CN1068585C - 用于基因治疗的阳离子类脂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的阳离于类脂，特别是胍基类脂，以及它们的制备方法。还提供了含有本发明类脂的聚阴离于-类脂复合体，它们的制法以及将生物活性物质特别是核酸递送到细胞的用途。

Description

用于基因疗法的阳离子类脂
本发明涉及胍的阳离子类脂衍生物，它们的制备及用途，以及利用这些衍生物制备的药物组合物。
有一些基于类脂的物质如脂质体已被有效地用作一些药品和生物制品中的载体，用来将生物活性物质如药物、放射治疗剂、酶、病毒、核酸(例如：质粒、DNA和RNA结构、转录因子及其它细胞载体)等引入培养细胞系和动物体内。例如，最近已有几种类脂包囊的药物如道诺霉素(DaunoXomeTM)和两性霉素B(AbelcetTM,AmbisomeTM,AmphotecTM)获得了食品和药品管理局(FDA)的批准或被列入了目前FDA审查的NDA项目。
在这种情况下人们作了更多的努力，希望研制出能有用并有效地将遗传物质直接递送到生物细胞的类脂介导的方法。例如，基因治疗技术就是通过以所希望的治疗方式用能影响基因复制、转录和翻译过程的核酸结构转染患者的靶细胞，从而减轻患者的病情。一般这些核酸结构是高分子量的、聚阴离子分子，因此若要在体内、来自体内或在体外有效地转染细胞，则通常需要载体介导的递送。参见，例如美国专利No.5,264,618，它描述了若干在临床应用的利用类脂载体的技术和这样的药物组合物。这种转染方法也可用于研制可生产有商业意义的蛋白质的新的细胞系和动物。
最近已公开了几种用于质粒递送的类脂载体，参见Felgner等人的美国专利4,897,355,4,946,787,5,049,386,5,366,737,5,545,412；美国专利5,264,618,5,283,185(Epand等人，描述的DC-chol)，5,334,761；PCT申请WO 95/14381,WO 96/01840,WO 96/1841,WO96/18372，以及Felgner等人，酶学方法，5,67-75(1993)。尽管在上述参考文献中描述的化合物有助于生物活性物质进入细胞中，但人们仍希望能开发出更多的能提供更高摄取效力、更好的特异性和减少毒性的类脂载体。本发明即满足了这些以及相关的需要。
本发明的一个方面涉及式Ⅰ的胍的阳离子类脂衍生物及其盐、溶剂化物、拆分及未拆分的对映体、非对映体和它们的混合物：
R1R2N-C(O)-A-X    式Ⅰ其中：
R1和R2可以是相同的或不同的，为C10-C26烃基；
A为亚烃基，其中一个或多个亚甲基可被基团Y任意取代(假如Y基团彼此不能邻接)，而每个Y可独立地为：-O-,-OC(O)-,-C(O)O-,-NR5-,-NR5C(O)-,-C(O)NR5-,NR5C(O)NR5-,-NR5C(O)O-,-OC(O)NR5-,-S(O)n-(n为0、1或2)或-NZ-C(=NZ)NZ-,其中每个Z独立地为H或-(CH2)mNR5-C(=NR5)NR5，m为1-10的整数，而每个R5独立地为H或低级烷基；
X是：(1)三烃基铵基，其中烃基彼此相同或不同，或(2)-NH-C(=NR3)NHR4，其中R3和R4各自独立地为烃基、卤代烷基、羟烷基、O-被护羟烷基、烷氧烷基、卤代烷氧烷基、芳氧烷基、氨基烷基、单或二取代氨基烷基、N-保护的-氨基烷基、酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、-C(O)NR6R7(其中R6和R7独立地为H或烃基)、氮保护基，或R3和R4与它们连接的原子一起形成任意取代的单环或双环；但条件是：
当R1和R2相同，均为C16烷基，而X为-NH-C(=NH)NH2时，A不为3丁基链。
X优选为-NH-C(=NR3)NHR4。在另一种优选的情况下，R1和R2相同，均为单不饱和链烯基。
在另一种优选的情况下，R3和R4相同，均为H，氮保护基，氨基烷基或N-保护的氨基烷基，羟烷基或O-保护的羟烷基。R3和R4常常是由-(CH2)p-NH2表示的氨基烷基，其中p为2-10的整数。该氨基也可被保护，优选被叔丁氧羰基保护。应考虑到烷基氨基也可季铵化或以相应的N-氧化物存在。
在相关方面，本发明提供了含有式Ⅰ的阳离子类脂的聚阴离子-类脂配合物，它们的制备方法及它们在将生物活性物质递送到细胞中的用途。
另一方面，本发明涉及含治疗有效量的核酸、式Ⅰ的阳离子类脂和任选的药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
附图说明
图1所示为有代表性的本发明阳离子类脂化合物，表示为与首基X相连的具有所绘结构的脂酰胺尾基。
图2所示为本发明的阳离子类脂化合物的有代表性的首基X。
图3A和3B显示了在无血清(图3A)和含有血清(图3B)的培养基中，商业上可获得的化合物LipofectinTM(Lp)和LipofectAmineTM(Lf)与本发明化合物之间对人内皮细胞的DNA转染效率的比较。
图4A和4B显示了在无血清(图4A)和含有血清(图4B)的培养基中，商业上可获得的化合物LipofectinTM(Lp)和LipofectAmineTM(Lf)与本发明化合物之间对人支气管上皮细胞的DNA转染效率的比较。
图5A和5B显示了在无血清(图5A)和含有血清(图5B)的培养基中，商业上可获得的化合物LipofectinTM(Lp)和LipofectAmineTM(Lf)与本发明化合物之间对鼠3T3成纤维细胞的DNA转染效率的比较。
图6显示了在含血清、无血清(图6B)培养基中，共(CO-)类脂胆固醇和DOPE对新化合物2-胍基-N,N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺(2B)在人内皮细胞中在血清中的转染效率的影响。括号中的比率为每次试验中2B：胆固醇：DOPE的用量比。
图7A显示了在上皮细胞中本发明化合物相对于其它类脂化合物：LipofectinTM(Lp),LipofectAmineTM(Lf)和GS-2888(11n，用作游离碱，11n/b或盐酸盐，11n/Cl)的转染效率。图7B显示了在培养血管内皮细胞中几种试验化合物的活性。
图8A所示为本发明化合物与DOTMATM通过导气道装置给予大鼠后的体内转染效率的比较。
定义及基本参数A、定义
给出下面这些定义是为了解释和定义用来描述本发明的各种术语的含义和范围。
术语“烃基”是指含有由连接有氢原子的最多26个碳原子的碳链或环的一价烃基。该术语包括烷基、环烷基、链烯基、炔基和芳基、有饱和和不饱和键的混合的基团、碳环，还包括这样的基团的组合。它也包括直链、支链、环状结构或它们的组合。
术语“亚烃基”是指二价烃基。有代表性的实例包括亚烷基、亚苯基、亚环己基、二亚甲基环己基、2-丁烯-1,4-二基等等。优选该亚烃基链是完全饱和的和/或具有1-10个碳原子链长。
术语“三烃基铵”是指基团(R)3N+-，每个R独立地为烃基，优选低级烷基。
脂族链包括下面定义的烷基、链烯基和炔基。脂族直链限定为无支碳链基。
烷基是指完全饱和的具有特定碳原子数，或者若没有详细说明的话，最多26个碳原子的支链或无支碳链基团。例如，1-8个碳原子的烷基是指诸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基等的基团，以及这些基团的位置异构体。低级烷基是指1-6个碳原子的烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。6-26个碳原子的烷基包括己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基和二十四烷基。
链烯基是指任何具有特定碳原子数，或者若对碳原子数没有特别限制的话，最多26个碳原子的支链或无支不饱和碳链基团；且在这些基团中有1个或多个双键。6-26个碳原子的链烯基的实例为：己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基和二十四碳烯基，在它们的各种异构型中，不饱和键可位于基团中的任意位置，并且该双键可以是(Z)构型，也可以是(E)构型。
炔基是指链烯基范围的烃基，但在这些基团中有1个或多个三键。
术语“低级烷氧基”是指基团-O-R′，其中R′为低级烷基。
术语“聚亚甲基”是指基团-(CH2)n-，其中n为2-10的整数。
术语“亚甲基”是指基团-CH2-。
术语“亚丁基”是指基团-(CH2)4-。
术语“亚烷基”是指二价饱和脂族基。
术语“羰基”是指基团-C(O)-。
术语“羟基羰基”或“羧基”是指基团-C(O)OH。
术语“低级烷氧羰基”是指基团-C(O)OR′，其中R′为低级烷基。
术语“酰基”是指基团-C(O)-R′，其中R′为氢或烃基，例如：甲基羰基、乙基羰基、苯甲酰基、萘甲酰基等。
术语“氨基甲酰基”是指基团-C(O)NR′R，其中R和R′独立地为氢或低级烷基，例如：当R为氢，R′为低级烷基时，该基团即低级烷基氨基甲酰基；当R和R′均为低级烷基时，该基团即二低级烷基氨基甲酰基。
术语“单取代氨基”是指基团-NHR，其中R为烃基或酰基。
术语“二取代氨基”是指基团NR′R″，其中R′和R″独立地为烃基或酰基。
术语“卤代”是指氟代、溴代、氯代和碘代。
术语“芳基”是指芳香一价单或多碳环基。
术语“(低级烷基)-羟甲基”是指基团-CH(OH)-(低级烷基)。
术语“芳甲基”是指基团：芳基-CH2-。
芳烷基是指从其中氢原子被芳基取代的烷基衍生的有机基团。有代表性的实例为苄基、苯乙基、3-苯丙基等。
单环一般具有3-8个环原子。
双环一般具有7-14个环原子。
碳环是指所有的环原子均为碳的环系统。
杂环是指至少有一个环原子为杂原子的环系统，杂原子一般为O,N,或S(O)n(n为0、1或2)。
术语“保护基”是指当一个基团的原子与分子中的反应基相连时可掩蔽、降低或阻止其反应性。保护基的实例可见于T.W.Greene等人，有机化学中的保护基，(Wiley,2nd ed.,1991)和HarriSon等人，合成有机方法概要，1-8卷，(John Wiley和Sons,1971-1996)。有代表性的胺保护基包括甲酰基，或2-6个碳原子的低级烷酰基，特别是乙酰或丙酰基，三苯甲游基或取代三苯甲游基如一甲氧三苯甲游基，二甲氧三苯甲游基如4,4′-二甲氧三苯甲游基或4,4′-二甲氧三苯基甲游基，三氟乙酰基，烯丙氧羰基，氨基甲酸叔丁酯(t-BOC)，氨基甲酸1-金钢烷基酯，氨基甲酸苄基酯(Cbz)，氨基甲酸9-芴甲酯(FMOC)，硝基-藜芦氧基氨基甲酸酯(NVOC)，邻苯二甲酰基等。有代表性的羟基保护基是：该羟基可以是酰化了的，也可以是烷基化的，包括苄基和三苯甲游基醚以及烷基醚，四氢吡喃醚，三烷基甲硅烷基醚和烯丙基醚。
生物活性物质是指能在体外和/或体内发挥生物作用的任何分子或分子的混合物或复合体，包括药剂、药物、蛋白质、维生素、类固醇、聚阴离子、核苷、核苷酸、多核苷酸、核酸等。
在本申请中所提到的缓冲剂包括“Tris”、“Hepes”和“PBS”。“Tris”是三(羟甲基)氨基甲烷，对本发明的优选实施方案来说，其在约pH 7使用。“Hepes”是N-2羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸，本发明所用的该缓冲液的PH也约为7。磷酸盐缓冲盐水或“PBS”是10mM磷酸钠和0.9 wt.％NaCl，用作pH 7.4的等渗生理缓冲剂。
聚阴离子为生物活性聚合结构如多肽、多核苷酸、核酸、或其它大分子，其中有一个以上的聚合物单元带有负电荷，且该聚合物的净电荷为阴性。
复合体(或脂质体复合体)定义为含有式Ⅰ类脂的预制脂质体与聚阴离子混合制得的产物。这样一种复合体的特点在于通过聚阴离子与类脂成分间的相互作用使得聚阴离子和脂质体一起作为一个基本整体通过凝胶过滤柱进行洗脱，从而根据斯托克斯半径或通过一些其它的分离过程进行分离。
电荷比率是指在复合体中由类脂提供的净正电荷与聚阴离子提供的净负电荷之间的数量关系。本文中的电荷比率表示为正电荷比负电荷，即：5∶1意味着类脂上的净正电荷为5，而聚阴离子上的净负电荷为1。
脂质体-聚阴离子复合体是通过聚阴离子溶液与由式Ⅰ类脂(可适当带有任意共类脂)制备的脂质体制剂接触后所生成的物质的组合物。
任意或任选的意思是其后所描述的事件或情形可以发生，也可不发生，这种表述包括所述事件或情形发生的情况，也包括它们不发生的情况。任选取代基包括烷基，环烷基，链烯基，炔基，芳基，卤代烷基，羟基，氨基，卤代，硝基，氰基，羧基，氨基甲酰基，烷氧基，卤代烷氧基，单和二取代氨基，酰基，烷氧酰基，芳氧酰基等。
任选的共类脂可理解为能产生稳定脂质体的结构，单独或与包括本发明的阳离子胍基类脂在内的其它类脂成分结合在一起。它可以是中性的、带正电荷的或带负电荷的。
双层包覆复合体是从带有净正电荷的脂质体复合体制备的。而带有净正电荷的脂质体复合体是利用正电荷类脂的摩尔量比由聚阴离子提供的负电荷的摩尔量大而制得的。将这些带正电荷的复合体与带负电荷的类脂混合从而生成双层包覆复合体。如果加入足够的负电荷类脂，则最终的复合体将带有净负电荷。这一定义包括对表面进行了进一步改性的脂质体，如在其中掺入了抗体或抗原。
DNA代表脱氧核糖核酸，它可任意含有人造核苷酸。DNA可以是单链、双链或三链螺旋形式。
RNA代表可任意含有人造核苷酸的核糖核酸。RNA可以是单链或双链的。
多核苷酸是含有一个以上核苷酸的DNA或RNA。多核苷酸可通过本领域普通技术人员熟知的化学合成方法，或利用重组DNA工艺，或通过上述两种技术的结合来制备并包括掺入人造核苷酸的那些方法。
反义是指与DNA或RNA中的核苷酸的特定序列互补的核苷酸序列。
术语核酸是指DNA(例如：基因组DNA,cDNA),RNA(例如：mRNA,核糖体RNA,tRNA,反义RNA)，核糖酶，寡聚核苷酰，多核苷酸，DNA和RNA的混合双链体和三链体，质粒，表达载体等，包括含有人造核苷酸的那些序列。
药物是指所有治疗或预防性的物质，而不是食物，药物用于预防、诊断、缓解、治疗或治愈人或动物的疾病。(治疗上有用的多核苷酸、核酸和多肽均在该药物定义的范围内)。
药物制剂是包括药物的物质组合物，用于人或动物的治疗给药。
药学上可接受的阴离子是其本身无毒性或在药学上可接受的以及不会使得化合物变成药学上不可接受的阴离子。这样的阴离子的实例为卤化物阴离子，氯化物，溴化物和碘化物。也可使用无机阴离子如硫酸根，磷酸根和硝酸根。有机阴离子可从单一有机酸衍生而得，如从乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸等获得。
稳定转染剂是其中引入了DNA且使该细胞的基因组DNA完整化的的活细胞。
局部给药包括将药物用于任何身体表面，包括眼部给药和任何体腔表面的给药。
经皮给药是通过皮肤产生系统作用而给药。
转染是指为了本发明的目的而将DNA或RNA引入活细胞中。
人造核苷酸包括商业上可获得的那些或可由本领域普通技术人员熟知的方法方便地制得的那些。
术语“药学上可接受的盐”是指从无机或有机酸或碱衍生的任何盐。
此处所用的术语-对哺乳动物的病情和/或疾病的“治疗”，意思是：
(ⅰ)预防病情或疾病，即避免疾病的任何临床症状；
(ⅱ)抑制病情或疾病，即抑制或减轻临床症状的加重或发展；和/或
(ⅲ)解除病情或疾病，即导致临床症状的消除。
此处所用的术语“治疗有效量”是指当需要时给予哺乳动物生物活性物质的量足以产生治疗作用。构成“治疗有效量”的剂量将根据物质、病情或疾病及其严重程度、以及被治疗的哺乳动物的情况而变化，但可由本领域普通技术人员按照现代的知识和本发明来决定。
所给的所有温度均为摄氏温度(即℃)。
除非有相反的说明，否则本文所述的反应是在大气压下，在约-78℃到约150℃的温度范围内，更优选约10℃-约50℃，最优选约室温，例如约20℃进行的。除非有相反的说明，本文所述的时间和温度范围均为近似值，例如：“在10℃-100℃下，从8-24小时”意思是在约10℃-约100℃下，从约8-约24小时。
如果需要的话，本文所述的化合物和中间体的分离和纯化可利用任何适宜的分离或纯化方法来进行，例如过滤、萃取、结晶、柱层析、制备高压液相色谱(制备HPLC)、薄层色谱或厚层色谱、或者这些方法的结合。合适的分离和离析方法的特别说明可参考下文中的实施例。不过也可使用其它等效的分离或离析方法。
在下面的例子中命名了一些有代表性的化合物。
[CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8]2N-C(O)CH2NHC(=NH)NH2
2-胍基-N,N-二-十八碳-9-烯基-乙酰胺
[CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8]2N-C(O)CH2CH2NHC(=NH)NH2
3-胍基-N,N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺
[CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8]2N-C(O)CH2CH2NHC(=NBOC)NHBOC
3-[N′,N″-双(叔丁氧羰基)胍基]-N,N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺
[CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8]2N-C(O)CH2CH2NHC(=NC2H4NHBOC)-NHC2H4NHBOC3-[N′N″-双(2-叔丁氧羰基氨基乙基)胍基]-N,N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺
[CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8]2N-C(O)CH2CH2NHC(=NC3H6NHBOC)-NHC3H6NHBOC3-[N′,N″-双(2-叔丁氧羰基氨基丙基)胍基]-N,N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺
[CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8]2N-C(O)CH2CH2NHC(=NCH2CH2NH2)NHCH2CH2NH23-[N′,N″-双(2-氨基乙基)胍基]-N,N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺
[CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8][C18H35]N-C(O)CH2CH2NHC(=NH)NH23-胍基-N-十八碳-9-烯基-N-十八烷基-丙酰胺
化合物也可参照图1和图2中所示的结构来表示和定义。在这些表示图中，化合物表示为与阳离子首基X相连的脂酰胺尾基。图1显示了有代表性的脂酰胺尾基1-14，图2显示了有代表性的阳离子首基的结构A-U。因此，定义为1B的化合物是指其中脂酰胺尾基1与阳离子首基B相连的化合物，即：2-胍基-N,N-二-十八碳-9-烯基-乙酰胺。式Ⅰ化合物的合成
在反应流程中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7与本发明概述中所描述的相同。
反应流程A说明了新的胍的阳离子类脂衍生物，即式Ⅰ化合物的代表性制备流程。
反应流程B说明了在反应流程A中用作原料的不对称胺R1R2NH的代表性制备流程。
反应流程A
Figure C9712151400151
反应流程B
Figure C9712151400161
原料
对于反应流程A和B来说，原料可从Aldrich Chemical Co.,Inc.,Fluka Chemical Corporation,K&K Chemicals,Eastman Kodak Chemicals,Lancaster Synthesis Ltd.,Karl Industries,Maybridge Chemical Co.Ltd.,或Tokyo kasai International获得。长链酸优选从Nu Chek PrepLnc.,(Elysian,MN)得到。无法直接购得的那些化合物可由本领域普通技术人员按照参考文献中记载的方法进行制备，如：“用于有机合成的Fieser和Fieser′s试剂”，1-15卷，John Wiley和Sons,1991；“碳化合物的Rodd′s化学”，1-5卷及附编，Elsevier Science Publishers,1989；“有机反应”,1-40卷，John Wiley和Sons,1991。胺R1R2NH的制备
根据反应流程B，结构R1R2NH的中间体可通过下述过程进行合成：首先式RNH2的胺与式R1COOH的羧酸在活性基如N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚等和偶合剂如二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-羟基苯并三唑(HBOT)、N-羟基苯并三唑磷酰氯、氯甲酸异丁酯、N,N′-羰基二咪唑等存在的条件下进行偶合。该偶合反应一般在无水、非羟基有机溶剂中进行。然后用还原剂如金属氢化物(例如氢化铝锂、乙硼烷等)将所得酰胺还原为预期的胺R1R2NH。
胺RNH2和酸R1COOH一般可购得。胺RNH2也可通过前体羧酰胺(可从相应的酸经酰氯依次得到)的还原来制备。酸R1COOH可购得或通过易于得到的前体醇的氧化制得。式Ⅰ化合物的制备
一端带有胺，另一端带有羧酸的双官能连接物HOC(O)-A-NH2(A如前所定义)既可从供应商如Sigma Chemical Company(St.Louis,MO)处购得，也可利用本领域普通技术人员熟知的标准方法进行制备。根据反应流程A，在步骤1中，胺被保护，然后在与上述相似的条件下，所得N-保护连接物的羧基与式R1R2NH的胺偶合。在步骤2中，在适宜条件下(酸处理、氢解、光解等)去除氮保护基，然后在步骤3中，所得游离胺与硫脲或异硫脲鎓盐缩合得到式Ⅰ化合物。硫脲和异硫脲鎓盐可从商业上获得，也可利用下面的参考文献中描述的合成方法进行制备：Org.Syn.Coll.,卷Ⅱ(S-甲基异硫脲硫酸盐)，Org.Syn.Coll.，卷Ⅲ(S-乙基硫脲)，化学评论，55,181(1955)。X为三烃基铵的式Ⅰ化合物可通过将步骤2中得到的游离胺用所需要的烷基化剂如三烃基碘，对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐等进行烷基化反应而得到，如果需要可连续进行。
本发明化合物可方便地表示为与阳离子首基X相连的脂酰胺尾基。图1中显示了有代表生的脂酰胺尾基，其中X代表阳离子首基。有代表生的阳离子首基X显示于图2中。通常，阳离子首基为胍基部分。利用图1和图2的代表方式，表1中显示了利用上述方法及在实施例中制备的本发明化合物的有代表性的实例。
  脂酰胺尾基     阳离子首基
    1     A,B,C,D,E
    2     A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,M,O,P,Q,R,S,T,U
    3     A,B,C,D,E
    4     A,B,C,D,E
    5     A,B,D,E
    6     A,B,D,E
    7     A,B
    8     A,B,R
    9     B
    10     B
    11     B,N
    12     B,M,N
    13     B
    14     B
优选化合物R1和R2为CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8-的式Ⅰ化合物是优选的。特别优选的是R3和R4为烷基氨基(任意N-保护的)或叔丁氧羰基，且R1和R2为CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8-的式Ⅰ化合物。
应用
本发明的阳离子类脂一般用作各种生物活性物质如药物或核酸的载体。特别是该阳离子类脂可在用于制备类脂复合体的制剂中单独使用，也可与其它类脂联合应用，类脂复合体用于胞内递送生物活性物质。本发明的阳离子胍基类脂的应用包括那些与目前实际使用商业上的阳离子类脂制品如LipofectinTM相应的转染方法，以及其它公开的利用常规阳离子类脂的递送技术。本发明的阳离子类脂可用于药物制剂，通过各种体内或从自体内途径递送治疗剂到哺乳动物的各个部位，从而达到预期的治疗效果。它们也可在体外用来转染和制备能表达有商业意义的蛋白质的细胞系。
类脂复合体的制备
含有本发明阳离子类脂的脂质体可用本领域普通技术人员熟知的方法进行制备。一般是将阳离子类脂(带有一个或多个任意共类脂)的有机溶液干燥得到类脂膜，然后将其再水化得到脂质体的悬液。从所需类脂成分制备干燥类脂膜的适宜溶剂可理解为是能溶解所有成分并可在其后通过蒸发或冷冻干燥而方便去除的任何溶剂。这样的溶剂的实例为氯仿、二氯甲烷、乙醚、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、甲醇、或其它脂族醇如丙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、异丁醇、戊醇和己醇。实施本发明时也可用两种多种溶剂的混合物。
用于由干燥类脂膜形成脂质体的合适的水性介质可以是，例如水、缓冲水溶液、或组织培养基。例如，合适的缓冲液为磷酸盐缓冲盐水，即：pH 7.4的10mM磷酸钾在0.9％NaCl中的溶液。介质的pH值应该在约2-约12的范围内，但优选约5-约9，最优选约7。某些情况下，生物活性物质将包括在再水化介质中，而在其它情况下，如对于核酸，它们将在再水化/脂质体形成过程后再加入。
任意共类脂的实例为与磷脂相关的物质如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘髓磷脂、脑磷脂、心肌磷脂、磷脂酸、糖脂、磷酸三十二烷酯、二油酰磷脂酰氯(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰氯(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰氯(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚氨基-甲基)环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)。此外不含磷的磷脂是，例如：硬脂酰胺、十二烷胺、十六烷胺、乙酰十六酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-十二烷基硫酸盐、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧化的脂肪酸酰胺、二十八烷基二甲基溴化铵、和类固醇如胆固醇，麦角甾醇，麦角甾醇B1、B2和B3，雄甾酮、胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸等。优选的共类脂是胆固醇和/或DOPE。
任意地，该悬液可经过声处理、逆向蒸发、冷冻-熔化或挤压方法以生成特定尺寸范围的脂质体。优选制备直径为约50-约200μM的单层脂质体。然后将被递送的生物活性物质与脂质体的悬液混合生成生物物质的类脂复合体。
复合体上的净电荷可由脂质体上的电荷、生物物质上的电荷、和每种物质的相对用量来决定。由此即可制得阳离子类脂，也可制得阴离子类脂。一般优选避免所制得的复合体为中性，特别是当它们被制备成用于核酸的体内递送时。一般这一点是通过将较小的组分(对于基本电荷)加入到较大组分中，并用力搅拌以避免局部浓度梯度来完成的。因此，当制备阴离子复合体时，将阳离子脂质体悬液加入到核酸中，而制备阳离子复合体时，添加顺序要反过来。一般观察认为阴离子复合体更适合核酸的呼吸道递送，而静脉内递送可由阳离子复合体更有效地完成。
药物制剂
本发明提供了包含上述阳离子类脂及一种或多种生物活性物质的药物组合物。这样的药物组合物有助于细胞内生物活性分子进入组织和器官如呼吸道上皮细胞、肺、心脏、胃粘膜和固体肿瘤。另外，这些组合物有助于生物活性物质进入体外维持的细胞中。生物活性物质
在本发明的药物制剂中所包含的生物活性物质包括药物和核酸。如本文所描述，核酸包括基因组DNA、cDNA、RNA、mRNA、核糖体RNA、反义RNA、核糖酶、RNA和DNA的混合双链体与三链体以及质粒。核酸还包括(分子中)的天然碱基、糖残基和/或磷酸二酯键经过修饰的那些以及肽核酸。这样的修饰包括硫代磷酸、非天然碱基的取代等，包括但不限于PCT申请WO 96/1840和WO 96/1841中公开的那些。
一般核酸将对治疗或诊断意义上的蛋白质进行编码。这样的蛋白质包括组织相容性抗原、细胞粘着分子、生长因子(例如有关外周动脉疾病的血管内皮生长因子)、重组人类因子Ⅷ、激素(胰岛素、生长激素、生长激素释放因子)、细胞因子(例如IL-12)、趋化因子、抗体、抗体片断、细胞受体、胞内酶、转录因子(例如NF-κB、IκB)、毒肽(诸如蓖麻毒蛋白A链、白喉毒素等，它们可除去染病或有害的噁性细胞)或任何这些物质的片断或修饰体。应理解为这样的蛋白质包括野生型蛋白质的截断和突变型蛋白，依据治疗的需要可将它们用作野生型变异体的激动剂或拮抗剂。
核酸还可包含表达控制序列，且一般将具有含转录启动子、增强子、转录终止子、操纵基因或其它控制序列的转录单位。通常希望能有一种组织特异性启动子，以确保蛋白质在靶组织中的特异性表达。一般核酸编码的诊断上有意义的蛋白质常带有另外对选择性或诊断标记(例如lacZ、β-半乳糖苷酶、氯霉素转移酶等)编码的序列。
本发明的阳离子类脂-核酸制剂还可含有能与细胞的成分结合的配体和/或受体。配体是任何能与另一个称之为受体的分子特异性结合的化合物，配体和受体形成一个互补对。例如，配体可以是针对细胞表面受体的抗体，如主要组织相容生复合体HLA-A的抗原。这样的制剂可使配体特异性地将核酸靶向在其表面表达受体的细胞亚单位(subset)。另外，配体可以是小分子，如象血管紧张肽转化酶这样的胞内酶的抑制剂。配体可以与阳离子类脂共价结合或非共价嵌入脂质体的膜中。转染
本发明的阳离子类脂-核酸复合体可在体外和体内用来转染细胞。体外实验是在有血清和无血清两种情况下进行的。转染效率相对于商业上的阳离子类脂制剂如LipofectinTM，DOTMATM，以及最近才公开的阳离子类脂如Cytofectin GS-2888(J.G.Lewis等人，美国国家科学院院报，93卷，3176-3181(1996)等来确定。转染效率利用带有lacZ/β-半乳糖苷酶可检测标记的PCMVβ质粒来测定。如实施例部分中的详细描述所显示，在血清存在的条件下，所测阳离子类脂的转染效率一贯比LipofectinTM或GS-2888要高。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但仍相信本文所公开的由阳离子胍基类脂提供的这些令人惊奇的优越性应归功于胍基首基可更牢固地与DNA结合，因此更少地与血清蛋白质结合。
可利用本发明的阳离子类脂介导的递送来转染的细胞类型包括但不限于内皮细胞、上皮细胞(特别是肺上皮细胞)、肺泡、支气管细胞、角质形成细胞和滑液细胞。
同时还令人惊奇地观察到将胍基首基与脂酰胺部分连结起来的连接链的长度在转染效率中起到重要作用，即脂酰胺的酰氨官能团与胍基首基之间的2或3个碳原子链的间隔基，其转染效率高于3或4个碳原子链的间隔基的转染效率。
表1显示了在鼠成纤维(3T3)细胞、上皮细胞(HBE)和血管内皮细胞(IVEC)中，在油基尾基和胍基首基之间具有1-4个碳原子链长的连接链的阳离子类脂的转染效率。转染效率以相对于DOTMATM获得的数据来表示。
表1
化合物 连接基团长度   3T3   HBE   IVEC
    1B     1   16.6   1.9   2.4
    2B     2   23.3   1.5   7.4
    7B     3   4.2   0.4   1.4
    9B     4   4.3   0.2   2.1
另外还惊奇地观察到：胍基首基的氨基上的取代基也提供了出乎意料的高转染效率。表2显示了在鼠成纤维(3T3)细胞、上皮细胞(HBE)和血管内皮细胞(IVEC)中，由油基尾、亚乙基连接链和胍基首基上的不同取代基组成的阳离子类脂的转染效率。转染效率是以相对于DOTMATM获得数据来表示的。
表2
化合物   3T3  HBE  IVEC
    2B   16.6   1.9   7.4
2C 9.0 1.5 7.3
    2Q   47.8   1.6   23.2
    2O   50.0   4.4   11.2
    2R   41.1   2.9   47.5
体内转染过程可通过直接注射入动物体内细胞中来进行。另外，转染也可通过体外从动物体内移植的细胞，然后将细胞重新再植入动物体内(从活体内方法)来完成。转染的体内和从活体内的临床试验记录可见于人类基因治疗，7,1621-1642(1996)。可在体内转染的组织包括呼吸道上皮和血管内皮。
可经任何可接受的系统或局部途径给药，例如：胃肠外的、口服(特别是婴儿制剂)、静脉内的、鼻的、支气管吸入剂(即气溶胶制剂)、经皮或局部途径，可以是固体、半固体或液体剂型如片剂、栓剂、丸剂、胶囊、粉剂、溶液、悬浮液、气雾剂、乳剂等，优选以适合精确剂量的简便给药的单位剂型。该组合物将包括惯用的药物载体或赋形剂、生物活性物质、式Ⅰ的阳离子类脂，此外还可包括其它药物、药剂、载体、辅剂等。载体可选自各种油，包括石油，动物、植物或合成油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水、盐水、含水右旋糖和乙二醇是优选的液体载体，特别是用于注射溶液。适宜的药物载体包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、干燥脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。其它适宜的药物载体和它们的配方参见E.W.Martin的“Remington′s医药科学”。
如果需要，所给予的药物组合物也可含有少量无毒的辅助物质如湿润剂或乳化剂、PH缓冲剂等，诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇一月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本发明的类脂-聚阴离子复合体一般是以含与聚阴离子和式Ⅰ的阳离子类脂结合的药物赋形剂的药物组合物形式给药。如前所述，它对核酸编码的治疗上有意义的蛋白质的递送特别有用。核酸和阳离子类脂在制剂中的浓度可由本领域技术人员在惯用范围内进行变化。对于体外给药来说，核酸的用量范围是约0.5-100μM，优选约1.5-30μM，而阳离子类脂的用量范围是约1-200μM，优选约5-120μM.对于体内给药来说，核酸的用量可以是约0.1-10mM，优选约0.2-2mM，而阳离子类脂的用量可以是约0.1-20mM，优选约0.2-10mM。静脉内给药
静脉注射已被证明是治疗剂给药的重要途径。含有本发明的阳离子类脂的药物制剂可经这种途径给药，例如通过制备上述类脂复合体并将其分散于可接受的输液中。一般本发明化合物的每日用量可通过一次性输入或通过均匀间隔一定时间的几次输入来给药。
美国专利4,016,100中描述了用于注射或口服给药的控释脂质体液体药物制剂。已有建议将冻干的脂质体/肽药物混合物填充到肠溶胶囊中作为口服的脂质体药物，参见美国专利4,348,384。上述文献均引入本文作为参考。气雾剂给药
气雾剂给药是一种将治疗剂直接递送到呼吸道的有效方式。这一方法的优点是：(1)它设法克服了酶降解、从胃肠道的不良吸收、或治疗剂由于肝脏的首过作用而损失等的影响；(2)以这种方式给药时，治疗时不会因为它们的分子大小、电荷或对肺外部位的亲和力而无法到达它们在呼吸道上的靶部位；(3)它可使治疗剂经肺泡快速吸收入体内；(4)它可避免其它器官系统接触到治疗剂，这在接触可能导致不期望的副作用的情况下尤为重要。由于这些理由，气雾剂给药对于哮喘、肺的局部感染、以及肺和呼吸道的其它疾病或病况的治疗来说特别有利。
有三种类型的药物吸入装置：喷雾式吸入器、定量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。喷雾式装置可产生高速气流，将治疗剂(已制备成液体型式)以雾状喷射到患者的呼吸道。MDI一般带有与压缩气体包装在一起的制剂。一经开启，该设备就通过压缩气体排放出定量的治疗剂，由此提供了一种以一定剂量给药的可靠方法。事实上，MDI已采用含氯氟烃(CFC)作为压缩气体来推进治疗剂。在最近几年里，CFC被认为与地球臭氧层的消耗有关。因此，其它没有臭氧威胁的推进剂已被选作CFC的可能的替代品。
DPI是以游离流动粉末的方式给予治疗剂的，这些粉末可通过该装置在呼吸过程中分散到患者的吸入气流中。为了得到游离的流动粉末，用赋形剂如乳糖来配制治疗剂。将定量的治疗剂贮存于胶囊中，并随着每次开启而给出。所用的DPI的实例为Spinhaler(用于色甘酸二钠的给药)，Rotahaler(用于羟甲叔丁肾上腺素的给药)和Turbuhaler(用于间羟叔丁肾上腺素的给药)。所有上述方法都可用作本发明的给药方式，特别适用于哮喘和其它类似或与呼吸道异常相关疾病的治疗。栓剂
对于通过栓剂的系统给药来说，惯用的粘合剂和载体包括：例如聚二醇或甘油三酸酯〔例如PEG1000(96％)和PEG4000(4％)〕。这样的栓剂可由含有约0.5wt/wt％-约10wt/wt％，优选约1wt/wt％-约2wt/wt％的活性成分的混合物形成。液体
可以液体给药的药物组合物的制备是通过溶解、分散等形式将上述活性化合物(约0.5％-约20％)和任选的载体中的药物辅剂如水、盐水、含水右旋糖、甘油、乙醇等一起制备成溶液或悬浮液。
制备这种剂型的现行方法对于本领域技术人员来说是熟知的或将要知道的，例如参见Remington′s药物科学，Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,16th Ed.,1980。按照本发明的教导，在任何情况下，所给药的组合物都将含有用来缓解所治疗的特定病情的有效治疗量的活性化合物。
实施例
给出下面的实施例是为了使本领域技术人员更清楚地理解和实施本发明。它们对本发明范围不起任何限制作用，仅仅是对本发明的解释和说明。
缩写：
BOC-叔丁氧羰基
CDI-羰基二咪唑
硫代-CDI-硫代羰基二咪唑
PYBOP-六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧)三吡咯烷磷鎓
DIEA-二异丙基乙基胺实施例1  式Ⅰ化合物的制备A.3-[N′,N″-双(2-叔丁氧羰基氨基乙基)胍基]-N,N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺(图1和图2所示的化合物2-0)的制备
2B合成的特定反应顺序见反应流程C和D。在实验过程中描述的中间体在这些反应流程中给出了编号。
反应流程C
Figure C9712151400271
R=CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7
反应流程D
Figure C9712151400281
化合物1
向室温下油酸(99+％,12.48gm.,44.2mmol)的二氯甲烷(200ml)溶液中加入1,1′-羰基二咪唑(8.24g,50.2mmol)。搅拌30分钟后，加入浓缩氢氧化铵(50ml)和四丁基溴化铵(1.42g,4.42mmol)，所得混合物迅速搅拌2小时。用水(100ml)搅拌后，分离有机层，用水洗涤两次，(硫酸镁)干燥，并真空解吸。粗产物(12.88g)从己烷中重结晶得到12.35g化合物1，为白色固体。
1HNMR(CDCL3)δ0.86(t,J=6.6Hz,3H),1.27-1.80(m,22H),2.0(m,4H),2.22(t,J=8.0Hz,2H),5.30(m,2H)；MSm/z281(M+)。化合物2
在氩气氛下，在1分钟内用注射器向室温下化合物1(10g,35.5mmol)的干燥四氢呋喃溶液(100ml)中逐滴加入氢化铝锂(39ml,39mmol 1摩尔的THF液)。有轻微的放热。该奶状混合物在室温下搅拌1小时后，再于50℃搅拌6小时。向迅速搅拌的冰冷却的混合物中顺序缓慢滴加水(1.5ml)，氢氧化钠水溶液(15％,1.5ml)，水(3.5ml)。将所得白色颗粒状固体过滤并用二氯甲烷(30ml)洗涤。用二氯甲烷溶液洗提后，所得无色液体(9.7g)经硅胶柱快速层析(用5％-7％-10％甲醇的二氯甲烷液进行洗脱)得到7.4g无色液体。
1HNMR(CDCL3)δ0.88(t,J=6.6Hz,3H),1.27-1.64(m,36H), 2.00(m,4H),2.68(t,J=7.0Hz,2H),5.36(m,2H)；MSm/z267(M+) 。
化合物3
向室温下油酸(99％,28.25g,100mmol)的二氯甲烷溶液(400ml)中一次加入1,1′-羰基二咪唑(17.84g,110mmol)并在氩气氛下搅拌30分钟。然后加入化合物2(26.75g,100mmol)并在氩气氛下搅拌2小时。加入水(200ml)后将该混合物搅拌几分钟。分离二氯甲烷层，(用硫酸镁)干燥，并真空浓缩得到白色脂膏(57.5g)。
1H NMR(CDCL3)δ0.88(t,J=6.5Hz,6H),1.27-1.73(m,54H),2.01(m,8H),2.15(t,J=6.0Hz,2H),3.26(q,J=7.0Hz,2H),5.35(m,2H)；MS m/z531(M+)。化合物4
在氩气氛下，在1分钟内用注射器向室温下化合物3(9.67g,18.25mmol)的干燥四氢呋喃溶液(100ml)中逐滴加入氢化铝锂(20ml,20mml 1摩尔的THF液)，然后在氩气氛中60℃下搅拌过夜。向迅速搅拌的冰冷却的混合物中顺序缓慢滴加水(0.7ml)，氢氧化钠水溶液(15％,0.7ml)，水(2.1ml)。将所得白色颗粒状固体过滤并用乙醚(50ml)洗涤，(用无水硫酸镁)干燥并真空浓缩。粗黄色油(9.45g)经硅胶闪式层析(用25％乙酸乙酯/己烷+1％三乙胺洗脱)得到4.2g淡黄色油和0.89g稍微不纯的产物。
1HNMR(CDCL3)δ0.88(t,J=2.6Hz,6H),1.25-1.98(m,46H),2.02(m,8H),2.58(t,J=2.5Hz,4H),5.34(m,4H)；MSm/z518(M+)。
化合物5
在氩气氛中，向室温下化合物4(10.36g,20mmol)、N-t-BOC-β-丙氨酸(3.78g,20mmol)和PyBOP(12.49g,24mmol)的混合物中加入二甲基甲酰胺(75ml)并搅拌5分钟。向该溶液中加入二异丙基乙基胺(10.45ml,60mmol)，接着再搅拌45分钟。向搅拌着的棕色溶液中加入水(500ml)和乙酸乙酯(250ml)。分离有机层，水层用乙酸乙酯(100ml)萃取两次。合并后的有机部分用水(100ml)洗涤，(硫酸镁)干燥并真空浓缩。粗棕色油状固体经硅胶柱快速层析(5％-10％乙酸乙酯/己烷)得到13.45g无色油。
1HNMR(CDCL3)δ0.88(t,J=6.7Hz,6H),1.26-1.42(m,45H),1.42(s,9H),1.43-1.75(m,6H),2.00(m,8H),2.50(t,J=4.8Hz,2H),3.16(brt,2H),3.30(brt,2H),3.41(brt,2H),5.35(m,2H)；MSm/z 688(M+)。
化合物6
在氩气氛中，向化合物5(7.75g,11.2mmol)的干燥二噁烷溶液(20ml)中加入4N HCL的二噁烷液(25ml)并在室温下搅拌过夜。该溶液洗提后加入乙腈(50ml)，洗提，重复2次以上。残余物用乙酸乙酯(200ml)和10％氢氧化钠水溶液(100ml)搅拌2小时。分离乙酸乙酯层，水层用乙酸乙酯(50ml)萃取，合并后的乙酸乙酯部分用(硫酸镁)干燥并真空浓缩。粗油(6.6g)经硅胶闪式层析(依次用3％和10％甲醇/二氯甲烷洗脱)得到6.29g非常淡的黄色油。
1H NMR(CDCL3)δ0.88(t,J=7.0Hz,6H),1.27-1.60(m,54H),2.01(m,8H),2.55(t,J=5.9Hz,2H),2.95(m,2H),3.10(brt,2H),3.35(brt,2H),3.25(br t,2H),5.34(m,4H)；MSm/z589(M+)。
化合物7
向65℃下化合物6(0.589g,1.0mmol)、硫脲(95mg,1.25mmol)、三乙胺(0.42ml,3.0mmol)和四氢呋喃(25ml)的溶液中加入氯化汞(0.34g,1.25mmol)并在氩气氛中65℃下搅拌7天。白色悬液逐渐变为黑色。将该悬液冷却至室温，用硅藻土过滤并洗提该溶液。粗稠油用硅胶闪式层析(5％-8％-10％-15％甲醇/二氯甲烷+1％氢氧化铵，回收起始物(425mg)并得到纯产物(170mg)，为淡黄色油。将该油溶于10％甲醇/二氯甲烷并加入1N HCL的乙醚液(1ml)洗提得到混浊油脂。
1H NMR(CDCL3)δ0.88(t,J=6.5Hz,6H),1.27-1.78(m,6OH),2.00(m,8H),2.56(m,2H),3.18(m,2H),3.28(brt,2H),3.54(brt,2H),5.34(m,4H),8.29(brt,1H)；MSm/z630(M+)。
化合物8
在3小时内，向室温下1,2-乙二胺(21g,0.349moles)的干燥二噁烷溶液(120ml)中滴加二碳酸二叔丁酯(9.8g,26.6mmol)的二噁烷液(120ml)。混浊混合物逐渐澄清。该混合物在室温下搅拌过夜。洗提后残余物用水(200ml)搅拌并过滤白色沉淀。滤液用二氯甲烷(200ml)萃取3次，(用氯化镁)干燥，洗提得到无色油(4.8g)。
1H NMR(CDCL3)δ1.44(s,9H),2.83(t,J=6Hz,2H),3.17(q,J=6Hz).
化合物9
向室温下化合物8(0.8g,5mmol)和乙酸乙酯(35ml)的混合物中加入1,1′-硫代羰基二咪唑(1.07g,6mmol)并搅拌过夜。洗提后残余物用硅胶闪式层析，以30％-50％乙酸乙酯/己烷进行洗脱得到0.66g固体。
1H NMR(CDCL3)δ1.53(s,9H),3.59(t,J=8.4Hz,2H),4.10(t,J=7Hz,2H)。
化合物10
在氩气氛中，将化合物8(0.275g,1.72mmol)、化合物9(0.347g,1.72mmol)和甲苯(4ml)的溶液在75℃下搅拌过夜。洗提后残余物用硅胶闪式层析，以2％-3％甲醇/二氯甲烷洗脱得到油(0.37g)。
1H NMR(CDCL3)δ1.45(s,9H),3.34(t,J=5.8Hz,2H),3.54(m,2H)。
化合物11
向65℃下化合物6(0.29g,0.494mmol)、化合物10(0.21g,0.596mmol)、三乙胺(0.27ml,1.98mmol)和四氢呋喃(25ml)的溶液中加入氯化汞(0.16g,0.596mmol)并在氩气氛中65℃下搅拌1天。白色悬液逐渐变为黑色。将该悬液用硅藻土过滤并洗提该溶液。粗稠油用硅胶闪式层析(5％-10％甲醇/二氯甲烷+1％浓氢氧化铵)得到稠油(0.21g)。
1H NMR(CDCL3)δ0.88(t,J=6.8Hz,6H),1.2-1.6(m,72H),2.1(m,10H),2.78(m,2H),3.2-3.55(m,14H),3.68(m,2H),5.35(m,4H)；MSm/z916(M+)。B.其它式Ⅰ化合物的制备
利用上述方法，以合适的酸代替油酸，以合适的硫脲或异硫脲鎓盐代替10，可制得下表中列出的化合物。这些化合物是根据图1和图2中显示的脂酰胺尾基和阳离子首基来定义的。例如，化合物1A是指图1中显示的化合物1，其中X为图2中显示的首基A。
基因治疗中新的类脂
  化合物     MP℃     MS(M+H)
    1A     575  m+
    1B     76.3-78.8     617.3
    1C     673.9
    1D     781.8
    1E     617.7  m+
    2A     589.5
    2B     631.4
    2C     687.6
    2D     795.5
    2E     631.6  m+
    2F     831.8
    2G     673.6
    2H     102-105.1     763.6
    2I     703.6
    2J     779.6
    2K     670  m+
    2M     741.5
    2O     916.8
    2P     717.7
    2Q     743.6
    2R     945.7
    2S     832.7
    2T     973.8
    2U     799.8
    3A     579.4
    3B     621.6
    3C     88.8-91.2     677.7
    3D     785.7
    3E     621.5  m+
    4A     65.9-67.8     592  m+
    4B     27.3-29.0     635.7
    4C     54.5-57.0     691.7
    4D     799.7
    4E     635.8  m+
    5A   166.4-168.4     410  m+
    5B     453.4
    5D     91.2-92.5     617.5
    5E     453.6  m+
    6A     49-56     424  m+
    6B     467.7
    6D     631.4
    6E     467.5  m+
    7A     125-129.2     603.6
    7B     645.6
    8A     66.5-69.6     439.4
    8B     481.4
    8R     781.5
    9B     659.6
    10B     495.5
    11B     623.7
    11N     723.5
    12B     GS-2888     745.6
    12N     845.5
    13B     523.6
    14B     141.5-154     578.6
实施例2  脂质体的制备
在下面的实施例中将使用含有1∶1摩尔比的所示阳离子类脂和中性类脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE’)的阳离子脂质体囊。
例如，将溶于二氯甲烷的9.19mg 2-胍基-N,N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺(化合物2B)与10.81mg DOPE的氯仿液混合。通过旋转式蒸发去除溶剂，类脂膜真空干燥。该膜用20ml无菌水再水化到浓度为1mg/ml，加热至45℃，在高粉浴近距离声波定位器中用声波处理，或压制成多层脂质体囊。利用Coulter Submicron Particle Sizer.N4M，(Coulter,Hialeah Florida)对颗粒尺寸进行激光扫描。新脂质体制剂的平均颗粒大小为296nm±40。实施例3  类脂-核酸复合体的制备
在下面的实施例中，将对lacZ/β-半乳糖苷酶基因编码的PCMV β质粒(Clontech,Palo Alto,CA)以1mg/ml的浓度储存于-20℃下的水中。用与CMV启动子连接的对CAT基因编码的PCT0129质粒来制备用于体内递送的复合体。用无血清的Optimem培养基(LifeTechnologies,Gathersburg,Md.)将质粒DNA稀释到浓度为8μg/ml，然后将其加入到等体积的阳离子脂质体溶液中。复合体在用于转染试验前先形成30-45分钟。以类脂/DNA为1∶1、1∶5和1∶25(重量)的比例来制备复合体。
类脂/DNA复合体也可利用两种商业上可获得的类脂转染剂LipofectamineTM和LipofectinTM(LifeTechnologies,Gathersburg,Md.)来制备。这些试剂将以惯用于转染的商业上可获得的类脂为准来评定其转染效率。实施例4  转染效率的测定
在含有血清或不含血清的培养基中比较利用本发明的含有胍基的脂质体得到的转染效率与含有季铵的脂质体的转染效率(图3-5)。同时测定不同共类脂(DOPE或胆固醇)以及共类脂与阳离子胍基类脂的摩尔比对转染效率的影响(图6)。还要测定本发明类脂的转染效率与DOTMATM和GS2888的转染效率在体外(图7)和体内(图8)的对比数据。
将新的类脂/DNA复合体置于96孔微量滴定板中进行常规筛选，以测定三个不同细胞系：NIH3T3鼠成纤维细胞(ATCC#CTRL 1658)、IVEC人内皮细胞(购自Dr.Denise Paulin,Pasteur Institute,Parise,France，细胞生理学杂志，457,41-51(1993)和16-HBE14o-人上皮细胞，美国生理学杂志，268,L347-L360(1995)的基因转移效率。
细胞在Costar微量滴定孔(Cambridge,MA)中覆以0.5％胶原(Collaborative Biomedical,Bedford,MA)进行培养。转染前48小时先将细胞以20,000细胞/孔的浓度接种于完全培养基中。在转染当天吸出基质，细胞用Optimem培养基洗涤3次，向每个微量滴定孔中加入50μL带或不带10％FBS的Optimem培养基(BioWhittaker,Walker)，并向合适的孔中加入50μL类脂/DNA复合体，以使终DNA浓度的细胞用类脂DNA复合体在37℃温育5小时。然后将该培养基吸出，替之以100μL含有血清的完全培养基，之后再将细胞培养48小时。
为了评定转染效率，制备细胞溶解产物，并按照生产者的说明，利用荧光底物4-甲基伞形基(umbelliferyl)β-D半乳糖苷酶(MUG)(Sigma,St.Louis,MO)来测定β-半乳糖苷酶的活性。水解了的底物的量利用CytoFluorⅡ荧光计(Mllipore,Bedford MA)进行荧光测定。利用BCA试验(Pierce,Rockford IL)测定溶胞产物中的总细胞蛋白质，结构表示为荧光单位/μg蛋白质，每个数据点代表3份样品的平均测定值。A．人内皮细胞(IVEC)的转染：
在无血清培养基(图3A)或有血清的培养基(图3B)中，用与0、2、10或50μg/ml阳离子脂质体复合的2μg/ml PCMV-β质粒来转染IVEC细胞(2×104)。转染48小时后，利用荧光底物(MUG)检测β-半乳糖苷酶活性并将细胞溶解产物中的每μg蛋白质的活性归一化。每个数据点代表一式三份样品的平均值。图3B显示的有血清的情况下，几种新化合物的转染效率比商业上可获得的化合物高2-10倍。B．人支气管上皮细胞(16HBE)的转染：
在无血清培养基(图4A)或含有血清的培养基(图4B)中，用与0、2、10或50μg/ml阳离子脂质体复合的2μg/ml PCMV-β质粒来转染16HBE细胞(2×104)。转染48小时后，利用荧光底物(MUG)检测β-半乳糖苷酶活性并将细胞溶解产物中的每μg蛋白质的活性归一化。每个数据点代表一式三份样品的平均值。
图4A中的结果显示，在人支气管上皮细胞中，在无血清的情况下，几种新化合物的转染效率与商业上可获得的化合物LipofectinTM的转染效率相当，其中一种新化合物的转染效率比其高出约30％。另一方面，图4B显示的有血清的情况下，几种新化合物的转染效率高于商业上可获得的化合物的近数倍。C．鼠3T3成纤维细胞的转染：
在无血清培养基(图5A)或含有血清的培养基(图5B)中，用与0、2、10或50μg/ml阳离子脂质体复合的2μg/ml PCMV-β质粒来转染3T3成纤维细胞(2×104)。转染48小时后，利用荧光底物(MUG)检测β-半乳糖苷酶活性并将细胞溶解产物中的每μg蛋白质的活生归一化。每个数据点代表一式三份样品的平均值。
图5A中的结果显示，在鼠3T3成纤维细胞中，在无血清的情况下，几种新化合物的转染效率比商业上可获得的化合物Lipofectin的转染效率高出约30-50％，显示于图的较右方。另一方面，图5B显示的有血清的情况下，几种新化合物的转染效率比商业上可获得的化合物高4-10倍。D．人内皮细胞中共类脂对新化合物2-胍基-N,N-二-十八碳-9-烯基-丙酰胺(2B)的转染效率的影响：
制备含2B：胆固醇：DOPE的摩尔比不同的阳离子脂质体。在有血清或无血清的培养基中，用与0、2、10或50μg/ml阳离子脂质体复合的2μg/ml PCMV-β质粒来转染IVEC细胞(2×104)(图6)。转染48小时后，利用荧光底物(MUG)检测β-半乳糖苷酶活生并将细胞溶解产物中的每μg蛋白质的活性归一化。每个数据点代表一式三份样品的平均值。
图6中的结果显示，在人内皮细胞中，在有血清的情况下，新化合物2B与胆固醇和DOPE以1∶0∶1和0.5∶0.25∶0.25的比例结合时的转染效率比商业上可获得的化合物LipofectinTM和LipofectAmineTM的转染效率高出约10-20倍，显示于图的较左方。图6中显示的无血清的情况下，新化合物2B与DOPE以1∶1的比例结合时的转染效率比商业上可获得的化合物LipofectAmineTM的转染效率高出约40％。E．新的RS-化合物相对于Cytofectin GS2888的转染活性
以两种方式将BOC保护的GS-2888分别制备成盐酸盐和游离碱。阳离子类脂与中性类脂的比例为1∶1。图7B作为对照，显示GS-2888是有活性的。在图7A和7B中所用的化合物是用同一批料，在同一天，利用不同细胞上的相同DNA制备的。
在含有血清的培养基中(图4B)，用与0、2、10或50μg/ml阳离子脂质体复合的2μg/ml PCMV-β质粒来转染2×104细胞。GS-2888与中性类脂的配比为1∶1和2∶1摩尔比。转染48小时后，利用荧光底物(MUG)检测β-半乳糖苷酶活性并将细胞溶解产物中的每μg蛋白质的活性归一化。每个数据点代表一式三份样品的平均值。图7A显示了IVEC内皮细胞中的转染效力。图7B显示了16-HBE上皮细胞中的转染效力。图7A表明在HBE细胞中，几种新的胍基类脂的转染效率比GS2888高出10倍。F．本发明的新化合物的体内转染效率
确立一种以适于体内递送的浓度和体积制备DNA/类脂复合体的可重复的方法。该方法是用含有阳离子类脂DOTMATM或本发明的阳离子类脂配以性类脂DOPE的脂质体来进行的。DNA采用聚阴离子环状质粒的形式。成功的复合是通过将较少的成分缓慢注入迅速搅拌的主要成分的溶液中来完成的。这一方法是在无菌环境中操作的，可根据复合体大小在较宽的浓度范围(DNA 0.15-1.5mM；类脂0.2-8.5mM)内和电荷比例下重复进行。
体内试验是用麻醉鼠，通过类脂/DNA复合体的气管内装置来进行的。用与CMV启动子相连的对氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)编码的质粒(PCT0129)来进行转染效率的所有体内评估。转染复合体一般含有与0.8-3.5mM脂质体和5％右旋糖复合物200μg DNA。利用上述装置，通过与30测量针连结的P10导管将250μL复合体输送到鼠的肺部。40小时后将动物处死，摘除肺并利用CAT Elisa试验(Boehringer Mannheim)分析酶活性。
不同组的阳离子类脂与DOTMATM对比的结果显示于图8A中。数据表示为平均微微克CAT蛋白质/mg肺蛋白质(n=8)，结果显示：在接受了与本发明类脂复合的DNA的动物体中检测到的CAT蛋白质水平比接受了与DOTMATM复合的DNA的动物体中检测到的CAT浓度高50倍。
出于清晰和便于理解的目的，上述发明已通过图表和实施例进行了详细描述。对于本领域技术人员来说，显然可在本权利要求书记载的范围内进行改变和改动。因此，应理解为上面的描述是解释性的，而不是限制性的。所以本发明的范围不应依据上面的描述来确定，而应当根据下面的权利要求以及该权利要求所定义的等效物的整个范围来确定。
在本说明书中引用的所有专利、专利申请书和出版物均作为一整体而完全结合在此作为参考，就象每一单个专利、专利申请书或出版物均在此单独地公开了一样。

Claims (15)

1．式Ⅰ化合物及其盐、溶剂化物、拆分了及未拆分的对映体、非对映体或它们的混合物：
R1R2N-C(O)-A-X    式Ⅰ其中：
R1和R2可以是相同的或不同的，为C10-C26烃基；
A为亚烃基，其中一个或多个亚甲基可被基团Y任意取代，条件是Y基团彼此不能邻接，而每个Y可独立地为：-O-,-OC(O)-,-C(O)O-,-NR5-,-NR5C(O)-,-C(O)NR5-,NR5C(O)NR5-,-NR5C(O)O-,-OC(O)NR5-,-S(O)n-,n为0、1或2，或-NZ-C(=NZ)NZ-，其中每个Z独立地为H或-(CH2)mNR5-C(=NR5)NR5,m为1-10的整数，而每个R5独立地为H或C1-6烷基；
X是：(1)三烃基铵基，其中烃基彼此相同或不同，或(2)-NH-C(=NR3)NHR4，其中R3和R4各自独立地为烃基、卤代烷基、羟烷基、O-保护的羟烷基、烷氧烷基、卤代烷氧烷基、芳氧烷基、氨基烷基、单或二取代氨基烷基、N-保护的-氨基烷基、酰基、烷氧羰基、芳氧羰基、-C(O)NR6R7，其中R6和R7独立地为H或烃基、氮保护基，或R3和R4与它们连接的原子一起形成单环或双环化合物，任选地被烷基，环烷基，链烯基，炔基，芳基，卤代烷基，羟基，氨基，卤代，硝基，氰基，羧基，氨基甲酰基，烷氧基，卤代烷氧基，单和二取代氨基，酰基，烷氧酰基或芳氧酰基取代；但条件是：
当R1和R2相同，均为C16烷基，而X为-NH-C(=NH)NH2时，A不为亚丁基链；
以下情况不同时发生：R1=R2=C18H37，A是(CH2)n(n=5或10)而X是三甲基铵基；
以下情况不同时发生：R1=R2=C18烷基，A为亚甲基，X为-NH-C(=NH)NH2。
2．按照权利要求1的化合物，其中X为-NH-C(=NR2)NHR4。
3．按照权利要求1或2的化合物，其中R1和R2为烷基或单不饱和链烯基。
4．按照权利要求1所述的化合物，其中R1和R2是相同的。
5．按照权利要求1所述的化合物，其中R1和R2为CH3(CH2)7CH=CH(CH2)8-。
6．按照权利要求1所述的化合物，其中A为亚烷基。
7．按照权利要求1所述的化合物，其中A为亚甲基或亚乙基，而R3和R4均为H或N-保护的-氨基烷基。
8．按照权利要求1所述的化合物，其中R3和R4为选自下列基团的N-保护的-氨基烷基，选自2-(叔丁氧羰基氨基)乙基和3-(叔丁氧羰基)丙基。
9．聚阴离子-类脂复合体，含有权利要求1-8中任一项所述的化合物和聚阴离子。
10．权利要求9的聚阴离子类脂复合体，其中聚阴离子为核酸。
11．按照权利要求9或10的聚阴离子类脂复合体，进一步含有靶向配体。
12．按照权利要求10所述的聚阴离子类脂复合体，其中核酸为表达质粒。
13．权利要求12的聚阴离子-类脂复合体，其中所述表达质粒编码IL-12或IκB。
14．利用权利要求9-13中任一的聚阴离子-类脂复合体将聚阴离子递送到细胞中的用途，其物征在于该聚阴离子-类脂复合体与细胞接触。
15．利用权利要求9-13中任一项所述的聚阴离子-类脂复合体和药学上可接受的赋形剂制备药物的用途。
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