JP6895892B2 - ポンペ病のmRNA治療 - Google Patents
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Description
本願は、2015年3月19日に出願された米国仮出願第62/135,338号の優先権を主張し、その開示内容を参照として本明細書に援用する。
本明細書は、配列表(2016年3月17日に「SHR_1185WO_SL」という名称の.txtファイルとして電子提出した)を参照する。.txtファイルは2016年3月17日に生成したものであって、そのサイズは28,284バイトである。配列表の内容全体を、参照として本明細書に援用する。
本発明は、とりわけ、mRNA療法に基づく改良型のポンペ病治療方法及び組成物を提供する。本発明は、ヒトGAAタンパク質をコードするmRNAをリポソーム内に封入して投与すると、in vivoでの高効率かつ持続的なタンパク質産生が得られ、例えば、臨床上、関連性の高い疾患マーカーである肝臓及び筋肉におけるグリコーゲンレベルが効果的に低減するという観察を含む。
各R2は、独立して水素またはC1‐3アルキルであり;
各qは、独立して2〜6であり;
各R’は、独立して水素またはC1‐3アルキルであり;
各RLは、独立してC8‐12アルキルである。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される:
(項目1)
ポンペ病の治療方法であって、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードするmRNAを含む組成物を、有効な用量及び投与間隔で投与し、ポンペ病の少なくとも1つの症状または特徴の強度、重症度、または頻度を低減するか、または発症を遅らせることを含む、前記治療方法。
(項目2)
ポンペ病の治療方法であって、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードするmRNAを含む組成物の治療有効量を投与し、被験体の肥大性心筋症を治療することを含む、前記治療方法。
(項目3)
前記mRNAをリポソーム内に封入する、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記リポソームが、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上の非カチオン性脂質、1つ以上のコレステロール系脂質及び1つ以上のPEG修飾脂質を含む、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記1つ以上のカチオン性脂質が、C12‐200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK‐E12、ICE(イミダゾール系)、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA及びDMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin‐K‐DMA、DLin‐K‐XTC2‐DMA、HGT4003、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されるカチオン性脂質を含む、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記1つ以上のカチオン性脂質が、cKK‐E12:
を含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記1つ以上の非カチオン性脂質が、DSPC(1,2‐ジステアロイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホコリン)、DPPC(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホコリン)、DOPE(1,2‐ジオレイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2‐ジオレイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスフォチジルコリン) DPPE(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2‐ジミリストイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2‐ジオレオイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホ‐(1’‐rac‐
グリセロール))及びそれらの組合せからなる群から選択される、項目4〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
前記1つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロール及び/またはPEG化コレステロールである、項目4〜7に記載の方法。
(項目9)
前記1つ以上のPEG修飾脂質が、鎖長C 6 〜C 20 のアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有結合した最大鎖長5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖を含む、項目4〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記カチオン性脂質が、前記リポソームの約30〜50重量%を占める、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
カチオン性脂質が、リポソームの約40重量%を占める、項目10に記載の方法。
(項目12)
カチオン性脂質:非カチオン性脂質:コレステロール:PEG化脂質の比が、モル比でおよそ40:30:20:10である、項目4〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
カチオン性脂質:非カチオン性脂質:コレステロール:PEG化脂質の比が、重量比でおよそ40:30:25:5である、項目4〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
カチオン性脂質:非カチオン性脂質:コレステロール:PEG化脂質の比が、重量比でおよそ40:32:25:3である、項目4〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記リポソームが:
cKK‐E12、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2K;
C12‐200、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2K;
HGT4003、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2K;または、
ICE、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kから選択される組み合わせを含む、項目3〜15のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記リポソームが約100nm未満のサイズを有する、項目3〜15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記mRNAを、約0.1〜5.0mg/kg体重の範囲の有効用量で投与する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記mRNAを、約0.1〜3.0mg/kg体重の範囲の有効用量で投与する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記mRNAを、約0.1〜1.0mg/kg体重の範囲の有効用量で投与する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記mRNAを、約1.0mg/kg体重の有効用量で投与する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記組成物を静脈内に投与する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記組成物を筋肉内に投与する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記筋肉内投与を、骨格筋、平滑筋、心筋及びそれらの組合せからなる群から選択される筋肉に対して行う、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記組成物を週1回投与する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記組成物を週2回投与する、項目1〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記組成物を月2回投与する、項目1〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記組成物を月1回投与する、項目1〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記組成物を14日に1回投与する、項目1〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記組成物の前記投与が、肝臓内でのGAAタンパク質の発現をもたらす、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記組成物の前記投与が、筋肉組織または筋肉細胞内でのGAAタンパク質の発現をもたらす、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記筋肉組織が、骨格筋、平滑筋、心筋及びそれらの組合せから選択される、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記筋肉細胞が、筋細胞、筋管、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞及びそれらの組合せからなる群より選択される、項目30に記載の方法。
(項目33)
前記組成物の投与が、血清中でのGAAタンパク質発現をもたらす、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の尿中Glc4レベルが、治療前のベースラインの尿中Glc4レベルに比べて低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の筋グリコーゲンレベルが、治療前のベースラインの筋グリコーゲンレベルに比べて低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の肝グリコーゲンレベルが、治療前のベースラインの肝グリコーゲンレベルに比べて低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清アスパラギン酸トランスアミナーゼレベルが、治療前のベースラインの血清アスパラギン酸トランスアミナーゼレベルに比べて低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清アラニントランスアミナーゼレベルが、治療前のベースラインの血清アラニントランスアミナーゼレベルに比べて低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清クレアチンキナーゼレベルが、治療前のベースラインの血清クレアチンキナーゼレベルに比べて低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清乳酸デヒドロゲナーゼレベルが、治療前のベースラインの血清乳酸デヒドロゲナーゼレベルに比べて低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体由来の生物学的試料中のGAA酵素活性レベルが、治療前の生物学的試料中のベースラインのGAA酵素活性レベルに比べて上昇する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記mRNAがコドン最適化されている、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記コドン最適化mRNAが配列番号3を有する、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記mRNAが、配列番号8の5’UTR配列をさらに含む、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記mRNAが、配列番号9または配列番号10の3’UTR配列をさらに含む、項目43に記載の方法。
(項目46)
前記mRNAが、配列番号11または配列番号12を有する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記mRNAが、1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記1つ以上の修飾ヌクレオチドが、プソイドウリジン、N‐1‐メチル‐プソイドウリジン、2‐アミノアデノシン、2‐チオチミジン、イノシン、ピロロ‐ピリミジン、3‐メチルアデノシン、5‐メチルシチジン、C‐5プロピニル‐シチジン、C‐5プロピニル‐ウリジン、2‐アミノアデノシン、C5‐ブロモウリジン、C5‐フルオロウリジン、C5‐ヨードウリジン、C5‐プロピニル‐ウリジン、C5‐プロピニル‐シチジン、C5‐メチルシチジン、2‐アミノアデノシン、7‐デアザアデノシン、7‐デアザグアノシン、8‐オキソアデノシン、8‐オキソグアノシン、O(6)‐メチルグアニン及び/または2‐チオシチジンを含む、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記mRNAが未修飾である、項目1〜46のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードする有効量のmRNAをリポソーム内に封入して含むポンペ病の治療用組成物であって、前記リポソームが、カチオン性脂質cKK‐E12:
を含む、前記治療用組成物。
(項目51)
前記リポソームが、1つ以上の非カチオン性脂質、1つ以上のコレステロール系脂質、及び1つ以上のPEG修飾脂質をさらに含む、項目50に記載の組成物。
(項目52)
前記1つ以上の非カチオン性脂質が、DSPC(1,2‐ジステアロイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホコリン)、DPPC(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホコリン)、DOPE(1,2‐ジオレイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2‐ジオレイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスフォチジルコリン(phosphotidylcholine)) DPPE(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2‐ジミリストイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2‐ジオレオイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホ‐(1’‐rac‐グリセロール))及びそれらの組合せからなる群から選択される、項目51に記載の組成物。
(項目53)
前記1つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロール及び/またはPEG化コレステロールから選択される、項目51または52に記載の組成物。
(項目54)
前記1つ以上のPEG修飾脂質が、鎖長C 6 〜C 20 のアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有結合している最大鎖長5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖を含む、項目51〜53のいずれか一項に記載の組成物。
(項目55)
前記リポソームが、cKK‐E12、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kを含む、項目50〜54のいずれか一項に記載の組成物。
(項目56)
前記カチオン性脂質が、リポソームの約30〜50mol%を占める、項目50〜55のいずれか一項に記載の組成物。
(項目57)
前記カチオン性脂質が、リポソームの約40mol%を占める、項目56に記載の組成物。
(項目58)
cKK‐E12:DOPE:コレステロール:DMG‐PEG2Kの比が、モル比でおよそ40:30:20:10である、項目55〜57のいずれか一項に記載の組成物。
(項目59)
cKK‐E12:DOPE:コレステロール:DMG‐PEG2Kの比が、モル比でおよそ40:30:25:5である、項目55〜57のいずれか一項に記載の組成物。
(項目60)
cKK‐E12:DOPE:コレステロール:DMG‐PEG2Kの比が、モル比でおよそ40:32:25:3である、項目55〜57のいずれか一項に記載の組成物。
(項目61)
前記リポソームが約100nm未満のサイズを有する、項目50〜60のいずれか一項に記載の組成物。
(項目62)
前記組成物を静脈内投与用に製剤化する、項目50〜61のいずれか一項に記載の組成物。
(項目63)
前記組成物を筋肉内投与用に製剤化する、項目50〜61のいずれか一項に記載の組成物。
(項目64)
前記mRNAが配列番号3を有する、項目50〜63のいずれか一項に記載の組成物。
(項目65)
前記mRNAが、配列番号8の5’UTR配列をさらに含む、項目64に記載の組成物。
(項目66)
前記mRNAが、配列番号9または配列番号10の3’UTR配列をさらに含む、項目64に記載の組成物。
(項目67)
前記mRNAが、配列番号11または配列番号12を有する、項目50〜66のいずれか一項に記載の組成物。
(項目68)
ポンペ病の治療用組成物であって、酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードする有効量のmRNAをリポソーム内に封入して含み、前記mRNAが配列番号3を有し、及び、
前記リポソームが、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質及びPEG修飾脂質をさらに含む、前記治療用組成物。
(項目69)
ポンペ病の治療用組成物であって、酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードする有効量のmRNAをリポソーム内に封入して含み、前記mRNAが配列番号11または配列番号12を有し、及び、
前記リポソームが、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質及びPEG修飾脂質をさらに含む、前記治療用組成物。
本発明がより容易に理解されるように、初めにいくつかの用語を以下に定義する。以下の用語及び他の用語の追加の定義を、本明細書全体の随所において記載する。本明細書中で参照し、本発明の背景を説明するとともに、その実施に関するさらなる詳細を提供する刊行物及び他の参考資料を、参照として本明細書に援用する。
本発明は、とりわけ、mRNA療法に基づくポンペ病の治療方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードするmRNAを含有する組成物を、有効な用量及び投与間隔で投与し、それによってポンペ病の少なくとも1つの症状または特徴の、強度、重症度、もしくは頻度を低下させるか、または発症を遅らせることによってポンペ病を治療する方法を提供する。本発明はさらに、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードするmRNAを含有する組成物の治療有効量を投与し、それによって被験体の肥大性心筋症を治療することを含む、ポンペ病の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、mRNAを1つ以上のリポソーム内に封入する。本明細書中で使用する場合、用語「リポソーム」とは、任意の層状、多層状、または固体のナノ粒子小胞を指す。一般的には、本明細書中で使用するリポソームは、1種以上の脂質を混合することによって、または1種以上の脂質と1種以上のポリマー(複数可)とを混合することによって形成することができる。したがって、本明細書で使用する用語「リポソーム」は、脂質系及びポリマー系ナノ粒子の両方を包含する。いくつかの実施形態では、本発明に適したリポソームは、カチオン性または非カチオン性脂質(複数可)、コレステロール系脂質(複数可)及びPEG修飾脂質(複数可)を含有する。
本発明を、ポンペ病に罹患しているか、または罹患しやすい被験体を治療するために使用してもよい。ポンペ病は、酸性αグルコシダーゼ(GAA)酵素の遺伝子中の変異を特徴とする常染色体劣性代謝遺伝性障害である。GAA酵素は:酸性マルターゼ、マルターゼ、マルターゼ‐グルコアミラーゼ、グルオインベルターゼ(gluoinvertase)、グルコシドスクラーゼ、アグルコシダーゼα、α‐1,4‐グルコシダーゼ、アミログルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、LYAG、LYAG_HUMAN、リソソームαグルコシダーゼ及びαグルコシダーゼ、酸としても知られている。GAA遺伝子(グルコシダーゼα;酸)は:酸性マルターゼ、α‐1,4‐グルコシダーゼ及びαグルコシダーゼ、酸としても知られている。ポンペ病を引き起こす200種以上の突然変異がGAA遺伝子において同定されている。これらの突然変異のほとんどは、単一のアミノ酸置換及び小さな挿入または欠失を含んでいる。GAA遺伝子の突然変異の多くは、得られるタンパク質の構造に影響を与え、その活性を低下させている可能性がある。GAA遺伝子の突然変異のうちのいくつかは、異常に短くなった酵素の産生をもたらし、そのような酵素はグリコーゲンの加水分解においてその役割を効果的に果たすことができない。
いくつかの実施形態において、本発明は、ポンペ病の治療のための、GAAをコードするmRNAの被験体への送達方法及び組成物を提供する。適切なGAA mRNAは、天然のGAAタンパク質の活性を置き換えることができ、及び/またはポンペ病に関連する1つ以上の症状の強度、重症度、及び/または頻度を低下させることができるGAAタンパク質の全長、断片または部分のいずれかをコードしている。
AUGGGAGUCAGACACCCGCCGUGCUCGCACAGGCUUCUGGCCGUGUGCGCACUCGUGAGUCUGGCGACUGCUGCGUUGCUGGGGCACAUUCUUCUCCACGACUUUCUCUUGGUGCCCCGAGAAUUGUCGGGCUCGUCGCCGGUACUGGAAGAAACCCACCCCGCACAUCAGCAGGGCGCGUCGCGGCCUGGUCCGAGGGAUGCCCAGGCACAUCCCGGAAGGCCACGAGCCGUCCCGACUCAAUGUGACGUACCUCCCAAUUCCCGGUUCGACUGUGCGCCAGACAAGGCAAUCACGCAAGAGCAGUGCGAAGCCCGUGGAUGCUGCUAUAUUCCGGCGAAGCAGGGACUUCAGGGAGCCCAGAUGGGGCAGCCCUGGUGUUUCUUCCCGCCUUCCUAUCCCUCAUAUAAGCUGGAGAAUUUGUCGUCCUCGGAAAUGGGGUAUACCGCUACUCUUACGAGAACCACCCCCACAUUCUUUCCGAAGGACAUCCUUACUCUGCGGCUCGACGUGAUGAUGGAGACAGAAAAUAGGCUGCAUUUCACGAUCAAAGACCCGGCGAACCGGAGAUAUGAGGUUCCGCUUGAGACUCCCCACGUUCACUCUCGUGCGCCUUCACCCUUGUACUCCGUGGAGUUCUCGGAAGAACCGUUCGGGGUGAUCGUCAGACGUCAACUUGAUGGUAGGGUAUUGCUGAACACAACGGUCGCCCCCUUGUUUUUCGCCGACCAGUUUCUGCAGCUUUCGACAUCGCUGCCGUCCCAGUAUAUCACAGGGCUCGCGGAGCAUCUUUCACCCCUCAUGCUGAGCACGAGCUGGACACGGAUUACGCUCUGGAACAGGGAUCUCGCGCCGACGCCCGGAGCGAAUUUGUAUGGGUCGCAUCCCUUCUACCUCGCAUUGGAAGACGGGGGUUCCGCGCACGGAGUAUUCCUGCUUAAUUCUAAUGCGAUGGACGUUGUCUUGCAGCCCUCCCCUGCUUUGUCGUGGCGUUCCACGGGGGGCAUUUUGGACGUUUACAUCUUUUUGGGACCCGAGCCAAAGAGCGUAGUGCAGCAGUAUUUGGAUGUAGUGGGCUACCCCUUCAUGCCGCCUUAUUGGGGACUGGGGUUCCAUCUCUGCCGCUGGGGGUACUCUUCGACCGCGAUCACCCGCCAGGUGGUCGAGAACAUGACCAGAGCACAUUUCCCUUUGGACGUGCAGUGGAAUGAUUUGGAUUACAUGGAUAGCCGAAGAGACUUCACGUUCAAUAAGGACGGGUUUAGAGAUUUUCCCGCGAUGGUGCAAGAAUUGCACCAGGGUGGGCGCAGAUACAUGAUGAUCGUCGAUCCCGCCAUCAGCAGCUCGGGACCAGCGGGGAGUUACCGGCCUUACGAUGAGGGACUUAGGAGAGGCGUCUUUAUCACGAACGAAACAGGUCAGCCGCUCAUUGGUAAAGUGUGGCCUGGAUCAACGGCCUUUCCCGACUUCACGAAUCCCACAGCCCUCGCCUGGUGGGAAGACAUGGUGGCGGAGUUUCACGACCAAGUACCGUUUGAUGGGAUGUGGAUUGAUAUGAACGAACCCUCAAACUUUAUUCGCGGCUCGGAAGAUGGAUGCCCGAAUAAUGAGCUUGAGAAUCCCCCGUAUGUGCCAGGGGUGGUAGGUGGGACGCUCCAGGCCGCUACGAUCUGUGCGUCAUCACAUCAGUUCUUGUCAACGCACUACAACUUGCACAAUCUUUACGGUUUGACUGAAGCCAUCGCUUCGCAUCGCGCGCUGGUCAAAGCGCGUGGUACGCGACCCUUCGUUAUUUCUCGGUCCACAUUUGCCGGGCACGGUCGGUAUGCCGGACACUGGACGGGAGAUGUCUGGUCUAGCUGGGAGCAGCUCGCGUCGAGCGUACCGGAGAUCCUCCAGUUCAAUCUUUUGGGAGUUCCGCUCGUCGGCGCUGACGUGUGCGGUUUUCUCGGAAACACAUCAGAAGAGCUUUGCGUACGCUGGACACAGCUCGGUGCGUUUUACCCCUUUAUGAGAAACCAUAACUCGUUGCUCUCACUCCCUCAAGAGCCGUACAGUUUUUCGGAGCCUGCGCAACAGGCGAUGCGGAAGGCAUUGACACUUCGCUAUGCACUGCUCCCGCAUCUCUAUACUCUGUUCCAUCAGGCCCAUGUGGCUGGAGAAACGGUGGCGAGGCCCCUGUUCUUGGAGUUCCCCAAAGAUAGUUCCACAUGGACCGUGGAUCACCAGUUGCUGUGGGGAGAGGCGCUUCUGAUCACUCCGGUACUUCAGGCGGGUAAAGCGGAAGUCACUGGGUAUUUCCCGCUUGGGACCUGGUACGACCUUCAGACUGUCCCAGUAGAAGCCCUCGGAAGCCUGCCACCUCCCCCUGCUGCACCCCGCGAGCCUGCAAUCCAUAGCGAGGGCCAGUGGGUAACGUUGCCAGCCCCACUGGAUACCAUCAAUGUCCACCUCAGGGCGGGUUACAUUAUCCCUCUCCAAGGCCCUGGGUUGACCACCACAGAGUCGCGCCAGCAGCCAAUGGCACUUGCGGUCGCAUUGACGAAAGGGGGUGAAGCCCGAGGGGAACUGUUUUGGGAUGACGGGGAAAGCCUUGAGGUGCUGGAACGGGGAGCGUACACACAAGUCAUUUUCUUGGCCAGGAACAACACUAUUGUCAACGAGUUGGUGCGCGUGACCUCUGAGGGUGCCGGACUGCAACUGCAGAAGGUCACGGUCCUCGGAGUGGCGACAGCACCCCAACAGGUCCUUAGUAACGGAGUACCUGUCUCGAACUUUACAUACUCCCCGGACACGAAGGUGCUCGACAUCUGUGUGUCGCUGCUUAUGGGGGAACAGUUUCUCGUGAGCUGGUGCUAG
本発明によれば、本明細書に記載のGAAタンパク質(例えば、GAAタンパク質の全長、断片または一部)をコードするmRNAは、裸のRNA(パッケージされていない)として、または送達媒体を介して送達してもよい。本明細書中で使用する用語「送達媒体」、「輸送媒体」、「ナノ粒子」または文法上の同等表現は、同じ意味で用いる。
いくつかの実施形態において、適切な送達媒体は、リポソーム送達媒体、例えば脂質ナノ粒子である。本明細書中で使用する場合、脂質ナノ粒子などのリポソーム送達媒体は、通常、1つ以上の二重層の膜によって外部媒質から隔離された内部水性空間を備えた極小の小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は、通常、空間的に分離した親水性及び疎水性ドメインを有する合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成される(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307‐321,1998)。リポソームの二重層膜は、両親媒性ポリマー及び界面活性剤(例えば、ポリメロソーム(polymerosome)、ニオソームなど)によって形成することもできる。本発明の文脈において、リポソーム送達媒体は、一般的には、所望のmRNAを標的細胞または組織に輸送するのに役立つ。
いくつかの実施形態において、リポソームは、1つ以上のカチオン性脂質を含み得る。本明細書中で使用する語句「カチオン性脂質」とは、選択したpH、例えば生理学的pHなどにおいて、正味の正電荷を有する多くの脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法における使用に特に適したカチオン性脂質として、国際特許公開WO2010/053572(特に、段落[00225]に記載されているCI2‐200)及びWO2012/170930に記載されているものが挙げられ、これらの文献は、参照として本明細書に援用する。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、2012年3月29日に出願された米国仮特許出願第61/617,468号(本明細書中に参照として援用する)に記載のイオン化可能なカチオン性脂質、例えば(15Z,18Z)‐N,N‐ジメチル‐6‐(9Z,12Z)‐オクタデカ‐9,12‐ジエン‐1‐イル)テトラコサ‐15,18‐ジエン‐1‐アミン(HGT5000)、(15Z,18Z)‐N,N‐ジメチル‐6‐((9Z,12Z)‐オクタデカ‐9,12‐ジエン‐1‐イル)テトラコサ‐4,15,18‐トリエン‐1‐アミン(HGT5001)、及び(15Z,18Z)‐N,N‐ジメチル‐6‐((9Z,12Z)‐オクタデカ‐9,12‐ジエン‐1‐イル)テトラコサ‐5,15,18‐トリエン‐1‐アミン(HGT5002)などを含む脂質ナノ粒子を利用する。
各R2は独立して水素またはC1‐3アルキルであり;
各qは独立して2〜6であり;
各R’は独立して水素またはC1‐3アルキルであり;
及び、各RLは独立してC8‐12アルキルである。
いくつかの実施形態において、提供するリポソームは、1つ以上の非カチオン性(「ヘルパー」)脂質を含有する。本明細書中で使用する場合、語句「非カチオン性脂質」とは、任意の中性、双性イオン性または陰イオン性の脂質を指す。本明細書中で使用する場合、語句「アニオン性脂質」とは、選択したH、例えば生理学的pHなどにおいて正味の負電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン4‐(N‐マレイミドメチル)‐シクロヘキサン‐1‐カルボキシレート(DOPE‐mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、16‐O‐モノメチルPE、16‐O‐ジメチルPE、18‐1‐trans‐PE、1‐ステアロイル‐2‐オレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)、またはそれらの混合物が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
いくつかの実施形態では、提供するリポソームは、1つ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、適切なコレステロール系カチオン性脂質として、例えばDC‐Choi(N,N‐ジメチル‐N‐エチルカルボキシアミドコレステロール)、1,4‐ビス(3‐N‐オレイルアミノ‐プロピル)ピペラジン(Gao,et al. Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991);Wolf et al. BioTechniques 23,139(1997);U.S.Pat.No.5,744,335)、またはICEが挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約2%〜約30%、または約5%〜約20%のモル比を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質の割合は、5,%超、10%、20%超、30%超、または40%超であってもよい。
いくつかの実施形態において、提供するリポソームは、1種以上のPEG化脂質を含む。例えば、N‐オクタノイル‐スフィンゴシン‐1‐[スクシニル(メトキシポリエチレングリコール)‐2000](C8 PEG‐2000セラミド)をはじめとするポリエチレングリコール(PEG)修飾リン脂質、及び誘導体化セラミド(PEG‐CER)などの誘導体化脂質を、1種以上のカチオン性の脂質、及びいくつかの実施形態においては他の脂質と組み合わせて用いて、共にリポソームを構成することも本発明は想定している。想定されるPEG修飾脂質として、鎖長C6〜C20のアルキル鎖(複数可)を有し、脂質に共有結合した最大鎖長5kDaのポリエチレングリコール鎖が挙げられるが、必ずしもこれに限定するものではない。いくつかの実施形態では、PEG修飾またはPEG化脂質は、PEG化コレステロールまたはPEG‐2Kである。このような成分の添加は、複雑な凝集を防止する可能性があり、循環寿命を引き延ばし、標的細胞への脂質‐核酸組成物の送達を高める手段を提供し得るが(Klibanov et al.(1990)FEBS Letters,268(1):235‐237)、またはin vivoで製剤から速やかに交換されるように成分を選択してもよい(米国特許第5,885,613号参照)。
いくつかの実施形態において、ポリマーを担体として単独で、または本明細書に記載の様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて用いて、適切な送達媒体を製剤化する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書中で用いるリポソーム送達媒体は、ポリマーを含有するナノ粒子も包含する。適切なポリマーとして、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド‐ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、PEG化プロタミン、PLL、PEG化PLL及びポリエチレンイミン(PEI)を挙げてもよい。PEIが存在する場合、それは10〜40kDaの範囲の分子量の分枝PEI、例えば25kDa分枝PEI(シグマ#408727)などであってもよい。
本発明によるmRNAは、様々な公知の方法のいずれかに従って合成してもよい。例えば、本発明によるmRNAを、in vitro転写法(IVT)によって合成してもよい。簡単に説明すると、IVTは通常、プロモーターを含む直鎖または環状DNA鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、DTT及びマグネシウムイオンを含んでもよい緩衝系、ならびに、適切な、RNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7またはSP6 RNAポリメラーゼ)、DNAseI、ピロホスファターゼ、及び/またはRNAse阻害剤を用いて実施する。その正確な条件は、具体的用途に応じて異なる。
いくつかの実施形態では、本発明によるmRNAは、未修飾mRNAまたは修飾mRNAとして合成してもよい。一般的には、mRNAを修飾して安定性を高める。mRNAの修飾は、例えば、RNAのヌクレオチドの修飾を含み得る。したがって、本発明による修飾mRNAは、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、mRNAは、天然のヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログ(修飾ヌクレオチド)から合成してもよく、これらの一例として、プリン(アデニン(A)、グアニン(G))またはピリミジン(チミン(T)、シトシン(C)、ウラシル(U))、ならびにプリン及びピリミジンの修飾ヌクレオチドアナログまたは誘導体として、例えば、1‐メチルアデニン、2‐メチルアデニン、2‐メチルチオ‐N‐6‐イソペンテニルアデニン、N6‐メチル‐アデニン、N6‐イソペンテニル‐アデニン、2‐チオ‐シトシン、3‐メチル‐シトシン、4‐アセチル‐シトシン、5‐メチル‐シトシン、2,6‐ジアミノプリン、1‐メチル‐グアニン、2‐メチル‐グアニン、2,2‐ジメチル‐グアニン、7‐メチル‐グアニン、イノシン、1‐メチル‐イノシン、プソイドウラシル(5‐ウラシル)、ジヒドロ‐ウラシル、2‐チオ‐ウラシル、4‐チオ‐ウラシル、5‐カルボキシメチルアミノメチル‐2‐チオ‐ウラシル、5‐(カルボキシヒドロキシメチル)‐ウラシル、5‐フルオロ‐ウラシル、5‐ブロモ‐ウラシル、5‐カルボキシメチルアミノメチル‐ウラシル、5‐メチル‐2‐チオ‐ウラシル、5‐メチル‐ウラシル、N‐ウラシル‐5‐オキシ酢酸メチルエステル、5‐メチルアミノメチル‐ウラシル、5‐メトキシアミノメチル‐2‐チオ‐ウラシル、5’‐メトキシカルボニルメチル‐ウラシル、5‐メトキシ‐ウラシル、ウラシル‐5‐オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル‐5‐オキシ酢酸(v)、1‐メチル‐プソイドウラシル、キューオシン(queosine)、.β.‐D‐マンノシルキューオシン(mannosyl‐queosine)、ワイブトキソシン、及びホスホルアミド酸、チオリン酸エステル、ペプチド・ヌクレオチド、メチルホスホン酸、7‐デアザグアノシン、5‐メチルシトシン並びにイノシンが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。そのようなアナログの調製は、例えば、米国特許第4,373,071号、米国特許第4,401,796号、米国特許第4,415,732号、米国特許第4,458,066号、米国特許第4,500,707号、米国特許第4,668,777号、米国特許第4,973,679号、米国特許第5,047,524号、米国特許第5,132,418号、米国特許第5,153,319号、米国特許第5,262,530号及び同第5,700,642号の記載から、当業者には公知であり、これらの開示内容は、参照としてその全体を本明細書に援用する。
いくつかの実施形態では、mRNAは、5’末端キャップ構造を含む。5’末端キャップは、一般的に、以下のように付加される:まず、RNA末端ホスファターゼが、5’ヌクレオチドから末端リン酸基の1つを除去し、2つの末端リン酸基を残す;次いで、グアニリルトランスフェラーゼが、グアノシン三リン酸(GTP)を末端リン酸基に付加し、5’5’5三リン酸エステル結合を生成する;そして、グアニンの7位の窒素を、メチルトランスフェラーゼがメチル化する。キャップ構造の例として、m7G(5’)ppp(5’(A、G(5’)ppp(5’)A及びG(5’)ppp(5’)Gが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。
一般的に、「テール」の存在はmRNAをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するのに役立つ。ポリAテールは、天然のメッセンジャー及び合成のセンスRNAを安定化させると考えられている。したがって、ある実施形態では、長いポリAテールをmRNA分子に付加し、それによりRNAをより安定化することができる。ポリAテールは、当該技術分野で認められている多種多様な技術を用いて付加することができる。例えば、合成RNAまたはin vitro転写したRNAに、ポリAポリメラーゼを用いて長いポリAテールを付加することができる(Yokoe,et al.Nature Biotechnology.1996;14:1252‐1256)。転写ベクターに長いポリAテールをコードすることもできる。さらに、ポリAテールは、PCR産物から直接転写することによって付加することができる。RNAリガーゼを用いて、ポリAをセンスRNAの3’末端に連結してもよい(例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,ed.by Sambrook,Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1991 edition)参照)。
いくつかの実施形態では、mRNAは、5’及び/または3’の非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、5’非翻訳領域は、mRNAの安定性または翻訳に影響を与える1種以上のエレメント、例えば、鉄応答性エレメントを含む。いくつかの実施形態では、5’非翻訳領域は、約50〜500ヌクレオチドの鎖長であってもよい。
本発明の組成物に使用するためのリポソーム輸送媒体は、現在、当該技術分野で公知の様々な技術により調製することができる。提供組成物に使用するためのリポソームは、現在、当該技術分野で公知の様々な技術により調製することができる。例えば、適切な溶媒に選択脂質を溶解させてその脂質を好適な容器または器の内壁に付着させ、その後、溶媒を蒸発乾涸させて容器内側に薄膜を残すか、または噴霧乾燥させるなどの従来技術に従って多重層リポソーム(MLV)を調製してもよい。次いで、容器に、ボルテックス撹拌とともに水相を加えてもよく、これによってMLVが形成する。その後、多重層リポソームを均質化、超音波処理または押出することによって、単層リポソーム(ULV)を形成することができる。さらに、界面活性剤除去法によって単層リポソームを形成することができる。
本発明の好適なリポソームは、様々なサイズで生成してもよい。いくつかの実施形態では、提供リポソームは、これまでに公知のmRNA封入リポソームより小さい場合がある。いくつかの実施形態では、リポソームのサイズ縮小は、mRNA送達の高効率性に関連している。リポソームの適切なサイズの選択には、標的とする細胞または組織の部位、及び、ある程度、リポソーム作製の用途を考慮に入れてもよい。
in vivoでのmRNAの発現を促進するために、リポソームなどの送達媒体を、1種以上の追加の核酸、担体、標的リガンドもしくは安定化剤と組み合わせて、または適切な賦形剤とともに混合した医薬組成物中に製剤化することができる。薬物の製剤化及び投与法についての手法は、“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,latest editionに記載されている。
本実施例は、in vivoでのGAA mRNAの効果的な送達及び発現のための例示的なリポソーム製剤を提示する。
脂質材料
本明細書に記載の製剤は、GAAタンパク質をコードするmRNAをカプセル化するように設計され、1つ以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質(例えば、非カチオン性脂質及び/またはコレステロール系脂質)及びPEG化脂質を様々な割合で用いる多成分脂質混合物を含有する。カチオン性脂質として、DOTAP(1,2‐ジオレイル‐3‐トリメチルアンモニウムプロパン)、DODAP(1,2‐ジオレイル‐3‐ジメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2‐ジ‐O‐オクタデセニル‐3‐トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA(Heyes,J.;Palmer,L.;Bremner,K.;MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276‐287)、DLin‐KC2‐DMA(Semple,S.C.et al.“Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172‐176)、C12‐200(Love,K.T.et al.“Lipid‐like materials for low‐dose in vivo gene silencing”PNAS 2010,107,1864‐1869)、cKK‐E12(3,6‐ビス(4‐(ビス(2‐ヒドロキシドデシル)アミノ)ブチル)ピペラジン‐2,5‐ジオン)、HGT5000、HGT5001、HGT4003、ICE、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジニウム系などを挙げることができる(しかし、これらだけに限るものではない)。ヘルパー脂質として、DSPC(1,2‐ジステアロイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホコリン)、DPPC(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホコリン)、DOPE(1,2‐ジオレイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2‐ジオレイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスフォチジルコリン(phosphotidylcholine)) DPPE(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2‐ジミリストイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2‐ジオレオイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホ‐(1’‐rac‐グリセロール))、コレステロールなどを挙げることができる(しかし、これらだけに限るものではない)。ペグ化脂質として、鎖長C6〜C20のアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有結合した最大鎖長5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖を挙げることができる(しかし、これらだけに限るものではない)。
例示的なコドン最適化ヒト酸性αグルコシダーゼ(GAA)mRNA
構築物の設計:
X‐配列番号3‐Y
5’及び3’UTR配列
X(5’UTR配列)=
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG [配列番号8]
Y(3’UTR配列)=
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU [配列番号9]
または
GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU [配列番号10]
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGAGUCAGACACCCGCCGUGCUCGCACAGGCUUCUGGCCGUGUGCGCACUCGUGAGUCUGGCGACUGCUGCGUUGCUGGGGCACAUUCUUCUCCACGACUUUCUCUUGGUGCCCCGAGAAUUGUCGGGCUCGUCGCCGGUACUGGAAGAAACCCACCCCGCACAUCAGCAGGGCGCGUCGCGGCCUGGUCCGAGGGAUGCCCAGGCACAUCCCGGAAGGCCACGAGCCGUCCCGACUCAAUGUGACGUACCUCCCAAUUCCCGGUUCGACUGUGCGCCAGACAAGGCAAUCACGCAAGAGCAGUGCGAAGCCCGUGGAUGCUGCUAUAUUCCGGCGAAGCAGGGACUUCAGGGAGCCCAGAUGGGGCAGCCCUGGUGUUUCUUCCCGCCUUCCUAUCCCUCAUAUAAGCUGGAGAAUUUGUCGUCCUCGGAAAUGGGGUAUACCGCUACUCUUACGAGAACCACCCCCACAUUCUUUCCGAAGGACAUCCUUACUCUGCGGCUCGACGUGAUGAUGGAGACAGAAAAUAGGCUGCAUUUCACGAUCAAAGACCCGGCGAACCGGAGAUAUGAGGUUCCGCUUGAGACUCCCCACGUUCACUCUCGUGCGCCUUCACCCUUGUACUCCGUGGAGUUCUCGGAAGAACCGUUCGGGGUGAUCGUCAGACGUCAACUUGAUGGUAGGGUAUUGCUGAACACAACGGUCGCCCCCUUGUUUUUCGCCGACCAGUUUCUGCAGCUUUCGACAUCGCUGCCGUCCCAGUAUAUCACAGGGCUCGCGGAGCAUCUUUCACCCCUCAUGCUGAGCACGAGCUGGACACGGAUUACGCUCUGGAACAGGGAUCUCGCGCCGACGCCCGGAGCGAAUUUGUAUGGGUCGCAUCCCUUCUACCUCGCAUUGGAAGACGGGGGUUCCGCGCACGGAGUAUUCCUGCUUAAUUCUAAUGCGAUGGACGUUGUCUUGCAGCCCUCCCCUGCUUUGUCGUGGCGUUCCACGGGGGGCAUUUUGGACGUUUACAUCUUUUUGGGACCCGAGCCAAAGAGCGUAGUGCAGCAGUAUUUGGAUGUAGUGGGCUACCCCUUCAUGCCGCCUUAUUGGGGACUGGGGUUCCAUCUCUGCCGCUGGGGGUACUCUUCGACCGCGAUCACCCGCCAGGUGGUCGAGAACAUGACCAGAGCACAUUUCCCUUUGGACGUGCAGUGGAAUGAUUUGGAUUACAUGGAUAGCCGAAGAGACUUCACGUUCAAUAAGGACGGGUUUAGAGAUUUUCCCGCGAUGGUGCAAGAAUUGCACCAGGGUGGGCGCAGAUACAUGAUGAUCGUCGAUCCCGCCAUCAGCAGCUCGGGACCAGCGGGGAGUUACCGGCCUUACGAUGAGGGACUUAGGAGAGGCGUCUUUAUCACGAACGAAACAGGUCAGCCGCUCAUUGGUAAAGUGUGGCCUGGAUCAACGGCCUUUCCCGACUUCACGAAUCCCACAGCCCUCGCCUGGUGGGAAGACAUGGUGGCGGAGUUUCACGACCAAGUACCGUUUGAUGGGAUGUGGAUUGAUAUGAACGAACCCUCAAACUUUAUUCGCGGCUCGGAAGAUGGAUGCCCGAAUAAUGAGCUUGAGAAUCCCCCGUAUGUGCCAGGGGUGGUAGGUGGGACGCUCCAGGCCGCUACGAUCUGUGCGUCAUCACAUCAGUUCUUGUCAACGCACUACAACUUGCACAAUCUUUACGGUUUGACUGAAGCCAUCGCUUCGCAUCGCGCGCUGGUCAAAGCGCGUGGUACGCGACCCUUCGUUAUUUCUCGGUCCACAUUUGCCGGGCACGGUCGGUAUGCCGGACACUGGACGGGAGAUGUCUGGUCUAGCUGGGAGCAGCUCGCGUCGAGCGUACCGGAGAUCCUCCAGUUCAAUCUUUUGGGAGUUCCGCUCGUCGGCGCUGACGUGUGCGGUUUUCUCGGAAACACAUCAGAAGAGCUUUGCGUACGCUGGACACAGCUCGGUGCGUUUUACCCCUUUAUGAGAAACCAUAACUCGUUGCUCUCACUCCCUCAAGAGCCGUACAGUUUUUCGGAGCCUGCGCAACAGGCGAUGCGGAAGGCAUUGACACUUCGCUAUGCACUGCUCCCGCAUCUCUAUACUCUGUUCCAUCAGGCCCAUGUGGCUGGAGAAACGGUGGCGAGGCCCCUGUUCUUGGAGUUCCCCAAAGAUAGUUCCACAUGGACCGUGGAUCACCAGUUGCUGUGGGGAGAGGCGCUUCUGAUCACUCCGGUACUUCAGGCGGGUAAAGCGGAAGUCACUGGGUAUUUCCCGCUUGGGACCUGGUACGACCUUCAGACUGUCCCAGUAGAAGCCCUCGGAAGCCUGCCACCUCCCCCUGCUGCACCCCGCGAGCCUGCAAUCCAUAGCGAGGGCCAGUGGGUAACGUUGCCAGCCCCACUGGAUACCAUCAAUGUCCACCUCAGGGCGGGUUACAUUAUCCCUCUCCAAGGCCCUGGGUUGACCACCACAGAGUCGCGCCAGCAGCCAAUGGCACUUGCGGUCGCAUUGACGAAAGGGGGUGAAGCCCGAGGGGAACUGUUUUGGGAUGACGGGGAAAGCCUUGAGGUGCUGGAACGGGGAGCGUACACACAAGUCAUUUUCUUGGCCAGGAACAACACUAUUGUCAACGAGUUGGUGCGCGUGACCUCUGAGGGUGCCGGACUGCAACUGCAGAAGGUCACGGUCCUCGGAGUGGCGACAGCACCCCAACAGGUCCUUAGUAACGGAGUACCUGUCUCGAACUUUACAUACUCCCCGGACACGAAGGUGCUCGACAUCUGUGUGUCGCUGCUUAUGGGGGAACAGUUUCUCGUGAGCUGGUGCUAGCGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU [配列番号11]
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGAGUCAGACACCCGCCGUGCUCGCACAGGCUUCUGGCCGUGUGCGCACUCGUGAGUCUGGCGACUGCUGCGUUGCUGGGGCACAUUCUUCUCCACGACUUUCUCUUGGUGCCCCGAGAAUUGUCGGGCUCGUCGCCGGUACUGGAAGAAACCCACCCCGCACAUCAGCAGGGCGCGUCGCGGCCUGGUCCGAGGGAUGCCCAGGCACAUCCCGGAAGGCCACGAGCCGUCCCGACUCAAUGUGACGUACCUCCCAAUUCCCGGUUCGACUGUGCGCCAGACAAGGCAAUCACGCAAGAGCAGUGCGAAGCCCGUGGAUGCUGCUAUAUUCCGGCGAAGCAGGGACUUCAGGGAGCCCAGAUGGGGCAGCCCUGGUGUUUCUUCCCGCCUUCCUAUCCCUCAUAUAAGCUGGAGAAUUUGUCGUCCUCGGAAAUGGGGUAUACCGCUACUCUUACGAGAACCACCCCCACAUUCUUUCCGAAGGACAUCCUUACUCUGCGGCUCGACGUGAUGAUGGAGACAGAAAAUAGGCUGCAUUUCACGAUCAAAGACCCGGCGAACCGGAGAUAUGAGGUUCCGCUUGAGACUCCCCACGUUCACUCUCGUGCGCCUUCACCCUUGUACUCCGUGGAGUUCUCGGAAGAACCGUUCGGGGUGAUCGUCAGACGUCAACUUGAUGGUAGGGUAUUGCUGAACACAACGGUCGCCCCCUUGUUUUUCGCCGACCAGUUUCUGCAGCUUUCGACAUCGCUGCCGUCCCAGUAUAUCACAGGGCUCGCGGAGCAUCUUUCACCCCUCAUGCUGAGCACGAGCUGGACACGGAUUACGCUCUGGAACAGGGAUCUCGCGCCGACGCCCGGAGCGAAUUUGUAUGGGUCGCAUCCCUUCUACCUCGCAUUGGAAGACGGGGGUUCCGCGCACGGAGUAUUCCUGCUUAAUUCUAAUGCGAUGGACGUUGUCUUGCAGCCCUCCCCUGCUUUGUCGUGGCGUUCCACGGGGGGCAUUUUGGACGUUUACAUCUUUUUGGGACCCGAGCCAAAGAGCGUAGUGCAGCAGUAUUUGGAUGUAGUGGGCUACCCCUUCAUGCCGCCUUAUUGGGGACUGGGGUUCCAUCUCUGCCGCUGGGGGUACUCUUCGACCGCGAUCACCCGCCAGGUGGUCGAGAACAUGACCAGAGCACAUUUCCCUUUGGACGUGCAGUGGAAUGAUUUGGAUUACAUGGAUAGCCGAAGAGACUUCACGUUCAAUAAGGACGGGUUUAGAGAUUUUCCCGCGAUGGUGCAAGAAUUGCACCAGGGUGGGCGCAGAUACAUGAUGAUCGUCGAUCCCGCCAUCAGCAGCUCGGGACCAGCGGGGAGUUACCGGCCUUACGAUGAGGGACUUAGGAGAGGCGUCUUUAUCACGAACGAAACAGGUCAGCCGCUCAUUGGUAAAGUGUGGCCUGGAUCAACGGCCUUUCCCGACUUCACGAAUCCCACAGCCCUCGCCUGGUGGGAAGACAUGGUGGCGGAGUUUCACGACCAAGUACCGUUUGAUGGGAUGUGGAUUGAUAUGAACGAACCCUCAAACUUUAUUCGCGGCUCGGAAGAUGGAUGCCCGAAUAAUGAGCUUGAGAAUCCCCCGUAUGUGCCAGGGGUGGUAGGUGGGACGCUCCAGGCCGCUACGAUCUGUGCGUCAUCACAUCAGUUCUUGUCAACGCACUACAACUUGCACAAUCUUUACGGUUUGACUGAAGCCAUCGCUUCGCAUCGCGCGCUGGUCAAAGCGCGUGGUACGCGACCCUUCGUUAUUUCUCGGUCCACAUUUGCCGGGCACGGUCGGUAUGCCGGACACUGGACGGGAGAUGUCUGGUCUAGCUGGGAGCAGCUCGCGUCGAGCGUACCGGAGAUCCUCCAGUUCAAUCUUUUGGGAGUUCCGCUCGUCGGCGCUGACGUGUGCGGUUUUCUCGGAAACACAUCAGAAGAGCUUUGCGUACGCUGGACACAGCUCGGUGCGUUUUACCCCUUUAUGAGAAACCAUAACUCGUUGCUCUCACUCCCUCAAGAGCCGUACAGUUUUUCGGAGCCUGCGCAACAGGCGAUGCGGAAGGCAUUGACACUUCGCUAUGCACUGCUCCCGCAUCUCUAUACUCUGUUCCAUCAGGCCCAUGUGGCUGGAGAAACGGUGGCGAGGCCCCUGUUCUUGGAGUUCCCCAAAGAUAGUUCCACAUGGACCGUGGAUCACCAGUUGCUGUGGGGAGAGGCGCUUCUGAUCACUCCGGUACUUCAGGCGGGUAAAGCGGAAGUCACUGGGUAUUUCCCGCUUGGGACCUGGUACGACCUUCAGACUGUCCCAGUAGAAGCCCUCGGAAGCCUGCCACCUCCCCCUGCUGCACCCCGCGAGCCUGCAAUCCAUAGCGAGGGCCAGUGGGUAACGUUGCCAGCCCCACUGGAUACCAUCAAUGUCCACCUCAGGGCGGGUUACAUUAUCCCUCUCCAAGGCCCUGGGUUGACCACCACAGAGUCGCGCCAGCAGCCAAUGGCACUUGCGGUCGCAUUGACGAAAGGGGGUGAAGCCCGAGGGGAACUGUUUUGGGAUGACGGGGAAAGCCUUGAGGUGCUGGAACGGGGAGCGUACACACAAGUCAUUUUCUUGGCCAGGAACAACACUAUUGUCAACGAGUUGGUGCGCGUGACCUCUGAGGGUGCCGGACUGCAACUGCAGAAGGUCACGGUCCUCGGAGUGGCGACAGCACCCCAACAGGUCCUUAGUAACGGAGUACCUGUCUCGAACUUUACAUACUCCCCGGACACGAAGGUGCUCGACAUCUGUGUGUCGCUGCUUAUGGGGGAACAGUUUCUCGUGAGCUGGUGCUAGGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU [配列番号12]
A. cKK‐E12
cKK‐E12、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kの50mg/mLエタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積3mLまでエタノールで希釈した。これとは別に、GAA mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製した。脂質溶液をmRNA水溶液に急速に注入し、振盪して20%エタノール中の最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保存した。最終濃度=0.64mg/mL GAA mRNA(カプセル化)であった。Zave=80nm;PDI=0.17であった。封入率=85%;収率=89%であった。
C12‐200、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kの50mg/mLエタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積3mLまでエタノールで希釈する。これとは別に、GAA mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製する。脂質溶液をmRNA水溶液に急速に注入し、振盪して20%エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保存する。GAAカプセル化mRNAの最終濃度、Zave、Dv(50)及びDv(90)を測定する。
HGT4003、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kの50mg/mLエタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積3mLまでエタノールで希釈する。これとは別に、GAA mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製する。脂質溶液をmRNA水溶液に急速に注入し、振盪して20%エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保存する。GAAカプセル化mRNAの最終濃度、Zave、Dv(50)及びDv(90)を測定する。
ICE、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kの50mg/mLエタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積3mLまでエタノールで希釈する。これとは別に、GAA mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製する。脂質溶液をmRNA水溶液に急速に注入し、振盪して20%エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保存する。GAAカプセル化mRNAの最終濃度、Zave、Dv(50)及びDv(90)を測定する。
HGT5001、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kの50mg/mLエタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積3mLまでエタノールで希釈する。これとは別に、GAA mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製する。脂質溶液をmRNA水溶液に急速に注入し、振盪して20%エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保存する。GAAカプセル化mRNAの最終濃度、Zave、Dv(50)及びDv(90)を測定する。
HGT5000、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kの50mg/mLエタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積3mLまでエタノールで希釈する。これとは別に、GAA mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製する。脂質溶液をmRNA水溶液に急速に注入し、振盪して20%エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保存する。GAAカプセル化mRNAの最終濃度、Zave、Dv(50)及びDv(90)を測定する。
DLinKC2DMA、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kの50mg/mLエタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積3mLまでエタノールで希釈する。これとは別に、GAA mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製する。脂質溶液をmRNA水溶液に急速に注入し、振盪して20%エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保存する。GAAカプセル化mRNAの最終濃度、Zave、Dv(50)及びDv(90)を測定する。
DODAP、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kの50mg/mLエタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積3mLまでエタノールで希釈する。これとは別に、GAA mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製する。脂質溶液をmRNA水溶液に急速に注入し、振盪して20%エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保存する。GAAカプセル化mRNAの最終濃度、Zave、Dv(50)及びDv(90)を測定する。
DODMA、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kの50mg/mLエタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積3mLまでエタノールで希釈する。これとは別に、GAA mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLのストックから調製する。脂質溶液をmRNA水溶液に急速に注入し、振盪して20%エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保存する。GAAカプセル化mRNAの最終濃度、Zave、Dv(50)及びDv(90)を測定する。
本実施例は、GAA mRNAを充填したリポソームナノ粒子を投与する例示的な方法、及びin vivoで様々な標的組織中のGAA mRNA及びグリコーゲンを分析する方法を説明する。
本実施例は、GAA mRNAを充填したリポソームナノ粒子を投与する例示的な方法、及びin vivoでの様々な標的組織におけるGAA mRNA及びグリコーゲンの分析方法を例示する。
当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験を用いて確認するであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定することを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲にこれを記載する。
Claims (63)
- ポンペ病の治療のための組成物であって、リポソーム内に封入される酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードするmRNAを含み、前記組成物は、治療を必要とする被験体に有効な用量及び投与間隔で投与され、ポンペ病の少なくとも1つの症状または特徴の強度、重症度、または頻度を低減するか、または発症を遅らせることを特徴とし、前記mRNAが配列番号3と少なくとも90%同一のGAAをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含み、前記mRNAのG/C含有が最適化されて、可能な限り高いG/C含有を達成し、前記リポソームが、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上の非カチオン性脂質、1つ以上のコレステロール系脂質、及び1つ以上のPEG修飾脂質を含む、前記組成物。
- ポンペ病の治療のための組成物であって、リポソーム内に封入される酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードするmRNAを含み、前記組成物の治療有効量は、治療を必要とする被験体に投与されて、被験体の肥大性心筋症を治療することを特徴とし、前記mRNAが配列番号3と少なくとも90%同一のGAAをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含み、前記mRNAのG/C含有が最適化されて、可能な限り高いG/C含有を達成し、前記リポソームが、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上の非カチオン性脂質、1つ以上のコレステロール系脂質、及び1つ以上のPEG修飾脂質を含む、前記組成物。
- 前記1つ以上のカチオン性脂質が、C12‐200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK‐E12、ICE(イミダゾール系)、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA及びDMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin‐K‐DMA、DLin‐K‐XTC2‐DMA、HGT4003、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されるカチオン性脂質を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記1つ以上の非カチオン性脂質が、DSPC(1,2‐ジステアロイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホコリン)、DPPC(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホコリン)、DOPE(1,2‐ジオレイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2‐ジオレイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスフォチジルコリン) DPPE(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2‐ジミリストイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2‐ジオレオイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホ‐(1’‐rac‐グリセロール))及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロール及び/またはPEG化コレステロールである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つ以上のPEG修飾脂質が、鎖長C6〜C20のアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有結合した最大鎖長5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が、前記リポソームの約30〜50重量%を占める、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- カチオン性脂質が、リポソームの約40重量%を占める、請求項8に記載の組成物。
- カチオン性脂質:非カチオン性脂質:コレステロール:PEG化脂質の比が、モル比でおよそ40:30:20:10である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- カチオン性脂質:非カチオン性脂質:コレステロール:PEG化脂質の比が、重量比でおよそ40:30:25:5である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- カチオン性脂質:非カチオン性脂質:コレステロール:PEG化脂質の比が、重量比でおよそ40:32:25:3である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記リポソームが:
cKK‐E12、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2K;
C12‐200、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2K;
HGT4003、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2K;または、
ICE、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kから選択される組み合わせを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記リポソームが約100nm未満のサイズを有する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、前記mRNAが、約0.1〜5.0mg/kg体重の範囲の有効用量で投与されるように投与されることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、前記mRNAが、約0.1〜3.0mg/kg体重の範囲の有効用量で投与されるように投与されることを特徴とする、請求項1〜15のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、前記mRNAが、約0.1〜1.0mg/kg体重の範囲の有効用量で投与されるように投与されることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は、前記mRNAが、約1.0mg/kg体重の有効用量で投与されるように投与されることを特徴とする、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は静脈内に投与されることを特徴とする、請求項1〜18のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は筋肉内に投与されることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記筋肉内投与を、骨格筋、平滑筋、心筋及びそれらの組合せからなる群から選択される筋肉に対して行う、請求項20に記載の組成物。
- 前記組成物は週1回投与されることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は週2回投与されることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は月2回投与されることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は月1回投与されることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は14日に1回投与されることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記投与は、肝臓内でのGAAタンパク質の発現をもたらすことを特徴とする、請求項1〜26のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記投与は、筋肉組織または筋肉細胞内でのGAAタンパク質の発現をもたらすことを特徴とする、請求項1〜27のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記筋肉組織が、骨格筋、平滑筋、心筋及びそれらの組合せから選択される、請求項28に記載の組成物。
- 前記筋肉細胞が、筋細胞、筋管、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項28に記載の組成物。
- 前記組成物の投与は、血清中でのGAAタンパク質発現をもたらすことを特徴とする、請求項1〜30のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の尿中Glc4レベルが、治療前のベースラインの尿中Glc4レベルに比べて低下することを特徴とする、請求項1〜31のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の筋グリコーゲンレベルが、治療前のベースラインの筋グリコーゲンレベルに比べて低下することを特徴とする、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の肝グリコーゲンレベルが、治療前のベースラインの肝グリコーゲンレベルに比べて低下することを特徴とする、請求項1〜33のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清アスパラギン酸トランスアミナーゼレベルが、治療前のベースラインの血清アスパラギン酸トランスアミナーゼレベルに比べて低下することを特徴とする、請求項1〜34のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清アラニントランスアミナーゼレベルが、治療前のベースラインの血清アラニントランスアミナーゼレベルに比べて低下することを特徴とする、請求項1〜35のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清クレアチンキナーゼレベルが、治療前のベースラインの血清クレアチンキナーゼレベルに比べて低下することを特徴とする、請求項1〜36のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清乳酸デヒドロゲナーゼレベルが、治療前のベースラインの血清乳酸デヒドロゲナーゼレベルに比べて低下することを特徴とする、請求項1〜37のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物の前記投与の結果、前記被験体由来の生物学的試料中のGAA酵素活性レベルが、治療前の生物学的試料中のベースラインのGAA酵素活性レベルに比べて上昇することを特徴とする、請求項1〜38のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mRNAが、配列番号8の5’UTR配列をさらに含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mRNAが、配列番号9または配列番号10の3’UTR配列をさらに含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mRNAが、配列番号11または配列番号12を有する、請求項1〜41のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mRNAが、1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つ以上の修飾ヌクレオチドが、プソイドウリジン、N‐1‐メチル‐プソイドウリジン、2‐アミノアデノシン、2‐チオチミジン、イノシン、ピロロ‐ピリミジン、3‐メチルアデノシン、5‐メチルシチジン、C‐5プロピニル‐シチジン、C‐5プロピニル‐ウリジン、2‐アミノアデノシン、C5‐ブロモウリジン、C5‐フルオロウリジン、C5‐ヨードウリジン、C5‐プロピニル‐ウリジン、C5‐プロピニル‐シチジン、C5‐メチルシチジン、2‐アミノアデノシン、7‐デアザアデノシン、7‐デアザグアノシン、8‐オキソアデノシン、8‐オキソグアノシン、O(6)‐メチルグアニン及び/または2‐チオシチジンを含む、請求項43に記載の組成物。
- 前記mRNAが未修飾である、請求項1〜42のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1つ以上の非カチオン性脂質が、DSPC(1,2‐ジステアロイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホコリン)、DPPC(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホコリン)、DOPE(1,2‐ジオレイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2‐ジオレイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスフォチジルコリン(phosphotidylcholine)) DPPE(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2‐ジミリストイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2‐ジオレオイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホ‐(1’‐rac‐グリセロール))及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項46に記載の組成物。
- 前記1つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロール及び/またはPEG化コレステロールから選択される、請求項46または47に記載の組成物。
- 前記1つ以上のPEG修飾脂質が、鎖長C6〜C20のアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有結合している最大鎖長5kDaのポリ(エチレン)グリコール鎖を含む、請求項46〜48のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記リポソームが、cKK‐E12、DOPE、コレステロール及びDMG‐PEG2Kを含む、請求項46〜49のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が、リポソームの約30〜50mol%を占める、請求項46〜50のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が、リポソームの約40mol%を占める、請求項51に記載の組成物。
- cKK‐E12:DOPE:コレステロール:DMG‐PEG2Kの比が、モル比でおよそ40:30:20:10である、請求項50〜52のいずれか一項に記載の組成物。
- cKK‐E12:DOPE:コレステロール:DMG‐PEG2Kの比が、モル比でおよそ40:30:25:5である、請求項50〜52のいずれか一項に記載の組成物。
- cKK‐E12:DOPE:コレステロール:DMG‐PEG2Kの比が、モル比でおよそ40:32:25:3である、請求項50〜52のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記リポソームが約100nm未満のサイズを有する、請求項46〜55のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物を静脈内投与用に製剤化する、請求項46〜56のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物を筋肉内投与用に製剤化する、請求項46〜56のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mRNAが、配列番号8の5’UTR配列をさらに含む、請求項46〜58のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mRNAが、配列番号9または配列番号10の3’UTR配列をさらに含む、請求項46〜58のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mRNAが、配列番号11または配列番号12を有する、請求項46〜60のいずれか一項に記載の組成物。
- ポンペ病の治療用組成物であって、酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードする有効量のmRNAをリポソーム内に封入して含み、前記mRNAが配列番号3と少なくとも90%同一のGAAをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を有し、前記mRNAのG/C含有が最適化されて、可能な限り高いG/C含有を達成し、及び、
前記リポソームが、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質及びPEG修飾脂質をさらに含む、前記治療用組成物。 - ポンペ病の治療用組成物であって、酸性αグルコシダーゼ(GAA)をコードする有効量のmRNAをリポソーム内に封入して含み、前記mRNAが配列番号3と少なくとも90%同一のGAAをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を有し、前記mRNAのG/C含有が最適化されて、可能な限り高いG/C含有を達成し、前記mRNAが配列番号11または配列番号12を有し、及び、
前記リポソームが、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質及びPEG修飾脂質をさらに含む、前記治療用組成物。
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