ES2312608T3 - Procedimiento simplificado y mejorado para preparar un polipejo o inmunoliposoma dirigido contra un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo para la administracion sistemica de un agente de diagnostico o terapeutico. - Google Patents
Procedimiento simplificado y mejorado para preparar un polipejo o inmunoliposoma dirigido contra un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo para la administracion sistemica de un agente de diagnostico o terapeutico. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de preparación de un complejo polimérico o inmunoliposoma catiónico dirigido contra un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende las etapas que consisten en: a) mezclar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con un liposoma catiónico para formar un inmunoliposoma catiónico o con un polímero catiónico para formar un poliplejo, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se compleja con, pero no está químicamente conjugado a dicho liposoma catiónico o dicho polímero catiónico; y b) mezclar dicho inmunoliposoma catiónico o dicho poliplejo con un agente de diagnóstico o terapéutico para formar dicho complejo polimérico o inmunoliposoma catiónico dirigido contra un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
Description
Procedimiento simplificado y mejorado para
preparar un poliplejo o inmunoliposoma dirigido contra un anticuerpo
o un fragmento de anticuerpo para la administración sistémica de un
agente de diagnóstico o terapéutico.
La presente solicitud reivindica la prioridad de
la solicitud provisional con número de serie 60/280.134, presentada
el 2 de abril de 2001 y es una solicitud de continuación en parte
del documento US con número de serie 09/914.046, presentada el 22
de febrero de 2000.
La presente invención proporciona un
procedimiento para preparar inmunoliposomas dirigidos contra un
anticuerpo o fragmento de anticuerpo y polímeros dirigidos contra
un anticuerpo o fragmento de anticuerpo útiles para la
administración sistémica de moléculas para tratar enfermedades. Los
complejos de liposoma y polímero son útiles para llevar a cabo la
inserción génica dirigida y la expresión génica eficaz tras la
administración sistémica. La especificidad del sistema de inserción
se obtiene de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo
dirigidos.
El tratamiento contra el cáncer ideal sería el
dirigido selectivamente contra una ruta celular responsable del
fenotipo tumoral y que no resultara tóxico para las células
normales. Hasta ahora, el tratamiento ideal sigue siendo solamente
esto, un ideal. Aunque los tratamientos contra el cáncer que
implican terapia génica son muy prometedores, muchas cuestiones
requieren tratarse antes de que esta promesa pueda realizarse.
Quizás lo mas importante entre las cuestiones asociadas con los
tratamientos macromoleculares es la administración eficaz de las
moléculas terapéuticas al/a los sitio(s) en el cuerpo donde
son necesarias. El portador de administración ideal sería uno que
pudiese administrarse de modo sistémico y entonces localizarse en
las células tumorales en cualquier parte del cuerpo en la que se
produzcan. Se ha probado una variedad de sistemas de administración
("vectores"), incluyendo virus y liposomas. La infectividad que
hace a los virus atractivos como vectores de administración también
representa su mayor inconveniente. Los elementos virales residuales
pueden ser inmunogénicos, citopáticos o recombinogénicos. La
generación de virus nuevos con nuevas dianas para infección también
plantea la posibilidad teórica de que, una vez introducidos en los
pacientes, estos virus podrían transformarse a través de alteración
genética en nuevos patógenos humanos. Por consiguiente, se ha
dirigido la atención en gran medida a vectores no virales para la
administración de agentes terapéuticos moleculares. El enfoque con
liposomas ofrece varias ventajas con respecto a las metodologías
virales para la inserción génica. De la manera más significativa,
carecen de inmunogenicidad. Además, puesto que los liposomas no son
agentes infecciosos que pueden autorreplicarse, no presentan el
riesgo de evolucionar en nuevas clases de patógenos humanos
infecciosos.
Puede lograrse la selección como diana de
células cancerosas a través de liposomas modificando los liposomas
de modo que administren selectivamente su carga útil en células
tumorales. Pueden utilizarse moléculas de superficie para dirigir
los liposomas hasta las células tumorales, porque las moléculas del
exterior de las células tumorales difieren de las de las células
normales. Por ejemplo, si un liposoma presenta la proteína
transferrina (Tf) o un anticuerpo que reconoce el receptor de
transferrina (TfR) sobre su superficie, se localizarán en células
cancerosas que presentan niveles superiores del TfR. Tales liposomas
diseñados para localizarse en tumores se han comparado a bombas
"inteligentes" que pueden buscar su diana.
El fracaso en la respuesta al tratamiento
representa una necesidad médica no satisfecha en el tratamiento de
muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata. A menudo
cuando el cáncer reaparece, los tumores han adquirido una
resistencia aumentada a los agentes quimioterápicos o a la
radiación. La incorporación en las terapias contra el cáncer
actuales de un nuevo componente que da como resultado la
radio/quimiosensibilización presentarían una inmensa relevancia
clínica. Un modo en el que tal sensibilización podría lograrse es
mediante terapia génica (es decir, la inserción de un gen cuya
expresión da como resultado una sensibilización aumentada). En la
solicitud de patente PCT WO 00/50008 (publicada el 31 de agosto de
2.000), incorporada a la presente memoria como referencia, se
proporciona la demostración de la eficacia de un anticuerpo de
cadena sencilla antirreceptor de transferrina (TfRscFv) que puede
conjugarse químicamente a un liposoma catiónico. Además, este
sistema de administración de liposoma dirigido contra TfRscFv puede
administrar genes y otras moléculas de modo sistémico y
específicamente a tumores.
Tal como se observó anteriormente, algunos de
los problemas asociados con la utilización de vectores virales
podrían evitarse mediante vectores de transferencia génica no
virales. Se han hecho progresos hacia el desarrollo de
formulaciones génicas farmacéuticas no virales para el tratamiento
de seres humanos in vivo, particularmente sistemas de
transferencia génica mediada por liposomas catiónicos (31, 32). Los
liposomas catiónicos están compuestos de bicapas lipídicas cargadas
positivamente y pueden complejarse a ADN desnudo cargado
negativamente mediante mezclado simple de lípidos y ADN de modo que
el complejo resultante presenta una carga neta positiva. El
complejo puede unirse y captarse por células en cultivo con eficacia
de transfección moderadamente buena (33). Las características de
los liposomas catiónicos que los hacen versátiles y atractivos para
la inserción de ADN incluyen: la simplicidad de preparación; la
capacidad de complejar grandes cantidades de ADN; la versatilidad
en utilizar con cualquier tipo y tamaño de ADN o ARN; la capacidad
de transfectar muchos tipos de células diferentes, incluyendo
células que no se dividen; y la ausencia de inmunogenicidad o
actividad peligrosa biológicamente (revisado en 34, 35). Y lo que
es más importante desde la perspectiva del tratamiento del cáncer
humano, los liposomas catiónicos han demostrado ser seguros y
eficaces para la inserción génica in vivo (33, 34, 36). Al
menos se han aprobado 75 ensayos clínicos utilizando liposomas
catiónicos para inserción génica (37), y ya están en el mercado
liposomas para la administración de agentes terapéuticos de
moléculas pequeñas (por ejemplo, agentes antifúngicos).
Los investigadores también han considerado la
idoneidad de los polímeros catiónicos como vectores de transferencia
para administrar agentes terapéuticos in vivo. Por ejemplo,
la polietilenimina (PEI) es la macromolécula orgánica con el mayor
potencial de densidad de carga catiónica, y es un vector versátil
para transferencia génica y de oligonucleótidos in vitro e
in vivo, tal como informó en primer lugar Boussif et
al. (66). Desde entonces, se han realizado muchas
investigaciones dirigidas a este policatión y su papel en terapia
génica (73). Pueden introducirse ligandos que se unen a células en
el policatión para 1) tipos celulares específicos de diana y 2)
potenciar la captación intracelular tras la unión a la célula diana
(13). Erbacher et al. (67) conjugó el péptido de unión a
integrina de 9 meros RGD mediante un puente disulfuro y mostró
propiedades físicas de interés para la administración sistémica de
genes.
La eficacia de la transfección tanto de
liposomas catiónicos como de polímeros catiónicos, tales como PEI,
puede aumentarse espectacularmente cuando son portadores de un
ligando reconocido por un receptor de la superficie celular. La
endocitosis mediada por receptor representa una ruta de
internalización sumamente eficaz presente en células eucariotas
(38, 39). La presencia de un ligando en un liposoma facilita la
entrada de ADN en las células a través de la unión inicial del
ligando mediante su receptor en la superficie celular seguido por
la internalización del complejo unido. Los niveles de receptor de
transferrina (TfR) son elevados en diversos tipos de células
cancerosas, incluyendo los cánceres de próstata (40), incluso en
aquellas líneas celulares de próstata derivadas de metástasis ósea
y de nódulo linfático humanas (40-43). Niveles
elevados de TfR también se correlacionan con la capacidad
proliferativa o agresiva de las células tumorales (44). Por tanto,
TfR es una diana potencial para la administración de fármacos en el
tratamiento del crecimiento de células malignas (45, 46). Se han
preparado liposomas catiónicos complejados con transferrina con
eficacias de transfección de células tumorales en SCCHN del
60%-70%, en comparación con solamente el 5-20%
mediante liposomas catiónicos sin ligando (47). También véase la
solicitud de patente PCT publicada WO
00/50008.
Además de la utilización de ligandos que
reconocen los receptores en las células tumorales, también pueden
unirse anticuerpos específicos a la superficie del liposoma (48)
permitiéndoles dirigirse contra antígenos específicos de la
superficie del tumor (incluyendo pero sin limitarse a receptores)
(49). Estos "inmunoliposomas", especialmente los
inmunoliposomas estabilizados estéricamente, pueden administrar
fármacos terapéuticos a una población de células diana específica
(50). Parks et al. (51) descubrieron que fragmentos Fab de
anticuerpo monoclonal (AcM)
anti-HER-2 conjugados a liposomas
podrían unirse específicamente a una línea celular de cáncer de
mama, SK-BR-3, que sobreexpresa
HER-2. Se descubrió que los inmunoliposomas se
internalizan eficazmente mediante endocitosis mediada por receptor
mediante la ruta de vesículas recubiertas y también posiblemente
mediante fusión de membranas. Además, el anclaje de los fragmentos
Fab anti-HER-2 potenciaron los
efectos inhibidores. Más recientemente, Park et al. (23)
utilizaron un inmunoliposoma
anti-HER-2 compuesto de liposomas
de larga circulación conjugados químicamente a fragmentos scFv de
anticuerpo monoclonal anti-HER-2
para administrar doxorubicina en tumores de cáncer de mama incluso
cuando HER-2 no estaba sobreexpresado. Se han
publicado algunos otros estudios en los que se han utilizado
anticuerpos contra antígenos específicos de tumores acoplados a
liposomas, principalmente liposomas estabilizados estéricamente,
para células tumorales diana para la administración de profármacos
y fármacos in vitro o in vivo (52-56).
Estos estudios demostraron la utilidad de inmunoliposomas para la
administración de fármacos dirigidos contra el tumor. La
combinación de técnicas de inmunoliposomas y transferencia génica en
liposomas catiónicos parece ser un sistema prometedor para terapia
génica dirigida y es el objeto de esta propuesta.
Los progresos en biotecnología han permitido la
derivación de dominios de reconocimiento específico de AcM (57). La
recombinación de las regiones variables de las cadenas pesadas y
ligeras y su integración en un polipéptido de cadena sencilla
proporciona la posibilidad de utilizar derivados de anticuerpo de
cadena sencilla (denominados scFv) para la selección como diana.
Por tanto, un scFv basado en el AcM anti-TfR 5E9
(52) contiene el sitio de unión de anticuerpo completo para el
epítopo del TfR reconocido por este AcM como una cadena de
polipéptido sencilla de peso molecular aproximado 26.000. Se forma
este TfRscFv conectando los dominios variables VH y VL componentes
de las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente, con un péptido
ligador diseñado apropiadamente. El ligador une el extremo
C-terminal de la primera región variable y el
extremo N-terminal de la segunda, ordenada como o
bien VH-ligador-VL o bien
VL-ligador-VH. El sitio de unión de
un scFv puede replicar tanto la afinidad como la especificidad de
su sitio de combinación del anticuerpo de origen.
El TfRscFv presenta ventajas en la utilización
en seres humanos con respecto a la molécula Tf por sí misma o
incluso con respecto a un AcM entero para dirigir liposomas o
polímeros catiónicos contra células de cáncer de próstata con
niveles elevados del TfR por varias razones. En primer lugar, el
tamaño del scFv (\sim28 kDa) es mucho menor que el de la molécula
Tf (\sim80 kDa) o el del AcM de origen (\sim150 kDa). El
complejo de scFv-liposoma-agente
terapéutico o el complejo de
scFv-polímero-agente terapéutico por
tanto puede mostrar una mejor penetración en los pequeños capilares
característicos de los tumores sólidos. En segundo lugar, el scFv
menor también presenta ventajas prácticas relacionadas con su
producción como una proteína recombinante. La producción a gran
escala del TfRscFv será necesaria para el tratamiento que se prevé
en esta propuesta que va a utilizarse en ensayos en seres humanos
eventuales. En tercer lugar, el scFv es una molécula recombinante
(no un producto de la sangre como Tf) y, por tanto, no presenta
cuestiones relacionadas con la potencial contaminación con
patógenos transportados por la sangre. Otras ventajas adicionales de
utilizar el TfRscFv se refieren al hecho de que Tf interactúa con
el TfR con alta afinidad solamente una vez que el ligando está
cargado con hierro. La producción a gran escala de liposomas que
contienen Tf cargado con hierro puede presentar desafíos prácticos.
Por tanto la utilización de TfRscFv permite que un complejo
terapéutico de liposoma que no contiene hierro (implicado por sí
mismo en el cáncer (58)) seleccione como diana el TfR de las células
tumorales. En cuarto lugar, sin la región Fc del AcM, se elimina el
problema de unión no específica de antígeno a través de receptores
Fc (57).
El gen supresor de tumores p53 desempeña un
papel crucial en diversas rutas celulares incluyendo las activadas
en respuesta a daño de ADN, tales como reparación del ADN,
regulación del ciclo celular y muerte celular programada
(apoptosis) (1). El mal funcionamiento de estas rutas celulares
críticas está asociado con el proceso de tumorigénesis. La pérdida
de p53 funcional, que está implicada en más del 60% de los cánceres
humanos, pueden producirse o bien a través de mutaciones en el gen
p53 en sí mismo (lo que se produce con más frecuencia) o a través
de otros mecanismos tales como amplificación del gen
MDM-2 (encontrado en ciertos sarcomas, y otros
cánceres) o asociación de p53 con la proteína E6 de virus del
papiloma humano (que probablemente desempeña un papel en el
carcinoma de cuello uterino) (2).
La pérdida de la función de p53 es de relevancia
para una amplia serie de tipos de cáncer, estando asociado p53 no
funcional con, por ejemplo, el 15-50% del cáncer de
mama, el 25-70% del cáncer de próstata metastásico,
el 25-75% del cáncer de pulmón y el
33-100% de los cánceres cabeza y cuello (3). La
presencia de p53 mutante también se ha asociado con un pronóstico
desfavorable para muchos cánceres humanos incluyendo pulmón, colon
y mama (3), y casi nunca se encuentra p53 mutante en algunas de las
formas de cáncer más curables por ejemplo, tumor de Wilm,
retinoblastoma, cáncer testicular, neuroblastoma y leucemia
linfoblástica aguda (4). Además, la proteína p53 regula de modo
transcripcional los genes implicados en la angiogénesis, un proceso
necesario para el crecimiento del tumor sólido (5). Volpert et
al. han propuesto que el desarrollo del fenotipo angiogénico
para estos tumores requiere la pérdida de ambos alelos p53 (6).
Puesto que parece que la mayoría de los agentes
anticancerosos trabajan induciendo la apoptosis (20), la inhibición
de o los cambios en esta ruta puede conducir al fracaso de los
regímenes terapéuticos. Se ha sugerido una relación directa entre
las mutaciones en p53 y la resistencia a tratamientos de cáncer
citotóxicos (tanto quimio como radioterapia (21)). También se ha
sugerido que la pérdida de función de p53 puede contribuir a la
resistencia cruzada a agentes anticancerosos observada en algunas
células tumorales (22).
La restauración de la función de p53 podría, por
tanto dar como resultado la sensibilización de tumores de próstata
primarios e incluso la metástasis a radio/quimioterapia. Se ha
notificado la introducción de wtp53 para suprimir, tanto in
vitro como en modelos de xenoinjerto en ratón, el crecimiento de
diversos tipos de tumores malignos, por ejemplo, células tumorales
de próstata (23, 24), cabeza y cuello (25, 26), colon (27), cuello
uterino (28) y pulmón (15, 29). Sin embargo, p53 solo, aunque puede
inhibir parcialmente el crecimiento tumoral, no ha mostrado poder
eliminar tumores establecidos. De modo significativo, sin embargo,
se ha demostrado que la combinación de liposoma-p53
administrado sistémicamente y radiación llevan a regresión tumoral
completa de larga duración de tumores en xenoinjerto de cabeza y
cuello establecidos (25, 30).
En resumen, la implicación del gen p53 en una
fracción significativa de cánceres humanos le convierte en uno de
los principales candidatos para terapia génica contra el cáncer.
Basándose en las crecientes evidencias relacionadas con las
funciones de p53, podría esperarse que la restauración eficaz de
estas funciones en las células tumorales restableciera el control
crecimiento celular normal, restaurara las respuestas apropiadas a
agentes que dañan el ADN (por ejemplo, quimioterapia y radioterapia)
e impidiera la angiogénesis.
La sensibilización de tumores a quimioterapia y
radiación podría disminuir la dosis eficaz de ambos tipos de
modalidades anticáncer, reduciendo en consecuencia los efectos
secundarios graves asociados a menudo con estos tratamientos. Hasta
ahora la inmensa mayoría de los protocolos de terapia génica de p53
han utilizado la sustitución génica de wtp53 solo. Basándose en la
bibliografía actual y en los datos (30, 59), parece que la
sustitución génica de wtp53 solo, aunque puede inhibir el
crecimiento tumoral en cierto grado, es insuficiente para eliminar
tumores a largo plazo. Por tanto, parece que un enfoque de
combinación que implique tanto el tratamiento convencional como la
terapia génica dirigida constituye una promesa sustancial como
modalidad clínica nueva y más eficaz para el tratamiento contra el
cáncer. Además, la selectividad de las células tumorales demostrada
del complejo ligando-liposoma wtp53 administrado
sistémicamente indica el potencial de este procedimiento para
sensibilizar incluso las micrometástasis distantes que son la causa
primordial de tantas muertes por cáncer de próstata.
La patente US nº 5.786.214 da a conocer
inmunoliposomas sensibles a pH con un anticuerpo conjugado sensible
a células de mamífero CONS.
El documento WO 95/14380 da a conocer agentes
anfifílicos que contiene un sistema de anillo de imidazolinio que
no son tóxicos para el mamífero huésped. Los agentes anfifílicos se
utilizan para producir liposomas útiles como excipientes para
administrar macromoléculas intracelularmente.
El documento WO 99/59643 da a conocer un
complejo de administración en liposomas para la administración
específica de sitio de un agente farmacológico a una superficie
celular.
El documento WO 95/35301 da a conocer agentes
anfifílicos catiónicos que son alquil o alcoxialquil
O-fosfato ésteres de compuestos zwiteriónicos de
diacilfosfatidilo tales como fosfatidilcolina o
fosfatidiletanolamina. Los agentes anfifílicos pueden utilizarse
como excipientes para administrar macromoléculas
intracelularmente.
El documento WO 98/20857 da a conocer complejos
lípido:ácido nucleico que presentan término de caducidad aumentado
y actividad de transfección alta in vivo tras la inyección
intravenosa y procedimientos para preparar tales complejos.
El documento EP 0451972 da a conocer uno o más
portadores, que pueden ser aceptables para introducirlos en la boca
que contienen al menos una de dos enzimas que cooperan más medios de
unirlas entre sí.
Según la presente invención se ha construido una
variedad de complejos de inmunoliposomas y de polímero que pueden
administrar sistémicamente, de manera dirigida contra el tumor, una
variedad de tipos de moléculas terapéuticas para su utilización en
el tratamiento de enfermedades de seres humanos. Los complejos de
inmunoliposomas o de polímero dirigidos contra un anticuerpo o
fragmento de anticuerpo se preparan mediante un procedimiento de
conjugación no químico simple y eficaz. Estos complejos son
igualmente tan eficaces como, o más eficaces que, complejos
similares preparados mediante conjugación química del anticuerpo o
fragmento de anticuerpo al complejo de liposoma o de polímero. Si
se utiliza un fragmento de anticuerpo, el complejo resultante puede
producir un nivel de eficacia de transfección mucho mayor que el
mismo complejo de liposoma-agente terapéutico o
polímero-agente terapéutico que lleva la molécula de
anticuerpo completa.
Según la presente invención, la proteína de
cadena sencilla no está químicamente conjugada al liposoma o
polímero. En vez de eso, el complejo de anticuerpo-(o
scFv)-liposoma-agente de diagnóstico
o terapéutico o el complejo de anticuerpo-(o
scFv)-polímero-agente de diagnóstico
o terapéutico se forma mediante mezclado simple de los componentes
en un orden y razón definidos. En una forma de realización, se
mezcla en primer lugar el anticuerpo o proteína de cadena sencilla
con el polímero o liposoma catiónico en una razón de proteína:lípido
en el intervalo de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:40
(p:p) o en una razón de proteína:polímero en el intervalo de
aproximadamente 0,1:1 a 10:1 (razón molar). Entonces se mezcla el
anticuerpo-(o fragmento de anticuerpo)-liposoma o
el anticuerpo-(o fragmento de anticuerpo)-polímero
con un agente de diagnóstico o terapéutico deseado, tal como ácido
nucleico (preferentemente ADN), en una razón en el intervalo de
aproximadamente 1:10 a 1:20 (\mug de agente de diagnóstico o
terapéutico:nmol de lípido total) o aproximadamente de 1:1 a 1:40
(ug de agente de diagnóstico o terapéutico:nmol de polímero) y se
incuba durante 10-15 minutos a temperatura
ambiente.
El complejo agente de diagnóstico o
terapéutico-anticuerpo-liposoma o
agente
terapéutico-anticuerpo-polímero
resultante puede administrarse a un mamífero, preferentemente un ser
humano, para administrar el agente a células diana en el cuerpo del
mamífero. De manera deseable, se dirigen los complejos contra un
sitio de interés que puede ser una célula que es una célula
cancerosa o una célula no cancerosa. El agente de direccionamiento
es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que en una forma de
realización preferida se une a un receptor de transferrina, y la
célula diana es una célula que expresa o contiene el sitio diana de
interés. Si el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a un
receptor de transferrina, la célula diana es una célula que expresa
un receptor de transferrina. El agente terapéutico puede ser un
ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADN y más
preferentemente una molécula de ADN que codifica para una molécula
de p53 de tipo natural, molécula de Rb o molécula de apoptina o un
HER-2 antisentido. Los complejos, preferentemente en
una composición terapéutica, pueden administrarse sistémicamente,
preferentemente por vía intravenosa.
La figura 1 muestra los resultados de un ensayo
ELISA que muestra la unión del complejo
TfRscFv-liposoma-ADN, preparado
mediante mezclado simple, a células DU145 a diversas razones de
proteína/lípido y ADN/lípido.
La figura 2 muestra los resultados de un ensayo
de transfección in vitro utilizando diferentes razones de
mezclado de TfRscFv:lípido en células DU145 (ensayo de
luciferasa).
La figura 3 muestra los resultados de un ensayo
de transfección in vitro utilizando diferentes razones de
mezclado de TfRscFv:lípido en células C6 de rata (ensayo de
luciferasa).
La figura 4 muestra un gel de poliacrilamida no
desnaturalizante que demuestra que >95% de TfRscFv está unido al
liposoma o al liposoma-p53 tras un mezclado
simple.
La figura 5A muestra los resultados de un ensayo
de citotoxicidad con XTT que muestra la quimiosensibilidad frente a
Gemzar inducida en células DU145 tratadas con
TfRscFv-liposoma-p53 preparadas
mediante mezclado simple.
La figura 5B muestra los resultados de un ensayo
de citotoxicidad con XTT que muestra la quimiosensibilidad frente a
mitoxantrona inducida en células DU145 tratadas con
TfRscFv-liposoma-p53 preparado
mediante mezclado simple.
Las figuras 6A y 6B muestran los resultados de
un ensayo de citotoxicidad con XTT que muestra la quimiosensibilidad
frente a Gemzar inducida en líneas celulares de cáncer pancreático
(Colo 357 y Panc I) tratadas con
TfRscFv-liposoma-p53 preparado
mediante mezclado simple.
La figura 7A muestra la capacidad de seleccionar
como diana el tumor in vitro del complejo
TfRscFv-liposoma-EGFP administrado
sistémicamente preparado mediante mezclado simple a diversas razones
de ADN:lípido
La figura 7B muestra la capacidad de seleccionar
como diana el tumor in vivo del complejo
TfRscFv-liposoma-EGFP administrado
sistémicamente preparado mediante mezclado simple en cuatro tumores
diferentes y utilizando múltiples lotes de la proteína TfRscFv.
La figura 8 muestra el efecto de la combinación
de TfRscFv-liposoma A-p53
administrado sistémicamente preparado mediante mezclado simple y
radiación sobre tumores en xenoinjerto de próstata humano DU145.
La figura 9 muestra los resultados de un ensayo
de citotoxicidad con XTT que muestra la quimiosensibilidad frente a
Gemzar® inducida en células Panc I tratadas con
TfRscFv-liposoma-ODN AS
HER-2.
La figura 10A muestra el efecto de la
combinación de TfRscFv-liposoma
A-ODN AS HER-2 administrado
sistémicamente y Gemzar® sobre tumores en xenoinjerto de páncreas
humano Panc I.
La figura 10B muestra el efecto de la
combinación de TfRscFv-liposoma
B-ODN AS HER-2 administrado
sistémicamente y Taxotere sobre tumores en xenoinjerto de mama
humano MDA-MB-435.
La figura 11 muestra la formación de imágenes
potenciada de tumores resultante de la administración sistémica del
complejo
TfRscFv-liposoma-Magnevist®.
La figura 12 muestra los resultados de un ensayo
de transfección in vitro de
TfRscFv-PEG-liposoma
A-pLuc estabilizado estéricamente en células
MDA-MB-435 (ensayo de
luciferasa).
Se preparan complejos de polímero catiónico o de
liposoma catiónico dirigidos contra un anticuerpo (o fragmento de
anticuerpo) según la presente invención mediante un procedimiento de
conjugación no químico simple y eficaz en el que se mezclan los
componentes del complejo deseado entre sí en una razón definida y en
un orden definido. Los complejos resultantes son tan eficaces como,
o más eficaces que, complejos similares en los que el anticuerpo o
fragmento de anticuerpo está químicamente conjugado al liposoma o
polímero.
Puede utilizarse o bien un anticuerpo entero o
bien un fragmento de anticuerpo para preparar los complejos de esta
invención. En una forma de realización preferida, se utiliza un
fragmento de anticuerpo. Preferentemente, el fragmento de
anticuerpo es un fragmento Fv de cadena sencilla de un anticuerpo.
Un anticuerpo preferido es un anticuerpo monoclonal
anti-TfR y un fragmento preferido de anticuerpo es
un scFv basado en un anticuerpo monoclonal
anti-TfR. Un anticuerpo monoclonal
anti-TfR adecuado es 5E9. Otro anticuerpo preferido
es un anticuerpo monoclonal
anti-HER-2, y otro fragmento
preferido de anticuerpo es un scFv basado en un anticuerpo
monoclonal anti-HER-2. Un scFv
basado en este anticuerpo contiene el sitio de unión del anticuerpo
completo para el epítopo del TfR reconocido por este AcM como una
cadena polipeptídica sencilla de peso molecular aproximado de
26.000. Un scFv se forma conectando los dominios variables VH y VL
componentes de las cadenas pesada y ligera, respectivamente, con un
péptido ligador apropiadamente diseñado, que hace de puente entre el
extremo C-terminal de la primera región variable y
el extremo N-terminal de la segunda, ordenado o bien
como VH-ligador-VL o bien como
VL-ligador-
VH.
VH.
En una forma de realización preferida, se añade
un resto cisteína al extremo C-terminal de scFv. Sin
desear limitarse a ninguna teoría, se cree que la cisteína, que
proporciona un grupo sulfhidrilo libre, puede potenciar la
formación del complejo entre el anticuerpo y el liposoma. Con o sin
la cisteína, la proteína puede expresarse en cuerpos de inclusión
de E. coli y después replegarse para producir el fragmento de
anticuerpo en forma activa, tal como se describe en detalle en los
ejemplos a continuación.
A menos que se desee utilizar un inmunoliposoma
estabilizado estéricamente en la formación del complejo, una
primera etapa en la preparación del complejo comprende mezclar un
liposoma catiónico o combinación de liposomas o polímero pequeño
con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de elección. Una amplia
variedad de liposomas catiónicos son útiles en la preparación de
los complejos de esta invención. La solicitud PCT publicada
WO99/25320 describe la preparación de varios liposomas catiónicos.
Los ejemplos de liposomas deseables incluyen los que comprenden una
mezcla de fosfato de dioleoiltrimetilamonio (DOTAP) y
dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) y/o colesterol (chol), una
mezcla de bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB) y DOPE y/o
chol. Puede variarse la razón de los lípidos para optimizar la
eficacia de captación de la molécula terapéutica para el tipo de
célula diana específico. El liposoma puede comprender una mezcla de
uno o más lípidos catiónicos y uno o más lípidos auxiliares o
neutros. Una razón deseable de lípido(s) catiónico(s)
con respecto a lípido(s) neutro(s) o
cooperador(es) es de aproximadamente
1:(0,5-3), preferentemente de
1:(1-2) (razón molar).
Los polímeros adecuados son polímeros catiónicos
de unión a ADN que pueden mediar la compactación de ADN y también
pueden mediar la liberación de endosoma. Un polímero preferido es
polietilenimina. Otros polímeros útiles incluyen dendrímeros de
poliamidoamina, protamina y polilisina.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo es uno
que se unirá a la superficie de la célula diana, y preferentemente
a un receptor que se expresa de manera diferencial sobre la célula
diana. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se mezcla con el
polímero o el liposoma catiónico a temperatura ambiente y en una
razón de proteína:lípido en el intervalo de aproximadamente 1:20 a
aproximadamente 1:40 (p:p) o en una razón de proteína:polímero en
el intervalo de aproximadamente 0,1:1 a 10:1 (razón molar).
Se dejan incubar el anticuerpo o fragmento de
anticuerpo y el liposoma o polímero a temperatura ambiente durante
un corto periodo de tiempo, normalmente durante aproximadamente
10-15 minutos, después se mezcla la mezcla con un
agente de diagnóstico o terapéutico de elección. Los ejemplos de
moléculas o agentes terapéuticos que pueden complejarse con el
anticuerpo y el liposoma incluyen genes, ADN de alto peso molecular
(ADN genómico), ADN de plásmido, oligonucleótidos antisentido,
péptidos, ribozimas, ácidos nucleicos, partículas virales, agentes
inmunomoduladores, proteínas y agentes químicos. Las moléculas
terapéuticas preferidas incluyen genes que codifican para p53, Rb94
o apoptina. RB94 es una variante del gen supresor de tumor de
retinoblastoma. La apoptina es un gen que induce la apoptosis sólo
en células tumorales. En otra forma de realización preferida, el
agente es un oligonucleótido antisentido, tal como
HER-2. Un oligonucleótido antisentido
HER-2 preferido presenta la secuencia
5'-TCC ATG GTG CTC ACT-3'. Un tercer
tipo de agente preferido es un agente de formación de imágenes de
diagnóstico, tal como un agente de formación de imágenes mediante
RMN, tal como un agente Gd-DTPA. SI el agente es
ADN, tal como la región codificante de p53, puede colocarse bajo el
control de un promotor constitutivo fuerte, tal como un promotor de
VRS o de CMV.
La combinación de anticuerpo o fragmento de
anticuerpo y liposoma se mezcla con el agente de diagnóstico o
terapéutico en una razón en el intervalo de aproximadamente 1:10 a
1:20 (\mug de agente:nmol de lípido total) o de 1:10 a 1:40 (ug
de agente:nmol de polímero total) y se incuba a temperatura ambiente
durante un corto periodo de tiempo, normalmente de aproximadamente
10 a 15 minutos. El tamaño del complejo de liposoma está
normalmente dentro del intervalo de aproximadamente
50-400 nm según se mide mediante dispersión de luz
dinámica utilizando un instrumento Malvern Zetasizer 3.000.
En una forma de realización de la presente
invención, el liposoma utilizado para formar el complejo es un
liposoma estabilizado estéricamente. Los liposomas estabilizados
estéricamente son liposomas en los que se ha integrado un polímero
hidrófilo, tal como PEG, poli(ácido 2-etilacrílico)
o poli(n-isopropilacrilamida) (PNIPAM).
Tales liposomas modificados pueden ser particularmente útiles cuando
se complejan con agentes terapéuticos o de diagnóstico, ya que
normalmente no se eliminan del torrente circulatorio mediante el
sistema reticuloendotelial tan rápidamente como los liposomas
comparables que no se han modificado así. Para preparar un complejo
de liposoma estabilizado estéricamente de la presente invención, se
invierte el orden de mezclar el anticuerpo o fragmento de
anticuerpo, el liposoma y el agente de diagnóstico o terapéutico del
orden expuesto anteriormente. En una primera etapa, se mezcla en
primer lugar un liposoma catiónico tal como se describió
anteriormente con un agente de diagnóstico o terapéutico tal como
se describió anteriormente en una razón en el intervalo de
aproximadamente 1:10 a 1:20 (\mug de agente:nmol de lípido). A
este lipoplejo se le añade una disolución de un polímero de PEG en
un tampón fisiológicamente aceptable y se incuba la disolución
resultante a temperatura ambiente durante un tiempo suficiente para
permitir que el polímero se integre en el complejo de liposoma.
Después se mezcla el anticuerpo o fragmento de anticuerpo con el
complejo de liposoma estabilizado a temperatura ambiente y en una
razón de proteína:lípido en el intervalo de aproximadamente 1:5 a
aproximadamente 1:30 (p:p).
Los complejos de liposoma o de polímero
preparados según la presente invención pueden formularse como una
formulación farmacéuticamente aceptable para su administración in
vivo. Los complejos pueden combinarse con un portador o
excipiente farmacéuticamente compatible. Las composiciones pueden
formularse, por ejemplo, para su administración intravenosa a un
paciente humano que va a beneficiarse de la administración de la
molécula del complejo terapéutica o de diagnóstico. Los complejos
se dimensionan apropiadamente para que puedan distribuirse a través
del cuerpo tras la administración i.v. Alternativamente, los
complejos pueden administrarse mediante otras vías de
administración,
\hbox{tales como administración intratumoral,
intralesional, aerosol, percutánea, endoscópica, tópica o
subcutánea.}
En una forma de realización, se administran
composiciones que comprenden los complejos de liposoma (o polímero)
y agente terapéutico dirigidos contra un anticuerpo (o fragmento de
anticuerpo) para realizar una terapia génica en seres humanos. El
componente de agente terapéutico del complejo comprende un gen
terapéutico bajo el control de una secuencia reguladora apropiada.
La terapia génica para diversas formas de cánceres humanos puede
lograrse mediante la administración sistémica de complejos de
liposoma o polímero dirigidos contra un anticuerpo o fragmento de
anticuerpo que contienen un ácido nucleico que codifica para wt p53.
Los complejos pueden seleccionar como diana específicamente y
sensibilizar células tumorales, tanto tumores primarios como
metastásicos, frente a radiación y/o quimioterapia tanto in
vitro como in vivo.
Los complejos pueden optimizarse para
seleccionar como diana un tipo de célula mediante la elección y la
razón de lípidos, la razón de anticuerpo o fragmento de anticuerpo
con respecto a liposoma, la razón de anticuerpo o fragmento de
anticuerpo y liposoma con respecto al agente de diagnóstico o
terapéutico, y la elección de anticuerpo o fragmento de anticuerpo
y de agente de diagnóstico o terapéutico.
En una forma de realización, las células diana
son células cancerosas. Aunque cualquier tejido que tenga
crecimiento de células malignas puede ser una diana, los cánceres
de cabeza y cuello, de mama, de próstata, de páncreas,
glioblastoma, de cuello uterino, de pulmón, liposarcoma,
rabdomiosarcoma, coriocarcinoma, melanoma, retinoblastoma, de
ovarios, gástrico y colorrectal son dianas preferidos.
Los complejos preparados mediante el
procedimiento de esta invención también pueden utilizarse para
seleccionar como diana células no tumorales para la administración
de una molécula terapéutica. Aunque puede seleccionarse como diana
cualquier célula normal, las células preferidas son células
dendríticas, células endoteliales de los vasos sanguíneos, células
pulmonares, células de mama, células de médula ósea y células
hepáticas. Pueden seleccionarse como diana células indeseables,
pero benignas, tales como células de hiperplasia de próstata
benigna, células tiroideas hiperactivas, células de lipoma y células
relacionadas con enfermedades autoinmunitarias, tales como células
B que producen anticuerpos implicadas en artritis, lupus, miastenia
grave, metaplasia escamosa, displasia y similares.
Los complejos pueden administrarse en
combinación con otro agente terapéutico, tal como un agente o bien
de radiación o bien quimioterápico. Puede administrarse el agente
terapéutico, o una combinación de agentes terapéuticos, antes o
tras la administración del complejo, por ejemplo en el plazo de
aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 7 días. Los agentes
quimioterápicos incluyen, por ejemplo, doxorubicina,
5-fluorouracilo (5FU), cisplatino (CDDP),
docetaxel, gemcitabina, paclitaxel, vinblastina, etopósido
(VP-16), camptotecina, actinomicina D, mitoxantrona
y mitomicina C. Las radioterapias incluyen radiación gamma, rayos X,
radiación UV, microondas, emisiones electrónicas y similares.
También pueden insertarse agentes de diagnóstico
en células seleccionadas como diana mediante los complejos de
liposoma o de polímero. Pueden utilizarse agentes que pueden
detectarse in vivo tras la administración. Agentes de
diagnóstico a modo de ejemplo incluyen materiales densos en
electrones, agentes de formación de imágenes por resonancia
magnética y productos radiofarmacéuticos. Los radionúclidos útiles
para la formación de imágenes incluyen radioisótopos del cobre,
galio, indio, renio y tecnecio, incluyendo isótopos ^{64}Cu,
^{67}Cu, ^{111}In, ^{99m}Tc, ^{67}Ga o ^{68}Ga. Los
agentes de formación de imágenes, dados a conocer por Low et
al. en la patente US nº 5.688.488, incorporada a la presente
memoria como referencia, son útiles en la presente invención.
Los complejos preparados según el procedimiento
de esta invención pueden proporcionarse en forma de kits para su
utilización en la administración sistémica de una molécula
terapéutica por el complejo. Los kits adecuados pueden comprender,
por separado, envases adecuados, el liposoma, el anticuerpo o
fragmento de anticuerpo, y el agente de diagnóstico o terapéutico.
Los componentes pueden mezclarse en condiciones estériles en el
orden apropiado y administrarse a un paciente en el plazo de un
periodo de tiempo razonable, generalmente desde aproximadamente 30
minutos hasta aproximadamente 24 horas, tras la preparación. Los
componentes del kit se proporcionan preferentemente como
disoluciones o como polvos secos. Los componentes proporcionados en
forma de disolución se formulan preferentemente en agua para
inyección estéril, junto con tampones apropiados, agentes de
control de la osmolaridad, etc.
La invención se ilustra mediante los ejemplos
siguientes, proporcionados a título limitativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se obtuvo el vector de expresión de plásmido
pDFH2T-vecOK del Dr. David Fitzgerald, NCI. Este
vector codifica para el fragmento de cadena sencilla para el
anticuerpo 5E9, que reconoce el receptor de transferrina humano
(CD71). Se obtuvo el TfRscFv
VH-ligador-VK mediante amplificación
por PCR del fragmento deseado. Se añadió un resto de cisteína al
extremo 3' de la proteína TfRscFv. Se construyeron las dos formas de
este vector. La primera contiene una secuencia señal líder pelB,
para el transporte al espacio periplásmico, y una cola de His. La
presencia de esta cola de His ayuda en la detección de la proteína,
simplificando así el desarrollo del protocolo de purificación.
Aunque se utilizó esta forma para las pruebas iniciales, las
directrices de la FDA recomiendan que no haya secuencias extrañas
presentes para la utilización en ensayos clínicos. Por tanto,
también se preparó una segunda forma sin ambas de estas
secuencias.
Utilizando la amplificación por PCR se
introdujeron la secuencia de nucleótidos para el residuo de cisteína
y un sitio de restricción NotI en el extremo 3'. De manera similar,
también se incorporó un sitio NcoI en 5'. Se clonó el producto de
PCR en los sitios NcoI y NotI del vector comercial pET26b(+)
(Novagen) produciendo así un producto proteico que contenía tanto
la secuencia señal líder pelB como la cola de His. El crecimiento
en cultivo bacteriano que contenía IPTG proporcionó un aumento de
aproximadamente 100 veces en la expresión de la proteína de cadena
sencilla que fue máximo a aproximadamente 10 horas desde la
inducción de IPTG. Esta proteína se encontró principalmente en la
fracción insoluble (cuerpos de inclusión).
También se modificó el constructo anterior para
eliminar tanto la secuencia de cola de His como pelB en el producto
proteico final. Para lograr esto, se cortó el vector pET26b(+) en el
sitio enzimático Nde I en 5' de la secuencia pelB. La amplificación
por PCR insertó un sitio Nde I en el extremo 5' del scFv
VH-ligador-Vx para la secuencia de
TfR. Además de la secuencia de nucleótidos para el residuo de
cisteína y el sitio de restricción NotI en el extremo 3', se
introdujo un codón de terminación de ADN adyacente a la secuencia de
cisteína y antes del sitio NotI. Se clonó el producto de PCR en los
sitios NdeI y NotI del vector de expresión comercial pET26b(+)
(Novogen). Por tanto, el producto proteico de este constructo no
contendrá ni la secuencia pelB ni la cola de His.
Se encontró que la mayor parte de la proteína
cys-TfRscFv (aproximadamente el 90%) no era soluble
sino que estaba contenida en cuerpos de inclusión. Por tanto, se
aisló la proteína de los constructos descritos anteriormente de los
cuerpos de inclusión mediante sonicación, tratamiento con
guanidina-HCl 6 M, NaCl 200 mM (tampón GuHCl 6 M) y
se purificó mediante cromatografía en columna con filtración en gel
Sephacril S-200. Se logró el replegado de la
proteína cys-TfRscFv mediante diálisis a 4ºC frente
a concentraciones decrecientes de guanidina-HCl.
Tras la purificación, la SDS-PAGE mostró una única
banda de la proteína cys-TfRscFv solubilizada,
replegada, con el peso molecular correcto de aproximadamente
28-30 kDa (tal como se describe en el documento WO
00/50008). Se almacena la proteína cys-TfRscFv a
-80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La solicitud PCT publicada WO 99/25320;
incorporada en la presente memoria como referencia, describe la
preparación de varios liposomas catiónicos. Los liposomas
catiónicos preparados son disoluciones transparentes, sus
composiciones y razones son las siguientes:
Los expertos en la materia saben bien que el
TfRscFv-inmunoliposoma conjugado conserva su
actividad inmunológica. Se estableció que
cys-TfRscFv podía conjugarse químicamente con el
lipoplejo (solicitud PCT WO 00/50008) y puede transfectar
eficazmente células de tumor de próstata humanas in vitro e
in vivo. Es de práctica común unir fragmentos de anticuerpo
de cadena sencilla a liposomas utilizando diversos procedimientos de
conjugación química. Se realizaron estudios para determinar si un
mezclado simple de cys-TfRscFv y el liposoma
catiónico, en vez de la conjugación química, proporcionaría la
formación de un complejo inmunológicamente activo que todavía
podría unirse eficazmente a, y transfectar, células tumorales. Se
preparó una serie de complejos de
cys-TfRscFv-inmunoliposoma mezclando
cys-TfRscFv con liposoma A en razones definidas de
proteína de cadena sencilla con respecto a liposoma que oscilaban
desde 1/25 hasta 1/36 (p/p). Basándose en los datos de ELISA con el
complejo de cys-TfRscFv conjugado, también se varió
la razón de ADN con respecto a nmoles de lípido total en el
complejo mezclado desde 1/8 hasta 1/18. La preparación de los
complejos fue según el siguiente procedimiento general: se mezcla
la cantidad apropiada de liposoma 2 mM
(A-H descrito anteriormente) con cualquier agua
requerida para proporcionar un volumen deseado y se invierte para
mezclarlo. Al liposoma-agua se le añade la cantidad
apropiada de cys-TfRscFv para proporcionar la razón
deseada y se mezcla mediante inversión suave durante
5-10 segundos. Se mantiene esta mezcla a temperatura
ambiente durante 10 minutos (vuelve a invertirse suavemente durante
5-10 segundos tras aproximadamente 5 minutos). Al
mismo tiempo, se mezcla la cantidad apropiada de ADN mediante
inversión durante 5-10 segundos con cualquier agua
requerida para proporcionar un volumen deseado. Normalmente, para
su utilización en un ensayo in vitro, es deseable que la
concentración de ADN esté en el intervalo de aproximadamente 0,01
\mug a aproximadamente 2 \mug por pocillo; para su utilización
in vivo, es deseable proporcionar de aproximadamente 5 \mug
a aproximadamente 50 \mug de ADN por inyección. Se añade
rápidamente la disolución de ADN a la disolución de
cys-TfRscFv-liposoma y se invierte
la mezcla durante 5-10 segundos. Se mantiene la
mezcla final a temperatura ambiente durante 10 minutos, volviendo a
invertir suavemente durante 5-10 segundos tras
aproximadamente 5 minutos. Para su utilización in vivo se
añade dextrosa al 50% hasta una concentración final del 5% (V:V) y
se mezcla mediante inversión suave durante 5-10
segundos. Un ejemplo específico en una razón preferida 1:30
(cys-TfRscFv: liposoma, p:p) y 1:14 (\mug de
ADN:nmol de lípido total) es tal como se expone a continuación: para
40 \mug de ADN en un volumen final de 800 \mul se mezclan 183
\mul de agua 280 \mul de disolución de liposoma 2 mM. Se añaden
34 \mul de cys-TfRscFv (con una concentración de
0,4 \mug/ml). Se mezclan 183 \mul de agua con 40 \mul de ADN
1 \mug/l \mul. Se añaden 80 \mul de dextrosa al 50% como
última etapa.
El tamaño del complejo final preparado mediante
el procedimiento de esta invención es de entre 100 y 400 (valor de
número) con un potencial zeta de entre 25 y 35 según se determina
mediante dispersión de luz dinámica utilizando un instrumento
Malvern Zetasizer 3.000. Este tamaño es lo bastante pequeño para
pasar eficazmente a través del lecho capilar del tumor y alcanzar
las células tumorales.
Se realizó un ensayo ELISA para evaluar la
capacidad de unión del complejo mezclado a células de cáncer de
próstata humanas DU145. Para comparación, también se incluyeron
complejos preparados con el inmunoliposoma conjugado en el ensayo.
Los resultados mostrados en la figura 1 demuestran claramente que el
complejo de inmunoliposoma preparado mediante mezclado simple de la
proteína cys-TfRscFv con el liposoma catiónico se
une a células DU145 por lo menos tan bien como los preparados
mediante conjugación. De manera similar al complejo conjugado, se
descubrió que una razón de 1/30 de proteína con respecto a lípido y
de 1/14 de ADN con respecto a lípido tenía la mayor capacidad de
unión. Tal como también se observó anteriormente con los complejos
conjugados, la unión disminuyó de una manera dependiente de la
dosis de ADN. Estos hallazgos indican que el mezclado simple de
componentes puede formar un complejo que conserva su actividad
inmunológica. Se encontraron razones óptimas idénticas en células
de próstata humanas DU145 y en células de rata C6 utilizando el
ensayo de luciferasa (figuras 2 y 3) y en línea celular de cáncer
pancreático humano Panc I (tabla I, II) utilizando proteína verde
fluorescente potenciada (EGFP) para evaluar la eficacia de
transfección.
\vskip1.000000\baselineskip
La razón de cys-TfRscFv:Liposoma
fue de 1:3 (p:p)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para establecer la eficacia de la unión de
cys-TfRscFv al complejo de liposoma mediante
mezclado simple, se utilizó un gel de poliacrilamida no
desnaturalizante. Se cargaron complejo
cys-TfRscFv-liposoma
A-p53 mezclado y
cys-TfRscFv-Liposoma A sin ADN de
p53 sobre el gel junto con cys-TfRscFv libre en
cantidades iguales a 1/5 ó 1/10 de la cantidad de
cys-TfRscFv utilizada para preparar los complejos.
Se prepararon los complejos utilizando la razón de
cys-TfRscFv:liposoma de 1:30 (p:p) y ADN:lípido
total de 1:14 (\mug:nmol de lípido total). Los complejos
cys-TfRscFv libres sirvieron como patrones de
cuantificación, ya que en condiciones no desnaturalizantes el
complejo no puede entrar en el gel, sólo el
cys-TfRscFv no unido, libre, puede migrar en él.
Tras transferir a la membrana, se examinó con sondas el gel con un
anticuerpo anti-cys-TfRscFv
utilizando el kit de detección de inmunotransferencia tipo western
ECL (Amersham). La comparación del nivel de señal bajo para los dos
complejos (con y sin ADN de p53) mostrada en la figura 4 con las
señales de los patrones de cys-TfEscFv libre indica
que se incorpora más del 95% del cys-TfRscFv en el
complejo mediante el mezclado simple de los componentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se realizaron experimentos para determinar cómo
de eficaz sería el complejo
cys-TfRscFv-Liposoma-p53
preparado mediante mezclado simple en la sensibilización de células
de tumor de próstata frente a los fármacos Gemzar® (gemcitabina
HCl; fabricado por Eli Lilly y Co.) y Novantrone® (mitoxantrona,
Inmunex Corp.) que se utilizan ambos actualmente para el
tratamiento del cáncer de próstata. En estos estudios se utilizó la
línea celular de tumor de próstata DU145, que alberga p53 mutante.
Se utilizó el ensayo de citotoxicidad con XTT (66) para establecer
el nivel de quimiosensibilidad inducido por el complejo
cys-TfRscFv-Liposoma-p53
de esta invención. Se sembraron en placa 5 x 10^{3} células
DU145/pocillo de una placa de 96 pocillos. Tras 24 horas, se
transfectaron las células con el complejo
cys-TfRscFv-Liposoma-p53
mezclado. Se preparó el
cys-TfRscFv-Liposoma-p53
mezclado mezclando en una razón de 1:30 (p:p)
(cys-TfRscFv:Liposoma A) y 1:14 (\mug de ADN de
p53:nmoles de lípido total). Un día tras la transfección, se
añadieron agentes antineoplásicos en concentraciones crecientes (por
triplicado). Se realizó el ensayo con XTT aproximadamente 3 días
después y se calcularon los valores de CI_{50}, la concentración
de fármaco que proporciona una inhibición del crecimiento del 50%.
Tal como se muestra en la figura 5A, el tratamiento con el complejo
cys-TfRscFv-Liposoma-p53
aumentó la sensibilidad de las células frente a Gemzar® en 8 veces.
Para la figura 5A, los valores de CI_{50} (nM) son los siguientes:
cys-TfRscFv-LipA-p53:
0,5; cys-TfRscFv-LipA: 4,0;
cys-TfRscFv-LipA-Vec:
4,0; sin transfectar: 5,0. Las veces de sensibilización para Vec
frente a p53 = 8 y para UT frente a
p53 = 10.
p53 = 10.
De manera similar, se sensibilizaron células
DU145 frente al fármaco mitoxantrona en 17,5 veces (figura 5B).
Para la figura 5B, los valores de CI_{50} (ng/ml) fueron los
siguientes:
cys-TfRscFv-LipA-p53:
0,08; cys-TfRscV-LipA: 1,20;
cys-TfRscFv-LipA-Vec:
1,40 y sin transfectar: 1,80. Las veces de sensibilización para Vec
frente a p53 = 17,5 y para UT frente a p53 = 22,5. Se realizaron
estudios similares utilizando la línea celular de cáncer de
páncreas humana Panc I. Se sembraron en placa 4 x 10^{3} células
Panc I por pocillo, y se realizó el ensayo con XTT tal como
anteriormente. Aquí también se utilizó una razón preferida de 1:30
(cys-TfRscFv:liposoma A p:p) y 1:14 (\mug de ADN
de p53:nmoles de lípido total). Tal como con DU145 hubo una
sensibilización significativa de las células tumorales frente a
agentes quimioterápicos (figuras 6A y B). A una concentración de ADN
de p53 de 0,06 \mug/pocillo, hubo un aumento de 23,8 veces en la
sensibilización frente a Gemzar® utilizando el complejo
cys-TfRscFv-liposoma-ADN
mezclado (figura 6A). Para la figura 6A, los valores de CI_{50}
fueron los siguientes:
cys-TfRscFv-LipA-p53:
0,21 nM;
cys-TfRscFv-LipA-Vec:
5,00 nM y Tf-LipA-p53: 0,30 nM. La
CI_{50} de
cys-TfRscFv-LipA-Vec/CI_{50}
de
cys-TfRscFr-LipA-p53
= 23,8. No se observó sensibilización cuando se utilizó vector
vacío en lugar de p53. Hubo un drástico aumento en la respuesta de
las células Panc I a una concentración de ADN de p53 de 0,08 \mug
de ADN/pocillo (figura 6B). Aquí se observó un aumento de casi 200
en la sensibilización. Para la figura 6B, los valores de CI_{50}
fueron los siguientes:
cys-TfRscFv-LipA-p53:
1,8 nM;
cys-TfRscFv-LipA-Vec:
350 nM; y cys-TfRscFv-LipA: 600 nM.
La CI_{50} de
cys-TfRscFv-LipA-Vec/CI_{50}
de
cys-TfRscFv-LipA-p53
= 194,44. Por tanto, estos estudios in vitro demuestran que
el cys-TfRscFv-liposoma, preparado
mediante mezclado simple, puede transfectar de manera eficaz wtp53
en células de tumor de próstata y sensibilizarlas frente a agentes
quimioterápicos convencionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se indujeron por vía subcutánea tumores DU145 en
ratones desnudos atímicos hembra (NCR nu/nu). A los ratones se les
inyectó en la vena de la cola i.v. tres veces durante un periodo de
24 horas
cys-TfRscFv-LipA-EGFP
(proteína verde fluorescente potenciada) (TfRscFvII) preparado
mediante mezclado simple en una razón de scFv:Liposoma de 1/30 pero
a diversas razones de ADN:lípido total (1/10, 1/11, 1/12, 1/13.
1/14) a 32 ug de ADN/inyección. Para su comparación, también se
inyectó a los ratones un complejo a 1/30, 1/14 preparado mediante el
procedimiento de conjugación (TfRscFv III en la figura 7B) y un
lote diferente de cadena sencilla a 1/30, 1/14 (TfRscFv I en la
figura 7B). 60 horas tras la inyección se sacrificó a los ratones,
se extirpó el tumor y los pulmones y se aisló la proteína para
análisis de inmunotransferencia de tipo Western utilizando un
anticuerpo anti-EGFP. Se inyectaron el complejo
LipA-EGFP sin ligando (UL), el complejo
Tf-LipA-EGFP (Tf) y el complejo
BSALipA-EGFP (BSA) en ratones como controles.
Figura 7A: Tal como se muestra en el tumor DU145 se observa una
banda EGFP en los controles positivos Tf, TfRscFvIII, y en
TfRscFvI. Y lo que es más significativo, se encontró una fuerte
señal de EGFP en TfRscFvII en la razón de ADN con respecto a lípido
de 1/14. Por el contrario, sólo fue evidente un nivel muy bajo de
expresión de EGFP en el tejido pulmonar normal. Por tanto, el
cys-TfRscFv-Lipoplejo preparado
mediante mezclado simple puede seleccionar como diana eficazmente el
tumor tras la administración
sistémica.
sistémica.
Para evaluar la reproducibilidad del mezclado,
se complejaron diferentes lotes de cys-TfRscFv (I a
V) con Liposoma A-EGFP mediante mezclado simple a
la razón preferida de 1:30 (scFv : liposoma p:p) y 1:14 (\mug de
ADN : nmoles de lípido total). Se indujeron por vía subcutánea como
anteriormente los tumores en xenoinjerto de próstata humano DU145,
de vejiga HTB-9, de mama
MDA-MB-435 y de cabeza y cuello
JSQ-3. Los complejos también se inyectaron en la
vena de la cola i.v. tres veces durante un periodo de 24 horas. Se
utilizaron Tf-LipA-EGFP(Tf)
y complejo LipA-EGFP sin ligando (UL) como
controles. 60 horas tras la inyección, se sacrificó a los ratones y
se extirpó el tumor y el hígado y se analizaron como anteriormente.
La selección como diana es evidente con todos los complejos
mezclados en los cuatro tipos de tumores (figura 7B). Sin embargo,
casi no hay señal en el tejido normal (hígado). Se examinó con
sonda la membrana idéntica para determinar los niveles de actina
para demostrar una carga igual.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se llevaron a cabo estudios de eficacia para
confirmar adicionalmente la capacidad del complejo
cys-TfRscFv-inmunoliposoma de esta
invención para unirse e insertar wtp53 eficazmente a células
tumorales in vivo. A ratones que portaban tumores DU145
subcutáneos de aproximadamente 60-90 mm^{3} se les
inyectó
cys-TfRscFv-Liposoma-p53,
a través de la vena de la cola, tres veces por semana (un total de
10 inyecciones). Este complejo se preparó mediante mezclado simple
en una razón de 1/30 (cys-TfRscFv:Liposoma A, p:p) y
1/14 (\mug de ADN/nmoles de lípido total). El área tumoral se
expuso selectivamente a dosis fraccionadas diarias de 2,0 Gy de
radiación \gamma hasta un total de 32 Gy (figura 8). Los animales
tratados con el complejo
cys-TFRrscFv-liposoma A mezclado
más radiación presentaban inhibición significativa del crecimiento
tumoral. También se observaron hallazgos similares utilizando la
combinación de fármaco anticancerígeno Gemzar® y el
cys-TFRscFv-inmunoliposoma de esta
invención que inserta el gen supresor de tumores Rb94 a un tumor en
xenoinjerto de carcinoma de vejiga humano (HTB-9),
y en xenoinjertos Panc I tratados con Gemzar® y
cys-TFRscFv-Liposoma que llevan o
bien otro gen que induce apoptosis (apoptina) o bien p53.
Estos hallazgos demuestran que un complejo
preparado mediante el procedimiento de esta invención puede
comprender una variedad de genes (incorporados en vectores de
plásmido) para su inserción eficaz in vivo en células
cancerosas como tratamiento terapéutico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Este ejemplo demuestra la utilidad de esta
invención en insertar eficazmente moléculas distintas a genes en
células tumorales para el tratamiento terapéutico. Se preparó el
complejo como en el ejemplo 2, sin embargo, el ADN encapsulado aquí
fue un oligonucleótido de 18 meros fosforotiado (ODN) dirigido
contra el codón de iniciación del gen HER-2 (AS
HER-2) (51). La razón utilizada fue superior para el
ADN de plásmido 1:30 (cys-TfRscFv:liposoma, p:p) y
1:14 (nmoles de ODN:nmol de lípidos totales). Se sembraron células
Panc I, a 4 x 10^{3} células/pocillo, en una placa de 96
pocillos. Las células se transfectaron 24 horas después mediante
cys-TfRscFv-LipA-AS
HER-2 preparado mediante el procedimiento de esta
invención. Se utilizaron los
Tf-LipA-AS HER-2 y
cys-TfRscFv-LipA-ODN
SC como controles. El ODN SC es un ODN desorganizado que presenta
la misma composición de nucleótidos que el ODN AS
HER-2, pero en orden aleatorio. Tal como se muestra
en la figura 9, el complejo
cys-TfRscFv-Lip
A-AS HER-2 preparado mediante el
procedimiento de esta invención pudo sensibilizar a la línea celular
de cáncer de páncreas Panc I frente a los efectos del agente
quimioterápico Gemzar® en más de 11 veces. Este aumento en la en
sensibilización es idéntico al que resulta de la transfección con el
control positivo complejo Tf-LipA-AS
HER2. Para la figura 9, los valores de CI_{50} fueron los
siguientes:
TfRscFv-LipA3-AS-HER-2:
16 nM;
Tf-LipAe-AS-HER-2:
14 nM y
TfR-scFv-LipAe-SC:
200 nM. La CI_{50} de
TfR-scFv-LipAe-SC/CI_{50}
de
TfR-scFv-LipAe-AS-HER-2
= 12,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
En este ejemplo se demuestra la capacidad del
complejo
cys-TfRscFv-liposoma-ADN
preparado mediante el procedimiento de esta invención para insertar
una molécula antisentido en células tumorales in vivo tras la
administración sistémica. Para demostrar la universalidad de este
sistema de administración, se utilizaron dos modelos distintos de
tumor de ratón en xenoinjerto humano (cáncer de páncreas y cáncer de
mama). En el primero (figura 10A) se indujeron tumores en
xenoinjerto subcutáneos Panc I en ratones desnudos atímicos hembra
(NCR nu/nu). Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de
100-200 mm^{3}, se inyectó a los animales el
agente quimioterápico Gemzar® (por vía intraperitoneal) y
cys-TfRscFv-LipA-AS
HER-2 preparado mediante el procedimiento de esta
invención (i.v.). El complejo se preparó utilizando la razón de
1:30 (cys-TfRscFv:liposoma, p:p) y 1:15 (nmol de
ODN:nmol de lípido total). Además de las inyecciones i.v., el
complejo descrito anteriormente también se inyectó por vía
intratumoral. Un grupo de animales recibió Gemzar® sólo y un segundo
grupo control recibió Gemzar® más el complejo que lleva el vector
vacío. El tratamiento con Gemzar® solo no pudo inhibir
significativamente el crecimiento del tumor de páncreas. Por el
contrario (figura 10A), la combinación de Gemzar y el ODN
AS-HER-2 insertado mediante el
complejo cys-TfRscFv-Lip A preparado
mediante el procedimiento de esta invención, no sólo inhibió
significativamente el crecimiento del tumor, sino que también dio
como resultado la regresión del tumor.
También se observó la inhibición significativa
del crecimiento tumoral de tumores en xenoinjerto de cáncer de mama
humanos con la combinación del fármaco Taxotere® (docetaxel;
fabricado por Aventis Pharmaceuticals, Collegeville, PA) y
cys-TfRscFv-LipB-AS
HER-2 administrado i.v. preparado mediante el
procedimiento de esta invención (figura 10B). Aunque la formulación
de liposoma B se utilizó en el tumor de mama, se utilizaron las
mismas razones que las descritas anteriormente para Panc I.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Este ejemplo demuestra la capacidad para
encapsular agentes de formación de imágenes de RMN y formar un
complejo
cys-TfRscFv-Liposoma-agente
de formación de imágenes mediante el procedimiento de esta
invención. El complejo preparado mediante el procedimiento de esta
invención puede administrarse por vía intravenosa dando como
resultado un aumento en la potenciación de la imagen del tumor.
Estos agentes de formación de imágenes pueden incluir, pero no se
limitan a, Magnevist® (Gd-DTPA) (Schering AG). Las
razones utilizadas para formar el complejo mediante mezclado simple
son las razones preferidas de 1:30
(cys-TfRscFv:liposoma, p:p) y 1:14 (ug de agente de
formación de imágenes:nmoles de lípido). En estos estudios se
utilizaron 16 \mul de Magnevist® en el complejo.
La figura 11 muestra los resultados de una
inyección i.v. de
cys-TfRscFv-LipA-Magnevist®
preparada mediante el procedimiento de esta invención en ratones
que portan tumores en xenoinjerto subcutáneos de origen humano de
cabeza y cuello (panel superior), mama (panel central) o próstata
(panel inferior). Un nivel superior de potenciación de agente de
formación de imágenes es evidente en el tumor que recibió
cys-TfRscFv-LipA-Magnivist®
en comparación con el que recibió Magnivist® libre, lo que
demuestra el beneficio de administrar el agente de formación de
imágenes utilizando el complejo preparado mediante el procedimiento
de esta invención. En otros experimentos también se observó un
aumento de la captación en el tumor en comparación con el tejido
normal circundante.
También se observó una potenciación similar
utilizando el modelo de metástasis de pulmón de ratón singenético.
Se inyectaron células de melanoma de ratón B_{16}/F_{10} por vía
intravenosa en ratones C57BL/6. Estas células forman nódulos
tumorales en los pulmones del ratón. Se preparó el complejo
cys-TfRscFv-Liposoma-Magnevist®
mediante el procedimiento de esta invención utilizando también las
razones preferidas de 1:30 y 1:14. Se administró el complejo por
vía i.v. y se obtuvieron imágenes de los nódulos tumorales mediante
RMN. En comparación con Magnevist® libre, el agente de formación de
imágenes encapsulado también presenta una captación prolongada en
el tumor dado que la potenciación pico con el complejo es posterior
a la de Magnevist® libre.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Los complejos de liposomas se eliminan
rápidamente del torrente circulatorio mediante el sistema
reticuloendotelial. En un esfuerzo por prolongar este tiempo de
circulación, se han formulado liposomas estabilizados estéricamente
que presentan un polímero hidrófilo tal como PEG integrado en el
complejo de liposoma. Se han ideado diversos procedimientos para
incluir un ligando de direccionamiento tal como un anticuerpo o
fragmento de anticuerpo en el complejo
PEG-liposoma. La mayoría, sino todas, de estas
metodologías implican una etapa de conjugación química para ligar
el anticuerpo o fragmento de anticuerpo al PEG. Tales reacciones
químicas rigurosas y el procedimiento utilizado para formar el
complejo pueden proporcionar la pérdida o el enmascaramiento de la
actividad del anticuerpo. En este ejemplo, se demuestra que la
proteína cys-TfRscFv pueden ligarse a una molécula
de PEG-liposoma mediante mezclado simple y que el
complejo resultante puede transfectar más eficazmente a células
tumorales
humanas.
humanas.
Para formar este complejo, se mezcló un
lipoplejo constituido por una de las formulaciones de lípido
catiónico proporcionadas en el ejemplo 2 con ácido nucleico en una
razón de 1:14 (ug de ADN:nmoles de lípido) tal como se describió en
el ejemplo 2. A este lipoplejo se le añadió el polímero
comercialmente disponible
NHS-PEG-MAL (2%) en tampón HEPE 25
mM (pH 7,2). Se invirtió suavemente la disolución durante 3 - 5
segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Para
formar el complejo
cys-TfRscFv-PEG-Liposoma-ADN,
se añadió la proteína cys-TfRscFv al
PEG-lipoplejo en una razón de 1:8
(cys-TfRscFv:liposoma, p:p), se invirtió suavemente
y se mantuvo a temperatura ambiente durante de 10 minutos a 1 hora,
luego se utilizó para transfectar las células in vitro.
También podrían emplearse otras razones en el intervalo de 1:5 a
1:30 (cys-TfRscFv:liposoma, p:p) para formar el
complejo. Para su utilización in vivo, se añadió dextrosa al
50% hasta una concentración final del 5% tras la incubación, se
mezcló suavemente mediante inversión y se inyectó en los animales.
Alternativamente, el complejo final podría haberse almacenado a 4ºC
durante la noche (12 - 18 h).
En el experimento mostrado aquí, el ácido
nucleico fue pLuc, un ADN de plásmido que codifica para el gen de
la luciferasa de luciérnaga. Se sembraron en placa células de cáncer
de mama humano MDA-MB-435 a 5 x
10^{4} células/pocillo. Veinticuatro horas después, se
transfectaron con
cys-TfRscFv-PEG-LipA-pLuc
tal como se describió en el ejemplo 3 y se evaluó la eficacia de la
transfección mediante el nivel de actividad de la luciferasa. Tal
como se muestra en la figura 12, el complejo
cys-TfRscFv-PEG-LipA-pLuc
preparado mediante el procedimiento de esta invención pudo
transfectar a las células diana con mejor eficacia que
PEG-LipA-pLuc sin la proteína
cys-TfRscF de direccionamiento.
Por tanto, el procedimiento de mezclado simple
descrito en la presente memoria puede utilizarse como un medio
simple, no destructivo para preparar inmunoliposomas dirigidos
estabilizados estéricamente.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (56)
1. Procedimiento de preparación de un complejo
polimérico o inmunoliposoma catiónico dirigido contra un anticuerpo
o fragmento de anticuerpo que comprende las etapas que consisten
en:
a) mezclar un anticuerpo o fragmento de
anticuerpo con un liposoma catiónico para formar un inmunoliposoma
catiónico o con un polímero catiónico para formar un poliplejo, en
el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se compleja con,
pero no está químicamente conjugado a dicho liposoma catiónico o
dicho polímero catiónico; y
b) mezclar dicho inmunoliposoma catiónico o
dicho poliplejo con un agente de diagnóstico o terapéutico para
formar dicho complejo polimérico o inmunoliposoma catiónico
dirigido contra un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además la etapa que consiste en preparar el anticuerpo o
fragmento de anticuerpo.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que se mezcla un anticuerpo con dicho liposoma catiónico o
dicho polímero catiónico.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que se mezcla un fragmento de anticuerpo con dicho liposoma
catiónico o dicho polímero catiónico.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que dicho fragmento de anticuerpo es un fragmento Fv de cadena
sencilla.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicho fragmento de anticuerpo es un Fv de cadena sencilla de
antirreceptor de transferrina (TfRscFv).
7. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un
anticuerpo o fragmento de anticuerpo
anti-HER-2.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho fragmento de anticuerpo
comprende un resto de cisteína en un extremo carboxilo terminal
antes de mezclarse con dicho liposoma catiónico o polímero
catiónico.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo o fragmento
de anticuerpo se mezcla con un liposoma catiónico.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que dicho liposoma catiónico comprende una mezcla de uno o más
lípidos catiónicos y uno o más lípidos auxiliares o neutros.
11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó
10, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se mezcla
con dicho liposoma catiónico en una razón en el intervalo de
aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:40 (p:p).
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho liposoma catiónico
comprende una mezcla de fosfato de dioleiltrimetilamonio y
dioleilfosfatidiletanolamina, colesterol, o una combinación de los
mismos o una mezcla de bromuro de dimetildioctadecilamonio y
dioleilfosfatidiletanolamina, colesterol, o una combinación de los
mismos.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, en el que dicho anticuerpo o fragmento de
anticuerpo y liposoma se mezclan con un agente de diagnóstico o
terapéutico en una razón en el intervalo de aproximadamente 1:10 a
aproximadamente 1:20 (\mug de agente:nmol de lípido total).
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo o fragmento de
anticuerpo se mezcla con un polímero catiónico.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en
el que dicho polímero catiónico comprende polietilenimina,
polilisina, protamina o un dendrímero de poliamidoamina.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que dicho polímero catiónico es la polietilenimina.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, en el que dicho anticuerpo o fragmento de
anticuerpo se mezcla con dicho polímero catiónico en una razón en el
intervalo de aproximadamente 0,1:1 a aproximadamente 10:1.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, en el que dicho anticuerpo o fragmento de
anticuerpo y polímero se mezclan con un agente de diagnóstico o
terapéutico en una razón en el intervalo de aproximadamente 1:1 a
aproximadamente 1:40 (\mug de agente:nmol de polímero total).
19. Procedimiento según la reivindicación 13 ó
18, en el que dicho agente es un agente terapéutico y comprende un
gen, ADN de alto peso molecular, ADN de plásmido, oligonucleótido
antisentido, péptido, ribozima, ácido nucleico, partícula viral,
agente de inmunomodulación, proteína o agente químico.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que dicho agente es un gen que codifica para un gen supresor de
tumores.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que dicho gen supresor de tumores es p53 o Rb94.
22. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que dicho agente es un gen que codifica para apoptina.
23. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que dicho agente es un oligonucleótido antisentido.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que dicho oligonucleótido antisentido es un oligonucleótido
antisentido HER-2.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en
el que el oligonucleótido antisentido HER-2
comprende la secuencia 5'-TCCATGGTGCTCACT- 3'.
26. Procedimiento según la reivindicación 13 ó
18, en el que dicho agente es un agente de diagnóstico.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, en
el que dicho agente de diagnóstico comprende un agente de formación
de imágenes mediante RMI.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, en
el que dicho agente de formación de imágenes comprende un agente de
Gd-DTPA.
29. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además formular dicho
complejo como una formulación farmacéuticamente aceptable para la
administración in vivo.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, en
el que dicho complejo se combina con un portador farmacéuticamente
aceptable.
31. Procedimiento según la reivindicación 29 ó
30, en el que dicho complejo se formula para la administración
intravenosa, intratumoral, intralesional, mediante aerosol,
percutánea, endoscópica, tópica o subcutánea.
32. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho complejo se optimiza
para dirigirse contra células tumorales.
33. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 31, en el que dicho complejo se optimiza para
dirigirse contra células no tumorales.
34. Procedimiento de preparación de un
inmunoliposoma catiónico estabilizado estéricamente, dirigido contra
un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que comprende las etapas
que consisten en:
- (a)
- mezclar un liposoma catiónico con un agente de diagnóstico o terapéutico para formar un complejo;
- (b)
- mezclar dicho complejo de liposoma catiónico-agente terapéutico o agente de diagnóstico con un polímero hidrófilo para incorporar dicho polímero en dicho liposoma; y
- (c)
- mezclar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con dicho mezcla de la etapa (b) para formar dicho complejo de inmunoliposoma catiónico estabilizado estéricamente, dirigido contra un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se compleja con, pero no está químicamente conjugado a dicho liposoma catiónico.
35. Procedimiento según la reivindicación 34,
que comprende además la etapa que consiste en preparar el anticuerpo
o el fragmento de anticuerpo.
36. Procedimiento según la reivindicación 34 ó
35, en el que dicho polímero hidrófilo comprende polietilenglicol,
poli(ácido 2-etilacrílico) o
poli(N-isopropilacrilamida).
37. Procedimiento según la reivindicación 34 ó
35, en el que dicho polímero hidrófilo es el polietilenglicol.
38. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 34 a 37, en el que se mezcla un anticuerpo con
dicho liposoma catiónico.
39. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 34 a 37, en el que se mezcla un fragmento de
anticuerpo con dicho liposoma catiónico.
40. Procedimiento según la reivindicación 39, en
el que dicho fragmento de anticuerpo es un fragmento Fv de cadena
sencilla.
41. Procedimiento según la reivindicación 40, en
el que dicho fragmento de anticuerpo es un Fv de cadena sencilla de
antirreceptor de transferrina ((TfRscFv).
42. Procedimiento según la reivindicación 40, en
el que dicho fragmento de anticuerpo es un Fv de cadena sencilla de
anti-HER-2.
43. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 39 a 42, en el que dicho fragmento de anticuerpo
comprende un resto de cisteína en un extremo carboxilo terminal
antes del mezclado con dicho liposoma catiónico.
44. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 34 a 43, en el que dicho liposoma catiónico
comprende una mezcla de fosfato de dioleiltrimetilamonio y
dioleilfosfatidiletanolamina, colesterol o una combinación de los
mismos, o una mezcla de bromuro de dimetildioctadecilamonio y
dioleilfosfatidiletanolamina, colesterol o una combinación de los
mismos.
45. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 34 a 44, en el que dicho agente es un agente
terapéutico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25.
46. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 34 a 44, en el que dicho agente es un agente de
diagnóstico según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.
47. Complejo de inmunoliposoma que comprende un
anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un liposoma catiónico y un
agente de diagnóstico o terapéutico, en el que dicho anticuerpo o
fragmento de anticuerpo se compleja con, pero no está químicamente
conjugado a dicho liposoma catiónico.
48. Complejo de inmunoliposoma según la
reivindicación 47, que comprende un agente terapéutico según
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25.
49. Complejo de inmunoliposoma según la
reivindicación 47, que comprende un agente de diagnóstico según
cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.
50. Complejo de inmunoliposoma según cualquiera
de las reivindicaciones 47 a 49, en el que dicho complejo se formula
como una formulación farmacéuticamente aceptable para la
administración in vivo.
51. Complejo de inmunoliposoma según cualquiera
de las reivindicaciones 47 a 50, en el que dicho liposoma está
estabilizado estéricamente.
52. Complejo de polímero catiónico que comprende
un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un polímero catiónico y un
agente de diagnóstico o terapéutico, en el que dicho anticuerpo o
fragmento de anticuerpo se compleja con, pero no está químicamente
conjugado a dicho polímero catiónico.
53. Complejo de polímero catiónico según la
reivindicación 52, que comprende un agente terapéutico según
cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.
54. Complejo de polímero catiónico según la
reivindicación 52, que comprende un agente de diagnóstico según
cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.
55. Complejo de polímero catiónico según
cualquiera de las reivindicaciones 52 a 54, en el que dicho polímero
comprende polietilenimina, polilisina, protamina o dendrímero de
poliamidoamina.
56. Complejo de polímero catiónico según
cualquiera de las reivindicaciones 52 a 55, en el que dicho complejo
se formula como una formulación farmacéuticamente aceptable para la
administración in vivo.
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