CN102421417B - 脂质组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了含有式(I)

Description

脂质组合物
优先权要求
本申请要求2009年5月5日提交的U.S.S.N61/175,770和2010年1月28日提交的U.S.S.N.61/299,291的优先权，所述每个申请的内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及使用脂质颗粒(lipidparticle)递送治疗剂的领域。特别地，本发明提供包括这些脂质的阳离子脂质和脂质颗粒，这些对于核酸的体内递送以及适合体内治疗用途的核酸-脂质颗粒组合物是有利的。另外，本发明提供制备这些组合物的方法，以及使用这些组合物将核酸引入细胞中的方法，例如，用于治疗各种疾病的症状。
背景技术
治疗性核酸包括例如小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核酶、质粒和免疫刺激核酸。这些核酸通过多种机制起作用。在siRNA或miRNA的情况下，这些核酸可通过被称作RNA干扰(RNAi)的过程下调特异性蛋白的细胞内水平。在将siRNA或miRNA引入到细胞质后，这些双链RNA构建体可结合至被称作RISC的蛋白。从RISC复合物中置换siRNA或miRNA的有义链，从而在RISC中提供可识别和结合具有与结合的siRNA或miRNA的序列互补的mRNA的模板。在结合互补mRNA后，RISC复合物切割mRNA并且释放切割的链。RNAi可通过靶向编码蛋白合成的相应mRNA的特异性破坏来提供特异性蛋白的下调。
RNAi的治疗性应用非常广泛，这是因为siRNA和miRNA的构建体可用任何一种针对靶蛋白的核苷酸序列合成。迄今为止，siRNA在体外和体内模型中都已显示出特异性下调靶蛋白的能力。另外，目前在临床研究中评估siRNA构建体。
然而，当前siRNA或miRNA构建体面临的两个问题是：首先，它们在血浆中对核酸酶酶解的敏感性以及，其次，它们有限的进入细胞内区室(当以游离siRNA或miRNA全身性施用时它们可在所述区室中结合RIST)的能力。通过在分子内引入化学修饰的核苷酸接头(例如，硫代磷酸酯基团)可稳定这些双链构建体。然而，这些化学修饰只提供有限的免受核酸酶酶解的保护作用并且可降低构建体的活性。可通过使用载体系统(如聚合物、阳离子脂质体)或者通过化学修饰构建体(例如通过共价连接胆固醇分子)来促进siRNA或miRNA的细胞内递送。然而，需要改进的递送系统来增加siRNA和miRNA分子的效力以及减少或消除对化学修饰的需求。
反义寡核苷酸和核酶还可抑制mRNA翻译成蛋白质。在反义构建体的情况下，这些单链脱氧核糖核酸具有与靶蛋白mRNA的序列互补的序列，并且可按照沃森-克里克碱基配对结合至mRNA。这种结合可防止靶mRNA的翻译和/或触发mRNA转录物的RNA酶H降解。因此，反义寡核苷酸对于作用特异性(即特异性疾病相关蛋白的下调)具有巨大潜力。迄今为止，这些化合物在体内和体外模型中显示出了前景，这些模型包括炎症性疾病、癌症和HIV的模型(评论于Agrawal，TrendsinBiotech.14：376-387(1996))。反义链还可通过与染色体DNA的特异性杂交影响细胞活性。目前正在进行几个反义药物的晚期人体临床评估。这些药物的靶包括bcl2和载脂蛋白B基因以及mRNA产品。
使用治疗性核酸的一个众所周知的问题涉及磷酸二酯核苷酸间键合的稳定性以及这个接头对核酸酶的敏感性。血清中核酸外切酶和核酸内切酶的存在导致含有磷酸二酯接头的核酸快速降解并且，因此，在血清的存在下或在细胞中，治疗性核酸具有非常短的半衰期(Zelphati，O.等人，Antisense.Res.Dev.3：323-338(1993)；以及Thierry，A.R.等人，第147-161页，GeneRegulation：BiologyofAntisenseRNAandDNA(编者Erickson，RP和Izant，JG；RavenPress，NY(1992))。由于这些和其他已知的问题，目前正在开发的治疗性核酸并没有采用建立在天然核酸上的碱性磷酸二酯化学。
这种问题已通过降低血清或细胞内降解的化学修饰得到部分解决。对核苷酸间磷酸二酯桥(例如，使用硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或氨基磷酸酯键合)、核苷酸碱基(例如5-丙炔基-嘧啶)或糖(例如，2′-修饰的糖)(UhlmannE.等人，Antisense：ChemicalModifications.EncyclopediaofCancer，Vol.X.，pp64-81AcademicPressInc.(1997))修饰进行测试。其他人试图使用2′-5′糖键来改善稳定性(参见，例如，美国专利No.5,532,130)。还试过其他改变。然而，这些解决方案没有一个完全令人满意并且体内游离的治疗性核酸仍然只有有限的效力。
此外，如上有关siRNA和miRNA所述，问题仍然存在于治疗性核酸跨细胞膜的能力有限(参见Vlassov等人，Biochim.Biophys.Acta1197：95-1082(1994))以及与全身毒性相关的问题，例如补体介导的过敏反应、改变凝血性能和血细胞减少症(Galbraith等人，AntisenseNucl.AcidDrugDes.4：201-206(1994))。
尽管最近取得了进展，但是本领域仍需要适于一般治疗用途的改进的脂质-治疗性核酸组合物，这些组合物可高效地封装核酸、具有高的药物∶脂质比、保护封装的核酸在血清中不被降解和清除、适于全身递送以及提供封装的核酸的细胞内递送。此外，这些脂质-核酸颗粒应耐受性好并且提供足够的治疗指数，以至于采用有效剂量的核酸的患者治疗没有显著的毒性和/或对患者没有风险。本发明提供了此类组合物及其制备方法以及使用此类组合物将核酸引入细胞中的方法，包括用于治疗疾病的方法。
发明内容
本发明提供脂质组合物，该组合物包括式(I)的阳离子脂质、中性脂质、甾醇以及PEG或PEG修饰的脂质，其中式(I)为
其中
每个Xa和Xb对于每次出现各自独立地为C1-6亚烷基；
n为0、1、2、3、4或5；
A对于每次出现为NR2或任选地被1-3个R取代的环状部分；
B是NR或任选地被1-2个R取代的环状部分；
每个R对于每次出现独立地为H、烷基、条件是至少一个R为
R1对于每次出现独立地为H、R3、
R2对于每次出现独立地为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代；
R3对于每次出现独立地为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基(例如，亲水性取代基)取代；
Y对于每次出现独立地为O、NR4或S；
R4对于每次出现独立地为H、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；H、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代。
本发明进一步地提供配制所述组合物的方法以及用所述脂质组合物治疗疾病的方法。
在另一方面，提供式(IV)化合物的制备方法
其中，每个R独立地为H、烷基、条件是至少一个R为其中R1对于每次出现独立地为H、R3、 其中R3任选地被一个或多个取代基取代；
R2对于每次出现独立地为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代；
R3对于每次出现独立地为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代；
Y对于每次出现独立地为O、NR4或S；
R4对于每次出现独立地为H、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；H、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代；
所述方法包括将富含对映体的β-羟烷基合成等价物与式(VIII)化合物接触，该β-羟烷基基团任选地被一个或多个取代基取代，
其中，R5对于每次出现独立地为H、烷基或胺保护基，其中所述烷基任选地被一个或多个取代基取代；且R6对于每次出现独立地为H、-(CH2)2N(R5)2或胺保护基。
所述的β-羟烷基合成等价物可以是R基团的前体。换句话说，β-羟烷基合成等价物提供的官能团可以进一步反应以得到最终的式(IV)化合物中的R基团。
式(VIII)化合物可为
或其混合物。
所述富含对映体的β-羟烷基合成等价物可以含有富含对映体的1，2-环氧烷烃，例如，(R)-1，2-环氧十二烷。所述富含对映体的β-羟烷基合成等价物可以含有受保护的α-醇醛，例如，2-(O-Pg)-十二醛，其中，O-Pg表示受保护的羟基。
所述方法可进一步地包括将伯醇捕集试剂与在所述富含对映体的β-羟烷基合成等价物和式(VIII)化合物之间反应得到的产物接触。
在另一方面，化合物的制备方法包括将1-(2-(苯二甲酰亚氨基)乙基)-哌嗪和1-(2-氯乙基)咪唑烷-2-酮接触。
在另一方面，所述化合物为具有下式的化合物及其盐：
在另一方面，所述化合物为具有下式的化合物及其盐：
在另一方面，化合物的制备方法包括将1-氰甲基-4-(2-((氰甲基)氨基)乙基)哌嗪和还原剂接触。
所述还原剂可以不是H2。所述还原剂可包括NaBH4。所述方法可包括将氰甲基-4-(2-((氰甲基)氨基)乙基)哌嗪与还原剂和氨基保护剂同时接触。所述氨基保护剂可包括(Boc)2O。
附图说明
图1显示在各种脂质比率下的相关FVII蛋白。
图2显示各种脂质比率对体重变化的影响。
图3显示在不同量的阳离子脂质(I)和低PEG脂质下的相关FVII蛋白。
图4显示不同量的阳离子脂质(I)和低PEG脂质对体重变化的影响。
图5显示包含10种不同siRNA的脂质组合物对10种不同肝mRNA的影响。
图6显示在包含不同AF12的脂质体组合物中FVII的剂量依赖性反应。
图7显示含有ApoE和含有GalNAc3的脂质体组合物在ApoE敲除小鼠中的剂量反应。
图8显示不同量的AF12在WT(C57BI/6)和LDLRKO小鼠中的相关FVII蛋白水平。
图9a含有ApoE和GalNAc3的组合物中的不同量的AF12在ApoEKO小鼠中的相关FVII蛋白水平。
图9b为显示含有ApoE和GalNAc3的组合物中的不同量的AF12在野生型小鼠中的相关FVII蛋白水平的归一化图。
图10A到10C显示了与GAPDH表达(图10A)、VEFG受体2(VEGFR2)表达(图10B)以及Ve-钙粘着蛋白表达(图10C)相比，心脏中Tie2表达的降低(KD)。
图11A和11B显示用AF-012(图11A)而非AF-011(图11B)配制的siRNA在肝脏中的Tie2表达的降低。
图12A和12B显示用AF-012配制的siRNA在肝脏中的Tie2表达的降低(图12A)以及响应于用AF-012配制的Tie2siRNA的VEGFR2表达的激活(图12B)。
图13A和13B显示用AF-012配制的siRNA在肺中的Tie2表达的降低。将Tie2表达与VE-钙粘着蛋白表达(图13A)和VEGFR-2表达(图13B)相比较。
图14A和14B显示了当用AF-012而非用AF-011配制siRNA时，在肾脏(图14A)和骨骼肌(图14B)中的Tie2表达的降低。
图15显示了当用AF-012或AF-011配制siRNA时，Tie2siRNA在下丘脑中没有降低基因表达。
图16A和16B显示了Tie2表达分别在肝脏和骨骼肌中的剂量依赖性降低。
图17A和17B显示Tie2分别在脾脏和心脏中的剂量依赖性降低。
图18A和18B显示不同剂量下Tie2分别在肾脏和脂肪组织中的降低。
具体实施方式
本发明提供本文公开的脂质组合物，该脂质组合物适用于递送试剂(例如，基于核酸的试剂，如基于RNA的构建体)到细胞或受治疗者。该方法将含有基于RNA的构建体的脂质组合物施用于动物，且对目标基因的表达进行评估。
本发明提供组合物，其包含式(I)化合物、甾醇以及PEG或PEG修饰的脂质，
其中，
每个Xa和Xb对于每次出现各自独立地为C1-6亚烷基；n为0、1、2、3、4或5；
A对于每次出现为NR2或任选地被1-3个R取代的环状部分；
B是NR或任选地被1-2个R取代的环状部分；
每个R对于每次出现独立地为H、烷基、条件是至少一个R为
R1对于每次出现独立地为H、R3、
R2对于每次出现独立地为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代；
R3对于每次出现独立地为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基(例如，亲水性取代基)取代；
Y对于每次出现独立地为O、NR4或S；
R4对于每次出现独立地为H、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；H、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代。
在一个实施方案中，式(I)化合物包括至少2个氮原子。在一个实施方案中，式(I)化合物包括至少3个氮原子。
在一个实施方案中，n为1、2或3。
在一个实施方案中，至少一个A是环状部分。在一个实施方案中，至少一个A为含氮的环状部分。在一个实施方案中，至少一个A为哌啶基或哌啶部分。
在一个实施方案中，n为2且至少一个A是环状部分。
在一个实施方案中，至少一个B是环状部分。在一个实施方案中，至少一个B是含氮的环状部分。在一个实施方案中，至少一个B为哌啶基或哌啶部分。
在一个实施方案中，n为2且至少一个B是环状部分。
在一个实施方案中，Xa为C2或C3亚烷基。在一个实施方案中，Xb为C2或C3亚烷基。
在一个实施方案中，每个Xa和Xb为C2或C3亚烷基。在一个实施方案中，每个Xa和Xb为C2亚烷基。
在一个实施方案中，R为且至少出现3次。在一个实施方案中，n为2或3，R为且至少出现3次。在一个实施方案中，n为3，R为且出现5次。
在一个实施方案中，R为H，且至少出现1次(例如，1或2次)。
在一个实施方案中，Y为O或NR4。
在一个实施方案中，Y为O。在一个实施方案中，Y对于每次出现都为O。
在一个实施方案中，R1为H。在一个实施方案中，R1对于每次出现都为H。
在一个实施方案中，R1为其中，R3为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基，所述各基团任选地被一个或多个取代基(例如，亲水性取代基)取代；
在一个实施方案中，R1为其中，R3为任选地被一个或多个取代基(例如，亲水性取代基)取代的烷基；
在一个实施方案中，R3被-OH取代。
在一个实施方案中，R1为R3、 其中，R3为任选地被一个或多个取代基取代的烷基。
在一个实施方案中，R3被亲水基团所取代。在一个实施方案中，R3被-OH取代。
在一个实施方案中，R2为烷基、链烯基或炔基。在一个实施方案中，R2为烷基(例如，C6-C18烷基，例如，C8-C12烷基，例如，C10烷基)。
在一个实施方案中，R为且至少出现3次(例如，至少4或5次)。
在一个实施方案中，R2为烷基(例如，C6-C18烷基，例如，C8-C12烷基，例如，C10烷基)。
在一个实施方案中，所述组合物包括式(II)化合物、甾醇以及PEG或PEG修饰的脂质，
其中，
每个Xa和Xb对于每次出现各自独立地为C1-6亚烷基；n为0、1、2、3、4或5；
每个R独立地为H、烷基、条件是至少一个R为或者两个R与它们所连接的氮一起形成环；
R1对于每次出现独立地为R3、 其中，R3任选地被一个或多个取代基取代。
R2对于每次出现独立地为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代；
R3对于每次出现独立地为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代；
Y对于每次出现独立地为O、NR4或S；
R4对于每次出现独立地为H、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；H、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代。
在一个实施方案中，Xa为C2或C3亚烷基。在一个实施方案中，Xb为C2或C3亚烷基。
在一个实施方案中，每个Xa和Xb为C2或C3亚烷基。在一个实施方案中，每个Xa和Xb为C2亚烷基。
在一个实施方案中，n为2或3。
在一个实施方案中，n为3。
在一个实施方案中，R为且至少出现3次。在一个实施方案中，n为2或3，R为且至少出现3次。在一个实施方案中，n为3，R为且出现5次。
权利要求x所述的组合物，其中两个R与它们所连接的氮一起形成环。在一个实施方案中，与它们所连接的氮一起形成环的两个位于相邻的氮上。
在一个实施方案中，Y为O或NR4。在一个实施方案中，Y为O。在一个实施方案中，Y对于每次出现都为O。
在一个实施方案中，R1为H。在一个实施方案中，R1对于每次出现都为H。
在一个实施方案中，R1为其中R3为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基，所述各基团任选地被一个或多个取代基(例如，亲水性取代基)取代。在一个实施方案中，R1为且R3为任选地被一个或多个取代基(例如，亲水性取代基)取代的烷基。
在一个实施方案中，R3被-OH取代。
在一个实施方案中，R1为R3、 其中R3为任选地被一个或多个取代基取代的烷基。
在一个实施方案中，R3任选地被亲水性取代基取代。在一个实施方案中，R3被-OH取代。
在一个实施方案中，R2为烷基、链烯基或炔基。在一个实施方案中，R2为烷基(例如，C6-C18烷基，例如，C8-C12烷基，例如，C10烷基)。
在一个实施方案中，R为且至少出现3次(例如，至少4或5次)。
在一个实施方案中，R2为烷基(例如，C6-C18烷基，例如，C8-C12烷基，例如，C10烷基)。
在一个实施方案中，R2为H，且至少出现一次(例如，1或2次)。
在一个实施方案中，所述组合物含有式(III)化合物、式(VI)化合物或其混合物，
在一个实施方案中，R为且至少出现3次。在一个实施方案中，n为2或3，R为且至少出现3次。在一个实施方案中，n为3，且R为且出现5次。
在一个实施方案中，Y为O或NR4。在一个实施方案中，Y为O。在一个实施方案中，Y对于每次出现都为O。
在一个实施方案中，R1为H。在一个实施方案中，R1对于每次出现都为H。在一个实施方案中，R1为其中R3为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基，所述各基团任选地被一个或多个取代基(例如，亲水性取代基)取代。在一个实施方案中，R1为其中R3为任选地被一个或多个取代基(例如，亲水性取代基)取代的烷基。
在一个实施方案中，R3被-OH取代。
在一个实施方案中，R1为R3、 其中R3为任选地被一个或多个取代基取代的烷基。
在一个实施方案中，R3被亲水性取代基取代。在一个实施方案中，R3被-OH取代。
在一个实施方案中，R2为烷基、链烯基或炔基。在一个实施方案中，R2为烷基(例如，C6-C18烷基，例如，C8-C12烷基，例如，C10烷基)。
在一个实施方案中，R为且至少出现3次(例如，至少4或5次)。
在一个实施方案中，R2为烷基(例如，C6-C18烷基，例如，C8-C12烷基，例如，C10烷基)。在一个实施方案中，R2为烷基(例如，C6-C18烷基，例如，C8-C12烷基，例如，C10烷基)。
在一个实施方案中，R为H，且至少出现1次(例如，1或2次)。
在一个实施方案中，所述组合物包括式(V)化合物
在一个实施方案中，所述组合物包括式(VI)化合物
在一个实施方案中，所述组合物包括式(VII)化合物
在一个实施方案中，式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物为其无机或有机盐，例如，氢卤化物盐，如盐酸盐。在一个实施方案中，式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物为有机酸的盐，例如，醋酸盐或甲酸盐。在一个实施方案中，式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物为水合物形式。
在一个实施方案中，所述甾醇为胆固醇。在一个实施方案中，所述脂质为PEG修饰的脂质。在一个实施方案中，所述PEG修饰的脂质为PEG-DMG。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包括中性脂质。在一个实施方案中，所述中性脂质为DSPC。
在一个实施方案中，所述组合物包括约25-75％的式(I)化合物(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物)、约5-50％的甾醇以及约0.5-20％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个实施方案中，所述组合物进一步包括约0.5-15％的中性脂质。
在一个实施方案中，所述组合物包括约35-65％的式(I)化合物(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物)、约15-45％的甾醇以及约0.5-10％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包括约3-12％的中性脂质。
在一个实施方案中，所述组合物包括约45-65％的式(I)化合物(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物)、约25-40％的甾醇以及约0.5-5％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包括约5-10％的中性脂质。
在一个实施方案中，所述组合物包括约60％的式(I)化合物(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物)、约31％的甾醇以及约1.5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个实施方案中，所述组合物进一步包括约7.5％的中性脂质。
在一个实施方案中，所述组合物包括约57.5％的式(I)化合物(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物)、约7.5％的中性脂质、约31.5％的甾醇以及约3.5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，式(I)的阳离子脂质为式V化合物，所述中性脂质为DSPC，所述甾醇为胆固醇，且所述PEG脂质为PEG-DMG。
在一个实施方案中，所述组合物包括约50％的式(I)化合物(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物)、约10％的中性脂质、约38.5％的甾醇以及约1.5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，式(I)的阳离子脂质为式V的脂质，所述中性脂质为DSPC，所述甾醇为胆固醇，且所述PEG脂质为PEG-DMG。
在一个实施方案中，所述组合物包括约50％的式(I)化合物(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物)、约10％的中性脂质、约38.5％的甾醇以及约1.5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，式(I)的阳离子脂质为式V的脂质，所述中性脂质为DSPC，所述甾醇为胆固醇，且所述PEG脂质为PEG-DSG。
在一个实施方案中，所述组合物包括约50％的式(I)化合物(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物)、约10％的中性脂质、约38.5％的甾醇以及约1.5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，式(I)的阳离子脂质为式VI的脂质，所述中性脂质为DSPC，所述甾醇为胆固醇，且所述PEG脂质为PEG-DMG。
在一个实施方案中，所述组合物包括约50％的式(I)化合物(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)化合物)、约10％的中性脂质、约38.5％的甾醇以及约1.5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，式(I)的阳离子脂质为式VI的脂质，所述中性脂质为DSPC，所述甾醇为胆固醇，且所述PEG脂质为PEG-DSG。
在一个实施方案中，所述组合物为缔合络合物。在一个实施方案中，所述组合物为脂质体。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包括核酸试剂(例如，一种或多种核酸试剂)。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包括RNA试剂。在一个实施方案中，所述组合物进一步包括单链RNA试剂(例如，一种或多种单链RNA试剂)。在一个实施方案中，所述组合物进一步包括双链RNA试剂(例如，一种或多种双链RNA试剂)。
在一个实施方案中，所述脂质组合物可包括超过一个的siRNA。在一些实施方案中，所述脂质组合物可包括两种或更多种不同的siRNA。在一些实施方案中，所述脂质组合物可包括五种或更多种不同的siRNA。在一些实施方案中，所述组合物可包括十种或更多种不同的siRNA。在一些实施方案中，所述组合物可包括二十种或更多种不同的siRNA。
所述组合物包括式(III)或(VI)化合物或其混合物、甾醇以及PEG或PEG修饰的脂质，
其中，
每个R独立地为H，烷基，
R1对于每次出现独立地为H、R3、
R2对于每次出现独立地为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代；
R3对于每次出现独立地为烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基(例如，亲水性取代基)取代；
Y对于每次出现独立地为O、NR4或S；
R4对于每次出现独立地为H、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基；H、烷基、链烯基、炔基、杂烷基、杂链烯基或杂炔基中的每一个任选地被一个或多个取代基取代。
本发明描述了组合物的制备方法，所述方法包括挤压法或在线混合法。
在一个实施方案中，本发明的组合物包括25-75％的式(I)阳离子脂质(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)脂质)、0.5-15％的中性脂质、5-50％的甾醇以及0.5-20％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本发明的组合物包括35-65％的式(I)阳离子脂质(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)脂质)、15-45％的甾醇以及0.5-10％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本发明的组合物包括45-65％的式(I)阳离子脂质(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)脂质)、5-10％的中性脂质、25-40％的甾醇以及0.5-5％的PEG或PEG修饰的脂质。
在一个实施方案中，本发明的组合物包括约60％的式(I)阳离子脂质(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)脂质)、约7.5％的中性脂质、约31％的甾醇以及约1.5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，式(I)的阳离子脂质为式V化合物，所述中性脂质为DSPC，所述甾醇为胆固醇，所述PEG脂质为PEG-DMG。。
在一个实施方案中，本发明的组合物包括约57.5％的式(I)阳离子脂质(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)脂质)、约7.5％的中性脂质、约31.5％的甾醇以及约3.5％的PEG或PEG修饰的脂质。在一个优选实施方案中，式(I)的阳离子脂质为式V化合物，所述中性脂质为DSPC，所述甾醇为胆固醇，所述PEG脂质为PEG-DMG。
在一个实施方案中，脂质∶siRNA的比率为至少约0.5∶1、至少约1∶1、至少约2∶1、至少约3∶1、至少约4∶1、至少约5∶1、至少约6∶1、至少约7∶1、至少约811、至少约9∶1、至少约10∶1、至少约11∶1。在一个实施方案中，脂质∶siRNA的比率为约1∶1至约20∶1、约3∶1至约15∶1、约4∶1至约15∶1、约5∶1至约13∶1。在一个实施方案中，脂质∶siRNA的比率为约0.5∶1至约12∶1。
一方面，所述脂质组合物还包括靶向脂质。在一些实施方案中，所述靶向脂质包含GalNAc片段(例如，N-半乳糖胺片段)。例如，靶向脂质包含于2008年12月4日提交的USSN12/328669中公开的那些GalNAc片段，该文献通过引用整体并入本文。靶向脂质还可包含本领域已知的任何其它脂质(例如，靶向脂质)，例如，USSN12/328,669或国际专利公布No.WO2008/042973中描述的脂质，所述每个专利申请的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，所述靶向脂质包括多个GalNAc部分，例如，两个或三个GalNAc部分。在一些实施方案中，所述靶向脂质包含多个，例如两个或三个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分。在一些实施方案中，所述靶向脂质中的脂质为1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯(即DSG)。在一些实施方案中，所述靶向脂质包含PEG部分(例如，具有至少约500Da分子量的PEG部分，如具有约1000Da、1500Da、2000Da或更高分子量的PEG部分)，例如，所述靶向片段通过PEG片段连接到脂质上。
在一些实施方案中，所述靶向脂质包含叶酸盐部分。例如，包括叶酸盐部分的靶向脂质可包括2008年12月4日提交的USSN12/328669中公开的那些，该内容通过引用整体并入本文。在另一个实施方案中，包含叶酸盐部分片段的靶向脂质可包括式5化合物。
示例性的靶向脂质由下列的式L所示：
(靶向基团)n-L-脂质
式L
其中：
靶向基团是本领域已知的和/或本文描述的任何靶向基团(例如，细胞表面受体)；
n为1至5的整数(例如，3)，
L为连接基团；且
脂质为如本文所描述的脂质(例如，中性脂质如DSG)。
在一些实施方案中，所述连接基团包括PEG部分。在另一个实施方案中，所述PEG部分的大小可从约1,000道尔顿至约20,000道尔顿变化(例如，从约1,500道尔顿至约5,000道尔顿，如约1000道尔顿、约2000道尔顿、约3400道尔顿或约5000道尔顿)。
在一些实施方案中，所述靶向脂质为下面提供的式2、3、4、5、6或7的化合物：
式2
GalNAc3-PEG-DSG
式3
GalNAc3-PEG-DSG
(GalNAc)3-PEG-LCO
式4
叶酸盐-PEG-DSPE
1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸盐(聚乙二醇)-2000](铵盐)
式5
叶酸盐-PEG2000-DSG
式6
叶酸盐-PEG3400-DSG
式7
在一些实施方案中，所述靶向脂质以按摩尔计约0.001％至约5％(例如，约0.005％、0.15％、0.3％、0.5％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％或5％)的量存在于所述组合物中。在一些实施方案中，本文所述的组合物中包括所述靶向脂质。
在一些实施方案中，所述脂质组合物还含有抗氧化剂(例如，自由基捕获剂)。所述抗氧化剂例如以0.01％至约5％的量存在于所述组合物中。所述抗氧化剂可为疏水的或亲水的(例如，脂溶性或水溶性)。在一些实施方案中，所述抗氧化剂为酚类化合物，例如丁羟基甲苯、白藜芦醇、辅酶Q10或其它类黄酮，或维生素，例如维生素E或维生素C。其它示例性的抗氧化剂包括硫辛酸、尿酸、胡萝卜素(如β-胡萝卜素或视黄醇(维生素A))、谷胱甘肽、褪黑激素、硒以及泛醇。
在一些实施方案中，所述靶向脂质(例如，含有GalNAc的脂质)的受体为唾液酸糖蛋白受体(即，ASGPR)。
在一个实施方案中，本发明的组合物通过挤压法或在线混合法制备。
所述挤压法(也称作预成型法或分批法)是指首先制备空的脂质体(即，无核酸)，随后往该空的脂质体中加入核酸的方法。脂质体组合物通过小孔聚碳酸酯膜或不对称陶瓷膜挤压产生相对明确定义的尺寸分布。通常，将悬浮液通过膜进行循环一次或更多次，直到得到所需的脂质体复合物尺寸分布。将脂质体连续通过小孔膜挤压，以实现脂质体尺寸的逐渐减少。在某些情况下，可以不经任何尺寸调整而使用所形成的脂质-核酸组合物。这些方法公开于US5,008,050；US4,927,637；US4,737,323；BiochimBiophysActa.1979年10月19日；557(1)：9-23；BiochimBiophysActa.1980年10月2日；601(3)：559-7；BiochimBiophysActa.1986年6月13日；858(1)：161-8；和Biochim.Biophys.Acta1985812，55-65中，这些内容通过引用整体并入本文。
所述在线混合法是指将脂质和核酸二者平行加入到混合室中。所述混合室可为简单的T型连接器或本领域已知的任何其它混合室。这些方法公开于美国专利No.6,534,018和和US6,855,277；US公布2007/0042031和和PharmaceuticalsResearch，Vol.22，No.3，2005年3月，第362-372页中，这些内容通过引用整体并入本文。
可进一步理解的是，本发明的组合物可通过本领域普通技术人员已知的任何方法来制备。
在又一个实施方案中，通过挤压法或在线混合法制备的代表性化合物列于表1中，其中脂质T为
表1
在一个实施方案中，本发明的组合物被包埋至少60％、至少65％、至少75％、至少80％或至少90％。
在一个实施方案中，本发明的组合物进一步包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐，磷酸盐)。
在一个实施方案中，本发明的组合物进一步包括载脂蛋白(apolipoprotem)。如本文所用，术语“载脂蛋白”或“脂蛋白”指的是本领域技术人员已知的载脂蛋白及其变体和片段，以及下述的载脂蛋白激动剂或其类似物和片段。
适合的载脂蛋白包括但不限于ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V和ApoE，以及它们的活性多晶型物、同工型、变体和突变体及其片段或截短形式。在某些实施方案中，所述载脂蛋白为含巯基的载脂蛋白。“含巯基的载脂蛋白含巯基的载脂蛋白”指的是含有至少一个半胱氨酸残基的载脂蛋白、变体、片段或异形。最常见的含巯基的载脂蛋白为含有一个半胱氨酸残基的ApoA-IMilano(APOA-IM)和ApoA-IParis(ApoA-Ip)(Jia等人，2002，Biochem.Biophys.Res.Comm.297：206-13；Bielicki和Oda，2002，Biochemistry41：2089-96)。ApoA-II、ApoE2和ApoE3也都是含巯基的载脂蛋白。分离的ApoE和/或其活性片段和多肽类似物(包括其重组制备的形式)它们公开于美国专利No.5,672,685、5,525,472、5,473,039、5,182,364、5,177,189、5,168,045和5,116,739中，这些专利的公开内容通过引用并入本文。ApoE3公开于Weisgraber等人，“HumanEapoproteinheterogeneity：cysteine-arginineinterchangesintheaminoacidsequenceoftheapo-Eisoforms”，J.Biol.Chem.(1981)256：9077-9083；以及Rail等人，“StructuralbasisforreceptorbindingheterogeneityofapolipoproteinEfromtypeIIIhyperlipoproteinemicsubjects”，Proc.Nat.Acad.Sci.(1982)79：4696-4700。还可参见基因库(GenBank)登录号K00396。
在某些实施方案中，所述载脂蛋白可为它的成熟形式、载脂蛋白原前体(preproapolipoprotein)形式或载脂蛋白原(proapolipoprotein)形式。也可在本发明的范围之内使用ApoA-I原或ApoA-I成熟体(Duverger等人，1996，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.16(12)：1424-29)、ApoA-IMilano(Klon等人，2000，Biophys.J.79：(3)1679-87；Franceschini等人，1985，J.Biol.Chem.260：1632-35)、ApoA-IParis(Daum等人，1999，J.Mol.Med.77：614-22)、ApoA-II(Shelness等人，1985，J.Biol.Chem.260(14)：8637-46；Shelness等人，1984，J.Biol.Chem.259(15)：9929-35)、ApoA-IV(Duverger等人，1991，Euro.J.Biochem.201(2)：373-83)以及ApoE(McLean等人，1983，J.Biol.Chem.258(14)：8993-9000)的同二聚体或异二聚体(可行的话)。
在某些实施方案中，所述载脂蛋白可为载脂蛋白的片段、变体或同工型同工型。术语“片段”指的是任何具有比天然载脂蛋白氨基酸序列短的氨基酸序列的载脂蛋白，其片段保留了包括脂质结合特性在内的天然载脂蛋白活性。“变体”指的是载脂蛋白的氨基酸序列中的置换或改变，所述置换或改变(例如，添加或缺失氨基酸残基)并没有破坏包括脂质结合特性在内的天然载脂蛋白活性。因此，变体可以包括具有与本文提供的天然载脂蛋白大体相同的氨基酸序列的蛋白或肽，其中一个或多个氨基酸残基被化学上类似的氨基酸保守置换。保守置换的实例包括至少一种疏水性残基(诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)置换另一疏水性残基。同样地，本发明设想，例如至少一种亲水性残基的置换，诸如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、甘氨酸与丝氨酸之间的置换(参见美国专利No.6,004,925，6,037,323和6,046,166)。术语″同工型″指的是具有相同、更多或部分功能以及相似、相同或部分序列的蛋白，并且可能是或可能不是相同基因的产物并且通常是组织特异性的(参见Weisgraber1990，J.LipidRes.31(8)：1503-11；Hixson和Powers1991，J.LipidRes.32(9)：1529-35；Lackner等人，1985，J.Biol.Chem.260(2)：703-6；Hoeg等人，1986，J.Biol.Chem.261(9)：3911-4；Gordon等人，1986，J.Biol.Chem.259(1)：468-74；Powell等人，1987，Cell50(6)：831-40；Aviram等人，1998，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.18(10)：1617-24；Aviram等人，1998，J.Clin.Invest.101(8)：1581-90；Billecke等人，2000，DrugMetab.Dispos.28(11)：1335-42；Draganov等人，2000，J.Biol.Chem.275(43)：33435-42；Steinmetz和UtermannJ.Biol.Chem.260(4)：2258-64；Widler等人，1980，J.Biol.Chem.255(21)：10464-71；Dyer等人，1995，J.LipidRes.36(1)：80-8；Sacre等人，2003，FEBSLett.540(1-3)：181-7；Weers等人，2003，Biophys.Chem.100(1-3)：481-92；Gong等人，2002，J.Biol.Chem.277(33)：29919-26；Ohta等人，1984，J.Biol.Chem.259(23)：14888-93和U.S.Pat.No.6,372,886)。
在某些具体实施方案中，本发明的方法和组合物包括载脂蛋白的嵌合构建的应用。例如，载脂蛋白的嵌合构建可由具有与含有缺血再灌注保护性能的载脂蛋白域相关的高脂质结合特性的载脂蛋白域组成。载脂蛋白的嵌合构建可为包括在载脂蛋白内的分开区域的构建(例如，同源构建)，或者，嵌合构建可为包括不同载脂蛋白之间的分开区域的构建(例如，异源构建)。包括嵌合构建的组合物还可以包括载脂蛋白变体的区段或旨在具有特异性(例如，脂质结合性、受体结合性、酶性质、酶活化性质、抗氧化性或氧化-还原性)的片段(参见Weisgraber1990，J.LipidRes.31(8)：1503-11；Hixson和Powers1991，J.LipidRes.32(9)：1529-35；Lackner等人，1985，J.Biol.Chem.260(2)：703-6；Hoeg等人，1986，J.Biol.Chem.261(9)：3911-4；Gordon等人，1984，J.Biol.Chem.259(1)：468-74；Powell等人，1987，Cell50(6)：831-40；Aviram等人，1998，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.18(10)：1617-24；Aviram等人，1998，J.Clin.Invest.101(8)：1581-90；Billecke等人，2000，DrugMetab.Dispos.28(11)：1335-42；Draganov等人，2000，J.Biol.Chem.275(43)：33435-42；Steinmetz和Utermann1985，J.Biol.Chem.260(4)：2258-64；Widler等人，1980，J.Biol.Chem.255(21)：10464-71；Dyer等人，1995，J.LipidRes.36(1)：80-8；Sorenson等人，1999，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.19(9)：2214-25；Palgunachari1996，Arterioscler.Throb.Vase.Biol.16(2)：328-38：Thurberg等人，J.Biol.Chem.271(11)：6062-70；Dyer1991，J.Biol.Chem.266(23)：150009-15；Hill1998，J.Biol.Chem.273(47)：30979-84)。
本发明所用的载脂蛋白还包括重组的、合成的、半合成的或纯化的载脂蛋白。本发明所用的载脂蛋白或其等价形式的制备方法在本领域众所周知。例如，载脂蛋白可通过诸如密度梯度离心法或免疫亲和层析法从血浆或天然产物中分离，或者用合成方法、半合成方法或用本领域所熟知的重组DNA技术制备(参见，例如，Mulugeta等人，1998，J.Chromatogr.798(1-2)：83-90；Chung等人，1980，J.LipidRes.21(3)：284-91；Cheung等人，1987，J.LipidRes.28(8)：913-29；Persson，等人，1998，J.Chromatogr.711：97-109；U.S.Pat.No.5,059,528、5,834,596、5,876,968和5,721,114；和PCT公布WO86/04920和WO87/02062)。
本发明所用载脂蛋白进一步包括载脂蛋白激动剂，例如，能模拟ApoA-I、ApoA-IMilano(ApoA-IM)、ApoA-IParis(ApoA-IP)、ApoA-II，ApoA-IV以及ApoE的活性的肽和肽类似物。例如，所述载脂蛋白可为美国专利No.6,004,925、6,037,323、6,046,166以及5,840,688中所述的任何载脂蛋白，所述每个专利的内容通过引用整体并入本文。
载脂蛋白激动剂肽和肽类似物可用本领域已知的任何用于肽合成的技术来合成或制备，例如，在美国专利No.6,004,925、6,037,323和6,046,166中描述的技术。例如，所述肽可用最初由Merrifield描述的固相合成技术(1963，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)制备。其它的肽合成技术可参见Bodanszky等人的PeptideSynthesis，JohnWiley&Sons，第2版(1976)，以及本领域技术人员可轻易获得的其它参考文献。多肽合成技术的概述可参见Stuart和Young，SolidPhasePeptide.Synthesis，PierceChemicalCompany，Rockford，Ill.(1984)。肽还可以用TheProteins，Vol.II，第3版，Neurath等人，编辑，第105-237页，AcademicPress，NewYork，N.Y.(1976)中所述的溶液方法来合成。适用于不同的肽合成的保护基描述于上述文本以及McOmie，ProtectiveGroupsinOrganicChemistry，PlenumPress，NewYork，N.Y.(1973)。本发明的肽也可通过从例如载脂蛋白A-I的较大部分中化学或酶切割来制备。
在某些实施方案中，所述载脂蛋白可为载脂蛋白的混合物。在一个实施方案中，所述载脂蛋白可为均质混合物，即单一型载脂蛋白。在另一个实施方案中，所述载脂蛋白可为载脂蛋白的非均质混合物，即两种或更多种载脂蛋白的混合物。载脂蛋白的非均质混合物的实例可包括，例如，来自动物源的载脂蛋白和来自半合成源的载脂蛋白的混合物。在某些实施方案中，载脂蛋白的非均质混合物可包括，例如，ApoA-I和ApoA-IMilano的混合物。在某些实施方案中，载脂蛋白的非均质混合物可包括，例如，ApoA-IMilano和ApoA-IParis的混合物。适用于本发明的方法和组合物的混合物对于本领域技术人员来说是显而易见的。
如果载脂蛋白来自自然源，那么该载脂蛋白可从植物或动物源获得。如果载脂蛋白获自动物源，那么所述载脂蛋白可来自任何物种。在某些实施方案中，所述载脂蛋白可从动物源获得。在某些实施方案中，所述载脂蛋白可从人源得到。在本发明的优选的实施方案中，所述载脂蛋白源自于与被施用载脂蛋白的个体同样的物种。
在一个实施方案中，所述靶向基因为在肝脏中表达的基因，例如，凝血因子VII(FVII)基因。在其它实施方案中，所述靶向基因为在内皮(例如，在心脏、肝脏、肺、肾脏、下丘脑或骨骼肌中)中的表达。所述靶向基因(例如，FVII)表达的效果通过测定生物样品(例如，血清或组织样品)中的FVII水平来评估。例如，可测定血液中的FVII水平，例如通过检测FVII活性来测量。在一个实施方案中，可评估肝脏或内皮中的mRNA水平。在另一个优选实施方案中，可进行至少两种类型的评估，例如，蛋白水平(例如，在血液中)的评估和mRNA水平(例如，在肝脏中)的测定都进行。
在一个实施方案中，试剂为核酸，例如，双链RNA(dsRNA)。
在另一个实施方案中，所述核酸剂为单链DNA或RNA，或者双链DNA或RNA，或者DNA-RNA杂交体。例如，双链DNA可为结构基因，包括控制区和终止区的基因，或者诸如病毒或质粒DNA的自我复制系统。双链DNA可为，例如，dsRNA或另一种RNA干扰剂。单链核酸可为，例如，反义寡核苷酸、核酶、微RNA或者三链形成寡核苷酸。
在另一个实施方案中，在施用候选试剂后的不同时间点，自测试主体采集生物样品(如流体样品，如血液、血浆或血清)或组织样品(例如肝脏或内皮，如源自于心脏、肾脏、肺、下丘脑或骨骼肌)，然后测试所述试剂对靶向蛋白或mRNA表达水平的效果。在一个特别优选的实施方案中，所述候选试剂为靶向FVII的dsRNA，以及测试所述生物样品对因子VII蛋白或mRNA水平的效果。在一个实施方案中，通过诸如免疫组织化学测定法或显色测定法来测定FVII蛋白的血浆水平。在另一个实施方案中，通过诸如支链DNA测定法、RNA印迹法或RT-PCR测定法来测定肝脏或内皮(例如，在心脏、肝脏、肺、肾脏、下丘脑或骨骼肌中)中FVIImRNA的水平。
在一个实施方案中，评价所述试剂(例如，包括所述脂质组合物的组合物)的毒性。在另一个实施方案中，可以监控模型主体的身体作用，例如重量或笼边行为(cagesidebehavior)的变化。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述试剂(例如，包括所述脂质组合物的组合物)做进一步评估。所述进一步评估可包括，例如，(i)重复上述的评估，(ii)在不同数量的动物或不同剂量的情况下重复上述的评估，或者(iii)通过不同的方法如用另一种动物模型(如非人类灵长类动物)进行评估。
在另一个实施方案中，作出关于是否在进一步研究(例如临床试验)中包括所述试剂和所述脂质组合物的决定，取决于所观察的候选试剂对肝脏蛋白或mRNA水平或内皮的作用。例如，如果观察到候选的dsRNA使蛋白或mRNA水平至少降低20％、30％、40％、50％或更多，那么就可以考虑将所述的试剂用于临床试验中。
在另一个实施方案中，作出关于是否在药物组合物中包括所述试剂和所述脂质组合物的决定，取决于所观察的候选试剂和氨基脂质对肝脏蛋白或mRNA水平或内皮的作用。例如，如果观察到候选的dsRNA使蛋白或mRNA水平至少降低20％、30％、40％、50％或更多，那么就可以考虑将所述的试剂用于临床试验中。
在另一方面，本发明的特征在于一种评估所述脂质组合物对递送基于RNA的构建体(例如，靶向FVII的dsRNA)的适用性的方法。所述方法包括提供一种组合物，该组合物包括靶向FVII的dsRNA和候选的氨基脂质，将所述组合物施用于啮齿动物(例如，小鼠)，评估作为具有在血液中的FVII水平和在肝脏中的FVIImRNA水平的函数的FVII的表达，从而评估所述的候选氨基脂质。
包括含有脂质组分的组合物(例如，脂质体)以及这些脂质组分在下文作更详细描述。示例性的基于核酸的试剂包括dsRNAs、反义寡核苷酸、核糖核酸酶、微RNA、免疫刺激性寡核苷酸或者三链形成寡核苷酸。这些试剂在下文也会作更详细描述。
被称作″LNP″组合物的组合物(例如，LNP01、LNP02等)也被称为″AF″组合物(例如，AF01、AF02等)。
″烷基″是指含有1至24个碳原子的直链或支链的、非环状或环状的、饱和的脂肪族烃。代表性的饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基及类似基团；而饱和的支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基及类似基团。代表性的饱和环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基及类似基团；而不饱和的支链烷基包括环戊烯基和环己烯基及类似基团。
″链烯基″是指在相邻碳原子之间含有至少一个双键的如上定义的烷基。链烯基包括顺式和反式异构体二者。代表性的直链和支链的链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基及类似基团。
″炔基″是指在相邻的碳原子之间另外含有至少一个三键的如上定义的烷基或链烯基。代表性的直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基及类似基团。
″酰基″是指连接点上的碳原子被如下定义的氧代基团所取代的任何烷基、链烯基或炔基。例如，C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基和-C(＝O)炔基都是酰基。
″杂环″指的是5至7元的单环杂环，或者7至10元的二环杂环，所述杂环或者是饱和的、不饱和的，或者是芳族的，且含有1至2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子，其中所述氮和硫杂原子可任选地被氧化，所述氮杂原子可任选地被季铵化，所述杂环包括二环，其中任何上述杂环可与苯环稠合。所述杂环可通过任何杂原子或碳原子连接。杂环化合物包括如下定义的杂芳基。杂环化合物包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、氧杂环丁烷基、环氧丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基及类似基团。
术语″任选地取代的烷基″、″任选地取代的链烯基″、″任选地取代的炔基″、″任选地取代的酰基″以及″任选地取代的烷基″是指当取代时，至少一个H被取代基替换。在氧代取代基(＝O)的情况下，两个H被替换。就这一点而言，取代基包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx以及-SOnNRxRy，其中n为0、1或2，Rx和Ry是相同或不同并且独立地为卤素、烷基或杂环，并且每个所述的烷基和杂环取代基可进一步地被一个或多个氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy所取代。
″卤素″指的是氟、氯、溴和碘。
在一些实施方案中，本发明的方法可要求使用保护基。保护基方法学是本领域技术人员熟知的(参见例如PROTECTIVEGROUPSINORGANICSYNTHESIS，Green，T.W.等人，Wiley-Interscience，NewYorkCity，1999)。简言之，本发明中的保护基为减少或消除官能团的不期望的反应性的任何基团。可将保护基加至官能团以掩盖它在某些反应过程中的反应性，然后将其除去以暴露最初的官能团。在一些实施方案中，使用了″乙醇保护基″。″乙醇保护基″为减少或消除乙醇官能团的不期望的反应性的任何基团。可以使用本领域中熟知的技术来添加和除去保护基。
合成
本发明的化合物由已知的有机合成技术制备。通常，式(I)、(II)、(III)、)(IV和(V)的脂质可通过将胺化合物与各种的环氧化物反应来制备。在一个例子中，式(V)和(VI)的脂质可通过下列的反应方案1制得，其中，除非另有说明，所有取代基如上所定义。
方案1
根据WO/9318017中所述的程序合成化合物1和2。
将1和环氧化物3在高温下反应生成化合物4，再用标准硅胶柱层析法进行纯化。同样地，化合物5由胺2得到。
根据方案1适用于形成氨基脂质的其它的环氧化物和胺描述于Love，K.T.等，″Lipid-likematerialsforlow-dose，invivogenesilencing″，PNASEarlyEdition，www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0910603106，这些内容通过引用整体并入本文。
一些可使用的示例性环氧化物包括：
一些可使用的示例性胺包括：
式(V)化合物
可由以下两个前体制备：
例如，式(V)化合物可由外消旋体3制备。在这种情况下，所述初产物可包括非对映体的混合物，该非对映体的混合物可任选地被进一步纯化。
根据式(V)，化合物(R)-6为立体控制性化合物：
根据方案1，化合物(R)-6可由以下两个前体制备：
相应的(S)-6化合物可由化合物1和化合物(S)-7(即化合物(R)-7的对映体)制备。
化合物1的结构异构体还可用于制备氨基脂质。这样的结构异构体包括：
式(VI)化合物
可由以下两个前体制备，
式(VII)的化合物
可由以下两个前体制备，
大体上立体纯的环氧化物可用于提供立体控制性氨基脂质。
方案2
胺2和胺8可按照反应方案2来制备。这两种化合物都可由常见原料(4-(叔丁氧羰基)-1-(2-(苯二甲酰亚氨基)乙基)-哌嗪)制备。
根据方案2制备克数量级的化合物2和化合物8。
可根据方案3由1-(2-氨基乙基)哌嗪开始制备胺1。
方案3
或者，方案4阐述通过1-(2-(苯二甲酰亚氨基)乙基)哌嗪制备化合物1。
方案4
按克数量级规模量化方案4的方法来产生化合物1。最后步骤可选地使用碱(例如KOH)来取代酸(例如HCl)。所述反应在碱性条件下可能会更为快速地进行。
在另一个变型中，化合物1可通过类似方案3的方式制备，但是使用不同的还原条件，如方案5中所示。
方案5
有利的是，方案5的方法比方案3或方案4的方法更容易量化；所述反应条件非常温和，只需要催化量(10mol％)的氯化镍(II)，并且所得产物的分离和纯化都很简单。量化该方法生产克数量级规模的化合物1。
可分解环氧化物3(n＝9)以提供期望的高对映体过量的光学异构体(例如化合物(R)-7)。例如，可通过方案6中描述的Jacobsen催化剂来拆分化合物3(n＝9)。
方案6
按多克数量级(例如，300克)规模进行反应。
氨基脂质(R)-6可通过化合物1和化合物(R)-7按克数量(例如，＞16g)级规模制备得到。所述反应产物进一步通过柱层析法来纯化；所生成的物质当通过TLC测定时明显是纯的。然而，也存在一些副产物。在环氧化物环在多位阻的碳原子处开环、由此生成伯醇的反应中产生所述副产物(参见方案7)。
方案7
通过用固相载体(solid-support)三苯甲基氯试剂(方案8)处理，可从所述主要产物基本上分离出副产物，所述试剂可选择性地与伯醇反应(并且因此固定)。
方案8
另一个生成立体选择氨基脂质的方法可涉及立体纯的α-羟基醛，所述α-羟基醛可用于取代环氧化物与胺类(例如化合物1)反应。当使用α-羟基醛时，与胺类(例如化合物1)的反应是在还原条件下进行的。方案9阐述由α-烯烃开始的受保护的α-羟基醛10的立体控制性合成。
方案9
方案10描述了由(R)-缩水甘油开始的合成受保护的α-羟基醛11的替代路线。
方案10
为了制备立体控制的氨基脂质例如化合物(R)-6，在还原剂(例如，乙酸中的Na(OAc)3BH)存在下，将胺1和受保护的α-羟基醛反应，所述α-羟基醛具有所需的立体化学性。
本发明中的所述氨基脂质为阳离子脂质。如本文所用，术语″氨基脂质″是指包括具有一个或两个脂肪酸链或脂肪烷基链以及氨基头基(包括烷基氨基或二烷基氨基)的脂质，所述脂质可在生理pH下质子化以形成阳离子脂质。
其它氨基脂质可包括具有替代性脂肪酸基团和其它二烷基氨基的那些氨基脂质，包括其中烷基取代基不同(例如，N-乙基-N-甲基氨基-，N-丙基-N-乙基氨基-等)的那些氨基脂质。在其中R11和R12都是长链烷基或酰基的实施方案中，R11和R12可相同或不同。通常，具有较少的饱和酰基链的氨基脂质更容易被分级，特别是当为了过滤灭菌必须对低于约0.3微米的复合物进行分级时。优选含有碳链长度为C14至C22的不饱和脂肪酸的氨基脂质。其它支架也可用来分离氨基脂质的的氨基和脂肪酸或脂肪烷基部分。合适的支架为本领域技术人员所熟知。
在某些实施方案中，本发明的氨基脂质或阳离子脂质具有至少一个可质子化的基团或可脱质子化的基团，以使脂质在pH或低于生理pH(例如pH7.4)下带正电，并且在第二pH下(优选在生理pH或高于生理pH下)为中性。当然，应理解作为pH函数的质子的增加或除去是一个平衡过程，并且对带电的或中性的脂质的提及指的是优势种类的性质，并不需要所有的脂质都以带电的或中性的形式存在。本发明使用的脂质不排除具有一个以上的可质子化或可脱质子化的基团的脂质，或者具有两性的脂质。
在某些实施方案中，根据本发明的可质子化的脂质具有可质子化基团的pKa，该pKa的范围为约4至约11。最优选的是约4至约7的pKa，因为这些脂质在较低的pH配制阶段时为阳离子的，然而，在生理pH约为pH7.4下颗粒将在很大程度上(尽管并非完全地)被表面中和。所述pKa的益处之一在于至少一些与颗粒外表面缔合的核酸将于生理pH下丧失它的静电作用，并且可用简单的透析除去；因此，大大降低了所述颗粒对清除的敏感性。
脂质颗粒
用于在肝脏和内皮中(例如，在心脏、肝脏、肺、肾脏、下丘脑和骨骼肌中)(本文为筛选模型)测试的试剂和/或氨基脂质可在脂质颗粒中配制。脂质颗粒包括但不限于脂质体。如本文所用，脂质体是具有包封水性内部的含脂质膜的结构。脂质体可具有一种或多种脂质膜。本发明既包括被称作单室的单层脂质体，又包括被称作多室的多层脂质体。当与核酸复合时，脂质颗粒还可以是脂质体复合物，其由夹在DNA层之间的阳离子脂质双层组成，如在例如Feigner，ScientificAmerican中所描述的。
脂质颗粒可进一步包括一种或多种另外的脂质和/或其它组分例如胆固醇。出于多种目的，为了多种目的(例如为了防止脂质氧化或将配体连接至脂质体表面上)可在所述脂质体组合物中包括其它脂质。可存在许多脂质中的任一种，该脂质包括两亲性、中性、阳离子和阴离子脂质。这些脂质可单独或混合使用。可能存在的另外的脂质组分的具体实例描述如下。
可能存在于脂质颗粒中的另外组分包括双层稳定组分，例如聚酰胺寡聚物(参见例如，美国专利No.6,320,017)、肽、蛋白、去污剂、脂质衍生物(如偶联至磷脂酰乙醇胺的PEG以及缀合至神经酰胺的PEG(参见美国专利No.5,885,613))。
脂质颗粒可包括一种或多种第二氨基脂质或阳离子脂质、中性脂质、甾醇以及被选择来减少形成过程中脂质颗粒聚集的脂质，该脂质可由颗粒的立体稳定化产生，所述立体稳定化防止形成过程中电荷诱导的聚集。
适用于缀合到用在肝脏或内皮(例如，心脏、肝脏、肺、肾脏、下丘脑或骨骼肌)筛选模型中的核酸试剂的脂质实例为聚乙二醇(PEG)修饰的脂质、单唾液酸神经节苷酯Gm1和聚酰胺寡聚物(″PAO″)(例如，描述于美国专利No.6,320,017中)。防止形成过程中聚集的具有不带电的、亲水的、立体障碍部分的其它化合物(例如PEG、Gm1或ATTA)还可被偶联至如本发明的方法和组合物中使用的脂质。ATTA-脂质描述于例如美国专利No.6,320,017中，而PEG-脂质缀合物描述于例如美国专利No.5,820,873、5,534,499和5,885,613中。通常，被选择来减少聚集的脂质组分的浓度为约1％至15％(按脂质的摩尔百分比计)。
在本发明中采用的PEG修饰的脂质(或脂质-聚氧乙烯缀合物)的具体实例可具有多种“锚定”脂质部分以便将PEG部分固定在脂质囊泡的表面。适合的PEG修饰的脂质的实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、在共同待审的USSN08/486,214(其通过引用并入本文)中所述的PEG-神经酰胺缀合物(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1，2-二酰氧基丙-3-胺。特别优选的是PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。
在空间上巨大的部分(例如PEG或ATTA)被缀合至脂质锚的实施方案中，脂质锚的选择取决于缀合物与脂质颗粒具有何种类型的缔合。众所周知，mePEG(mw2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)将保持与脂质体缔合，直到颗粒从循环中清除，这可能得几天。其它缀合物(例如PEG-CerC20)具有相似的保持能力。然而，在一些测定中，PEG-CerC14经与血清接触后快速地以少于60min的T1/2交换出制剂。这正如美国专利申请SN08/486,214中所示，至少三个特征影响交换效率：酰基链的长度、酰基链的饱和度以及立体障碍头基的大小。具有这些特征的适当改变的化合物对于本发明可能是有用的。对于一些治疗应用，有利的是，PEG修饰的脂质快速地从体内的核酸-脂质颗粒中丢失，因此，PEG修饰的脂质将具有相对短的脂质锚。在其它的治疗应用中，有利的是，核酸-脂质颗粒展现出较长的血浆循环寿命，因此，PEG修饰的脂质将具有相对较长的脂质锚。示例性脂质锚包括具有长度为约C14至约C22、优选约C14至约C16的那些脂质。在一些实施方案中，PEG部分(例如mPEG-NH2)的大小为约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿。
应该注意的是，防止聚集的化合物并非必需脂质缀合来适当地起作用。溶液中游离的PEG或游离的ATTA可足以防止聚集。如果在配制后颗粒是稳定的，可在施用于受治疗者之前将PEG或ATTA透析除去。
当存在于脂质颗粒中时，中性脂质可以是在生理pH下以不带电的或中性的两性离子形式存在的许多脂质种类中的任一种。这些脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷酯。用于本文所述颗粒中的中性脂质一般通过考虑例如脂质体尺寸和血流中脂质体的稳定性来选择。优选地，所述中性脂质组分为具有两个酰基的脂质(即二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。具有不同链长度和饱和度的多种酰基链基团的脂质是可得的，或者可通过熟知的技术分离或合成。在一组实施方案中，优选的是含有碳链长度为C14至C22范围的饱和脂肪酸的脂质。在另一组实施方案中，使用含有碳链长度为C14至C22范围的单不饱和或双不饱和脂肪酸的脂质。另外，可使用具有饱和的和不饱和的脂肪酸链的混合物的脂质。优选地，用于本发明的中性脂质可为DOPE、DSPC、POPC或任何相关的磷脂酰胆碱。在本发明中有用的中性脂质还可以由具有其它头基(例如丝氨酸和肌醇)的鞘磷脂、二氢鞘磷脂或磷脂组成。
当存在时，脂质混合物的甾醇组分可以是常规用于脂质体、脂质囊泡或脂质颗粒制备领域中的那些甾醇中的任一种。优选的甾醇是胆固醇。
除了上面具体描述的阳离子脂质以外，本发明的脂质颗粒还可包括其它的阳离子脂质，该阳离子脂质在大约生理pH下带有净正电荷。这些阳离子脂质包括但不限于N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(″DODAC″)；N-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N，N-三乙基氯化铵(DOTMA)；N，N-二硬脂酰基-N，N-二甲基溴化铵(″DDAB″)；N-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(″DOTAP″)；1，2-二油基氧基-3-氯化三甲基丙基铵盐(″DOTAP.Cl″)；3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(″DC-Chol″)，
N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(″DOSPA″)，双十八烷基酰胺基甘氨酰基羧基精胺(″DOGS″)，1，2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(″DOPE″)，1，2-二油酰基-3-二甲基丙烷铵(″DODAP″)，N，N-二甲基-2，3-二油基氧基)丙胺(″DODMA″)和N-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(″DMRIE″)。另外，可使用阳离子脂质的多个商品化制剂，例如LIPOFECTIN(包括DOTMA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)以及LIPOFECTAMINE(包括DOSPA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)。在具体的实施方案中，阳离子脂质是氨基脂质。
适用于本发明脂质颗粒的阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷基酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油以及连接至中性脂质的其它阴离子修饰基团。
在很多实施方案中，本发明的脂质颗粒包括两亲性脂质。″两亲性脂质″指的是任何适合的物质，其中脂质物质的疏水部分指向疏水相，而亲水部分指向水相。这些化合物包括但不限于磷脂、氨脂质和鞘脂。代表性的磷脂包括鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二亚油酰基磷脂酰胆碱。还可使用其它缺乏磷的化合物例如鞘脂、糖鞘脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸。另外，这些两亲性脂质容易与其它脂质(例如甘油三酯和甾醇)混合。
还适合于包括在本发明的脂质颗粒中的是程序可控的融合脂质。这类脂质颗粒几乎不具有与细胞膜融合的倾向并且直到发生给定的信号事件才递送它们的有效负载。这允许脂质颗粒在注射进生物体或疾病部位之后且在与细胞开始融合之前更均匀地分布。所述的信号事件可以是例如pH、温度、离子环境或时间的改变。在后一种情况下，延迟或“掩藏(cloaking)”融合的组分(例如ATTA-脂质缀合物或PEG-脂质缀合物)可随时间的推移而简单地从脂质颗粒膜中交换出。示例性脂质锚包括长度为约C14至约C22、优选约C14至约C16的那些脂质锚。在一些实施方案中，PEG部分(例如mPEG-NH2)的大小为约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿。
在所述脂质颗粒适当地分布于体内之前，它已经失去足够的掩藏剂以便融合。考虑到其它信号事件，期望选择与疾病部位或靶细胞相关的信号，例如在炎症部位处温度的升高。
缔合至核酸试剂的脂质颗粒还可包括靶向部分，例如，对细胞类型或组织有特异性的靶向部分。以往(参见，例如，美国专利No.4,957,773和4,603,044)曾有描述用多种靶向部分(例如配体、细胞表面受体、糖蛋白、维生素(例如维生素B2)和单克隆抗体)靶向脂质颗粒。所述靶向部分包括整个蛋白或其片段。靶向机制通常需要靶向剂，所述靶向剂通过置于所述脂质颗粒的表面上的这种方式使得所述靶向部分可与所述靶(例如细胞表面受体)相互作用。多种不同的靶向剂和方法在本领域是已知且可用的，包括描述于例如Sapra，P.和Allen，TM，Prog.LipidRes.42(5)：439-62(2003)；和Abra，RM等人，J.LiposomeRes.12：1-3，(2002)中的那些。
具有亲水聚合物链(例如聚乙二醇(PEG)链)的表面包被的脂质颗粒(即脂质体)用于靶向的应用已被提出(Allen等人，BiochimicaetBiophysicaActa1237：99-108(1995)；DeFrees等人，JournaloftheAmericanChemistrySociety118：6101-6104(1996)；Blume等人，BiochimicaetBiophysicaActa1149：180-184(1993)；Klibanov等人，JournalofLiposomeResearch2：321-334(1992)；美国专利No.5,013556；Zalipsky，BioconjugateChemistry4：296-299(1993)；Zalipsky，FEBSLetters353：71-74(1994)；Zalipsky，StealthLiposomes第9章(Lasic和Martin编辑)CRCPress，BocaRatonFl(1995)。一种方法是，用于靶向所述脂质颗粒的配体(例如抗体)连接至形成脂质颗粒的脂质的极性头基。另一种方法是，所述靶向配体连接至所述PEG链的末端以形成所述亲水性聚合物包被(Klibanov等人，JournalofLiposomeResearch2：321-334(1992)；Kirpotin等人，FEBSLetters388：115-118(1996))。
可使用偶合所述靶向剂的标准方法。例如，可使用通过附着于靶向剂而具有活性的磷脂酰乙醇胺，或者衍生的亲脂性化合物(例如脂质衍生的博来霉素)。抗体靶向的脂质体可使用例如结合蛋白A的脂质体进行构建(参见Renneisen等人，J.Bio.Chem.，265：16337-16342(1990)和Leonetti等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，87：2448-2451(1990))。其它的抗体缀合的实例公开于美国专利No.6,027,726，其内容通过引用并入本文。靶向部分的实例还可包括对细胞组分有特异性的其它蛋白，包括与瘤或肿瘤有关的抗原。用作靶向部分的蛋白可通过共价键附着在脂质体上(参见，Heath，CovalentAttachmentofProteinstoLiposomes，149MethodsinEnzymology111-119(AcademicPress，Inc.1987))。其它靶向方法包括生物素-抗生物素系统。
治疗剂-脂质颗粒组合物和制剂
本发明包括含有本发明脂质颗粒和活性剂的组合物，其中所述活性剂与所述脂质颗粒缔合。在具体的实施方案中，所述活性剂是治疗剂。在具体的实施方案中，所述活性剂封装于脂质颗粒的水性内部。在其它实施方案中，所述活性剂存在于脂质颗粒的一个或多个脂质层中。在其它实施方案中，所述活性剂被连接至脂质颗粒的外部或内部脂质表面上。
本文所用的″完全封装的″表明颗粒中的核酸在暴露于血清或核酸酶测定之后未被显著降解，所述血清或核酸酶测定可显著地降解游离DNA。在完全封装的系统中，在通常将降解100％游离核酸的治疗中降解了优选少于25％的颗粒核酸，更优选降解了少于10％且最优选少于5％的颗粒核酸。可选地，可通过Oligreen测定来确定完全封装。Oligreen是用于定量溶液中的寡核苷酸和单链DNA的超灵敏荧光核酸染色(可得自InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)。完全封装的还表示颗粒是血清稳定的，也就是说它们经体内施用后并不迅速地分解为它们的组成部分。
本文所用的活性剂包括能对细胞、组织、器官或受治疗者施加期望作用的任何分子或化合物。这类作用可以是例如生物的、生理的或美容的。活性剂可以是任何类型的分子或化合物，包括例如核酸、肽和多肽，所述多肽包括例如抗体诸如多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段；人源化抗体、重组抗体、重组人类抗体和PrimatizedTM抗体、细胞因子、生长因子、凋亡因子、分化诱导因子、细胞表面受体和它们的配体；激素；以及小分子(包括小有机分子或化合物)。
在一个实施方案中，所述活性剂是治疗剂或其盐或其衍生物。治疗剂衍生物自身可以具有治疗活性，或者它们经进一步修饰后变得有活性的前体药物。因此，在一个实施方案中，治疗剂衍生物与未修饰的试剂相比保留一些或所有的治疗活性，而在另一个实施方案中，治疗剂衍生物缺乏治疗活性。
在各种实施方案中，治疗剂包括任何有效治疗试剂或药物，例如抗炎症化合物、抗抑郁剂、刺激剂、镇痛药、抗生素、避孕药物、退热剂、血管舒张剂、抗血管生成剂、细胞血管剂(cytovascularagents)、信号转导抑制剂、心血管药物(例如抗心律不齐剂)、血管收缩剂、激素和类固醇。
在某些实施方案中，治疗剂可为肿瘤学药物，其也可被称作抗肿瘤药物、抗癌药物、肿瘤药物、抗瘤剂或类似药物。可根据本发明使用的肿瘤学药物的实例包括但不限于阿霉素、左旋苯丙氨酸氮芥、别嘌醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、阿糖胞苷(araC)、三氧化二砷、硫唑嘌呤、贝沙罗汀、双氯乙亚硝脲、博来霉素、静脉内注射的白消安、口服的白消安、卡培他滨(希罗达)、卡铂、卡莫司汀、环己亚硝脲(CCNU)、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环孢霉素A、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、柔红霉素、环磷酰胺、柔红霉素、地塞米松、右雷佐生、多西他赛(dodetaxel)、阿霉素、阿霉素、DTIC、表柔比星、雌莫司汀、磷酸依托泊苷、依托泊苷和VP-16、依西美坦、FK506、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-FU、吉西他滨(健择)、吉姆单抗-奥佐米星、醋酸戈舍瑞林、羟基脲(hydrea)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星、异环磷酰胺、甲磺酸伊马替尼、干扰素、伊立替康(Camptostar，CPT-111)、来曲唑、亚叶酸、克拉立平、亮丙瑞林、左旋咪唑、阿利维A酸(litretinoin)、甲地孕酮(megastrol)、美法仑、L-PAM、美司钠、甲氨蝶呤、甲氧沙林、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇、帕米膦酸盐、培加酶、喷司他丁、卟吩姆钠、强的松、利妥昔单抗(rituxan)、链脲菌素、STI-571、三苯氧胺、泰索帝(taxotere)、替莫唑胺(temozolamide)、替尼泊苷、VM-26、抑拓扑酶素(Hycamtin)、托瑞米芬、维甲酸、ATRA、戊柔比星、长春碱、长春花碱、长春花新碱、VP16和脱水长春花碱。根据本发明使用的肿瘤学药物的其它实例是玫瑰树碱(ellipticin)和玫瑰树碱类似物或衍生物、埃博霉素(epothilone)、细胞内的激酶抑制剂和喜树碱。
核酸-脂质颗粒
在某些实施方案中，本发明的脂质颗粒与核酸缔合，得到核酸-脂质颗粒。在具体的实施方案中，所述核酸被完全封装于所述脂质颗粒中。如本文所用，术语″核酸″意味着包括任何寡核苷酸或多核苷酸。含有至多50个核苷酸的片段通常被称作寡核苷酸，而更长的片段被称作多核苷酸。在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸长度是20-50个核苷酸。
在本发明中，术语″多核苷酸″和″寡核苷酸″指的是由包含天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键所组成的核苷酸或核苷单体的聚合物或寡聚物。术语″多核苷酸″和″寡核苷酸″还包括含有类似地起作用的非天然存在的单体的聚合物或寡聚物，或其部分。与天然形式相比，这类修饰或取代的寡核苷酸通常是优选的，这是因为该寡核苷酸的特性，例如在核酸酶存在下增强的细胞摄取和增加的稳定性。
寡核苷酸可分为脱氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。脱氧核糖寡核苷酸由被称作脱氧核糖的5-碳糖组成，所述脱氧核糖在该糖的5′和3′碳处被共价地连接至磷酸以形成交替的、无支链的聚合物。核糖寡核苷酸由相似的重复结构组成，其中所述5-碳糖为核糖。
存在于本发明的脂质-核酸颗粒中的核酸包括已知的任何形式的核酸。本文所用的核酸可以是单链DNA或RNA，或者双链DNA或RNA，或者DNA-RNA杂交体。双链DNA的实例包括结构基因、含有控制区和终止区的基因以及诸如病毒或质粒DNA的自我复制系统。双链RNA的实例包括siRNA和其它RNA干扰剂。单链核酸包括例如反义寡核苷酸、核酶、微RNA和三链形成寡核苷酸。
本发明的核酸可具有各种长度，这一般取决于核酸的具体形式。例如，在具体的实施方案中，质粒或基因的长度可为约1,000至100,000个核苷酸残基。在具体的实施方案中，寡核苷酸的长度可以在约10至100个核苷酸的范围内变化。在各种相关的实施方案中，单链、双链和三链的寡核苷酸的长度都可以在约10至约50个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约15至约30个核苷酸、约20至约30个核苷酸的范围内变化。
在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸(或其链)与靶多核苷酸可特异性杂交靶多核苷酸或与靶多核苷酸互补。术语″可特异性杂交″和″互补的″是用来表示充足的互补度以使得在DNA或RNA靶与寡核苷酸之间产生稳定且特异性的结合的术语。应理解寡核苷酸不需要与它的可特异性杂交的靶核酸序列100％互补。当所述寡核苷酸与所述靶的结合干扰靶分子的正常功能导致效用或表达丧失时，寡核苷酸是可特异性地杂交的，并且存在充足的互补度以避免在期望特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗性处理的情况中为在生理条件下；或者在体外测定的情况中为在进行测定的条件下)寡核苷酸与非靶序列的非特异性结合。因此，在其它实施方案中，与所述寡核苷酸所靶向或特异性地杂交的基因或mRNA序列的区域相比，所述寡核苷酸包括1、2或3个碱基的取代。
RNA干扰核酸
在具体的实施方案中，本发明的核酸-脂质颗粒与RNA干扰(RNAi)分子缔合。使用RNAi分子的RNA干扰方法可用来破坏目标基因或多核苷酸的表达。在过去的5年里，小干扰RNA(siRNA)基本上已经取代反义ODN和核酶，成为开发的新一代靶向寡核苷酸药物。SiRNAs为通常具有21-30个核苷酸长的RNA双链体，所述RNA双链体可与细胞质多蛋白复合物结合，该复合物称为RNAi诱导的沉默复合物(RISC)。负荷有siRNA的RISC介导同源的mRNA转录物的降解，因此，siRNA可设计为高特异性地敲减蛋白表达。与其它的反义技术不同，siRNA通过自然机制起作用，该自然机制发展成通过非编码的RNA来控制基因表达。通常认为这就是它们在体内和在体外的活性比反义ODN或核酶中的任一个都要强的原因。多种RNAi试剂(包括靶向临床相关靶的siRNA)目前正处于药物研发中，例如，在德国Fougerolles，A.等人，NatureReviews6：443-453(2007)中所描述的。
虽然首次描述的RNAi分子为含有RNA有义链和RNA反义链的RNA:RNA杂交体，但是现已证实DNA有义:RNA反义杂交体，RNA有义:DNA反义杂交体以及DNA:DNA杂交体能介导RNAi(Lamberton，J.S.和Christian，A.T.，(2003)MolecularBiotechnology24：111-119)。因此，本发明包括使用含有这些不同类型的双键分子中的任一种的RNAi分子。另外，应理解可使用RNAi分子并且以各种形式引入RNAi至细胞中。因此，如本文所用，RNAi分子包含能在细胞中诱导RNAi应答的任何和全部分子，包括但不限于含有两条分离的链(即有义链和反义链)的双链多核苷酸(例如，小干扰RNA(siRNA))；含有形成双链区的互补序列的发夹环的多核苷酸(例如shRNAi分子)以及表达一个或多个能单独或与另一个多核苷酸结合形成双链多核苷酸的多核苷酸的表达载体。
RNA干扰(RNAi)可用来特异性抑制靶多核苷酸的表达。根据本发明可通过引入dsRNA，siRNA或shRNA到细胞或生物体中来抑制双链RNA介导的基因和核酸的表达。SiRNA可为双链RNA或者包含RNA和DNA两者(例如一条RNA链和一条DNA链)的杂交体分子。现已证明直接将siRNAs引入至细胞能触发哺乳动物细胞中的RNAi(Elshabir，S.M.等人，Nature411：494-498(2001))。此外，哺乳动物细胞的抑制在RNA水平发生且对靶向的基因有特异性，在RNA和蛋白抑制之间具有很强的关联性(Caplen，N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：9746-9747(2001))。另外，结果表明，大量的细胞系(包括HeLaS3、COS7、293、NIH/3T3、A549、HT-29、CHO-KI和MCF-7细胞)易受到一些siRNA沉默水平的影响(Brown，D.等人，TechNotes9(1)：1-7，可经万维网在www.dot.ambion.dot.com/techlib/tn/91/912.html(9/1/02)得到)。
靶向RNAi分子的特异性多核苷酸可通过本领域已知的方法容易地制备。已鉴定出有效的siRNA分子的结构特征(Elshabir，S.M.等人(2001)Nature411：494-498和Elshabir，S.M.等人(2001)，EMBO20：6877-6888)。因此，本领域的技术人员可理解大量不同的siRNA分子可用来靶向特异性基因或转录物。在某些实施方案中，根据本发明的siRNA分子为双链且长度为16-30个或18-25个核苷酸，该长度范围包括其之间的每个整数。在一个实施方案中，siRNA为长度是21的核苷酸。在某些实施方案中，siRNA具有0-7个核苷酸3′突出端或0-4个核苷酸5′突出端。在一个实施方案中，siRNA具有2个核苷酸3′突出端。在一个实施方案中，siRNA具有21个核苷酸的长度，其中具有2个核苷酸3′突出端(即，它们在有义链和反义链之间包括19个核苷酸互补区)。在某些实施方案中，突出端为UU或dTdT3′突出端。
通常，siRNA分子与靶DNA分子的一条链完全互补，这是因为已表明即使单个的碱基对错配都可减少沉默。在其它的实施方案中，siRNA可具有修饰的主链组成，例如，2′-脱氧-或者2′-O-甲基修饰。然而，在优选的实施方案中，所述siRNA的整条链不是用2′-脱氧-或者2′-O-修饰的碱基中的任何一个制得。
在另一个实施方案中，本发明提供包含抑制细胞中基因表达的载体的细胞。所述载体包括可连接至核苷酸序列的调节序列，所述核酸序列编码本发明的一个dsRNA的至少一条链。
在一个实施方案中，通过扫描靶mRNA转录物序列中AA二核苷酸靶序列的存在来选择siRNA靶位点。每一个与3′邻近的大约19个核苷酸结合的AA二核苷酸靶序列为潜在的siRNA靶位点。在一个实施方案中，siRNA靶位点优选不位于5′和3′非翻译区(UTR)或者起始密码子附近的区域(在大约75个碱基内)，这是因为结合调节区的蛋白可干扰siRNP核酸内切酶复合物的结合(Elshabir，S.等人，Nature411：494-498(2001)；Elshabir，S.等人EMBOJ.20：6877-6888(2001))。另外，潜在的靶位点可与适当的基因组数据库(可经NCBI服务器在www.ncbi.nlm得到，例如BLASTN2.0.5)比较，并且排除与其它编码序列具有显著同源性的潜在靶序列。
在特别的实施方案中，短发夹RNA构成了本发明的核酸-脂质颗粒中的核酸组分。短发夹RNA(shRNA)为能够序列特异性减少靶基因的表达的发夹RNA的形式。短发夹RNA在抑制基因表达方面优于siRNA，这是因为它们在细胞环境中通常更为稳定以及不容易受到降解的影响。已经确定在多种正常和癌细胞系以及哺乳动物细胞(包括小鼠和人类细胞)中的这类短发夹RNA介导的基因沉默工作(Paddison，P.等人，GenesDev.16(8)：948-58(2002))。此外，已经产生含有编码工程改造的shRNA的染色体基因的转基因细胞系。这些细胞能够组成性地合成shRNA，从而促进可传到子代细胞的持久型或组成型基因。
ShRNA含有茎环结构。在某些实施方案中，它们可含有可变的茎长度，代表性地从19至29个核苷酸，或者19至29个之间的任一个。在某些实施方案中，发夹包括19至21个核苷酸茎，然而在其它的实施方案中，发夹包括27至29个核苷酸茎。在某些实施方案中，环的大小为长度在4至23个之间的核苷酸，虽然所述的环的大小可大于23个核苷酸而不会显著地影响沉默活性。ShRNA分子可含有错配，例如在shRNA茎的两条链之间的G-U错配，而不会减少效价。事实上，在某些实施方案中，shRNA被设计用于包括在发夹茎中的一个或更多个的G-U配对以例如在细菌增殖过程中稳定发夹。然而，通常需要在结合至靶mRNA(反义链)的茎的部分与mRNA之间的互补，并且在此区域中的甚至单一碱基对错配都可能取消沉默。不需要5′和3′突出端，这是因为它们看来对shRNA功能并不重要，尽管它们可能存在危险(Paddison等人(2002)Genes&Dev.16(8)：948-58)。
微RNA
微RNA(miRNA)为高度保守的一类小RNA分子，该小RNA分子从植物或动物的基因组中的DNA转录，但不被翻译为蛋白。被加工的miRNA为单链约17-25个核苷酸(nt)的RNA分子，该RNA分子被并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)并且已被确定为发育、细胞增殖、凋亡和分化的关键调节剂。认为它们通过结合至特定mRNA的3′-非翻译区而在基因表达的调节中起作用。RISC通过翻译抑制、转录物裂解或二者来介导基因表达的向下调节。RISC还涉及范围广泛的真核细胞的核中的转录沉默。
迄今为止所鉴定的miRNA序列的数目是巨大的并且正在增长，其说明性的实例可在例如″miRBase：microRNAsequences，targetsandgenenomenclature″Griffiths-JonesS，GrocockRJ，vanDongenS，BatemanA，EnrightAJ.NAR，2006，34，DatabaseIssue，D140-D144；″ThemicroRNARegistry″Griffiths-JonesS.NAR，2004，32，DatabaseIssue，D109-D111中；以及还可经互联网在microrna.dot.sanger.dot.ac.dot.uk/sequences/找到。
反义寡核苷酸
在一个实施方案中，核酸是针对靶多核苷酸的反义寡核苷酸。术语″反义寡核苷酸″或仅仅″反义″是指包括与靶向多核苷酸序列互补的寡核苷酸。反义寡核苷酸是与所选序列互补的DNA或RNA的单链。在反义RNA的情况下，它们通过结合至互补RNA链而防止互补RNA链的翻译。反义DNA可用于靶向特定的互补的(编码的或非编码的)RNA。如果发生结合，那么此DNA/RNA杂交体可被RNA酶H所降解。在特定的实施方案中，反义寡核苷酸含有约10至约50个核苷酸，更优选地约15至约30个核苷酸。该术语还包含可能不与期望的靶基因精确互补的反义寡核苷酸。因此，本发明可被用于如下的情况：当发现反义具有非靶特异性的活性时，或者当含有一个或多个与靶序列错配的反义序列对于特定用途是最优选时。
已证明反义核苷酸是蛋白合成的有效且靶向的抑制剂，并且因此用来通过靶基因特异性地抑制蛋白合成。反义寡核苷酸用来抑制蛋白合成的效力已得到充分确认。例如，聚半乳糖醛酸酶(polygalactauronase)和毒蕈碱2型乙酰胆碱受体的合成被针对它们相应mRNA序列的反义寡核苷酸所抑制(美国专利5,739,119和美国专利5,759,829)。进一步地，反义抑制的实例已由核蛋白细胞周期蛋白、多重抗药性基因(MDG1)、ICAM-1、E-选择蛋白、STK-1、纹状体的GABAa受体和人EGF所证明(Jaskulski等人，Science.1988年6月10日；240(4858)：1544-6；Vasanthakumar和Ahmed，CancerCommun.1989；1(4)：225-32；Peris等人，BrainResMolBrainRes.1998年6月15日；57(2)：310-20；美国专利5,801,154；美国专利5,789,573；美国专利5,718,709和美国专利5,610,288)。此外，还描述了抑制并且可用来治疗各种异常细胞增殖例如癌症的反义构建体(美国专利5,747,470；美国专利5,591,317和美国专利5,783,683)。
反义寡核苷酸的制备方法是本领域中已知的并且易适于产生靶向任何多核苷酸序列的反义寡核苷酸。对给定的靶序列特异的反义核苷酸序列的选择是基于对所选靶序列的分析以及二级结构、Tm、结合能和相对稳定性的确定。可基于反义寡核苷酸相对不能形成二聚体、发夹结构或者将减少或阻止与宿主细胞中靶mRNA的特异性结合的其它二级结构来选择反义寡核苷酸。mRNA的高度优选的靶区域包括在AUG翻译起始密码子处或附近的那些区域和基本上与mRNA的5′区域互补的那些序列。可使用例如OLIGO引物分析软件(MolecularBiologyInsights)的v.4和/或BLASTN2.0.5算法软件(Altschul等人，NucleicAcidsRes.1997，25(17)：3389-402)来进行这些二级结构分析和靶位点选择的考虑。
核酶
根据本发明另一个实施方案，核酸-脂质颗粒与核酶缔合。核酶是具有特异性催化结构域的RNA-蛋白复合物，所述特异性催化结构域具有核酸内切酶活性(Kim和Cech，ProcNatlAcadSciUSA.1987年12月；84(24)：8788-92；Forster和Symons，Cell.1987年4月24日；49(2)：211-20)。例如，大量的核酶以高度的特异性加速磷酸酯转移反应，经常只将寡核苷酸底物中的几种磷酸酯中的一种裂解(Cech等人，Cell.1981年12月；27(3Pt2)：487-96；Michel和Westhof，JMolBiol.1990年12月5日；216(3)：585-610；Reinhold-Hurek和Shub，Nature.1992年5月14日；357(6374)：173-6)。该特异性已被归因于如下要求：底物在化学反应之前通过特异性碱基配对相互作用结合至核酶的内部引导序列(″IGS″)。
目前已知至少六个基本种类的天然存在的酶促RNA。每种都可在生理条件下催化RNA磷酸二酯键的反向水解(且因此可裂解其它的RNA分子)。通常，酶促核酸首先通过结合至靶RNA来起作用。这种结合通过酶促核酸的靶结合部分产生，所述靶结合部分被保持在极靠近用于裂解靶RNA的分子的酶促部分之处。因此，所述酶促核酸首先识别，然后通过互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦结合至正确的位点，酶促地起作用以切断靶RNA。这种靶RNA的策略性裂解将破坏它指导编码蛋白的合成的能力。在酶促核酸结合并切割它的RNA靶之后，它从该RNA中被释放以寻找另一个靶并可重复地结合并切割新的靶。
可在例如锤头结构、发夹结构、丁型肝炎病毒、I组内含子或RNA酶PRNA(与RNA引导序列缔合)或脉孢菌属VSRNA基序中形成酶促核酸分子。锤头结构基序的具体实例描述于Rossi等人NucleicAcidsRes.1992年9月11日；20(17)：4559-65中。发夹结构基序的实例描述于Hampel等人(欧洲专利申请公布EP0360257)，Hampel和Tritz，Biochemistry1989年6月13日；28(12)：4929-33；Hampel等人，NucleicAcidsRes.1990年1月25日；18(2)：299-304和美国专利5,631,359中。丁型肝炎病毒基序的实例描述于Perrotta和Been，Biochemistry.1992年12月1日；31(47)：11843-52中。RNA酶P基序的实例描述于Guerrier-Takada等人，Cell.1983年12月；35(3Pt2)：849-57中。脉孢菌属VSRNA核酶基序由Collins(Saville和Collins，Cell.1990年5月18日；61(4)：685-96；Saville和Collins，ProcNatlAcadSciUSA.1991年10月1日；88(19)：8826-30；Collins和Olive，Biochemistry.1993年3月23日；32(11)：2795-9)中；并且I组内含子的实例描述于美国专利4,987,071中。根据本发明使用的酶促核酸分子的重要特征是它们具有与一个或多个靶基因DNA或RNA区域互补的特异性底物结合位点，并且它们在该底物结合位点之内或周围具有将RNA裂解活性赋予至该分子的核苷酸序列。因此，核酶构建体不必受限于本文所提到的特定基序。
靶向任何多核苷酸序列的核酶的制备方法是本领域中已知的。可如国际专利申请公布No.WO93/23569和国际专利申请公布No.WO94/02595中所述来设计核酶，其中每篇专利申请都通过引用特别地并入本文，并且可如其中所述在体外和体内合成核酶以进行测试。
可通过改变核酶结合臂的长度或者化学合成具有以下修饰的核酶来优化核酶活性：用以防止核酶被血清核糖核酸酶降解(参见例如国际专利申请公布WO92/07065；国际专利申请公布No.WO93/15187；国际专利申请公布No.WO91/03162；欧洲专利申请公布No.92110298.4；美国专利5,334,711；和国际专利申请公布WO94/13688，这些专利和专利申请描述可对酶促RNA分子的糖部分进行的各种化学修饰)的修饰、增强核酶在细胞中的效力和除去茎II碱基以缩短RNA合成次数并降低化学要求的修饰。
适于用在本发明的组合物和方法中的其它的寡核苷酸(ODN)的特异性核酸序列描述于美国专利申请60/379,343、美国专利申请No.09/649,527、国际公布No.WO02/069369、国际公布WO01/15726、美国专利No.6,406,705，以及Raney等人，JournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics，298：1185-1192(2001)中。在某些实施方案中，本发明的化合物和方法中所用的ODN具有磷酸二酯(″PO″)主链或硫代磷酸酯(″PS″)主链，和/或至少一种CpG基序中的甲基化胞嘧啶残基。
核酸修饰
在20世纪90年代，基于DNA的反义寡核苷酸(ODN)和核酶(RNA)代表药物设计和发展中的令人兴奋的全新模式，但核酸内切酶和核酸外切酶活性以及缺乏成功的细胞内递送阻止了它们在体内的施用。通过大量研究阻止寡核苷酸(寡)药物被核酸酶识别但不会抑制它们的作用机制的化学修饰，有效地克服了降解问题。所述研究非常成功，以致于开发的反义ODN药物目前在体内保持完整达数天而未修饰的分子则只能保持几分钟(Kurreck，J.2003.Antisensetechnologies.Improvementthroughnovelchemicalmodifications.EurJBiochem270：1628-44)。然而，到目前为止细胞内传递和作用机制问题已限制反义ODN和核酶成为临床产品。
RNA双链体在本质上比单链DNA或RNA对核酸酶更稳定，与反义ODN不同，未修饰的siRNA一旦接近细胞质就会显示出良好的活性。虽然如此，用来稳定反义ODN和核酶的化学修饰还可系统地应用至siRNA以确定可以接受多少化学修饰，以及是否可以增强药物代谢动力学和药效学的活性。由siRNA双链体引起的RNA干扰需要具有不同功能的反义链和有义链。这两种链对于使siRNA进入RISC来说是必需的，但是，一旦负载，这两种链分离并且有义链降解，然而所述反义链仍引导RISC到靶mRNA。进入RISC是在结构上不如靶mRNA的识别和切割严格。因此，所述有义链可能有许多不同的化学修饰，但是仅仅有限的变化被反义链接受(Zhang等人，2006)。
正如本领域所知，核苷为碱-糖组合。核苷是进一步包括共价连接到核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷酸。对于那些包括戊呋喃糖的核苷来说，磷酸酯基团可连接到糖的2′、3′或5′羟基部分。在形成寡核苷酸的过程中，磷酸酯基团和相邻的核苷彼此共价连接，以形成线状的聚合物。进而所述线状聚合结构的各个末端可进一步地连接以形成环状结构。寡核苷酸结构中，磷酸酯基团通常用以组成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的常见键合或主链为3′至5′磷酸二酯键合。
在根据本发明的脂质-核酸颗粒中使用的核酸包括已知的任何形式的核酸。因此，核酸可以是之前用来增强核酸酶抵抗力和血清稳定性的修饰的核酸的类型。出人意料地，然而，还可使用本发明的由不具有对天然核酸聚合物的磷酸二酯键的修饰的核酸配制脂质-核酸颗粒的方法来制备可接受的治疗产物，并且本发明的优选实施方案是使用未修饰的磷酸二酯核酸(即其中所有键都是磷酸二酯键的核酸)。
主链修饰
本发明所用的反义、siRNA和其他的寡核苷酸包括但不限于包含修饰的主链或非天然核苷间键合的寡核苷酸。具有修饰的主链的寡核苷酸包括主链上留有磷原子以及主链上没有磷原子的寡核苷酸。核苷间主链上没有磷原子的修饰的寡核苷酸被认为是寡核苷。修饰的寡核苷酸主链包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3′-烯基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基膦酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯、甲基膦酸酯或O-烷基磷酸三酯键合，以及具有正常3′-5′键合的硼烷磷酸酯及其2′-5′连接的类似物，以及具有反极性的那些类似物(其中相邻的核苷单元对的连接为3′-5′至5′-3′或由2′-5′至5′-2′)。可存在于根据本发明的核酸的具体修饰的具体非限制性实例如表2所示。
还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。教导上述键合的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361以及5,625,050。
在某些实施方案中，不包含磷原子的修饰的寡核苷酸主链包括具有通过短链烷基或环烷基核苷间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键合，或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键合形成的主链。这些主链包括例如具有吗啉代键合(部分由核苷的糖部分形成)的主链；硅氧烷主链；硫代物、亚砜和砜主链；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主链；亚甲基甲酰基(methyleneformacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚胺和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和其他具有混合的N、O、S、CH2组成部分的主链。与上述寡核苷酸的制备相关的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437以及5,677,439。
通过磷酸二酯键中的非桥接氧被硫取代的硫代磷酸酯主链修饰(表3，#1)是最早且最常见的用来稳定核酸药物以对抗核酸酶降解的方法之一。通常，PS修饰通过两条siRNA链在对活性没太大影响的情况下广泛进行(Kurreck，J.，Eur.J.Biochem.270：1628-44，2003)。然而，已经知道PS寡核苷酸非特异性地与蛋白紧密联系时会产生毒性，特别是经静脉内注射后。因此，所述的PS修饰通常局限于3′和5′末端上的一个或两个碱基。硼烷磷酸酯接头(表3，#2)是最新的修饰，该修饰显然比PS更稳定，增强siRNA的活性且具有低毒性。
表3.用于siRNA和其他核酸的化学修饰
其他有用的核酸衍生物包括桥氧原子(这些桥氧原子组成磷酸酯键合)被-S-、-NH-、-CH2-等所取代的核酸分子。在某些实施方案中，对所用的反义、siRNA或其他核酸的改变将不会完全影响核酸所带的负电荷。因此，本发明考虑使用部分键被诸如中性的甲基磷酸酯或氨基磷酸酯键合所取代的反义、siRNA和其他核酸。在某些实施方案中，当使用中性键合时，少于80％核酸键合被如此取代，或少于50％的核酸键合被如此取代。
碱基修饰
碱基修饰不如主链修饰和糖修饰普遍。表3的3-6中所示的修饰都显示使对抗核酸酶的siRNA稳定且对活性几乎没有影响(Zhang，H.Y.，Du，Q.，Wahlestedt，C，Liang，Z.2006.RNAInterferencewithchemicallymodifiedsiRNA.CurrTopMedChem6：893-900)。
因此，寡核苷酸还可包括核苷碱基(在本领域中通常简称为″碱基″)修饰或取代。如本文所用，″未修饰的″或″天然的″核苷碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷碱基包括其他合成的或天然的核苷碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C或者m5c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基或其他烷基的衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基或其他烷基的衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶(2-thiothymine)和2-巯基胞嘧啶(2-thiocytosine)、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(特别是5-溴代)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。
某些核苷碱基对于增强本发明的低聚物化合物的结合亲和力特别有用，所述核苷碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(包括2-氨丙基腺嘌呤)、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已证实5-甲基胞嘧啶取代可使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编辑，AntisenseResearchandApplications1993，CRCPress，BocaRaton，第276-278页)。在具体的实施方案中，这些核苷碱基可与2′-O-甲氧基乙基糖修饰组合。教导了制备某些这些修饰的核苷碱基和其他核苷碱基的美国专利包括但不限于上述的美国专利No.3,687,808，以及美国专利No.4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617和5,681,941。
糖修饰
糖基上的多数修饰发生在RNA糖环的2′-OH上，其提供了合宜的化学反应位点(Manoharan，M.2004.RNAinterferenceandchemicallymodifiedsmallinterferingRNAs.CurrOpinChemBiol8：570-9；Zhang，H.Y.，Du，Q.，Wahlestedt，C，Liang，Z.2006.RNAInterferencewithchemicallymodifiedsiRNA.CurrTopMedChem6：893-900)。所述的2′-F和2′-OME(表3中的#7和8)常见且两者均能增强稳定性，只要限制每条链少于4个核苷酸，所述的2′-OME修饰就不会降低活性(Holen，T.，Amarzguioui，M.，Babaie，E.，Prydz，H.2003.Similarbehaviourofsingle-strandanddouble-strandsiRNAssuggeststheyactthroughacommonRNAipathway.NucleicAcidsRes31：2401-7)。当修饰的碱基限制在分子的中间区域时，所述2′-O-MOE(表3中的#9)在siRNA中最有效(Prakash，T.P.，Allerson，C.R.，Dande，P.，Vickers，T.A.，Sioufi，N.，Jarres，R.，Baker，B.F.，Swayze，E.E.，Griffey，R.H.，Bhat，B.2005.PositionaleffectofchemicalmodificationsonshortinterferenceRNAactivityinmammaliancells.JMedChem48：4247-53)。发现的稳定siRNA而不丧失活性的其他修饰示于表3中的#10-14。
修饰的寡核苷酸还可包括一个或多个取代的糖部分。例如，本发明包括在2′位上包含如下一种基团的寡核苷酸：OH；F；O-、S-或N-烷基、O-烷基-O-烷基、O-、S-或N-烯基，或O-、S-或N-炔基，其中，所述烷基、烯基和炔基可被C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基取代或未取代。特别优选地是O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1到约10。其他优选的寡核苷酸包括2′位上包含如下一种基团：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、可促进寡核苷酸药物代谢动力学性能的基团，以及其他的具有相似性能的取代基。一种修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也称作2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta1995，78，486-504)，即烷氧基烷氧基。其他的修饰包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基(即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称作2′-DMAOE)以及2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(2′-DMAEOE)。
另外的修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)以及2′-氟(2′-F)。还可以在寡核苷酸的其他位置上，特别是在3′端核苷酸上或者2′-5′连接的寡核苷酸上的糖的3′位置上以及5′端核苷酸的5′位置上进行相似的修饰。寡核苷酸还可含有糖模拟物(例如取代戊呋喃糖的环丁基部分)。教导了这些修饰的糖结构制备的代表性的美国专利包括但不限于美国专利No.4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633以及5,700,920。
在其他的寡核苷酸模拟物中，尽管保留碱基单位以和适当的核酸靶化合物杂交，核苷酸单位的糖和核苷间键合(即主链)二者都被新的基团取代。一种显示出优异的杂交性能的低聚物化合物(寡核苷酸模拟物)被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含酰胺的主链(特别是氨基乙基甘氨酸主链)替代。核苷碱基被保留，且直接或间接地与主链的酰胺部分中的氮杂氮原子结合。教导这些PNA化合物制备的代表性的美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082、5,714,331以及5,719,262。PNA化合物的进一步教导可参见Nielsen等人(Science，1991，254，1497-1500)。
本发明的具体实施方案是具有硫代磷酸主链的寡核苷酸以及具有杂原子主链的寡核苷，特别是上面提到的美国专利No.5,489,677的-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-以及-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中，天然的磷酸二酯主链表示为-O-P-O-CH2-)，上面提到的美国专利No.5,602,240的酰胺主链。还优选地是具有吗啉代主链结构的寡核苷酸参见上面提到的美国专利No.5,034,506。
嵌合的寡核苷酸
将给定化合物的所有位置一致地修饰是不必要的，并且事实上多于一种的前述修饰可被并入单独的化合物或甚至寡核苷酸中的单核苷处。本发明某些优选的寡核苷酸是嵌合的寡核苷酸。本发明中的上下文中的“嵌合的寡核苷酸”或“嵌合体”是含有两个或更多个化学上不同的区域的寡核苷酸，所述区域中的每一个都由至少一个核苷酸构成。这些寡核苷酸通常含有赋予一种或多种有利特性(例如增强的核酸酶抗性、增强的细胞摄取、增强的对RNA靶的结合亲和力)的修饰的核苷酸的至少一个区域以及作为RNA酶H切割的底物的区域。
在一个实施方案中，嵌合的寡核苷酸包括被修饰以增强靶结合亲和力的至少一个区域。常规地通过测量寡核苷酸/靶对的Tm来确定寡核苷酸对其靶的亲和力，所述Tm是寡核苷酸与靶解离的温度；通过分光光度计来检测解离。Tm越高，寡核苷酸对靶的亲和力越大。在一个实施方案中，被修饰以增强靶mRNA结合亲和力的寡核苷酸区域包括至少一个在糖的2′位上修饰的核苷酸，最优选地为2′-O-烷基、2′-O-烷基-O-烷基或2′-氟修饰的核苷酸。此修饰常规地并入寡核苷酸中，并且这些寡核苷酸已经显示比2′-脱氧寡核苷酸具有更高的针对给定靶的Tm(即更高的靶结合亲和力)。这种增强的亲和力的作用是极大地增强靶基因表达的寡核苷酸抑制。
在另一个实施方案中，嵌合的寡核苷酸包括作为RNA酶H的底物起作用的区域。当然，应理解寡核苷酸可包括本文所述的各种修饰的任何组合。
本发明的寡核苷酸的另一种修饰包括以化学方式将增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物连接至寡核苷酸。这类缀合物及其制备方法是本领域中已知的。
本领域技术人员将意识到，对于体内应用(例如治疗效力)来说，合理的经验法则是如果序列的硫代型以游离形式工作，那么任何化学的相同序列的封装的颗粒也将是有效的。封装的颗粒还可具有更广阔的体内应用范围，显示出未知另外对反义疗法的反应的条件和模型中的效力。本领域技术人员知道，通过应用本发明，他们可找到现在对反义疗法反应的老模型。此外，他们可重新访问丢弃的反义序列或反义化学并通过利用本发明发现效力。
可通过固相合成的熟知技术来方便且常规地制备根据本发明使用的寡核苷酸。用于这种合成的设备由包括AppliedBiosystems在内的几家销售商销售。还可使用用于这种合成的任何其他方法；寡核苷酸的实际合成完全在操作者的能力之内。还熟知的是使用相似的技术来制备其他寡核苷酸(例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物)。
定义
为方便起见，本说明书、实施例和所附权利要求书中所用的某些术语和短语的含义提供如下。如果术语在本说明书其他部分中的使用与在这一部分所提供的定义之间存在明显的不一致，那么以这一部分中的定义为准。
″G″、″C″、″A″和″U″一般各自代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应理解术语″核糖核苷酸″或″核苷酸″还可指如下进一步详述的修饰的核苷酸或者替代品替换部分。本领域技术人员可充分意识到鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可被其他部分替换而不实质性改变寡核苷酸的碱基配对特性，所述寡核苷酸包括含有这种替换部分的核苷酸。例如，不限制地，包括肌苷作为碱基的核苷酸可与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸在本发明的核苷酸序列中可被含有例如肌苷的核苷酸所替换。含有这种替换部分的序列是本发明的实施方案。
本文所用的″因子VII″是指因子VIImRNA、蛋白质、肽或多肽。术语″因子VII″在本领域中还称作AI132620、Cf7、凝结因子VII前体、凝结因子VII、FVII、血清凝血酶原转变加速因子、FVII凝结蛋白和依他凝血素α。
如本文所用，″靶序列″是指在基因转录过程中形成的mRNA(包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA)分子的核苷酸序列的连续部分。
如本文所用，术语″包括序列的链″是指包括由使用标准的核苷酸命名法所提及的序列所描述的核苷酸链的寡核苷酸。
如本文所用并且除非另外指出，术语″互补的″当在核苷酸对情况下使用时是指经典的沃森-克里克对，即GC、AT或AU。当一个或两个核苷酸如本文所述已被例如通过核糖修饰或磷酸酯主链修饰来修饰时，该术语也延伸至经典的沃森-克里克配对。它还可包括与肌苷或非实质性改变碱基配对特性的其他实体的配对。
如文本所用并且除非另外指出，如本领域技术人员所理解，术语″互补的″当用来描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，是指包括该第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包括该第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下杂交并形成双链结构的能力。互补性可包括允许在生理条件下(例如在生物体内可能遇到的生理相关条件下)的杂交的完全的互补性、基本上的互补性和充分的互补性。完全的互补性是指在第一和第二序列的所有的碱基对处互补，如上对单独碱基对所定义的。当一条序列与本文的第二序列是″基本上互补的″时，这两条序列可以是完全互补的，或者它们在杂交时可形成一个或多个，但是通常不多于4、3或2个错配的碱基对，同时在与它们的最终应用最相关的条件下保持杂交的能力。基本上的互补性还可被定义为在严格条件下的杂交，其中严格条件可包括：400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA、50℃或70℃保持12-16小时，接着是洗涤。本领域技术人员将能够根据杂交的核苷酸的最终应用来确定最适合用于测试两条序列互补性的一组条件。
然而，当设计两个寡核苷酸以在杂交时形成一个或多个单链突出端时，这种突出端将不被视为有关互补性的确定的错配。例如，包括长度为21个核苷酸的寡核苷酸和长度为23个核苷酸的另一个寡核苷酸且其中所述较长的寡核苷酸包括与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列的dsRNA，为了本发明的目的仍可称作是″完全互补的″。
本文所用的″互补的″序列还可包括非沃森-克里克碱基对或者完全由它们形成，和/或包括从非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对，在上述有关它们的杂交能力被满足的要求的范围内。
允许在生理条件下(例如在生物体内可能遇到的生理相关条件下)地杂交的术语″互补的″、″完全互补的″和″基本互补的″在本文中可关于在dsRNA的有义链和反义链之间或者在dsRNA的反义链和靶序列之间的碱基配对而使用，这正如从它们的使用情况下所理解的。
如本文所用，与信使RNA(mRNA)″至少一部分互补例如基本上互补″的多核苷酸是指与目标mRNA(例如编码因子VII的mRNA)的连续部分互补例如基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码因子VII的mRNA的未中断部分基本上互补，那么多核苷酸与因子VIImRNA的至少一部分互补。
本文所用的术语″双链RNA″或″dsRNA″是指核糖核酸分子或核糖核酸分子的复合物，其具有包括两条反平行和如上所定义的基本上互补的核酸链的双链结构。形成双链结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者它们可以是分离的RNA分子。当两条链是一个较大分子的一部分，并且因此被一条链的3′端和形成双链结构的相应的另一条链的5′末端之间未打断的核苷酸链所连接的时候，连接的RNA链被称作″发夹环″。当两条链通过除了一条链的3′端和形成双链结构的相应的另一条链的5′末端之间未打断的核苷酸链之外的其他方式共价连接的时候，连接的结构被称作″接头″。RNA链可具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数量是dsRNA的最短链中的核苷酸数量。除了双链结构，dsRNA可包括一个或多个核苷酸突出端。本文所用的dsRNA还被称作″小的抑制性RNA″、″siRNA″、″siRNA剂″、″iRNA剂″或″RNAi剂″。
如本文所用，″核苷酸突出端″是指当dsRNA的一条链的3′端伸出超过另一条链的5′端或者反过来时从dsRNA的双链结构中突出的一个或多个不成对的核苷酸。″钝的″或″钝端″是指在dsRNA的末端没有不成对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。″钝端的″dsRNA是指在它的整个长度中是双链的dsRNA，即在分子的任一端没有核苷酸突出端。
术语″反义链″是指包括与靶序列基本上互补的区域的dsRNA的链。如本文所用，术语″互补性的区域″是指与序列(例如本文所定义的靶序列)基本上互补的反义链的区域。当互补性的区域与靶序列不完全互补时，在末端区域的错配是最能被容忍的，并且如果存在，其通常是在一个或多个末端区域中，例如在5′和/或3’端的6、5、4、3或2个核苷酸中。
本文所用的术语″有义链″是指包括与反义链的区域基本上互补的区域的dsRNA的链。
术语″同一性″是通过比较序列而确定的两条或更多条多核苷酸序列之间的关系。同一性还指通过这种序列串之间的匹配而确定的多核苷酸序列之间的序列相关性程度。尽管存在测量两条多核苷酸序列之间的同一性的多种方法，但是该术语对于本领域技术人员而言是熟知的(参见例如SequenceAnalysisinMolecularBiology，vonHeinje，G.，AcademicPress(1987)和SequenceAnalysisPrimer，Gribskov.，M.和Devereux，J.，eds.，M.StocktonPress，NewYork(1991))。本文所用的″基本上同一的″是指在dsRNA的有义链和靶基因的相应部分之间具有非常高度的同源性(优选100％的序列同一性)。然而，具有大于90％或95％的序列同一性的dsRNA可被用于本发明，并且因此可以容忍由于基因突变、株的多态现象或进化趋异而可被预期的序列变化。虽然100％的同一性是优选的，但是dsRNA可在RNA和靶基因之间含有单个或多个碱基对随机错配。
如本领域技术人员所理解的，当提及dsRNA时，″引入到细胞中″是指促进摄取或吸收进细胞。dsRNA的吸收或摄取可通过未辅助的扩散性或主动性细胞过程，或通过辅助剂或辅助装置发生。该术语的含义不限于在体外的细胞；dsRNA还可被″引入细胞中″，其中所述细胞是活生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞中将包括递送至生物体。例如，对于体内递送，可将dsRNA注射进组织位点或全身施用。在体外引入细胞中包括本领域已知的方法，例如电穿孔和脂质转染。
在提及因子VII基因的范围内，术语″沉默″和″抑制……的表达″在本文中是指因子VII基因表达的至少部分抑制，其表现为从因子VII基因转录的mRNA的量与和第一细胞或细胞群基本上同一但未被如此处理的第二细胞或细胞群(对照细胞)相比的减少，所述因子VII基因可从第一细胞或细胞群分离，在所述第一细胞或细胞群中因子VII基因被转录，并且所述第一细胞或细胞群已被处理以使因子VII基因的表达得到抑制。抑制程度通常被表示为：
可选地，可以按照与因子VII基因转录功能相关的参数的减少给出抑制程度，所述参数为例如由因子VII基因所编码的由细胞分泌的蛋白的量，或者展示某种表现型(如凋亡)的细胞的数量。原则上，组成性地或通过基因组工程，并且通过任何合适的测定，可以在表达靶的任何细胞中确定因子VII基因的沉默。然而，当需要参考以便确定给定siRNA是否在一定程度上抑制因子VII基因的表达并且因此被本发明所包括的时候，在下面的实施例中提供的测定将用作这种参考。
例如，在某些情况下，通过施用本发明的双链寡核苷酸，因子VII基因的表达被抑制了至少约20％、25％、35％、40％或50％。在一个实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸，因子VII基因被抑制了至少约60％、70％或80％。在更优选的实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸，因子VII基因被抑制了至少约85％、90％或95％。
术语″治疗″、″处理″等是指疾病或疾患的缓解或减轻。在本发明中，在它涉及本文下面列举的任何其他条件(例如除了血栓性疾患之外的因子VII介导的病症)的范围内，术语″治疗″、″处理″等是指缓解或减轻至少一种与这种病症相关的症状，或者减缓或逆转这种病症的进展。
当以适合的剂量施用时，″治疗相关的″组合物可减轻疾病或疾患，或者疾病或疾患的症状。
如本文所用，术语″因子VII介导的病症或疾病″及相关的术语和短语是指特征为不适合的(例如超过正常的)因子VII活性的病症或疾病。不适合的因子VII功能活性可由于因子VII在通常不表达因子VII的细胞中的表达或者增加的因子VII的表达(导致例如病毒性出血热或血栓的症状)而产生。因子VII介导的病症或疾病可被不适合的因子VII功能活性来完全地或部分地介导。然而，因子VII介导的病症或疾病是如下的病症或疾病，其中因子VII的调节导致对潜在的病症或疾患产生一些作用(例如因子VII抑制剂在至少一些患者中导致患者健康的某些改进)。
″出血热″包括由病毒性感染所引起的疾病的组合。发热和胃肠症状之后通常为毛细管出血。
″凝血病″是受治疗者血液凝固机制中的任何缺陷。
如本文所用，″血栓性疾患″是优选由不期望的FVII表达所致的任何疾患，其包括以不期望的血液凝固为特征的任何疾患。
如本文所用，短语″治疗有效量″和″预防有效量″是指在治疗、预防或管理病毒性出血热或这种疾患的明显症状(如出血、发热、虚弱、肌痛、头痛、炎症或循环休克)中提供治疗性益处的量。治疗有效的具体量可由普通医师容易地确定，并且可根据本领域中已知的因素(例如血栓性疾患的类型、患者的病史和年龄、疾病的阶段和其他试剂的施用)而变化。
如本文所用，″药物组合物″包括药学有效量的dsRNA和药学上可接受的载体。如本文所用，″药学有效量″、″治疗有效量″或仅仅″有效量″是指对于产生期望的药学、治疗性或预防性结果有效的RNA的量。例如，如果当与疾病或疾患相关的可测量的参数具有至少25％的减少时，给定的临床治疗被认为是有效的，那么用于治疗该疾病或疾患的药物的治疗有效量是该参数产生至少25％的减少所必要的量。
术语″药学上可接受的载体″是指用于治疗剂施用的载体。这种载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。该术语特别地排除细胞培养基。对于口服施用的药物，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂例如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。适合的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，而玉米淀粉和海藻酸是适合的崩解剂。粘合剂可包括淀粉和明胶，而润滑剂如果存在将通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如果有需要的话，可用一种物质(例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)涂布片剂以便延缓胃肠道中的吸收。
如本文所用，″转化的细胞″是已将载体引入其中且从中可表达dsRNA分子的细胞。
核酸-脂质颗粒的特征
在某些实施方案中，本发明涉及用于生产脂质封装的核酸颗粒的方法和组合物，在所述脂质封装的核酸中核酸被封装在脂质层内。使用各种生物物理参数来表征这类含有siRNA寡核苷酸的核酸-脂质颗粒，所述生物物理参数包括：(1)药物与脂质的比例；(2)封装效率和(3)颗粒尺寸。期望具有高的药物与脂质的比例、高的封装效率、良好的核酸酶抗性和血清稳定性以及直径通常小于200nm的可控的颗粒尺寸。另外，核酸聚合物的性质很重要，因为致力于赋予核酸酶抗性的核酸修饰增加了治疗花费却在许多情况下只提供有限的抗性。除非另有说明，在本说明书中这些标准计算如下：
核酸与脂质的比例是确定体积的制剂中的核酸的量除以相同体积中脂质的量。这可以是按摩尔每摩尔计或者按重量每重量计，或者按重量每摩尔计。对于最终的现成施用的组合物，在使用透析、色谱和/或酶(例如核酸酶)消化尽量多地除去外部核酸之后计算核酸∶脂质的比例；
封装效率是指起始混合物的药物与脂质的比例除以最终的能施用的组合物的药物与脂质的比例。这是相对效率的量度。对于绝对效率的量度，还可计算被加至结束于能施用的组合物中的起始混合物的核酸总量。还可计算在配制过程中丧失的脂质的量。效率是制剂的损失和消耗的量度；以及
尺寸表明所形成的颗粒的尺寸(直径)。可使用Nicomp370型亚微米粒度分级器上的准弹性光散射(QELS)来确定尺寸分布。低于200nm的颗粒对于分布到新血管形成的(泄露的)组织(例如肿瘤和炎症部位)是优选的。
脂质颗粒的制备方法
本发明的方法和组合物利用某些阳离子脂质，其合成、制备和表征描述于随附实施例中。此外，本发明提供制备脂质颗粒的方法，所述脂质颗粒包括与治疗剂如核酸缔合的那些脂质颗粒。在本文所述方法中，将脂质混合物与缓冲的核酸水溶液组合以产生含有封装在脂质颗粒中的核酸的中间混合物，其中所述封装的核酸以约3wt％至约25wt％，优选地5至15wt％的核酸/脂质比存在。可任选地调整中间混合物的尺寸以获得脂质封装的核酸颗粒，其中所述脂质部分是单层囊泡，其直径优选为30至150nm，更优选为约40至90nm。然后提高pH以中和脂质-核酸颗粒上至少一部分的表面电荷，从而提供至少部分地表面中和的脂质封装的核酸组合物。
如上所述，几种阳离子脂质是在低于氨基的pKa的pH下是带电的并在高于pKa的pH下是基本上中性的氨基脂质。这些阳离子脂质被称作可滴定的阳离子脂质且可使用两步处理法用于本发明的组合物中。第一，可在较低的pH下用可滴定的阳离子脂质和其他囊泡组分在核酸的存在下形成脂质囊泡。以该方式，囊泡将封装并包埋核酸。第二，可通过将培养基的pH增加至高于存在的可滴定的阳离子脂质的pKa(即生理pH或更高的水平)来中和新形成的囊泡的表面电荷。该方法的特别有利的方面包括容易除去表面吸附的任何核酸以及所得的核酸递送媒介物具有中性表面。含有中性表面的脂质体或脂质颗粒将有望避免从循环中快速清除并避免与阳离子脂质体制剂相关的某些毒性。有关这类可滴定的阳离子脂质在核酸-脂质颗粒的组合物中的这些用途的另外细节在美国专利6,287,591和美国专利6,858,225中提供，这两篇专利通过引用并入本文。
还注意到，以此方式形成的囊泡提供均一的囊泡尺寸及高含量核酸的组合物。另外，囊泡的尺寸范围为约30至约150nm，更优选地为约30至约90nm。
不期望被任何特定理论所束缚，认为核酸封装的极高效率应是在低pH下静电相互作用的结果。在酸性pH(例如pH4.0)下，囊泡表面是带电的并通过静电相互作用来结合部分核酸。当外部酸性缓冲液被换成更中性的缓冲液(例如pH7.5)时，脂质颗粒或脂质体的表面被中和，使得可除去任何外部核酸。有关配制方法的更详细的信息在各种出版物(例如美国专利6,287,591和美国专利6,858,225)中提供。
鉴于以上情况，本发明提供制备脂质/核酸组合物的方法。在本文所述方法中，将脂质的混合物与核酸的缓冲水溶液组合以产生包含封装在脂质颗粒中的核酸的中间混合物，例如其中所述封装的核酸以约10wt％至约20wt％的核酸/脂质比例存在。任选地调整中间混合物的尺寸以获得脂质封装的核酸颗粒，其中所述脂质部分是单层囊泡，其直径优选为30nm至150nm，更优选为40nm至90nm。然后，提高pH以中和脂质-核酸颗粒上的至少一部分表面电荷，从而得到至少部分表面中和的脂质封装的核酸组合物。
在某些实施方案中，脂质混合物包括至少两种脂质组分：第一种为选自在具有当pH低于pKa时为阳离子脂质且当pH高于pKa时为中性脂质的脂质中的本发明的氨基脂质组分，以及第二种为选自在脂质-核酸颗粒形成过程中防止颗粒聚集的脂质组分。在具体的实施方案中，所述氨基脂质为本发明的新型阳离子脂质。
在制备本发明的核酸-脂质颗粒过程中，脂质混合物通常是在有机溶剂中的脂质溶液。然后，脂质混合物可干燥以形成薄膜或冻干以形成粉末，之后用缓冲溶液水合以形成脂质体。可选地，在优选的方法中，可将脂质混合物溶解于水混溶性醇(例如乙醇)中，并且将得到的乙醇溶液加至缓冲水溶液中以自发形成脂质体。在大多数的实施方案中，所用的醇是商业上可得的醇，例如，可以无水乙醇(100％)或95％乙醇的形式使用乙醇，其余的是水。该方法更详细地描述于美国专利5,976,567中。
根据本发明，脂质混合物可与含有核酸的缓冲水溶液组合。所述的缓冲水溶液通常是具有比脂质混合物中可质子化的脂质的pKa小的pH的缓冲液。适合的缓冲液的实例包括柠檬酸、磷酸、醋酸和MES。特别优选为柠檬酸缓冲液。依据被封装的核酸的化学性质，优选的缓冲液的阴离子在1-1000mM范围内，并且缓冲液浓度的优化可能对获得高负载水平是重要的(参见例如美国专利6,287,591和美国专利6,858,225)。可选地，用氯化物、硫酸盐等酸化至pH5-6的纯净水是可使用的。在这种情况下，适于加入5％葡萄糖或另一种非离子溶质，其在将颗粒透析以除去乙醇、增大pH值或与药学上可接受的载体如生理盐水混合时，可平衡跨颗粒膜的渗透势。缓冲液中核酸的量可不同，但通常是从约0.01mg/mL至约200mg/mL，更优选为从约0.5mg/mL至约50mg/mL。
将脂质混合物与治疗性核酸的缓冲水溶液组合以提供中间混合物。中间混合物通常是具有封装的核酸的脂质颗粒的混合物。另外，中间混合物还可含有核酸的某部分，所述核酸由于带负电的核酸和脂质颗粒表面上的带正电的脂质(构成质子化的第一脂质的氨基脂质或其他脂质在具有比脂质上该可质子化的基团的pKa小的pH的缓冲液中是带正电的)的离子吸引而被连接至脂质颗粒(脂质体或脂质囊泡)的表面。在一组优选的实施方案中，脂质混合物为脂质的醇溶液，并且调整每种溶液的体积以使经组合后所得的醇含量为约20体积％至约45体积％。组合混合物的方法可包括各种方法中的任何方法，其通常取决于所产生的组合物的规模。例如，当总体积为约10-20mL或更少时，可将溶液在试管中组合且使用漩涡混合器一起搅拌。可在适合的生产规模的玻璃器皿中进行大规模的步骤。
任选地，可通过将脂质混合物与治疗剂(核酸)的缓冲水溶液组合产生的封装了脂质的治疗剂(例如核酸)复合物的尺寸进行调整以获得期望的尺寸范围和脂质颗粒尺寸的相对狭窄的分布。优选地，将本文所提供的组合物的尺寸调整到平均直径为约70nm至约200nm，更优选为约90nm至约130nm。可使用若干技术来调整脂质体的尺寸以得到期望的尺寸。一个调整尺寸的方法描述于美国专利No.4,737,323中，该专利通过引用并入本文。通过水浴超声或探头超声对脂质体悬浮液进行超声处理以产生渐进的尺寸减小，降为尺寸小于约0.05微米的小单层囊泡(SUV)。另一种方法是依靠剪切能来将大的脂质体切割为较小的脂质体的均化作用。在典型的均化步骤中，通过标准乳液均化器进行再循环多层囊泡直至观察到所选的脂质体尺寸通常在0.1和0.5微米之间。在两种方法中，可通过常规的激光束颗粒尺寸测定来监测颗粒尺寸分布。对于本文的某些方法，使用挤出法来获得均一的囊泡尺寸。
脂质体组合物通过小孔聚碳酸酯膜或不对称陶瓷膜的挤出可产生明确界定的尺寸分布。通常，将悬浮液通过膜进行一次或更多次循环，直到实现所需的脂质体复合物尺寸分布。将脂质体连续通过更小孔膜挤出，以实现脂质体尺寸的逐渐减少。在某些情况下，可以不经任何尺寸调整而使用所形成的脂质-核酸组合物。
在具体的实施方案中，本发明的方法进一步包括中和脂质-核酸组合物的脂质部分上的至少一些表面电荷的步骤。通过至少部分地中和表面电荷，将未封装的核酸从脂质颗粒的表面释放并可使用常规技术将其从组合物中除去。优选地，通过交换缓冲溶液从所得的组合物中除去未封装的且吸附于表面的核酸。例如，用HEPES缓冲盐水(HBSpH为约7.5)溶液替换柠檬酸缓冲液(pH为约4.0，用于形成组合物)导致脂质体表面的中和以及核酸从表面的释放。然后可通过色谱法使用标准方法将释放的核酸除去，然后更换为具有高于所用脂质的pKa的pH的缓冲液。
任选地，脂质囊泡(即脂质颗粒)通过在缓冲水溶液中的水合作用形成，并在加入核酸之前使用上述任何方法调整尺寸。如上所述，缓冲水溶液应具有低于氨基脂质的pKa的pH值。然后可将核酸溶液加至这些已调整尺寸的预先形成的囊泡中。混合物中应含有醇(例如乙醇)以使得核酸封装进这种“预先形成的”囊泡中。在乙醇的情况下，它以约20％(w/w)至约45％(w/w)的浓度存在。此外，可能需要将缓冲水溶液-乙醇混合物中预先形成的囊泡和核酸的混合物加温至约25℃至约50℃，这取决于脂质囊泡的构成和核酸的性质。显然，对本领域普通技术人员来说，将封装方法优化以在脂质囊泡中获得期望水平的核酸将需要对变量(例如乙醇浓度和温度)进行操作。实施例中提供了用于核酸封装的适合条件的实例。一旦核酸被封装进预先形成的囊泡中，外部pH会增大到至少部分地中和表面电荷。然后可如上述除去未封装的且表面吸附的核酸。
使用方法
可使用本发明的脂质颗粒在体外或在体内将治疗剂递送至细胞。在具体的实施方案中，治疗剂是使用本发明的核酸-脂质颗粒递送至细胞的核酸。虽然通过核酸-脂质颗粒相关的描述示例下述的使用本发明的脂质颗粒和相关药物组合物的各种方法的描述，但是应理解这些方法和组合物可容易地进行修改以用于递送用于治疗任何疾病或疾患的任何治疗剂，所述疾病或疾患将得益于这种治疗。
在某些实施方案中，本发明提供用于将核酸引入细胞中的方法。用于引入细胞中的优选的核酸为siRNA、免疫刺激寡核苷酸、质粒、反义和核酶。可通过将本发明的颗粒或组合物与细胞接触一段足以发生细胞内递送的时间来进行这些方法。
可将本发明的组合物吸附于几乎任何细胞类型。一旦被吸附，核酸-脂质颗粒可被一部分细胞所胞吞，与细胞膜交换脂质，或与细胞融合。可通过这些途径中的任一个进行复合物的核酸部分的转移或并入。并非旨在限制本发明的范围，认为在颗粒通过胞吞作用被摄取进细胞的情况下，所述颗粒然后会与内体膜相互作用，可能通过形成非双层相导致内体膜的去稳定作用，导致封装的核酸被引入到细胞质中。相似地，在颗粒与细胞质膜直接融合的情况下，当融合发生时，脂质体膜被整合进细胞膜并且脂质体的内含物与细胞内的液体组合。当在体外进行细胞和脂质-核酸组合物之间的接触时将在生物相容的培养基中发生。组合物的浓度可依据具体的应用而广泛地改变，但通常是在约1μmol和约10mmol之间。在某些实施方案中，用脂质-核酸组合物对细胞的处理通常是在生理温度(约37℃)下进行约1小时至24小时、优选地约2小时至8小时。对于体外应用，可将核酸递送至生长在培养物中的不论是植物或动物来源、脊椎动物或无脊椎动物的细胞以及任何组织或类型的任何细胞。在优选的实施方案中，细胞将是动物细胞，更优选地是哺乳动物细胞，并且最优选地是人类细胞。
在一组实施方案中，将脂质-核酸颗粒悬浮液加至细胞密度为约103至约105个细胞/mL、更优选地为约2×104个细胞/mL的60-80％融合的铺板细胞。加至细胞的悬浮液的浓度优选为从约0.01至20μg/mL，更优选为约1μg/mL。
典型的应用包括使用熟知的步骤来提供siRNA的细胞内递送以使特定的细胞靶降低或沉默。可选地，应用包括编码治疗上有用的多肽的DNA或mRNA序列的递送。以此方式，通过供应有缺陷的或不存在的基因产物而提供对遗传疾病的治疗(即，对于杜兴氏肌营养不良，参见Kunkel等人，Brit.Med.Bull.45(3)：630-643(1989)，而对于囊性纤维病，参见Goodfellow，Nature341：102-103(1989))。本发明的组合物的其他用途包括将反义寡核苷酸引入细胞中(参见Bennett等人，Mol.Pharm.41：1023-1033(1992))。
可选地，通过本领域技术人员已知的方法，本发明的混合物还可用于在体内将核酸递送至细胞。对于本发明用于递送DNA或mRNA序列的应用而言，通过引用并入本文的Zhu等人在Science261：209-211(1993)中描述了使用DOTMA-DOPE复合物的巨细胞病毒(CMV)-氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达质粒的静脉内递送。通过引用并入本文的Hyde等人在Nature362：250-256(1993)中描述了使用脂质体将囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因递送至气道上皮和小鼠肺的肺泡。通过引用并入本文的Brigham等人在Am.J.Med.Sci.298：278-281(1989)中描述了用编码细胞内的酶氯霉素乙酰转移酶(CAT)的功能性原核基因体内转染小鼠的肺。因此，本发明的组合物可用来治疗传染性疾病。
对于体内施用，药物组合物优选地通过肠胃内(即关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内)施用。在具体的实施方案中，通过弹丸注射经静脉内或腹膜内施用药物组合物。对于一个实例，参见通过引用并入本文的Stadler等人的美国专利No.5,286,634，还在Straubringer等人，MethodsinEnzymology，AcademicPress，NewYork.101：512-527(1983)；Mannino等人，Biotechniques6：682-690(1988)；Nicolau等人，Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.6：239-271(1989)以及Behr，Ace.Chem.Res.26：274-278(1993)中讨论了细胞内核酸递送。还在例如Rahman等人的美国专利No.3,993,754、Sears的美国专利No.4,145,410、Papahadjopoulos等人的美国专利No.4,235,871、Schneider的美国专利No.4,224,179、Lenk等人的美国专利No.4,522,803以及Fountain等人的美国专利No.4,588,578中描述了其他的基于脂质的治疗剂的施用方法。
在其他方法中，可通过将制剂直接应用于组织而使药物制剂与靶组织接触。可通过局部的、“打开的”或“关闭的”步骤进行该应用。对于“局部的”，它是指将药物制剂直接应用在暴露于环境的组织，如皮肤、口咽、外耳道等。“打开的”步骤是包括切开患者皮肤并直接使下面的被施加药物制剂的组织可见的那些步骤。这通常通过外科手术步骤来完成，例如接近肺的开胸术、接近腹腔内脏的开腹术或接近靶组织的其他直接手术。“关闭的”步骤是不直接使得内部靶组织可见但是通过皮肤上的小伤口插入仪器而接近内部靶组织的侵入性步骤。例如，可通过针头灌洗而将制剂施用于腹膜。同样地，可在腰椎穿刺过程中通过输注，随后通过如通常在脊髓麻醉或脊髓的甲泛葡胺(metrazamide)成像中所实施的对患者的适当定位，将药物制剂施用于脑膜或脊髓。可选地，可通过内窥装置施用制剂。
还可在吸入肺的气溶胶中(参见Brigham等人，Am.J.Sci.298(4)：278-281(1989))或通过在疾病部位直接注射(Culver，HumanGeneTherapy，MaryAnnLiebert，Inc.，Publishers，纽约，pp.70-71(1994))来施用脂质-核酸组合物。
可以在各种宿主中实践本发明的方法。优选的宿主包括哺乳动物物种，例如人、非人灵长类、狗、猫、牛、马、绵羊等。
本发明的脂质-治疗剂颗粒的剂量将取决于治疗剂与脂质的比例以及施药医生基于患者的年龄、重量和状况的意见。
在一个实施方案中，本发明提供调节靶多核苷酸或靶多肽的表达的方法。这些方法通常包括将细胞与本发明的能与调节靶多核苷酸或靶多肽的表达的核酸缔合的脂质颗粒接触。如本文所用，术语“调节(modulating)”是指改变靶多核苷酸或靶多肽的表达。在不同实施方案中，调节可以是增加或增强，或者可以是减少或减弱。测量靶多核苷酸或靶多肽的表达水平的方法在本领域中是已知的且可得的，并且包括例如使用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫组织化学技术的方法。在具体的实施方案中，与适当的对照值相比，可增加或减少靶多核苷酸或靶多肽的表达水平至少10％、20％、30％、40％、50％或大于50％。例如，如果期望多肽的表达增加，核酸可以是含有编码期望多肽的多核苷酸的表达载体。在另一方面，如果期望多核苷酸或多肽的表达减少，那么核酸可以是例如反义寡核苷酸、siRNA或微RNA，它们含有与编码靶多肽的多核苷酸特异性地杂交从而破坏靶多核苷酸或靶多肽的表达的多核苷酸序列。可选地，核酸可以是表达这种反义寡核苷酸、siRNA或微RNA的质粒。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种通过细胞调节多肽的表达的方法，包括将由或基本上由式(I)阳离子脂质(例如，式(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的脂质)、中性脂质、甾醇、PEG修饰的脂质中的PEG构成(例如，按摩尔比计约35-65％的式(I)阳离子脂质、3-12％的中性脂质、15-45％的甾醇和0.5-10％的PEG或PEG修饰的脂质)组成的脂质颗粒提供给细胞，其中脂质颗粒与能调节多肽表达的核酸缔合。在具体的实施方案中，摩尔脂质比例为大约60/7.5/31/1.5或者57.5/7.5/31.5/3.5(mol％脂质I/DSPC/胆固醇/PEG-DMG)。在具体的实施方案中，摩尔比为大约50/10/38.5/1.5(mol％脂质V/DSPC/胆固醇/PEG-DMG)或大约50/10/38.5/1.5(mol％脂质VI/DSPC/胆固醇/PEG-DSG)。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被DPPC、POPC、DOPE或SM替换。在另一组实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质为PEG-DSG。
在具体的实施方案中，治疗剂选自siRNA、微RNA、反义寡核苷酸和能表达siRNA、微RNA、反义寡核苷酸的质粒，且其中所述的siRNA、微RNA或反义RNA包括与编码多肽的多核苷酸特异性地结合的多核苷酸或其互补序列，以使得减少多肽的表达。
在其他的实施方案中，核酸是编码多肽或其功能性变体或片段的质粒，以使得多肽或其功能性变体或片段的表达增加。
在相关的实施方案中，本发明提供治疗受治疗者中以多肽的过表达为特征的疾病或疾患的方法，所述方法包括对受治疗者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂选自siRNA、微RNA、反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA、微RNA或反义RNA包括与编码多肽的多核苷酸特异性地结合的多核苷酸或其互补序列。
在一个实施方案中，药物组合物包括由或基本上由脂质A、DSPC、胆固醇以及PEG-DMG、PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成的脂质颗粒，例如按摩尔比计约35-65％的式(I)阳离子脂质(例如式(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的脂质)、3-12％的中性脂质、15-45％的甾醇和0.5-10％的PEG或PEG修饰的脂质PEG-DMG、PEG-C-DOMG或PEG-DMA，其中脂质颗粒与治疗性核酸缔合。在具体的实施方案中，摩尔脂质比例为大约60/7.5/31/1.5或者57.5/7.5/31.5/3.5(mol％脂质I/DSPC/胆固醇/PEG-DMG)。在具体的实施方案中，摩尔比为大约50/10/38.5/1.5(mol％脂质V/DSPC/胆固醇/PEG-DMG)或大约50/10/38.5/1.5(mol％脂质VI/DSPC/胆固醇/PEG-DSG)。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被DPPC、POPC、DOPE或SM替换。在另一组实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质为PEG-DSG。
在另一个相关的实施方案中，本发明包括治疗受治疗者中以多肽的表达不足为特征的疾病或疾患的方法，所述方法包括对受治疗者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂是编码多肽或者其功能性变体或片段的质粒。
本发明进一步提供诱导受治疗者的免疫反应的方法，所述方法包括对受治疗者提供本发明的药物组合物，其中治疗剂为免疫刺激性寡核苷酸。在某些实施方案中，免疫反应为体液或粘膜免疫反应，由或基本上由脂质A、DSPC、胆固醇以及PEG-DMG、PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成，例如按摩尔比计约35-65％的式(I)阳离子脂质(例如式(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的脂质)、3-12％的中性脂质、15-45％的甾醇和0.5-10％的PEG或PEG修饰的脂质PEG-DMG、PEG-C-DOMG或PEG-DMA，其中脂质颗粒与治疗性核酸缔合。在具体的实施方案中，摩尔脂质比例为大约60/7.5/31/1.5或者57.5/7.5/31.5/3.5(mol％脂质I/DSPC/胆固醇/PEG-DMG)。在具体的实施方案中，摩尔比为大约50/10/38.5/1.5(mol％脂质V/DSPC/胆固醇/PEG-DMG)或大约50/10/38.5/1.5(mol％脂质VI/DSPC/胆固醇/PEG-DSG)。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被DPPC、POPC、DOPE或SM替换。在另一组实施方案中，PEG或PEG修饰的脂质为PEG-DSG。
在进一步的实施方案中，将药物组合物与疫苗或抗原一起提供给受治疗者。因此，本发明自身提供包括本发明脂质颗粒的疫苗，所述脂质颗粒含有免疫刺激寡核苷酸并且还与对其期望免疫反应的抗原缔合。在具体的实施方案中，抗原是肿瘤抗原或者与传染剂(例如病毒、细菌或寄生虫)相关。
各种肿瘤抗原、传染剂抗原以及与其他疾病相关的抗原是本领域中熟知的，并且这些抗原的实例描述于本文所引用的参考文献中。适合用于本发明的抗原的实例包括但不限于多肽抗原和DNA抗原。抗原的具体实例是甲型肝炎、乙型肝炎、天花、脊髓灰质炎、炭疽、流感、斑疹伤寒、破伤风、麻疹、轮状病毒、白喉、百日咳、结核病和风疹的抗原。在一个实施方案中，抗原是乙型肝炎重组抗原。在其他方面，抗原是甲型肝炎重组抗原。在另一方面，抗原是肿瘤抗原。这种肿瘤相关抗原的实例是MUC-1、EBV抗原和与伯基特淋巴瘤相关的抗原。在另一个方面，抗原是酪氨酸酶相关的蛋白肿瘤抗原的重组抗原。本领域技术人员知道适合用于本发明的其他抗原。
适合用于本发明的肿瘤相关的抗原包括突变的分子和未突变的分子，其可能指示单肿瘤类型，在几种肿瘤类型中共享和/或与正常细胞相比在肿瘤细胞中被唯一地表达或过表达。除了蛋白质和糖蛋白之外，还已经记载了碳水化合物、神经节苷酯、糖脂和粘蛋白的肿瘤特异性模式的表达。用于受试癌症疫苗的示例性的肿瘤相关抗原包括致癌基因、肿瘤抑制基因和含有对肿瘤细胞独特的突变或重排的其他基因的蛋白产物，重新活化的胚胎基因产物、癌胚抗原、组织特异性(但非肿瘤特异性)分化抗原、生长因子受体、细胞表面碳水化合物残基、外来病毒蛋白和若干其他自体蛋白(selfprotein)。
肿瘤相关抗原的具体实施方案包括例如：突变的抗原如Rasp21原癌基因、肿瘤抑制因子p53和BCR-ab1致癌基因的蛋白产物，以及CDK4、MUM1、半胱天冬酶8和β连环蛋白；过表达的抗原如半乳凝素4、半乳凝素9、碳酸酐酶、醛缩酶A、PRAME、Her2/neu、ErbB-2和KSA，癌胚抗原如α胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)；自体抗原如癌胚抗原(CEA)和黑色素细胞分化抗原如Mart1/MelanA、gp100、gp75、酪氨酸酶、TRP1和TRP2；前列腺相关抗原如PSA、PAP、PSMA、PSM-P1和PSM-P2；重新活化的胚胎基因产物如MAGE1、MAGE3、MAGE4、GAGE1、GAGE2、BAGE、RAGE，以及其他癌症睾丸抗原如NY-ESO1、SSX2和SCP1；粘蛋白如Muc-1和Muc-2；神经节苷脂如GM2、GD2和GD3，中性糖脂和糖蛋白如Lewis(y)和globo-H；以及糖蛋白如Tn、Thompson-Freidenreich抗原(TF)和sTn。本文中还包括的肿瘤相关抗原为全细胞和肿瘤细胞的溶解产物及其免疫原性部分，以及为了抗B细胞淋巴瘤使用的表达在B淋巴细胞的单克隆增殖物上的免疫球蛋白独特型。
病原体包括但不限于传染剂，例如感染哺乳动物并且更特别地感染人的病毒。传染性病毒的实例包括但不限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒如HIV-1(也称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III)；和其他分离物如HIV-LP；微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如导致胃肠炎的菌株)；披盖病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviradae)(例如水泡性口膜炎病毒、狂犬病毒)；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒、bunga病毒、静脉病毒和内罗病毒(Nairovirus))；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科(Birnaviridae)；肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；微小病毒科(Parvovirida)(微小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)，单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；以及虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原因子、丁型肝炎的因子(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷性卫星病毒)、非甲型肝炎、非乙型肝炎的因子(第1类＝内部传递的；第2类＝肠胃外传递的(即丙型肝炎)；诺瓦克病毒和相关病毒，以及星状病毒)。
并且，革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌在脊椎动物中作为抗原起作用。这种革兰氏阳性细菌包括但不限于巴斯德氏菌属物种、葡萄球菌物种和链球菌属物种。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、假单胞菌属物种和沙门氏菌属物种。传染性细菌的具体实例包括但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacterpyloris)、博氏疏螺旋体(Boreliaburgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophilia)、分枝杆菌属(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登氏分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、单核细胞增多性李氏菌(Listeriamonocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)、链球菌(草绿色组)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、牛链球菌(Streptococcusbovis)、链球菌属(厌氧种)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、病原性弯曲杆菌属某种(Campylobactersp.)、肠道球菌属某种(Enterococcussp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfuenzae)、炭疽杆菌(Bacillusantracis)、白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、棒状杆菌属(corynebacteriumsp.)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringers)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、多杀巴斯德氏菌(Pasturellamultocida)、类杆菌属(Bacteroidessp.)、具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)、苍白密螺旋体(Treponemapallidium)、细弱密螺旋体(Treponemapertenue)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次氏体(Rickettsia)和衣氏放线菌(Actinomycesisraelli)。
病原体的另外的实例包括但不限于感染哺乳动物并且更特别地感染人的传染性真菌。传染性真菌的实例包括但不限于：新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、白色念球菌(Candidaalbicans)。传染性寄生虫的实例包括疟原虫属例如镰状疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)和间日疟原虫(Plasmodiumvivax)。其他传染性生物体(例如原生生物)包括鼠弓形体(Toxoplasmagondii)。
药物组合物
在一个实施方案中，本发明提供包含通过本文所述的肝脏筛选模型鉴别的核酸剂的药物组合物。该组合物包括试剂(例如dsRNA)和药学上可接受的载体。药物组合物可用于治疗与基因活性的表达相关的疾病或疾患。可基于递送的方式来配制这种药物组合物。一个实例是将组合物配制成通过肠胃外递送进行全身施用。
以足够抑制靶基因(例如因子VII基因)表达的剂量施用包括鉴定的试剂的药物组合物。通常，dsRNA剂的合适剂量范围为每天0.01～5.0mg/kg受体体重，通常为每天1μg～1mg/kg体重。药物组合物可以每天施用一次，或者dsRNA可以在一天内以适当的间隔分两个、三个或多个亚剂量施用，或者甚至通过连续输注或通过控释制剂递送施用。在这种情况下，每个亚剂量中所包含的dsRNA必须相应较少以达到每天的总剂量。也可将剂量单位组合以用于数天的施用，例如使用常规持续释放制剂以在数天内提供dsRNA的持续释放。持续释放制剂是本领域所熟知的，且特别适于试剂的鞘的递送，例如可与本发明的试剂一起使用。在这个实施方案中，剂量单位包含相应的每日剂量的倍数。
本领域技术人员可领会到某些因素可能会影响有效治疗受治疗者所需的剂量和时间，该因素包括但不限于疾病或疾患的严重性、先期治疗、受治疗者的综合健康状况和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，使用治疗有效量的组合物对受治疗者进行的治疗可包括单次治疗或一系列治疗。如本文其他部分所述，可以使用常规方法或使用合适的动物模型在体内检测的基础上评估本发明包含的单个dsRNA的有效量和体内半衰期。
在具体的实施方案中，根据标准技术制备包括本发明的脂质-核酸颗粒的药物组合物，并且所述组合物还包括药学上可接受的载体。通常，可将生理盐水作为药学上可接受的载体。其他适合的载体包括例如水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸等，包括用于增强稳定性的糖蛋白(例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等)。在包括含有盐水或其他盐的载体的组合物中，优选在脂质颗粒形成之后加入载体。因此，在脂质-核酸组合物形成之后，可将所述组合物稀释到药学上可接受的载体(如生理盐水)中。
可通过传统、熟知的灭菌技术将所得的药物制剂灭菌。然后将水溶液包装使用，或在无菌条件下过滤并冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水溶液组合。为了接近生理条件，组合物可含有药学上可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂、张力调节剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。另外，脂质悬浮液可包括保护脂质在储存中免受自由基和脂质过氧化的损害的脂质保护剂。亲脂性自由基淬灭剂(例如α-生育酚)和水溶性铁特异性螯合剂(如铁氧胺(ferrioxamine))是适合的。
药物组合物中的脂质颗粒或脂质-核酸颗粒的浓度可广泛地改变，即按重量计从少于约0.01％，通常为约0.05-5％或至少约0.05-5％到多达10至30％，并且主要通过液体体积、粘度等根据所选的特定施用方式来进行选择。例如，可增加浓度以降低与治疗相关的流体载荷。这可能是患有动脉粥样硬化相关的充血性心力衰竭或严重的高血压的患者特别期望的。可选地，可将刺激性脂质组成的复合物稀释至低浓度以减轻施用部位的炎症。在一组实施方案中，核酸具有连接的标记并且用于诊断(通过指出互补核酸的存在)。在该情况下，所施用的复合物的量将取决于所使用的具体标记、被诊断的疾病状态和临床医师的判断，但是通常是在约0.01mg每公斤体重至约50mg每公斤体重之间，优选在约0.15mg/kg体重至约5mg/kg体重之间。
如上所述，本发明的脂质治疗剂(例如核酸)颗粒可包括聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂、PEG-神经酰胺或神经节苷酯GM1修饰的脂质或能有效防止或限制聚集的其他脂质。这类组分的加入不仅仅防止复合物聚集。相反地，它还可提供增加循环寿命和增加脂质-核酸组合物向靶组织的递送的方法。
本发明还提供试剂盒形式的脂质-治疗剂组合物。所述试剂盒通常由被分隔以容纳试剂盒各种元件的容器所组成。所述试剂盒含有优选地处于脱水或浓缩形式的本发明的颗粒或药物组合物，以及它们再水化或稀释和施用的说明书。在某些实施方案中，所述颗粒包含活性剂，而在其他实施方案中，所述颗粒不包含活性剂。
含有被肝脏筛选模型鉴别的试剂的药物组合物可通过若干方法施用，这取决于是局部治疗还是全身治疗以及治疗的面积。可以是局部施用、肺部施用(例如通过粉剂或气雾剂的吸入或吹入，包括使用喷雾器)；气管内的、鼻内的、表皮的和透皮)、口服施用或肠胃外施用。还可设计施用使得通过局部递送选择定位到特定组织，例如，通过直接关节内注射到关节、通过直肠施用直接递送到消化道和肠、通过阴道内施用递送到子宫颈和阴道、通过玻璃体内施用递送到眼睛。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、关节内、皮下、腹膜内或肌肉注射或输注；或者颅内(例如鞘内)或心室内施用。
用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液剂和粉剂。常见的药物载体(液态、粉状或油性基质，增稠剂等)是需要或是可用的。还可使用有涂层的避孕套、手套等。优选的局部制剂包括含有本发明的dsRNA和局部递送组分(例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂或表面活性剂)的混合物。优选的脂质和脂质体包括中性的(例如二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如二油酰四甲基氨丙基DOTAP和二油酰磷酸酰乙醇胺DOTMA)。本发明的DsRNA可封装入脂质体(特别是阳离子脂质体)中或形成其复合物。可选地，DsRNA与脂质(特别是阳离子)脂质复合。油酸单甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、月桂氮酮、酰基肉碱、酰基胆碱，或C1-10烷基酯(例如肉豆蔻酸异丙酯(isopropylmyristate)IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部的制剂详细地描述于1999年5月20日提交的美国专利申请No.09/315,298，该专利通过引用整体并入本文。
用于口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒、微粒、纳米颗粒、水悬浮液或水溶液或非水介质、凝胶胶囊、囊剂(sachet)、片剂或迷你片。增稠剂、增味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘结剂是可取的。优选的口服制剂为将本发明的dsRNA与一种或多种穿透促进剂、表面活性剂和螯合剂结合施用的那些制剂。优选的表面活性剂包括脂肪酸和/或脂肪酸酯或其盐、胆汁酸和/或其盐。优选的胆汁酸/盐包括鹅去氧胆酸(CDCA)和熊去氧胆酸(UDCA)、胆酸、去氢胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、甘醇酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺胆酸，牛磺脱氧胆酸、牛磺-24，25-二氢-夫西地酸钠以及甘氨二氢夫西地酸钠(sodiumglycodihydrofusidate)。优选的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、油酸单甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠盐)。还可组合渗透促进剂，例如，脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。特别优选的组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。该穿透促进剂可进一步地包括聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-20-十六醚。本发明的sRNA以包括喷雾干燥颗粒或者复合形成微粒或纳米颗粒的方式进行口服递送。DsRNA复合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯、聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙烯醚(polyoxethane)、聚烷基氰基丙烯酸酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯(polyalkylcyanoacrylate)；DEAE衍生的聚亚胺、短梗霉多糖、纤维素和淀粉。特别优选的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚(L-赖氨酸)、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨苯乙烯(例如p-氨基)、聚氰基丙烯酸甲酯、聚氰基丙烯酸乙酯、聚氰基丙烯酸丁酯、聚氰基丙烯酸异丁酯、聚氰基丙烯酸异己酯、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酸己酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-右旋糖酐、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D，L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，藻酸盐以及聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制剂及其制备详细描述于美国申请No.08/886,829(1997年7月1日提交)、No.09/108,673(1998年7月1日提交)、No.09/256,515(1999年2月23日提交)、No.09/082,624(1998年5月21日提交)和No.09/315,298(1999年5月20日提交)中，所述每篇申请通过引用整体并入本文。
用于肠胃外、鞘内或或心室内施用的组合物和制剂可包括无菌水溶液(可能还含有缓冲剂、稀释剂和其他适合的添加剂)，所述添加剂例如但不限于渗透促进剂、载体组分和其他的药学上可接受的载体或赋形剂)。
药物组合物包括但不限于溶液、乳液和含有脂质体的组合物。这些组合物可由多种组分(包括但不限于预形成的液体、自乳化固体和自乳化半固体)生成。
通过制药业熟知的常规技术可制得可适宜地以单位剂型存在的药物组合物。此类技术包括将活性成分与药用载体或赋形剂结合的步骤。通常，将活性成分与液体载体或细粒固体载体或两者兼有进行均匀地且紧密地结合，然后，如果必要的话，可产品成型，从而制得组合物。
所述组合物可配制成许多可能的剂型(例如但不限于片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂、栓剂和灌肠剂)中的任一种。本发明的组合物还可在水性、非水性或混合型介质中配制成混悬剂。水性混悬剂可进一步含有增加混悬液粘度的物质(例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或右旋糖酐)。所述的混悬液还可含有稳定剂。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物可配制成泡沫剂并且用作泡沫剂，药物泡沫剂包括例如但不限于乳液、微乳液、霜剂、凝胶和脂质体。虽然在性质上基本相似，但是这些制剂在组分和最终产品的一致性上不同。这些组合物和制剂的制品通常为制药和制剂领域的技术人员所熟知，且可用在本发明的组合物的制剂上。
本发明并不限于以下描述中列举的组分的详细构成和排列。本发明能有其他的实施方案或者以不同的方式实施或实现。另外，本文所用的短语和术语是为了描述且不能当做限制。使用″包括(including)″、″包含(comprising)″或″具有(having)″、″含有(containing)″、″包括(involving)″及其变型意指不但包含其后所列的物料及其等同物，而且包含其它物料。
实施例
以下实施例只用来说明而非限制所要求保护的发明。
实施例1：体内啮齿动物因子VII沉默实验C57BL/6小鼠(CharlesRiverLabs，MA)和Sprague-Dawley大鼠(CharlesRiverLabs，MA)通过体积为0.01mL/g的尾静脉注射接受盐水或配制的siRNA。在施用后的各时间点上，通过眶后取血采集血清样品。使用显色测定法(BiophenFVII，AniaraCorporation，OH)测定样品中的因子VII蛋白的血清水平。将动物处死且收集肝脏并将其在液氮中速冻以测定因子VII的肝脏mRNA水平。用冷冻的肝脏组织制备组织溶解产物并使用分支DNA测定法(QuantiGeneAssay，Panomics，CA)来定量因子VII的肝脏mRNA水平。
实施例2：使用核酸-脂质颗粒调节哺乳动物基因表达
因子VII(FVII)是凝血级联系统中的重要蛋白质，在肝脏(肝细胞)中合成并分泌到血浆中。可通过简单的基于板的比色法测定血浆中的FVII水平。就其本身而言，FVII代表用于测定siRNA介导的肝细胞衍生的蛋白质下调的简便模型，还监测核酸脂质颗粒和siRNA的血浆浓度以及组织分布。
小鼠中的因子VII降低
在将C57BL/6小鼠静脉(大丸剂)注射24小时后在FVIIsiRNA治疗的动物中评估FVII活性。通过商购的用于测定血清或组织中的蛋白质水平的试剂盒按照制造商的说明书以微板规模测量FVII。相对于未治疗的对照小鼠的测定FVII的减少，并且结果表示为％残余FVII。在每个新型的脂质体组合物的初始筛选中使用四种剂量水平(2、5、12.5、25mg/kgFVIIsiRNA)，基于初始筛选所得结果在后续研究中加大此剂量。
耐受性的测量
通过监测重量变化、笼边观察、临床化学以及在某些情况下的血液学来评估每个新型脂质体siRNA组合物的耐受性。在治疗之前和治疗之后24小时记录动物的重量。数据可记为％体重变化。除了体重测量，使用等分的为FVII分析采集的血浆注射后24小时得到每个剂量水平(2、5、12.5和25mg/kgsiRNA)的完整的包括肝功能标记的临床化学图。样品被送至兽医中心实验室(Langley，BC)进行分析。在某些情况下，治疗组中可包括另外的小鼠以采集全血供血液学分析。
治疗指数的测定
治疗指数(TI)为通过比较毒性和活性的测量值得到的任意参数。对于这些研究，TI被定为：
TI＝MTD(最大耐受剂量)/ED50(50％FVII降低的剂量)
对于这些研究，MTD设定为引起体重降低大于7％且丙氨酸转氨酶(ALT)中增加大于200倍的最低剂量，该ALT为对于啮齿动物的肝脏损害具有良好特异性的临床化学标记。所述的ED50从FVII剂量-活性曲线中测得。
实施例3：用于挤出法的一般规程
脂质(脂质(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)：DSPC∶胆固醇∶DMG-PEG)根据期望的摩尔比例在乙醇中溶解和混合。通过乙醇注入法形成脂质体，其中混合后的脂质加至pH值为5.2的乙酸钠缓冲液。这导致脂质体在35％乙醇中自发形成。所述脂质体至少两次通过0.08μm的聚碳酸酯膜挤出。在乙酸钠和35％乙醇中配制备用的siRNA溶液，然后加至脂质体中负载。该siRNA-脂质体溶液于37℃下孵育30分钟，随后进行稀释。通过透析或切向流过滤将乙醇除去并换成PBS缓冲液。
实施例4：线上搅拌法的一般规程
制备单个和分离的备用溶液-一个含有脂质，另一个含有siRNA。备用的脂质中含有脂质(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)。通过在90％乙醇中溶解制备得到DSPC∶胆固醇∶PEG脂质。余下的10％为低pH的柠檬酸盐缓冲液。备用脂质的浓度为4mg/mL。柠檬酸盐缓冲液的pH值介于pH3-5范围之间，这取决于所用融合的脂质的类型。siRNA也可以4mg/mL的浓度溶解于柠檬酸盐缓冲液中。对于小规模，制备每个5mL的备用液配。
备用液可完全透明，且脂质在与siRNA组合之前必须完全溶解。因此，可加热备用液以使得脂质完全溶解。此过程中使用的siRNA可为未修饰的寡核苷酸或修饰的寡核苷酸，并且可与亲脂性部分(例如胆固醇)缀合。
通过将每个备用液泵送到T形接头来混合单个的备用液。使用双头Watson-Marlow泵来同时控制这两个流的启动和停止。1.6mm的聚丙烯管缩小尺寸为0.8mm管以增大线性流速。将聚丙烯管线(内径＝0.8mm)装在T形接头的任何一边。聚丙烯T的直线边缘(linearedge)为1.6mm以使合成量为4.1mm3。将聚丙烯管线的每个大的端部(1.6mm)放进具有溶解的备用脂质或是溶解的siRNA的试管中。将单管装在在T形接头之后组合后的水流流出的位置上。所述管然后延伸至具有两倍PBS体积的容器。将PBS快速搅拌。所述泵的流速设为300rpm或110mL/min。通过透析将乙醇除去并换成PBS。然后使用离心分离或渗滤将脂质组合物浓缩至合适的工作浓度。
实施例5：具有不同脂质比例的组合物的效力
如下表所示测试不同的脂质比例。该脂质包括脂质T(″T″)、胆固醇(″C″)和PEG-脂质(PEG-DMG)。组分相关的摩尔百分比列于下表。因此，″T50-C40-P10″包括50mol％的脂质T、40mol％的胆固醇和10mol％的PEG-DMG。
所用的双链体siRNA为靶向因子VII基因(FVII)的AD-1661：
实验方案
动物C57BL/6
总数57
siRNA1661
结果(图1)
实施例6：线上混合的组合物在小鼠中的效力
实验方案
动物C57BL/6
总数21
SiRNA1661
结果(图2)
实施例7：具有不同的脂质体组合物的线上混合(IL)的组合物在小鼠中的效 力
实验方案
动物C57BL/6
总数39
siRNA1661
结果(图3)
实施例8：具有不同PEG和中性脂质的IL组合物在小鼠中的效力
对修饰PEG的链长或中性脂质的效果进行检测。对于中性脂质而言，测试DOPC(二油酰磷脂酰胆碱)或DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)。也对1.5mol％的具有C10或C18链长的mPEG2000缀合的脂质进行测试。在下述对″IL″的说明中，使用线上混合法产生颗粒。
实验方案
动物C57BL/6
总数57
siRNA1661
结果：(图4)
实施例9：AF12在小鼠中的剂量反应
C57BL/6小鼠(CharlesRiverLabs，MA)和Sprague-Dawley大鼠(CharlesRiverLabs，MA)通过体积为0.01mL/g的尾静脉注射接受盐水或配制的siRNA。在施用后的各时间点上，通过眶后取血采集血清样品。使用显色测定法(BiophenFVII，AniaraCorporation，OH)测定样品中的因子VII蛋白的血清水平。将动物处死并且收集肝脏并将其在液氮中速冻以测定因子VII的肝脏mRNA水平。用冷冻的肝脏组织制备组织溶解产物并使用分支DNA测定(QuantiGeneAssay，Panomics，CA)来量化因子VII的肝脏mRNA水平。
用包含不同浓度的AF12的脂质体组合物进行体内实验。使用标准因子VII(FVII)双链体siRNA1661测试剂量为0.001mg/kg至0.3mg/kg的AF12的剂量反应。这些结果与图6中所示的荧光素酶对照(双链体1955)进行对比。实验中每个基因型为5个动物，八组一共40个。如图6所示，脂质体组合物剂量的增大通常会造成FVII降低量的增加。
实验方案
动物C57BL6
总数40
实施例10：AF12脂质体组合物在ApoE敲除小鼠中的效力
为了进一步检测不同的AF12脂质体组合物对ApoE的影响，可施用不同浓度的含有AD-1661siRNA组合物的AF12脂质体组合物。
用包含ApoE或N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)缀合的脂质的脂质体组合物进行体内实验。选择GalNAc作为合适的靶向配体是因为已知GalNAc受体能在肝脏中高表达。因此使用基本上描述于实施例6中的C57BL/6和ApoE敲除小鼠进行研究以测试AF12制剂的效力，该AF12制剂可进一步包含不同浓度的GalNAc3-PEG-DSG脂质。在所有的实验中，PEG缀合的脂质的总量保持不变(例如，当添加0.5mol％的GalNAc3-PEG时，PEG-DMG相应量减少0.5mol％以保持PEG-脂质的总量为1.5mol％)。如图7所示，将ApoE加至脂质体组合物对于含有AF12的脂质体组合物的剂量反应几乎没有任何效果。含有GalNAc3的组合物对降低FVII似乎略有效。
实施方案
动物ApoE敲除小鼠
总数39
实施例11：AF12在WT和ApoE小鼠以及在WT和LDLR敲除小鼠中测试
评估这些脂质体组合物在LDLR(LDL受体)缺失小鼠中的效力以检测不同的AF脂质体组合物的ApoE依赖性。脂质体组合物在LDLR缺失小鼠中的效力减弱将显示ApoE依赖性。包含AD-1661siRNA组合物的AF12脂质体组合物以如下所述的不同浓度施用在野生型和LDLR敲除小鼠上。接受PBS的第一组作为阴性对照。
图8描述了结果，该结果与在LDLR(LDL受体)缺失小鼠中增大的效力类似，表明这些脂质体组合物并不是ApoE依赖的。
实施例12：ApoE或GalNAc脂质对AF12在ApoE缺失小鼠中效力的作用
在下述的ApoE或GalNAc靶向脂质的存在下施用不同浓度的AF12以检测 AF12组合物对ApoE缺失小鼠的作用。
实施方案
动物ApoE敲除小鼠
总数45
如表9a和9b所示，可观察到脂质体组合物在ApoE敲除小鼠和野生型小鼠 上几乎没有任何区别。这可从包含ApoE的脂质体组合物和包含GalNAc3的组 合物中观察到。图9a描述了在ApoE敲除小鼠中的剂量反应，而图9b描述了在 野生型小鼠中的剂量反应。
实施例13：用包含脂质T的制剂的Tie2沉默
选择内皮特定标记(TEK酪氨酸激酶)以测试使用本文的制剂进行的核酸的 递送。用AF-012或AF-011配制靶向Tie2或荧光素酶(″Luc″)的具有以下序列的双链体siRNAAD-27430。
双链体名称 靶 链 寡核苷酸名称 寡核苷酸序列
AD-27430.1 TEK 有义链 A-62836.1 GAAGAuGcAGuGAuuuAcAdTsdT
TEK 反义链 A-62837.1 UGuAAAUcACUGcAUCUUCdTsdT
缩写表示用在核苷酸序列中的核苷酸单体。应理解当在寡核苷酸中存在时，这些单体通过5′-3′-磷酸二酯键相互连接。
缩写 核苷酸
A 腺苷
C 胞苷
G 鸟苷
T 胸苷
U 尿苷
N 任一核苷酸(G、A、C、T或U)
缩写 核苷酸
a 2′-O-甲基腺苷
c 2′-O-甲基胞苷
g 2′-O-甲基鸟苷
u 2′-O-甲基尿苷
dT 2′-脱氧胸苷
s 硫代磷酸键
根据下述的“高剂量”或“低剂量”方案给小鼠施用制剂。
在高剂量方案中，将表中所述的两倍剂量的PBS、脂质配制的靶向Tie2的siRNA或脂质配制的靶向荧光素酶(n＝5/组)的siRNA施用于小鼠。
预治疗/高剂量(两次注射)
在“低剂量”实验中，下表所列的单剂量脂质配制的靶向Tie2(N＝4)的siRNA或脂质配制的靶向荧光素酶(n＝1仅对AF-012)的siRNA施用于小鼠。
低剂量(单次注射)
如下表所示，AF-012配制的siRNA导致不同的血管床(包括肝脏、肺、心脏和肾脏)中内皮细胞的有效沉默。观察到不含有脂质T的AF-011制剂没有沉默。
高剂量实验结果
归一化到GAPDH、VE-钙粘着蛋白或VEGFR-2的Tie2的mRNA水平
高剂量 Tie2/GAPDH Tie2/VE-钙粘着 Tie2/VEGFR- 平均
2
肝脏 71％(78％) 78％(85％) 88％(82％) 78％
肺 ND 50％ 42％ 46％
骨骼肌* (58％) ND ND (58％)
心脏 76％ 69％ 74％ 73％
肾脏 40％ (65％) ND 52％
下丘脑 0％
低剂量实验结果
结果概括于图10A-15。图10A到10C显示了与GAPDH(图10A)、VEFG受体2(VEGFR2)(图10B)和Ve-钙粘着蛋白(图10C)表达相比，在心脏中Tie2表达的降低(KD)。当siRNA用AF-012制剂包裹时，Tie2siRNA仅沉默Tie2，而当siRNA用AF-011制剂包裹时，Tie2siRNA不沉默Tie2。
图11A、11B和12A显示用AF-012(图11A和12A)而非AF-011(表11B)配制的siRNA在肝脏中Tie2表达的降低(KD)。高剂量表示为2.0(这些治疗接受0.6mg/kg和2.0mg/kg)；低剂量表示为0.6(接受0.6mg/kg)。
也观察到响应于Tie2siRNA的施用，肝脏中的VEGFR2表达增加(图12B)。
图13A和13B显示用AF-012配制的siRNA在肺中的Tie2表达的降低。将Tie2表达与VE-钙粘着蛋白(图13A)表达和VEGFR-2(图13B)表达相比较。图14A和14B显示了当用AF-012而非用AF-011配制siRNA时，siRNA分别在肾脏和骨骼肌中的Tie2表达的降低。
图15显示了当用AF-012或AF-011配制siRNA时，在下丘脑中Tie2siRNA没有降低基因表达。
这些结果表明包含脂质T的脂质体特别适合于在内皮组织中被靶向使得基因沉默的siRNA。
进行分别单独的剂量反应实验。简言之，7组C57Bl6雌性小鼠(每组5个)施用0.25mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg和0.6mg/kg(减少Day-1)+2.0mg/kg(Day0)。72小时后收集组织和器官并且在这些组织中测量Tie2水平。图16A和16B显示了Tie2表达分别在肝脏和骨骼肌中的剂量依赖性降低。图17A和17B显示Tie2表达分别在脾脏和心脏中的剂量依赖性降低。图18A和18B显示不同剂量下Tie2表达分别在肾脏和脂肪组织中的降低。
实施例14：脂质组合物与多种不同的siRNA的组合
由于本文的制剂给予了相对宽的治疗窗，对通过静脉注射沉默肝脏中的多基因的可能性做了测试。可以想象调节多基因的能力给已经证实为多基因靶的疾病提供一条强大的治疗途径。为了了解这条途径的可能性，可集中并通过含有TechG1脂质的颗粒配制对抗可能有治疗学兴趣的肝脏靶的siRNA序列、因子VII、ApoB、PCSK9、Xbp1、SORT1、TTR1、TTC39B、ITGb1、ApoC3和Rab5c。
在多种基因沉默的研究中，对因子VII、ApoB、PCSK9、Xbp1、SORT1、TTR1、TTC39B、ITGb1、ApoC3和Rab5c在从小鼠中收集的肝脏中的mRNA水平进行评估，该小鼠被施用了包含了一批十个siRNA的制剂或在含有TechG1脂质的制剂中的靶向荧光素酶的对照的不相关的siRNA。脂质颗粒(AF12)包括了如下的组分(按摩尔％计)：TechG1∶DSPC∶胆固醇∶PEG-DMG(50摩尔％∶10摩尔％∶38.5摩尔％∶1.5摩尔％)，该组分以脂质∶siRNA为约11的比例配制。
在对小鼠以每个siRNA为0.1mg/kg的剂量进行单尾静脉注射后48小时，分析这些靶基因表达的mRNA水平。简单地说，将冷冻的肝脏组织研磨并且制备组织溶解产物。使用分支DNA测定法(QuantiGeneReagentSystem，Panomics)来测量溶解产物中的被归一化为GAPDH的这些基因的mRNA水平。在归一化到用相同的但含有荧光素酶对照的siRNA的制剂治疗的小鼠的相应的靶/GAPDH水平之后，测量用本文的一批十个siRNA治疗过的小鼠的靶/GAPDH水平。研究剂量为0.1mg/kg每个siRNA的沉默效果。当剂量为0.1mg/kg每个siRNA(1mg/kgsiRNA总量)(图5)时，可观察到所有十个基因明显沉默。
如本文所示，所有十个基因的同时沉默说明了第一次包含相似或相异的信号途径的多基因可用单一药物产品的单独施用进行调节。例如，肝脏中的几个不同的靶的同时沉默可提供新的治疗可能牵涉多种基因和途径的多因素疾病(例如代谢综合症、癌症或传染病)策略。据我们所知，这是体内十个肝脏靶的siRNA介导的沉默同时发生的第一篇报导。考虑到使用本文的脂质递送的效价，可以假设通过组合siRNA产品，甚至更多的基因可能会同时沉默。从治疗的立场上，这使得更多复杂的能使多种靶获得增强治疗效果的治疗途径成为可能。例如，这种策略可能会对治疗病毒性感染(如丙型肝炎)特别有用，其中快速进化的病毒基因组对于靶向病毒基因组单位点的单个siRNA来说是难以找到的。这种多靶的途径还证实对低密度脂蛋白水平的调节以及会牵涉多基因的疾病(如癌症)的治疗有用。
照此而论，本文公开了包括多于一种核酸组合物(例如siRNA)的脂质组合物。在一些实施方案中，该脂质组合物包括两种或更多种不同的核酸组合物。在一些实施方案中，该脂质组合物包括五种或更多种不同的核酸组合物。在一些实施方案中，该脂质组合物包括十种或更多种不同的核酸组合物。在一些实施方案中，该脂质组合物包括二十种或更多种不同的核酸组合物。不同的核酸组合物可靶向相同的靶基因。在另一个实施方案中，不同的核酸组合物可靶向不同的靶基因。该靶基因可为相同生物途径(例如，免疫反应如抗病毒反应、细胞凋亡、胆固醇代谢)的组分或相异生物途径的组分。该靶基因可包括不来自受治疗者的基因(例如病毒基因)。在一个实施方案中，该脂质组合物包括本文的至少一种阳离子脂质。该脂质组合物可进一步包括PEG-脂质或PEG修饰的脂质。在另一个实施方案中，该脂质组合物可进一步包括甾醇(例如，胆固醇)。在另一个实施方案中该脂质组合物可进一步包括中性脂质。
在如此说明本发明至少一个实施方案的数个方面的情况下，应当理解，本领域技术人员容易想到各种改变、修改和改进。这些改变、修改和改进将作为本发明公开的一部分，并且在本发明的精神和范围之内。相应地，上述描述仅作为例子。

Claims (28)

1.一种脂质组合物，包括甾醇、中性脂质、PEG或PEG修饰的脂质以及式(V)脂质，
其中所述甾醇为胆固醇。
2.如权利要求1所述的脂质组合物，其中式(V)化合物为其无机或有机盐。
3.如权利要求1所述的脂质组合物，其中式(V)化合物为其氢卤酸盐。
4.如权利要求1所述的脂质组合物，其中式(V)化合物为其氢氯酸盐。
5.如权利要求1所述的脂质组合物，其中式(V)化合物为有机酸的盐。
6.如权利要求1所述的脂质组合物，其中式(V)化合物为其醋酸盐或甲酸盐。
7.如权利要求1所述的脂质组合物，其中式(V)化合物以水合物的形式存在。
8.如权利要求1所述的脂质组合物，其中所述PEG修饰的脂质为PEG-DMG。
9.如权利要求1所述的脂质组合物，其中所述中性脂质为DSPC。
10.如权利要求1所述的脂质组合物，其中所述PEG修饰的脂质为PEG-DMG且所述中性脂质为DSPC。
11.如权利要求1所述的脂质组合物，其中所述组合物包括25-75％的式(V)化合物、5-50％的甾醇和0.5-20％的PEG或PEG修饰的脂质以及0.5-15％的中性脂质。
12.如权利要求1所述的脂质组合物，其中所述组合物包括35-65％的式(V)化合物、15-45％的甾醇和0.5-10％的PEG或PEG修饰的脂质以及3-15％的中性脂质。
13.如权利要求1所述的脂质组合物，其中所述组合物包括40-65％的式(V)化合物、25-40％的甾醇、0.5-5％的PEG或PEG修饰的脂质以及5-10％的中性脂质。
14.如权利要求1所述的脂质组合物，其中所述组合物包括50％的式(V)化合物、38.5％的甾醇和1.5％的PEG或PEG修饰的脂质以及10％的中性脂质。
15.如权利要求1所述的脂质组合物，其中所述组合物为缔合复合物。
16.如权利要求1所述的脂质组合物，其中所述组合物为脂质体。
17.如权利要求1所述的脂质组合物，所述组合物进一步包括核酸剂。
18.如权利要求1所述的脂质组合物，所述组合物进一步包括RNA剂。
19.如权利要求1所述的脂质组合物，所述组合物进一步包括单链RNA剂。
20.如权利要求1所述的脂质组合物，所述组合物进一步包括双链RNA试剂。
21.一种制备如权利要求1所述的脂质组合物的方法，所述方法包括挤出法或线上混合法。
22.如权利要求17所述的脂质组合物，其中脂质:siRNA的比率为3至15。
23.如权利要求17所述的脂质组合物，其中脂质:siRNA的比率为5至13。
24.如权利要求1所述的脂质组合物，所述组合物进一步包括至少一种载脂蛋白。
25.如权利要求24所述的脂质组合物，其中载脂蛋白选自由ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V和ApoE以及它们的活性多晶型物、同工型、变体或片段构成的组。
26.如权利要求24所述的脂质组合物，其中载脂蛋白选自ApoA-I及其活性多晶型物、同工型、变体以及片段。
27.根据权利要求25或26所述的脂质组合物，其中所述变体是突变体。
28.根据权利要求25或26所述的脂质组合物，其中所述片段是截短形式。
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