TWI391149B - 小粒徑聚乙二醇化微脂體及其製備方法 - Google Patents

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小粒徑聚乙二醇化微脂體及其製備方法
本發明是有關於一種微脂體(liposome)，特別是指一種粒徑小於73nm之聚乙二醇化微脂體(pegylated liposome)及其製備方法。
微脂體主要是磷脂質(phospholipids)所構成，是一種具有密閉脂質雙層膜(lipid bilayer)的囊泡(vesicle)載體，可包覆親脂性物質於該脂質雙層膜之夾層中，亦可包覆親水性物質於該脂質雙層膜所界定出的一個內部空間中，也因為微脂體具有與生物細胞膜結構類似的脂質雙層膜，且具有生物相容性(biocompatibility)以及生物可分解性(biodegradability)，故在醫藥及生物科技領域中逐漸受到重視，亦陸續被應用於基因治療與藥物傳遞等研究及臨床試驗中。
微脂體依型態之分類一般可被區分為：多層囊泡(multilamellar vesicle,MLV)，粒徑約為0.4至3.5μm；單層大胞囊(large unilamellar vesicle,LUV)，粒徑約為0.2至1μm；單層小囊泡(small unilamellar vesicle,SUV)，粒徑約為20至100nm。各種微脂體有其適用特性，MLV有層層釋出內含包容物的特性，例如：持續性釋放(sustained release)；LUV因內部水相體積較大，具有較高的藥物包覆能力；SUV則因為粒徑很小，較不易被免疫細胞清除，可穿過血管壁。
而聚乙二醇化微脂體(以下簡稱PEG微脂體)則是利用聚乙二醇化技術(PEGylation technology)，使得聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)與被修飾之藥物偶聯以生成具有保護性的新分子結構(putative new molecular entity,pNME)，並改善藥物的立體穩定性及生物活性，使其可迴避生物體血管之網狀內皮組織系統(reticuloendothelial system)的辨識，從而延長微脂體在血液循環系統中的滯留時間，可作為經由血液傳輸之藥物或造影劑的載體，故適用於進入腫瘤組織中以產生標靶藥物或標靶造影的功能，並達到藥物治療或腫瘤診斷造影的目的。
目前用以製備PEG微脂體的方法中，一般以結合薄膜水合(hydration)與微孔擠壓(pore-extrusion)的方式被認為較具經濟效益並可供產業上量產的潛力，例如Santos等人於Biochimica et Biophysica Acta 2002,1561,p.188-201揭示將二硬脂酸磷脂醯膽鹼(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DSPC)、膽固醇(cholesterol)以及二硬脂磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethyleneglycol),DSPE-PEG]以50:45:5mol/mol/mol之莫耳比例混合並溶解於氯仿(chloroform)中，接著於氮氣環境下將氯仿移除而形成一脂質薄膜(lipid film)，之後再加入一水性基質(為HEPES buffered saline,HBS)在65℃的操作溫度下進行水合，使得初形成的微脂體粒子將少量的水性基質包封在其內部，並得到多層囊泡(multilamellar vesicle,MLV)之微脂體，之後將該等多層囊泡以一擠壓裝置擠壓通過100nm孔徑的聚碳酸酯過濾膜(polycarbonate filter)，並重複該擠壓步驟10次以對該等多層囊泡進行一微孔擠壓處理，之後可得到粒徑為100±30nm之單層囊泡PEG微脂體；而如TW200503777所揭示之製法，為將磷脂化合物(如磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholines,PC)、膽固醇以及一聚乙二醇-衍生的化合物以5~10:2~10:1之莫耳比例，在45~70℃下加入一溶劑中以形成一混合物，之後維持此溫度範圍直接以一硫酸銨[ammonium sulfate,(NH4 )2 SO4 ]水溶液進行水合，接著通過100、50nm孔徑的過濾器以進行兩階段的孔擠壓處理，並以蔗糖水溶液進行透析，所製得PEG微脂體的平均粒徑72.9nm。
如上所述之傳統方法製備PEG微脂體皆是建議在45~70℃的溫度下進行，較佳的操作溫度是60℃或65℃，將該水性基質包封在其所界定出的內部空間中，之後再進行微孔擠壓處理，而依傳統方法所製得之PEG微脂體的平均粒徑一般約介於70~120nm之間，若能使得PEG微脂體的粒徑降低，除了不易被免疫細胞及網狀內皮系統清除之外；更可提高微脂體穿透腫瘤新生血管壁的漏洞以及血管間隙的比例，使包裹抗癌藥物或造影劑的PEG微脂體能大量累積在腫瘤組織中，以增進PEG微脂體在腫瘤之診斷與治療上的利用效能；另有利於穿越血腦屏障(blood brain barrier)，應用於腦腫瘤的診斷與治療。
有鑑於PEG微脂體依傳統之製備方法所得之平均粒徑較大，於是本案發明人跳脫傳統製備方法，反向地提高製備方法中的水合溫度至磷脂化合物、膽固醇以及聚乙二醇衍生物之混合物的相轉移溫度(phase transition temperature,Tc )，以降低PEG微脂體之粒徑，經由實際實驗驗證確認，前述製法上之改良可明顯降低PEG微脂體的顆粒大小，以增加其穿透血管間隙的功效與比例，並促進PEG微脂體於臨床醫療上的實用性與功效。
因此，本發明之第一目的，即在提供一種小粒徑聚乙二醇化微脂體的製備方法，包含之步驟為：
(a)　將一磷脂化合物、膽固醇、一磷脂醯乙醇胺之聚乙二醇衍生物及一溶劑在71~86℃下混合，以形成一混合物，其中，該磷脂化合物、膽固醇及磷脂醯乙醇胺之聚乙二醇衍生物的用量比例以莫耳數計是13~7:10~4:1；
(b)　移除該混合物中的溶劑，以得到一脂質薄膜；
(c)　加入一水性基質，使該水性基質與該脂質薄膜在71~86℃下混合並進行水合，以得到懸浮於該水性基質中的至少一個多層囊泡；以及
(d)　對步驟(c)的該等多層囊泡施予一微孔擠壓處理，以得到該聚乙二醇化微脂體。
本發明之第二目的，即在提供一種小粒徑聚乙二醇化微脂體，係包含由一磷脂化合物、膽固醇及一磷脂醯乙醇胺之聚乙二醇衍生物所形成的脂質雙層膜，以及一由該脂質雙層膜所界定出的一個內部空間，且該聚乙二醇化微脂體的粒徑是介於50~73nm之間。
本發明小粒徑聚乙二醇化微脂體及其製備方法之功效在於：發明人使用有別於傳統之一較高的水合溫度，以製得粒徑大幅降低的PEG微脂體，可適用於包覆生理活性物質如抗癌藥物或顯影劑，以增進PEG微脂體在腫瘤診斷及治療上的應用及效能。
較佳地，本發明小粒徑聚乙二醇化微脂體之製備方法之步驟(a)中的磷脂化合物、膽固醇、磷脂醯乙醇胺之聚乙二醇衍生物及該溶劑是在71~86℃下混合。
較佳地，該步驟(a)中的溶劑是選自於氯仿、二氯甲烷，或此等之一組合。
較佳地，該步驟(a)中的磷脂化合物是選自於磷脂醯膽鹼(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamines,PE)、磷脂醯甘油(phosphatidylglycerols,PG)、磷脂醯肌醇(phosphatidylinositols,PI)、神經鞘磷脂(sphingomyelins,SM)、磷脂酸(phosphatidic acids,PA)，前述化合物的二(C12 ~C22 )醯基衍生物，或此等之一組合。
而前述化合物的二(C12 ~C22 )醯基衍生物中的醯基可以選自於月桂醯基(lauroyl)、肉荳蔻醯基(myristoyl)、棕櫚醯基(palmitoyl)、硬脂醯基(stearoyl)、油醯基(oleoyl)，或此等之一組合。故較佳地，該磷脂醯膽鹼的二(C12 ~C22 )醯基衍生物是選自於二月桂酸磷脂醯膽鹼(dilauroyl PC,DLPC)、二肉荳蔻酸磷脂醯膽鹼(dimyristoyl PC,DMPC)、二棕櫚酸磷脂醯膽鹼(dipalmitoyl PC,DPPC)、二硬脂酸磷脂醯膽鹼(distearoyl PC,DSPC)、二油酸磷脂醯膽鹼(dioleoyl PC,DOPC)、二亞麻油酸磷脂醯膽鹼(dilinoleoyl PC,DlPC)、1-棕櫚酸-2-油酸磷脂醯膽鹼(1-palmitoyl-2-oleoyl PC,POPC)，二花生酸磷脂醯膽鹼(diarachidonoyl PC,DAPC)或此等之一組合。更佳地，是二硬脂酸磷脂醯膽鹼(DSPC)，因此，本發明之較佳實施例以及比較例中的磷脂化合物是使用DSPC。
較佳地，該步驟(a)中的磷脂醯乙醇胺之聚乙二醇衍生物是選自於二硬脂磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇1000~5000[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethyleneglycol) 1000~5000,例如DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000、DSPE-PEG4000、DSPE-PEG5000等]。更佳地，是DSPE-PEG2000，因此，本發明之較佳實施例以及比較例中的磷脂醯乙醇胺之聚乙二醇衍生物是使用DSPE-PEG2000。
較佳地，該步驟(c)中的水性基質與該脂質薄膜是在76~86℃下進行水合。其中，該步驟(c)中的水性基質與脂質薄膜混合並進行水合的方式是藉由手搖(hand-shaking)、均質混合(homogenization)、超音波震盪(sonication)、震盪(vortex)、旋轉(swirling)，使得脂質薄膜自瓶壁剝離且與水性基質水合，以得到懸浮於該水性基質中的多層囊泡，而於本發明之較佳實施例中，是使用手搖法來達成。
較佳地，以該水性基質的體積來計算，該水性基質中所含該步驟(a)的溶質混合物之莫耳濃度是介於2.4~65μmole/mL之間。
本發明方法之步驟(d)之前，可進行冷凍解凍(freeze and thaw)法或超音波法(sonication)，使多層囊泡先經過分裂後再組合的程序，有助於進一步降低後續微孔擠壓處理後所得之PEG微脂體的粒徑。
經過該步驟(d)之微孔擠壓處理所得的PEG微脂體，亦可進一步進行管柱純化程序，以分離未被包埋的水性基質，例如可使用Sephadex G-50等純化用管柱移除未包埋之硫酸銨。
較佳地，本發明之聚乙二醇化微脂體的粒徑是介於50~69nm之間。
較佳地，本發明之聚乙二醇化微脂體之內部空間中係用於包含一生理活性成分、一顯影劑，或此等之一組合。
較佳地，該造影劑是擇自於放射性同位素及其衍生物、螢光物質等。
本發明將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。
＜儀器設備＞
1.旋轉蒸發器：廠牌：Yamato，型號：Re440。
2.擠壓機：廠牌：Northern Lipids，型號：LIPEX-10。
3.粒徑分析儀(particle size analyzer)：廠牌：Malvern Instruments，型號：ZetaSizer3000。
4.Sephadex G-50管柱：廠牌：GE Healthcare，型號：17-0573-01。
＜化學品來源＞
1.二硬脂酸磷脂醯膽鹼【1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DSPC,FW=790】：廠牌為Genzyne，型號為LP-P4-076。
2.二硬脂磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇2000【1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethyleneglycol)2000,FW=2800】：廠牌為Genzyne，型號為LP-R4-039。
3.膽固醇【cholesterol,FW=386.66】：廠牌為SIGMA，型號為C8667-2SG。
4.氯仿【chloroform】：廠牌為Merck，型號為K31917145。
5.硫酸銨【ammonium sulfate】：廠牌為Merck，型號為A695617907。
＜實施例1＞PEG微脂體之製備
本實施例的製備步驟如下：
(1)　分別取65μmole(即0.0513g)二硬脂酸磷脂醯膽鹼(DSPC)、43μmole(即0.0167g)膽固醇和6.5μmole(即0.0182g)二硬脂磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)加入10mL氯仿(即溶劑)中，並在一81℃的水浴中混合以形成一混合物，故本實施例所使用的磷脂化合物(DSPC)、膽固醇及磷脂醯乙醇胺之聚乙二醇衍生物(DSPE-PEG2000)的莫耳比例是10:6.7:1；
(2)　使用一旋轉蒸發器於真空下將該混合物中的氯仿蒸發，至其在該旋轉蒸發器之圓底燒瓶內壁形成一脂質薄膜；
(3)　在一81℃的水浴中，加入濃度為250mM的硫酸銨水溶液(即水性基質)至該圓底燒瓶中，以手搖使脂質薄膜自瓶壁剝離且與硫酸銨水溶液水合，以得到懸浮該硫酸銨水溶液中的多層囊泡；及
(4)　將該步驟(3)所得之多層囊泡進行冷凍解凍法操作5次，接著使用LIPEX-10擠壓機將該等多層囊泡以氮氣擠壓依序通過200nm、100nm、50nm孔徑大小的聚碳酸酯薄膜，即可獲得單層小囊泡之PEG微脂體。
＜實施例2~4＞
實施例2~4是以與實施例1相同的製備步驟製備本發明PEG微脂體，不同之處在於：該步驟(3)的水浴溫度(即水合溫度)，分別為71、76、86℃；
＜比較例1＞
比較例1的製備步驟與條件分別與實施例1~4相同，除了水合溫度是65℃。
各實施例及比較例於製備步驟中的反應條件整理如下表1所示：
[微脂體粒徑之測定]
發明人將實施例1~4及比較例1製得之PEG微脂體通過Sephadex G-50管柱以移除未包埋之水性基質(硫酸銨水溶液)，接著再以ZetaSizer3000測量各組經Sephadex G-50管柱純化後之PEG微脂體粒徑，可分別得到如圖1(A)~(D)及圖1(E)之粒徑分布圖，該等粒徑分析的統計結果及其製備條件亦表示於上表1中。
由表1之粒徑分析結果，可看出實施例1~4採用不同於習知須限制水合溫度於低溫範圍(45~70℃)的方式，以71~86℃之水合溫度所製得之PEG微脂體粒徑(分別為55.8nm、72.8nm、70.8nm、72.7nm)，相較於比較例1於65℃之水合溫度下所製得之PEG微脂體粒徑(89.0nm)，可看出本發明方法可獲得粒子尺寸明顯減小的PEG微脂體；實施例1採用81℃的水合溫度，當降低溫度(即實施例2、3之71及76℃)或提高溫度(即實施例4之86℃)所製得之PEG微脂體粒徑(72.8、70.8及72.7nm)，皆會提高PEG微脂體粒徑，且顯示於相轉移溫度(81℃)時可獲得最佳粒徑(55.8nm)，故建議71~86℃為PEG微脂體之製備溫度，而以81℃為較佳溫度。
綜上所述，本發明小粒徑聚乙二醇化微脂體及其製備方法所製得之PEG微脂體，其粒徑明顯降低，可適用於包覆生理活性物質如抗癌藥物或造影劑，以增進PEG微脂體在腫瘤診斷及治療上的應用及效能。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
圖1是粒徑分析圖，說明本發明之(A)實施例1、(B)實施例2、(C)實施例3、(D)實施例4及(E)比較例1所製得之PEG微脂體以ZetaSizer3000測量經管柱純化後之粒徑分佈圖。

Claims (2)

  1. 一種小粒徑聚乙二醇化微脂體組成物之製備方法，包含之步驟為：(a)將含有一磷脂化合物、膽固醇、一磷脂醯乙醇胺之聚乙二醇衍生物及一溶劑混合，以形成一混合物，其中，該磷脂化合物、膽固醇及該磷脂醯乙醇胺之聚乙二醇衍生物之莫耳數比例範圍為13~7：10~4：1；(b)移除該混合物中的溶劑，以得到一脂質薄膜；(c)加入一水性基質，使該水性基質與該脂質薄膜在81℃下進行水合，以得到至少一個懸浮於該水性基質中的多層囊泡；以及(d)對步驟(c)的該等多層囊泡進行冷凍解凍法或超音波法，使該等多層囊泡先經過分裂後再組合後，施予一微孔擠壓處理，以得到該小粒徑聚乙二醇化微脂體；其中，該步驟(a)中的磷脂化合物是二硬酯酸磷脂醯膽鹼；該磷脂醯乙醇胺之聚乙二醇衍生物是二硬脂磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇2000。
  2. 依據申請專利範圍第1項所述之小粒徑聚乙二醇化微脂體組成物之製備方法，其中，該步驟(a)中的溶劑是選自於氯仿、二氯甲烷，或此等之一組合。
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