WO2012098937A1 - リポソームの製造方法 - Google Patents

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WO2012098937A1
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liposome
microchannel
gas
producing
phospholipid
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Inventor
洋 鈴木
悦之 菰田
知尚 勝田
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国立大学法人 神戸大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a liposome capable of easily producing a liposome having a uniform particle size without using an organic solvent, further by pressure filtration with carbon dioxide gas or the like, or without heating, and
  • the present invention relates to a liposome obtained by the production method. Furthermore, the present invention relates to such a device for producing liposomes and a production kit.
  • Liposomes are closed vesicles of bilayer membranes (liposome membranes) formed mainly by phospholipids and have similar structures and functions as biological membranes, and thus have been conventionally used as various research materials. Since this liposome can construct a so-called capsule structure in which a water-soluble inclusion agent (for example, a medicinal ingredient) is retained in the aqueous phase inside and an oil-soluble inclusion agent is retained inside the bilayer membrane, It has been used in various fields such as diagnosis, treatment, and makeup. Furthermore, in recent years, application to drug delivery systems (DDS) has been actively studied.
  • DDS drug delivery systems
  • Liposomes encapsulating such encapsulating agents such as medicinal components are aqueous solutions that use a rotary evaporator or the like to form a lipid film at the bottom of the flask under the rotating condition of a round bottom flask in a thermostatic bath, and contain the inclusions therein.
  • a Bangham method that is formed under reduced pressure conditions (Non-patent Document 1). Liposomes obtained by such a bangham method have a wide particle size distribution, and liposomes having a desired particle size have been collected through treatment such as gel filtration. However, in this method, the recovered liposome is only about 1% of the input raw material, and an increase in production cost has been a big problem.
  • Non-patent Document 2 There is a method such as Andreas Jahn as a method for producing liposomes using microchannels (Non-patent Document 2).
  • the flow path has a cross-shaped structure, and a mixture of inclusions, lipids, and an organic solvent is allowed to flow through the central flow path, a buffer solution is flowed from both flow paths, and liposomes are adjusted by adjusting the mixing speed (dilution process) of both.
  • a phospholipid solution dissolved in an organic solvent is introduced into a microchannel, and the organic solvent is dried to form a phospholipid thin film on the wall of the microchannel to generate liposomes.
  • Patent Document 1 a method such as Andreas Jahn as a method for producing liposomes using microchannels.
  • Patent Document 2 As a method of generating liposomes without using an organic solvent, a method of mixing a liposome membrane component substance and an aqueous solution at a phase transition temperature or higher of the liposome membrane component substance and performing pressure filtration with carbon dioxide gas (Patent Document 2), A method of producing a lipid membrane component by mixing a supercritical or subcritical carbon dioxide (carbon dioxide gas) in the presence of a compound having a hydroxyl group (Patent Document 3) is disclosed. However, these methods require pressure filtration with carbon dioxide gas, or supercritical or subcritical carbon dioxide (carbon dioxide gas), which requires complicated steps. In addition, there is a disclosure of a liposome-containing preparation that does not contain an organic solvent. In the manufacturing process of the liposome-containing preparation, the liposome membrane component substance is treated at a phase transition temperature of 40 to 65 ° C. The use of (carbon dioxide) is also a requirement (Patent Document 4).
  • the present invention provides a liposome having a uniform particle size without using an organic solvent, and without performing pressure filtration with carbon dioxide gas, etc., heat treatment for removing the organic solvent, suction treatment or drying treatment. It is an object of the present invention to provide a method for producing liposomes that can be easily produced. It is another object of the present invention to provide a liposome obtained by such a production method, and further to provide a device and a production kit for producing such a liposome.
  • the present inventors have found that in the liposome production process, the phospholipid dispersion liquid and gas, that is, air, inert gas, or a mixture thereof are provided in the microchannel.
  • the manufacturing method which includes the step of introducing a gas mainly containing a gas and mixing the phospholipid dispersion and the gas in the microchannel, the carbon dioxide gas is further used without using an organic solvent.
  • the inventors have found that liposomes having a uniform particle diameter can be produced without performing pressure filtration by means of, etc., heat treatment for removing the organic solvent, suction treatment or drying treatment, thereby completing the present invention.
  • this invention consists of the following.
  • a step of introducing a solution containing no organic solvent and a phospholipid dispersion composed of a phospholipid component and a gas into the microchannel, and mixing the phospholipid dispersion and the gas in the microchannel A method for producing a liposome, comprising: 2. 2. The method for producing a liposome according to item 1 above, wherein the liposome production step does not include a pressure filtration step using carbon dioxide gas. 3. Item 1.
  • the microchannel is a branched microchannel having at least two microchannels in the introduction part and one microchannel in the lead-out part, and includes the following steps: Or the manufacturing method of the liposome as described in 2: 1) a step of introducing a phospholipid dispersion from one microchannel in the introduction part; 2) a step of introducing a gas from the other one microchannel in the introduction section; 3) mixing the phospholipid dispersion and gas in the microchannel; 4) A step of deriving the liposome from the microchannel of the deriving portion. 4). 4. The method for producing a liposome according to any one of items 1 to 3, wherein the inner diameter of the microchannel is 100 to 1000 ⁇ m. 5. 5. 5.
  • a method for producing a liposome containing an encapsulating agent 9. 9. A liposome obtained by the method for producing a liposome according to any one of 1 to 8 above. 10. 10. The device for producing liposomes according to 9 above, comprising a microchannel. 11. 21. A liposome production kit comprising the liposome production device according to item 10 above, and a phospholipid dispersion not containing an organic solvent, an encapsulant and / or a gas introduction syringe.
  • orientation can be performed by adsorbing phospholipids to the gas-liquid interface between the gas and the phospholipid dispersion.
  • a phospholipid solution dissolved in an organic solvent is introduced into a microchannel, and the organic solvent is dried to form a phospholipid thin film on the wall of the microchannel. It was formed to produce liposomes, and an organic solvent was required to adsorb the phospholipid component on the wall surface.
  • phospholipids can be adsorbed on the gas-liquid interface without using an organic solvent, and liposomes can be produced.
  • the organic solvent generally has a problem of toxicity, so it was essential to remove it completely. However, according to the method of the present invention, the possibility of the organic solvent remaining is completely denied by not using the organic solvent. can do.
  • Example 1 It is a figure which shows an example of the apparatus for liposome manufacture of this invention. It is a microscope picture figure which shows the flow of the confluence
  • Example 1 It is a microscope picture figure which shows the mode in the microchannel in the device for liposome manufacture of this invention.
  • Example 1 It is a photograph figure which shows a mode that phospholipid adsorb
  • Example 1 It is a photograph figure which shows the mechanism in which a phospholipid adsorb
  • Example 1 It is a figure which shows the particle size distribution comparison result of the liposome obtained by the liposome manufacturing method of this invention, and the liposome obtained by the bangham method. (Experimental example 1) It is a figure which shows the particle size distribution comparison result of the liposome obtained by the liposome obtained by the liposome manufacturing method of this invention, and the liposome obtained by the method of using a microchannel in the system which does not contain air.
  • Example 2 It is a figure which shows the yield of a liposome when changing a phospholipid dispersion, PBS flow volume, and an air flow rate.
  • Example 3 It is a figure which shows the yield of a liposome when changing the flow rate ratio of a phospholipid dispersion, PBS flow volume, and air flow volume. (Experimental example 3)
  • the method for producing the liposome of the present invention will be described in detail.
  • a solution containing no organic solvent and a phospholipid dispersion liquid composed of a phospholipid component and a gas are introduced into the microchannel, and the phosphorous in the microchannel.
  • the present invention relates to a method for producing a liposome, comprising a step of mixing a lipid dispersion and a gas.
  • the “solution not containing an organic solvent” refers to an aqueous medium that does not contain an organic solvent and can disperse a phospholipid component, and is not particularly limited.
  • water preferably distilled for injection.
  • examples thereof include water, physiological saline, ion-exchanged water, and aqueous media containing about 0.2 to 0.3 M of polyhydric alcohol as an isotonic agent such as glycerin, glucose, saccharose, maltose, etc. in these solutions.
  • the production method of the present invention has an advantage that liposomes can be easily and efficiently formed without using liposome forming aids such as organic solvents, glycyrrhizins and cholic acids during production.
  • the solution containing no organic solvent of the present invention may be an aqueous medium that can dissolve a desired encapsulating agent that can be encapsulated in liposomes, such as a phosphate buffer (PBS).
  • PBS phosphate buffer
  • the “gas” includes a gas mainly composed of air, an inert gas, or a mixture thereof.
  • Examples of the “phospholipid component” used in the production method of the present invention include neutral phospholipids such as lecithin, lysolecithin and / or hydrogenated products and hydroxide derivatives thereof obtained from soybeans, egg yolks, and the like. it can. These may be used alone or in combination.
  • phospholipids include egg yolk, soybean or other phosphatidylcholine derived from animals and plants, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, sphingomyelin, synthetically obtained phosphatidic acid, dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), distearoyl Phosphatidylcholine (DSPC), Dimyristolphosphatidylcholine (DMPC), Dioleylphosphatidylcholine (DOPC), Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), Distearoylphosphatidylserine (DSPS), Distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), Dipalmitoylphosphatidylinositol (DPPI) ), Distearoyl phosphatidylinositol (DSPI), dipalmitoy P
  • phospholipid components are usually used alone, but may be used in combination of two or more.
  • phospholipid dispersion of the present invention
  • other components can be added to the “phospholipid dispersion” of the present invention as desired.
  • sterols such as cholesterol and cholesterol ester as membrane stabilizers or anchors for introducing polyalkylene oxide groups
  • dialkyl phosphates such as dicetyl phosphate which is a charged substance.
  • the “micro channel” is a channel having a length of 2 mm to 5 m having an introduction part and a lead part, and the inner diameter of the channel is 100 to 1000 ⁇ m, preferably 200 to 530 ⁇ m.
  • the channel inner diameter can be appropriately adjusted according to the desired liposome particle diameter.
  • the microchannel of the present invention is preferably a branched microchannel having at least two microchannels in the introduction part and one microchannel in the lead-out part (see FIG. 1). For example, a phospholipid dispersion is introduced from one microchannel in the introduction part, a gas is introduced from the other microchannel in the introduction part, and the phospholipid dispersion and gas are introduced into the integrated microchannel. Can be mixed.
  • the liposome of the present invention is produced by a production method including the following steps.
  • Can be manufactured (see FIG. 1). 1) a step of introducing a phospholipid dispersion from one microchannel in the introduction part; 2) a step of introducing a gas from the other one microchannel in the introduction section; 3) mixing the phospholipid dispersion and gas in the microchannel; 4) A step of deriving the liposome from the microchannel of the deriving portion.
  • Step 1) and Step 2) can be performed simultaneously, and the phospholipid dispersion and gas can be introduced into the microchannel from different introduction portions.
  • an aqueous medium solution not containing an organic solvent
  • an aqueous medium containing an encapsulating agent can be introduced from other microchannels.
  • the encapsulating agent may be mixed with the phospholipid dispersion and used.
  • the method for introducing the phospholipid dispersion and gas into the microchannel in step 1) and step 2) is not particularly limited.
  • a syringe containing the phospholipid dispersion or gas is used for each of the introduction parts. It can couple
  • the encapsulating agent that can be used in the above is water-soluble and is encapsulated in the aqueous phase of the closed space surrounded by the lipid bilayer membrane.
  • Specific examples of the encapsulating agent include water-soluble substances widely used in pharmaceuticals. Specifically, contrast agents, anticancer agents, antioxidant agents, antibacterial agents, anti-inflammatory agents, blood circulation promoters, whitening agents, rough skin prevention agents, anti-aging agents, hair growth promoters, moisturizers, hormone agents, vitamins Class, dyes, and proteins.
  • a compound containing a hydroxyl group or a carboxy group in the molecular structure is preferable from the viewpoint of stability.
  • the encapsulating agent may be introduced into the microchannel simultaneously with the phospholipid dispersion and gas, or may be introduced after the phospholipid dispersion and gas are introduced into the microchannel.
  • the mixing ratio of the phospholipid and the aqueous medium in the phospholipid dispersion is not particularly limited as long as it is a sufficient amount to dissolve the phospholipid, but generally the concentration is 2 to 30 mg / ml. Regulated and used.
  • the amount of the phospholipid dispersion introduced into the microchannel may be an amount that can sufficiently fill the channel according to the volume of the microchannel.
  • the ratio of the phospholipid dispersion flow rate and the gas flow rate introduced is such that the phospholipid dispersion flow rate: gas flow rate is 0.001 to 10: 1, preferably 0.001 to 4: 1. Preferably, it is 0.5-2: 1.
  • the introduced gas flow rate is 1 to 15 ml / hour, preferably 5 to 15 ml / hour, and most preferably 5 to 10 ml / hour.
  • the introduction speed of the phospholipid dispersion is such that the flow rate is 0.0001 to 0.5 m / second, preferably 0.05 to 0.3 m / second, more preferably 0.1 to 0.2 m / second.
  • the temperature of the aqueous solution in the flow path is 15 to 80 ° C., preferably 45 to 65 ° C., more preferably 55 to 62 ° C.
  • the phospholipid can be oriented by adsorbing the phospholipid to the gas-liquid interface between the gas and the phospholipid dispersion.
  • Patent Document 1 described in the Background Art section a phospholipid solution dissolved in an organic solvent is introduced into a microchannel, and the organic solvent is dried to form a phospholipid thin film on the wall of the microchannel.
  • an organic solvent was required to adsorb the phospholipid component on the wall, whereas according to the production method of the present invention, the organic solvent was not required and the phospholipid was formed at the gas-liquid interface. Can be adsorbed and liposomes can be produced (see FIGS. 2 to 4).
  • liposomes can be produced without including a pressure filtration step using carbon dioxide gas in the production step.
  • the present invention extends to a device for producing liposomes.
  • the device for producing liposomes of the present invention includes a microchannel (see FIG. 1).
  • the micro-channel is a channel having a length of 2 mm to 5 m having an introduction part and a lead-out part, and the inner diameter of the channel is 100 to 1000 ⁇ m, preferably 200 to 530 ⁇ m.
  • the inner diameter of the channel is appropriately adjusted depending on the desired liposome particle diameter.
  • the microchannel included in the liposome production device of the present invention is preferably a branched microchannel having at least two microchannels in the introduction part and one microchannel in the lead-out part. It is.
  • the present invention further extends to a liposome production kit including a liposome production device and an introduction syringe.
  • the introduction syringe can be filled with a phospholipid dispersion containing no organic solvent, an encapsulant and / or a gas, and these substances can be introduced into the microchannel.
  • a phospholipid dispersion and an encapsulating agent not containing an organic solvent can be prepared at the time of use.
  • an inclusion agent can be added to a phospholipid dispersion containing no organic solvent and simultaneously introduced into the microchannel.
  • the present invention also extends to liposomes obtained by the above production method.
  • Liposomes produced by the production method of the present invention are discharged from the outlet of the microchannel.
  • the produced liposomes are collected as a precipitate by ordinary means such as centrifugation.
  • the collected liposomes have a uniform particle size depending on the inner diameter of the microchannel, but may be filtered to adjust the particle diameter as desired. Further, addition treatment for preparation, sterilization and the like are performed, and if desired, lyophilized and / or prepared as an aqueous solution preparation.
  • a liposome composed of a multilamellar membrane (Multilamellar vesicles; MLV), a liposome composed of a single membrane LUV having a large particle size (Large unilamellar veislcles), a particle size of less than 50 nm
  • Liposomes (Small unilamellar vesicles) composed of small single-film SUVs may be mentioned, and these may be mixed, but according to the method of the present invention, liposomes having a substantially uniform particle size can be obtained.
  • the liposome produced by the production method of the present invention can be prepared as an aqueous dispersion or lyophilizer of the liposome.
  • the preparation suitable as the liposome containing the encapsulating agent includes an aqueous dispersion formulation in which the encapsulating agent is a water-soluble drug and the liposome encapsulating the water-soluble drug is dispersed in an aqueous solvent.
  • the liposome aqueous dispersion stabilizers, chelating agents, antioxidants, viscosity modifiers, buffers, pH adjusters and the like may be dissolved or dispersed.
  • Various methods are known for preparing such an aqueous dispersion formulation of liposome, and it is appropriately selected according to the purpose, characteristics, use and the like.
  • Example 1 Manufacture of liposomes
  • the liposomes of the present invention were manufactured using a liposome manufacturing device including the microchannel shown in Fig. 1.
  • a phospholipid dispersion was prepared by stirring until 0.002 g of egg yolk lecithin was completely dispersed in 1 ml of ion exchange water.
  • the microchannel (device) to be introduced and the phospholipid dispersion were kept at 60 ° C., and the phospholipid dispersion, air and PBS were introduced into the introduction portion of the three-branch channel having an inner diameter of 270 ⁇ m and a length of 10 cm.
  • Air was introduced at a flow rate of 1 to 15 ml / hour, and at the same time, a phospholipid dispersion and PBS were introduced at a flow rate of 0.0001 to 0.5 m / second.
  • a dispersed aqueous solution of liposomes formed from the outlet of the microchannel was obtained. This aqueous solution was centrifuged at 12000 rpm, and multilamellar liposomes were collected as a precipitate. The precipitate was lyophilized to produce a dry liposome preparation.
  • FIG. 2 shows the flow shown in FIG. 2 at the junction of the branched microchannel.
  • FIG. 3 shows the state in the flow path
  • FIGS. 4A and 4B show the state in which the phospholipid is adsorbed on the gas-liquid interface.
  • Example 1 Particle size distribution 1
  • the particle diameters of the liposomes produced in Example 1 and the liposomes produced by the Bangham method (Non-Patent Document 1) as a comparative example were measured, and the results are shown in FIG.
  • the liposome-dispersed aqueous solution was recovered at the outlet of the flow path, and this was centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes, and recovered as a precipitate of multilamellar liposomes. Thereafter, the precipitate was dispersed in 1 ml of physiological saline, and the particle size of the liposome contained in the obtained solution was measured using a dynamic light scattering method.
  • the horizontal axis represents the liposome particle size (nm), and the vertical axis represents the probability density (%).
  • the solid line is based on the present invention, and the broken line is based on the Bangham method. According to the bangham method as a comparative example, liposomes with various particle sizes were generated by a broad particle size distribution, whereas according to the production method of the present invention, a particle size distribution consisting of one sharp peak was recognized and homogenized. It was confirmed that liposomes having the specified particle size were produced.
  • Example 2 Particle size distribution 2
  • liposomes were produced under conditions including air and not including air.
  • the flow rate of the phospholipid solution and PBS when air was included was 16.7 ⁇ l / min
  • the air flow rate was 5 ml / hour
  • the flow rate of phospholipid solution and PBS when air was not included was 15 ⁇ l / min.
  • the particle size of the obtained liposome was measured by the same method as in Experimental Example 1. As a result, in the liposome produced under conditions containing air, a particle size distribution consisting of one sharp peak was observed, and it was confirmed that liposomes with a uniform particle size were produced (FIG. 6).
  • Example 3 Yield In the liposome production method shown in Example 1, the yield of liposome was measured when the flow rate of phospholipid dispersion and PBS and the air flow rate were changed. The yield was calculated by the weight ratio (%) of the phospholipid (weight) constituting the liposome to the phospholipid (weight) used.
  • Fig. 7 shows the yield of liposomes when the flow rate of phospholipid dispersion and PBS and the air flow rate were changed.
  • the yield of the liposome manufactured by the bangham method as a comparative example was shown with the broken line.
  • the flow rate ratio and yield of the phospholipid dispersion and PBS with respect to the air flow rate are shown in FIG.
  • liposomes could be obtained in high yield when the air flow rate was 1 to 15 ml / hour and the phospholipid dispersion flow rate: air flow rate was 0.001 to 10: 1.
  • the yield is highest when the flow rate ratio between the phospholipid dispersion and the PBS to the air flow rate is near 1, and when the air flow rate is less than 5 ml / hour, The yield was higher when the flow rate ratio of the phospholipid dispersion and PBS to the air flow rate was larger (FIG. 8).
  • a liposome preparation containing a desired encapsulating agent can be obtained in a short time by using a compact liposome production kit or production device. It becomes possible to manufacture, and it is possible to manufacture liposome preparations in hospitals, pharmacies and the like, and it can be used in a stable state.
  • This liposome can construct a so-called capsule structure in which a water-soluble inclusion agent (for example, a medicinal component) is retained in the aqueous phase inside and an oil-soluble inclusion agent is retained in the bilayer membrane.
  • a water-soluble inclusion agent for example, a medicinal component
  • the liposome produced by the production method of the present invention can be used in various fields such as examination (diagnosis), treatment, and makeup. Furthermore, in recent years, application to a drug delivery system (DDS) has been actively studied, and the production method of the present invention can greatly contribute to the spread of liposome preparations.
  • DDS drug delivery system

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Abstract

　本発明は、有機溶媒を使用することなく、さらに炭酸ガス等による加圧濾過を行うことなく、粒子径が均一化されたリポソームを容易に製造しうるリポソームの製造方法を提供する。また、そのような該製造方法により得られたリポソームを提供し、さらには、このようなリポソーム製造用のデバイス並びに製造用キットを提供する。リポソームの生成工程において、マイクロ流路に、リン脂質分散液及び気体を導入し、当該マイクロ流路内でリン脂質分散液と気体を混合させる工程を含むことを特徴とする製造方法による。本製造方法によれば、有機溶媒を使用することなく、さらに炭酸ガス等による加圧濾過や、有機溶媒を除去するための加熱処理、吸引処理や乾燥処理を行うことなく、粒子径が均一化されたリポソームを製造しうる。

Description

リポソームの製造方法
　本発明は、有機溶媒を使用することなく、さらに炭酸ガス等による加圧濾過や、加熱を行うことなく、粒子径が均一化されたリポソームを容易に製造しうるリポソームの製造方法に関し、及び該製造方法により得られたリポソームに関する。さらには、このようなリポソーム製造用のデバイス並びに製造用キットに関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１１－１０４０８号優先権を請求する。
　リポソームは、主にリン脂質によって形成される二分子膜（リポソーム膜）の閉鎖小胞体であり、生体膜と類似の構造や機能を有するため、従来から様々な研究材料として用いられてきている。このリポソームは、内部に有する水相には、水溶性の内包剤（例えば、薬効成分）を、二分子膜の内部には油溶性の内包剤を保持するという、いわゆるカプセル構造を構築できることから、診断、治療、化粧などの様々な分野で用いられてきている。さらに、近年では、薬物送達システム（ＤＤＳ）への応用が盛んに研究されている。
　このような薬効成分などの内包剤を内包したリポソームは、ロータリエバポレータ等を使い、恒温槽にて丸底フラスコの回転条件下でフラスコの底部に脂質膜を形成させ、そこに内包物を含む水溶液を導入して、減圧条件下で形成されるバンガム（Bangham）法がある（非特許文献１）。かかるバンガム法により得られるリポソームは粒子径分布が広く、ゲルろ過等の処理を経て所望の粒径のリポソームの回収を行っていた。しかし、その方法では回収されるリポソームは投入原料のせいぜい１％程度にしかならず、製造コストの高額化が大きな問題であった。
　マイクロ流路を使ったリポソームの製法としてはアンドレアス・ジャーン等の方法がある（非特許文献２）。この方法では、流路が十字構造となり、中央流路に内包物と脂質と有機溶媒の混合物を流し、両側流路から緩衝液を流し、この両者の混合速度（希釈過程）の調整によりリポソームを製造する。また、他の製造方法として、有機溶媒に溶解させたリン脂質溶液をマイクロ流路に導入し、有機溶媒を乾燥させてマイクロ流路の壁にリン脂質の薄膜を形成させ、リポソームを生成させる方法について開示がある（特許文献１）。上記の方法では、有機溶媒を除去する工程が煩雑であり、また有機溶媒がリポソーム製剤に残留する可能性は完全には否定することができず、有機溶媒による生体への好ましくない影響が問題となる。係るマイクロ流路を用いる方法によれば、粒子径が均一化されたリポソームを容易に製造することができるが、有機溶媒を除去したり、乾燥させる工程に、時間を要することが問題であった。
　有機溶媒を用いないで、リポソームを生成させる方法として、リポソーム膜成分物質と水溶液とをリポソーム膜成分物質の相転移温度以上で混合し、炭酸ガスによる加圧濾過を行う方法（特許文献２）、ヒドロキシル基を有する化合物の存在下で、脂質膜成分と超臨界若しくは亜臨界状態の二酸化炭素（炭酸ガス）とを混合することにより作製する方法（特許文献３）などが開示されている。しかしながら、これらの方法は、炭酸ガスによる加圧濾過や、又は超臨界若しくは亜臨界状態の二酸化炭素（炭酸ガス）を要し、煩雑な工程を要する。また、有機溶媒を含まないリポソーム含有製剤について開示があるが、係るリポソーム含有製剤の製造工程においても、リポソーム膜成分物質の４０～６５℃の相転移温度でリポソーム膜成分物質を処理し、二酸化炭素（炭酸ガス）を用いることも要件とされている（特許文献４）。
J.Mol.Biol.,13,238(1965) J.Am.Chem. Soc. 2004, 126, 2674-2675(Controlled Vesicle self-assembly in microfluidic channels with hydrodynamic focusing)
特開2008-285459号公報 特開2007-262026号公報 特開2006-63052号公報 特開2006-298844号公報
　本発明は、有機溶媒を使用することなく、さらに炭酸ガス等による加圧濾過や、有機溶媒を除去するための加熱処理、吸引処理や乾燥処理を行うことなく、粒子径が均一化されたリポソームを容易に製造しうるリポソームの製造方法を提供することを課題とする。また、そのような該製造方法により得られたリポソームを提供することを課題とし、さらには、このようなリポソーム製造用のデバイス並びに製造用キットを提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、リポソームの生成工程において、マイクロ流路に、リン脂質分散液、及び気体、即ち空気、不活性ガス、若しくはそれらの混合物を主成分とする気体を導入し、当該マイクロ流路内でリン脂質分散液と気体を混合させる工程を含むことを特徴とする製造方法によれば、有機溶媒を使用することなく、さらに炭酸ガス等による加圧濾過や、有機溶媒を除去するための加熱処理、吸引処理や乾燥処理を行うことなく、粒子径が均一化されたリポソームを製造しうることを見出し、本発明を完成した。
　つまり、本発明は以下からなる。
１．リポソームの生成工程において、マイクロ流路に、有機溶媒を含まない溶液とリン脂質成分からなるリン脂質分散液、及び気体を導入し、当該マイクロ流路内でリン脂質分散液と気体を混合させる工程を含むことを特徴とするリポソームの製造方法。
２．前記リポソームの生成工程において、炭酸ガスによる加圧濾過工程を含まないことを特徴とする、前項１に記載のリポソームの製造方法。
３．マイクロ流路が、導入部に少なくとも２つのマイクロ流路を有し、導出部に１つのマイクロ流路を有する分岐型マイクロ流路であって、以下の工程を含むことを特徴とする、前項１又は２に記載のリポソームの製造方法：
１）導入部における１のマイクロ流路よりリン脂質分散液を導入する工程；
２）導入部における他の１のマイクロ流路より気体を導入する工程；
３）マイクロ流路内で、リン脂質分散液と気体を混合させる工程；
４）導出部のマイクロ流路よりリポソームを導出する工程。
４．マイクロ流路の内径が、１００～１０００μｍである、前項１～３のいずれか１に記載のリポソームの製造方法。
５．リン脂質分散液流量：気体流量が、０．００１～１０：１である、前項１～４のいずれか１に記載のリポソームの製造方法。
６．気体流量が、１～１５ｍｌ／時である、前項１～５のいずれか１に記載のリポソームの製造方法。
７．リポソーム形成時の温度が、１５～８０℃である、前項１～６のいずれか１に記載のリポソームの製造方法。
８．前項１～７のいずれか１に記載のリポソームの製造方法において、マイクロ流路に、さらに内包剤を導入し、当該マイクロ流路内でリン脂質分散液、内包剤及び気体を混合することを特徴とする、内包剤を含有するリポソームの製造方法。
９．前項１～８のいずれか１に記載のリポソームの製造方法により得られるリポソーム。
１０．マイクロ流路を含んでなる、前項９に記載のリポソームの製造用デバイス。
１１．前項１０に記載のリポソーム製造用デバイスと、有機溶媒を含まないリン脂質分散液、内包剤及び／又は気体の導入用シリンジを含むことを特徴とする、リポソーム製造用キット。
　本発明のリポソーム製剤の製造方法によれば、有機溶媒を使用することなく、さらに炭酸ガス等による加圧濾過や、有機溶媒を除去するための加熱処理、吸引処理や乾燥処理を行うことなく、粒子径が均一化されたリポソームを容易に製造しうる。
　本発明のリポソーム製剤の製造方法によれば、気体とリン脂質分散液との気液界面にリン脂質を吸着させて、配向を行うことができる。背景技術の欄で述べた特許文献１に記載の方法では、有機溶媒に溶解させたリン脂質溶液をマイクロ流路に導入し、有機溶媒を乾燥させてマイクロ流路の壁にリン脂質の薄膜を形成させて、リポソームを生成させており、壁面にリン脂質成分を吸着させるために有機溶媒が必要であった。一方、本発明の製造方法によれば、有機溶媒を必要とせず気液界面にリン脂質を吸着させることができ、リポソームを生成することができる。有機溶媒は、一般に毒性が問題となるので、完全に除去することが必須であったが、本発明の方法によれば、有機溶媒を用いないことにより、有機溶媒の残存可能性を完全に否定することができる。
本発明のリポソーム製造用装置の一例を示す図である。 本発明のリポソーム製造用デバイスにおけるマイクロ流路内での合流部の流れを示す顕微鏡写真図である。（実施例１） 本発明のリポソーム製造用デバイスにおけるマイクロ流路内の様子を示す顕微鏡写真図である。（実施例１） 本発明のリポソーム製造用デバイスにおけるマイクロ流路内で、気液界面にリン脂質が吸着する様子を示す写真図である。（実施例１） 本発明のリポソーム製造用デバイスにおけるマイクロ流路内で、気液界面にリン脂質が吸着し、リポソームを生成する機構を示す写真図である。（実施例１） 本発明のリポソーム製造方法により得られたリポソームと、バンガム法により得られたリポソームの粒度分布比較結果を示す図である。（実験例１） 本発明のリポソーム製造方法により得られたリポソームと、空気を含まない系でマイクロ流路を用いる方法により得られたリポソームの粒度分布比較結果を示す図である。（実験例２） リン脂質分散液、ＰＢＳ流量及び空気流量を変えたときのリポソームの収率を示す図である。（実験例３） リン脂質分散液、ＰＢＳ流量及び空気流量の流量比を変えたときのリポソームの収率を示す図である。（実験例３）
　以下、本発明のリポソームの製造方法について詳細に説明する。本発明のリポソームの製造方法は、リポソームの生成工程において、マイクロ流路に、有機溶媒を含まない溶液とリン脂質成分からなるリン脂質分散液、及び気体を導入し、当該マイクロ流路内でリン脂質分散液と気体を混合させる工程を含むことを特徴とするリポソームの製造方法に関する。
　本発明において「有機溶媒を含まない溶液」とは、有機溶剤を含まない水性媒体であって、リン脂質成分を分散しうる媒体をいい、特に限定されないが、例えば水、好適には注射用蒸留水、生理的食塩水、イオン交換水や、これらの溶液にグリセリン、グルコース、サッカロース、マルトースなどの等張化剤としての多価アルコールを０．２～０．３Ｍ程度含有する水性媒体が挙げられる。本発明の製造方法によれば、製造時において有機溶媒、グリチルリチン類やコール酸類等のリポソームの形成助剤を用いることなく、簡便かつ効率良くリポソームを形成し得る利点を有する。また、本発明の有機溶媒を含まない溶液は、リン脂質成分の他、リポソームに内包されうる所望の内包剤を溶解しうる水性媒体、例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）等であってもよい。また、本発明において「気体」とは、空気、不活性ガス、又はそれらの混合物を主成分とする気体が挙げられる。
　本発明の製造方法で使用される「リン脂質成分」は、中性リン脂質として、大豆、卵黄などから得られるレシチン、リゾレシチン及び／又はこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体を挙げることができる。これらは単独でも併用してもよい。その他のリン脂質として、卵黄、大豆又はその他、動植物に由来するホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、合成により得られるホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPG）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）などを挙げることができる。
　これらのリン脂質成分は通常、単独で使用されるが、２種以上併用して混合使用してもよい。２種以上の荷電リン脂質成分を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士又は正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。
　本発明の「リン脂質分散液」には、所望により上記リン脂質成分の他に、他の成分を加えることもできる。その例として、膜安定化剤又はポリアルキレンオキシド基導入用アンカーとしてコレステロール、コレステロールエステルなどのステロール類、荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン酸ジアルキルエステルなどが例示される。
　本発明において「マイクロ流路」とは、導入部と導出部を有する、長さが２ｍｍ～５ｍの流路であり、その流路内径は１００～１０００μｍ、好ましくは２００～５３０μｍである。流路内径は、所望するリポソーム粒子径により適宜調整されたものを使用することができる。本発明のマイクロ流路には、導入部に少なくとも２つのマイクロ流路を有し、導出部に１つのマイクロ流路を有する分岐型マイクロ流路であるのが好適である（図１参照）。例えば、導入部における１のマイクロ流路よりリン脂質分散液を導入し、導入部における他の１のマイクロ流路より気体を導入し、統合されたマイクロ流路内でリン脂質分散液と気体を混合させることができる。
　マイクロ流路が、導入部に少なくとも２つのマイクロ流路を有し、導出部に１つのマイクロ流路を有する分岐型マイクロ流路の場合、本発明のリポソームは、以下の工程を含む製造方法により、製造することができる（図１参照）。
１）導入部における１のマイクロ流路よりリン脂質分散液を導入する工程；
２）導入部における他の１のマイクロ流路より気体を導入する工程；
３）マイクロ流路内で、リン脂質分散液と気体を混合させる工程；
４）導出部のマイクロ流路よりリポソームを導出する工程。
　上記において、工程１）及び工程２）は同時に行うことができ、各々別の導入部よりリン脂質分散液及び気体をマイクロ流路内に導入することができる。導入部に３以上のマイクロ流路を有する場合は、その他のマイクロ流路より、水性媒体（有機溶媒を含まない溶液）を導入したり、内包剤を含む水性媒体を導入することができる。内包剤は、リン脂質分散液に混合して使用してもよい。
　上記において、工程１）及び工程２）において、リン脂質分散液及び気体をマイクロ流路内に導入する方法は、特に限定されないが、例えばリン脂質分散液又は気体を含むシリンジを、各々導入部のマイクロ流路に結合させて、ピストン又はポンプ等の作用によって導入することができる（図１参照）。リン脂質分散液及び気体をマイクロ流路内に導入させうる方法であれば、自体公知の方法であってもよいし、今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。
　上記において使用可能な内包剤は水溶性であり、脂質二重膜に囲まれた閉鎖空間の水相に内包される。内包剤の具体例として、広く医薬品に使用される水溶性の物質が挙げられる。具体的には造影剤、抗がん剤、抗酸化剤、抗菌剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進剤、保湿剤、ホルモン剤、ビタミン類、色素、及びタンパク質類などが挙げられる。この中でもヒドロキシル基、カルボキシ基を分子構造中に含有する化合物が安定性の観点から好ましい。内包剤は、リン脂質分散液及び気体と同時にマイクロ流路内に導入してもよいし、リン脂質分散液及び気体をマイクロ流路内に導入した後に導入してもよい。
　上記において、リン脂質分散液におけるリン脂質と水性媒体の混合比は、リン脂質が溶解される十分量であれば特に限定されるものではないが、一般的には２～３０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整され、使用される。
　マイクロ流路に導入されるリン脂質分散液は、マイクロ流路の体積に応じて流路が十分に満たされる量であればよい。また、導入されるリン脂質分散液流量と気体流量の比は、リン脂質分散液流量：気体流量が、０．００１～１０：１であり、好ましくは０．００１～４：１であり、最も好ましくは、０．５～２：１である。導入される気体流量は、１～１５ｍｌ／時であり、好ましくは５～１５ｍｌ／時であり、最も好ましくは５～１０ｍｌ／時である。リン脂質分散液の導入速度は、流速が、０．０００１～０．５ｍ／秒、好ましくは０．０５～０．３ｍ／秒、より好ましくは０．１～０．２ｍ／秒である。流路内の水溶液温度は、１５～８０℃、好ましくは４５～６５℃、より好ましくは５５～６２℃である。
　上記条件で、気体とリン脂質分散液との気液界面にリン脂質を吸着させて、リン脂質の配向を行うことができる。背景技術の欄で述べた特許文献１には、有機溶媒に溶解させたリン脂質溶液をマイクロ流路に導入し、有機溶媒を乾燥させてマイクロ流路の壁にリン脂質の薄膜を形成させて、リポソームを生成させており、壁面にリン脂質成分を吸着させるために有機溶媒が必要であったのに対し、本発明の製造方法によれば、有機溶媒を必要とせず気液界面にリン脂質を吸着させることができ、リポソームを生成することができる（図２～４参照）。
　本発明のリポソームの製造方法によれば、生成工程において、炭酸ガスによる加圧濾過工程を含まないでリポソームを製造することができる。
　本発明は、リポソームの製造用デバイスにも及ぶ。本発明のリポソームの製造用デバイスには、マイクロ流路が含まれる（図１参照）。当該マイクロ流路は、上記説明したように、導入部と導出部を有する長さが２ｍｍ～５ｍの流路であり、その流路内径は１００～１０００μｍ、好ましくは２００～５３０μｍである。流路内径は、所望するリポソーム粒子径により、適宜調整される。本発明のリポソームの製造用デバイスに含まれるマイクロ流路には、導入部に少なくとも２つのマイクロ流路を有し、導出部に１つのマイクロ流路を有する分岐型マイクロ流路であるのが好適である。
　本発明は、さらに、リポソームの製造用デバイスと導入用シリンジを含むリポソーム製造用キットにも及ぶ。当該導入用シリンジには、有機溶媒を含まないリン脂質分散液、内包剤及び／又は気体を充填し、これらの物質をマイクロ流路に導入させることができる。有機溶媒を含まないリン脂質分散液や内包剤は、用時調製することができる。また、有機溶媒を含まないリン脂質分散液に、内包剤を加え、同時にマイクロ流路内に導入することもできる。
　本発明は、上記製造方法により得られたリポソームにも及ぶ。本発明の製造方法により生成されたリポソームは、マイクロ流路の導出部から排出される。生成されたリポソームは、遠心分離等の通常の手段で沈殿として回収される。回収されたリポソームは、マイクロ流路の内径により、粒径が均一化されているが、所望により粒子径を調整するためのろ過を行ってもよい。また、製剤化のための付加処理、滅菌等が行われ、所望により凍結乾燥化及び／又は水溶液製剤として調製される。
　本発明の製造方法によって製造されるリポソームとしては、多重層膜からなるリポソーム（Multilamellar vesicles; ＭＬＶ）、粒子径が大きい一枚膜のＬＵＶからなるリポソーム（Large unilamellar veislcles）、粒子径が５０ｎｍ未満の小さい一枚膜のＳＵＶからなるリポソーム（Small unilamellar vesicles）が挙げられ、これらは混在していてもよいが、本発明の方法によれば粒径がほぼ均一化したリポソームを得ることができる。
　また、本発明の製造方法によって製造されるリポソームは、リポソームの水性分散液剤又は凍結乾燥剤として調製することができる。内包剤を含有するリポソームとして好適な製剤は、内包剤が水溶性の薬剤であり、水溶性薬剤が内包されたリポソームが水性溶媒中に分散している水性分散液製剤が挙げられる。このリポソームの水性分散液剤には、安定化剤、キレート剤、抗酸化剤、粘度調節剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤などが溶解又は分散していてもよい。このようなリポソームの水性分散液製剤の調製は、各種の方法が知られているが、目的、特性、用途などに応じて適宜選択して行う。
　以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）リポソームの製造
　本発明のリポソームを、図１に示すマイクロ流路を含むリポソーム製造用デバイスを用いて製造した。
　卵黄レシチン０．００２ｇをイオン交換水１ｍｌに完全に分散するまで攪拌し、リン脂質分散液を調製した。導入するマイクロ流路（デバイス）及びリン脂質分散液を６０℃に保ち、内径２７０μｍ、長さ１０ｃｍの３分岐からなる流路の導入部にリン脂質分散液、空気及びＰＢＳを導入した。空気は流量１～１５ｍｌ／時で導入し、同時にリン脂質分散液及びＰＢＳを流速０．０００１～０．５ｍ／秒で導入した。マイクロ流路の導出部から形成されたリポソームの分散水溶液を得た。この水溶液を１２０００ｒｐｍの条件で遠心分離し、多重膜リポソームを沈殿として回収した。沈殿を凍結乾燥し、乾燥リポソーム製剤を製造した。
　本発明の製造方法によれば、分岐型マイクロ流路の合流部において図２に示す流れが認められた。また、流路内の様子を図３に、気液界面にリン脂質を吸着させている状態を図４Ａ、Ｂに示した。
（実験例１）粒度分布１
　実施例１で製造したリポソーム及び比較例としてのバンガム法（非特許文献１）で製造したリポソームの粒子径を測定し、その結果を図５に示した。
　リポソーム分散水溶液を流路出口で回収し、これを１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、多重膜リポソームの沈殿として回収した。その後沈殿を生理食塩水１ミリリットル中に分散させ、得られた溶液に含まれるリポソームの粒子径を、動的光散乱法を用いて測定した。
　図５において横軸はリポソームの粒子径（ｎｍ）、縦軸は確率密度(intensity)（％）を示した。実線は本願発明、破線はバンガム法によるものである。比較例としてのバンガム法によるとブロードな粒子径分布により各種粒子径のリポソームが生成されたのに対し、本発明の製造方法によると、１つの鋭いピークからなる粒子径分布が認められ、均一化された粒子径のリポソームが生成されることが確認された。
（実験例２）粒度分布２
　実施例１のリポソームの製造方法において、空気を含む条件及び空気を含まない条件で、リポソームを製造した。空気を含む場合のリン脂質溶液及びＰＢＳの流量は１６．７μｌ／分、空気流量は５ｍｌ／時であり、空気を含まない場合のリン脂質溶液及びＰＢＳの流量は１５μｌ／分であった。
　得られたリポソームについて、実験例１と同手法により粒子径を測定した。その結果、空気を含む条件下で製造したリポソームでは１つの鋭いピークからなる粒子径分布が認められ、均一化された粒子径のリポソームが生成されることが確認された（図６）。
（実験例３）収率
　実施例１に示すリポソームの製造方法において、リン脂質分散液とＰＢＳの流量及び空気流量を変えたときのリポソームの収率を測定した。収率は、用いたリン脂質（重量）に対するリポソームを構成するリン脂質（重量）の重量比（％）により算出した。
　リン脂質分散液とＰＢＳの流量及び空気流量を変えたときのリポソームの収率を図７に示した。なお、比較例としてバンガム法で製造したリポソームの収率を破線で示した。その結果、本発明の製造方法によれば、バンガム法で製造した場合に比べて優れた収率を示した。また、空気流量に対するリン脂質分散液とＰＢＳの流量比と収率を図８に示した。その結果、空気流量が、１～１５ｍｌ／時であって、リン脂質分散液流量：空気流量が、０．００１～１０：１の場合に、高い収率でリポソームを得ることができた。より具体的には、空気流量が１０ｍｌ／時より多い場合は、空気流量に対するリン脂質分散液とＰＢＳの流量比が１付近で最も収率が高く、空気流量が５ｍｌ／時より少ない場合は、空気流量に対するリン脂質分散液とＰＢＳの流量比が大きいほうが収率が高かった（図８）。
　以上詳述したように、本発明の有機溶媒を使用しない方法でリポソームを製造することにより、加圧濾過処理や、有機溶媒を除去するための加熱処理、吸引処理や乾燥処理などの工程を省略することができ、リポソーム製造に要する時間の短縮化ができ、さらに従来よりも高収率でリポソームを製造することできる。リポソームの寿命は、通常３日程度であるといわれているが、本発明の製造方法によれば、コンパクトなリポソーム製造用キット又は製造用装置により、短時間に所望の内包剤を含むリポソーム製剤を製造することが可能となり、病院や薬局等でのリポソーム製剤を製造することができ、安定な状態で使用することができる。
　このリポソームは、内部に有する水相には水溶性の内包剤（例えば、薬効成分）を、二分子膜の内部には油溶性の内包剤を保持するという、いわゆるカプセル構造を構築することができる。本発明の製造方法により製造したリポソームにより、検査（診断）、治療、化粧などの様々な分野で用いることができる。さらに、近年では、薬物送達システム（ＤＤＳ）への応用が盛んに研究されており、本発明の製造方法により、リポソーム製剤の普及に対して多いに貢献することができる。

Claims (11)

  1. リポソームの生成工程において、マイクロ流路に、有機溶媒を含まない溶液とリン脂質成分からなるリン脂質分散液、及び気体を導入し、当該マイクロ流路内でリン脂質分散液と気体を混合させる工程を含むことを特徴とするリポソームの製造方法。
  2. 前記リポソームの生成工程において、炭酸ガスによる加圧濾過工程を含まないことを特徴とする、請求項１に記載のリポソームの製造方法。
  3. マイクロ流路が、導入部に少なくとも２つのマイクロ流路を有し、導出部に１つのマイクロ流路を有する分岐型マイクロ流路であって、以下の工程を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のリポソームの製造方法：
    １）導入部における１のマイクロ流路よりリン脂質分散液を導入する工程；
    ２）導入部における他の１のマイクロ流路より気体を導入する工程；
    ３）マイクロ流路内で、リン脂質分散液と気体を混合させる工程；
    ４）導出部のマイクロ流路よりリポソームを導出する工程。
  4. マイクロ流路の内径が、１００～１０００μｍである、請求項１～３のいずれか１に記載のリポソームの製造方法。
  5. リン脂質分散液流量：気体流量が、０．００１～１０：１である、請求項１～４のいずれか１に記載のリポソームの製造方法。
  6. 気体流量が、１～１５ｍｌ／時である、請求項１～５のいずれか１に記載のリポソームの製造方法。
  7. リポソーム形成時の温度が、１５～８０℃である、請求項１～６のいずれか１に記載のリポソームの製造方法。
  8. 請求項１～７のいずれか１に記載のリポソームの製造方法において、マイクロ流路に、さらに内包剤を導入し、当該マイクロ流路内でリン脂質分散液、内包剤及び気体を混合することを特徴とする、内包剤を含有するリポソームの製造方法。
  9. 請求項１～８のいずれか１に記載のリポソームの製造方法により得られるリポソーム。
  10. マイクロ流路を含んでなる、請求項９に記載のリポソームの製造用デバイス。
  11. 請求項１０に記載のリポソーム製造用デバイスと、有機溶媒を含まないリン脂質分散液、内包剤及び／又は気体の導入用シリンジを含むことを特徴とする、リポソーム製造用キット。
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