CN1714094A - 心磷脂组合物及它们制备的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供新的心磷脂合成途径，该心磷脂具有不同链长、不饱和或饱和的不同脂肪酸和/或烷基链。反应路线可以用于产生新形式的心磷脂，包括心磷脂变体。通过本发明方法制备的心磷脂可以便利地整合到可还包括活性剂如疏水性或亲水性药物的脂质体及其它脂类制剂中。这些制剂可以用于治疗疾病或诊断和/或分析测定。脂质体还可以包括例如用于将它们靶向某一细胞类型或特定组织的配体。

Description

心磷脂组合物及它们制备的方法和应用

技术领域

本发明涉及新的心磷脂组合物，制备它们的方法和包含它们的脂质体组合物。本发明还涉及含有活性剂的脂质体制剂或复合物或乳剂，和它们在诊断测定和治疗人和动物疾病中的应用。

背景技术

脂质体制剂具有增加疏水性药物在水溶液中的溶解度的能力。它们经常降低与药物治疗相关的副作用并且它们为开发活性剂的新制剂提供灵活的工具。

脂质体通常从天然磷脂如磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酸，和磷脂酰肌醇制备。可以加入阴离子磷脂，如磷脂酰甘油和心磷脂以产生提供胶体稳定性的净负表面电荷。这些成分通常从天然来源中纯化，有时它们可以化学合成。

心磷脂(也称为双磷脂酰甘油)，构成一类复杂的阴离子磷脂，其典型地从与高代谢活性相关的组织，包括心肌和骨骼肌的线粒体的细胞膜中纯化。然而，已知的色谱纯化技术不能将心磷脂解析为分离的分子种类。因此，含有该成分的药物制剂是不均一的。

通过化学合成可以获得均质的四肉豆蔻酰心磷脂。然而，该化合物的可获量有限，目前太贵而不能常规用于药物制剂。其它均质心磷脂种类含有限定的疏水性酰基，如脂肪酸，不能商购或仅可获得少量并且成本昂贵。

心磷脂的有限可获量部分是由于合成它的方法繁琐，费时且昂贵的事实。通常，它们包含从取代甘油的不同衍生物开始逐步构建分子的单个部分和多步中间体纯化。已知的合成方法主要分成两组：(a)使用磷酸化剂将2-O-保护的甘油的伯羟基与1，2-O-二酰基-sn-甘油偶联和(b)在2，4，6-三异丙基苯磺酰氯(TPS)和吡啶的存在下2-O-保护的甘油的伯羟基和磷脂酸缩合。

Ramirez等(Synthesis，769-770(1976)；Tetrahedron，33：599-608(1977))描述一种心磷脂的合成方法，其中在三乙胺的存在下用二(1，2-二甲基亚乙烯基)焦磷酸盐磷酸化1，2-O-二酰甘油。产物与2-叔丁基二甲基甲硅烷基氯甘油在胺催化剂的存在下反应生成心磷脂的磷酸三酯形式。在温和碱性条件下去除丙酮基磷酸酯保护基以获得磷酸二酯，在温和酸性条件下去除甲硅烷基。该合成方法进行重要的酯交换反应，其产生除了所需心磷脂以外的多种副产物。

Duralski等(Tetrahedron Lett.，39：1607-1610(1998))描述通过与4，4’-二甲氧基三苯甲基氯反应保护甘油的伯羟基。然后通过与与叔丁基二甲基甲硅烷基氯反应保护2-羟基，通过用对甲苯磺酸处理去除三苯甲基。使用双官能磷酸化剂2-氯苯基偶磷二-(1，2，4-三唑胺(triazolide))磷酸化二酰甘油的伯羟基，该双官能磷酸化剂由含有1，2，4-三唑和2-氯苯基磷酸二氯化物的混合物在三乙胺的存在下原位产生，并使与甲硅烷基化的甘油在2，4，6-三异丙基磺酰氯和N-甲基咪唑的存在下反应。通过用2-硝基苯甲醛肟和N，N，N，N-四甲基胍处理将完全保护的心磷脂脱保护，通过用乙酸处理去除甲硅烷基。

Saunders和Schwarz(J.Am.Chem.Soc.，88：3844-3847(1966))描述通过用氯氧化磷磷酸化2，3-二-O-硬脂酰-D-甘油，加入2-O-苄基甘油和通过催化加氢去除苄基来制备心磷脂。通过硅酸色谱法纯化产物。该方法后来为研究者所置疑(Ramirez等，Tetrahedron，33：599-608(1977))，不能使用它来成功地获得心磷脂。

Mishina等(Bioorg.Khim.，11：992-994(1985)；Bioorg.Khim.，13：1110-1115(1987))使用油酸咪唑来酰化sn-甘油-3-胆碱磷酸，其然后用甘蓝磷脂酶D裂解以获得1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸。该化合物在含有2，4，6-三异丙基苯磺酰氯的吡啶中与2-O-叔丁基二甲基甲硅烷基甘油缩合，产生保护的心磷脂，其通过标准方法脱保护而生成心磷脂。

Stepanov等(Zh.Org.Khim，20：985-988(1984))描述使用缩合剂2，4，6-三异丙基苯磺酰氯，二酰基磷脂酸与2-O-苄基甘油缩合。

Keana等(J.Org.Chem.，51：2297-2299(1986))描述在吡啶中使用2，4，6-三异丙基苯磺酰氯，磷脂酰甘油(PG)甲酯与磷脂酸(PA)的偶联。用重氮甲烷甲基化偶联产物的一甲基酯，产生心磷脂的二甲酯，其进行NaI脱甲基化以获得心磷脂。

也已经通过二酰甘油磷酸苄酯的银盐与1，3-二碘丙醇苄醚或1，3-二碘丙醇叔丁醚反应产生心磷脂。例如，De Haas和van Deenen(Biochim.Biophys.Acta，116：114-124(1966))使用多步顺序来获得心磷脂，总产率为26％。摩尔比为2∶1的苄基二酰-L-α-甘油磷酸银和2-叔丁氧基-1，3-二碘甘油之间的反应产生三酯，将其纯化和脱保护以产生心磷脂。立即用碘化钡处理从三酯上去除苄基保护基，通过用氯仿中的无水HCl处理去除叔丁基醚基团。类似地，Inoue等(Chem.Pharm.Bull.，11：1150-1156(1963))描述制备心磷脂的1，3-丙二醇类似物的方法，其中通过1，3-二碘丙烷和苄基二酰-L-α-甘油磷酸银反应制备磷酸二酯键，用碘化钠去除苄基保护基。尽管这些稍后的方案适于制备小量心磷脂，对于常规大量制备无吸引力，因为包括许多步骤，要求小心纯化中间体和使用高度光敏的银盐中间体和不稳定的碘中间体。

需要可以用于以更节省成本的方式制备大量多样和均质的心磷脂种类的新合成方法。这些方法将增加广泛多样的均质心磷脂种类的可获量，和将使开发活性剂的新脂类制剂可用的脂类多样化，其将具有比目前可能的更确定的组成。

本发明提供这些方法和组合物。本发明的这些和其它优点以及另外的发明特征将从本文提供的发明描述中变得明显。

                        发明内容

                        发明简述

本发明提供新的心磷脂分子和类似物及新的心磷脂合成途径，该心磷脂具有不同链长和饱和/不饱和的不同脂肪酸和/或烷基链。反应路线可以用于产生新形式的心磷脂，包括心磷脂变体。通过本发明方法制备的心磷脂可以便利地整合到脂质体、乳剂或复合物(例如药物复合物)中，该脂质体、乳剂或复合物也可以包括(例如与脂质体复合或包埋在脂质体中)活性剂如基因和基因载体，反义分子(例如寡核苷酸)，蛋白质和肽，蛋白质或化学药物(例如疏水性或亲水性药物)或诊断剂。这些脂质体和其它制剂也可以用于治疗疾病或诊断和/或分析测定。

                           附图说明

图1显示心磷脂的通用结构。

图2显示心磷脂的一种合成方案。

图3显示心磷脂的一种备选合成方案。

图4显示心磷脂醚类似物的一种备选合成方案。

图5显示心磷脂的一种备选合成方案。

图6显示心磷脂的一种备选合成方案。

图7显示心磷脂的一种备选合成方案。

图8显示心磷脂的一种备选合成方案。

                         发明详述

本发明提供心磷脂分子(包括其类似物或衍生物)。在一个实施方案中，心磷脂分子具有按照下列通式的结构：

其中Z₁和Z₂相同或不同并且是-O-C(O)-，-O-，-S-，-NH-C(O)-等；

R₁和R₂相同或不同并且可以是H，或饱和或不饱和烷基；

R₃为(CH₂)_n且n＝0-10；

R₄为氢，烷基，取代烷基，环烷基，取代的环烷基，肽，二肽，多肽，蛋白质，糖类如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖等，杂环，核苷，多核苷酸等；

X为阳离子，最优选非毒性阳离子如氢，铵，钠，钾，钙，钡离子等。

在优选实施方案中，心磷脂类似物可以具有式II或式III：

本发明还提供包含心磷脂类似物的组合物，所述类似物具有按照下列同时的结构：

其中Z₁和Z₂相同或不同并且是-O-C(O)-，-O-，-S-，-NH-C(O)-等；

R₁和R₂相同或不同并且是H，或饱和或不饱和烷基；

R₃为(CH₂)_n且n＝0-10；

R₄为氢，烷基，取代烷基，环烷基，取代的环烷基，肽，二肽，多肽，蛋白质，糖类如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖等，杂环，核苷，多核苷酸等；

R5为接头，其可以包含烷基，取代烷基，环烷基，取代环烷基，烷氧基，聚烷氧基如PEG化的含有约1至约500个烷氧基单体单元的醚(可以具有至少约10个烷氧基单体单元，如至少约50个烷氧基单体单元或至少约100个烷氧基单体单元，如至少约200个烷氧基单体单元或至少约300个烷氧基单体单元或至少约400个烷氧基单体单元)，取代的聚烷氧基等，肽，二肽，多肽，蛋白质，糖类如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖等；

X为阳离子，最优选非毒性阳离子如氢，铵，钠，钾，钙，钡离子等。

在最优选的实施方案中，Z₁和Z₂为-O-C(O)-，R₁和R₂相同并且是C₄至C₃₄的饱和和/或不饱和烷基，更优选含有14-24个碳原子(如约16-约20个碳原子)。术语“烷基”包含饱和或不饱和直链和支链烃基部分。术语“取代烷基”包含另外携带一个或多个取代基的烷基，所述取代基选自羟基，烷氧基(或低级烷基)，巯基(低级烷基)，环烷基，取代的环烷基，卤素，氰基，硝基，氨基，酰氨基，亚氨基，硫代，-C(O)H，酰基，氧酰基，羧基等。R₃最优选为CH₂。R₄优选为氢。X最优选为氢或铵离子，其给出如图1所示的心磷脂的通用结构。

可以通过任何期望方法制备心磷脂分子和类似物。本发明提供的一种制备心磷脂分子或其类似物的优选方法包括，在偶联剂N，N’-二环己基碳二亚胺或N，N’-羰二咪唑的存在下将磷脂酸和2-O-保护的甘油反应。本发明另一优选实施方案是一种生产心磷脂或其类似物的方法，其包含在偶联剂的存在下将磷脂酸和甘油反应，所述偶联剂为三异丙基苯磺酰氯，或N，N’-二环己基碳二亚胺或N，N’-羰二咪唑。

本发明的一个实施方案提供制备心磷脂及其类似物如本发明的化合物的一种适当方法，包括将式V的醇

(其中Z₁，Z₂，R₁，R₂和R₃定义如上)和2-O-保护的甘油或2-O-取代的甘油在偶联剂存在下反应，所述偶联剂为二氯磷酸酯或N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯。该方法特别适合于制备式I，II，和III的心磷脂。本发明方法的另一实施方案特别适合于制备式II的心磷脂，包括在偶联剂的存在下将1，2-O-二酰甘油和2-O-保护的甘油反应，所述偶联剂为二氯磷酸酯或N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯(phosphonamidic chloride)。本发明另一实施方案特别优选用于制备式III的心磷脂醚类似物，包括在偶联剂的存在下将1，2-O-二烷基甘油和2-O-保护的甘油反应，所述偶联剂为二氯磷酸酯或N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯。

本发明的一个实施方案提供合成心磷脂分子及其类似物的另一种方法，包括将式V(以上)的醇和式VI的二醇

(其中R₄和R₅定义如上)在偶联剂的存在下反应，所述偶联剂是二氯磷酸酯或N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯。该方法特别适合于生产按照式IV的分子。

用于本发明合成方法的优选偶联剂是式VII的二氯磷酸酯

其中W是烷基或取代烷基，包括甲基，乙基，异丙基，叔丁基，烯丙基，2-取代的乙基，卤代乙基如2，2，2-三溴乙基；苄基或取代的苄基；苯基或取代的苯基如2-氯苯基，4-氯苯基和2，4-二氯苯基；或其它任何可去除的保护基。用于本发明合成方法中的另一种优选偶联剂是N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯。

本发明的一个实施方案在图2中阐明，该图描述一种合成心磷脂的新方法。在该方法中，磷酸化剂，o-氯苯基二氯磷酸酯(CPDCP)3，与1，2-O-二酰甘油1和2-O-保护的甘油2(Y为羟基保护基，优选苄基等，或甲硅烷基保护基，例如叔丁基二甲基甲硅烷基等)在惰性溶剂(例如二氯甲烷等)中在碱(例如吡啶等)的存在下反应，以提供心磷脂前体4。o-氯苯基的去除可以通过4和2-吡啶醛肟(PAO)和1，1，3，3-四甲基胍(TMG)反应，接着用氢氧化铵水溶液处理完成，以提供心磷脂前体5的铵盐。除了2-吡啶醛肟(PAO)以外，其它试剂如2-硝基苯并醛肟在TMG的存在下可以用于去除o-氯苯基。

通过取决于保护基性质的方法可以完成脱保护，产生心磷脂6。例如，通过在钯催化剂的存在下氢化可以去除苄基。在酸性条件下可以将叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)脱保护。通过用2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)处理可以将对甲氧苄基(PMB)脱保护。

本文所用的术语“羟基保护基”是指用于保护羟基在合成步骤期间中免于不希望有的反应的基团。常规使用的羟基保护基在T.W.Greene和P.G.M.Wuts， Protective Groups in Organic Svnthesis，第3版，John Wiley & Sons，纽约(1999)中公开。这些羟基保护基包括：甲基醚；取代的甲基醚，包括甲氧基甲基，苄氧基甲基，对甲氧基苄氧基甲基，叔丁氧基甲基，2-甲氧基乙氧基甲基，四氢吡喃基，四氢呋喃基醚等；取代的乙基醚，包括1-乙氧基乙基，1-甲基-1-甲氧基乙基，1-甲基-1-苄氧基乙基，烯丙基，叔丁基醚等；苄基醚；取代的苄基醚，包括对甲氧基苄基，3，4-二甲氧基苄基醚等；甲硅烷基醚，包括三甲基甲硅烷基，三乙基甲硅烷基，二甲基异丙基甲硅烷基，二乙基异丙基甲硅烷基，叔丁基二甲基甲硅烷基等；酯类，包括甲酸酯，乙酸酯，氯乙酸酯，二氯乙酸酯，三氯乙酸酯，甲氧基乙酸酯，苯氧基乙酸酯等；和碳酸酯。

上述的本发明是一种简单，有效的制备心磷脂的方法。合成的关键步骤是磷酸化偶联反应。在该磷酸三酯方法中，将CPDCP用于以直接的方式顺序地磷酸化醇而直接提供高产率的中间体磷酸三酯。该方法是构建心磷脂核心结构的一种简单、节省成本的一罐式(one-pot)方法。

本发明的这种新的二氯磷酸酯偶联方案优于常规的偶磷二-(1，2，4-三唑胺(triazolide))或偶磷二(羟基苯并三唑)方法(Ramirez等，Synthesis，449-489(1985)；van Boeckel等，Tetrahedron Lett.，21：3705-3708(1980)；van Boeckel等，Synthesis，399-402(1982))。一方面，偶磷二-(1，2，4-三唑胺)或偶磷二(羟基苯并三唑)需要从相应的二氯磷酸酯制备。在另一方面，偶磷二-(1，2，4-三唑胺)方法在大多数情形中在与第二个醇的缩合反应中，优选使用另外的活化剂如2，4，6-三异丙基苯磺酰基-(3-硝基-1，2，4-三唑)或2，4，6-三异丙基苯磺酰氯。

图3表示的本发明另一实施方案包括使用新的磷酸化剂：氯亚磷酰胺(chlorophosphoramidite)将1，2-二取代甘油与2-保护的甘油偶联。(尽管N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯7已经用于合成肌醇磷脂(Bruzik等，Tetrahedron Lettt，36：2415-2418(1995)，它还未用于合成心磷脂)。在本方法中，将氯亚磷酰胺7用于偶联反应来构建核心结构。在该方案中，1，2-O-二酰甘油1随后与试剂7在惰性溶剂(例如二氯甲烷等)中在碱(例如N，N-二异丙基乙胺等)的存在下反应，然后与2-O-保护的甘油2(Y为羟基保护基，优选苄基等)在活化剂如四唑等的存在下反应，接着通过用间-氯过苯甲酸(MCPBA)等氧化以产生保护的心磷脂前体8。通过与NaI反应去除保护的前体8的甲基，以生产心磷脂前体的钠盐，其然后通过用稀HCl接着10％氢氧化铵处理转化为铵盐5。如上所述可以发生脱保护以产生心磷脂。

图4所示的本发明的另一实施方案生产心磷脂的醚类似物，其中烷基替代心磷脂甘油侧链的酰基。按照该方案，1，2-O-二烷基-sn-甘油9反应与2-O-保护的甘油2在氯亚磷酰胺7的存在下偶联，提供中间体10。通过类似于图3所述的步骤，该中间体10在2-丁酮中用NaI脱甲基化产生保护的心磷脂类似物11，其经脱保护产生心磷脂的醚类似物12。

本发明另一实施方案在图5中表示。在该方法中，磷脂酸(PA)13与2-O-保护的甘油2(Y是羟基保护基，优选苄基等，或甲硅烷基，例如叔丁基二甲基甲硅烷基等)在惰性溶剂(例如二氯甲烷等)中在缩合剂的存在下反应，接着用氢氧化铵水溶液处理以形成心磷脂前体5，所述缩合剂如N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，或N，N’-羰二咪唑(CDI)等。如上所述脱保护产生心磷脂6。

本发明另一实施方案在图6中表示。在该方法中，将不含保护基的甘油14直接用作缩合反应中的反应物。通过在三异丙基苯磺酰氯(TPSCI)和吡啶的存在下与磷脂酸(PA)13缩合发生甘油14的伯醇的选择性磷酸化，接着用氢氧化铵水溶液处理以产生心磷脂6。其它偶联剂如DCC，CDI等也可以用于这种心磷脂的一步合成。

本发明另一实施方案在图7中表示。在该方法中，将二氯磷酸酯15用于偶联反应中来构建核心结构。在该方案中，1，2-二酰甘油1和2-保护的甘油2与二氯磷酸酯15在碱如吡啶的存在下反应，产生保护的心磷脂前体8。然后通过与NaI反应去除保护的心磷脂8的甲基，生产心磷脂前体的钠盐，其然后通过用稀HCl接着10％氢氧化铵处理转化为铵盐5。如上所述可以发生脱保护以产生成熟的心磷脂。

本发明另一实施方案在图8中表示。在该方法中，产生心磷脂的醚类似物，将二氯磷酸酯15用于偶联反应以构建核心结构。在该方案中，1，2-二酰基-sn-甘油9和2-保护的甘油2与二氯磷酸酯15反应以产生保护的中间体10。然后通过与NaI反应和用稀HCl接着10％氢氧化铵处理去除中间体10的甲基以生产保护的铵盐11。如上所述可以发生脱保护以产生成熟的心磷脂。

所述方法可以用于制备多种新的心磷脂种类。例如，该方法可以用于制备含有任何期望脂肪酸链作为R₁和/或R₂取代基的心磷脂及其类似物。优选的脂肪酸碳链长度范围为约C₄至约C₃₄，优选约C₁₄至约C₂₄，包括丁酸(C4:0)，戊酸(C5:0)，己酸(C6:0)，庚酸(C7:0)，辛酸(C8:0)，壬酸(C9:0)，癸酸(C10:0)，十一烷酸(C11:0)，十二烷酸(C12:0)，十三烷酸(13:0)，十四烷酸(C14:0)，十五烷酸(C15:0)，棕榈酸(C14:0)，十七烷酸(C17:0)，硬脂酸(C18:0)，十九烷酸(C19:0)，花生酸(C20:0)，二十一烷酸(C21:0)，二十二烷酸(C22:0)，二十三烷酸(C23:0)，二十四烷酸(C24:0)，10-十一烷酸(C11:1)，11-十二烷酸(C12:1)，12-十三碳烯酸(C13:1)，肉豆蔻脑酸(C14:1)，10-十五碳烯酸(C15:1)，棕榈油酸(C16:1)，油酸(C18:1)，亚油酸(C18:2)，亚麻酸(C18:3)，二十碳二烯酸(C20:2)，二十碳三烯酸(C20:3)，花生四烯酸(顺-5，8，11，14-二十碳四烯酸)，和顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸等等。对于醚类似物，烷基链的碳链长度范围也为约C₄至约C₃₄，优选约C₁₄至约C₂₄。其它脂肪酸链也可以用作R₁和/或R₂取代基。其实例包括饱和脂肪酸如甲酸(或蚁酸)，醋酸(或乙酸)，丙酸(或丙酸)，丁酸(或丁酸)，二十六烷酸(或蜡酸)，二十八烷酸(或褐煤酸)，三十烷酸(或蜂花酸)，三十二烷酸(或紫胶蜡酸)，三十四烷酸(或三十四烷酸)，三十六烷酸(或三十六烷酸)等；单烯不饱和脂肪酸如反-2-丁烯酸(或巴豆酸)，顺-2-丁烯酸(或异巴豆酸)，2-己烯酸(或异氢山梨酸)，4-癸酸(或4-十碳烯酸)，9-癸酸(或癸烯酸)，4-十二碳烯酸(或5-十二碳烯酸)，5-十二碳烯酸(或十二碳-5-烯酸)，9-十二碳烯酸(或月桂烯酸)，4-十四碳烯酸(或粗租酸)，5-十四碳烯酸(或抹香鲸酸)，6-十八碳烯酸(或岩芹酸)，反-9-十八碳烯酸(或反油酸)，反-11-十八碳烯酸(或牛痘酸)，9-二十碳烯酸(或鳕肝油酸)，11-二十碳烯酸(或巨头鲸鱼酸)，11-二十二碳烯酸(或鲸蜡烯酸)，13-二十二碳烯酸(或芥酸)，15-二十四碳烯酸(或神经酸)，17-二十六碳烯酸(或西门木烯酸)，21-三十碳烯酸(或三十碳烯酸)等；二烯不饱和脂肪酸如2，4-戊二烯酸(或β-乙烯基丙烯酸)，2，4-己二烯酸(或山梨酸)，2，4-癸二烯酸(或乌桕酸)，2，4-十二碳二烯酸，9，12-十六碳二烯酸，顺-9，顺-12-十八碳二烯酸(或α-亚油酸)，反-9，反-12-十八碳二烯酸(或反亚油酸)，反-10-反-12-十八碳二烯酸，11，14-二十碳二烯酸，13，16-二十二碳二烯酸，17，20-二十六碳二烯酸等；三烯不饱和脂肪酸，如6，10，14-十六碳三烯酸(或十六碳三烯酸)，7，10，13-十六碳三烯酸，顺-6，顺-12-十八碳三烯酸(或γ-亚麻酸)，反-8，反-10，顺-12-十八碳三烯酸(或α-十八碳三烯酸)，反-8，反-10，反-12-十八碳三烯酸(或β-十八碳三烯酸)，顺-8，反-10，顺-12-十八碳三烯酸，顺-9，顺-12，顺-15-十八碳三烯酸(或α-亚麻酸)，反-9，反-12，反-15-十八碳三烯酸(或反亚麻酸)，顺-9，反-11，反-13-十八碳三烯酸(或α-桐酸)，反-9，反-11，反-13-十八碳三烯酸(或β-桐酸)，顺-9，反-11，顺-13-十八碳三烯酸(或石榴酸)，反-9，反-11，反-13-十八碳三烯酸，5，8，11-二十碳三烯酸，8，11，14-二十碳三烯酸等；四烯不饱和脂肪酸如4，8，11，14-十六碳四烯酸，6，9，12，15-十六碳四烯酸，4，8，12，15-十八碳四烯酸(或4，8，12，15-十八碳四烯酸)，6，9，12，15-十八碳四烯酸，9，11，13，15-十八碳四烯酸(或α-或β-十八碳四烯酸)，9，12，15，18-十八碳四烯酸，4，8，12，16-二十碳四烯酸，6，10，14，18-二十碳四烯酸，4，7，10，13-二十二碳四烯酸，7，10，13，16-二十二碳四烯酸，8，12，16，19-二十二碳四烯酸等；五和六烯不饱和脂肪酸如4，8，12，15，18-二十碳五烯酸(或二十碳五烯酸)，4，7，10，13，16-二十碳五烯酸，4，8，12，15，19-二十二碳五烯酸(或祭鱼酸)，7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸，4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，4，8，12，15，18，21-二十四碳六烯酸(或二十四碳六烯酸)等；支链脂肪酸如3-甲基丁酸(或异戊酸)，d-6-甲基辛酸，8-甲基癸酸，10-甲基十一烷酸(或异月桂酸)，d-10-甲基十二烷酸，11-甲基十二烷酸(或异十一烷酸)，12-甲基十三烷酸(或异肉豆蔻酸)，d-12-甲基十四烷酸，13-甲基十四烷酸(或异十五烷酸)，14-甲基十五烷酸(或异棕榈酸)，d-14-甲基十六烷酸，15-甲基十六烷酸，10-甲基十七烷酸，16-甲基十七烷酸(或异硬脂酸)，t-D-10-甲基硬脂酸(或结核硬脂酸)，d-16-甲基硬脂酸，18-甲基十九烷酸(或异花生酸)，d-18-甲基花生酸，20-甲基二十一烷酸(或异二十二碳烷酸)，d-20-甲基二十二烷酸，22-甲基二十三烷酸(或异二十四烷酸)，d-22-甲基二十四烷酸，24-甲基二十五烷酸(或异蜡酸)，d-24-甲基二十六烷酸，26-甲基二十七烷酸(或异二十八烷酸)，d-28-甲基三十烷酸，2，4，6-(D)-三甲基二十八烷酸(mycoceranic酸或2，4，6-三甲基硬脂酸)，2-甲基-顺-2-丁烯酸(当归酸)，2-甲基-反-2-丁烯酸(或顺芷酸)，4-甲基-3-戊烯酸(或4-甲基-3-戊烯酸)，d-2，4(L)，6(L)-三甲基-反-2-二十四碳烯酸(或C₂₇-结核菌烯酸或霉脂酸)等。

本文所述心磷脂分子和通过本发明方法生产的心磷脂分子可以用于脂类制剂。优选制剂或组合物是包括本发明心磷脂类似物的脂类组合物。包括本发明心磷脂的复合物，乳剂和其它制剂也在本发明的范围内。按照本发明的这些制剂可以通过任何适当技术制备。除了本发明合成的心磷脂以外，脂类组合物，复合物，乳剂等可以包括其它成分：稳定剂，吸收促进剂，抗氧化剂，磷脂，生物可降解聚合物，和药物活性剂。在一些实施方案中，优选本发明组合物，特别是脂类组合物，还包括靶向剂(targetingagent)，如糖类或蛋白质或其它与特异性底物结合的配体，如抗体(或其片段)或识别细胞受体的配体。这些试剂(如糖或一种或多种选自下组的蛋白质：抗体，抗体片段，肽，肽激素，受体配体，如对细胞受体的抗体，及其混合物)的包括可以促进将脂质体导向预定组织或细胞类型。

亲油性形成脂质体的成分，如磷脂酰胆碱，通过上述方法制备的心磷脂，胆甾醇和α-生育酚可以溶解或分散在适当溶剂或溶剂组合中并干燥。适当的溶剂包括任何非极性或轻微极性溶剂，如叔丁醇，乙醇，甲醇，氯仿，或丙酮，其可以蒸发而不留下药物不可接受的残渣。干燥可以是任何适当方法如冻干，还优选在冻干期间使用防冻剂(例如保护性糖如海藻糖)。亲水性成分可以溶解在包括水的极性溶剂中。

通过将干燥的亲油性成分与亲水性混合物混合可以形成脂质体。可以通过强烈均化混合物的任何方法混合极性溶液和干燥脂质膜。可以通过涡旋，磁力搅拌和/或超声进行均化。

脂质体还可以包含活性剂，本发明提供将活性剂保留在脂质体中的方法。该方法包括制备如本文所述的心磷脂或心磷脂类似物，和在脂质体中包括心磷脂或心磷脂类似物及活性剂。活性剂可以与脂类(如本发明的心磷脂)的一部分复合，或活性剂可以包埋在脂质体内。按照该方法，活性剂可以溶解或分散在适当溶剂中并在混合前加入脂质体混合物。典型地亲水性活性剂将直接加入极性溶剂，疏水性活性剂将加入用于溶解其它成分的非极性溶剂，但这不是必须。活性剂可以溶解在第三溶剂或溶剂混合物并在均化混合物之前将脂质膜脂质膜加入极性溶剂的混合物。

通常，脂质体可以具有净中性，负或正电荷。例如，由含有磷脂酰胆碱，胆甾醇，心磷脂和足够的硬脂胺以克服心磷脂净负电荷的溶液可以形成正脂质体。由含有例如磷脂酰胆碱，胆甾醇，和/或心磷脂的溶液可以形成负脂质体。

包括本发明心磷脂的脂质体还可以在脂质相内包括其它成分。优选的成分包括磷脂酰胆碱，其选自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二花生四烯酰磷脂酰胆碱，卵磷脂酰胆碱，大豆磷脂酰胆碱，氢化大豆磷脂酰胆碱及其混合物。另一优选成分是磷脂酰甘油，其选自二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，二硬脂酰磷脂酰甘油，二油酰磷脂酰甘油，二棕榈酰磷脂酰甘油，二花生四烯酰磷脂酰甘油，及其混合物。脂质体还可以包括甾醇，其选自胆甾醇，聚乙二醇，胆甾醇衍生物，粪甾醇，胆甾烷醇，胆甾烷，胆甾醇半琥珀酸酯，胆甾醇硫酸酯，及其混合物。

取决于具体组合物和用于制备它们的方法，本发明的脂质体可以是多层或单层囊。可以制备脂质体而在所选大小范围内具有基本上均匀的大小，如约1微米或更小，或约500nm或更小，约200nm或更小，或约100nm或更小。一种有效的分级方法包括将脂质体的水性混悬液挤压通过一系列具有选择均匀孔径的聚碳酸酯膜；膜的孔径将大致对应于通过挤压该膜生产的脂质体的最大尺寸。

脂质体可以包被生物可降解聚合物如蔗糖，表氯醇，蔗糖的支链亲水聚合物，聚乙二醇，聚乙烯醇，甲氧基聚乙二醇，乙氧基聚乙二醇，聚环氧乙烷，聚氧乙烯，聚氧丙烯，醋酸纤维素，海藻酸钠，N，N-二乙氨基乙酸酯，聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物，聚乙烯吡咯烷酮，聚氧乙烯X-月桂基醚，其中X为9-20，和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯。

抗氧化剂可以包括在本发明的脂质体制剂，复合物，乳剂或其它制剂中。适当的抗氧化剂包括化合物如抗坏血酸，生育酚，和deteroxime甲磺酸盐。

如果需要，吸收促进剂也可以包括在本发明的脂质体制剂，复合物，乳剂等中。适当的吸收促进剂包括Na-水杨酸-鹅脱氧胆酸，Na-脱氧胆酸，聚氧乙烯9-月桂基醚，鹅脱氧胆酸-脱氧胆酸和聚氧乙烯9-月桂基醚，一油精，Na-牛磺-24，25-二氢梭链孢酸，Na-牛磺脱氧胆酸，Na-甘鹅脱氧胆酸，油酸，亚油酸，亚麻酸。聚合物吸收促进剂也可以包括如聚氧乙烯醚，聚氧乙烯山梨糖醇酐酯，聚氧乙烯10-月桂基醚，聚氧乙烯16-月桂基醚，氮酮(azone)(1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮)。

本发明的脂质体和其它类型的组合物，包括本发明的心磷脂(包括按照本发明方法制备的那些)，可以配制而包括活性剂。活性剂可以是例如包埋在组合物中的脂质体内。与组合物中的一种成分复合(例如与组合物中的心磷脂复合)，或否则存在组合物中。包括在本发明组合物中通常被认为是对于在表面活性剂存在下稳定的活性剂。当组合物包括脂质体时，亲水性活性剂是稳定的，并可以包括在脂质体内部以致脂质体双层产生扩散屏障，防止它任意扩散在身体中。认为疏水性活性剂特别适合于用于本发明制剂，特别是脂质体制剂，因为它们不仅通过显示降低的毒性有益，而且它们倾向于在脂质体的脂双层中很稳定。对于医疗或化妆品应用，制剂可以是在生理学上相容的，如药用的，并且可以包括普通技术人员已知的其它试剂(例如缓冲液，抗生素，防腐剂或其它赋形剂，如一种或多种药用赋形剂)以配制药物组合物。

当按照本发明的组合物包含活性剂时，本发明还提供使用该制剂向人或动物细胞施用活性剂的方法。细胞可以是体外的，在该情形中制剂可以用于诊断或研究目的，或将活性剂传递给移植到人或动物患者中的细胞。备选地，细胞可以是体内的，在该情形中本发明提供将活性剂传递至人或动物，例如需要使用活性剂治疗或为化妆品目的的患者中的方法。该方法可以用于将实际上任何活性剂施用于例如患者患病的细胞或器官。适当的活性剂包括用于治疗病症的诊断剂和药剂，所述病症如炎症(例如慢性炎症)，依赖于血管生成的疾病，关节炎，再狭窄，牛皮癣，癌症(例如肺癌，脑癌或中枢神经系统的其它癌，黑色素瘤，胰腺癌，肝癌，睾丸或卵巢癌，和其它肿瘤疾病)，多发性硬化，阿尔茨海默氏病，帕金森氏症，和各种血管病。脂质体制剂，乳剂，或复合物也可以用于抗真菌应用，并可以包含适当的抗真菌剂作为活性剂。典型地，活性剂可以是一种或多种基因和基因载体，反义分子(例如寡核苷酸)，蛋白质和肽，蛋白质或化学药物(例如疏水性或亲水性药物)或诊断剂。

适合于本发明的活性剂包括作用于以下各项的试剂：外周神经，肾上腺素能受体，胆碱能受体，骨骼肌，心血管系统，平滑肌，血液循环系统，突触位点，神经效应器接合位点，内分泌和激素系统，免疫系统，生殖系统，骨骼系统，消化和排泄系统，组胺系统和中枢神经系统。适当的试剂可以选自例如蛋白质，酶，激素，核苷酸，多核苷酸，核蛋白，多糖，糖蛋白，脂蛋白，多肽，类固醇，萜类，三萜，类维生素A，抗-溃疡H2受体拮抗剂，抗溃疡药物，降钙药，湿润剂，化妆品等。活性剂可以是镇痛药；麻醉剂；抗心率失常药，抗生素；抗过敏药，抗真菌剂，抗癌剂(例如米托蒽醌(参见例如国际专利公开WO 02/32400)，紫杉烷类(例如参见国际专利公开WO 00/01366)，紫杉醇，喜树碱，和喜树碱衍生物((例如SN-38)(参见例如国际专利公开WO 02/058622)，伊立替康(参见例如国际专利公开WO 03/030864)，和其它喜树碱)，吉西他滨，蒽环霉素，反义寡核苷酸(例如靶向癌基因，如raf基因(参见例如国际专利公开WO 98/43095))，长春花属生物碱(例如长春瑞滨，参见例如国际专利公开WO 03/018018)，抗体，环磷酰胺(cytoxine)，免疫毒素等)，抗高血压药(例如二氢吡啶，抗抑郁药，cox-2抑制剂)；抗凝血剂；抗抑郁药；抗糖尿病药，抗癫痫药，抗炎皮质甾类；治疗阿尔茨海默氏病或帕金森氏病的药剂；抗溃疡药；抗原虫药，抗焦虑药，甲状腺药，抗甲状腺药，抗病毒药，食欲减退药，二膦酸盐，强心变力剂，心血管药，皮质甾类，利尿剂，多巴胺能药，肠胃病药，止血药，降胆甾醇药，抗高血压药；免疫抑制药；抗痛风药，抗疟药，抗偏头痛药，抗毒蕈碱药，抗炎药，如治疗风湿病，关节炎，牛皮癣，炎性肠病，局限性回肠炎的药剂；或治疗包括多发性硬化的脱髓鞘性病的药剂；眼药；疫苗(例如抗流感病毒，肺炎，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，霍乱毒素B-亚基，伤寒，恶性疟原虫，白喉，破伤风，单纯疱疹病毒，结核病，HIV，SARS病毒，百日咳杆菌，麻疹，流行性腮腺炎，风疹，细菌类毒素，牛痘病毒，腺病毒，金丝雀痘病毒病毒，卡介苗，肺炎克氏杆菌疫苗等)；组胺受体拮抗剂，安眠药，肾保护剂，脂调节剂，肌肉松弛药，精神安定药，亲神经药，阿片类激动剂和拮抗剂，拟副交感神经药，蛋白酶抑制剂，前列腺素，镇静剂，性激素(例如雄性激素，雌激素等)，兴奋剂，拟交感神经药，血管舒张药和黄质和这些种类的合成的类似物。治疗剂可以是肾毒性的，如环孢菌素和两性霉素B，或心脏毒性的，如两性霉素B和紫杉醇。例举性的抗癌剂包括美法仑，氮芥，磷酸雌莫司汀(extramustine phosphate)，乌拉莫司汀，异环磷酰胺，甘露莫司汀，trifosfamide，链脲菌素，二溴甘露醇，米托蒽醌，甲氨蝶呤，氟尿嘧啶，阿糖胞苷，替加氟，idoxide，泰素，紫杉醇，道诺霉素，柔红霉素，博来霉素，两性霉素，卡铂，顺铂，紫杉醇，BCNU，长春新碱，喜树碱，多柔比星，依托泊苷，细胞因子，核酶，干扰素，寡核苷酸和前述的官能衍生物。按照该方法可以传递的药物的另外实例包括乙二磺酸丙氯拉嗪(prochlorperzine edisylate)，硫酸亚铁，氨基己酸，盐酸美加明，盐酸普鲁卡因胺，硫酸苯丙胺，去氧麻黄碱盐酸盐，benzamphetamine盐酸盐，硫酸异丙肾上腺素，吩美曲秦盐酸盐，氯贝胆碱，氯醋甲胆碱，盐酸毛果芸香碱，硫酸阿托品，溴东莨菪碱，异丙碘铵，曲地氯铵，盐酸苯乙双胍，盐酸哌甲酯，胆茶碱，盐酸头孢氨苄，地芬尼多，盐酸美克洛嗪，马来酸丙氯拉嗪，酚苄明，马来酸硫乙拉嗪，茴茚二酮，双苯茚酮丁四硝酯，地高辛，异氟磷，乙酰唑胺，醋甲唑胺，苄氟噻嗪，chloropromaide，妥拉磺脲，醋酸氯地孕酮，非那二醇，别嘌醇，阿司匹林铝，氨甲蝶呤，醋磺胺甲噁唑，红霉素，氢化可的松，醋酸氢可的松，醋酸可的松，地塞米松及其衍生物如倍他米松，曲安西龙，甲睾酮，17-S-雌二醇，炔雌醇，炔雌醇3-甲醚，泼尼松龙，醋酸17α-羟孕酮，19-降孕甾酮(norprogesterone)，炔诺孕酮，炔诺酮，炔诺酮，norethiederone，黄体酮，诺孕酮，异炔诺酮，阿司匹林，吲哚美辛，萘普生，非诺洛芬，舒林酸，吲哚洛芬，硝化甘油，硝酸异山梨酯，普萘洛尔，噻吗洛尔，阿替洛尔，阿普洛尔，西咪替丁，可乐定，丙咪嗪，左旋多巴，氯丙嗪，甲基多巴，二羟苯丙氨酸，茶碱，葡糖酸钙，酮洛芬，布洛芬，头孢氨苄，红霉素，氟哌啶醇，佐美酸，乳酸亚铁，长春胺，安定，酚苄明，地尔硫_，米力农，头孢羟唑钠甲酸酯，quanbenz，氢氯噻嗪，雷尼替丁，氟比洛芬，fenufen，氟洛芬，托美丁，阿氯芬酸，甲芬那酸，氟芬那酸，difuinal，尼莫地平，尼群地平，尼索地平，尼卡地平，非洛地平，利多氟嗪，噻帕米，戈洛帕米，氨氯地平，米氟嗪，赖诺普利，依那普利，依那普利拉，卡托普利，雷米普利，法莫替丁，尼扎替丁，硫糖铝，依汀替丁，tetratolol，米诺地尔，氯氮_，安定，阿米替林，和丙米嗪。更多的实例是蛋白质和肽，包括但不限于骨形态形成蛋白，胰岛素，肝素，秋水仙素，胰高血糖素，促甲状腺激素，甲状旁腺和垂体激素，降钙素，肾素，催乳激素，促肾上腺皮质激素，促甲状腺激素，促卵泡激素，绒毛膜促性腺素，促性腺激素释放激素，生长激素(例如，牛生长激素，猪生长激素等)，催产素，加压素，GRF，生长激素释放抑制因子，赖氨酸加压素，促胰酶素，黄体化激素，LHRH，LHRH激动剂和拮抗剂，亮丙瑞林(leuprolide)，干扰素(例如α-，β-，或γ-干扰素，干扰素α-2a，干扰素α-2b，和保守的干扰素等)，白细胞介素，生长激素(例如人生长激素及其衍生物如甲硫氨酸-人生长激素和去苯丙氨酸人生长激素，牛生长激素，猪生长激素，类胰岛素生长激素等)，消化激素，甲状腺素，抗甲状腺素，生育抑制剂如前列腺素，生育促进剂，生长因子如类胰岛素生长因子，凝血因子，胰岛激素释放因子，这些化合物的类似物和衍生物，和这些化合物的药用盐，或它们的类似物或衍生物。活性剂(用于诊断或治疗应用)也可以是或包括核酸，如RNA，DNA(例如寡核苷酸，质粒，噬菌体或病毒载体等)。活性剂也可以是试剂(两种或更多)的混合物，其可以有利地在脂质体制剂，复合物，乳剂或其它制剂中共同施用。

化学治疗剂和其它抗癌剂，如以上所述，很适合用于本发明的组合物和治疗方法。可以将含有化学治疗剂和其它抗癌剂的脂质体制剂，复合物，乳剂等直接注射到肿瘤组织中以将化学治疗剂和其它抗癌剂直接传递到癌细胞。在一些情形中，特别是在肿瘤切除后，脂质体制剂，乳剂，复合物或其它本发明制剂可以直接移植到产生的空腔中或可以作为涂层施用于剩余组织。在手术后施用本发明脂质体制剂的情形中，可以利用具有较大直径的约1微米的脂质体，因为它们不必通过脉管系统。

当组合物包括活性剂时，本发明提供将活性剂传递至细胞的方法。按照该方法，如本文所述制备包含本发明心磷脂和所需活性剂的组合物。然后将组合物暴露于细胞以将活性剂传递给细胞。该方法可以用于将活性剂如药物，核酸，和其它适当的试剂传递至任何期望细胞。例如，该方法可以用于体外应用以将活性剂传递给培养物中的细胞。备选地，该方法可以用于将活性剂如药物传递给体内细胞。当在体内使用该方法时，它可以用于治疗人或动物疾病。在该实施方案中，将组合物保留于人或动物以便将活性剂传递给人或动物。在一些应用中，试剂和组合物可以用于化妆品。该方法的一种优选应用包括治疗癌症，如在本文中所述当组合物包含一种或多种抗癌剂时。

对于体内应用，优选组合物包括一种或多种药用赋形剂。此外，药物活性剂如抗癌药，核酸和本文所述的蛋白质试剂可以以适于传递药物有效剂量的浓度掺入到本发明的组合物中。如治疗医师或兽医认为合适，可以改变药物活性剂如抗癌剂的剂量，选择治疗剂治疗的适当剂量在这些专业人员的技术范围内。

该方法提供药物制剂的给药，该药物制剂除了活性剂的脂质体制剂(和含有本发明心磷脂和活性剂的其它制剂)以外包括无毒，惰性药物上适当的赋形剂。药物上适当的赋形剂包括所有类型的固体，半固体或液体稀释剂，填充剂和助剂。本发明还包括剂量单位的药物制剂。这意味着制剂是单独部分的形式，例如小瓶，注射器，胶囊，药丸，栓剂，或安瓿，其中活性剂脂质体制剂的含量对应于部分或多个单个剂量。剂量单位可以包含例如1，2，3或4个单个剂量，或1/2，1/3，或1/4的单个剂量。单个剂量优选含有一次给药提供活性剂的量，通常对应于整个，半个，三分之一，四分之一个日剂量。

片剂，锭剂，胶囊，丸剂，颗粒剂，栓剂，溶液，混悬剂和乳剂，糊剂，软膏(例如干性皮肤软膏)，凝胶，乳膏，洗剂(如干性皮肤软化剂，湿润剂等)，散剂和喷雾剂可以是适当的药物制剂。除了脂质体活性剂以外，栓剂可以包含适当的水溶性或水不溶性赋形剂。适当的赋形剂是其中本发明脂质体活性剂足够稳定而允许治疗应用的那些，如聚乙二醇，某些脂类，和这些物质的酯或混合物。油膏，糊剂，乳膏和凝胶也可以包含适当的其中对脂质体活性剂稳定的赋形剂。

如已知或开发了的，活性剂或其药物制剂可以静脉内，皮下，局部，口服，肠胃外，腹膜内，和/或直肠，或者通过直接注射到肿瘤或器官或需要通过该方法治疗的其它部位给药。基于心磷脂和心磷脂类似物的制剂也可以例如作为乳膏，皮肤油膏，干性皮肤软化剂，湿润剂等局部施用。

下列实施例进一步不限制性地举例说明本发明。

                         实施例1

1A. 完全保护的心磷脂的合成

                   R＝肉豆蔻酰(C_14:0链)

在0℃下在45分钟内向o-氯苯基二氯磷酸酯(2.45g，9.98mmol)和无水吡啶(4.39mL，54.28mmol)在CH₂Cl₂(10mL)中的溶液滴加1，2-O-二肉豆蔻酰-sn-甘油(5.00g，9.75mmol)在CH₂Cl₂(50mL)中的溶液。在0℃下搅拌反应混合物1小时和在室温下搅拌1小时后，滴加2-苄氧基-1，3-丙二醇(0.71g，3.90mmol)在CH₂Cl₂(8mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌3小时。在真空中去除有机溶剂，残渣在乙酸乙酯(150mL)和冷的0.5 N HCl(100mL)之间分配。用水，盐水洗涤有机相，用无水Na₂SO₄干燥，并真空浓缩。通过在硅胶上使用己烷/乙酸乙酯(3∶1)的快速色谱法纯化获得的残渣，提供4.37g完全保护的心磷脂，其为无色油。产率为72％。TLC(己烷/EtOAc 3∶1)R_f＝0.31；¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ7.40-7.08(m，13H，ArH)，5.22(m，2H，RCOOCH)，4.63(m，2H，CH₂Ph)，4.40-4.06(m，12H，RCOOCH₂，POCH₂)，3.89(m，1H，BnOCH)，2.26(m，8H，-CH₂COO-)，1.57(m，8H，-CH₂CH₂COO-)，1.25(br s，80H，CH₂)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH₃)；ESI-MS，m/z(M+Na)⁺1576.6。

1B. 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐 的合成

                     R＝肉豆蔻酰(C_14:0链)

方法1.向搅拌过的完全保护的心磷脂(260.3mg，0.17mmol)在THF(5mL)中的溶液加入2-吡啶醛肟(202.5mg，1.66mmol)和四甲基胍(176.0mg，1.53mmol)。在加入1滴水后，将混合物在室温下搅拌2.5小时。在真空下去除溶剂。将残渣溶解在CHCl₃(10mL)中并用H₂O(4mL×2)洗涤，用Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过在硅胶上使用CHCl₃/MeOH/NH₄OH(65∶15∶1)的快速色谱法纯化获得的残渣，提供200mg 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐，其为白色固体。产率为87％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH 65∶25∶5)R_f＝0.64；¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ7.42-7.23(m，5H，ArH)，5.20(m，2H，RCOOCH)，4.60(s，2H，CH₂Ph)，4.29-3.89(m，12H，RCOOCH₂，POCH₂)，3.69(m，1H，BnOCH)，2.27(m，8H，-CH₂COO-)，1.56(m，8H，-CH₂CH₂COO-)，1.28(br s，80H，CH₂)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH₃)；ESI-MS，m/z(M-2NH₄)^2- 664.9，(M-2NH₄-RCOO)^- 1102.0，(M-2NH₄+H)^- 1330.3

方法2.向搅拌过的完全保护的心磷脂(3.88g，2.50mmol)在THF(65mL)中的溶液加入2-硝基苯甲醛肟(4.11g，24.74mmol)和四甲基胍(2.62g，22.75mmol)。在加入15滴水以后，将混合物在室温下搅拌4小时。真空去除溶剂。将残渣溶解在CHCl₃(100mL)中并用H₂O和MeOH(2mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机相并真空浓缩。通过在硅胶上使用CHCl₃/MeOH/NH₄OH(65∶15∶1)的快速色谱法纯化获得的黄色残渣，提供2.17g 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐，其为白色固体。产率为64％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH 65∶25∶5)R_f＝0.64。

1C. 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(四肉豆 蔻酰心磷脂)的合成

                     R＝肉豆蔻酰基(C_14:0链)

方法1.将2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(520.1mg，0.38mmol)样品溶解在THF(25mL)中，并用钯黑(200mg)在氢气球下氢化3.5小时。在过滤去除催化剂以后，将溶液蒸干。将残渣溶解在THF(7mL)中，然后使用丙酮(35mL)沉淀。将混合物保持在冰箱中过夜，次日，过滤白色固体并用少量冷丙酮洗涤。在真空干燥器中用无水硫酸钙干燥12小时和用P₂O₅干燥5小时后，获得415.1mg 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(四肉豆蔻酰心磷脂)。产率为86％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH 65∶25∶5)R_f＝0.29；¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ7.32(br s，NH₄)，5.26(m，2H，RCOOCH)，4.34-3.92(m，13H，RCOOCH₂ POCH₂ HOCH)，2.33(m，8H，-CH₂COO-)，2.29(t，J＝7.5，1H，CHOH)，1.58(m，8H，-CH₂CH₂COO-)，1.30(br s，80H，CH₂)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH3)；FTIR(ATR)3231s，2918s，2850s，1738s，1467w，1378w，1203ms，1067s cm^-1；ESI-MS，m/z(M-2NH₄)^2- 619.9，(M-2NH₄-RCOO)^- 1011.9，(M-2NH₄+H)^- 1240.2。

方法2.将2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(124.7mg，0.09mmol)样品溶解在THF(15mL)中，用10％Pd-C(50mg)在50psi的压力下氢化过夜。在过滤去除催化剂以后，将溶液蒸干。将残渣溶解在THF(2mL)中，然后使用丙酮(10mL)沉淀。将混合物保持在冰箱中过夜，过滤白色固体并用少量冷丙酮洗涤。在真空干燥器中用无水硫酸钙干燥3小时后，获得98.6mg 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(四肉豆蔻酰心磷脂)。产率为85％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH 65∶25∶5)R_f＝0.29。

                           实施例2

2A. 顺-2-苯基-1，3-二噁烷-5-基叔丁基二甲基甲硅烷基醚的合成

按照Dodd等，J.Chem.Soc.Perkin I，2273-2277(1976)所述方法经过修改从顺-2-苯基-1，3-二噁烷-5-醇制备标题化合物。下列是改进的方法。

向顺-2-苯基-1，3-二噁烷-5-醇(5.01g，27.8mmol)和咪唑(3.78g，55.5mmol)在DMF(15mL)中的溶液分份加入二甲基叔丁基甲硅烷基氯(5.03g，33.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入H₂O(20mL)。用己烷(25mL×3)萃取混合物。合并有机相，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥并真空浓缩以给出定量产率(8.18g)的顺-2-苯基-1，3-二噁烷-5-基-叔丁基二甲基甲硅烷基醚，其为无色油。该产物用于下一步骤合成而不进一步纯化。

2B. 2-O-叔丁基二甲基甲硅烷基甘油的合成

按照Dodd等，J.Chem.Soc.Perkin I，2273-2277(1976)所述方法从顺-2-苯基-1，3-二噁烷-5-基叔丁基二甲基甲硅烷基醚制备标题化合物。¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ3.65(m，5H，CH₂CHCH₂)，1.88(t，J＝6.0，2H，OH)，0.92(s，9H，SiCCH₃)，0.12(s，6H，SiCH₃)。

2C. 完全保护的心磷脂的合成

                 R＝肉豆蔻酰基(C_14:0链)

在0℃下在15分钟内向o-氯苯基二氯磷酸酯(1.51g，6.15mmol)和无水吡啶(2.7mL，33.3mmol)在CH₂Cl₂(6mL)中的溶液滴加1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油(3.08 g，6.0mmol)在CH₂Cl₂(30mL)中的溶液。在0℃下搅拌反应混合物1小时和在室温下搅拌1小时以后，滴加2-O-叔丁基二甲基甲硅烷基甘油(495.3mg，2.4mmol)在CH₂Cl₂(6mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物3小时。真空去除有机溶剂，小心用冷乙酸乙酯(120mL)/0.25NHCl(120mL)处理剩余的残渣。用水，盐水洗涤有机相，用无水Na₂SO₄干燥和真空浓缩。通过在硅胶上使用己烷/乙酸乙酯(4∶1-3.5∶1)的快速色谱法纯化获得的残渣，提供2.79g完全保护的心磷脂，其为无色油。产率为74％。TLC(己烷/EtOAc 3∶1)R_f＝0.42；¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ7.41(d，J＝8.0Hz，4H，ArH)，7.23(t，J＝8.0Hz，2H，ArH)，7.12(t，J＝8.0Hz，2H，ArH)，5.23(m，2H，RCOOCH)，4.36-4.06(m，13H，RCOOCH₂，POCH₂，SiOCH)，2.26(m，8H，-CH₂COO-)，1.57(m，8H，-CH₂CH₂COO-)，1.25(br s，80H，CH₂)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH₃)，0.87(s，9H，SiCCH₃)，0.08(s，6H，SiCH₃)。

2D. 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)-2-O-(叔丁基二甲基 甲硅烷基)甘油二铵盐的合成

              R＝肉豆蔻酰基(C_14:0链)

向搅拌过的完全保护的心磷脂(0.68g，0.43mmol)在THF(10mL)中的溶液加入2-硝基苯醛肟(0.71g，4.26mmol)和四甲基胍(0.45g，3.91mmol)。在加入3滴水后，将混合物在室温下搅拌3小时。真空去除溶剂。将残渣溶解在CHCl₃(25mL)中并用H₂O(10mL)洗涤。用Na₂SO₄干燥有机相并真空浓缩。通过在硅胶上使用CHCl₃/MeOH/NH₄OH(65∶15∶1)的快速色谱法纯化获得的黄色残渣，提供370mg 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)-2-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)甘油二铵盐，其为白色固体。产率为62％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH 65∶25∶5)R_f＝0.64；¹HNMR(500MHz，CDCl₃)δ7.32(br s，NH₄)，5.26(m，2H，RCOOCH)，4.34-3.92(m，13H，RCOOCH₂，POCH₂，SiOCH)，2.30(m，8H，-CH₂COO-)，1.58(m，8H，-CH₂CH₂COO-)，1.30(br s，80H，CH₂)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH₃)，0.87(s，9H，SiCCH₃)，0.08(s，6H，SiCH₃)。

2E. 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(四肉豆 蔻酰心磷脂)的合成

                R＝肉豆蔻酰基(C_14:0链)

向搅拌过的1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)-2-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)甘油二铵盐(138.0mg，0.099mmol)在CHCl₃(10mL)，MeOH(20mL)和H₂O(7mL)中的混合物，滴加1N HCl(0.3mL)。将混合物在室温下搅拌6小时，然后在冰浴中冷却。向冷的反应混合物滴加10％NH₄OH(2mL)。真空去除有机溶剂，用CHCl₃萃取剩余的水层两次。用Na₂SO₄干燥合并的有机层，浓缩至干燥。将残渣溶解在THF(5mL)中，然后使用丙酮(25mL)沉淀。将混合物保持在冰箱中过夜，过滤白色固体并用少量冷丙酮洗涤。在真空干燥器中用无水硫酸钙干燥1小时和用P₂O₅干燥5小时后，获得115mg 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(四肉豆蔻酰心磷脂)。产率为83％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH65∶25∶5)R_f＝0.29。由实施例2E制备的四肉豆蔻酰心磷脂的表征与实施例1C相同。

                        实施例3

3A. 完全保护的不饱和心磷脂的合成

                     R＝油酰基(C_18:1链)

用1，2-O-二油酰基-sn-甘油替代1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油，按照实施例2C所述方法制备标题化合物。产物为无色油，产率为35％。TLC(己烷/EtOAc 3∶1)R_f＝0.46；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ7.41(d，J＝8.0Hz，4H，ArH)，7.23(t，J＝8.0Hz，2H，ArH)，7.12(t，J＝8.0Hz，2H，ArH)，5.36(m，8H，烯烃质子)，5.24(m，2H，RCOOCH)，4.35-4.06(m，13H，RCOOCH₂，POCH₂，SiOCH)，2.28(m，8H，-CH₂COO-)，2.00(m，16H，烯丙基CH₂)，1.57(m，8H，-CH₂CH₂COO-)，1.28(br s，88H，CH₂)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH₃)，0.88(s，9H，SiCCH₃)，0.08(s，6H，SiCH₃)。ESI-MS，m/z(M+Na)⁺ 1816.4。

3B. 1，3-二-(1，2-O-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰基)-2-O-(叔丁基二甲基甲 硅烷基)甘油二铵盐的合成

               R＝油酰基(C_18:1链)

方法1.向搅拌过的完全保护的不饱和心磷脂(170.0mg，0.095mmol)在THF(3mL)中的溶液加入2-吡啶醛肟(92.7mg，0.76mmol)和四甲基胍(80.6mg，0.70mmol)，所述不饱和心磷脂按照实施例3A所述方法制备。在加入1滴水后，将混合物在室温下搅拌7小时。真空去除溶剂。将残渣溶解在CHCl₃(10mL)中并用H₂O(4mL×2)洗涤，用Na₂SO₄干燥，真空浓缩。通过使用CHCl₃/MeOH/NH₄OH(65∶15∶1)的快速色谱法纯化获得的残渣，提供134mg 1，3-二(1，2-O-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰基)-2-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)甘油二铵盐，其为白色胶状固体。产率为88％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH 65∶25∶5)R_f＝0.67；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ7.39(br s，NH₄)，5.34(m，8H，烯烃质子)，5.25(m，2H，RCOOCH)，4.31-3.90(m，13H，RCOOCH₂，POCH₂，SiOCH)，2.30(m，8H，-CH₂COO-)，2.01(m，16H，烯丙基CH₂)，1.59(m，8H，-CH₂CH₂COO-)，1.29(br s，88H，CH₂)，0.88(t，J＝6.5，12H，CH₃)，0.87(s，9H，SiCCH₃)，0.08(s，6H，SiCH₃)。ESI-MS，m/z(M-2NH₄)^2- 784.8，(M-2NH₄-RCOO)^- 1288.3，(M-2NH₄+H)^- 1571.9。

方法2.向搅拌过的完全保护的不饱和心磷脂(0.59g，0.33mmol)在THF(8mL)中的溶液加入2-硝基苯甲醛肟(0.54g，3.23mmol)和四甲基胍(0.35g，3.00mmol)，所述不饱和心磷脂由实施例3A所述方法制备。在加入3滴水后，在室温下搅拌混合物3小时。真空去除溶剂。将残渣溶解在CHCl₃(15mL)中，用H₂O(6mL)洗涤。真空浓缩有机相。通过使用CHCl₃/MeOH/NH₄OH(65∶15∶1)的快速色谱法纯化获得的黄色残渣，提供350mg 1，3-二(1，2-O-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰基)-2-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)甘油二铵盐，其为白色胶状固体。产率为66％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH 65∶25∶5)R_f＝0.67。

3C. 1，3-二(1，2-O-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰基)-甘油二铵盐(四油酰心 磷脂)的合成

                     R＝油酰基(C_18:1链)

向搅拌过的1，3-二(1，2-O-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰基)-2-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)甘油二铵盐(110.1mg，0.069mmol)在CHCl₃(10mL)，MeOH(20mL)和H₂O(7mL)中的混合物滴加1N HCl(0.3mL)。将混合物在室温下搅拌5小时。加入另外0.1mL 1N HCl。将混合物在室温下搅拌另外4小时，然后在冰浴中冷却。向冷却的反应混合物滴加10％NH₄OH(2mL)。真空去除有机溶剂，用CHCl₃萃取剩余残渣。浓缩有机层至干燥。通过在硅胶上使用CHCl₃/MeOH/NH₄OH(65∶15∶1)的快速色谱法纯化粗制产物，提供71mg 1，3-二(1，2-O-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(四油酰基心磷脂)，其为白色胶状固体。产率为70％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH65∶25∶5)R_f＝0.40；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ7.43(br s，NH₄)，5.34(m，8H，烯烃质子)，5.19(m，2H，RCOOCH)，4.38-3.91(m，13H，RCOOCH₂，POCH₂，HOCH)，2.29(m，8H，-CH₂COO-)，2.17(br s，1H，OH)，2.01(m，16H，烯丙基CH₂)，1.58(m，8H，-CH₂CH₂COO-)，1.29(br s，88H，CH₂)，0.87(t，J＝6.5，12H，CH₃).ESI-MS，m/z(M-2NH₄)^2- 727.6，(M-2NH₄-RCOO)^- 1174.2，(M-2NH₄+H)^- 1456.6。

                          实施例4

4A. 完全保护的心磷脂的合成

               R＝肉豆蔻酰基(C_14:0链)

在室温下在30分钟内向N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯(1.92g，9.22mmol)和无水N，N-二异丙基乙胺(1.92mL，11.1mmol)在CH₂Cl₂(10mL)中的溶液滴加1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油(4.61g，9.0mmol)在CH₂Cl₂(45mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物1.5小时以后，加入1H-四唑在乙腈(71.8mL，24.3mmol)中的3wt％溶液。向该反应混合物滴加2-苄氧基-1，3-丙二醇(0.66g，3.60mmol)在CH₂Cl₂(10mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌3小时。然后将反应混合物冷却至-40℃，加入77％的间氯过苯甲酸(2.64g，11.80mmol)在CH₂Cl₂(10mL)中的溶液以使反应混合物的温度保持在0℃以下。在升温至25℃时，将混合物转移至分液漏斗和用5％NaHCO₃(2×50mL)，冷1N HCl(2×15mL)，水，盐水洗涤。用Na₂SO₄干燥有机相并真空浓缩，产生油残渣。通过在硅胶上用己烷/乙酸乙酯(2∶1-1∶1)洗脱的快速色谱法纯化残渣，提供4.38g完全保护的心磷脂，其为无色油。产率为90％。TLC(己烷/EtOAc 1∶1)R_f＝0.16；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ7.35(m，5H，ArH)，5.22(m，2H，RCOOCH)，4.67(m，2H，CH₂Ph)，4.34-4.06(m，12H，RCOOCH₂，POCH₂)，3.83(m，1H，BnOCH)，3.75(dt，J₁＝11.4，J₂＝3.0，6H，POCH₃)，2.31(m，8H，-CH₂COO-)，1.59(m，8H，-CH₂CH₂COO-)，1.25(br s，80H，CH₂)，0.88(t，J＝6.6，12H，CH₃)。

4B. 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵 盐的合成

                 R＝肉豆蔻酰基(C_14:0链)

向搅拌过的完全保护的心磷脂(1.80g，1.32mmol)在2-丁酮(85mL)中的溶液加入NaI(0.59g，3.96mmol)，将反应混合物回流1.5小时，冷却至25℃。过滤得到的白色沉淀，用冷2-丁酮洗涤以产生1.71g 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二钠盐，其为白色固体。

通过应用按照Bligh和Dyer，Can.J.Biochem.，37：911-917(1959)的萃取方法，将二钠盐转化为其对应的游离酸。因此，上述二钠盐溶解在CHCl₃(80mL)，MeOH(160mL)和0.1N HCl(80mL)的冷混合物中，在室温下搅拌40分钟。加入H₂O(80mL)和CHCl₃(80mL)，分离分开的CHCl₃层，用H₂O(50mL)洗涤。通过加入15mL 10％NH₄OH中和有机层。分离有机层，真空浓缩以获得残渣，其进一步通过使用CHCl₃/MeOH/NH₄OH(65∶15∶1)的短硅胶柱纯化，提供1.42g 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐，其为白色固体。产率为79％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH 65∶25∶5)R_f＝0.64。由实施例4B制备的终产物的表征与实施例1B相同。

4C. 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(四肉豆 蔻酰心磷脂)的合成

                 R＝肉豆蔻酰基(C_14:0，链)

按照实施例1C所述方法制备标题化合物。由实施例4所述方法制备的四肉豆蔻酰心磷脂的表征与实施例1相同。

                          实施例5

5A. 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二甲 酯的合成

                     R＝肉豆蔻酰基(C_14:0链)

在室温下在15分钟内向搅拌过的N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯(1.02g，5.15mmol)和无水N，N-二异丙基乙胺(1.2mL，6.94mmol)在CH₂Cl₂(4mL)中的溶液滴加1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油(2.00g，4.13mmol)在CH₂Cl₂(20mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物1.5小时以后，加入1H-四唑在乙腈(31.0mL，10.5mmol)中的3wt％溶液。向该反应混合物中，加入2-苄氧基-1，3-丙二醇(0.30g，1.65mmol)在CH₂Cl₂(5mL)中的溶液。在室温搅拌反应混合物3小时。然后将反应混合物冷却至-40℃，加入77％的间-氯过苯甲酸(1.14g，6.6mmol)在CH₂Cl₂(7mL)中的溶液。将混合物逐渐升温至室温30分钟，然后转移至分液漏斗，用5％NaHCO₃(2×30mL)，1N HCl(2×20mL)，水，盐水洗涤。用Na₂SO₄干燥有机相，真空浓缩。

通过在硅胶上使用己烷/乙酸乙酯(1∶0-1∶1)的梯度的快速色谱法纯化残渣，提供1.69g 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二甲酯。产率为79％。TLC(己烷/EtOAc 1∶1)R_f＝0.24.¹HNMR(300MHz，CDCl₃)δ7.35-7.29(m，5H，ArH)，4.68(m，2H，CH₂Ph)，4.26-4.02(m，8H，POCH₂)，3.86(m，2H，ROCH)，3.75(d，J₁＝12.0，6H，POCH₃)，3.61-3.38(m，13H，-CH₂OCH₂-，-CH₂OCH-，BnOCH)，1.54(m，8H，-CH₂CH₂O-)，1.29(m，88H，CH₂)，0.88(t，J＝6.7，12H，CH₃)。

5B. 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵 盐的合成

              R＝肉豆蔻酰基(C_14:0链)

向搅拌过的2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二甲酯(230mg，0.18mmol)在2-丁酮(4mL)中的溶液加入NaI(88mg，0.59mmol)。将反应混合物回流1.5小时，冷却至25℃，然后0℃。将得到的固体沉淀过滤，用冷2-丁酮洗涤以产生2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐。将二铵盐放入氯仿/甲醇/0.1 NHCl(30∶5∶15mL)，剧烈搅拌1小时。分离有机层，用氯仿(2×10mL)萃取水层。用水(2×10mL)洗涤合并的有机萃取液。将氢氧化铵水溶液(5mL)加入氯仿萃取液，真空浓缩并在高真空下干燥过夜，提供231mg 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐。产率为60％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH，65∶25∶5)R_f＝0.5；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.29-7.21(m，5H，ArH)，4.57(m，2H，CH₂Ph)，4.21-3.38(m，23H，POCH₂，-CH₂OCH₂-；-CH₂OCH-，BnOCH)，1.50(m，8H，CH₂CH₂O-)，1.25(m，88H，CH₂)，0.89(t，12H，J＝6.54 Hz，CH₃)；ESI-MS，m/z(M-2NH₄+H)^-，1274.1，(M-2NH₄)^2- 636.9。

5C. 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(四肉豆 蔻酰心磷脂醚类似物)的合成

                 R＝肉豆蔻酰基(C_14:0链)

将2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(85mg，0.065mmol)溶解在四氢呋喃(10mL)中。向其中加入10％Pd-C(70mg)，在Parr氢化器上在50psi下振荡混合物16小时。将溶液过滤通过硅藻土垫，用氯仿(5mL)洗涤。合并滤液和洗液，真空浓缩并干燥。在从四氢呋喃(0.2mL)-丙酮(8mL)混合物中结晶后，得到44mg 1，3-二-(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐。产率为56％。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH，65∶25∶5)R_f＝0.28；¹H NMR(CDCl₃)：δ7.29(br，NH₄ ⁺)，4.20-3.80(m，8H，POCH₂)，3.57-3.41(m，15H，CH₂OCH₂；CH₂OCH^-，HOCH)，2.3(br，1H，OH)，1.53(m，8H，CH₂CH₂O-)，1.25(m，88H，CH₂)，0.875((t，12H，J＝6.9Hz，CH₃)；ESI-MS，m/z 1184.7(M-2NH₄ ⁺H)^-，591.3(M-2NH₄)^2-。

                            实施例6

6A. 2-O-苄基-1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵 盐的合成

                        R＝肉豆蔻酰基(C_14:0链)

向搅拌过的N，N’-二环己基碳二亚胺(265mg，1.28mmol)在吡啶(2mL)中的溶液滴加1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷脂酸(281mg，0.47mmol)在无水CH₂Cl₂(3mL)中的溶液。在室温下搅拌该溶液5分钟，然后加入2-苄氧基-1，3-丙二醇(0.71g，3.90mmol)在CH₂Cl₂(8mL)中的溶液，继续在室温下搅拌24小时。过滤反应物，用CH₂Cl₂洗涤。浓缩滤液，与甲苯共蒸发以去除痕量吡啶。向该残渣中加入CH₂Cl₂(15mL)，将混合物保存在冰箱中过夜。通过过滤去除白色沉淀。将滤液真空浓缩，在硅胶柱上用CHCl₃/MeOH/NH₄OH(65∶15∶1)洗脱纯化。产生13mg(4％)。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH 65∶25∶5)R_f＝0.64。TLC与按照实施例1B所述方法制备的真实样品相同。

6B. 1，3-二(1，2-O-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰基)甘油二铵盐(四肉豆 蔻酰心磷脂)的合成

                 R＝肉豆蔻酰基(C14:0链)

按照实施例1 C所述方法制备标题化合物。TLC(CHCl₃/MeOH/NH₄OH65∶25∶5)R_f＝0.29。TLC与按照实施例1C所述方法制备的真实样品相同。

                          实施例7

本实施例显示本发明含有心磷脂的脂质体组合物的制备。通过混合19.1μmol如上制备的四肉豆蔻酰心磷脂，96.2μmol磷脂酰胆碱和64.6μmol胆甾醇形成小的单层囊。在充分搅拌后，在50ml圆底烧瓶中使用旋转蒸发器将混合物蒸发干。将随后干燥的脂膜重悬浮在10ml无菌非热原性的水中。在30分钟膨胀时间后，在定温槽中在25℃下将获得的悬浮液超声15分钟。然后用海藻糖冻干脂质体制剂。

                          实施例8

本实施例显示如上制备包括四肉豆蔻酰心磷脂的保留蒽环霉素，多柔比星的脂质体的制备。可以制备脂质体多柔比星用于临床给药，其通过简单涡旋混合含有40mg心磷脂-脂质体冻干产物和预先在0.85％NaCl中以2mg/ml制备的2.5ml多柔比星溶液的小瓶。1分钟完成涡旋混合，将混合物保持在37℃，温育15分钟。

                           实施例9

本实施例显示保留药物米托蒽醌盐酸盐的脂质体的制备。通过在叔丁醇中混合1.96gm D-α-生育酚，58.7gm如上制备的四肉豆蔻酰心磷脂，97.9gm胆甾醇，293.6gm卵磷脂酰胆碱以使溶液总重为13.05kg来制备脂类混合物。然后将3,080gm含有122.4gm海藻糖二水合物的水溶液混合到丁醇溶液中。将小瓶装满11.1gm该混合物并冻干，以使每个小瓶含有约300mg脂类。将7.5ml Novantrone_(15mg)和7.5ml水加入脂类小瓶以制备脂类包埋的米托蒽醌。使脂质体在室温下水合30分钟，剧烈振荡2分钟，以最大强度超声10分钟。在45分钟内将适当量分配至注射器或标准输液装置，在8小时内使用。

                     实施例10

本实施例显示保留药物紫杉醇的脂质体的制备。紫杉醇包封在心磷脂，磷脂酰胆碱，胆甾醇和α-生育酚中。每mg紫杉醇的脂类比例为：

1.8mg心磷脂

9.0mg磷脂酰胆碱

3.0mg胆甾醇

0.1mg α-生育酚

通过将8.89kg叔丁醇加入12.0L烧瓶和在40-45℃下加热可以制备脂质体包封的紫杉醇。随后在混合下加入下列各项直至溶解并在40-45℃下加热：3.412g D-α-生育酸琥珀酸酯，205g卵磷脂酰胆碱，22.78g紫杉醇，41.00g如上制备的四肉豆蔻酰心磷脂，68.33g胆甾醇。

将得到的溶液过滤通过0.22微米滤器。将得到的滤液装入无菌小瓶，每瓶含有约10.1g滤液。将小瓶塞好并进行冻干。可以将它们保存在-20℃直至使用。

根据需要从干燥脂膜用25ml生理盐水制备脂质体。使混合物在室温下水合约1小时，此后将小瓶涡旋约1分钟并在槽型超声波仪中以最大频率超声约10分钟。根据本发明可以将适量的小瓶内含物转移至输液袋并输注至患者中。

该紫杉醇的脂质体制剂可以用于将大量紫杉烷快速施用于人而不诱导显著的毒性反应。治疗可以在约1小时，甚至45分钟或更少期间内静脉内施用。考虑到正常实验室和治疗剂量变化，以大约下列剂量治疗至少3位患者：90mg/m²，135mg/m²，175mg/m²，250mg/m²，和300mg/m²。制剂可以作为单一药剂给予而不用甾族化合物、抗组胺剂或其它治疗剂如过敏抑制剂预处理。如果患者耐药量允许，可以每21天重复治疗。

                       实施例11

本实施例显示制备保留在溶液中的SN-38的脂质体。通过将约0.2gD-α-生育酸琥珀酸酯加入升温至约35-40℃的1kg叔丁醇来制备脂质膜。将溶液混合约5分钟直至生育酚溶解。将6.0g如上制备的四肉豆蔻酰心磷脂加入溶液，搅拌溶液约5分钟。将约10g胆甾醇加入溶液，混合溶液约5分钟，然后加入30g卵磷脂酰胆碱，接着混合另外5分钟。将约11g得到的脂类溶液冻干以产生脂质膜。

为了制备脂质体SN-38，通过将溶液溶解在pH为8-10的碱性水溶液中制备1.2mg/ml的SN-38溶液。近似地，将15ml该SN-38溶液加入含有脂膜的小瓶。将小瓶轻轻涡旋，使在室温下水合30分钟，剧烈涡旋2分钟，在槽型超声波仪中以最大强度超声约10分钟。脂质体溶液的pH降低至酸性pH。使用该方法超过90wt.％的SN-38与脂类以脂质体形式复合。

所引参考文献：

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本文所引用的所有参考文献，包括出版物，专利申请和专利，包括在前表和否则在本说明书中引用的那些，结合于此作为参考，其程度相同于将各篇参考文献单个和明确地显示结合作为参考并且在本文中完整地阐述。

除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本发明的上下文中(特别是在后附权利要求的上下文中)术语“一个(a)”和“一个(an)”和“该(the)”和类似对象的使用应当认为包括单数和复数。除非另外指出，术语“包含”，“具有”，“包括”，和“含有”应当认为是开放式的术语(即意味着“包括但不限于”)。除非在本文中另外指出，本文数值范围的列举仅意欲用作单独提及位于范围内的每个分离值的简写方法，每个分离值结合在说明书中而似乎在本文中被单独引用。除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，可以以任何适当的顺序实施本文描述的所有方法。除非另外要求，任何和所有实施例，或本文提供的例举性的语言(例如“如”)的使用仅意欲更好地举例说明本发明，而未对本发明的范围施加限制。说明书中的语言不应当认为是指任何未要求的要素为本发明实施所必需。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读前面的说明书以后，那些优选实施方案的变化对于本领域那些普通技术人员可变得明显。发明人期望技术人员适当地使用这些变化，发明人意欲除了如本文具体描述以外实施本发明。因此，本发明包括在于此后附的权利要求中引用主题的所有适用法律允许的改进和等效物。此外，除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，本发明包括上述要素以其所有可能变化的任何组合。

Claims (70)

1.一种心磷脂分子，其具有下列结构：

其中Z₁和Z₂相同或不同并且是-O-C(O)-，-O-，-S-，或-NH-C(O)-；

R₁和R₂相同或不同并且可以是H和/或饱和或不饱和烷基；

R₃为(CH₂)_n且n＝0-10；

R₄为氢，烷基，取代烷基，环烷基，取代的环烷基，肽，二肽，多肽，蛋白质，糖类如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖等，杂环，核苷，或多核苷酸；

X为阳离子。

2.按照权利要求1的心磷脂分子，其中所述化合物具有下列结构：

3.按照权利要求1的心磷脂分子，其中所述化合物是具有下列结构的心磷脂醚类似物：

4.一种具有下列结构的心磷脂类似物：

其中Z₁和Z₂相同或不同并且是-O-C(O)-，-O-，-S-，-NH-C(O)-；

R₁和R₂相同或不同并且是H或饱和或不饱和烷基；

R₃为(CH₂)_n且n＝0-10；

R₄为氢，烷基，取代烷基，环烷基，取代的环烷基，肽，二肽，多肽，蛋白质，糖类如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖等，杂环，核苷，或多核苷酸；

R5为接头；

X为阳离子。

5.按照权利要求4的心磷脂类似物，其中所述接头包含烷基，取代烷基，环烷基，取代环烷基，烷氧基，聚烷氧基如PEG化的含有1至500个烷氧基单体单元的醚，取代的聚烷氧基等，肽，二肽，多肽，蛋白质，糖类如葡萄糖，甘露糖，半乳糖，多糖。

6.权利要求1-5中任何一项的心磷脂分子，其中R₁和/或R₂中至少一个是饱和或不饱和的含有14-34个碳的烷基。

7.权利要求1-6中任何一项的心磷脂分子，其中X为非毒性阳离子。

8.权利要求1-7中任何一项的心磷脂分子，其中X为氢，铵，钠，钾，钙或钡离子。

9.一种制备心磷脂分子或其类似物的方法，其包含在偶联剂N，N’-二环己基碳二亚胺或N，N’-羰二咪唑的存在下将磷脂酸和2-O-保护的甘油反应。

10.一种制备心磷脂分子或其类似物的方法，其包含在偶联剂三异丙基苯磺酰氯，或N，N’-二环己基碳二亚胺或N，N’-羰二咪唑的存在下将磷脂酸和甘油反应。

11.一种制备心磷脂分子的方法，其包含在偶联剂二氯磷酸酯或N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯存在下将式V的醇和2-O-保护的甘油或2-O-取代的甘油反应

其中Z₁和Z₂相同或不同并且是-O-C(O)-，-O-，-S-，-NH-C(O)-；

R₁和R₂相同或不同并且是H和/或饱和或不饱和烷基；

R₃为(CH₂)_n且n＝0-10。

12.权利要求11的方法，其中R₁和/或R₂中至少一个是饱和或不饱和的含有4-34个碳的烷基。

13.权利要求11的方法，其中R₁和/或R₂中至少一个是饱和或不饱和的含有14-24个碳的烷基。

14.权利要求11的方法，其中所述心磷脂分子是权利要求1-3中任何一项的分子。

15.一种制备权利要求2的心磷脂的方法，其包含在偶联剂的存在下将1，2-O-二酰甘油和2-O-保护的甘油反应，所述偶联剂为二氯磷酸酯或N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯。

16.一种制备权利要求3的心磷脂的方法，其包含在偶联剂的存在下将1，2-O-二烷基甘油和2-O-保护的甘油反应，所述偶联剂为二氯磷酸酯或N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯。

17.一种制备权利要求4或5的心磷脂的方法，其包含将式V的醇和式VI的二醇(其中R₄和R₅定义如上)在偶联剂的存在下反应，所述偶联剂是二氯磷酸酯或N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯

18.权利要求11-17中任何一项的方法，其中所述偶联剂是式VII的二氯磷酸酯：

其中W是烷基或取代烷基，包括甲基，乙基，异丙基，叔丁基，烯丙基，2-取代的乙基，卤代乙基如2，2，2-三溴乙基；苄基或取代的苄基；苯基或取代的苯基如2-氯苯基，4-氯苯基和2，4-二氯苯基；或其它任何可去除的保护基。

19.权利要求11-17的方法，其中所述偶联剂是N，N-二异丙基甲基膦酰胺氯。

20.按照权利要求9-19中任何一项的方法生产的心磷脂或心磷脂类似物。

21.一种制备脂质体的方法，其包含通过权利要求9-19中任何一项的方法制备心磷脂或心磷脂类似物，和然后将所述心磷脂或心磷脂类似物包括在脂质体中。

22.一种将活性剂保留在脂质体中的方法，其包含通过权利要求9-19中的任何一种方法制备心磷脂或心磷脂类似物，和将所述心磷脂或心磷脂类似物和活性剂包括在脂质体中。

23.权利要求22的方法，其中所述活性剂包括药物。

24.权利要求22的方法，其中所述活性剂包括寡核苷酸。

25.权利要求22的方法，其中所述活性剂包括抗癌剂。

26.权利要求22的方法，其中所述活性剂包埋在脂质体中。

27.权利要求22的方法，其中所述活性剂与所述心磷脂复合。

28.权利要求21-27中任何一项的方法，其另外包含用防冻剂冻干所述脂质体。

29.按照权利要求21-28中任何一项的方法制备的脂质体组合物。

30.一种包含权利要求1-8中任何一项的心磷脂的组合物。

31.一种包含按照权利要求9-19中任何一项的方法生产的心磷脂或心磷脂类似物的组合物。

32.权利要求29-31中任何一项的组合物，其另外包含磷脂酰胆碱，甾醇，和生育酚。

33.权利要求29-32中任何一项的组合物，其另外包含选自以下各项的磷脂酰胆碱：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二花生四烯酰磷脂酰胆碱，卵磷脂酰胆碱，大豆磷脂酰胆碱，氢化大豆磷脂酰胆碱，及其混合物。

34.权利要求29-33中任何一项的组合物，其另外包含选自以下各项的磷脂酰甘油：二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，二硬脂酰磷脂酰甘油，二油酰磷脂酰甘油，二棕榈酰磷脂酰甘油，二花生四烯酰磷脂酰甘油，及其混合物。

35.权利要求29-34中任何一项的组合物，其另外包含选自以下各项的甾醇：胆甾醇，胆甾醇衍生物，粪甾醇，胆甾烷醇，胆甾烷，胆甾醇半琥珀酸酯，胆甾醇硫酸酯，及其混合物。

36.权利要求29-35中任何一项的组合物，其另外包含靶向剂。

37.权利要求36的组合物，其中所述靶向剂是蛋白质。

38.权利要求37的组合物，其中所述蛋白质选自抗体，抗体片段，肽，肽激素，受体配体，及其混合物。

39.权利要求36的组合物，其中所述靶向剂是糖类。

40.权利要求29-39中任何一项的组合物，其另外包含配体。

41.权利要求40的组合物，其中所述配体是抗体或细胞受体的配体。

42.权利要求29-41中任何一项的组合物，其包含活性剂。

43.权利要求42的组合物，其中所述活性剂与所述心磷脂复合。

44.权利要求42或43的组合物，其中所述活性剂包含一种或多种遗传载体，反义分子，蛋白质，肽，或药物。

45.权利要求42-44中任何一项的组合物，其中所述活性剂包含一种或多种抗癌剂。

46.权利要求29-45的组合物，其是脂类复合物或乳剂的形式。

47.权利要求29-46中任何一项的组合物，其包含脂质体。

48.权利要求47的组合物，其中所述脂质体包含心磷脂。

49.权利要求47或48的组合物，其另外包含活性剂。

50.一种组合物，其包含脂质体形式的权利要求1-8和20中任何一项的心磷脂或心磷脂类似物和活性剂。

51.一种组合物，其包含脂质体形式的按照权利要求9-19中任何一项的方法制备的心磷脂或心磷脂类似物和活性剂。

52.权利要求47-51中任何一项的组合物，其中所述活性剂包埋在一种或多种脂质体中。

53.权利要求47-52中任何一项的组合物，其中所述活性剂与所述心磷脂复合。

54.按照权利要求47-53中任何一项的冻干形式的组合物。

55.权利要求54的组合物，其另外包含防冻剂。

56.权利要求47-55中任何一项的组合物，其中所述脂质体直径为约1微米或更小。

57.权利要求47-56中任何一项的组合物，其中所述脂质体直径为约500nm或更小。

58.权利要求47-57中任何一项的组合物，其中所述脂质体直径为约200nm或更小。

59.权利要求47-58中任何一项的组合物，其中所述脂质体直径为约100nm或更小。

60.权利要求29-59中任何一项的组合物，其另外包含药用赋形剂。

61.权利要求29-60中任何一项的组合物在制备治疗疾病的药物中的应用。

62.按照权利要求61的应用，其中所述疾病是癌症。

63.一种将活性剂传递至细胞的方法，其包含制备按照权利要求42-60中任何一项的组合物，和将该组合物暴露于细胞。

64.权利要求63的方法，其中所述细胞是在体外。

65.权利要求63的方法，其中所述细胞是在体内。

66.一种治疗人或动物疾病的方法，其包含制备按照权利要求42-60中任何一项的组合物，和将该组合物暴露于需要其的人或动物以使活性剂传递至所述人或动物患者。

67.权利要求66的方法，其中所述疾病是癌症，所述活性剂是抗癌剂。

68.权利要求63-67中任何一项的方法，其中所述组合物包括一种或多种脂质体。

69.权利要求63-68中任何一项的方法，其中所述活性剂与组合物中的心磷脂复合。

70.权利要求68或69的方法，其中所述活性剂包埋在组合物中的脂质体内。

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