JP2918693B2 - 両親媒性イミダゾリニウム誘導体 - Google Patents

両親媒性イミダゾリニウム誘導体

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願の相互参照 本出願は、USSN08/157727の一部継続出願（1993年11
月24日出願）であり、この一部継続出願は、USSN07/991
935の一部継続出願（1992年12月17出願）であり、この
開示をもって本明細書の記載とする。
序論 発明の分野 本発明は、遺伝子療法に使用する核酸を含め、薬剤用
のリポソームおよび他の脂質含有担体を調製するために
使用する窒素含有両親媒性物質（化合物）に関する。
発明の背景 リポソームは、生物学的担体として使用する多くの脂
質含有材料の一種であり、多くの薬学的および他の生物
学的状況で、とりわけ薬物、放射線療法剤、酵素、ウイ
ルス、転写因子および他の細胞ベクターを種々の培養セ
ルラインおよび動物に導入するために、有効に用いられ
ている。リポソームを介した薬物デリバリー（送達）
が、リポソームに封入した薬物を特異的組織および特定
種の細胞にもたらすのに有効であることは臨床試験によ
り示されている。例えば、米国特許第5264618号には、
脂質担体を使用する多くの方法（リポソームおよび薬剤
組成物の調製、並びにそのような組成物の臨床的使用を
包含する）が記載されている。しかし、リポソームを介
するベクターの使用の基本的方法は開発が進んでいる
が、この方法において使用する材料は、生体適合性およ
び担体の有効性に関して、更に改善することが望まし
い。
とりわけ、ヒトおよび／または種々の商業的に有用動
物における外因性（外性）遺伝子の発現は、最終的に、
多くの重要な疾病の予防および／または治療、並びに商
業的に重要な性質を有する動物の開発をもたらし得る。
遺伝子は高分子量のポリアニオン性分子で、その担体伝
達デリバリーには通例、インビトロまたはインビボでの
細胞のDNAトランスフェクションが必要である。従っ
て、特定の組織または細胞におけるクローン化遺伝子の
デリバリーおよび最終的な発現を向上し得る脂質トラン
スフェクションベクターを開発することは重要である。
処置法によっては遺伝子（または他の薬学的生成物）を
反復して投与することがあるので、脂質担体は、反復し
た投与後もホストに対し無毒性であることも重要であ
る。
関連文献 DNAの担体としてリポソームを使用することを記載し
た文献は、下記のものを包含する：フリードマン（Frie
dmann）（1989）、上記；ブリンガム（Brigham）ら（19
89）アメリカン・ジャーナル・オブ・メディカル・サイ
エンシーズ（Am.J.Med.Sci.）、298:278−281;ナベル
（Nabel）ら（1990）サイエンス（Science）、249:1285
−1288;ハジンスキー（Hazinski）ら（1991）アム・ジ
ェイ・レスプ・セル・モレク・ビオル（Am.j.Resp.Cell
Molec.Biol.）、4:206−209;ワン（Wang）およびファ
ン（Huang）（1987）プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ（Proc.Nat
l.Acad.Sci.）（USA）、84:7851−7855;リガンド特異的
カチオン系輸送システムへの連結〔ウー（Wu）およびウ
ー（1988）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J.Biol.Chem.）、263:14621−14624〕または裸
のDNA発現ベクターの使用〔ネーベルら（1990）、上
記〕；ウォルフ（Wolff）ら（1990）サイエンス、247:1
465−1468。トランスジェニック材料の組織への直接注
射により、局部的な発現が導かれた：ローゼンフェルド
（Rosenfeld）（1992）、上記；ローゼンフェルドら（1
991）、上記；ブリンガムら（1989）、上記；ナベル（1
990）、上記；ハジンスキーら（1991）、上記。ブリン
ガムらのグループのアメリカン・ジャーナル・オブ・メ
ディカル・サイエンシーズ（1989）298:278−281および
クリニカル・リサーチ（Clinical Research）（1991）
39（アブストラクト）には、DNAリポソーム複合体の静
脈内または気管支内投与による、マウス肺への局部的な
インビボトランスフェクションが報告されている。スト
リブリング（Stribling）らのプロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ
（USA）89:11277−11281（1992）（マウス肺へのトラン
スジーンのエアロゾルデリバリーのための担体としてリ
ポソームを使用することが報告されている）、およびヨ
シムラ（Yoshimura）らのヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ（Nucleic Acids Research）（1992）20:3233
−3240も参照。
カチオン性脂質担体は、プラスミドDNA〔フェルグナ
ー（Felgner）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズUSA（1987）8
4:7413−7416〕、mRNA〔マロン（Malone）ら、プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシーズUSA（1989）86:6077−6081〕、および精製
転写因子〔デブズ（Debs）ら、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（1990）265:10189−10192〕
が機能形態で細胞内デリバリーを仲介することが示され
ている。
発明の概要 生分解性で新規な両親媒性イミダゾリニウム誘導体
は、その使用方法として提供される。カチオン性両親媒
性物質は核酸や他の生理学的化合物との複合体を形成す
ることができ、かかる核酸との複合体は哺乳類（哺乳動
物）細胞を形質転換することができる。本発明の両親媒
性物質は内性（内因性）酵素法に付すと、無毒性分解生
成物を生成する。
特定の態様の説明 生物学的活性分子（例えば抗生物質、または細胞形質
転換に使用する核酸）のための担体として有用な、イミ
ダゾリニウムの代謝可能な両親媒性誘導体を提供する。
本発明の両親媒性物質を用いて調製する組成物は核酸の
デリバリーに特に有用なので、核酸担体としての両親媒
性物質の使用について詳細に説明する。しかし、本発明
の両親媒性化合物（物質）は、通常の薬物デリバリー
（送達）、例えば患者の肺への抗生物質デリバリーにも
有用である。
明らかなように、本発明のカチオンは、１種またはそ
れ以上のアニオン、例えばヒドロキシド、クロリド、も
しくはブロミドイオン、またはより複雑な有機アニオン
もしくは塩基と共に存在しなければならない。かかる両
親媒性物質製造に関し以下に記載した合成法は、まずカ
チオン性両親媒性物質の水酸化物の塩を形成する。しか
しながら、両親媒性カチオンに対するアニオンの種類
は、両親媒性カチオンの生成または使用に重要ではな
く、組成物の使用において他のアニオンに（全部または
一部）交換し得る。別法として、たとえば、初期に形成
した塩（または中間体の塩）を所望のアニオンを含有す
る塩を過剰に存在させながら溶解させることによって、
意識的にアニオンを交換することもできる。従って、本
発明の両親媒性化合物に関する明細書中の説明は全般
に、アニオンの種類を特定することなくカチオンに関し
て行う。ただし、複数の例示、およびアニオン選択の一
般的説明は行う。ヒトへの投与には、好ましいアニオン
はクロリドである。ブロミドまたは他の生理学的に許容
し得るアニオン（アセテート、スクシネートおよびシト
レートを包含する）も適当である。カチオンは、それ自
体無毒性であり、および／または、ホストに無毒である
か、もしくはホストに内在する二次生成物（例えば酵素
分解生成物）を生成する。通例、元の脂質も、その分解
生成物も、ホストに無毒である。
本発明は、とくに以下の式を有する窒素含有両親媒性
カチオンに関する。
式中、ＲおよびR1は、各々独立して炭素原子11〜29を
含有する直鎖脂肪族ヒドロカルビル（hydrocarbyl）基
を意味する。好適には、これらのカチオンは、Ｒおよび
R1が各々独立して炭素原子13〜23を含有するものであ
る。ＲはおよびR1は、飽和またはエチレン系不飽和結合
を有する不飽和であって、好適には同じであるかまたは
相互に異なっている。R1基が結合する−CO−基と一緒に
なった当該R1基（即ちR1−CO−）の例示にはラウロイ
ル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、リノ
レオイル（linoleoyl）、エイコサノイル、トリコサノ
イルおよびノナコサノイル（これらは、対応する名称の
脂肪酸、たとえばラウリン酸、ミリスチン酸などから誘
導される。）が包含される。各R1基単独の系統名称を記
載すると、ラウリン酸から誘導されたヒドロカルビル基
の対応する名称は、ウンデシルで、ミリスチン酸からは
トリデシルで、パルミチン酸からはペンタデシルで、ス
テアリン酸からはヘプタデシルで、リノール酸からはシ
ス・シス−8,11−ヘプタデシルジエニルで、エイコサン
酸からはノナデシルで、トリコサン酸からはジコサニル
で、トリアコタン酸からはノナコサニルである。例示的
なＲ基は、前記したR1基と同じである。なぜなら、それ
らは、一般に同じ脂肪酸から誘導されるからである。カ
チオンの例示は、１−［９−（Ｚ）−オクタデセノイル
オキシエチル］−２−［８−（Ｚ）−ヘプタデセニル］
−３−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムである。前記
式Ｉの他の例示的なカチオンは、当該式から明白であ
り、ＲおよびR1の定義について種々に置換される。
本発明の化合物は、本明細書に新たに開示した再配置
反応によって合成することができ、これは、N,N−ビス
（２−ヒドロキエチル）エチレンジアミンから、アミノ
保護ジアシル化中間体を介し、所望の生成物に誘導され
る。その一般的方法には、水の沸点以上の温度を示す有
機溶媒中、以下の式の前駆体化合物を加熱してイミダゾ
リニウムイオンを合成することが包含される。
式中、ＲおよびR1は、各々独立して当該前駆体化合物
が上記溶媒に可溶性であるような有機基であって、かつ
上記温度の上記溶媒中での反応に対して安定性を示すも
のである。好適な具体例で用いられる必須的ではないあ
る種の工程や主要工程前の予備工程を含め、一般的な合
成法は以下のような反応経路で示される。
この反応工程図において、Ｘは任意のアミノ保護基
で、これは好適には、ヒドロキシ基の存在下に二級アミ
ノ基と反応して当該アミノ基を保護しているもので、好
適には、たとえばHClのような強酸による酸加水分解で
除去可能なものである。Ｘ′はＸ保護基の前駆体（たと
えば、保護基がアシル基である場合無水物または酸塩化
物）である。RCOZは酸ハロゲン化物または無水物〔当該
Ｒは、前記Ｒ（またはR1）と同じ〕である。HYは強酸、
たとえば硫酸またはその誘導体の一種、ハロゲン化水素
などである。好適なアミノ保護基はｔ−ブチルオキシカ
ルボニル（ジ−ｔ−ブチルピロカルボネートから誘
導）。好適なアシル化基は前記したような脂肪酸の酸塩
化物である。脱保護および再配置工程（これは、単一の
工程として連結可能）用の好適な酸は、HClである。再
配置反応の加熱は、好適には沸点範囲100〜200℃、好適
には100〜150℃の溶媒の還流によって得られる。最初の
イミダゾリニウムイオンは水酸化物塩および／または塩
化物塩（酸としてHClを用いて製造した場合）として形
成されるが、アニオン（対イオン）は前記したような交
換によって置換することができる。
この新規に開示した再配置反応およびその後の全合成
は、特定のカチオン両親媒性物質の製造に制限される必
要はない。それは、以下の式のイミジゾリウム化合物の
一般合成を示す。
式中、X1は示したような再配置反応後のアシル基残基
を示し（Ｈから複合体有機基）、他方、X2およびX3は独
立してＨまたは有機基である。X2は、当初Ｒ−CO−を示
すが、この基は標準的化学反応を用い、異なる有機基に
よって除去または変換することができる。なぜなら、当
初の生成物中の潜在的な２つのヒドロキシ基の一方が既
に保護されており、X2およびX3が異なる基である各化合
物は容易に達成することができるからである。X2および
X3の両者がＨであるイオンが好適である。なぜなら、こ
れらは、多数のイミダゾリニウム化合物の合成に使用す
ることができるからである。反応に使用される加熱条件
下の溶解性および反応性に課された条件を除き、一般的
合成において、３つの「Ｘ」基の構造にとくに制限され
るものではないが（これは、容易であることは明白であ
る。）、好適な有機基は炭素数30またはそれ以下のヒド
ロカルビル基およびその酸素化生成物であり、とくに、
前記したような脂肪酸およびその反応生成物並びに、炭
素原子15またはそれ以下の他のヒドロカルビル基および
酸素化生成物、好適には炭素原子10またはそれ以下のも
の、より好適には１以下のフェニル環を有するヒドロカ
ルビルであって当該ヒドロカルビルの残部がアルキル
基、とくに５またはそれ以下の炭素数のアルキル基であ
るものである。酸素化ヒドロカルビル基から形成される
有機基は、好適には当該有機基１つ当たりかかる官能基
を１以上有しないカルボン酸、アルコール、エステル、
エーテル、ケトンおよびアルデヒドである。前記合成
（単一の有機反応を用いるヒドロキシ基の付加的な変性
を伴う）によって製造しうるイミダゾリニウムイオンの
例示には、1,3−ジヒドロキシエチルイミダゾリニウ
ム、１−メトキシエチル−３−ヒドロキシエチルイミダ
ゾリニウム、１−ヒドロキシエチル−２−フェニル−３
−メトキシカルボキシエチルイミダゾリニウム、1,3−
ジメトキシエトキシエチルイミダゾリニウム、1,3−ヒ
ドロキシエチル−２−トリデシルイミダゾリニウム、お
よび１−ヒドロキシエチル−２−シス，シス−8,11−ヘ
プタデシルジエニル−３−オレオイルオキシエチルイミ
ダゾリニウムが包含される。
反応は、水分の除去を伴う簡単な自己縮合反応である
ので、溶媒および／または他の反応条件は全反応にとっ
て重要ではない。前駆体化合物を溶解し、また水の沸点
以上の沸点（加圧反応条件下、これには制限されず）を
有すれば、いずれの溶媒でも使用することができる。酸
触媒を用いて反応速度を加速する場合、プロトン性溶媒
がプロトン交換を容易にさせるのに好適である。沸点10
0℃以上を有するエチレングリコールなどの他のアルコ
ールも好適である。
本発明のカチオン性脂質は、通例、種々の生物学的分
子（例えば抗生物質または核酸）用の担体として使用す
る。とりわけ、本発明のカチオン性脂質は、細胞内デリ
バリーシステムに使用する脂質小胞またはリポソームの
製造用の製剤中、単独で、または他の脂質と組み合わせ
て使用し得る。本発明の脂質の用途は、両親媒性脂質
［市販のカチオン性脂質製剤、例えばリポフェクチン
（Lipofectin、商標）を包含する］を使用することが知
られているトランスフェクション、並びに従来のカチオ
ン性脂質および方法を用いる他の種々の文献記載の処置
を包含する。本発明のカチオン性脂質は、所望の処置効
果を達成するために動物体の種々の部材に種々の経路で
処理剤をデリバーする薬剤製剤において使用し得る。意
図した用途として、細胞トランスフェクションを考慮入
れる場合、イミジゾリニウムイオンの遊離のヒドロキシ
基は付加的な脂肪酸基でアシル化すべきではにことが測
定され、それ故、「トリ脂肪酸」はトランスホーミング
細胞では有効でないことが判明した。
そのような方法は当分野で一般に知られているので、
脂質含有薬剤組成物の製造に関する背景および基本技術
は、ここでは述べない。この背景に詳しくない読者は、
前記関連文献、および米国特許第5264618号を参照され
たい。この特許には、処置製剤および方法が詳細に多数
記載されており［特定のカチオン性脂質（本発明のもの
とは異なる）の使用例を包含する］、それに詳細に従っ
て、本発明のカチオン性脂質を該特許記載のものと置き
換え得る。本発明の組成物は、前記特許に記載の様式で
はあまり使用し得ないであろう。本発明の化合物に関す
る明細書中の説明と、脂質製剤および使用に関する当業
者の知識とによって、最適の結果を達成するために、操
作パラメータの変更が必要であり得る。
本発明の脂質は、遺伝子材料による動物細胞のトラン
スフェクションにおいて、特に有用および有利であるこ
とが判明した。更に、本発明の組成物は、動物細胞の酵
素反応によって分解して細胞にとって代表的な内性成分
になるため、既知のカチオン性脂質と比較して低毒性の
点で多くの利点を有する。本発明のこのような利点およ
び他の利点を詳細に後述する。その他の説明は主に、当
業者に自明ではないかもしれない本発明のカチオン性脂
質の選択、製造および使用パラメータに関するものであ
る。
特に、脂質−DNA複合体が特定の細胞または組織を標
的とすることが望ましい場合、担体として使用する脂質
混合物に種々の方法で変更を加え得る。脂質混合物と
は、本発明のカチオン性両親媒性化合物から調製する製
剤（更なる剤、例えばステロイドを含有または不含有）
を意図し、リポソーム、挟まれた脂質二重層などを包含
する。カチオン性両親媒性化合物を混合物の調製に使用
する際、ステロイド（例えばコレステロールまたはエル
ゴステロール）を組み合わせて使用し得る。ある種の態
様においては、脂質混合物はステロイドを０〜67モル
％、好ましくは約33〜50モル％含有し得る。脂質−DNA
複合体は、DNAと脂質混合物とを組み合わせることによ
って得られる組成物である。非脂質材料（例えば動物も
しくは植物細胞または標的特異部位にデリバーする生物
学的分子）は、小胞形成前または後に、結合基を介し
て、１個またはそれ以上の疎水基に結合し得る（例え
ば、炭素数約12〜20のアルキル鎖を用いる）。脂質鎖と
化合物との結合には、種々の結合基を使用し得る。特に
重要な官能基は、チオエステル、ジスルフィド、カルボ
キサミド、アルキルアミン、エーテルなどを包含し、そ
れらを単独で、または組み合わせて使用する。化合物と
脂質基との結合方法は、文献に種々の方法が記載されて
いるので、本発明に重要でない。また、化合物によって
は疎水部分を有し得、１個またはそれ以上の脂質基との
共有結合なしに脂質混合物と組み合わせ得る。
多くの場合、脂質混合物に結合する活性化合物は、標
的細胞中に存在する特定の生物学的分子に結合し得るリ
ガンドまたはレセプターである。リガンドは、他の化合
物（レセプターと称する）に特異的に結合し得る化合物
であり得、リガンドとレセプターは、相補的対を形成す
る。脂質混合物に結合する活性化合物は、小さいハプテ
ン（分子量約125〜2000）から、抗原（通例、分子量が
少なくとも約6000で、約100万未満、とりわけ約300000
未満）まで、非常に広範であり得る。特に重要なもの
は、細胞表面上に特異的相補的結合相手を有するタンパ
ク質性リガンドおよびレセプターである。活性化合物の
例は、せん毛性性腺刺激ホルモン、エンセファロン、エ
ンドルフィン、黄体形成ホルモン、モルヒネ、エピネフ
リン、インターフェロン、ACTH、およびポリヨードチロ
ニン、並びにそれらのフラグメントであって、元の（非
フラグメント）分子が結合するのと同じ細胞表面結合相
手に結合する能力を維持するものを包含する。
脂質混合物と結合する、標的に向かう分子（リガンド
またはレセプター）の数は、リポソームの大きさ、分子
の大きさ、分子と標的細胞レセプターまたはリガンドと
の結合親和性などによって、大きく変化し得る。通例、
結合した活性分子は、結合のために混合物中に存在する
分子の総数に対する結合した分子の割合として約0.05〜
２モル％、とりわけ約0.01〜１モル％の量で、脂質混合
物中に存在し得る。
特異的エフェクター分子（通例、細胞の外的環境中で
可溶の分子）を結合する表面膜タンパク質は、レセプタ
ーと称する。本発明において、レセプターは、抗体およ
び免疫グロブリンを包含する（それらの分子は、ある種
の細胞表面に見られるので）。しかし、抗体は通例、リ
ポソームを標的細胞上のレセプター分子に結合するのに
用いられるので、本発明のカチオン性脂質含有リポソー
ムに結合した抗体および免疫グロブリンは、リガンドと
も考えられる。免疫グロブリンは、モノクローナルまた
はポリクローナル、好ましくはモノクローナルであり得
る。通例、免疫グロブリンは、IgGおよびIgMであるが、
他の免疫グロブリン、例えばIgA、IgDおよびIgEも使用
し得る。免疫グロブリンそのもの、またはそのフラグメ
ント、例えばFab、Ｆ（ab′）２、FdまたはFvフラグメ
ント、また完全軽鎖もしくは重鎖を使用し得る。
細胞を標的とするリガンドとして使用する抗体として
は、表面膜抗原、例えば主要組織適合複合体（特にHLA
−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄ）から成る抗原に結合する
抗体が重要である。他の表面抗原は、thy−１、leu−５
あるいはIaを包含する。
本発明のカチオン性両親媒性化合物は、アニオン性化
合物、特にポリアニオン性巨大分子（例えば核酸）の担
体として特に有用である。両親媒性化合物をインビボ
（特にヒトにおいてインビボ）で使用する場合、または
反復使用の必要がある場合は、代謝されて無毒性二次生
成物となり、それ自体無毒性であり、または分解されず
に体外に排出される担体を選択することが重要である。
組織からのカチオン性両親媒性化合物の排出は、動物実
験において示し得る。マウスのような動物に、試験する
脂質を0.5〜10ピコモル含有する材料［要すれば活性成
分（例えばDNA）と複合したもの］を、１回またはそれ
以上投与し得る。投与から種々の時間後に、動物を殺
し、組織を採り、適当な溶媒抽出系を用いて脂質を全部
抽出し、全脂質中のカチオン性脂質またはその部分分解
生成物を、例えばHPLCによって分析する。
カチオン性両親媒性化合物は正に荷電しており、カチ
オン性脂質担体とポリアニオン性核酸との間に強い荷電
複合が生成し得、その結果、脂質担体−核酸複合体が生
成し、これを哺乳動物または哺乳動物細胞への全身的デ
リバリーに直接使用し得る。エアロゾル投与によるデリ
バリーの場合、エアロゾル投与複合体を鼻内または口内
にデリバリー後、荷電複合体は噴射力にも、肺気道内環
境にも耐え、エアロゾル投与したDNA:脂質担体複合体が
肺に蓄積し、肺細胞に移入することができる。
エアロゾル投与法における核酸用担体としてのカチオ
ン性両親媒性化合物の有効性の評価、および脂質担体−
核酸複合体の最適濃度の決定は、２段階の方法で行う。
第１段階においては、脂質担体を特定し、脂質担体−核
酸複合体が、それらの成分を組み合わせる時、または噴
射中に起こる混合物の激しい撹拌の際に凝集しない濃度
を特定する。第２段階においては、肺内の標的細胞中で
所定の遺伝子のトランスフェクションおよび転写を高レ
ベルで提供する複合体を凝集しない脂質を特定する。こ
のような方法は、1992年12月17日出願の国際特許出願PC
T/US92/11008に記載されている。該特許を引用により本
発明の一部とする。
例えば、リポーター遺伝子CAT（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼをコード化する）を発現
カセットに挿入し、脂質担体組成物の評価に使用し得
る。DNA:脂質担体複合体を、それ自体DNA:脂質担体複合
体の凝集を誘導しない溶液（例えば滅菌水）と混合す
る。発現カセット（DNA）は、試験する各脂質担体と、
複数の異なる比、例えば4:1ないし1:10［μgDNA:ナノモ
ル カチオン性脂質（または脂質混合物を使用する場合
は総脂質）］で混合する。得られる混合物の安定性試験
により、どの比がDNA:脂質担体複合体の凝集を導き、そ
れ故インビボで有用でないか、また、どの複合体がエア
ロゾル投与に適した形態で存在するかということに関す
る情報が得られる。どのDNA:脂質担体比がインビボで最
高レベルの形質転換発現を達成するかを調べるために、
凝集を起こさない比を動物モデルにおいて試験した。例
えば、エアロゾルによるトランスフェクションのために
は、脂質混合物、例えばＮ−［１−（2,3−ジオレイル
オキシ）−プロピル］−N,N,N−トリエチルアンモニウ
ムクロリド（DOTMA）：ジオレイルホスファチジルエタ
ノールアミン（DOPE）（この混合物の成分は1:1の重量
比で存在する）、およびジメチルジオクタデシルアンモ
ニウムブロミド（DDAB）：コレステロール（1:1）の場
合、最適DNA:脂質担体比は1:1である。
カチオン性両親媒性化合物を注射に用いる場合は、標
的細胞のトランスフェクションに有効か否かのみを考慮
すればよい。１−［９−（Ｚ）−オクタデセノイルオキ
シエチル］−２−［８−（Ｚ）−ヘプタデセニル］−３
−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム：コレステロール
＝1:1（重量比）については、DNA:脂質担体の比率は好
適には1:2〜1:7（DNA:マイクログラム、カチオン性脂
質：ナノモル）。
脂質混合物担体の調製に特定のカチオン性脂質を使用
することによって、特定細胞を標的とすることができ
る。例えば、Ｅ−DMPCの使用により、肺細胞を優先的に
標的とすることができる。あるいは、両親媒性化合物に
部位指向性分子で、特定種の細胞に到達するように変更
を加えることによって、特定細胞を標的とすることがで
きる。すなわち、特定の表面タンパク質を有する細胞を
標的とするために、特定レセプター用の抗体またはリガ
ンドを使用し得る。そのような部位指向性分子を脂質に
複合して脂質二重層中に組み合わせるか、または部位指
向性化合物の官能基を結合するための結合基を二重層中
の脂質に付加することによって、従来の方法で、特定リ
ガンドまたは抗体とカチオン性両親媒性化合物とを複合
することができる。そのような方法は、当業者によく知
られている。
脂質担体がリポソームである種々の脂質担体−核酸複
合体を当分野でよく知られた方法で調製する。混合条件
は、得られる脂質−DNA混合物の目視検査により、沈澱
が起こらないよう最適化し得る。脂質−DNA複合体をよ
り見易くするために、DNAまたは脂質を染色し得るが、
それ自体凝集を起こさない色素によって、複合体を染色
し得る。例えば、脂質−DNA混合物の凝集を調べるため
の助剤として、ズダンブラック（脂質を染色する）を使
用し得る。粒子サイズも、当分野で既知の方法、例えば
電子顕微鏡検査、レーザー光散乱、コールター（Coulte
r、商標）カウンティング／サインジングなどによって
調べることができる。生成するリポソームまたは凝集物
の大きさを調べるためのマーカーとして、標準的な大き
さのビーズを加えることができる。「脂質担体−核酸複
合体」とは、前記のような核酸配列が、後述のように、
通例脂質担体製剤の表面に結合したものを意味する。脂
質担体製剤は、他の物質、例えば、組込み、転写および
翻訳に要する酵素、または補因子をも含有し得る。更
に、脂質担体−核酸複合体は、該複合体を特定種の細胞
または組織にデリバーするための標的剤をも含有し得
る。通例、多重ラメラ小胞（MLV）または小さな単ラメ
ラ小胞（SUV）であり得る予め形成したリポソーム（通
例、超音波処理により形成したSUV）の懸濁液に、核酸
材料を加える。リポソーム自体は、適当な混合溶液、例
えば滅菌水または等張緩衝溶液（例えば滅菌水中の10mM
トリス/NaClまたは５％デキストロース）に乾燥脂質フ
ィルムを再懸濁し、リポソームを形成するよう超音波処
理することによって調製する。次いで、予め形成した脂
質担体を、直接にDNAと混合する。
脂質−DNA複合体の混合および調製は、脂質およびDNA
の組み合わせ方によって、大きく影響を受け得る。通
例、脂質をDNAに、DNA:脂質比1:2まで（μgDNA:ナノモ
ルカチオン性脂質）で加えることが好ましい（凝集を最
少限にするため）。DNA:脂質比が1:4またはそれ以上の
場合、DNAを脂質に加えることによって、通例より良い
結果が得られる。いずれの場合も、少量なら振とうまた
は撹拌によって、多量なら短時間混合装置の使用によっ
て、混合を短時間で行うべきである。脂質担体とDNA
は、負に荷電したDNAとカチオン性の脂質担体との結合
によって非常に安定な複合体を形成する。SUVは、小さ
い核酸フラグメントにも、DNAの大きい部分（≧250kb）
にも有用である。
噴射用の脂質担体−核酸複合体の調製においては、脂
質担体−核酸複合体の凝集物の形成を促進する化合物を
混合溶液から排除するよう注意すべきである。通例、大
きい粒子はネブライザーによってエアロゾル投与でき
ず、できたとしても大きい気道を越えて侵入するには大
きすぎる。脂質担体−核酸複合体の凝集の防止は、DNA:
脂質担体比の調節、溶液中のDNA:脂質担体複合体の総濃
度の低下（通例、5mgDNA/8ml溶液よりも低い）、並びに
キレート剤（例えばEDTA）および／または多量の塩（い
ずれも大きい凝集を促進する傾向にある）の使用の回避
によって行う。好ましい賦形剤は、水、デキストロース
／水、またはイオン強度が低いか、もしくは０の他の溶
液である。更に、体積はホスト哺乳動物の肺に蓄積する
のに必要最少限とすべきであるが、同時に、溶液が高濃
度になりすぎて凝集物が生成することのないように注意
しなければならない。溶液体積が大きいと、その大きい
体積を収容するようホストの吸入時間を長くしなければ
ならないので、そのようなことはできれば避けるべきで
ある。吸入用の脂質担体−核酸複合体を凍結乾燥するこ
とが好ましい場合がある。そのような材料は前記複合体
と同様に調製するが、脂質担体−DNA複合体の調製に使
用する緩衝溶液に、凍結保護物質、例えばマンニトール
またはトレハロースを加える。そのような緩衝液に通例
含まれるグルコースは、存在しないことが好ましい。脂
質担体複合体を、脂質およびDNAの混合後、短時間で凍
結乾燥する。混合物を滅菌水で再構成して、ホスト動物
に投与する即時投与用組成物を得ることができる。
本発明の両親媒性化合物でリポソームを形成する場
合、リポソームのサイズは、所望のサイズに応じて従来
の方法で調節し得る。動物の血流中に注射した大きいリ
ポソームは、肝細胞と比較して肺細胞に対する親和性の
方が高い場合がある。すなわち、種々の粒子サイズの脂
質−核酸複合体をホストに投与し、所望の結果をもたら
す粒子サイズを調べることによって、所期の標的組織に
応じて特定のサイズ範囲を決定することができる。
本発明によるカチオン性両親媒性化合物−核酸複合体
は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、局所、腹腔内、脈管
内投与、エアロゾル投与（噴射による）などの種々の方
法でホストに投与し得る。通例、溶液中の両親媒性化合
物を注射し得、この場合、リポソームに結合し、または
封入された化合物の濃度により、投与量を決定し得る。
投与量は、投与する化合物の効力、所望効果に要する濃
度、投与回数などによって変化し得る。場合により、特
にエアロゾル投与の場合、脂質−DNA複合体は、凍結乾
燥粉末の形態で投与し得る。
標的指向部分を用いた場合、両親媒性化合物の投与
後、両親媒性物質は、リポソームに結合した化合物に相
補的な細胞表面因子に優先的に結合する。標的指向部分
がリポソームに結合していない場合は、リポソームは親
脂性相互作用によって細胞表面に結合する。リポソーム
は通例、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込ま
れる。
本発明のカチオン性両親媒性化合物は、核酸またはタ
ンパク質と複合して、そのような巨大分子をインビボで
輸送するのに有用である。核酸は、DNA、RNA、アンチセ
ンスRNAまたは他のアンチセンス分子を包含し得る。リ
ポソームを形成するカチオン性両親媒性化合物は、薬物
デリバリーにも有用であり、この場合、薬物は、リポソ
ームに封入するかまたは外側に結合し得る。
以下の実施例は説明のためのものであって、制限のた
めのものではない。
実施例 実施例１ １−アシルオキシエチル−２−アルキル（アルケニル）
−３−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム誘導体 市販のN,N−ビス（２−ヒドキシエチル）エチレンジ
アミンを、ジ−ｔ−ブチルピロカルボネートを用いてN,
Nの２箇所を保護し、次いで好適なアシル・クロライド
を用いてO,Oの２箇所をアシル化した。Ｎ−BOC保護基を
ジオキサン中、4MHClで切断し、得られた塩酸塩を好適
な高沸点溶媒中で加熱再配置反応に付して、１−アシル
オキシエチル−２−アルキル（アルケニル）−３−ヒド
キシエチルイミダゾリニウム誘導体を得た。
実施例（ａ）:1−［９−（Ｚ）−オクタデカノイルオキ
シエチル］−２−［８−（Ｚ）−ヘプタデセニル］−３
−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム・ヒドロオキシド
N,N′−ジ−BOC−ジアミン（2.） CHCl3100ml中、N,N′−ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）エチレンジアミン（１）1.48g（0.01モル）の溶液
に、ジ−ｔ−ブチル・ピロカルボネート4.57g（0.021モ
ル）およびNaHCO3食塩水5mlを添加した。混合物を室温
で５時間撹はんし、有機相を分離し、水（25ml×２）で
洗浄し、MgSO4上で乾燥し、ローターベイパーで蒸発さ
せた。得られた白色結晶をヘキサン（25ml×２）で洗浄
し、真空下に乾燥して、生成物2.8g（80％）を得た。
N,N−ジ−BOC−エステル（3.） ０℃にて、ジクロロメタン100ml中、0.5g（0.0014モ
ル）の溶液に、トリエチルアミン0.7ml（0.005モル）を
添加し、次いでオレオイル・クロライド1.2ml（0.0037
モル）を添加して10分間撹はんした。混合物を０℃で30
分間撹はんし、次いで室温で45分間撹はんした。得られ
た溶液を10％クエン酸（50ml×２）、次いで10％重炭酸
ナトリウム水溶液（50ml×２）で洗浄し、MgSO4上で乾
燥し、ろ過し、ろ液をローターベイパーで蒸発させ、残
渣をシリカゲル上、０〜15％のEtOAc/ヘキサンを用い、
クロマトグラフィにかけて、N,N′−ジ−BOCエステル
（3.）1.2g（94％）を得た。
ジアミンエステル（4.） N.N′−ジ−BOC−エステル1.2g（0.00136モル）に、
ジオキサン中4MHCl溶液12mlを添加し、混合物を室温で
２時間撹はんした。得られた懸濁液をローターベイパー
で蒸発させ、エーテル20mlで希釈し、ろ過し、エーテル
（15ml×２）で洗浄し、真空乾燥させて、ジアミンエス
テル４（1.07g、100％）を得た。
１−［９−（Ｚ）−オクタデセノイルオキシエチル］
−２−［８−（Ｚ）−ヘプタデセニル］−３−ヒドロキ
シエチルイミダゾリニウム・ヒドロオキシド（5.） ジアミンエステル４の混合物1.16g（0.00149モル）
に、エチレングリコール3mlを添加し、得られた混合物
を110℃（油浴）で30分間撹はんした。得られた溶液をC
HCl3150ml中に溶解し、MeOHを用い、５％NaCl（50ml×
３）で洗浄した。有機相を分離し、MgSO4上で乾燥し、
ローターベイパーで蒸発させ、残渣をシリカゲル上で５
〜20％MeOH/CHCl3を用いてクロマトグラフィにかけ、黄
色油状の生成物0.95g（75％）を得た。
実施例（ｂ）１−［９−（Ｚ）−オクタデセノイルオキ
シエチル］−２−［８−（Ｚ）−ヘプタデセニル］−３
−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム化合物５含有リポ
ソームを用いるトランスフェクション コレステロールと共にモル比1:1で化合物５を含むリ
ポソームをDNA担体として、マウス中の遺伝子移入およ
び発現についてテストした。用いたプラスミドはpZ51で
あった。用いた方法およびプラスミドは、国際特許出願
公開WO93/24640に、より詳細に記載されている。リポソ
ーム濃度は、５％デキストロース中、10mMであった。リ
ポソーム：プラスミドDNA比を変化して、凝集物の存在
を調べた。1:2ないし1:7（μｇプラスミドDNA:ナノモル
カチオン性油質）の比を選択した。次いで、マウスにお
いて、凝集物を形成しない比のDNA:リポソームを試験し
た。正の対照には、pZN51（100μｇ）をDDAB:コレステ
ロールリポソーム（500ナノモル）と複合し、負の対照
（Ｎ）としては、マウスに注射を行わなかった。
ICR雌マウス（25g）を、インビボ試験に使用した。マ
ウス１匹当たり、５％デキストロース／水（200μｌ）
中のプラスミドDNA（100μｇ）の用量を、尾静脈に注射
した。
24時間後、肺、心臓、肝臓および脾臓を採った。各器
官を、0.25Mトリス−HCl（pH7.8）、5mM EDTA（0.3ml）
中でホモジナイズし、得られた抽出物を遠心した後、凍
結−解凍（３サイクル）に付し、65℃で20分間処理し
た。肺、心臓、肝臓および腎臓抽出物のタンパク質濃度
を、ニンヒドリン系タンパク質アッセイ［バイオ−ラド
（Bio−Rad、カリフォルニア州バークレイ）］によって
定量し、各組織抽出物の総タンパク質の同じ量を、20mM
アセチルCoA（10μｌ）＋14Cクロラムフェニコール［25
μCi/ml、55mCi/ミリモル、アマーシャム（Amersha
m）］（12μｌ）と共に、37℃で13時間のCATアッセイに
用いた。
CAT活性の高レベルは、肺臓、心臓、肝臓、腎臓およ
びひ臓において、リポソーム:DNA＝1:6の比率で得られ
た。CAT活性はDDAB:CHOL＝1:5の比率で生じたものより
もより高いようである。
本明細書中に挙げた文献および特許出願はすべて、そ
れぞれを特に個別に引用により本発明の一部とするのと
同様の意味で、引用により本発明の一部とする。
本発明を充分説明したので、請求の範囲を外れること
なく本発明に種々の変更を加え得ることは、当業者に明
らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07D 233/64 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： 〔式中、ＲおよびR1は、各々独立して炭素原子11〜29を
    含有する直鎖脂肪族ヒドロカルビル基を意味する。〕 で示される窒素含有両親媒性物質。
  2. 【請求項２】Ｒは独立して炭素原子13〜23を含有する請
    求項１記載の両親媒性物質。
  3. 【請求項３】Ｒはヘプタデシルであるか、またはR1はオ
    クタデカノイルである請求項１記載の両親媒性物質。
  4. 【請求項４】Ｒはトリデシルであるか、またはR1はテト
    ラデカノイルである請求項１記載の両親媒性物質。
  5. 【請求項５】Ｒはペンタデシルであるか、またはR1はヘ
    キサデカノイルである請求項１記載の両親媒性物質。
  6. 【請求項６】Ｒはヘプタデセニルであるか、またはR1は
    オクタデカノイルである請求項１記載の両親媒性物質。
  7. 【請求項７】当該両親媒性物質は１−［９−（Ｚ）−オ
    クタデセノイルオキシエチル］−２−［８−（Ｚ）−ヘ
    プタデセニル］−３−ヒドロキシエチルイミダゾリニウ
    ムである請求項１記載の両親媒性物質。
  8. 【請求項８】細胞を形質転換させる方法において、 細胞と、発現カセットと請求項１記載の窒素含有両親媒
    性物質とからなる複数の複合体とを接触させることを含
    んでなり、 上記複合体は、哺乳動物の少なくとも１つの組織におい
    て細胞内に入り、また内性酵素切断に対し感受性を示し
    て無毒性生成物になることを特徴とする方法。
  9. 【請求項９】哺乳動物細胞と、翻訳カセットまたは発現
    カセットと請求項１記載の窒素含有両親媒性物質とから
    なる複合体とを接触させてなることを特徴とする前記哺
    乳動物細胞をトランスフェクションする方法。
  10. 【請求項１０】請求項１記載の窒素含有両親媒性物質を
    製造する方法において、 水の沸点以上の温度を示す有機溶媒中、式： 〔式中、ＲおよびR1は、前記と同じ。〕 で示される前駆体化合物を加熱することを特徴とする方
    法。
  11. 【請求項１１】上記溶媒はプロトン性溶媒である請求項
    10記載の方法。
  12. 【請求項１２】上記加熱は酸の存在下に行う請求項10記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】上記酸はHClである請求項12記載の方
    法。
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