JP2018500359A - 表皮成長因子とリポソームのハイブリッド型多層ナノ構造体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、表皮成長因子とリポソームのハイブリッド型多層ナノ構造体及びその製造方法に関するものである。前記新しい形態のハイブリッド型多層ナノ構造体は、表皮成長因子の封入効率が高いだけではなく、その製造過程が簡単であるため、表皮成長因子の高い生理活性を維持しつつ、生体内または細胞内へ伝達することが容易である。

Description

本発明は、表皮成長因子（epidermal growth factor, ＥＧＦ）とリポソームのハイブリッド型多層ナノ構造体及びその製造方法に係り、さらに詳しくは、本発明は、陽イオン性脂質からなる球−小胞体と陰イオン性表皮成長因子たんぱく質との間の多価性静電気的相互作用（multivalent electrostatic interactions）及び疎水性相互作用の組み合わせによって形成される新しい形態のたんぱく質−脂質ハイブリッド型多層ナノ構造体（protein-lipid hybrid multi-lamellar nanostructures）及びその製造方法に関する。

美容に対する関心が高まるにつれ、作用機作が特異的で、かつ効能の良い生理活性たんぱく質が機能性化粧品の材料として脚光を浴びている。しかし、生理活性たんぱく質は、大きな分子量、短い半減期、及び構造的な不安定性のため皮膚へ浸透しにくいので、これら生理活性たんぱく質の皮膚伝達に対する関心が急増している。

生理活性たんぱく質の中、表皮成長因子は、皮膚再生における核心的役割を担当していると知られ、機能性化粧品成分として応用されている。表皮成長因子は、現在アメリカ化粧品協会（ＣＴＦＡ）の国際化粧品原料集（ＩＣＩＤ）に登載されているだけではなく、韓国食品医薬品安全処（ＭＦＤＳ）からも化粧品原料として承認をいただくことにより、国内外で公式的な化粧品原料として用いられるようになった（食品医薬品安全庁告示第２００６−１２号、２００６．４．１２）。

ところが、表皮成長因子のような生理活性たんぱく質成分を皮膚へ伝達する場合の最も大きな問題は、皮膚吸収率（透過率）が低いという点であるが、通常的にこれを克服するための代表的な方法は、リポソームを伝達体として用いて表皮成長因子のような生理活性たんぱく質を皮膚内へ伝達することである。リポソームは、両親媒性脂質の生体細胞膜の構成成分であるリン脂質（phospholipid）を主成分として形成された脂質−二重膜（lipid-bilayer）構造の小胞体（vesicle）であり、その内部の水相（aqueous compartment）に水溶性物質を封入させたり、脂質−二重膜に疎水性薬物を担持させることができる。このようなリポソームの膜構造は、細胞膜の構造に似ていて毒性が少なく、細胞との融合や細胞内移入による物質伝達が可能である。特に、生体適合性に優れるため、伝達体として研究が活発に行われている（Bangham, A.D.; Torchilin, V.P., 2005, Nat. Rev. Drug Discov., 4：145）。

しかし、このような長所にもかかわらず、リポソームはいくつかの問題があり、広く活用されにくい点がある。リポソームの問題のひとつは、リポソームの内部への封入効率が高くないという点である。特に、親水性物質の場合、リポソームの内部の水相にのみ封入が可能であるだけではなく、内部水相の容積が大きくないので、封入効率が低いのは当然である。一般的に約１０〜２０％の封入効率を見せ、リポソームの全体の重量に対して封入されたたんぱく質の量は極めて低い値を有する深刻な技術的限界を見せている（Martins, Susana et al, 2007, Int. J. Nanomed., 2. 4,595）。一方、脂溶性物質の場合、脂質二重膜に可溶化されるので封入効率は比較的良い方であるが、場合によっては脂質二重膜を不安定化させ、リポソームの安定性が不良になる恐れがある。よって、リポソーム技術は一部脂溶性物質に対して商業的に適用されているが、水溶性成分に対してはその使用が非常に稀な状況である。

リポソームをたんぱく質の伝達体として用いる時のさらなる問題は、一般的なリポソームの製造工程では生理活性たんぱく質に激しい変性が加えられ、たんぱく質固有の生理活性が失われるということである。一般的なリポソームの製造方法としては、Ｂａｎｇｈａｍ法（Bangham et al., 1965 J. Mol. Biol. 13:238-252）か、高圧乳化法（high-pressure homogenization）が広く使用されている。Ｂａｎｇｈａｍ法は、ガラス器具で界面活性剤と溶媒を混ぜて溶かてから蒸発させてガラス壁に薄い界面活性剤、即ちリン脂質膜を形成した後、封入したい物質の溶液を入れて激しく攪拌したり、超音波によって均質させてリポソームを製造する。高圧乳化法は、リポソームの構成成分を混合してサブマイクロサイズの微細孔（micro-pore）を有するカートリッジ・セルやバルブ（またはinteraction chamberともいう）を通過させるが、この時、通過する微細孔のサイズは約５０〜３００μｍであり、この時発生する大きなせん断応力（shear stress）により、界面活性剤による二重脂質膜が形成され、薬物が二重リン脂質膜の内部に封入される。これらの方法を用いて生理活性たんぱく質を捕集する場合、たんぱく質が高圧、高温、微細孔でのせん断応力による摩擦熱、それから有機溶媒の使用のような厳しい条件にさらされ、凝集、変性、酸化、分解される恐れがあり、結局これによってたんぱく質固有の生理活性を失う可能性が非常に高い。

例えば、大韓民国登録特許第０７５２９９０号は、中性脂質であるエステル化レシチン（esterified lecithin）を含むリポソーム膜からなるナノリポソームに関するものであり、前記ナノリポソームに上皮成長因子が封入されたナノリポソーム；及び抗炎症活性を有する天然抽出物を含む皮膚疾患の予防または治療用組成物を開示している。大韓民国登録特許第０９６２５６６号は、中性脂質である大豆レシチンを用いて高圧乳化法で生産された人間成長ホルモンを有効成分として含むナノリポソームを開示している。しかし、前記文献に開示された生理活性たんぱく質を含有するリポソームは、有効成分の封入効率が極めて低く、高温／高圧によって製造されるので、たんぱく質の生理活性を激しく低下させるという問題がある。

したがって、伝達構造体を製造する過程において、表皮成長因子の生理活性を安定的に維持すると同時に、高い封入率を確保できる方法を開発することが必要である。従来の研究結果を分析したところによれば、表皮成長因子のような生理活性たんぱく質をリポソームの内部水相内に封入させる効率を高めるため、色んな添加物を用いたり、新しい工程方法を開発する試みが多くあった（Pisal, Dipak S. et al, 2010, J. Pharm. Sci., 99.6, 2557-2575）。但し、全ての試みがリポソームの内部水相にたんぱく質を封入させる効率を高めることに集中されていたという特徴がある。

そこで、本発明者は、表皮成長因子を、高い生理活性を維持しつつ、効率的にリポソームの内部へ併合乃至捕集することができる新しいアプローチ法を開発するため努力した。特に、リポソームの内部水相へ封入させるアプローチ法の枠を破り、リポソームとたんぱく質のより積極的な相互作用を誘導し、新しい形態のナノ構造体を形成する方法に対する研究を行った。特に、陰イオン性を有する生体高分子であるヘキサンが、陽イオン性リポソームとの結合によって新しいナノ構造体を形成させる研究から発想し（Safinya, C. R. at al, 1997, Science, 275.5301, 810-814）、リポソームを製造する過程でたんぱく質を封入させることではなく、リポソームを製造した後、たんぱく質との相互作用によって新しい構造体を形成する方法に対する研究を行った。その結果、陽イオン性脂質からなる球−小胞体と陰イオン性たんぱく質である表皮成長因子との間の多価性静電気的相互作用（multivalent electrostatic interactions）及び疎水性相互作用の組み合わせを適切な条件下で用いる場合、表皮成長因子が生理活性を維持しつつ非常に高い効率で捕集された新しい形態のたんぱく質−脂質ハイブリッド型多層ナノ構造体を形成することができることを確認することにより、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、表皮成長因子と陽イオン性脂質球−小胞体の相互作用によって形成されるハイブリッド型多層ナノ構造体を提供することである。

本発明の他の目的は、表皮成長因子と陽イオン性脂質球−小胞体の混合によって発生する、常温常圧での自発的な自己組立（spontaneous self-assembly）過程を通じてたんぱく質−脂質ハイブリッド型多層ナノ構造体を製造する方法を提供することである。

本発明のまた他の目的は、前記ハイブリッド型多層ナノ構造体を含有する化粧料組成物を提供することである。

本発明によって提供される新しい形態のハイブリッド型多層ナノ構造体は、表皮成長因子の封入効率が高いだけではなく、その製造過程が簡単であるため、表皮成長因子の高い生理活性を維持しつつ、生体内または細胞内へ伝達することが容易である。

本発明の一実施例によるＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の形成過程を簡略に示した模式図である。 本発明の一実施例によって製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体に対する粒子サイズ及び表面電荷を測定した結果である。 本発明の一実施例によって製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体に対する透過度を測定した結果である。 本発明の一実施例によって製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の封入率を測定した結果である。 本発明の一実施例によって製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の実際の構造をＣｒｙｏ−ＴＥＭで測定した結果である。 本発明の一実施例によって製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の安定性を確認した結果である。 本発明の一実施例によって製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の皮膚透過特性を測定した結果である（図７ａ：皮膚表面、図７ｂ：皮膚断面）。

本発明は、表皮成長因子と陽イオン性脂質球−小胞体の相互作用によって形成されるハイブリッド型多層ナノ構造体、表皮成長因子と陽イオン性脂質球−小胞体の自己組立過程によるたんぱく質−脂質ハイブリッド型多層ナノ構造体を製造する方法及び前記ハイブリッド型多層ナノ構造体を含有する化粧品組成物を提供する。

以下、本発明をより詳しく説明する。
本発明は、
（ａ）陽イオン性脂質二重膜構造で構成された、内部が空である球−単一層リポソーム；
（ｂ）前記球−単一層リポソームを囲み、陽イオン性脂質二重膜構造で構成された、一つ以上の単一層リポソーム；及び
（ｃ）表皮成長因子；
を含み、前記表皮成長因子は、前記単一層リポソームの間に静電気的相互作用によって結合して位置することを特徴とする表皮成長因子とリポソームのハイブリッド型多層ナノ構造体（hybrid multi-lamellar nanostructures）に関するものである。

前記陽イオン性脂質は、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＤＯＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＰＯＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＤＭＰＣ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＳＰＣ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＤＰＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane、ＤＯＴＡＰ）、
Ｎ−[１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル]ーＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride、ＤＯＴＭＡ）、
３β−[Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル]コレステロール（3β[Ｎ−（Ｎ',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol、ＤＣ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ジオレオイルグルタミド（dioleoyl glutamide）、ジステアロイルグルタミド（distearoyl glutamide）、ジパルミトイルグルタミド（dipalmitoyl glutamide）、ジオレオイルアスパルタミド（dioleoyl aspartamide）及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（dimethyldioctadecylammonium bromide、ＤＤＡＢ）からなる群より選択された単独または２種以上であり得るが、これに限定されるものではない。

前記球−単一層リポソームのゼータ電位値（zeta potential、または表面電荷）は、＋１〜１００ｍＶ、好ましくは＋３０ｍＶ以上であり得る。

前記ハイブリッド型多層ナノ構造体の粒子サイズは５０〜９００ｎｍ、好ましくは５０〜５００ｎｍ、より好ましくは１００〜２００ｎｍであり得る。前記ナノ構造体の粒子サイズが９００ｎｍ以上である場合、サイズが大きくて皮膚透過が難しく、表皮成長因子を皮膚内へ伝達するのに不適合である。前記ナノ構造体の粒子サイズが５０ｎｍ以下である場合、ナノ粒子に対する人体内への有害性が立証されておらず、安全性に問題がある恐れがある。

前記ハイブリッド型多層ナノ構造体内の表皮成長因子と陽イオン性脂質との間の重量比（ｗ／ｗ）は、０．００１乃至２．５：１、好ましくは０．００１乃至２．３：１、より好ましくは０．００１乃至２．０：１であり得る。前記表皮成長因子と陽イオン性脂質との間の重量比（ｗ／ｗ）が０．００１：１以下である場合、多層ナノ構造体が形成されない恐れがある。前記表皮成長因子と陽イオン性脂質との間の重量比（ｗ／ｗ）が２．５：１以上である場合、多層ナノ構造体のサイズが大きくて皮膚透過が難しく、表皮成長因子を皮膚内へ伝達するのに不適合である。

前記ハイブリッド型多層ナノ構造体内の表皮成長因子の封入率は６０％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上であり得る。

前記表皮成長因子はセルトリオンで再組合たんぱく質の形態で製造して使用したり、または販売所から購入して使用することができる。

本発明の「ハイブリッド型多層ナノ構造体（hybrid multi-lamellar nanostructures）」は、陽イオン性脂質球−小胞体と、これとは反対の陰電荷を有する表皮成長因子との多価性静電気的及び疎水性相互作用によって形成された新しいナノ構造体である。より詳しくは、図１に示すように、球−小胞体と表皮成長因子との間の自発的な自己組立（spontaneous self-assembly）過程を通じて再組合された形態で新しいハイブリッド型多層ナノ構造体を形成することができる。

本発明の「球−小胞体」は内部空間が空いている小胞体で、より具体的には、二重脂質膜からなる一般的なリポソームを意味し、さらに具体的に、本発明においては「球−単一層リポソーム」を意味する。

本発明の「一つ以上の単一層リポソーム」は、リポソーム粒子内に複数個の非−同心円的（non-concentric）内部水性チャンバーを有する多層小胞リポソーム（multivesicular liposome；ＭＶＬ）、水性層が散在された脂質二重層（lipid bilayer）からなる一連の実質的に球形の外皮（shell）を有する多層小胞リポソーム（ＭＶＬ）であり得るが、これに限定されるものではない。

また、本発明は、
（１）陽イオン性脂質からなり、粒子サイズが均一な、内部が空いている球−単一層リポソーム含有溶液を製造するステップ；
（２）表皮成長因子含有水溶液を製造するステップ；及び
（３）前記ステップ（１）で得られた球−単一層リポソーム含有溶液と、前記ステップ（２）で得られた表皮成長因子含有水溶液とを混合するステップ;
を含むハイブリッド型多層ナノ構造体の製造方法に関するものである。

前記ステップ（１）において、陽イオン性脂質は、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＤＯＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＰＯＰＣ）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＤＭＰＣ）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＳＰＣ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＤＰＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane、ＤＯＴＡＰ）、
Ｎ−[１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル]ーＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride、ＤＯＴＭＡ）、
３β−[Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル]コレステロール（3β[Ｎ−(Ｎ',Ｎ'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol、ＤＣ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ジオレオイルグルタミド（dioleoyl glutamide）、ジステアロイルグルタミド（distearoyl glutamide）、ジパルミトイルグルタミド（dipalmitoyl glutamide）、ジオレオイルアスパルタミド（dioleoyl aspartamide）及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（dimethyldioctadecylammonium bromide、ＤＤＡＢ）からなる群より選択された単独または２種以上であり得るが、これに限定されるものではない。

前記ステップ（１）において、球−単一層リポソームは、一般的にリポソームを製造する方法によって製造することができる。前記リポソーム製造方法は、Ｂａｎｇｈａｍ方法、乾燥フィルム水和法（dry lipid hydration）、液体窒素で冷凍させてから室温で溶かす過程を繰り返す凍結−融解法（freeze and thawing）、押出法（extrusion method）、超音波法（sonication）及び高圧乳化法（microfluidizer）などからなる群より選択することができ、これに限定されるものではない。

前記ステップ（１）によって製造した球−単一層リポソームの粒子サイズは、１００〜３００ｎｍ、好ましくは１００〜２５０ｎｍ、より好ましくは１００〜２００ｎｍであり得る。

前記ステップ（３）では、表皮成長因子と球−単一層リポソームが多価性静電気的及び疎水性相互作用によって結合することにより、新しいたんぱく質−脂質ハイブリッド型多層ナノ構造体を形成する。より具体的には、図１に示すように、球−単一層リポソームと表皮成長因子との間の多価性静電気的及び疎水性相互作用による自発的な自己組立（spontaneous self-assembly）過程を通じて再組合された形で、図５のようにハイブリッド型多層ナノ構造体を形成する。

前記ハイブリッド型多層ナノ構造体は、
（ａ）陽イオン性脂質二重膜構造で構成された、内部が空いている球−単一層リポソーム；
（ｂ）前記球−単一層リポソームを囲み、かつ陽イオン性脂質二重膜構造で構成された一つ以上の単一層リポソーム；及び
（ｃ）表皮成長因子；
を含み、前記表皮成長因子は前記単一層リポソームの間に位置する。

前記ハイブリッド型多層ナノ構造体の粒子サイズは、５０〜９００ｎｍ、好ましくは５０〜５００ｎｍ、より好ましくは１００〜２００ｎｍであり得る。

前記ハイブリッド型多層ナノ構造体内の表皮成長因子と陽イオン性脂質との間の重量比（ｗ／ｗ）は０．００１乃至２．５：１、好ましくは０．００１乃至２．３：１、より好ましくは０．００１乃至２．０：１であり得る。

前記ハイブリッド型多層ナノ構造体内の表皮成長因子の封入率は６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であり得る。

一般的なリポソームの製造過程とは違い、本発明による製造方法は、予め目的するサイズの脂質球−小胞体（球−単一層リポソーム）を製造してから生理活性成分と混合するため、生理活性成分である表皮成長因子がリポソームの製造過程においての高圧、高温、あるいは強酸性溶液にさらされる過程が省略されることにより、表皮成長因子の生理活性を維持することができるというメリットがある。

また、本発明は、前記ハイブリッド型多層ナノ構造体を含有する化粧料組成物に関するものである。

前記ハイブリッド型多層ナノ構造体は、皮膚の真皮まで透過することができるが、これに限定されるものではない。

本発明の化粧料組成物は、その種類が特に限定されるものではなく、製造しようとする剤形によって、発明が属する技術分野において通常的に用いられる化粧料組成物配合成分を含むことができる。本発明の化粧料組成物は、化粧水、乳液、栄養クリーム、パック、美容液、エッセンスなどの剤形で製造することができ、製造しようとする剤形によって、さらに油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを選択して配合添加することができる。

以下、実施例、実験例及び剤形例を通じて本発明をより詳しく説明する。下記の実施例、実験例及び剤形例は、ただ本発明の例示的な記載であるだけであり、本発明の範囲がこの実施例、実験例及び剤形例によって制限されるものではない。

実施例１．ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の製造
１．１ ＤＯＴＡＰを含む陽イオン性球−単一層リポソームの製造

陽イオン性脂質であるＤＯＴＡＰ（２０．９６ｍｇ，Avanti Polar Lipid, Inc.）をクロロフォルム１ｍｌに溶かしてから、丸いフラスコガラス容器で混合した。
回転蒸留濃縮装置（rotary evaporator）で、低速で脂質溶液に窒素ガスを流し込んでクロロフォルムを除去して乾燥し、薄い脂質フィルム膜を形成した。
形成された脂質フィルム膜を１２時間真空でさらに乾燥し、残余クロロフォルムを完全に除去した。得られた脂質フィルム膜に精製水１ｍｌを加え、３７℃で２時間攪拌して脂質球−小胞体を製造した。得られた脂質球−小胞体を孔サイズが１００ｎｍであるポリカーボネート膜（policarbonate membrain）（Avanti Polar Lipid, Inc.）を用いて押出法で数回繰り返し透過させ、粒子サイズが均一なＤＯＴＡＰを含む陽イオン性球−単一層リポソームを製造した。

１．２．ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の製造

実施例１．１において製造されたＤＯＴＡＰを含む陽イオン性球−単一層リポソーム溶液（５００μｌ）とＥＧＦ溶液（５００μｌ、Celltrion, Inc.）を常温で精製水上で混合し、ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体を製造した。製造されたナノ構造体は、使用前まで４℃で保管した。

実験例１．ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の形成評価
１．１．陽イオン性球−単一層リポソーム形成の確認

実施例１．１において製造された陽イオン性球−単一層リポソームは、動的光散乱法（dynamic light scattering）（ＤＬＳ，ＥＬＳＺ−１０００，Otsuka Electronics）を用いて、粒子サイズとゼータ電位値を各々測定し、その結果を下記表１に示した。測定結果、粒子サイズが２００ｎｍで、表面電荷が陽電荷である陽イオン性球−単一層リポソームを獲得した。

１．２．ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の形成の確認

実施例１．２．において製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の粒子サイズとゼータ電位値をＤＬＳを用いて測定し、透過度を分光分析機（spectrophotometer, Jasco-815, Jasco. Inc.）を用いて５００ｎｍで測定した。その結果を図２及び図３に示した。

図２に示すように、ＥＧＦ／ＤＯＴＡＰの重量比率が２以下である範囲では、ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の粒子サイズはＤＯＴＡＰ球−単一層リポソームの粒子サイズに等しい２００ｎｍ位のサイズを維持する一方、ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の表面電荷は球−単一層リポソームに比べて減少することが分かる。これは、陰電荷を帯びるＥＧＦが陽イオン性球−単一層リポソームと静電気的相互作用によって結合することにより、新しい形態の構造体を形成するためであると予想される。

図３に示すように、ＥＧＦ／ＤＯＴＡＰの重量比率が２以下である範囲では、透過度が一定に維持される一方、それ以上の範囲では透過度が減少することが分かる。これは、ＥＧＦの濃度が高くなるにつれ、陽イオン性球−単一層リポソームと結合できず、凝集されるＥＧＦの量が増加するためであると予想される。

実験例２．ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の封入効率の平価

ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体内に封入されたＥＧＦの量を測定するため、実施例１．２．で製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体（１ｍｌ）を超遠心機（２００，０００×ｇ、２時間、４℃、Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて、封入されていないｆｒｅｅＥＧＦを分離した。マイクロＢＣＡ定量分析（ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ａｓｓａｙ）とＥＬＩＳＡ分析（ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ）を用いて分離されたｆｒｅｅＥＧＦの量を測定した。その結果を図４に示した。

図４に示すように、ＥＧＦの定量方法によって多少の差はあるが、大抵のＥＧＦ／ＤＯＴＡＰ重量比率において６０％以上の高い封入効率を見せた。

一般的なリポソーム内の封入効率が１０〜２０％に留まることに比べて、本発明による構造体の封入効率は桁違いであることが分かる。

実験例３．ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の多層状構造形成の確認

ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の多層状構造形成を確認するため、水溶液上に存在する粒子性物質を原型そのまま観察できるようにしてくれるエタン急速凍結法（plunge-dipping method）を用いて凍結電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）で観察した。実施例１．２．で製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体４μｌを、専用グリッド（lacey grid）に移して薄いフィルム膜が形成されるように用意した。薄い水溶液状のフィルム膜は溶媒が蒸発されないように適切な温度と９７〜９９％の湿度が維持されるようにしてから、急速で液体エタン（約−１７０℃）中に落下させ、単一層の凍結試料を作成した。こうして作成された凍結試料を加速電圧（３００ｋＶ）下で透過電子顕微鏡（ＪＥＭ−３０１１、ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．）で観察し、ガタンデジタルマイクログラフプログラム（Gatan Digital Micrograph program）でデータを分析した。

図５に示すように、ＥＧＦとＤＯＴＡＰの静電気的引力によって、ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の多層状構造の形成を確認した。

実験例４．ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の安定性の確認

ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体におけるＥＧＦの構造的変化を通じてたんぱく質の安定性を確認するため、円偏光二色性（Circular Dichroism、ＣＤ）を１８０〜２６０ｎｍの範囲でＪａｓｃｏ−８１５ＣＤ分光偏光計（spectropolarimeter、 Ｊａｓｃｏ−８１５、Ｊａｓｃｏ．Ｉｎｃ．）で測定した。実施例１．２．で製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体を０．５ｍｍ経路長さセル（path length cell）に入れて分析した。対照群として、ナノ構造体に捕集していないｆｒｅｅＥＧＦを使用し、温度によって１００日間のＥＧＦ構造的変化を比べてみた。ＣＤデータは図６に示した。

図６に示すように、対照群（ＥＧＦ）に比べると、４℃に保管されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体（ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰ、４℃）と、常温に保管されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体（ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰ、常温）において、ＥＧＦは物理的にあまり変化されないことが確認された。

実験例５．ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の皮膚透過確認

ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体の皮膚透過能力を確認するため、無毛マウス（ＳＫＨ−１ Ｈａｉｒｌｅｓｓ、５週、Orientbio、Korea）を用いた。ＰＤＭＳモールド（直径０．８ｃｍ、高さ０．５ｃｍ）をマウスの背中に固定させ、蛍光物質（ＦＩＴＣ）とＥＧＦ、ＤＯＴＡＰ、または実施例１．２．で製造されたＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体を反応させたサンプル５０ｍｌをＰＤＭＳモールドにローディングし、マウスの皮膚と１時間反応させた。マウスから分離した皮膚を冷凍組織切片機（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０、Leica Microsystems）で切開した後、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ３０００Ｂ、Leica Microsystems）で観察した。

図７ａに示すように、ＥＧＦとＤＯＴＡＰを単独で処理したものは表皮を通過することができず、皮膚表面に沈着される傾向を見せるが、ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体は皮膚表面に残っていないことが確認された。

また、図７ｂに示すように、マイクロトム（Microtome）を用いて皮膚断面を観察した結果、ＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体は、皮膚の表皮から真皮まで透過されていることが確認された。

以上の実験例の結果に基づき、本発明のＥＧＦ−ＤＯＴＡＰハイブリッド型多層ナノ構造体を含有する化粧料組成物の剤形を提示する。しかし、本発明の組成物が下記の剤形例に制限されるものではない。

剤形例１．柔軟化粧水（スキンローション）

下記表２に示すように、通常の方法によって柔軟化粧水を製造した。

剤形例２．栄養化粧水（ミルクローション）

下記表３に示すように、通常の方法によって栄養化粧水を製造した。

剤形例３．エッセンス

下記表４に示すように、通常の方法によってエッセンスを製造した。

剤形例４．栄養クリーム

下記表５に示すように、通常の方法によって栄養クリームを製造した。

剤形例５．パック

下記表６に示すように、通常の方法によってパックを製造した。

Claims (10)

1. （ａ）陽イオン性脂質二重膜構造で構成された、内部が空である球−単一層リポソーム；
   （ｂ）前記球−単一層リポソームを囲み、陽イオン性脂質二重膜構造で構成された、一つ以上の単一層リポソーム；及び
   （ｃ）表皮成長因子；
   を含み、前記表皮成長因子は、前記単一層リポソームの間に静電気的相互作用によって結合して位置することを特徴とする、表皮成長因子とリポソームのハイブリッド型多層ナノ構造体（hybrid multi-lamellar nanostructure）。
2. 前記陽イオン性脂質が、
   １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＤＯＰＣ）、
   １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＰＯＰＣ）、
   １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＤＭＰＣ）、
   １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＳＰＣ）、
   １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（1-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine、ＥＤＰＰＣ）、
   １，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane、ＤＯＴＡＰ）、
   Ｎ−[１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル]ーＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride、ＤＯＴＭＡ）、
   ３β−[Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル]コレステロール（3β[Ｎ−（Ｎ',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]cholesterol、ＤＣ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ジオレオイルグルタミド（dioleoyl glutamide）、ジステアロイルグルタミド（distearoyl glutamide）、ジパルミトイルグルタミド（dipalmitoyl glutamide）、ジオレオイルアスパルタミド（dioleoyl aspartamide）及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（dimethyldioctadecylammonium bromide、ＤＤＡＢ）からなる群より選択された単独または２種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のナノ構造体。
3. 前記ハイブリッド型多層ナノ構造体の粒子サイズが５０〜５００ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載のナノ構造体。
4. 前記球−単一層リポソームのゼータ電位値が＋１〜１００ｍＶであることを特徴とする、請求項１に記載のナノ構造体。
5. 前記表皮成長因子と陽イオン性脂質の重量比（ｗ／ｗ）が０．００１乃至２．５：１であることを特徴とする、請求項１に記載のナノ構造体。
6. 前記ハイブリッド型多層ナノ構造体内の表皮成長因子の封入率が６０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載のナノ構造体。
7. （１）陽イオン性脂質からなり、粒子サイズが均一な、内部が空いている球−単一層リポソーム含有溶液を製造するステップ；
   （２）表皮成長因子含有水溶液を製造するステップ；及び
   （３）前記ステップ（１）で得られた球−単一層リポソーム含有溶液と、前記ステップ（２）で得られた表皮成長因子含有水溶液とを混合するステップ；
   を含む、請求項１乃至６のいずれか１項のハイブリッド型多層ナノ構造体の製造方法。
8. 前記ステップ１によって製造した球−単一層リポソームの粒子サイズが１００〜３００ｎｍであることを特徴とする、請求項７に記載のナノ構造体の製造方法。
9. 請求項１乃至６のいずれか１項に記載のハイブリッド型多層ナノ構造体を有効成分として含む化粧料組成物。
10. 前記ハイブリッド型多層ナノ構造体が皮膚の真皮まで透過することを特徴とする、請求項９に記載の化粧料組成物。