JPH09505594A - 両親媒性イミダゾリニウム誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ホスト哺乳動物に対して無毒性のイミダゾリニウム環系含有両親媒性物質を提供する。本発明の両親媒性物質は、巨大分子を細胞内に送達するための担体として有用なリポソームの製造に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 両親媒性イミダゾリニウム誘導体 関連出願の相互参照 本出願は、ＵＳＳＮ０８／１５７７２７の一部継続出願(１９９３年１１月２ ４日出願)であり、この一部継続出願は、ＵＳＳＮ０７／９９１９３５の一部継 続出願(１９９２年１２月１７出願)であり、この開示をもって本明細書の記載と する。 序論 発明の分野 本発明は、遺伝子療法に使用する核酸を含め、薬剤用のリポソームおよび他の 脂質含有担体を調製するために使用する窒素含有両親媒性物質(化合物)に関する 。 発明の背景 リポソームは、生物学的担体として使用する多くの脂質含有材料の一種であり 、多くの薬学的および他の生物学的状況で、とりわけ薬物、放射線療法剤、酵素 、ウイルス、転写因子および他の細胞ベクターを種々の培養セルラインおよび動 物に導入するために、有効に用いられている。リポソームを介した薬物デリバリ ー(送達)が、リポソームに封入した薬物を特異的組織および特定種の細胞にもた らすのに有効であることは臨床試験により示されている。例えば、米国特許第５ ２６４６１８号には、脂質担体を使用する多くの方法(リポソームおよび薬剤組 成物の調製、並びにそのような組成物の臨床的使用を包含する)が記載されてい る。しかし、リポソームを介するベクターの使用の基本的方法は開発が進んでい るが、この方法において使用する材料は、生体適合性および担体の有効性に関し て、更に改善することが望ましい。 とりわけ、ヒトおよび／または種々の商業的に有用動物における外因性(外性) 遺伝子の発現は、最終的に、多くの重要な疾病の予防および／または治療、並び に商業的に重要な性質を有する動物の開発をもたらし得る。遺伝子は高分子量の ポリアニオン性分子で、その担体伝達デリバリーには通例、インビトロまたはイ ンビボでの細胞のＤＮＡトランスフェクションが必要である。従って、特定の組 織または細胞におけるクローン化遺伝子のデリバリーおよび最終的な発現を向上 し得る脂質トランスフェクションベクターを開発することは重要である。処置法 によっては遺伝子(または他の薬学的生成物)を反復して投与することがあるので 、脂質担体は、反復した投与後もホストに対し無毒性であることも重要である。 関連文献 ＤＮＡの担体としてリポソームを使用することを記載した文献は、下記のもの を包含する： フリードマン(Friedmann)(1989)、上記; ブリンガム(Brigham)ら(1989)アメリカン・ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンシーズ (Am.J.Med.Sci.)、298:278-281; ナベル(Nabel)ら(1990)サイエンス (Science)、249:1285-1288; ハジンスキー(Hazinski)ら(1991)アム・ジェイ・レスプ・セル・モレク・ビオル (Am.J.Resp.Cell Molec.Biol.)、4:206-209; ワン(Wang)およびファン(Huang)(1 987)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)(USA)、84:785 1-7855; リガンド特異的カチオン系輸送システムへの連結〔ウー(Wu)およびウー(19 88)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)、263:14621-14624〕または裸のＤ ＮＡ発現ベクターの使用〔ネーベルら(1990)、上記〕; ウォルフ(Wolff)ら(1990)サイエンス、 247:1465-1468。トランスジェニック材料の組織への直接注射により、局部的な 発現が導かれた: ローゼンフェルド(Rosenfeld)(1992)、上記; ローゼンフェルドら(1991)、上 記; ブリンガムら(1989)、上記; ナベル(1990)、上記; ハジンスキーら(1991)、上記。ブリ ンガムらのグループのアメリカン・ジャーナル・オブ・メディカル・サイエンシ ーズ(１９８９)２９８:２７８−２８１およびクリニカル・リサーチ(Ｃlinical Ｒesearch)(１９９１)３９(アブストラクト)には、ＤＮＡリポソーム複合体の静 脈内または気管支内投与による、マウス肺への局部的なインビボトランスフェク ションが報告されている。ストリブリング(Ｓtribling)らのプロシーディングズ ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(ＵＳＡ)８９：１１２ ７７−１１２８１(１９９２)(マウス肺へのトランスジーンのエアロゾルデリバ リーのための担体としてリポソームを使用することが報告されている)、および ヨシムラ(Ｙoshimura)らのヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic Ａcid s Ｒesearch)(１９９２)２０:３２３３−３２４０も参照。 カチオン性脂質担体は、プラスミドＤＮＡ〔フェルグナー(Felgner)ら、プロシーディング゛ズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ USA(1987)84:7413-7416〕、mＲＮＡ〔マロン(Malone)ら 、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズUSA(1989)86:6077-6081〕、および精製 転写因子〔デブズ(Debs)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー (１９９０)２６５:１０１８９−１０１９２〕が機能形態で細胞内デリバリーを 仲介することが示されている。 発明の概要 生分解性で新規な両親媒性イミダゾリニウム誘導体は、その使用方法として提 供される。カチオン性両親媒性物質は核酸や他の生物学的化合物との複合体を形 成することができ、かかる核酸との複合体は哺乳類(哺乳動物)細胞を形質転換す ることができる。本発明の両親媒性物質は内性(内因性)酵素法に付すと、無毒性 分解生成物を生成する。 特定の態様の説明 生物学的活性分子（例えば抗生物質、または細胞形質転換に使用する核酸）の ための担体として有用な、イミダゾリニウムの代謝可能な両親媒性誘導体を提供 する。本発明の両親媒性物質を用いて調製する組成物は核酸のデリバリーに特に 有用なので、核酸担体としての両親媒性物質の使用について詳細に説明する。し かし、本発明の両親媒性化合物(物質)は、通常の薬物デリバリー(送達)、例えば 患者の肺への抗生物質デリバリーにも有用である。 明らかなように、本発明のカチオンは、１種またはそれ以上のアニオン、例え ばヒドロキシド、クロリド、もしくはブロミドイオン、またはより複雑な有機ア ニオンもしくは塩基と共に存在しなければならない。かかる両親媒性物質製造に 関し以下に記載した合成法は、まずカチオン性両親媒性物質の水酸化物の塩を形 成する。しかしながら、両親媒性カチオンに対するアニオンの種類は、両親媒性 カチオンの生成または使用に重要ではなく、組成物の使用において他のアニオン に(全部または一部)交換し得る。別法として、たとえば、初期に形成した塩(ま たは中間体の塩)を所望のアニオンを含有する塩を過剰に存在させながら溶解さ せることによって、意識的にアニオンを変換することもできる。従って、本発明 の両親媒性化合物に関する明細書中の説明は全般に、アニオンの種類を特定する ことなくカチオンに関して行う。ただし、複数の例示、およびアニオン選択の一 般的説明は行う。ヒトへの投与には、好ましいアニオンはクロリドである。ブロ ミドまたは他の生理学的に許容し得るアニオン(アセテート、スクシネートおよ びシトレートを包含する)も適当である。カチオンは、それ自体無毒性であり、 および／または、ホストに無毒であるか、もしくはホストに内在する二次生成物 (例えば酵素分解生成物)を生成する。通例、元の脂質も、その分解生成物も、ホ ストに無毒である。 本発明は、とくに以下の式を有する窒素含有両親媒性カチオンに関する。 式中、ＲおよびＲ₁は、各々独立して炭素原子１１〜２９を含有する直鎖脂肪 族ヒドロカルビル(hydrocarbyl)基を意味する。好適には、これらのカチオンは 、ＲおよびＲ₁が各々独立して炭素原子１３〜２３を含有するものである。Ｒは およびＲ₁は、飽和またはエチレン系不飽和結合を有する不飽和であって、好適 には同じであるかまたは相互に異なっている。Ｒ₁基が結合する-ＣＯ-基と一緒 になった当該Ｒ₁基(即ちＲ₁-ＣＯ-)の例示にはラウロイル、ミリストイル、パル ミトイル、ステアロイル、リノレオイル(linoleoyl)、エイコサノイル、トリコ サノイルおよびノナコサノイル(これらは、対応する名称の脂肪酸、たとえばラ ウリン酸、ミリスチン酸などから誘導される。)が包含される。各Ｒ₁基単独の系 統名称を記載すると、ラウリン酸から誘導されたヒドロカルビル基の対応する名 称は、ウンデシルで、ミリスチン酸からはトリデシルで、パルミチン酸からはペ ン タデシルで、ステアリン酸からはヘプタデシルで、リノール酸からはシス・シス -８,１１-ヘプタデシルジエニルで、エイコサン酸からはノナデシルで、トリコ サン酸からはジコサニルで、トリアコタン酸からはノナコサニルである。例示的 なＲ基は、前記したＲ₁基と同じである。なぜなら、それらは、一般に同じ脂肪 酸から誘導されるからである。カチオンの例示は、１−[９−(Ｚ)−オクタデセ ノイルオキシエチル]−２−[８−(Ｚ)−ヘプタデセニル]−３−ヒドロキシエチ ルイミダゾリニウムである。前記式Ｉの他の例示的なカチオンは、当該式から明 白であり、ＲおよびＲ₁の定義について種々に置換される。 本発明の化合物は、本明細書に新たに開示した再配置反応によって合成するこ とができ、これは、Ｎ,Ｎ-ビス(２-ヒドロキエチル)エチレンジアミンから、ア ミノ保護ジアシル化中間体を介し、所望の生成物に誘導される。その一般的方法 には、水の沸点以上の温度を示す有機溶媒中、以下の式の前駆体化合物を加熱し てイミダゾリニウムイオンを合成することが包含される。 式中、ＲおよびＲ₁は、各々独立して当該前駆体化合物が上記溶媒に可溶性で あるような有機基であって、かつ上記温度の上記溶媒中での反応に対して安定性 を示すものである。好適な具体例で用いられる必須的ではないある種の工程や主 要工程前の予備工程を含め、一般的な合成法は以下のような反応経路で示される 。 この反応工程図において、Ｘは任意のアミノ保護基で、これは好適には、ヒド ロキシ基の存在下に二級アミノ基と反応して当該アミノ基を保護しているもので 、好適には、たとえばＨＣlのような強酸による酸加水分解で除去可能なもので ある。Ｘ'はＸ保護基の前駆体(たとえば、保護基がアシル基である場合無水物ま たは酸塩化物)である。ＲＣＯＺは酸ハロゲン化物または無水物〔当該Ｒは、前 記Ｒ(またはＲ₁)と同じ〕である。ＨＹは強酸、たとえば硫酸またはその誘導体 の一種、ハロゲン化水素などである。好適なアミノ保護基はt-ブチルオキシカル ボニル(ジ-t-ブチルピロカルボネートから誘導)。好適なアシル化基は前記した ような脂肪酸の酸塩化物である。脱保護および再配置工程(これは、単一の工程 として連結可能)用の好適な酸は、ＨＣlである。再配置反応の加熱は、好適には 沸点範囲１００〜２００℃、好適には１００〜１５０℃の溶媒の還流によって得 られる。最初のイミダゾリニウムイオンは水酸化物塩および／または塩化物塩( 酸としてＨＣlを用いて製造した場合)として形成されるが、アニオン(対イオン) は前記したような交換によって置換することができる。 この新規に開示した再配置反応およびその後の全合成は、特定のカチオン両親 媒性物質の製造に制限される必要はない。それは、以下の式のイミジゾリウム化 合物の一般合成を示す。 式中、Ｘ₁は示したような再配置反応後のアシル基残基を示し(Ｈから複合体有 機基)、他方、Ｘ₂およびＸ₃は独立してＨまたは有機基である。Ｘ₂は、当初Ｒ- ＣＯ-を示すが、この基は標準的化学反応を用い、異なる有機基によって除去ま たは変換することができる。なぜなら、当初の生成物中の潜在的な２つのヒドロ キシ基の一方が既に保護されており、Ｘ₂およびＸ₃が異なる基である各化合物は 容易に達成することができるからである。Ｘ₂およびＸ₃の両者がＨであるイオン が好適である。なぜなら、これらは、多数のイミダゾリニウム化合物の合成に使 用することができるからである。反応に使用される加熱条件下の溶解性および反 応性に課された条件を除き、一般的合成において、３つの「Ｘ」基の構造にとくに 制限されるものではないが(これは、容易であることは明白である。)、好適な有 機基は炭素数３０またはそれ以下のヒドロカルビル基およびその酸素化生成物で あり、とくに、前記したような脂肪酸およびその反応生成物並びに、炭素原子１ ５またはそれ以下の他のヒドロカルビル基および酸素化生成物、好適には炭素原 子１０またはそれ以下のもの、より好適には１以下のフェニル環を有するヒドロ カルビルであって当該ヒドロカルビルの残部がアルキル基、とくに５またはそれ 以下の炭素数のアルキル基であるものである。酸素化ヒドロカルビル基から形成 される有機基は、好適には当該有機基１つ当たりかかる官能基を１以上有しない カルボン酸、アルコール、エステル、エーテル、ケトンおよびアルデヒドである 。前記合成(単一の有機反応を用いるヒドロキシ基の付加的な変性を伴う)によっ て製造しうるイミダゾリニウムイオンの例示には、１,３-ジヒドロキシエチルイ ミダゾリニウム、１-メトキシエチル-３-ヒドロキシエチルイミダゾリニウム、 １-ヒドロキシエチル-２-フェニル-３-メトキシカルボキシエチルイミダゾリニ ウム、１,３-ジメトキシエトキシエチルイミダゾリニウム、１,３-ヒドロキシエ チル-２-トリデシルイミダゾリニウム、および１-ヒドロキシエチル-２-シス,シ ス-８,１１-ヘプタデシルジエニル-３-オレオイルオキシエチルイミダゾリニウ ムが包含される。 反応は、水分の除去を伴う簡単な自己縮合反応であるので、溶媒および／また は他の反応条件は全反応にとって重要ではない。前駆体化合物を溶解し、また水 の沸点以上の沸点(加圧反応条件下、これには制限されず)を有すれば、いずれの 溶媒でも使用することができる。酸触媒を用いて反応速度を加速する場合、プロ トン性溶媒がプロトン交換を容易にさせるのに好適である。沸点１００℃以上を 有するエチレングリコールなどの他のアルコールも好適である。 本発明のカチオン性脂質は、通例、種々の生物学的分子(例えば抗生物質また は核酸)用の担体として使用する。とりわけ、本発明のカチオン性脂質は、細胞 内デリバリーシステムに使用する脂質小胞またはリポソームの製造用の製剤中、 単独で、または他の脂質と組み合わせて使用し得る。本発明の脂質の用途は、両 親媒性脂質［市販のカチオン性脂質製剤、例えばリポフェクチン(Ｌipofectin、 商標)を包含する］を使用することが知られているトランスフェクション、並び に従来のカチオン性脂質および方法を用いる他の種々の文献記載の処置を包含す る。本発明のカチオン性脂質は、所望の処置効果を達成するために動物体の種々 の部位に種々の経路で処置剤をデリバーする薬剤製剤において使用し得る。意図 した用途として、細胞トランスフェクションを考慮入れる場合、イミジゾリニウ ムイオンの遊離のヒドロキシ基は付加的な脂肪酸基でアシル化すべきではにこと が測定され、それ故、「トリ脂肪酸」はトランスホーミング細胞では有効でないこ とが判明した。 そのような方法は当分野で一般に知られているので、脂質含有薬剤組成物の製 造に関する背景および基本技術は、ここでは述べない。この背景に詳しくない読 者は、前記関連文献、および米国特許第５２６４６１８号を参照されたい。この 特許には、処置製剤および方法が詳細に多数記載されており［特定のカチオン性 脂質(本発明のものとは異なる)の使用例を包含する］、それに詳細に従って、本 発明のカチオン性脂質を該特許記載のものと置き換え得る。本発明の組成物は、 前記特許に記載の様式ではあまり使用し得ないであろう。本発明の化合物に関す る明細書中の説明と、脂質製剤および使用に関する当業者の知識とによって、最 適の結果を達成するために、操作パラメータの変更が必要であり得る。 本発明の脂質は、遺伝子材料による動物細胞のトランスフェクションにおいて 、特に有用および有利であることが判明した。更に、本発明の組成物は、動物細 胞の酵素反応によって分解して細胞にとって代表的な内性成分になるため、既知 のカチオン性脂質と比較して低毒性の点で多くの利点を有する。本発明のこのよ うな利点および他の利点を詳細に後述する。その他の説明は主に、当業者に自明 ではないかもしれない本発明のカチオン性脂質の選択、製造および使用パラメー タ に関するものである。 特に、脂質−ＤＮＡ複合体が特定の細胞または組織を標的とすることが望まし い場合、担体として使用する脂質混合物に種々の方法で変更を加え得る。脂質混 合物とは、本発明のカチオン性両親媒性化合物から調製する製剤(更なる剤、例 えばステロイドを含有または不含有)を意図し、リポソーム、挟まれた脂質二重 層などを包含する。カチオン性両親媒性化合物を混合物の調製に使用する際、ス テロイド(例えばコレステロールまたはエルゴステロール)を組み合わせて使用し 得る。ある種の態様においては、脂質混合物はステロイドを０〜６７モル％、好 ましくは約３３〜５０モル％含有し得る。脂質−ＤＮＡ複合体は、ＤＮＡと脂質 混合物とを組み合わせることによって得られる組成物である。非脂質材料(例え ば動物もしくは植物細胞または標的特異部位にデリバーする生物学的分子)は、 小胞形成前または後に、結合基を介して、１個またはそれ以上の疎水基に結合し 得る(例えば、炭素数約１２〜２０のアルキル鎖を用いる)。脂質鎖と化合物との 結合には、種々の結合基を使用し得る。特に重要な官能基は、チオエステル、ジ スルフィド、カルボキサミド、アルキルアミン、エーテルなどを包含し、それら を単独で、または組み合わせて使用する。化合物と脂質基との結合方法は、文献 に種々の方法が記載されているので、本発明に重要でない。また、化合物によっ ては疎水部分を有し得、１個またはそれ以上の脂質基との共有結合なしに脂質混 合物と組み合わせ得る。 多くの場合、脂質混合物に結合する活性化合物は、標的細胞中に存在する特定 の生物学的分子に結合し得るリガンドまたはレセプターである。リガンドは、他 の化合物(レセプターと称する)に特異的に結合し得る化合物であり得、リガンド とレセプターは、相補的対を形成する。脂質混合物に結合する活性化合物は、小 さいハプテン(分子量約１２５〜２０００)から、抗原(通例、分子量が少なくと も約６０００で、約１００万未満、とりわけ約３０００００未満)まで、非常に 広範であり得る。特に重要なものは、細胞表面上に特異的相補的結合相手を有す るタンパク質性リガンドおよびレセプターである。活性化合物の例は、せん毛性 性腺刺激ホルモン、エンセファロン、エンドルフィン、黄体形成ホルモン、モル ヒネ、エピネフリン、インターフェロン、ＡＣＴＨ、およびポリヨードチロニン 、並びにそれらのフラグメントであって、元の(非フラグメント)分子が結合する のと同じ細胞表面結合相手に結合する能力を維持するものを包含する。 脂質混合物と結合する、標的に向かう分子(リガンドまたはレセプター)の数は 、リポソームの大きさ、分子の大きさ、分子と標的細胞レセプターまたはリガン ドとの結合親和性などによって、大きく変化し得る。通例、結合した活性分子は 、結合のために混合物中に存在する分子の総数に対する結合した分子の割合とし て約０.０５〜２モル％、とりわけ約０.０１〜１モル％の量で、脂質混合物中に 存在し得る。 特異的エフェクター分子(通例、細胞の外的環境中で可溶の分子)を結合する表 面膜タンパク質は、レセプターと称する。本発明において、レセプターは、抗体 および免疫グロブリンを包含する(それらの分子は、ある種の細胞表面に見られ るので)。しかし、抗体は通例、リポソームを標的細胞上のレセプター分子に結 合するのに用いられるので、本発明のカチオン性脂質含有リポソームに結合した 抗体および免疫グロブリンは、リガンドとも考えられる。免疫グロブリンは、モ ノクローナルまたはポリクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る。通 例、免疫グロブリンは、ＩgＧおよびＩgＭであるが、他の免疫グロブリン、例え ばＩgＡ、ＩgＤおよびＩgＥも使用し得る。免疫グロブリンそのもの、またはそ のフラグメント、例えばＦab、Ｆ(ab')₂、ＦdまたはＦvフラグメント、また完全 軽鎖もしくは重鎖を使用し得る。 細胞を標的とするリガンドとして使用する抗体としては、表面膜抗原、例えば 主要組織適合複合体(特にＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄ)から成る抗原に結 合する抗体が重要である。他の表面抗原は、thy−１、leu−５あるいはＩaを包 含する。 本発明のカチオン性両親媒性化合物は、アニオン性化合物、特にポリアニオン 性巨大分子(例えば核酸)の担体として特に有用である。両親媒性化合物をインビ ボ(特にヒトにおいてインビボ)で使用する場合、または反復使用の必要がある場 合は、代謝されて無毒性二次生成物となり、それ自体無毒性であり、または分解 されずに体外に排出される担体を選択することが重要である。組織からのカチオ ン性両親媒性化合物の排出は、動物実験において示し得る。マウスのような動物 に、試験する脂質を０.５〜１０ピコモル含有する材料［要すれば活性成分(例え ばＤＮＡ)と複合したもの］を、１回またはそれ以上投与し得る。投与から種々 の時間後に、動物を殺し、組織を採り、適当な溶媒抽出系を用いて脂質を全部抽 出し、全脂質中のカチオン性脂質またはその部分分解生成物を、例えばＨＰＬＣ によって分析する。 カチオン性両親媒性化合物は正に荷電しており、カチオン性脂質担体とポリア ニオン性核酸との間に強い荷電複合が生成し得、その結果、脂質担体−核酸複合 体が生成し、これを哺乳動物または哺乳動物細胞への全身的デリバリーに直接使 用し得る。エアロゾル投与によるデリバリーの場合、エアロゾル投与複合体を鼻 内または口内にデリバリー後、荷電複合体は噴射力にも、肺気道内環境にも耐え 、エアロゾル投与したＤＮＡ:脂質担体複合体が肺に蓄積し、肺細胞に移入する ことができる。 エアロゾル投与法における核酸用担体としてのカチオン性両親媒性化合物の有 効性の評価、および脂質担体−核酸複合体の最適濃度の決定は、２段階の方法で 行う。第１段階においては、脂質担体を特定し、脂質担体−核酸複合体が、それ らの成分を組み合わせる時、または噴射中に起こる混合物の激しい攪拌の際に凝 集しない濃度を特定する。第２段階においては、肺内の標的細胞中で所定の遺伝 子のトランスフェクションおよび転写を高レベルで提供する複合体を凝集しない 脂質を特定する。このような方法は、１９９２年１２月１７日出願の国際特許出 願ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１００８に記載されている。該特許を引用により本発明 の一部とする。 例えば、リポーター遺伝子ＣＡＴ(クロラムフェニコールアセチルトランスフ ェラーゼをコード化する)を発現カセットに挿入し、脂質担体組成物の評価に使 用し得る。ＤＮＡ:脂質担体複合体を、それ自体ＤＮＡ:脂質担体複合体の凝集を 誘導しない溶液(例えば滅菌水)と混合する。発現カセット(ＤＮＡ)は、試験する 各脂質担体と、複数の異なる比、例えば４:１ないし１:１０[μg ＤＮＡ:ナノモ ル カチオン性脂質(または脂質混合物を使用する場合は総脂質)]で混合する。 得られる混合物の安定性試験により、どの比がＤＮＡ:脂質担体複合体の凝集を 導き、それ故インビボで有用でないか、また、どの複合体がエアロゾル投与に適 した形態で存在するかということに関する情報が得られる。どのＤＮＡ:脂質担 体比がインビボで最高レベルの形質転換発現を達成するかを調べるために、凝集 を起こさない比を動物モデルにおいて試験した。例えば、エアロゾルによるトラ ンスフェクションのためには、脂質混合物、例えばＮ−[１−(２,３−ジオレイ ルオキシ)−プロピル]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド(ＤＯＴＭ Ａ):ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)(この混合物の成分 は１：１の重量比で存在する)、およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブ ロミド(ＤＤＡＢ):コレステロール(１:１)の場合、最適ＤＮＡ:脂質担体比は１: １である。 カチオン性両親媒性化合物を注射に用いる場合は、標的細胞のトランスフェク ションに有効か否かのみを考慮すればよい。１-[９-(Ｚ)-オクタデセノイルオキ シエチル]-２-[８-(Ｚ)-ヘプタデセニル]-３-ヒドロキシエチルイミダゾリニウ ム:コレステロール＝１:１(重量比)については、ＤＮＡ:脂質担体の比率は好適 には１:２〜１:７(ＤＮＡ:マイクログラム、カチオン性脂質:ナノモル)。 脂質混合物担体の調製に特定のカチオン性脂質を使用することによって、特定 細胞を標的とすることができる。例えば、Ｅ−ＤＭＰＣの使用により、肺細胞を 優先的に標的とすることができる。あるいは、両親媒性化合物に部位指向性分子 で、特定種の細胞に到達するように変更を加えることによって、特定細胞を標的 とすることができる。すなわち、特定の表面タンパク質を有する細胞を標的とす るために、特定レセプター用の抗体またはリガンドを使用し得る。そのような部 位指向性分子を脂質に複合して脂質二重層中に組み合わせるか、または部位指向 性化合物の官能基を結合するための結合基を二重層中の脂質に付加することによ って、従来の方法で、特定リガンドまたは抗体とカチオン性両親媒性化合物とを 複合することができる。そのような方法は、当業者によく知られている。 脂質担体がリポソームである種々の脂質担体−核酸複合体を当分野でよく知ら れた方法で調製する。混合条件は、得られる脂質−ＤＮＡ混合物の目視検査によ り、沈澱が起こらないよう最適化し得る。脂質−ＤＮＡ複合体をより見易くする ために、ＤＮＡまたは脂質を染色し得るが、それ自体凝集を起こさない色素によ って、複合体を染色し得る。例えば、脂質−ＤＮＡ混合物の凝集を調べるための 助剤として、ズダンブラック(脂質を染色する)を使用し得る。粒子サイズも、当 分野で既知の方法、例えば電子顕微鏡検査、レーザー光散乱、コールター(Coult er、商標)カウンティング／サイジングなどによって調べることができる。生成 するリポソームまたは凝集物の大きさを調べるためのマーカーとして、標準的な 大きさのビーズを加えることができる。「脂質担体−核酸複合体」とは、前記のよ うな核酸配列が、後述のように、通例脂質担体製剤の表面に結合したものを意味 する。脂質担体製剤は、他の物質、例えば、組込み、転写および翻訳に要する酵 素、または補因子をも含有し得る。更に、脂質担体−核酸複合体は、該複合体を 特定種の細胞または組織にデリバーするための標的剤をも含有し得る。通例、多 重ラメラ小胞(ＭＬＶ)または小さな単ラメラ小胞(ＳＵＶ)であり得る予め形成し たリポソーム(通例、超音波処理により形成したＳＵＶ)の懸濁液に、核酸材料を 加える。リポソーム自体は、適当な混合溶液、例えば滅菌水または等張緩衝溶液 (例えば滅菌水中の１０mＭトリス／ＮaＣlまたは５％デキストロース)に乾燥脂 質フィルムを再懸濁し、リポソームを形成するよう超音波処理することによって 調製する。次いで、予め形成した脂質担体を、直接にＤＮＡと混合する。 脂質−ＤＮＡ複合体の混合および調製は、脂質およびＤＮＡの組み合わせ方に よって、大きく影響を受け得る。通例、脂質をＤＮＡに、ＤＮＡ:脂質比１:２ま で(μgＤＮＡ:ナノモルカチオン性脂質)で加えることが好ましい(凝集を最少限 にするため)。ＤＮＡ:脂質比が１:４またはそれ以上の場合、ＤＮＡを脂質に加 えることによって、通例より良い結果が得られる。いずれの場合も、少量なら振 とうまたは撹拌によって、多量なら短時間混合装置の使用によって、混合を短時 間で行うべきである。脂質担体とＤＮＡは、負に荷電したＤＮＡとカチオン性の 脂質担体との結合によって非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小さい核 酸フラグメントにも、ＤＮＡの大きい部分(≧２５０kb)にも有用である。 噴射用の脂質担体−核酸複合体の調製においては、脂質担体−核酸複合体の凝 集物の形成を促進する化合物を混合溶液から排除するよう注意すべきである。通 例、大きい粒子はネブライザーによってエアロゾル投与できず、できたとしても 大きい気道を越えて侵入するには大きすぎる。脂質担体−核酸複合体の凝集の防 止は、ＤＮＡ:脂質担体比の調節、溶液中のＤＮＡ:脂質担体複合体の総濃度の低 下(通例、５mgＤＮＡ／８ml溶液よりも低い)、並びにキレート剤(例えばＥＤＴ Ａ)および／または多量の塩(いずれも大きい凝集を促進する傾向にある)の使用 の回避によって行う。好ましい賦形剤は、水、デキストロース／水、またはイオ ン強度が低いか、もしくは０の他の溶液である。更に、体積はホスト哺乳動物の 肺に蓄積するのに必要最少限とすべきであるが、同時に、溶液が高濃度になりす ぎて凝集物が生成することのないように注意しなければならない。溶液体積が大 きいと、その大きい体積を収容するようホストの吸入時間を長くしなければなら ないので、そのようなことはできれば避けるべきである。吸入用の脂質担体−核 酸複合体を凍結乾燥することが好ましい場合がある。そのような材料は前記複合 体と同様に調製するが、脂質担体−ＤＮＡ複合体の調製に使用する緩衝溶液に、 凍結保護物質、例えばマンニトールまたはトレハロースを加える。そのような緩 衝液に通例含まれるグルコースは、存在しないことが好ましい。脂質担体複合体 を、脂質およびＤＮＡの混合後、短時間で凍結乾燥する。混合物を滅菌水で再構 成して、ホスト動物に投与する即時投与用組成物を得ることができる。 本発明の両親媒性化合物でリポソームを形成する場合、リポソームのサイズは 、所望のサイズに応じて従来の方法で調節し得る。動物の血流中に注射した大き いリポソームは、肝細胞と比較して肺細胞に対する親和性の方が高い場合がある 。すなわち、種々の粒子サイズの脂質−核酸複合体をホストに投与し、所望の結 果をもたらす粒子サイズを調べることによって、所期の標的組織に応じて特定の サイズ範囲を決定することができる。 本発明によるカチオン性両親媒性化合物−核酸複合体は、静脈内、筋肉内、皮 下、経皮、局所、腹腔内、脈管内投与、エアロゾル投与(噴射による)などの種々 の方法でホストに投与し得る。通例、溶液中の両親媒性化合物を注射し得、この 場合、リポソームに結合し、または封入された化合物の濃度により、投与量を決 定し得る。投与量は、投与する化合物の効力、所望効果に要する濃度、投与回数 などによって変化し得る。場合により、特にエアロゾル投与の場合、脂質−ＤＮ Ａ複合体は、凍結乾燥粉末の形態で投与し得る。 標的指向部分を用いた場合、両親媒性化合物の投与後、両親媒性物質は、リポ ソームに結合した化合物に相補的な細胞表面因子に優先的に結合する。標的指向 部分がリポソームに結合していない場合は、リポソームは親脂性相互作用によっ て細胞表面に結合する。リポソームは通例、エンドサイトーシスによって細胞内 に取り込まれる。 本発明のカチオン性両親媒性化合物は、核酸またはタンパク質と複合して、そ のような巨大分子をインビボで輸送するのに有用である。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮ Ａ、アンチセンスＲＮＡまたは他のアンチセンス分子を包含し得る。リポソーム を形成するカチオン性両親媒性化合物は、薬物デリバリーにも有用であり、この 場合、薬物は、リポソームに封入するかまたは外側に結合し得る。 以下の実施例は説明のためのものであって、制限のためのものではない。 実施例 実施例１ １-アシルオキシエチル-２-アルキル(アルケニル)-３-ヒドロキシエチルイミ ダゾリニウム誘導体 市販のＮ,Ｎ-ビス(２-ヒドキシエチル)エチレンジアミンを、ジ-t-ブチルピロ カルボネートを用いてＮ,Ｎの２箇所を保護し、次いで好適なアシル・クロライ ドを用いてＯ,Ｏの２箇所をアシル化した。Ｎ-ＢＯＣ保護基をジオキサン中、４ ＭＨＣlで切断し、得られた塩酸塩を好適な高沸点溶媒中で加熱再配置反応に付 して、１-アシルオキシエチル-２-アルキル(アルケニル)-３-ヒドキシエチルイ ミダゾリニウム誘導体を得た。 実施例(a):１−[９−(Ｚ)−オクタデカノイルオキシエチル]−２−[８−(Ｚ) −ヘプタデセニル]−３−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム・ヒドロオキシド Ｎ,Ｎ'-ジ-ＢＯＣ-ジアミン(２.) ＣＨＣl₃１００ml中、Ｎ,Ｎ'-ビス(２-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン( １)１.４８g(０.０１モル)の溶液に、ジ-t-ブチル・ピロカルボネート４.５７g( ０.０２１モル)およびＮaＨＣＯ₃食塩水５mlを添加した。混合物を室温で５時間 撹はんし、有機相を分離し、水(２５ml×２)で洗浄し、ＭgＳＯ₄上で乾燥し、ロ ーターベイパーで蒸発させた。得られた白色結晶をヘキサン(２５ml×２)で洗浄 し、真空下に乾燥して、生成物２.８g(８０％)を得た。 Ｎ,Ｎ'-ジ-ＢＯＣ-エステル(３.) ０℃にて、ジクロロメタン１００ml中、０.５g(０.００１４モル)の溶液に、 トリエチルアミン０.７ml(０.００５モル)を添加し、次いでオレオイル・クロラ イド１.２ml(０.００３７モル)を添加して１０分間撹はんした。混合物を０℃で ３０分間撹はんし、次いで室温で４５分間撹はんした。得られた溶液を１０％ク エン酸(５０ml×２)、次いで１０％重炭酸ナトリウム水溶液(５０ml×２)で洗浄 し、ＭgＳＯ₄上で乾燥し、ろ過し、ろ液をローターベイパーで蒸発させ、残渣を シリカゲル上、０〜１５％のＥtＯＡc／ヘキサンを用い、クロマトグラフィにか けて、Ｎ,Ｎ'-ジ-ＢＯＣエステル(３．)１.２g(９４％)を得た。 ジアミンエステル(４.) Ｎ．Ｎ'-ジ-ＢＯＣエステル１.２g(０.００１３６モル)に、ジオキサン中４Ｍ ＨＣl溶液１２mlを添加し、混合物を室温で２時間撹はんした。得られた懸濁液 をローターベイパーで蒸発させ、エーテル２０mlで希釈し、ろ過し、エーテル( １５ml×２)で洗浄し、真空乾燥させて、ジアミンエステル４(１.０７g、１００ ％)を得た。 １−[９−(Ｚ)−オクタデセノイルオキシエチル]−２−[８−(Ｚ)−ヘプタデ セニル]−３−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム・ヒドロオキシド(５.) ジアミンエステル４の混合物１.１６g(０.００１４９モル)に、エチレングリ コール３mlを添加し、得られた混合物を１１０℃(油浴)で３０分間撹はんした。 得られた溶液をＣＨＣl₃１５０ml中に溶解し、ＭeＯＨを用い、５％ＮaＣl(５０ ml×３)で洗浄した。有機相を分離し、ＭgＳＯ₄上で乾燥し、ローターベイパー で蒸発させ、残渣をシリカゲル上で５〜２０％ＭeＯＨ／ＣＨＣl₃を用いてクロ マトグラフィにかけ、黄色油状の生成物０.９５g(７５％)を得た。 実施例(b)１−[９−(Ｚ)−オクタデセノイルオキシエチル]−２−[８−(Ｚ)− ヘプタデセニル]−３−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム化合物５含有リポソ ームを用いるトランスフェクション コレステロールと共にモル比１:１で化合物５を含むリポソームをＤＮＡ担体 として、マウス中の遺伝子移入および発現についてテストした。用いたプラスミ ドはpＺ５１であった。用いた方法およびプラスミドは、国際特許出願公開ＷＯ ９３／２４６４０に、より詳細に記載されている。リポソーム濃度は、５％デキ ストロース中、１０mＭであった。リポソーム:プラスミドＤＮＡ比を変化して、 凝集物の存在を調べた。１:２ないし１:７(μgプラスミドＤＮＡ:ナノモルカチ オン性脂質)の比を選択した。次いで、マウスにおいて、凝集物を形成しない比 のＤＮＡ:リポソームを試験した。正の対照には、pＺＮ５１(１００μg)をＤＤ ＡＢ:コレステロールリポソーム(５００ナノモル)と複合し、負の対照(Ｎ)とし ては、マウスに注射を行わなかった。 ＩＣＲ雌マウス(２５g)を、インビボ試験に使用した。マウス１匹当たり、５ ％デキストロース／水(２００μl)中のプラスミドＤＮＡ(１００μg)の用量を、 尾静脈に注射した。 ２４時間後、肺、心臓、肝臓および脾臓を採った。各器官を、０．２５Ｍトリ ス−ＨＣl(pＨ７．８)、５mＭ ＥＤＴＡ(０．３ml)中でホモジナイズし、得られ た抽出物を遠心した後、凍結−解凍(３サイクル)に付し、６５℃で２０分間処理 した。肺、心臓、肝臓および腎臓抽出物のタンパク質濃度を、ニンヒドリン系タ ンパク質アッセイ[バイオ−ラド(Ｂio−Ｒad、カリフォルニア州バークレイ)]に よって定量し、各組織抽出物の総タンパク質の同じ量を、２０mＭアセチルＣoＡ (１０μl)＋¹⁴Ｃクロラムフェニコール[２５μＣi／ml、５５mＣi／ミリモル、 アマーシャム(Ａmersham)](１２μl)と共に、３７℃で１３時間のＣＡＴアッセ イに用いた。 ＣＡＴ活性の高レベルは、肺臓、心臓、肝臓、腎臓およびひ臓において、リポ ソーム:ＤＮＡ＝１:６の比率で得られた。ＣＡＴ活性はＤＤＡＢ:ＣＨＯＬ＝１: ５の比率で生じたものよりもより高いようである。 本明細書中に挙げた文献および特許出願はすべて、それぞれを特に個別に引用 により本発明の一部とするのと同様の意味で、引用により本発明の一部とする。 本発明を充分説明したので、請求の範囲を外れることなく本発明に種々の変更 を加え得ることは、当業者に明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式： 〔式中、ＲおよびＲ₁は、各々独立して炭素原子１１〜２９を含有する直鎖脂肪 族ヒドロカルビル基を意味する。〕 で示される窒素含有両親媒性物質。 ２．Ｒは独立して炭素原子１１〜２３を含有する請求項１記載の両親媒性物質 。 ３．Ｒはヘプタデシルであるか、またはＲ₁はオクタデカノイルである請求項 １記載の両親媒性物質。 ４．Ｒはトリデシルであるか、またはＲ₁はテトラデカノイルである請求項１ 記載の両親媒性物質。 ５．Ｒはペンタデシルであるか、またはＲ₁はヘキサデカノイルである請求項 １記載の両親媒性物質。 ６．Ｒはヘプタデセニルであるか、またはＲ₁はオクタデカノイルである請求 項１記載の両親媒性物質。 ７．当該両親媒性物質は１−[９−(Ｚ)−オクタデカノイルオキシエチル]−２ −[８−(Ｚ)−ヘプタデセニル]−３−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムである 請求項１記載の両親媒性物質。 ８．細胞を形質転換させる方法において、 細胞と、発現カセットと請求項１記載の窒素含有両親媒性物質とからなる複数 の複合体とを接触させることを含んでなり、 上記複合体は、哺乳動物の少なくとも１つの組織において細胞内に入り、また 内性酵素切断に対し感受性を示して無毒性生成物になることを特徴とする方法。 ９．哺乳動物細胞と、翻訳カセットまたは発現カセットと請求項１記載の窒素 含有両親媒性物質とからなる複合体とを接触させてなることを特徴とする前記哺 乳動物細胞をトランスフェクションする方法。 10．イミダゾリニウムイオンを合成する方法において、 水の沸点以上の温度を示す有機溶媒中、式： 〔式中、ＲおよびＲ₁は、各々独立して当該前駆体化合物が上記溶媒に可溶性で あるような有機基であって、かつ上記温度の上記溶媒中での反応に対して安定性 を示すものである。〕 で示される前駆体化合物を加熱することを特徴とする方法。 11．上記溶媒はプロトン性溶媒である請求項１０記載の方法。 12．上記加熱は酸の存在下に行う請求項１０記載の方法。 13．上記酸はＨＣlである請求項１２記載の方法。