７．８４ｇ、１１０mmo
l）をすぐに添加し、アルゴン下で３０分間撹拌した。
化合物２（２６．７５ｇ、１００mmol）を添加し、アル
ゴン下でさらに２時間撹拌した。水（２００ml）を添加
し、混合物を２、３分間撹拌した。塩化メチレン層を分
離し、乾燥させ（硫酸マグネシウム）、減圧下で濃縮し
て白色グリース状物（５７．５ｇ）を得た。
【０１２３】
【表６】
【０１２４】化合物４ アルゴン下の乾燥テトラヒドロフラン（１００ml）中の
室温の化合物３（９．６７ｇ、１８．２５mmol）の溶液
に、１分間にわたりシリンジにより水素化アルミニウム
リチウム（２０ml、２０mmolＴＨＦ中１モル）を滴下
し、次いでアルゴン下で６０℃で一晩撹拌した。急速に
撹拌した氷冷混合物に、注意深く水（０．７ml）、次い
で水性の水酸化ナトリウム（１５％、０．７ml）、そし
て水（２．１ml）を滴下した。得られた白色粒状固体を
濾過し、エーテル（５０ml）で洗浄し、乾燥させ（無水
硫酸マグネシウム）、そして減圧下で濃縮した。粗製の
黄色の油（９．４５ｇ）をシリカゲル上でフラッシュク
ロマトグラフにかけ（２５％酢酸エチル／ヘキサン＋１
％トリエチルアミン）、薄い黄色の油４．２ｇおよびわ
ずかに不純な生成物０．８９ｇを得た。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】化合物５ アルゴン下の室温の化合物４（１０．３６ｇ、２０mmo
l）、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−β−アラニン（３．７８ｇ、２
０mmol）、およびＰｙＢＯＰ（１２．４９ｇ、２４mmo
l）の混合物に、ジメチルホルムアミド（７５ml）を添
加し、５分間撹拌した。この溶液に、ジイソプロピルエ
チルアミン（１０．４５ml、６０mmol）を添加し、次い
でさらに４５分間撹拌した。撹拌中の褐色の溶液に水
（５００ml）および酢酸エチル（２５０ml）を添加し
た。有機層を分離し、水層を酢酸エチル（１００ml）で
２回抽出した。あわせた有機層部分を水（１００ml）で
洗浄し、乾燥させ（硫酸マグネシウム）、そして減圧下
で濃縮した。粗製の褐色油性固体をシリカゲル上でフラ
ッシュクロマトグラフにかけ（酢酸エチル／ヘキサン、
５％〜１０％）、１３．４５ｇの無色の油を得た。
【０１２７】
【表８】
【０１２８】化合物６ アルゴン下の乾燥ジオキサン（２０ml）中の化合物５
（７．７５ｇ、１１．２mmol）の溶液にジオキサン中４
N ＨＣｌ（２５ml）を添加し、室温で一晩撹拌した。こ
の溶液をストリッピングし、アセトニトリル（５０ml）
を添加し、ストリッピングし、そしてさらに２回繰り返
した。残渣を酢酸エチル（２００ml）および１０％の水
性水酸化ナトリウム溶液（１００ml）とともに２時間撹
拌した。酢酸エチル層を分離し、水層を酢酸エチル（５
０ml）で抽出し、あわせた酢酸エチル部分を乾燥させ
（硫酸マグネシウム）、そして減圧下で濃縮した。粗製
の油（６．６ｇ）をシリカゲル上のフラッシュクロマト
グラフにかけ（３％、次いで１０％のメタノール／塩化
メチレン）、６．２９ｇの非常に薄い黄色の油を得た。
【０１２９】
【表９】
【０１３０】化合物７ ６５℃の化合物６（０．５８９ｇ、１．０mmol）、チオ
ウレア（９５mg、１．２５mmol）、トリエチルアミン
（０．４２ml、３．０mmol）、およびテトラヒドロフラ
ン（２５ml）の溶液に塩化第二水銀（０．３４ｇ、１．
２５mmol）を添加し、アルゴン下で６５℃で７日間撹拌
した。白色の懸濁液は徐々に黒色に変化した。この懸濁
液を室温まで冷却し、セライトを通して濾過し、溶液を
ストリッピングした。粗製の濃厚な油をシリカゲル上で
フラッシュクロマトグラフにかけた（５％〜８％〜１０
％〜１５％のメタノール／塩化メチレン＋１％の濃水酸
化アンモニウム）。出発材料（４２５mg）を回収し、純
粋な生成物（１７０mg）を薄黄色の油として得た。この
油を１０％メタノール／塩化メチレンで溶解し、そして
エーテル中１N ＨＣｌ（１ml）を添加してストリッピン
グし、濁ったグリース状物を得た。
【０１３１】
【表１０】
【０１３２】化合物８ 乾燥ジオキサン（１２０ml）中の室温のエチレンジアミ
ンの溶液（２１ｇ、０．３４９モル）に、ジオキサン
（１２０ml）中のジ−ｔ−ブチル−ジカルボネート
（９．８ｇ、２６．６mmol）を３時間にわたって滴下し
た。濁った混合物は徐々に透明になった。この混合物を
一晩室温で撹拌した。ストリッピング後、残渣を水（２
００ml）と一緒に撹拌し、白色の沈殿物を濾過した。濾
過液を塩化メチレン（２００ml）で３回抽出し、乾燥さ
せ（硫酸マグネシウム）、そしてストリッピングして無
色の油（４．８ｇ）を得た。
【０１３３】
【表１１】
【０１３４】化合物９ 化合物８（０．８ｇ、５mmol）と酢酸エチル（３５ml）
の室温の混合物に１，１′−チオカルボニルジイミダゾ
ール（１．０７ｇ、６mmol）を添加して一晩撹拌した。
ストリッピング後、残渣を３０％〜５０％の酢酸エチル
／ヘキサンを用いてシリカゲルでフラッシュクロマトグ
ラフし、０．６６ｇの固体を得た。
【０１３５】
【表１２】
【０１３６】化合物１０ 化合物８（０．２７５ｇ、１．７２mmol）、化合物９
（０．３４７ｇ、１．７２mmol）、およびトルエン（４
ml）の溶液を７５度でアルゴン下で一晩撹拌した。スト
リッピング後、残渣を２％〜３％のメタノール／塩化メ
チレンを用いてシリカゲルでフラッシュクロマトグラフ
し、油を得た（０．３７ｇ）。
【０１３７】
【表１３】
【０１３８】化合物１１ 化合物６（０．２９ｇ、０．４９４mmol）、化合物１０
（０．２１ｇ０．５９６mmol）、トリエチルアミン
（０．２７ml、１．９８mmol）、およびテトラヒドロフ
ラン（２５ml）の６５℃の溶液に、塩化第二水銀（０．
１６ｇ、０．５９６mmol）を添加し、６５℃でアルゴン
下で一日撹拌した。白色の懸濁液は徐々に黒色に変化し
た。この懸濁液をセライトを通して濾過し、この溶液を
ストリッピングした。粗製の濃厚な油をシリカゲル上で
フラッシュクロマトグラフし（５％〜１０％メタノール
／塩化メチレン＋１％濃水酸化アンモニウム）、濃厚な
油を得た（０．２１ｇ）
【０１３９】
【表１４】
【０１４０】Ｂ．式Ｉの他の化合物の調製 上記の手順を用い、適切な酸をオレイン酸の代わりに、
適切なチオウレアもしくはイソチオウロニウム塩を１０
の代わりにして、以下にあげた化合物もまた調製した。
これらの化合物は、図１および２に示すリポアミド尾部
基およびカチオン性頭部基を参考にして定義される。例
えば、化合物１Ａとは図１に示す化合物１であって、式
中Ｘが図２の頭部基Ａであるものをいう。
【０１４１】
【表１５】
【０１４２】
【表１６】
【０１４３】実施例２−リポソームの調製 以下の実施例では、１：１のモル比で指示したカチオン
性脂質と天然の脂質であるジオレオイル−ホスファチジ
ルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とを含むカチオン性リ
ポソーム小胞を用いた。
【０１４４】例えば、塩化メチレン中に溶解した９．１
９mgの２−グアニジノ−Ｎ，Ｎ−ジ−オクタデカ−９−
エニル−プロピオンアミド（化合物２Ｂ）を、クロロホ
ルム中の１０．８１mgのＤＯＰＥと混合した。溶媒をロ
ータリーエバポレーションで除去し、そして脂質フィル
ムを減圧下で乾燥させた。このフィルムを２０mlの滅菌
水で１mg/ml の濃度まで再水和し、４５℃まで加温し、
そして強力バスソニケーターで音波処理するか押し出し
成形して多層（multilamellar)リポソーム小胞を形成し
た。粒子を、Coulter Submicron Particle Sizer. N4M,
(Coulter, Hialeah Florida) を用いるレーザー光線分
散（laser light scattering) により大きさを測定し
た。新規なリポソーム調製物の平均的な大きさは２９６
nm±４０であった。
【０１４５】実施例３−脂質−核酸複合体の調製 以下の実施例では、ＰＣＭＶβプラスミド（Clontech,
Palo Alto, CA)、lacZ／βガラクトシダーゼ遺伝子をコ
ードしている、は水中で−２０℃で濃度１mg/ml で保存
されていた。in vivo 送達用の複合体をＣＭＶプロモー
ターに連結されたＣＡＴ遺伝子をコードするｐＣＴ０１
２９プラスミドにより作製した。プラスミドＤＮＡを無
血清Optimem 培地（LifeTechnologies, Gathersburg, M
d)で８μg/mlまで希釈し、等容量のカチオン性リポソー
ム溶液に添加した。複合体を、トランスフェクション実
験に用いる３０〜４５分前に形成した。複合体を、脂質
／ＤＮＡ比が１：１、１：５、および１：２５の重量比
で調製した。
【０１４６】脂質／ＤＮＡ複合体はまた、２つの市販の
脂質トランスフェクション物質、Lipofectamine （登録
商標）およびLipofectin（登録商標）（LifeTechnologi
es,Gathersburg, Md)を用いて調製した。これらの物質
は、トランスフェクションに慣用的に用いられている市
販の脂質と比較したトランスフェクション効率を評価す
るために用いた。
【０１４７】実施例４−トランスフェクション効率の測
定 第四級アミンを含有するリポソームのそれと比較した、
本発明のグアニジノ含有リポソームを用いて得られるト
ランスフェクション効率を、血清を含有するかもしくは
欠いている培地において比較した（図３〜８）。コリピ
ッド（ＤＯＰＥもしくはコレステロール）、ならびにコ
リピッドとカチオン性グアニジノ−脂質とのモル比の変
化がトランスフェクション効率に及ぼす影響もまた測定
した（図９）。本発明の脂質のトランスフェクション効
率とDOTMA （登録商標）およびGS2888のそれの比較デー
タもまた、in vitro（図１０および１１）、ならびにin
vivo （図１２）の両方で測定した。
【０１４８】新規な脂質／ＤＮＡ複合体を、９６ウェル
のマイクロタイターフォーマットで慣用的手法でスクリ
ーニングして、３つの異なる細胞系、すなわちＮＩＨ３
Ｔ３ネズミ線維芽細胞（ATCC # CTRL 1658) 、ＩＶＥＣ
ヒト内皮細胞（Denise Paulin, Pasteur Institute, Pa
ris, France から購入、J. Cellular Physiol., 457,41
-51 (1993))および１６−ＨＢＥ１４ｏ−ヒト上皮細
胞、Am. J. Physiol., 268, L347-L360 (1995)を用いて
遺伝子移入の効率を測定した。
【０１４９】細胞を、０．５％コラーゲン（Collaborat
ive Biomedical, Bedford, MA)で被覆したCoStarマイク
ロタイターウェル（Cambridge, MA)内で培養した。トラ
ンスフェクションの４８時間前に、細胞を２０，０００
細胞／ウェルで完全培地中に接種した。トランスフェク
ションの日に、培地を吸引し、細胞をOptimem 培地で３
回洗浄し、１０％ＦＢＳ（BioWhittaker, Walker) を含
むかまたは含まない５０μl のOptimem 培地を各マイク
ロタイターウェルに添加し、５０μl の脂質／ＤＮＡ複
合体を適切なウェルに添加し、細胞の最終ＤＮＡ濃度を
生じるよう脂質ＤＮＡ複合体と３７℃で５時間インキュ
ベーションした。次いで、培地を吸引し、１００μl の
完全血清含有培地で置き換え、次に細胞をさらに４８時
間培養した。
【０１５０】トランスフェクション効率を評価するた
め、細胞リゼートを調製し、そしてβガラクトシダーゼ
活性を、螢光発生基質である４−メチルウンベリフェリ
ルβ−Ｄガラクトシダーゼ（ＭＵＧ）（Sigma, St. Lou
is, MO）を製造者の指示に従って用いて測定した。加水
分解された基質の量を、CytoFluorII 螢光計（Millipor
e, Bedford MA)を用いて螢光測定により測定した。リゼ
ート中の全細胞性タンパク質は、ＢＣＡアッセイ(Pierc
e, Rockford IL）を用いて測定した。データは螢光単位
／μg タンパク質として表し、各データ点は３つのサン
プルの測定の平均を表す。
【０１５１】Ａ．ヒト内皮細胞（ＩＶＥＣ）のトランス
フェクション：ＩＶＥＣ細胞（２×１０4)を、０、２、
１０、もしくは５０μg/mlのカチオン性リポソームに複
合体化させた２μg/mlのｐＣＭＶ−βプラスミドＤＮＡ
で、無血清培地（図３）もしくは血清含有培地（図４）
内でトランスフェクションした。トランスフェクション
から４８時間後に、βガラクトシダーゼ活性を、螢光基
質（ＭＵＧ）を用いて測定し、そして活性を細胞リゼー
ト中のタンパク質１μg当たりに標準化した。各データ
点は３つのサンプルの平均を表す。血清存在下では、図
４に示すように、いくつかの新規化合物は、市販の化合
物より２〜１０倍効率よくトランスフェクションを行っ
た。
【０１５２】Ｂ．ヒト気管支上皮細胞（１６ＨＢＥ）の
トランスフェクション：１６ＨＢＥ細胞（２×１０4)
を、０、２、１０、もしくは５０μg/mlのカチオン性リ
ポソームに複合体化させた２μg/mlのｐＣＭＶ−βプラ
スミドＤＮＡで、無血清培地（図５）もしくは血清含有
培地（図６）内でトランスフェクションした。トランス
フェクションから４８時間後に、βガラクトシダーゼ活
性を、螢光基質（ＭＵＧ）を用いて測定し、そして活性
を細胞リゼート中のタンパク質１μg 当たりに標準化し
た。各データ点は３つのサンプルの平均を表す。
【０１５３】図５のデータは、ヒト気管支上皮細胞で
は、血清が存在しない場合、いくつかの新規化合物は、
市販の化合物であるLipofectin（登録商標）に匹敵する
効率でトランスフェクションを行い、そして新規化合物
の一つはおよそ３０％以上高い効率でトランスフェクシ
ョンを行ったことを示す。さらに、血清存在下では、図
６に示すように、いくつかの新規化合物は市販の化合物
より数倍高い効率でトランスフェクションを行った。
【０１５４】Ｃ．ネズミ３Ｔ３線維芽細胞のトランスフ
ェクション：３Ｔ３線維芽細胞（２×１０4)を、０、
２、１０、もしくは５０μg/mlのカチオン性リポソーム
に複合体化させた２μg/mlのｐＣＭＶ−βプラスミドＤ
ＮＡで、無血清培地（図７）もしくは血清含有培地（図
８）内でトランスフェクションした。トランスフェクシ
ョンから４８時間後に、βガラクトシダーゼ活性を、螢
光基質（ＭＵＧ）を用いて測定し、そして活性を細胞リ
ゼート中のタンパク質１μg 当たりに標準化した。各デ
ータ点は３つのサンプルの平均を表す。
【０１５５】図７のデータは、ネズミ３Ｔ３線維芽細胞
では、血清がない場合、新規化合物のいくつかは、グラ
フのずっと右に示した市販の化合物であるLipofectinよ
りおよそ３０〜５０％高い効率でトランスフェクション
を行ったことを示す。さらに、血清存在下では、図８に
示すように、新規化合物のいくつかは市販の化合物より
４〜１０倍高い効率でトランスフェクションを行った。
【０１５６】Ｄ．コリピッドが、ヒト内皮細胞内で、新
規化合物である２−グアニジノ−Ｎ，Ｎ−ジ−オクタデ
カ−９−エニル−プロピオンアミド（２Ｂ）のトランス
フェクション効率に及ぼす影響 カチオン性リポソームは２Ｂ：コレステロール：ＤＯＰ
Ｅを種々のモル比で含んで調製した。ＩＶＥＣ細胞（２
×１０4)を、０、２、１０、もしくは５０μg/mlのカチ
オン性リポソームに複合体化させた２μg/mlのｐＣＭＶ
−βプラスミドＤＮＡで、無血清培地もしくは血清含有
培地（図９）内でトランスフェクションした。トランス
フェクションから４８時間後に、βガラクトシダーゼ活
性を、螢光基質（ＭＵＧ）用いて測定し、そして活性を
細胞リゼート中のタンパク質１μg 当たりに標準化し
た。各データ点は３つのサンプルの平均を表す。
【０１５７】図９のデータは、ヒト内皮細胞では、血清
存在下では、新規化合物２ＢをコレステロールおよびＤ
ＯＰＥと、１：０：１、および０．５：０．２５：０．
２５の比で組み合わせたものは、グラフの左端に示した
市販の化合物であるLipofectin（登録商標）LipofectAm
ine （登録商標）より１０〜２０倍高い効率でトランス
フェクションを行ったことを示す。血清がない場合、図
９に示すように、新規化合物２ＢをＤＯＰＥと１：１の
比で組み合わせたものは、市販の化合物であるLipofect
Amine （登録商標）より約４０％高い効率でトランスフ
ェクションを行った。
【０１５８】Ｅ．Cytofectin GS2888 と比べた新規なＲ
Ｓ−化合物のトランスフェクション活性 ＢＯＣ保護したGS-2888 を、２つの方法、すなわち、ク
ロリド塩としておよび遊離の塩基として調製した。カチ
オン性の脂質と天然の脂質との比は１：１であった。図
１１は、GS-2888 が活性であったことを示すコントロー
ルとして供される。図１０および１１の両方に用いられ
た化合物は、異なる細胞について、同一のバッチから、
同一の日に、同一のＤＮＡを用いて調製した。
【０１５９】２×１０4 個の細胞を、０、２、１０、も
しくは５０μg/mlのカチオン性リポソームに複合体化さ
せた２μg/mlのｐＣＭＶ−βプラスミドＤＮＡで、血清
含有培地（図６）内でトランスフェクションした。GS-2
888 を、天然の脂質と１：１および２：１のモル比で処
方した。トランスフェクションから４８時間後に、βガ
ラクトシダーゼ活性を、螢光基質（ＭＵＧ）を用いて測
定し、そして活性を細胞リゼート中のタンパク質１μg
当たりに標準化した。各データ点は３つのサンプルの平
均を表す。図１０は、ＩＶＥＣ内皮細胞におけるトラン
スフェクション効率を示す；図１１は、１６−ＨＢＥ上
皮細胞におけるトランスフェクション効率を示す。図１
０は、ＨＢＥ細胞では、いくつかの新規なグアニジノ脂
質がGS2888より１０倍効率的であることを示す。
【０１６０】Ｆ．本発明の新規化合物のin vivo トラン
スフェクション効率 in vivo 送達に適切な濃度および容量でＤＮＡ／脂質複
合体を調製する再現性のある方法を確立した。この方法
は、天然の脂質ＤＯＰＥと共に処方した、カチオン性脂
質DOTMA （登録商標）もしくは本発明のカチオン性脂質
を含有するリポソームを用いて開発した。ＤＮＡは、ポ
リアニオン性環状プラスミドの形態であった。上首尾な
複合体化は、少量成分を、急速に撹拌されている多量成
分の溶液にゆっくりと注入することによって達成した。
この方法を滅菌条件下で用い、幅広い濃度範囲（ＤＮＡ
０．１５〜１．５mM；脂質０．２〜８．５mM）および電
荷比で複合体の大きさに関して再現性があることが示さ
れた。
【０１６１】In vivo テストは、麻酔したラットでの脂
質／ＤＮＡ複合体の気管内インストレーションにより行
った。ＣＭＶプロモーターに連結されたクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を
コードするプラスミド（ｐＣＴ０１２９）を、トランス
フェクション効率の全in vivo 評価に用いた。トランス
フェクション複合体は、代表的には、０．８〜３．５mM
のリポソームに複合体化させた２００μg のＤＮＡおよ
び５％デキストロースを含有していた。２５０μl の複
合体を、３０ゲージの針に接続したＰ１０チューブを介
してインストールすることによりラットの肺に送達し
た。ラットを４０時間後に屠殺し、肺を採取して、CAT-
Elisa (Boehringer Mannheim) アッセイを用いて酵素活
性を分析した。
【０１６２】DOTMA （登録商標）と比較した異なるセッ
トのカチオン性脂質について図１２に結果を示す。デー
タは、ｐｇのＣＡＴタンパク質／mgの肺タンパク質（ｎ
＝８）の平均として表され、本発明の脂質に複合体化さ
れたＤＮＡを与えた動物で検出されたＣＡＴタンパク質
のレベルは、DOTMA （登録商標）に複合体化されたＤＮ
Ａを与えた動物で検出されるそれより５０倍高いことが
示された。
【０１６３】前述の発明は、例示および実施例という方
法により、明確かと理解を目的として幾分詳細に記載さ
れてきた。変更および改変は、添付の請求の範囲内で実
施してもよいということは当業者には明らかである。し
たがって、上記の説明は例示を意図しているのであっ
て、制限を意図しているものではないことが理解される
であろう。したがって、本発明の範囲は、上記の説明を
参考にするのではなく、その代わりに添付の請求の範囲
を参考に、そのような請求の範囲が与えられる等価のも
のの全範囲を含めて決定されるべきである。
【０１６４】本明細書中に引用されたすべての特許、特
許出願、および刊行物は、それらのすべてを、各特許、
特許出願および刊行物が個々に示されているのと同じ範
囲だけ、すべての目的のために本明細書中に援用する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、頭部（head）基Ｘに付着した図示した
構造を有するリポアミド尾部（tail）基として示される
本発明の代表的なカチオン性脂質化合物を示す。
【図２】図２は、本発明のカチオン性脂質化合物の代表
的な頭部基Ｘを示す。
【図３】図３は、ヒト内皮細胞のＤＮＡトランスフェク
ション効率を、無血清培地中で、市販品であるLipofect
in（登録商標）（Ｌｐ）およびLipofectAmine （登録商
標）（Ｌｆ）と、本発明の化合物とを比較したものを示
す。
【図４】図４は、ヒト内皮細胞のＤＮＡトランスフェク
ション効率を、血清含有培地中で、市販品であるLipofe
ctin（登録商標）（Ｌｐ）およびLipofectAmine （登録
商標）（Ｌｆ）と、本発明の化合物とを比較したものを
示す。
【図５】図５は、ヒト気管支上皮細胞のＤＮＡトランス
フェクション効率を、無血清培地中で、市販品であるLi
pofectin（登録商標）（Ｌｐ）およびLipofectAmine
（登録商標）（Ｌｆ）と、本発明の化合物とを比較した
ものを示す。
【図６】図６は、ヒト気管支上皮細胞のＤＮＡトランス
フェクション効率を、血清含有培地中で、市販品である
Lipofectin（登録商標）（Ｌｐ）およびLipofectAmine
（登録商標）（Ｌｆ）と、本発明の化合物とを比較した
ものを示す。
【図７】図７は、ネズミ３Ｔ３線維芽細胞のＤＮＡトラ
ンスフェクション効率を、無血清培地中で、市販品であ
るLipofectin（登録商標）（Ｌｐ）およびLipofectAmin
e （登録商標）（Ｌｆ）と、本発明の化合物とを比較し
たものを示す。
【図８】図８は、ネズミ３Ｔ３線維芽細胞のＤＮＡトラ
ンスフェクション効率を、血清含有培地中で、市販品で
あるLipofectin（登録商標）（Ｌｐ）およびLipofectAm
ine （登録商標）（Ｌｆ）と、本発明の化合物とを比較
したものを示す。
【図９】図９は、コリピッドであるコレステロールおよ
びＤＯＰＥの、新規化合物２−グアニジノ−Ｎ，Ｎ−ジ
−オクタデカ−９−エニル−プロピオンアミド（２Ｂ）
の無血清培地中でのヒト内皮細胞におけるトランスフェ
クション効率への影響を示す。括弧内の比率は、各実験
における２Ｂ：コレステロール：ＤＯＰＥの比率であ
る。
【図１０】図１０は、本発明の化合物を他の脂質化合
物、すなわちLipofectin（登録商標）（Ｌｐ）、Lipofe
ctAmine （登録商標）（Ｌｆ）およびGS-2888 （１１
ｎ、遊離塩基として使用、１１ｎ／ｂもしくはクロリド
塩、１１ｎ／Ｃｌ）と比較した上皮細胞におけるトラン
スフェクション効率を示す。
【図１１】図１１は、培養血管上皮細胞においてテスト
したいくつかの化合物の活性を示す。
【図１２】図１２は、気管インストレーションによって
ラットに投与された場合の本発明の化合物とDOTMA （登
録商標）とを比較したin vivo トランスフェクション効
率を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ドナルド・ロイ・ヒルシュフェルド アメリカ合衆国、カリフォルニア 94041、 マウンテン・ビュー、ダルマ・ドライブ 62 (72)発明者 ジョン・オットー・リンク アメリカ合衆国、カリフォルニア 94110、 サン・フランシスコ、モルトリー 238 (72)発明者 ジョン・ヨセフ・ネスター・ジュニア アメリカ合衆国、ケンタッキー 40223、 ルイビル、エッジウォーター・ロード 10612 (72)発明者 ゲーリー・アレン・ペルツ アメリカ合衆国、カリフォルニア 94061、 レッドウッド・シティ、ダンベリー・レー ン 110

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下式の化合物 Ｒ1 Ｒ2 Ｎ−Ｃ（Ｏ）−Ａ−Ｘ（式Ｉ） 式中、 Ｒ1 およびＲ2 は、同じかまたは異なって、Ｃ10〜Ｃ26
    のヒドロカルビル基であり；Ａは、１以上のメチレン基
    が場合によりＹ基で置き換わっている（ただし、Ｙ基の
    いずれも互いに隣接していない）ヒドロカルビレン基で
    あって、ここで各Ｙは独立して、示した向きであり、−
    Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ5 −、
    −ＮＲ5 Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ5 −、−ＮＲ5 Ｃ
    （Ｏ）ＮＲ5−、−ＮＲ5 Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）
    ＮＲ5 −、−Ｓ（Ｏ)n−（ここでｎは０、１もしくは２
    である）または−ＮＺ−Ｃ（＝ＮＺ）ＮＺ−、ここで各
    Ｚは独立してＨもしくは−（ＣＨ2)m ＮＲ5 −Ｃ（＝Ｎ
    Ｒ5)ＮＲ5 で、ｍは１〜１０の整数であり、そして各Ｒ
    5 は独立してＨもしくは低級アルキルであり；Ｘは；
    （１）各ヒドロカルビル基が他と同じかもしくは異なる
    トリヒドロカルビルアンモニウム基であるか、（２）−
    ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ3)ＮＨＲ4 であって、Ｒ3 およびＲ4
    が独立してヒドロカルビル、ハロアルキル、ヒドロキシ
    アルキル、Ｏ−保護ヒドロキシアルキル、アルコキシア
    ルキル、ハロアルコキシアルキル、アリールオキシアル
    キル、アミノアルキル、モノ−もしくはジ−置換アミノ
    アルキル、Ｎ−保護アミノアルキル、アシル、アルコキ
    シカルボニル、アリールオキシカルボニル、−Ｃ（Ｏ）
    ＮＲ6 Ｒ7 （ここで、Ｒ6 およびＲ7 は独立してＨまた
    はヒドロカルビルである）、窒素保護基であるか、ある
    いは、Ｒ3 およびＲ4 がそれが付着している原子と一緒
    になって場合により置換されている単環式のもしくは二
    環式の環を形成するが；ただし：Ｒ1 およびＲ2 がどち
    らも同じＣ16アルキル基であり、かつＸが−ＮＨ−Ｃ
    （＝ＮＨ）ＮＨ2 であり、Ａがブチレン鎖ではない；な
    らびにそれらの塩、溶媒和物、分割したもしくは分割し
    ていないエナンチオマー、ジアステレオマーおよびそれ
    らの混合物。
  2. 【請求項２】 Ｘが−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ3)ＮＨＲ4 であ
    る、請求項１に記載の化合物。
  3. 【請求項３】 Ｒ1 およびＲ2 がアルキル基もしくはモ
    ノ不飽和アルケニル基である、請求項１または２に記載
    の化合物
  4. 【請求項４】 Ｒ1 およびＲ2 が同一である、請求項１
    〜３のいずれか１項に記載の化合物
  5. 【請求項５】 Ｒ1 およびＲ2 がＣＨ3(ＣＨ2)7 ＣＨ＝
    ＣＨ（ＣＨ2)8 −である、請求項１〜４のいずれか１項
    に記載の化合物。
  6. 【請求項６】 Ａがアルキレン基である、請求項１〜５
    のいずれか１項に記載の化合物。
  7. 【請求項７】 Ａがメチレン基もしくはエチレン基であ
    り、かつＲ3 およびＲ4 がどちらもＨまたはＮ−保護−
    アミノアルキルである、請求項１〜６のいずれか１項に
    記載の化合物。
  8. 【請求項８】 Ｒ3 およびＲ4 が、２−（ｔ−ブチルオ
    キシカルボニルアミノ）エチルおよび３−（ｔ−ブチル
    オキシカルボニル）プロピルからなる群から選択される
    Ｎ−保護−アミノアルキル基である、請求項１〜７のい
    ずれか１項に記載の化合物。
  9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の化
    合物とポリアニオンを含むポリアニオン−脂質複合体。
  10. 【請求項１０】 前記ポリアニオンが核酸である、請求
    項９に記載のポリアニオン−脂質複合体。
  11. 【請求項１１】 さらに標的化リガンドを含む、請求項
    ９または１０に記載のポリアニオン−脂質複合体。
  12. 【請求項１２】 前記核酸が発現プラスミドである、請
    求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリアニオン−脂
    質複合体。
  13. 【請求項１３】 前記発現プラスミドがＩＬ−１２もし
    くはＩκＢをコードする、請求項１２に記載のポリアニ
    オン−脂質複合体。
  14. 【請求項１４】 ポリアニオン−脂質複合体の作成方法
    であって、以下の工程：請求項１〜８のいずれか１項に
    記載の化合物と場合によってコリピッドを含むリポソー
    ムを形成する工程；および該リポソームをポリアニオン
    と接触させて請求項９〜１３のいずれか１項に記載のポ
    リアニオン−脂質複合体を形成する工程、を包含する方
    法。
  15. 【請求項１５】 ポリアニオンを細胞に送達する方法で
    あって：請求項１４に記載の複合体を形成する工程、お
    よび該細胞を該複合体に接触させる工程を包含する方
    法。
  16. 【請求項１６】 請求項９〜１３のいずれか１項に記載
    のポリアニオン−脂質複合体、および薬学的に受容可能
    な賦形剤を含む医薬製剤。
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