KR20230160872A - Tmem173 sarna 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

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로라 시니가글리아
마르티네즈 발렌틴 고메즈
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Abstract

본 개시내용은 표적 유전자의 발현을 상향 조절하는 데 유용한 saRNA 및 saRNA를 포함하는 치료 조성물에 관한 것이며, 여기서 표적 유전자는 TMEM173이다. saRNA 및 치료 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

TMEM173 SARNA 조성물 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 3월 26일에 출원된 TMEM173 SARNA 조성물 및 사용 방법이라는 제목의 미국 가출원 번호 63/166,390, 및 2022년 3월 11일에 출원된 TMEM173 SARNA 조성물 및 사용 방법이라는 제목의 미국 가출원 번호 63/318,927의 우선권을 주장하며, 그 전체는 참조로서 각각의 내용이 본원에 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원 중이다. 2058_1034PCT_SL.txt라는 제목으로 제출된 서열 목록은 2022년 3월 23일에 생성되었으며, 크기는 34,380바이트이다. 서열 목록의 전자 형식 정보는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 유전자 발현을 조절하기 위한 조성물인 올리고뉴클레오티드, 구체적으로 saRNA, 및 진단 및 치료 적용에서 상기 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
최근, 작은 듀플렉스 RNA가 유전자 프로모터와 중첩되는 ncRNA를 표적화함으로써 유전자 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (Janowski et al., Nature Chemical Biology, vol.3:166-173 (2007), 그 내용은 전체가 참조로서 본원에 포함됨). 임의의 메커니즘에 의해 표적 유전자 발현의 상향 조절(up-regulate)을 유도하는 임의의 짧은 RNA를 짧은 활성화 RNA 또는 작은 활성화 RNA(saRNA)라고 한다.
많은 고형 암에는 기능 장애가 있는 면역 미세 환경이 포함되어 있다. 외부 병원체에 대한 면역 반응을 개시하는 조절자는 종양에 대한 생산적인 반응을 유도하는 유망한 치료제가 될 수 있다. saRNA를 이용한 면역 자극 유전자의 표적 조절을 위한 조성물 및 방법이 여전히 필요하다.
개시내용의 요약
본 개시내용은 표적 유전자의 발현을 상향 조절하는 합성 단리된 소형 활성화 RNA(saRNA)를 제공하며, 여기서 표적 유전자는 TMEM173(STING; 스팅)이다. 일부 실시형태에서, saRNA는 표적 유전자의 표적 서열 상의 영역에 적어도 80% 상보적인 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 표적 서열은 서열번호 2 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 안티센스 가닥은 14 내지 30개의 뉴클레오티드를 갖는다. 이러한 saRNA를 포함하는 약제학적 조성물, 키트, 및 장치도 제공된다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 표적 유전자의 발현을 상향 조절하는 방법을 제공하며, 여기서 표적 유전자는 TMEM173(스팅)이다. 면역 신호전달 경로를 조절하는 방법 및 TMEM173과 관련된 질병(암을 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 치료하는 방법도 제공된다. 상기 방법들은 본 개시내용의 saRNA를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 다양한 실시형태의 상세내용은 하기 설명에 제시된다. 본 개시내용의 기타 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명, 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
전술 및 기타 목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면에 예시된 바와 같이, 본 개시내용의 특정 실시형태의 하기 설명으로부터 명백해질 것이며, 상기 도면에서 유사한 참조 문자는 다른 시각에서 동일한 부분을 지칭한다. 도면들은 반드시 일정한 척도는 아니며, 본 개시내용의 각종 실시형태의 원리를 예시하는데 중점을 둔다.
도 1은 본 개시내용의 saRNA의 기능에 관여하는 핵산 모이어티 사이의 관계를 예시하는 개략도이다.
도 2는 TMEM173-saRNA로 처리된 HepG2 세포에서의 TMEM173 mRNA 발현을 나타낸다.
도 3은 TTMEM173-Pr-70, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m2, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m1, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-0, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-p1 및 TMEM173-Pr-70-invAb-Se-p2로 처리된 HepG2 세포에서의 TMEM173 mRNA 발현을 나타낸다.
도 4는 다양한 TMEM173-saRNA 및 대조군으로 처리된 A549 세포에서의 TMEM173 mRNA 발현을 나타낸다.
도 5 (A 내지 C)는 TMEM173-saRNA로 처리한 후 A549 세포에서 TMEM173 mRNA 및 TMEM173 단백질 수준 변화를 나타낸다.
도 6은 TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m1 및 TMEM173-Pr-70-m1-emod51로 처리된 A549 세포에서의 TMEM173 mRNA 발현을 나타낸다.
도 7 (A 내지 C)은 다양한 시점에 다양한 용량의 TMEM173-saRNA로 처리한 후 A549 세포에서의 TMEM173 mRNA 변화를 나타낸다.
본 개시내용은 치료 목적을 위해 표적 유전자 발현 및/또는 기능을 조절하기 위한 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 이들 조성물, 방법 및 키트는 표적 유전자의 발현을 상향 조절하는 적어도 하나의 saRNA를 포함한다.
I. saRNA의 설계 및 합성
본 개시내용의 한 측면은 saRNA를 설계하고 합성하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 맥락에서 용어 "소형 활성화 RNA", "짧은 활성화 RNA" 또는 "saRNA"는 특정한 유전자의 발현을 상향조절하거나 이에 대한 양성 효과를 갖는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA를 의미한다. saRNA는 14 내지 30개 뉴클레오티드의 단일 가닥일 수 있으며, 예컨대 19, 20, 21, 22 또는 23개 뉴클레오티드의 단일 가닥일 수 있다. saRNA는 또한 이중 가닥일 수 있으며, 각 가닥은 14 내지 30개의 뉴클레오티드, 예컨대 19, 20, 21, 22 또는 23개의 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 유전자는 saRNA의 표적 유전자로 불린다. 본원에 사용된 바와 같이, 표적 유전자는 코딩 가닥과 주형 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA이다. 예를 들어, TMEM173 유전자의 발현을 상향 조절하는 saRNA는 "TMEM173-saRNA"라고 불리며, TMEM173 유전자는 TMEM173-saRNA의 표적 유전자이다. 표적 유전자는 관심 있는 모든 유전자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자는 주형 가닥에 프로모터 영역을 갖는다.
유전자의 "상향 조절" 또는 "활성화"는 유전자의 발현 수준, 또는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 수준 또는 그의 활성, 또는 유전자의 주형 가닥으로부터 전사된 RNA 전사체의 수준이 본 개시내용의 saRNA가 없을 때 관찰되는 수준 이상으로 증가하는 것을 의미한다. 본 개시내용의 saRNA는 표적 유전자의 발현에 직접적 상향 조절 효과를 가질 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 표적 유전자의 주형 가닥으로부터 전사된 RNA 전사체(들) 및/또는 표적 유전자 또는 mRNA에 의해 암호화된 폴리펩티드(들)에 대해 간접적인 상향 조절 효과를 가질 수 있다. 표적 유전자로부터 전사된 RNA 전사체를 이하에서 표적 전사체라고 지칭한다. 표적 전사체는 표적 유전자의 mRNA일 수 있다. 표적 전사체는 미토콘드리아에 존재할 수 있다. 본 개시내용의 saRNA는 생물학적 과정 또는 활성에 대한 다운스트림 효과를 가질 수 있다. 이러일 실시형태에서, 제1 전사체를 표적으로 하는 saRNA는 제2 비표적 전사체에 효과(상향 조절 또는 하향 조절)를 가질 수 있다.
표적 서열
일부 실시형태에서, saRNA는 표적 유전자의 주형 가닥 또는 코딩 가닥 상의 영역에 적어도 80% 상보적인 안티센스 가닥을 포함한다. saRNA의 가닥이 하이브리드되거나 결합하는, 주형 가닥 또는 코딩 가닥의 이 영역은 "표적 서열" 또는 "표적 부위"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 표적 영역은 코딩 가닥 상에 있다. 일부 실시형태에서, 표적 영역은 주형 가닥 상에 있다. 도 1은 안티센스 가닥과 주형 가닥의 표적 영역 사이의 관계를 예시한다.
문맥에서 "상보적인"이라는 용어는 엄격한 조건 하에서 하이브리드될 수 있다는 것을 의미한다. DNA의 티미딘은 RNA의 우리딘으로 대체되며 이러한 차이가 "상보성"이라는 용어에 대한 이해를 바꾸지 않는다는 것을 이해해야 한다.
saRNA(단일 가닥이든지 이중 가닥이든지)의 안티센스 가닥은 표적 서열의 역상보체와 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 따라서, saRNA의 안티센스 가닥의 역상보체는 표적 서열과 높은 서열 동일성 정도를 갖는다. 표적 서열은 saRNA 및/또는 saRNA의 역상보체 동일한 길이, 즉 동일한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 적어도 14개 내지 30개 미만의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 19, 20, 21, 22 또는 23개의 뉴클레오티드를 갖는다.
일부 실시형태에서, 표적 서열의 위치는 주형 가닥의 프로모터 영역 내에 위치된다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 주형 가닥의 TSS(전사 시작 부위) 코어 내에 위치한다. 본원에서 사용되는 "TSS 코어" 또는 "TSS 코어 서열"은 TSS(전사 시작 부위)의 2000개 뉴클레오티드 업스트림과 2000개 다운스트림 사이의 영역을 의미한다. 따라서, TSS 코어는 4001개 뉴클레오티드를 포함하며, TSS는 TSS 코어 서열의 5' 말단으로부터 2001번 위치에 위치한다. 본원에 사용된 용어 "전사 시작 부위"(TSS)는 전사 시작 위치에 해당하거나 이를 표시하는 유전자의 주형 가닥에 있는 뉴클레오티드를 의미한다. TSS는 유전자의 주형 가닥에 있는 프로모터 영역 내에 위치할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 TSS의 업스트림 1000개 뉴클레오티드와 다운스트림 1000개 뉴클레오티드 사이에 위치한다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 TSS의 업스트림 500개 뉴클레오티드와 다운스트림 500개 뉴클레오티드 사이에 위치한다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 TSS의 업스트림 250개 뉴클레오티드와 다운스트림 250개 뉴클레오티드 사이에 위치한다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 TSS의 업스트림 100개 뉴클레오티드와 다운스트림 100개 뉴클레오티드 사이에 위치한다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 TSS 코어 내 TSS의 업스트림에 위치한다. 표적 서열은 TSS 업스트림의 2000개 미만, 1000개 미만, 500개 미만, 250개 미만, 또는 100개 미만의 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 TSS 코어 내 TSS 다운스트림에 위치한다. 표적 서열은 TSS 다운스트림의 2000개 미만, 1000개 미만, 500개 미만, 250개 미만, 또는 100개 미만의 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 TSS 코어 주변의 +/-50개 뉴클레오티드에 위치한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 TSS 코어의 TSS와 실질적으로 중첩된다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 TSS 코어의 TSS에서 시작하거나 종결된다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 업스트림 또는 다운스트림 방향으로 TSS 코어의 TSS와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개 뉴클레오티드만큼 중첩된다.
주형 가닥상의 표적화된 서열의 위치는 표적화된 서열의 5' 말단의 위치에 의해 한정된다. 표적화된 서열의 5' 말단은 TSS 코어의 임의의 위치에 있을 수 있고, 표적화된 서열은 TSS 코어의 1번 위치 내지 4001번 위로부터 선택된 임의의 위치에서 시작할 수 있다. 본원에서 참조를 위해, 표적 서열의 5' 말단이 TSS 코어의 1번 위치 내지 2000번 위치 사이에 위치하는 경우, 표적 서열은 TSS의 업스트림으로서 간주되며, 표적화된 서열의 5' 말단이 TSS 코어의 2002번 위치부터 4001번 위치까지일 경우, 표적화된 서열은 TSS의 다운스트림으로서 간주된다. 표적화된 서열의 5' 말단이 2001번 뉴클레오티드에 있을 경우, 표적화된 서열은 TSS 중심 서열인 것으로 간주되며 TSS의 업스트림도 다운스트림도 아닌 것으로 간주된다.
추가 참조를 위해, 예를 들면, 표적 서열의 5' 말단이 TSS 코어의 1600번 위치에 있을 경우, 즉 TSS의 1600번째 뉴클레오티드일 경우, 표적화된 서열은 TSS 코어의 1600번 위치에서 시작하고 TSS의 업스트림인 것으로 간주된다.
saRNA 설계
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 단일 가닥 saRNA이다. 단일 가닥 saRNA는 길이가 뉴클레오티드 14개 이상, 또는 18개 이상, 예를 들어 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개일 수 있는데, 이는 이 길이를 초과하는 올리고뉴클레오티드 듀플렉스가 인터페론 반응을 유도할 증가된 위험을 가질 수 있기 때문이다. 바람직하게는, 단일 가닥 saRNA의 길이는 30개 뉴클레오티드 미만이다. 일부 실시형태에서, 단일 가닥 saRNA의 길이는 19 내지 25개 뉴클레오티드이다. 일 실시형태에서, 단일 가닥 saRNA의 길이는 정확히 19개 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 단일 가닥 saRNA의 길이는 정확히 20개 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 단일 가닥 saRNA의 길이는 정확히 21개 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 단일 가닥 saRNA의 길이는 정확히 22개 뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 단일 가닥 saRNA의 길이는 정확히 23개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 단일 가닥 saRNA는 14개 이상의 뉴클레오티드 및 30개 미만의 뉴클레오티드의 서열을 포함하며, 이는 표적 서열에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 갖는다. 일 실시형태에서, 표적 서열에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 갖는 서열은 길이가 적어도 뉴클레오티드 15개, 16개, 17개, 18개 또는 19개 이거나, 또는 18개 내지 22개 뉴클레오티드, 또는 19개 내지 21개 뉴클레오티드, 정확히 19개 뉴클레오티드이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 듀플렉스를 형성하는 2개의 가닥을 가지며, 한 가닥은 안티센스 또는 가이드 가닥이다. saRNA 듀플렉스는 이중 가닥 saRNA라고도 한다. 본원에 사용된 이중 가닥 saRNA 또는 saRNA 듀플렉스는 가닥간 하이브리드화가 듀플렉스 구조의 영역을 형성할 수 있는 1개 초과, 바람직하게는 2개의 가닥을 포함하는 saRNA이다. 이중 가닥 saRNA의 두 가닥은 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥, 및 센스 가닥 또는 패신저(passenger) 가닥으로 지칭된다.
듀플렉스의 각 가닥은 길이는 뉴클레오티드 14개 이상, 또는 18개 이상, 예를 들어 뉴클레오티드 19개, 20개, 21개 또는 22개일 수 있다. 듀플렉스는 뉴클레오티드 12개 이상, 15개 이상, 17개 이상, 19개 이상의 길이에 걸쳐 하이브리드화될 수 있다. 각 가닥의 길이는 정확히 뉴클레오티드 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개일 수 있다. 바람직하게는, saRNA의 각 가닥의 길이는 30개 뉴클레오티드 미만이고, 이는 이 길이를 초과하는 올리고뉴클레오티드 듀플렉스가 증가된 인터페론 반응 유도 위험을 가질 수 있기 때문이다. 일 실시형태에서, saRNA의 각 가닥의 길이는 19 내지 25개 뉴클레오티드이다. saRNA 듀플렉스를 형성하는 가닥들은 길이가 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA의 안티센스 가닥은 길이가 적어도 14개 뉴클레오티드 및 30개 미만 뉴클레오티드의 서열, 예컨대 길이가 정확히 뉴클레오티드 19개, 20개, 21개, 22개 또는 23개인 것을 포함하며, 이는 표적 서열에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 상보성을 갖는다. 일 실시형태에서, 표적 서열에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 갖는 서열은 길이가 적어도 뉴클레오티드 15개, 16개, 17개, 18개 또는 19개이거나, 또는 뉴클레오티드 18개 내지 22개, 또는 19개 내지 21개, 또는 정확히 19개이다.
안티센스 가닥은 주형 가닥의 표적 서열과 5개 이하, 4개 또는 3개 이하, 또는 2개 이하, 또는 1개 이하의 불일치를 갖거나, 또는 불일치가 없을 수 있다. 따라서 안티센스 가닥은 주형 가닥의 표적 서열에 대해 높은 수준의 상보성을 갖는다. saRNA 듀플렉스의 센스 가닥은 주형 가닥 상의 표적 서열과 높은 수준의 서열 동일성을 갖는다.
saRNA 듀플렉스, 표적 유전자, 표적 유전자의 코딩 가닥, 표적 유전자의 주형 가닥, 표적 전사체, 표적 서열/표적 부위 및 TSS 사이의 관계가 도 1에 도시되어 있다.
본 개시내용의 맥락에서 "가닥"은 비천연 발생 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 연속적인 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 2개 이상의 가닥은 별개의 분자이거나 각각 그 일부를 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 링커와 같은 링커에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. saRNA의 적어도 하나의 가닥은 표적 유전자(표적 서열)의 가이드 가닥 상의 영역에 상보적이고 표적 유전자의 코딩 가닥 상의 영역과 서열 동일성을 갖는 영역을 포함할 수 있다. 이러한 가닥은 saRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥으로 불린다. saRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하는 saRNA의 제2 가닥은 센스 가닥 또는 패신저 가닥으로 불린다.
saRNA 듀플렉스는 듀플렉스 영역을 포함하여 헤어핀 구조를 형성하는 적어도 부분적으로 자가-상보적인 단일 분자로부터 형성될 수도 있다. 이러한 경우에, 용어 "가닥"은 saRNA의 또 다른 내부 영역에 상보적인 saRNA의 영역들 중 하나를 의미한다. saRNA의 가이드 가닥은 표적 유전자(표적 서열)의 주형 가닥 상의 영역 내의 서열과 5개 이하, 또는 4개 또는 3개 이하 또는 2개 이하 또는 1개 이하의 불일치를 갖거나, 또는 불일치를 갖지 않을 것이다.
일부 실시형태에서, saRNA의 패신저 가닥은 가이드 가닥 상의 상응하는 뉴클레오티드에 상보적이지 않은 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이러한 뉴클레오티드는 가이드 가닥과의 불일치로 지칭된다. 가이드 가닥과의 불일치는 가이드 가닥의 우선적 로딩(loading)을 촉진할 수 있다(Wu et al., PLoS ONE, vol.6(12):e28580 (2011), 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다). 일 실시형태에서, 가이드 가닥과의 적어도 하나의 불일치는 패신저 가닥의 3' 말단에 있을 수 있다. 일 실시형태에서, 패신저 가닥의 3' 말단은 가이드 가닥과의 1 내지 5개의 불일치를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 패신저 가닥의 3' 말단은 가이드 가닥과의 2 내지 3개의 불일치를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 패신저 가닥의 3' 말단은 가이드 가닥과의 6 내지 10개의 불일치를 포함할 수 있다.
saRNA 듀플렉스는 주형 가닥 상의 표적 서열에 대해 siRNA-유사 상보성, 즉 saRNA 듀플렉스 내 가이드 가닥의 5' 말단으로부터 2 내지 6개의 뉴클레오티드와 표적 서열 상의 한 영역 사이에 100% 상보성을 가진다. 또한, saRNA의 기타 뉴클레오티드는 추가로 표적 서열의 영역에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 상보성을 가진다. 예를 들면, (5' 말단부터 계수하여) saRNA의 3' 말단까지의 뉴클레오티드 7개는 표적 서열의 한 영역에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 상보성을 가질 수 있다.
용어 "소형 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 맥락상 RNA 간섭(RNAi) 경로에 관여되고 특정 유전자의 발현을 간섭 또는 저해하는, 전형적으로 20 내지 25개의 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 RNA를 의미한다. 유전자는 siRNA의 표적 유전자이다. siRNA는 일반적으로 길이가 약 21개의 뉴클레오티드이며, 두 가닥의 각 말단에 3' 돌출부(overhang)(예: 2개의 뉴클레오티드)를 갖는다.
일부 실시형태에서, saRNA는 3' 돌출부 또는 꼬리(tail)를 형성하는 각 가닥의 3' 말단에 다수의 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 각 가닥의 3' 돌출부를 형성하는 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드의 수는 1개 내지 5개 뉴클레오티드, 또는 1개 내지 3개 뉴클레오티드, 또는 2개 뉴클레오티드 범위일 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 단일 가닥일 수 있고 (i) 표적 유전자의 주형 가닥 상의 표적 서열에 대해 적어도 80% 상보성을 갖는 서열; 및 (ii) UU, UUU 또는 mUmU (2'-OMe 변형의 경우 m 가닥)와 같은 우라실 잔기를 포함할 수 있는 1개 내지 5개의 뉴클레오티드의 3' 꼬리(돌출부)로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 이중 가닥일 수 있으며, (i) 표적 유전자의 주형 가닥 상의 표적 서열에 대해 적어도 80% 상보성을 갖는 제1 서열; 및 (ii) 1게 내지 5개의 뉴클레오티드의 3' 돌출부를 포함하는 제1 가닥; 및 (i) 제1 서열과 듀플렉스를 형성하는 제2 서열 및 (ii) 1개 내지 5개의 뉴클레오티드의 3' 돌출부를 포함하는 제2 가닥을 포함한다. 이러한 3' 꼬리(돌출부)는 saRNA 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의 상보성을 결정하는 것과 관련하여 불일치로 간주되어서는 안 된다. 본 개시내용의 saRNA는 3' 꼬리(돌출부)를 제외하고, 존재하는 경우, 전체 길이에 걸쳐 표적 서열에 대해 상보성을 가질 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 측면 서열(flanking sequence)을 함유할 수 있다. 측면 서열은 본 개시내용의 saRNA의 3' 말단 또는 5' 말단에 삽입될 수 있다. 일 실시형태에서, 측면 서열은 miRNA의 서열로서, saRNA가 miRNA 배열을 갖도록 하며 Drosha 및 Dicer로 처리될 수 있다. 비제한적인 예에서, 본 개시내용의 saRNA는 2개의 가닥을 갖고 마이크로RNA 전구체, 예를 들어 miR-30 골격 측면 서열 내로 클로닝된다.
본 개시내용의 saRNA는 제한 효소 기질 또는 인식 서열을 포함할 수 있다. 제한 효소 인식 서열은 본 개시내용의 saRNA의 3' 말단 또는 5' 말단에 있을 수 있다. 제한 효소의 비제한적인 예에는 NotI 및 AscI이 포함된다.
표적 유전자 및 saRNA
위에서 논의된 바와 같이, saRNA의 안티센스 가닥은 표적 서열의 역상보체와 높은 수준의 서열 동일성을 갖는다. "표적 서열에 상보적인" 대신에, 본 개시내용의 saRNA의 안티센스 가닥은 또한 표적 유전자의 코딩 가닥 상의 영역에 "동일성"을 갖는 것으로 정의될 수 있다. 따라서, 표적 유전자의 게놈 서열을 사용하여 saRNA를 설계할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA의 표적 유전자는 TMEM173(스팅)이다. 표적 유전자의 서열, 표적 유전자에 의해 코딩되는 단백질 및 mRNA, 및 표적 유전자의 TSS 코어는 표 1에 제공된다.
표 2는 saRNA의 표적 서열, 표적 서열의 게놈 위치 및 3' 돌출부가 없는 saRNA의 상대 위치를 기재한다. 표 2에서 표적 서열은 표적 유전자의 주형 가닥에 있는 영역으로 정의된다. 상대 위치는 표적 서열의 5' 말단에서 TSS까지의 거리이다. 음수는 TSS 업스트림 위치를 나타내고, 양수는 TSS 다운스트림 위치를 나타낸다.
saRNA는 단일 가닥일 수 있으며 14개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 단일 가닥 saRNA의 서열은 표 3의 안티센스 가닥의 서열로부터 선택된 서열과 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일성을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 단일 가닥 saRNA는 표 3의 안티센스 가닥의 서열로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 단일 가닥 saRNA는 3' 꼬리(돌출부)를 가질 수 있다. 3' 꼬리(돌출부)를 갖는 단일 가닥 saRNA의 서열은 표 4의 안티센스 가닥의 서열로부터 선택된 서열과 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일성을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 단일 가닥 saRNA는 표 4의 안티센스 가닥의 서열로부터 선택된 서열을 포함한다.
saRNA는 이중 가닥일 수 있다. 두 가닥은 듀플렉스를 형성하고 각 가닥은 14개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 이중 가닥 saRNA의 제1 가닥은 표 3의 안티센스 가닥의 서열로부터 선택된 서열과 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일성을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 이중 가닥 saRNA의 제1 가닥은 표 3의 안티센스 가닥의 서열로부터 선택된 서열을 포함한다. 이중 가닥 saRNA의 제2 가닥은 표 3의 센스 가닥의 서열로부터 선택된 서열과 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일성을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 이중 가닥 saRNA의 제2 가닥은 표 3의 센스 가닥의 서열로부터 선택된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 이중 가닥 saRNA는 각 가닥 상에 3' 돌출부를 갖는다. 이중 가닥 saRNA의 제1 가닥은 표 4의 안티센스 가닥의 서열로부터 선택된 서열과 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 이중 가닥 saRNA의 제1 가닥은 표 4의 안티센스 가닥의 서열 중에서 선택된 서열을 포함한다. 이중 가닥 saRNA의 제2 가닥은 표 4의 센스 가닥의 서열 중에서 선택된 서열과 적어도 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 이중 가닥 saRNA의 제2 가닥은 표 4의 센스 가닥의 서열로부터 선택된 서열을 포함한다.
saRNA는 변형되거나 변형되지 않을 수 있다.
2011년 6월 23일자로 출원된 US 2013/0164846에 개시된 방법(saRNA 알고리즘)(이의 내용은 그 전체가 본원에서 참조로 포함된다)을 또한 사용하여 saRNA를 설계할 수도 있다. saRNA의 설계는 미국 특허번호 8,324,181 및 미국 특허번호 7,709,566(Corey 등), 미국 특허공보 2010/0210707(Li 등) 및 문헌 [Voutila et al., Mol Ther Nucleic Acids, vol. 1, e35 (2012)](이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에도 개시되어 있다.
본 개시내용의 saRNA는 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들면, 합성적으로 또는 당업계의 숙련가들에게 널리 공지된 표준 분자 생물학 기술을 사용하는 세포에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 개시내용의 saRNA는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 제조될 수 있다.
이(2)기능 올리고뉴클레오티드
이(2)기능성 또는 이중-기능성 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 saRNA는 제1 유전자의 발현을 상향 조절하고 적어도 하나의 제2 유전자의 발현을 하향 조절하도록 설계될 수 있다. 이중 기능성 올리고뉴클레오티드의 한 가닥은 제1 유전자의 발현을 활성화하고 다른 가닥은 제2 유전자의 발현을 억제한다. 각 가닥은 Dicer 기질 서열을 추가로 포함할 수 있다.
saRNA의 화학적 변형
본원의 saRNA에서, 용어 "변형" 또는 적절하게는 "변형된"은 A, G, U 또는 C 리보뉴클레오티드와 관련하여 구조적 및/또는 화학적 변형을 의미한다. 본 개시내용의 saRNA에서의 뉴클레오티드는 비표준 뉴클레오티드, 예를 들면, 비-천연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 saRNA는, 예를 들면, 당, 핵염기 또는 뉴클레오시드간 결합(예를 들면, 연결성 포스페이트/포스포디에스테르 연결/포스포디에스테르 골격)으로의 임의의 유용한 변형을 포함할 수 있다. 피리미딘 핵염기의 하나 이상의 원자는 임의로 치환된 아미노, 임의로 치환된 티올, 임의로 치환된 알킬(예를 들면, 메틸 또는 에틸) 또는 할로(예를 들면, 클로로 또는 플루오로)로 대체되거나 치환될 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형(예를 들면, 하나 이상의 변형)은 당 및 뉴클레오시드간 결합의 각각에 존재할 수 있다. 본 개시내용에 따른 변형은 리보핵산(RNA)의 데옥시리보핵산(DNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(locked nucleic acid; LNA) 또는 이들의 하이브리드로의 변형일 수 있다. 비제한적인 예에서, U의 2'-OH는 2'-OMe로 치환된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 본원에 기재된 적어도 하나의 변형을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, saRNA는 saRNA 듀플렉스이고, 센스 가닥 및 안티센스 서열은 독립적으로 적어도 하나의 변형을 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 센스 서열은 변형을 포함할 수 있고, 안티센스 가닥은 변형되지 않을 수 있다. 다른 비제한적 예로서, 안티센스 서열은 변형을 포함할 수 있고, 센스 가닥은 변형되지 않을 수 있다. 또 다른 비제한적 예로서, 센스 서열은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있고 안티센스 가닥은 하나의 변형을 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 안티센스 서열은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있고 센스 가닥은 하나의 변형을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 당, 핵염기 및/또는 뉴클레오이드간 연결부의 변형들의 조합을 포함할 수 있다. 이들 조합은 본원 또는 2012년 10월 3일자로 출원된 국제 공개공보 WO2013/052523 (그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 임의의 하나 이상의 변형, 특히 화학식 (Ia)-(Ia-5), (Ib)-(If), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVl) 및 (IXa)-(IXr)을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 분자의 전체 길이를 따라 균일하게 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 예를 들면, 하나 이상 또는 모든 유형의 뉴클레오티드(예를 들면, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 A, G, U 및 C 중 어느 하나 이상 또는 모두)는 본 개시내용의 saRNA에 균일하게 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA 중 모든 뉴클레오티드 X는 변형된 것이고, 여기서, X는 뉴클레오티드 A, G, U 및 C 중 어느 하나 또는 조합 A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C 및 A+G+C 중 어느 하나일 수 있다.
상이한 당 변형, 뉴클레오티드 변형 및/또는 뉴클레오시드간 결합부(예를 들면, 골격 구조)는 saRNA의 다양한 위치에 존재할 수 있다. 당업계의 숙련가들은 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 변형(들)이 saRNA의 기능이 실질적으로 감소되지 않도록 하는 saRNA의 임의의 위치(들)에 위치될 수 있음을 이해할 것이다. 본 개시내용의 saRNA는 약 1% 내지 약 100%의 변형된 뉴클레오티드(총 뉴클레오티드 함량에 관하여 또는 하나 이상 유형의 뉴클레오티드, 즉 A, G, U 및 C 중 임의의 하나 이상에 관하여) 또는 임의의 개재 백분율(intervening percentage)(예를 들면, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100% 및 95% 내지 100%)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 원형 핵산이 되도록 변형될 수 있다. 본 개시내용의 saRNA의 말단은 화학 시약 또는 효소에 의해 연결되어 자유 말단(free end)이 없는 원형 saRNA를 형성할 수 있다. 원형 saRNA는 선형의 반대부분(counterpart)보다 더 안정하고 RNase R 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 저항성을 가질 것으로 예상된다. 원형 saRNA는 A, G, U 또는 C 리보뉴클레오티드와 관련하여 다른 구조적 및/또는 화학적 변형을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 2013년 10월 10일에 공개된 PCT 공개공보 WO2013/151666 (이 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다)의 페이지 136 내지 247 에 개시된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 임의의 변형으로 변형될 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 변형의 조합을 포함할 수 있다. saRNA는 각 가닥에 대해 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개의 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, saRNA는 적어도 50% 변형되고, 예를 들어 적어도 50%의 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 실시형태에서, saRNA는 적어도 75% 변형되고, 예를 들어 적어도 75%의 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 실시형태에서, saRNA의 두 가닥 모두 전체 길이에 걸쳐 변형될 수 있다(100% 변형). 뉴클레오티드(당, 염기 및 인산염 부분, 예를 들어 링커)는 각각 변형될 수 있으므로, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 임의의 부분에 대한 임의의 변형이 변형을 구성할 것이라는 것이 이해되어야 한다.
일부 실시형태에서, saRNA는 뉴클레오티드의 단 하나의 성분에서 적어도 10% 변형되며, 이러한 성분은 핵염기, 당 또는 뉴클레오시드 간의 연결부부(linkage)로부터 선택된다. 예를 들어, saRNA의 변형은 상기 saRNA의 핵염기, 당 또는 결합부의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%에 대해 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, saRNA는 적어도 하나의 당 변형을 포함한다. 당 변형의 비제한적인 예는 다음을 포함할 수 있다:
일부 실시형태에서, saRNA의 뉴클레오티드의 당(RNA의 OH 또는 DNA의 H)의 2' 위치 중 적어도 하나는 -OMe로 치환되며, 이는 2'-OMe로 지칭된다.
일부 실시형태에서, saRNA의 뉴클레오티드의 당(RNA의 OH 또는 DNA의 H)의 2' 위치 중 적어도 하나는 -F로 치환되며, 이는 2'-F로 지칭된다.
Figure pct00018
일부 실시형태에서, saRNA는 뉴클레오티드 사이에 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결부 또는 메틸포스포네이트 연결부를 포함한다.
일부 실시형태에서, saRNA는 3' 및/또는 5' 캡핑 또는 돌출부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 적어도 하나의 역전된 데옥시리보뉴클레오시드 또는 디데옥시리보뉴클레오시드 돌출부(예를 들어, dT 또는 ddT)를 포함할 수 있다. 역전된 돌출부(예: dT)는 패신저(센스) 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 패신저 가닥 상의 역전된 무염기(invAb) 변형을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 역전된 무염기 변형은 패신저 가닥의 5' 말단, 또는 3' 말단, 또는 양쪽 말단에 있을 수 있다. 역전된 무염기 변형은 가이드(안티센스) 가닥의 우선적인 로딩을 촉진할 수 있다.
일부 실시형태에서, saRNA는 적어도 하나의 5'-(E)-비닐포스포네이트(5'-E-VP) 변형을 포함한다.
Figure pct00019
일부 실시형태에서, saRNA는 변형으로서 적어도 하나의 비고리형 핵산 유사체인 글리콜 핵산(GNA)을 포함한다.
Figure pct00020
saRNA 접합체 및 조합
접합은 안정성 및/또는 반감기 증가를 초래할 수 있고, 본 개시내용의 saRNA를 세포, 조직 또는 기관의 특정 부위에 표적화하는데 특히 유용할 수 있다. 본 개시내용의 saRNA는 다른 폴리뉴클레오티드, 염료, 층간 삽입제(intercalating agent)(예를 들면, 아크리딘), 가교제(예를 들면, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소(예를 들면, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들면, EDTA), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG(예를 들면, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성표지 마커, 효소, 합텐(예를 들면, 비오틴), 운반/흡수 촉진제(예를 들면, 아스피린, 비타민 E, 폴산), 합성 리보뉴클레아제, 단백질, 예를 들면, 당단백질 또는 펩티드, 예를 들면, 공동-리간드에 대한 특정 친화성을 갖는 분자 또는 항체, 예를 들면, 암 세포, 내피 세포 또는 골 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체, 호르몬 및 호르몬 수용체, 비-펩티드성 종, 예를 들면, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자 또는 약물에 접합되도록 디자인될 수 있다. 핵산 분자에 적합한 접합체는 2012년 12월 14일자로 출원된 국제 공개공보 WO 2013/090648에 개시되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용에 따르면, 본 개시내용의 saRNA는 상이한 기능을 달성하기 위해 RNAi 제제, 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 긴 비-암호화 RNA(lncRNA), 인핸서 RNA, 인핸서-유도된 RNA 또는 인핸서-구동된 RNA(eRNA), 마이크로RNA(miRNA), miRNA 결합 부위, 안티센스 RNA, 리보자임, 촉매적 DNA, tRNA, 삼중 나선 형성을 유도하는 RNA, 압타머 및 벡터 등의 하나 이상과 함께 투여되거나 또는 포함할 수 있다. RNAi제, 작은 간섭 RNA(siRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 긴 비-암호화 RNA(lncRNA), 마이크로RNA(miRNA), miRNA 결합 부위, 안티센스 RNA, 리보자임, 촉매적 DNA, tRNA, 삼중 나선 형성을 유도하는 RNA, 압타머 및 벡터의 하나 이상은 하나 이상의 변형 또는 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형은 당 위치에서의 핵산의 화학적 치환, 포스페이트 위치에서의 화학적 치환 및 염기 위치에서의 화학적 치환으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, 화학적 변형은 변형된 뉴클레오티드의 도입; 3' 캡핑; 고분자량의 비-면역원성 화합물에 대한 접합; 친지성 화합물에 대한 접합 및 포스포로티오에이트의 포스페이트 골격으로의 도입으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 고분자량의 비-면역원성 화합물은 폴리알킬렌 글리콜이고, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 전이유전자에 부착되어 RNA 폴리머라제 II 프로모터로부터 공동 발현될 수 있다. 비제한적 예에서, 본 개시내용의 saRNA는 녹색 형광 단백질 유전자(GFP)에 부착된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 DNA 또는 RNA 압타머에 부착되고, 이로써 saRNA-압타머 접합체를 생성할 수 있다. 압타머는 높은 선택성, 친화성 및 안정성을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드이다. 이들은 특이적이고 안정한 3차원 형상으로 추정되고, 이로 인해 표적 분자에 매우 특이적이고 단단한 결합을 제공한다. 압타머는 소분자, 단백질, 핵산 및 심지어 세포, 조직 및 기관과 같은 다양한 분자 표적에 결합하기 위해 반복된 수 차례의 시험관내 선택법 또는 동등하게는 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment;기하급수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)를 통해 조작된 핵산 종일 수 있다. 핵산 압타머는 대표적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성 이외의 상호작용을 통해 분자에 특이적인 결합 친화성을 가진다. 파아지 디스플레이 또는 모노클로날 항체(mAb)에 의해 생성된 펩티드와 같은 핵산 압타머는 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 결합을 통해 기능하는 분자의 능력을 차단한다. 일부 경우에서, 압타머는 또한 펩티드 압타머일 수 있다. 임의의 특정 분자 표적의 경우, 핵산 압타머는, 예를 들면, SELEX에 의해 핵산의 조합 라이브러리로부터 동정될 수 있다. 펩티드 압타머는 효모의 2개의 하이브리드 시스템을 사용하여 확인 될 수 있다. 따라서, 당업계의 숙련가들은 본 개시내용의 saRNA 또는 세포를 간 세포와 같은 표적 세포에 전달하는데 적합한 압타머를 디자인할 수 있다. DNA 압타머, RNA 압타머 및 펩티드 압타머가 고려될 수 있다. 간-특이적인 압타머를 사용하는 본 개시내용의 saRNA의 간으로의 투여가 바람직하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 전형적인 핵산 압타머는 대략 10 내지 15 kDa(20 내지 45개의 뉴클레오티드)의 크기를 가지고, 적어도 나노몰 친화성을 갖는 표적에 결합하고, 밀접하게 관련된 표적을 구별한다. 핵산 압타머는 리보핵산, 데옥시리보핵산, 또는 리보핵산과 데옥시리보핵산의 혼합물일 수 있다. 압타머는 단일 가닥의 리보핵산, 데옥시리보핵산, 또는 리보핵산과 데옥시리보핵산의 혼합물일 수 있다. 압타머는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함할 수 있다.
압타머에 적합한 뉴클레오티드 길이는 약 15 내지 약 100개의 뉴클레오티드(nt), 다양한 다른 바람직한 실시형태에서는 15 내지 30개 nt, 20 내지 25개 nt, 30 내지 100개 nt, 30 내지 60개 nt, 25 내지 70개 nt, 25 내지 60개 nt, 40 내지 60개 nt, 25 내지 40개 nt, 30 내지 40개 nt, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 nt 중의 어느 하나 또는 40 내지 70개 nt의 범위이다. 그러나, 서열은 본원에 기재된 거리에서 압타머와 2개의 표적의 상호작용을 수용할 수 있기에 충분한 가요성을 갖도록 디자인될 수 있다. 압타머는 뉴클레아제 및 다른 효소적 활성으로부터 보호를 제공하도록 추가로 변형될 수 있다. 압타머 서열은 당업계에 공지되어 있는 임의의 적합한 방법에 의해 변형될 수 있다.
saRNA-압타머 접합체는 2개의 모이어티를 결합시키기 위한 임의의 공지된 방법, 예를 들면, 직접적인 화학 결합 형성, 스트렙타아비딘과 같은 링커를 통한 결합 등을 사용하여 형성될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 항체에 부착될 수 있다. 표적 세포 표면 수용체에 대한 항체를 생성하는 방법은 널리 공지되어 있다. 본 개시내용의 saRNA는, 예를 들면, RNA 운반체 단백질을 사용하여 공지된 방법으로 이러한 항체에 부착될 수 있다. 이어서, 생성된 복합체는 대상체에 투여되어 수용체-매개된 세포내이입을 통해 표적 세포에 의해 흡수될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 콜레스테롤 모이어티[Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556], 콜산[Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060], 티오에테르, 예를 들면, 베릴-5-트리틸티올[Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770], 티오콜레스테롤[Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538], 지방족 쇄, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기[Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54], 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트[Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783], 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄[Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973] 또는 아다만탄 아세트산[Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654], 팔미틸 모이어티[Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237] 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐옥시콜레스테롤 모이어티[Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937]와 같은 지질 모이어티와 접합될 수 있으며, 상기 문헌들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 리간드와 접합된다. 비제한적 예에서, 리간드는 미국 공개특허 US 20130184328(Manoharan et al.)(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 임의의 리간드일 수 있다. 접합체는 리간드-[링커]선택적-[테더(tether)]선택적-올리고뉴클레오티드제의 식을 가진다. 올리고뉴클레오티드제는 미국 공개특허 US 20130184328(Manoharan et al.)(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 화학식 (I)을 갖는 서브유닛을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 리간드는 화학식 II-XXVI의 지질, 단백질, 호르몬 또는 탄수화물 리간드와 같은 미국 공개특허 20130317081(Akinc et al.)(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 임의의 리간드일 수 있다. 리간드는 Akinc에 개시된 화학식 XXXI-XXXV의 2가 또는 3가 분지형 링커를 사용하여 saRNA와 커플링될 수 있다.
이러한 핵산/지질 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허번호 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 saRNA는 고려될 수 있는 특정 방법에서 효과를 갖는 것으로 알려진 다른 활성 성분과 조합하여 제공될 수 있다. 다른 활성 성분은 본 개시내용의 saRNA와 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 상이한 표적 유전자를 조절하는 saRNA와 함께 투여된다.
일 실시형태에서, saRNA는 미국 특허번호 8106022 및 8828956 (Manoharan et al. (Alnylam Pharmaceuticals))(이의 내용은 그 전체가 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 임의의 탄수화물 리간드와 같은 탄수화물 리간드와 접합된다. 예를 들면, 탄수화물 리간드는 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드일 수 있다. 이러한 탄수화물-접합된 RNA 제제들은 간의 실질 세포를 표적으로 할 수 있다. 일 실시형태에서, saRNA는 하나 이상의 탄수화물 리간드, 바람직하게는 2개 또는 3개의 리간드와 접합된다. 일 실시형태에서, saRNA는 하나 이상의 갈락토스 모이어티와 접합된다. 다른 실시형태에서, saRNA는 적어도 하나의(예를 들면, 2개 또는 3개 또는 그 이상) 락토스 분자(락토스는 갈락토스에 커플링된 글루코스이다)와 접합된다. 또 다른 실시형태에서, saRNA는 적어도 하나의(예를 들면, 2개 또는 3개 또는 그 이상) N-아세틸-갈락토사민(GalNAc), N-Ac-글루코사민(GluNAc) 또는 만노스(예를 들면, 만노스-6-포스페이트)와 접합된다. 일 실시형태에서, saRNA는 적어도 하나의 만노스 리간드와 접합되고, 접합된 saRNA는 대식세포를 표적으로 한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 유전자의 발현을 억제하는 소형 간섭 RNA 또는 siRNA와 함께 투여된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 치료 목적을 위해 하나 이상의 약물과 함께 투여된다.
II. 본 개시내용의 조성물
본 개시내용의 한 측면은 표적 유전자를 상향 조절하는 소형 활성화 RNA(saRNA) 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
제형화, 전달, 투여 및 용량
약제학적 제형은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이것은 본원에서 사용되는 바와 같이 목적하는 특정 용량형에 적합화된 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산물 또는 현탁액 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 약제학적 조성물을 제형화하기 위한 각종 부형제 및 조성물을 제조하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006 참조; 그 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다]. 통상적인 부형제 매질의 사용은 본 개시물의 범위 내에서 고려될 수 있지만, 임의의 통상적인 부형제 매질이, 예를 들면, 임의의 바람직하지 못한 생물학적 효과를 생성하거나 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 물질 또는 이의 유도체와 양립불가능하다면 제외된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 사람, 사람 환자 또는 대상체에게 투여된다. 본 개시물의 목적상, 용어 "활성 성분"은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 전달될 saRNA를 의미한다.
비록 본원에 제공된 약제학적 조성물의 설명이 원칙적으로 사람에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 임의의 다른 동물, 예를 들면, 비-인간 동물, 예를 들면, 비-인간 포유동물에게 투여하기에 적합하다는 것은 당업계의 숙련가들이라면 이해할 것이다. 각종 동물에게 투여하기에 적합한 조성물을 제공하기 위해서 인간에게 투여하는데 적합한 약제학적 조성물의 변형은 잘 이해되고, 통상의 수의학 약리학자는 존재하는 경우 단지 통상적인 실험으로 이러한 변형을 디자인 및/또는 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 다른 영장류; 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 래트와 같은 상업 관련 포유동물을 포함한 포유동물; 및/또는 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조와 같은 상업 관련 조류를 포함한 조류를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에 공지되거나 이후에 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 기타 보조 성분과 연관시키고, 이어서 필요에 따라 및/또는 경우에 따라 생성물을 목적하는 단일 또는 다중 용량 단위로 분할, 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 단일 단위 용량으로서 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장 및/또는 대량으로 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 "단위 용량"은 소정량의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 별개의 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 용량 및/또는 이러한 용량의 편리한 분획, 예를 들면, 이러한 용량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물 중 활성 성분, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 임의의 추가 성분의 상대량은 치료될 대상체의 정체성, 신장 및/또는 병태에 따라 그리고 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100%, 예를 들면, 0.5% 내지 50%, 1 내지 30%, 5 내지 80%, 적어도 80%(w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 제형은 적어도 하나의 saRNA를 함유할 수 있다. 비제한적 예로서, 제형은 상이한 서열을 갖는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 saRNA를 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 제형은 상이한 서열을 갖는 3개 이상의 saRNA를 함유한다. 일 실시형태에서, 제형은 상이한 서열을 갖는 5개 이상의 saRNA를 함유한다.
본 개시내용의 saRNA는 (1) 안정성을 증가시키고; (2) 세포 형질감염을 증가시키고; (3) (예를 들면, saRNA의 데포 제형으로부터) 지속 또는 지연 방출을 허용하고; (4) 생체분포를 변화시키고 (예를 들면, saRNA를 특정 조직 또는 세포 유형으로 표적화하고); (5) 생체내에서 암호화된 단백질의 번역을 증가시키고/시키거나; (6) 생체내에서 암호화된 단백질의 방출 프로파일을 변화시키도록 하나 이상의 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다.
임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산물 또는 현탁액 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제와 같은 전통적 부형제 이외에도, 본 개시내용의 부형제는 리피도이드, 리포좀, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스, 코어-쉘 나노입자, 펩티드, 단백질, saRNA로 형질감염된 세포(예를 들면, 대상체에 이식하기 위함), 히알루로니다제, 나노입자 모방체 및 이들의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 개시내용의 제형은 하나 이상의 부형제들을 각각 saRNA의 안정성을 증가시키고/거나 saRNA에 의해 세포 형질감염을 증가시키는 양으로 포함할 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 saRNA는 자가-조립 핵산 나노입자를 사용하여 제형화될 수 있다. 본 개시내용의 saRNA와 함께 제형화에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 핵산 전달제는 2012년 12월 14일자로 출원된 국제 공개공보 WO 2013/090648에 개시되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 활성 성분으로서 이중 가닥 saRNA를 형성하도록 어닐링되는 21개의 뉴클레오티드 길이인 2개의 단일 RNA 가닥을 포함한다. 조성물은 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 100mM NaCl 및 5mM EDTA로 구성된 염 완충제를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 덴드리머로 전달될 수 있다. 덴드리머는 고도로 분지화된 거대분자이다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 표적화된 생체내 전달은 위한 구조적으로 유연한 폴리(아미도아민)(PAMAM) 덴드리머와 복합체를 형성한다. 복합체는 saRNA-덴드리머로 지칭된다. 덴드리머는 고도의 분자 균일성, 협소한 분자량 분포, 특정 크기 및 형상 특징, 및 고도-작용화된 말단 표면을 가진다. 제조 공정은 중앙 개시제 코어로 시작하는 일련의 반복 단계이다. 각 후속 성장 단계는 더 큰 분자 직경 및 분자량, 및 이전 생성 보다 더 반응적인 표면 부위를 갖는 중합체의 새로운 생성을 나타낸다.
PAMAM 덴드리머는 자신의 표면 상에 1차 아민기 및 또한 구조의 내부에 3차 아민기를 갖는 효율적인 뉴클레오티드 전달 시스템이다. 1차 아민기는 뉴클레오티드 결합에 참여하여 세포 흡수를 촉진시키는 반면, 매립된 3차 아미노 기는 엔도좀에서 양성자 스폰지로서 작용하고 핵산의 세포질로의 방출을 향상시킨다. 이들 덴드리머는 자신에 의해 수행되는 saRNA를 리보뉴클레아제 분해로부터 보호하고 효율적인 유전자 표적화를 위해 세포내이입을 통해 연장된 기간에 걸쳐 saRNA의 상당한 방출을 달성한다. 이들 나노입자의 생체내 효능은 이미 평가되었으며, 생체분포 연구는 덴드리머가 말초 혈액 단핵 세포에서 우선적으로 축적되고 식별가능한 독성 없이 생존하는 것을 나타낸다 [Zhou et al., Molecular Ther. 2011 Vol. 19, 2228-2238 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다]. PAMAM 덴드리머는 트리에탄올아민(TEA) 코어, 디아미노부탄(DAB) 코어, 시스타민 코어, 디아미노헥산(HEX) 코어, 디아모노도데칸(DODE) 코어 또는 에틸렌디아민(EDA) 코어를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, PAMAM 덴드리머는 TEA 코어 또는 DAB 코어를 포함한다.
리피도이드( Lipidoid)
리피도이드의 합성은 광범위하게 기재되어 있으며, 이들 화합물을 포함하는 제형은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산의 전달에 특히 적합하다 [Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med. 2010 267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-3001 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다].
이들 리피도이드는 설치류 및 비-인간 영장류에서 이중 가닥의 작은 간섭 RNA 분자를 효과적으로 전달하는데 사용되었다 [Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Frank-Kamenetsky et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 105:11915-11920; Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869; Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다]; 본 개시내용은 이들의 제형화 및 saRNA 전달의 용도를 고려한다. 이들 리피도이드를 함유하는 복합체, 미셀, 리포좀 또는 입자는 제조될 수 있고, 따라서 국소 및/또는 전신 투여 경로를 통해 리피도이드 제형의 주입 후 saRNA의 효과적 전달을 초래할 수 있다. saRNA의 리피도이드 복합체는 정맥내, 근육내 또는 피하 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 각종 수단에 의해 투여될 수 있다.
핵산의 생체내 전달은 제형 조성, 입자 PEG화(PEGylation)의 성질, 부하 정도, 올리고뉴클레오티드 대 지질 비율, 및 입자 크기 등과 같은 생물리학 파라미터를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 파라미터에 의해 영향을 받을 수 있다[Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조에 의해 포함된다]. 예로서, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 지질의 앵커 쇄 길이에서의 작은 변화는 생체내 효능에 유의미한 영향을 초래할 수 있다. 펜타[3-(1-라우릴아미노프로피오닐)]-트리에틸렌테트라민 하이드로클로라이드[TETA-5LAP; aka 98N12-5, Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010); 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다], C12-200(유도체 및 변이체 포함) 및 Md1을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 리피도이드를 갖는 제형이 생체내 활성에 대해 시험될 수 있다.
본원에서 "98N12-5"로서 언급된 리피도이드는 문헌[Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879]에 개시되어 있으며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 "C12-200"으로서 언급된 리피도이드는 문헌[Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869] 및 문헌[Liu and Huang, Molecular Therapy. 2010 669-670]](이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 리피도이드 제형은 saRNA에 추가하여 3 또는 4개 또는 그 이상의 성분을 포함하는 입자를 포함할 수 있다. 예로서, 특정 리피도이드를 갖는 제형은 98N12-5를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 42% 리피도이드, 48% 콜레스테롤 및 10% PEG(C14 알킬 쇄 길이)를 함유할 수 있다. 다른 예로서, 특정 리피도이드를 갖는 제형은 C12-200을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 50% 리피도이드, 10% 디스테로일포스파티딜 콜린, 38.5% 콜레스테롤 및 1.5% PEG-DMG를 함유할 수 있다.
일 실시형태에서, 전신 정맥내 투여를 위한 리피도이드로 제형화된 saRNA는 간을 표적화할 수 있다. 예를 들면, saRNA를 사용하고 42% 98N12-5, 48% 콜레스테롤 및 10% PEG-지질의 지질 몰 조성을 포함하고 총 지질 대 saRNA의 최종 중량비가 약 7.5 대 1이고 PEG 지질 상의 알킬 쇄 길이가 C14이고 평균 입자 크기가 대략 50 내지 60 nm인 최종 최적화된 정맥내 제형은, 제형의 간에 대한 분포가 90% 초과되도록 할 수 있다 (Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다). 다른 예에서, C12-200을 사용하고(국제 공개공보 WO2010129709 참조, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨) 리포이드를 사용하는 정맥내 제형은 50/10/38.5/1.5의 C12-200/디스테로일포스파티딜 콜린/콜레스테롤/PEG-DMG의 몰비, 7 내지 1의 핵산에 대한 총 지질의 중량비를 가질 수 있고, 80 nm의 평균 입자 크기는 saRNA를 전달하는데 효과적일 수 있다 (Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
다른 실시형태에서, MD1 리피도이드-함유 제형은 생체내에서 saRNA를 간 세포에 효과적으로 전달하는데 사용될 수 있다. 근육내 또는 피하 경로를 위해 최적화된 리피도이드 제형의 특징은 표적 세포 유형 및 세포외 매트릭스를 통해 혈류로 확산하는 제형의 능력에 따라 현저하게 달라질 수 있다. 150 nm 미만의 입자 크기는 내피 천공의 크기로 인해 효과적인 간 세포 전달에 적합할 수 있고 (Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨), 내피 세포, 골수 세포 및 근육 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 기타 세포 유형으로 제형을 전달하기 위한 리피도이드-제형화된 saRNA의 사용은 유사하게 크기-제한될 수 없다.
생체내에서 siRNA를 골수 세포 및 내피 세포와 같은 다른 비-간 세포로 전달하기 위한 리피도이드 제형의 사용은 보고되었다 [Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010; Cho et al. Adv. Funct. Mater. 2009 19:3112-3118; 8th International Judah Folkman Conference, Cambridge, MA October 8-9, 2010 참조; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다]. 단핵구와 같은 골수 세포로의 리피도이드 제형의 효과적인 전달은 유사한 성분 몰비를 가질 수 있다. 리피도이드와 기타 성분(디스테로일포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 PEG-DMG를 포함하나 이들로 제한되지 않음)은 간 세포, 골수 세포, 근육 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 세포 유형에 전달하기 위해 saRNA의 제형을 최적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 성분 몰비는 50% C12-200, 10% 디스테로일포스파티딜콜린, 38.5% 콜레스테롤 및 1.5% PEG-DMG를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다 (Leuschner et al., Nat Biotechnol 2011 29:1005-1010 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다). 피하 또는 근육내 전달을 통해 핵산의 세포(예를 들면, 지방 세포 및 근육 세포를 포함하나 이에 제한되지 않음)로의 국소 전달을 위한 리피도이드 제형의 사용은 전신 전달에 바람직한 모든 제형 성분을 필요로 하지 않을 수 있으며, 이와 같이 리피도이드 및 saRNA만을 포함할 수 있다.
리포좀, 리포플렉스 및 지질 나노입자
본 개시내용의 saRNA는 하나 이상의 리포좀, 리포플렉스 또는 지질 나노입자를 사용하여 제형화할 수 있다. 일 실시형태에서, saRNA의 약제학적 조성물은 리포좀을 포함한다. 리포좀은 주로 지질 이중층으로 구성될 수 있고 영양소 및 약제학적 제형의 투여를 위한 전달 소포(vesicle)로서 사용될 수 있는 인공적으로 제조된 비히클이다. 리포좀은, 직경이 수백 나노미터일 수 있고 협소한 수성 구획에 의해 분리된 일련의 동심원 이중층을 함유할 수 있는 다층 소포(MLV), 직경이 50 nm 보다 작을 수 있는 작은 단세포 소포(SUV), 및 직경이 50 내지 500 nm일 수 있는 큰 단층(unilamellar) 소포(LUV)와 같은 다양한 크기일 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. 리포좀 디자인은 건강하지 않은 조직으로의 리포좀 부착을 향상시키기 위해 또는 세포내이입과 같으나 이에 제한되지 않은 이벤트를 활성화시키기 위해 옵소닌 또는 리간드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 리포좀은 약제학적 제형의 전달을 향상시키기 위해 낮거나 높은 pH를 가질 수 있다.
리포좀의 형성은 포획된 약제학적 제형 및 리포좀 성분, 지질 소포가 분산되는 매질의 성질, 포획된 물질의 유효 농도 및 이의 잠재 독성, 소포의 적용 및/또는 전달 동안 수반되는 임의의 추가의 과정, 최적화 크기, 의도된 적용을 위한 소포의 다분산도 및 저장수명, 및 뱃치 대 뱃치 재현성 및 안전하고 효율적인 리포좀 생성물의 대규모 생산의 가능성과 같으나 이에 제한되지 않는 물리화학적 특징에 의해 좌우될 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DODMA) 리포좀, DiLa2 리포좀(Marina Biotech; Bothell, WA), 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA) 및 MC3(US20100324120; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다), 및 DOXIL®(Janssen Biotech, Inc.; Horsham, PA)과 같으나 이에 제한되지 않는 소분자 약물을 전달할 수 있는 리포좀으로부터 형성된 것들과 같은 리포좀을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 시험관내 및 생체내 올리고뉴클레오티드 전달에 적합한 것으로 이미 기재되었고 밝혀진 안정화된 플라스미드-지질 입자(SPLP) 또는 안정화된 핵산 지질 입자(SNALP)의 합성으로부터 형성된 것들와 같은 리포좀을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다 (Wheeler et al. Gene Therapy. 1999 6:271-281; Zhang et al. Gene Therapy. 1999 6:1438-1447; Jeffs et al. Pharm Res. 2005 22:362-372; Morrissey et al., Nat Biotechnol. 2005 2:1002-1007; Zimmermann et al., Nature. 2006 441:111-114; Heyes et al. J Contr Rel. 2005 107:276-287; Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176; Judge et al. J Clin Invest. 2009 119:661-673; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132 참조; 이들 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다). Wheeler 등에 의한 최초 제조 방법은 나중에 Jeffs 등에 의해 개선되었으며 자발적 소포 형성 방법으로 언급되는 세제 투석 방법이었다. 리포좀 제형은 saRNA에 추가하여 3 또는 4개의 지질 성분으로 구성될 수 있다. 예로서, 리포좀은 Jeffs 등에 의해 기술된 바와 같이 55% 콜레스테롤, 20% 디스테로일포스파티딜콜린(DSPC), 10% PEG-S-DSG, 및 15% 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DODMA)을 함유할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 특정 리포좀 제형은 Heyes 등에 의해 기술된 바와 같이 48% 콜레스테롤, 20% DSPC, 2% PEG-c-DMA 및 30% 양이온성 지질을 함유할 수 있지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 양이온성 지질은 1,2-디스테아로일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DSDMA), DODMA, DLin-DMA 또는 1,2-디리놀레닐옥시-3-디메틸아미노프로판(DLenDMA)일 수 있다. 다른 예에서, 핵산-지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 85 몰%를 포함하는 양이온성 지질; 입자에 존재하는 총 지질의 약 13 몰% 내지 약 49.5 몰%를 포함하는 비-양이온성 지질; 및 Maclachlan 등의 국제 공개공보 WO2009127060(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 입자에 존재하는 총 지질의 약 0.5 몰% 내지 약 2 몰%을 포함하는 임자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 핵산-지질 입자는 마클라클란 등의 미국 공개특허 US 2006008910(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 임의의 핵산-지질 입자일 수 있다. 비제한적 예로서, 핵산-지질 입자는 화학삭 I의 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 기능성화된 지질 이중층들 사이에 가교결합을 가질 수 있는 지질 소포로 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 리포좀은 Bally 등의 미국 특허 5595756(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 당-변형된 지질을 함유할 수 있다. 지질은 약 10 몰%의 양의 강글리오시드 및 세레브로시드일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 양이온성 지질을 포함하는 리포좀으로 제형화될 수 있다. 리포좀은 국제 공개공보 WO2013006825(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 1:1 과 20:1 사이의 양이온성 지질 중 질소 대 saRNA 중 포스페이트의 몰비(N:P 비)를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 리포좀은 20:1 초과 또는 1:1 미만의 N:P 비를 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 지질-다가 양이온 착물로 제형화될 수 있다. 지질-다가 양이온 착물은 당업계에 공지된 방법 및/또는 미국 공개특허 US 20120178702(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 달성될 수 있다. 비제한적 예로서, 다가 양이온은 폴리리신, 폴리오르니틴 및/또는 폴리아르기닌과 같으나 이에 제한되지 않는 폴리펩티드 또는 양이온성 펩티드, 및 국제 공개공보 WO2012013326(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 양이온성 펩티드를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, saRNA는 콜레스테롤 또는 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)과 같으나 이에 제한되지 않는 중성 지질을 추가로 포함할 수 있는 지질-다가 양이온 착물로 제형화될 수 있다.
리포좀 제형은 양이온성 지질 성분의 선택, 양이온성 지질의 포화도, PEG화의 성질, 모든 성분과 생물리학적 파라미터, 예를 들면, 크기의 비율에 의해 영향을 받들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 문헌 [Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨]에 의한 하나의 예에서, 리포좀 제형은 57.1% 양이온성 지질, 7.1% 디팔미토일포스파티딜콜린, 34.3% 콜레스테롤 및 1.4% PEG-c-DMA로 구성되어 있다.
일부 실시형태에서, 지질 나노입자(LNP) 제형 중 PEG의 비율은 증가 또는 감소될 수 있고/있거나, PEG 지질의 탄소 쇄 길이는 C14 내지 C18 로 개질되어 LNP 제형의 약동학 및/또는 생체분포를 변화시킬 수 있다. 비제한적 예로서, LNP 제형은 양이온성 지질, DSPC 및 콜레스테롤과 비교하여 1 내지 5%의 지질 몰비의 PEG-c-DOMG를 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, PEG-c-DOMG는 PEG-DSG(1,2-디스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜) 또는 PEG-DPG(1,2-디팔미토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜)과 같으나 이에 제한되지 않는 PEG 지질로 대체될 수 있다. 양이온성 지질은 DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 및 DLin-KC2-DMA와 같으나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 지질로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 국제 공개공보 WO2012170930(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 지질 나노입자와 같은 지질 나노입자로 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 제형에 사용될 수 있는 양이온성 지질은 국제 공개공보 WO 2012040184, WO 2011153120, WO 2011149733, WO 2011090965, WO 2011043913, WO 2011022460, WO 2012061259, WO 2012054365, WO 2012044638, WO 2010080724, WO 201021865 및 WO 2008103276, 미국 특허번호 7,893,302, 7,404,969 및 8,283,333 및 미국 공개특허 US 20100036115 및 US 20120202871(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 양이온성 지질로부터 선택될 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 국제 공개공보 WO 2012040184, WO 2011153120, WO 2011149733, WO 2011090965, WO 2011043913, WO 2011022460, WO 2012061259, WO 2012054365 및 WO 2012044638(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 화학식 A로부터 선택될 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 국제 공개공보 WO 2008103276의 화학식 CLI-CLXXIX, 미국 특허 7,893,302의 화학식 CLI-CLXXIX, 미국 특허 7,404,969의 화학식 CLI-CLXXXXII 및 미국 공개특허 US 20100036115의 화학식 I-VI(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)로부터 선택될 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 Gaucheron 등의 미국 특허번호 7223887(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 양이온성 지질과 같은 다가 양이온성 지질일 수 있다. 양이온성 지질은 Gaucheron 등의 미국 특허 제7223887호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 2개의 4차 아민기를 포함하는 양으로 하전된 헤드 그룹(head group) 및 4개의 탄화수소 쇄를 포함하는 소수성 부분을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 Maier 등의 미국 공개특허 US 20130195920(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 생분해성 지질과 같이 생분해성일 수 있다. 양이온성 지질은 Maier 등의 미국 공개특허 US 20130195920(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)의 화학식 I-IV 에 개시된 양이온성 지질의 지질 모이어티에 위치한 하나 이상의 생분해성 그룹을 가질 수 있다.
비제한적 예로서, 양이온성 지질은 (20Z,23Z)-N,N-디메틸노나코사-20,23-디엔-10-아민, (17Z,20Z)-N,N-디메틸헥사코사-17,20-디엔-9-아민, (1Z,19Z)-N5N-디메틸펜타코사-l6,19-디엔-8-아민, (13Z,16Z)-N,N-디메틸도코사-13,16-디엔-5-아민, (12Z,15Z)-N,N-디메틸헤니코사-12,15-디엔-4-아민, (14Z,17Z)-N,N-디메틸트리코사-14,17-디엔-6-아민, (15Z,18Z)-N,N-디메틸테트라코사-15,18-디엔-7-아민, (18Z,21Z)-N,N-디메틸헵타코사-18,21-디엔-10-아민, (15,18)-N,N-디메틸테트라코사-15,18-디엔-5-아민, (14Z,17Z)-N,N-디메틸트리코사-14,17-디엔-4-아민, (19Z,22Z)-N,N-디메틸옥타코사-19,22-디엔-9-아민, (18Z,21Z)-N,N-디메틸헵타코사-18,21-디엔-8-아민, (17Z,20Z)-N,N-디메틸헥사코사-17,20-디엔-7-아민, (16Z,19Z)-N,N-디메틸펜타코사-16,19-디엔-6-아민, (22Z,25Z)-N,N-디메틸헨트리아콘타-22,25-디엔-10-아민, (21Z,24Z)-N,N-디메틸트리아콘타-21,24-디엔-9-아민, (18Z)-N,N-디메틸헵타코스-18-엔-10-아민, (17Z)-N,N-디메틸헥사코스-17-엔-9-아민, (19Z,22Z)-N,N-디메틸옥타코사-19,22-디엔-7-아민, N,N-디메틸헵타코산-10-아민, (20Z,23Z)-N-에틸-N-메틸노나코사-20,23-디엔-10-아민, 1-[(11Z,14Z)-1-노닐아이코사-11,14-디엔-1-일]피롤리딘, (20Z)-N,N-디메틸헵타코스-20-엔-10-아민, (15Z)-N,N-디메틸헵타코사-15-엔-10-아민, (14Z)-N,N-디메틸노나코스-14-엔-10-아민, (17Z)-N,N-디메틸노나코스-17-엔-10-아민, (24Z)-N,N-디메틸트리트리아콘트-24-엔-10-아민, (20Z)-N,N-디메틸노나코스-20-엔-10-아민, (22Z)-N,N-디메틸헨트리아콘트-22-엔-10-아민, (16Z)-N,N-디메틸펜타코스-16-엔-8-아민, (12Z,15Z)-N,N-디메틸-2-노닐헤니코사-12,15-디엔-1-아민, (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민, N,N-디메틸-1-[(lS,2R)-2-옥틸사이클로프로필]엡타데칸-8-아민, 1-[(1S,2R)-2-헥실사이클로프로필]-N,N-디메틸노나데칸-10-아민, N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]노나데칸-10-아민, N,N-디메틸-21-[(lS,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헤니코산-10-아민, N,N-디메틸-1-[(1S,2S)-2-{[(lR,2R)-2-펜틸사이클로프로필]메틸}사이클로프로필]노나데칸-10-아민, N,N-디메틸-1-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헥사데칸-8-아민, N,N-디메틸-[(lR,2S)-2-운데실사이클로프로필]테트라데칸-5-아민, N,N-디메틸-3-{7-[(1S,2R)-2-옥틸사이클로프로필]헵틸}도데칸-1-아민, 1-[(1R,2S)-2-헵틸사이클로프로필]-N,N-디메틸옥타데칸-9-아민, 1-[(1S,2R)-2-데실사이클로프로필]-N,N-디메틸펜타데칸-6-아민, N,N-디메틸-1-[(lS,2R)-2-옥틸사이클로프로필]펜타데칸-8-아민, R-N,N-디메틸-1-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, S-N,N-디메틸-1-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, 1-{2-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]-1-[(옥틸옥시)메틸]에틸}피롤리딘, (2S)-N,N-디메틸-1-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]-3-[(5Z)-옥트-5-엔-1-일옥시]프로판-2-아민, 1-{2-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]-1-[(옥틸옥시)메틸]에틸}아제티딘, (2S)-1-(헥실옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민, (2S)-1-(헵틸옥시)-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민, N,N-디메틸-1-(노닐옥시)-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민, N,N-디메틸-1-[(9Z)-옥타데크-9-엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민; (2S)-N,N-디메틸-1-[(6Z,9Z,12Z)-옥타데카-6,9,12-트리엔-1-일옥시]-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, (2S)-1-[(11Z,14Z)-아이코사-11,14-디엔-1-일옥시]-N,N-디메틸-3-(펜틸옥시)프로판-2-아민, (2S)-1-(헥실옥시)-3-[(11Z,14Z)-아이코사-11,14-디엔-1-일옥시]-N,N-디메틸프로판-2-아민, 1-[(11Z,14Z)-아이코사-11,14-디엔-1-일옥시]-N,N-디메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, 1-[(13Z,16Z)-도코사-13,16-디엔-1-일옥시]-N,N-디메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, (2S)-1-[(13Z,16Z)-도코사-13,16-디엔-1-일옥시]-3-(헥실옥시)-N,N-디메틸프로판-2-아민, (2S)-1-[(13Z)-도코스-13-엔-1-일옥시]-3-(헥실옥시)-N,N-디메틸프로판-2-아민, 1-[(13Z)-도코스-13-엔-1-일옥시]-N,N-디메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, 1-[(9Z)-헥사데크-9-엔-1-일옥시]-N,N-디메틸-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민, (2R)-N,N-디메틸-H(1-메토일옥틸)옥시]-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민, (2R)-1-[(3,7-디메틸옥틸)옥시]-N,N-디메틸-3-[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-2-아민, N,N-디메틸-1-(옥틸옥시)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-펜틸사이클로프로필]메틸}사이클로프로필]옥틸}옥시)프로판-2-아민, N,N-디메틸-1-{[8-(2-옥틸사이클로프로필)옥틸]옥시}-3-(옥틸옥시)프로판-2-아민 및 (11E,20Z,23Z)-N,N-디메틸노나코사-11,20,2-트리엔-10-아민 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염 또는 입체이성질체로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 지질은 국제 공개공보 WO 2012170889(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 것들과 같은 분해성 지질일 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 나노입자는 본원에 개재되고/되거나 당업계에 공지된 하나 이상의 양이온성 중합체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 양이온성 지질은 당업계에 공지된 방법에 의해 및/또는 국제 공개공보 WO 2012040184, WO 2011153120, WO 2011149733, WO 2011090965, WO 2011043913, WO 2011022460, WO 2012061259, WO2012054365, WO 2012044638, WO 2010080724 및 WO 201021865(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 합성될 수 있다.
일 실시형태에서, saRNA의 LNP 제형은 PEG-c-DOMG를 3% 지질 몰비로 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, saRNA의 LNP 제형은 PEG-c-DOMG를 1.5% 지질 몰비로 함유할 수 있다.
일 실시형태에서, saRNA의 약제학적 조성물은 국제 공개공보 WO 2012099755(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 페길화 지질들 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, LNP 제형은 PEG-DMG 2000 (1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000)을 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, LNP 제형은 PEG-DMG 2000, 당업계에 공지된 양이온성 지질 및 하나 이상의 기타 성분을 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, LNP 제형은 PEG-DMG 2000, 당업계에 공지된 양이온성 지질, DSPC 및 콜레스테롤을 함유할 수 있다. 비제한적 예로서, LNP 제형은 PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC 및 콜레스테롤을 함유할 수 있다. 다른 비제한적 예로서, LNP 제형은 PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC 및 콜레스테롤을 2:40:10:48의 몰비로 함유할 수 있다 (Geall et al., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines, PNAS 2012; PMID: 22908294 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다). 다른 비제한적 예로서, 본원에 기재된 saRNA는 미국 공개특허 US 20120207845(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 비경구 경로에 의해 전달될 나노입자로 제형화될 수 있다. 양이온성 지질은 또한 Manoharan 등의 미국공개 특허 US 20130156845 및 Manoharan 등의 미국 공개특허 US 20130129785, Wasan 등의 국제 공개공보 WO 2012047656, Chen 등의 국제 공개공보 WO 2010144740, Ansell 등의 국제 공개공보 WO 2013086322 또는 Manoharan 등의 국제 공개공보 WO 2012016184(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 양이온성 지질일 수 있다.　
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Hope 등의 미국 공개특허 US 20130017223(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 제1 및 제2 양이온성 지질과 같은 복수의 양이온성 지질을 사용하여 제형화될 수 있다. 　제1 양이온성 지질은 제1 특성에 기초하여 선택될 수 있고, 제2 양이온성 지질은 제2 특성에 기초하여 선택될 수 있으며, 여기서, 특성들은 미국 공개특허 US 20130017223(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개략적으로 나타낸 바와 같이 결정될 수 있다.　일 실시형태에서, 제1 및 제2 특성은 상보적이다. 　
다른 실시형태에서, saRNA는 하나 이상의 양이온성 지질 및 하나 이상의 제2 지질을 포함하는 지질 입자 및 하나 이상의 핵산을 사용하여 제형될 수 있으며, 여기서, 지질 입자는 Cullis 등의 미국 공개특허 US 20120276209(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같은 고체 코어를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Satishchandran 등의 EP2298358(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같은 수중유 (o/w) 유화액 중의 양이온성 양친매성 물질과 복합체를 형성할 수 있다. 양이온성 양친매성 물질은 양이온성 지질, 변형되거나 변형되지 않은 스페르민, 부피바카인 또는 벤즈알코늄 클로라이드일 수 있으며, 오일은 식물성 또는 동물성 오일일 수 있다. 비제한적 예로서, 10% 이상의 핵산-양이온성 양친매성 물질 복합체는 수중유 유화액의 오일 상에 존재한다(예를 들면, Satishchandran 등의 유럽 공개특허 EP 2298358(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함됨)에 개시된 복합체를 참조).
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 양이온성 화합물과 중성 지질의 혼합물을 포함하는 조성물을 사용하여 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 양이온성 화합물은 안셀 등의 국제 공개공보 WO 1999010390(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 화학식 (I)일 수 있으며, 중성 지질은 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드 및 스핑고미엘린으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 지질 제형은 Akinc 등의 US 20120101148에 개시된 화학식 A의 양이온성 지질, 중성 지질, 스테롤 및 PEG 또는 PEG-변형 지질을 포함할 수 있으며, 그 내용은 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
일 실시형태에서, LNP 제형은 국제 공개공보 WO 2011127255 또는 WO 2008103276(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법으로 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 개시내용의 saRNA는 국제 공개공보 WO 2011127255 및/또는 WO2008103276(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 임의의 지질 나노입자(LNP) 제형에 캡슐화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 LNP 제형은 다가 양이온성 조성물을 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 다가 양이온성 조성물은 미국 공개특허 US 20050222064(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)의 화학식 1 내지 60으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, 다가 양이온성 조성물을 포함하는 LNP 제형은 생체내 및/또는 시험관내에서 본원에 기재된 saRNA의 전달에 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 LNP 제형은 투과성 증강 분자를 추가로 포함할 수 있다. 비제한적 투과성 증강 분자는 미국 공개특허 US 20050222064(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 DiLa2 리포좀(Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES®/NOV340(Marina Biotech, Bothell, WA), 리포좀 기반 중성 DOPC (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린)(예를 들면, 난소암을 위한 siRNA 전달 (Landen et al. Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨) 및 히알루로난-코팅된 리포좀(Quiet Therapeutics; Israel)과 같으나 이에 제한되지 않는 리포좀으로 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 판즈너(Panzner)의 국제 공개공보 WO 2008/043575 및 Essler 등의 미국 공개특허 US 8580297 (Marina Biotech)(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 임의의 양쪽성 리포좀을 사용하여 제형화될 수 있다. 양쪽성 리포좀은 양이온성 양친매성 물질, 음이온성 양친매성 물질 및 임의로 하나 이상의 중성 양친매성 물질을 포함하는 지질들의 혼합물을 포함할 수 있다. 양쪽성 리포좀은 양쪽성 분자를 기본으로 하는 양쪽성 화합물을 포함할 수 있으며, 이의 헤드 그룹은 하나 이상의 양쪽성 그룹으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 Essler 등의 미국 공개특허 US 20140227345 (Marina Biotech)(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 4와 9 사이의 등전점을 갖는 하나 이상 양쪽성 그룹을 포함하는 양쪽성 지질을 사용하여 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 Panzner 등의 US 7312206 (Novosom)에 개시된 바와 같은 스테롤 유도체를 포함하는 리포좀으로 제형화될 수 있고, 그 내용 전체는 참조로서 본원에 포함된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 양친매성 양이온 지질, 적어도 하나의 양친매성 음이온 지질, 및 적어도 하나의 중성 지질을 포함하는 양쪽성 리포좀, 또는 양성 및 음성 전하를 둘 다 갖는 적어도 하나의 양친매성 지질 및 적어도 하나의 중성 지질을 포함하는 리포좀으로 제형화될 수 있고, 여기서 리포좀은 Panzner 등의 미국 특허번호 7780983 (Novosom)에 개시된 바와 같이 pH 4.2 및 pH 7.5에서 안정하고, 그 내용 전체는 참조로서 본원에 포함된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 Panzner 등의 US 20110076322(그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 교시된 지질의 혈청-안정 혼합물을 포함하는 리포좀으로 제형화될 수 있으며, 이는 본 개시내용의 saRNA를 캡슐화할 수 있다. 지질 혼합물은 약 0.5 내지 약 8 범위의 비율로 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함한다. 지질 혼합물은 또한 pH 민감성 음이온성 및 양이온성 양친매성 물질을 포함할 수 있어, 상기 혼합물은 양쪽성이고, pH 7.4에서는 음전하를 띠거나 중성이고 pH 4에서는 양전하를 띤다. 약물/지질 비는 리포좀이 신체의 특정 기관이나 다른 부위를 표적으로 삼도록 조정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 카고로서 본 개시내용의 saRNA가 로딩된 리포좀은 Panzner 등의 US 20120021042에 개시된 방법에 의해 제조되며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로서 포함된다. 상기 방법은 다중음이온성 활성제의 수성 용액과 하나 이상의 양친매성 물질의 알코올성 용액을 혼합하고 상기 혼합물을 산성 pH로 완충시키는 단계를 포함하며, 여기서 하나 이상의 양친매성 물질은 산성 pH에서 양쪽성 리포좀을 형성하기 쉬우며, 그에 의해 활성제를 캡슐화하는 현탁액에서 양쪽성 리포좀을 형성한다.
나노입자 제형은 탄수화물 운반체 및 핵산 분자(예를 들면, saRNA)를 포함하는 탄수화물 나노입자일 수 있다. 비제한적 예로서, 탄수화물 운반체는 무수물-개질된 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질, 피토글리코겐 옥테닐 숙시네이트, 피토글리코겐 베타-덱스트린, 무수물-개질된 피토글리코겐 베타-덱스트린을 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. (예를 들면, 국제 공개공보 WO 2012109121 참조, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
지질 나노입자 제형은 급속히 제거되는 지질 나노입자(reLNP)로서 알려진 생분해성 양이온성 지질로 양이온성 지질을 대체함으로써 개선될 수 있다. DLinDMA, DLin-KC2-DMA 및 DLin-MC3-DMA와 같으나 이에 제한되지 않는 이온화 가능한 양이온성 지질은 시간 경과에 따라 혈장 및 조직에 축적되는 것으로 나타났으며, 잠재적 독성원일 수 있다. 급속히 제거되는 지질의 급속한 대사는 지질 나노입자의 내약성(tolerability) 및 치료 지수를 래트에서 1 mg/kg 용량에서 10 mg/kg 용량으로 크게 개선시킬 수 있다. 효소적으로 분해되는 에스테르 결합의 포함은 reLNP 제형의 활성을 여전히 유지하면서 양이온성 성분의 분해 및 대사 프로파일을 향상시킬 수 있다. 에스테르 결합은 지질 쇄 내에 내부적으로 위치할 수 있거나 지질 쇄의 말단에서 말단 끝에 위치할 수 있다. 내부 에스테르 결합은 지질 쇄 중의 임의의 탄소를 대체할 수 있다.
일 실시형태에서, saRNA는 ATUPLEXTM 시스템, DACC 시스템, DBTC 시스템 및 기타 siRNA-리포플렉스 기술(Silence Therapeutics; London, United Kingdom), STEMGENT®의 STEMFECTTM (Cambridge, MA), 및 핵산의 폴리에틸렌이민(PEI) 또는 프로타민-기반 표적화 및 비-표적화된 전달과 같으나 이에 제한되지 않는 리포플렉스로서 제형화될 수 있다 (Aleku et al. Cancer Res. 2008 68:9788-9798; Strumberg et al. Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76-78; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Kaufmann et al. Microvasc Res 2010 80:286-293 Weide et al. J Immunother. 2009 32:498-507; Weide et al. J Immunother. 2008 31:180-188; Pascolo Expert Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek et al., 2011 J. Immunother. 34:1-15; Song et al., Nature Biotechnol. 2005, 23:709-717; Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 6;104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 이러한 제형들은 또한 제조될 수 있거나, 이들이 간 세포, 면역 세포, 종양 세포, 내피 세포, 항원 제시 세포 및 백혈구를 포함하나 이에 제한되지 않는 생체내 다양한 세포 유형에 수동적으로 또는 능동적으로 유도되도록 조성 변경될 수 있다 (Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Judge et al., J Clin Invest. 2009 119:661-673; Kaufmann et al., Microvasc Res 2010 80:286-293; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Basha et al., Mol. Ther. 2011 19:2186-2200; Fenske and Cullis, Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:25-44; Peer et al., Science. 2008 319:627-630; Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다). 간 세포에 대한 제형의 수동 표적화의 한 예는 아포지질단백질 E에 결합하고 이들 제형의 생체내 간세포로의 흡수 및 결합을 촉진하는 것으로 나타난 DLin-DMA, DLin-KC2-DMA 및 DLin-MC3-DMA-기반 지질 나노입자 제형을 포함한다 (Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다). 제형은 또한 폴레이트, 트랜스페린, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 및 항체 표적화된 접근법으로 예시된 바와 같으나 이들로 제한되지 않는 표면 상에서 다양한 리간드의 발현을 통해 선택적으로 표적화될 수 있다 (Kolhatkar et al., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206; Musacchio and Torchilin, Front Biosci. 2011 16:1388-1412; Yu et al., Mol Membr Biol. 2010 27:286-298; Patil et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008 25:1-61; Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Zhao et al., Expert Opin Drug Deliv. 2008 5:309-319; Akinc et al., Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Srinivasan et al., Methods Mol Biol. 2012 820:105-116; Ben-Arie et al., Methods Mol Biol. 2012 757:497-507; Peer 2010 J Control Release. 20:63-68; Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:4095-4100; Kim et al., Methods Mol Biol. 2011 721:339-353; Subramanya et al., Mol Ther. 2010 18:2028-2037; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Peer et al., Science. 2008 319:627-630; Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, saRNA는 고체 지질 나노입자로서 제형화된다. 고체 지질 나노입자(SLN)는 평균 직경이 10nm 내지 1000nm 사이인 구형일 수 있다. SLN은 친지성 분자를 용해할 수 있고 계면활성제 및/또는 유화제로 안정화될 수 있는 고체 지질 코어 매트릭스를 보유한다. 추가의 실시형태에서, 지질 나노입자는 자가-조립형 지질-중합체 나노입자일 수 있다 (Zhang et al., ACS Nano, 2008, 2 (8), pp 1696-1702 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본원에서 사용된 "제어된 방출"은 치료 결과를 발생하기 위해 특정 패턴의 방출에 따르는 약제학적 조성물 또는 화합물 방출 프로파일을 의미한다. 일 실시형태에서, saRNA는 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위해 본원에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 전달제 내로 캡슐화될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "캡슐화하다"란, 포위하거나 둘러싸거나 감싸는 것을 의미한다. 이것은 본 개시내용의 화합물의 제형에 관한 것이기 때문에, 캡슐화는 실질적이거나 완전하거나 부분적일 수 있다. 용어 "실질적으로 캡슐화된"은 본 개시내용의 약제학적 조성물 또는 화합물의 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.9% 초과 또는 99.999% 초과가 전달제 내에 포위되거나 둘러싸이거나 감싸질 수 있는 것을 의미한다. "부분적으로 캡슐화된"은 본 개시내용의 약제학적 조성물 또는 화합물의 10, 10, 20, 30, 40, 50% 미만이 전달제 내에 포위되거나 둘러싸이거나 감싸질 수 있는 것을 의미한다. 유리하게, 캡슐화는 형광 및/또는 전자 현미경 사진을 사용하여 본 개시내용의 약제학적 조성물 또는 화합물의 이탈 또는 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 본 개시내용의 약제학적 조성물 또는 화합물의 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99% 또는 99.99% 초과가 전달제 내로 캡슐화된다.
다른 실시형태에서, saRNA는 지질 나노입자 또는 급속하게 제거되는 지질 나노입자 내로 캡슐화되고, 이어서 지질 나노입자 또는 급속하게 제거되는 지질 나노입자는 본원에 기재되어 있고/있거나 당업계에 공지되어 있는 중합체, 하이드로겔 및/또는 수술 밀봉제에 캡슐화될 수 있다. 비제한적 예로서, 중합체, 하이드로겔 또는 수술 밀봉제는 PLGA, 에틸렌 비닐 아세테이트(EVAc), 폴록사머, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX®(Halozyme Therapeutics, San Diego CA), 수술 밀봉제, 예를 들면, 피브리노겐 중합체(Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL®(Baxter International, Inc Deerfield, IL), PEG계 밀봉제, 및 COSEAL®(Baxter International, Inc Deerfield, IL)일 수 있다.
다른 실시형태에서, 지질 나노입자는 대상체에 주사될 때 겔을 형성할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 중합체에 캡슐화될 수 있다. 다른 비제한적 예로서, 지질 나노입자는 생분해성일 수 있는 중합체 매트릭스에 캡슐화될 수 있다.
일 실시형태에서, 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달을 위한 saRNA 제형은 또한 하나 이상의 제어된 방출 코팅을 포함할 수 있다. 제어된 방출 코팅은 OPADRY®, 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® 및 셀룰로스 유도체, 예를 들면, 에틸셀룰로스 수성 분산물(AQUACOAT® 및 SURELEASE®)을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 제어된 방출 및/또는 표적화된 전달 제형은 다가 양이온 측쇄를 함유할 수 있는 하나 이상의 분해성 폴리에스테르를 포함할 수 있다. 분해성 폴리에스테르는 폴리(세린 에스테르), 폴리(L-락티드-코-L-리신), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르), 및 이들의 조합을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 다른 실시형태에서, 분해성 폴리에스테르는 페길화된 중합체를 형성하기 위해서 PEG 접합체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Manoharan 등의 미국 공개특허 US 20130202652(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 표적화 잔기와 같은 표적화 잔기를 갖는 표적화 지질을 사용하여 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, Manoharan 등의 미국 공개특허 US 20130202652의 화학식 I의 표적화 잔기는 지질이 목적하는 기관, 조직, 세포, 세포 유형 또는 아형, 또는 소기관으로 국소화되기에 유리하도록 하기 위해서 선택될 수 있다. 본 개시내용에서 고려되는 비제한적 표적화 잔기는 트랜스페린, 아니스아미드, RGD 펩티드, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 푸코오스, 항체 또는 압타머를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 치료적 나노입자에 캡슐화될 수 있다. 치료적 나노입자는 본원에 기재된 방법 및 국제 공개공보 WO 2010005740, WO 2010030763, WO 2010005721, WO 2010005723, WO 2012054923, 미국 공개특허 US 20110262491, US 20100104645, US 20100087337, US 20100068285, US 20110274759, US 20100068286 및 US20120288541 및 미국 특허번호 8,206,747, 8,293,276, 8,318,208 및 8,318,211(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)과 같으나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법에 의해 제형화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 치료 중합체 나노입자는 미국 공개특허 US 20120140790(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 방법에 의해 확인될 수 있다.
일 실시형태에서, 치료적 나노입자는 서방출(sustained release)을 위해 제형화될 수 있다. 본원에 사용되는 "서방출"은 특정 기간에 걸쳐 방출 속도에 따르는 약제학적 조성물 또는 화합물을 의미한다. 기간은 시간, 일, 주, 월 및 년을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 비제한적 예로서, 서방출 나노입자는 중합체 및 치료제, 예를 들면, 본 개시내용의 saRNA를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다 (국제 공개공보 WO 2010075072 및 미국 공개특허 US 20100216804, US 20110217377 및 US 20120201859 참조; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 치료적 나노입자는 표적 특이적이도록 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 치료적 나노입자는 코르티코스테로이드를 포함할 수 있다(국제 공개공보 WO 2011084518을 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.). 일 실시형태에서, 치료적 나노입자는 암 특이적이도록 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 치료적 나노입자는 국제 공개공보 WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 및 미국 공개특허 US20100069426, US20120004293 및 US20100104655(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 나노입자로 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 나노입자는 중합체성 매트릭스를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 나노입자는 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리무수물, 폴리히드록시산, 폴리프로필푸머레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 폴리아민, 폴리리신, 폴리(에틸렌 이민), 폴리(세린 에스테르), 폴리(L-락티드-코-L-리신), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르) 또는 이들의 조합과 같으나 이들로 제한되지 않는 2개 이상의 중합체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 치료적 나노입자는 디블록 공중합체를 포함한다. 일 실시형태에서, 디블록 공중합체는, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리무수물, 폴리히드록시산, 폴리프로필푸머레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 폴리아민, 폴리리신, 폴리(에틸렌 이민), 폴리(세린 에스테르), 폴리(L-락티드-코-L-리신), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르) 또는 이들의 조합과 같으나 이에 제한되지 않는 중합체와 함께 PEG를 포함할 수 있다.
비제한적 예로서, 치료적 나노입자는 PLGA-PEG 블록 공중합체를 포함한다(미국 공개특허 US 20120004293 및 미국 특허 제8,236,330호 참조; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다). 다른 비제한적 예에서, 치료적 나노입자는 PEG와 PLA 또는 PEG와 PLGA의 디블록 공중합체를 포함하는 스텔스(stealth) 나노입자이다(미국 특허 제8,246,968호 및 국제 공개공보 WO 2012166923 참조; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 치료적 나노입자는 미국 특허번호 8,263,665 및 8,287,910(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 멀티블록 공중합체와 같은 멀티블록 공중합체를 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 블록 공중합체는 비-중합체성 미셀 및 블록 공중합체를 포함하는 다중 이온 착물에 포함될 수 있다(예를 들면, 미국 공개특허 US 20120076836 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 치료적 나노입자는 하나 이상의 아크릴 중합체를 포함할 수 있다. 아크릴 중합체는 아크릴산, 메타크릴산, 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 시아노에틸 메타크릴레이트, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 폴리시아노아크릴레이트 및 이들의 조합을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 치료적 나노입자는 폴리리신, 폴리에틸렌 이민, 폴리(아미도아민) 덴드리머, 폴리(베타-아미노 에스테르)(예를 들면, 미국 특허 제8,287,849호를 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다) 및 이들의 조합과 같으나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 아민-함유 중합체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 치료적 나노입자는 다가 양이온성 측쇄를 함유할 수 있는 하나 이상의 분해성 폴리에스테르를 포함할 수 있다. 분해성 폴리에스테르는 폴리(세린 에스테르), 폴리(L-락티드-코-L-리신), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르) 및 이들의 조합을 포함하나 이들로 제한되지 않는다 다른 실시형태에서, 분해성 폴리에스테르는 페길화된 중합체를 형성하기 위해 PEG 접합체를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 치료적 나노입자는 하나 이상의 표적화 리간드의 접합체화를 포함할 수 있다. 표적화 리간드는 모노클로날 항체와 같으나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 리간드일 수 있다 (Kirpotin et al, Cancer Res. 2006 66:6732-6740; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 치료적 나노입자는 암을 표적화하는데 사용될 수 있는 수용액으로 제형화될 수 있다(국제 공개공보 WO 2011084513 및 미국 공개특허 US 20110294717 참조; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, saRNA는 합성 나노운반체에 캡슐화, 연결 및/또는 결합될 수 있다. 합성 나노운반체는 국제 공개공보 WO 2010005740, WO 2010030763, WO 201213501, WO 2012149252, WO 2012149255, WO 2012149259, WO 2012149265, WO 2012149268, WO 2012149282, WO 2012149301, WO 2012149393, WO 2012149405, WO 2012149411, WO 2012149454 및 WO 2013019669, 및 미국 공개특허 US 20110262491, US 20100104645, US 20100087337 및 US 20120244222 (이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 것들을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 합성 나노운반체는 당업계에 공지되어 있는 방법 및/또는 본원에 기재된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 합성 나노운반체는 국제 공개공보 WO 2010005740, WO 2010030763 및 WO 201213501 및 미국 공개특허 US 20110262491, US 20100104645, US 20100087337 및 US 2012024422, (이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 방법으로 제형화될 수 있다. 다른 실시형태에서, 합성 나노운반체 제형은 국제 공개공보 WO 2011072218 및 미국 특허 제8,211,473호(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 방법으로 동결건조될 수 있다.
일 실시형태에서, 합성 나노운반체는 본원에 기재된 saRNA를 방출하기 위해 반응성 그룹을 포함할 수 있다(국제 공개공보 WO 20120952552 및 미국 공개특허 US 20120171229 참조; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 합성 나노운반체는 표적화된 방출을 위해 제형화될 수 있다. 일 실시형태에서, 합성 나노운반체는 특정 pH에서 및/또는 원하는 시간 간격 후에 saRNA를 방출하도록 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 합성 나노입자는 24 시간 후 및/또는 4.5의 pH에서 saRNA를 방출하도록 제형화될 수 있다(국제 공개공보 WO 2010138193 및 WO 2010138194 및 미국 공개특허 US 20110020388 및 US 20110027217 참조; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 합성 나노운반체는 본원에 기재된 saRNA의 제어된 방출 및/또는 서방출을 위해 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 서방출을 위한 합성 나노운반체는 당업계에 공지된 방법으로, 본원에 기재된 방법으로 및/또는 국제 공개공보 WO 2010138192 및 미국 공개특허 20100303850(이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 나노입자는 경구 투여를 위해 최적화될 수 있다. 나노입자는 키토산 또는 이의 유도체와 같으나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 양이온성 생체고분자를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 나노입자는 미국 공개특허 20120282343(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 방법으로 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Manoharan 등의 미국 특허 제8575123호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같은 모듈식 조성물로 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 모듈식 조성물은 핵산, 예를 들면, 본 개시내용의 saRNA, 하나 이상의 엔도좀 분해성 성분 및 하나 이상의 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 모듈식 조성물은 Manoharan 등의 미국 특허번호 8575123 (그 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 임의의 화학식과 같은 화학식을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Fougerolles 등의 미국 특허 제8546554호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들과 같은 안정한 핵산-지질 입자(SNALP)를 형성하기 위해 지질 제형으로 캡슐화될 수 있다. 지질은 양이온성 또는 비이온성일 수 있다. 하나의 비제한적 예에서, 지질 대 핵산 비(질량/질량 비)(예를 들면, 지질 대 saRNA 비)는 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1 또는 약 6:1 내지 약 9:1, 또는 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 또는 11:1의 범위일 것이다. 다른 예에서, SNALP는 40% 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란(지질 A), 10% 디올레오일포스파티딜콜린(DSPC), 40% 콜레스테롤 및 10% 폴리에틸렌글리콜(PEG)-C-DOMG(몰%)을 포함하고 63.0±20 nm의 입자 크기 및 0.027의 핵산/지질 비를 가진다. 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Lam 등의 미국 특허 제7189705호(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같은 엔도좀 막 탈안정화제를 포함하는 핵산-지질 입자를 사용하여 제형화될 수 있다. 비제한적 예로서, 엔도좀 막 탈안정화제는 Ca2+ 이온일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Akinc 등의 미국 특허번호 8148344(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 제형화된 지질 입자(FLiP)를 사용하여 제형화될 수 있다. Akinc 등은 FLiP가 하나 이상의 단일 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 올리고뉴클레오티드는 접합된 올리고뉴클레오티드가 응집, 혼합 또는 결합되어 있는 하나 이상의 유화액 또는 리포좀 및 친지성 물질에 접합되어 있다. 놀랍게도, 이들 입자는 Akinc 등의 미국 특허번호 8148344(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드를 심장, 폐 및 근육으로 효과적으로 전달하는 것으로 나타났다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Tam 등의 미국 특허번호 6086913(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같은 발현 벡터를 지질 제형에 포함하는 조성물을 사용하여 세포에 전달될 수 있다. Tam에 의해 개시된 조성물은 혈청-안정하며 아데노 관련 바이러스 (AAV)로부터의 제1 및 제2 역 반복 서열, AAV로부터의 rep 유전자 및 핵산 단편을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 탐의 발현 벡터는 지질과 복합체를 형성한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Fougerolles 등의 미국 공개특허 US 20120270921(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 지질 제형을 사용하여 제형화될 수 있다. 하나의 비제한적 예에서, 지질 제형은 미국 공개특허 US 20120270921(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 화학식 A의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 미국 공개특허 US　20120270921(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)의 표 A에 개시된 예시적 핵산-지질 입자의 조성물은 본 개시내용의 saRNA와 함께 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Maurer 등의 미국 공개특허 US 20120276207(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 지질 입자에 완전히 캡슐화될 수 있다. 　입자는 탈안정화제 용매 중에서 예비형성된 소포와 치료제의 혼합물을 형성하기 위해 예비형성된　지질 소포, 하전된 치료제 및 탈안정화제를 포함하는 지질 조성물을 포함할 수 있으며, 상기 탈안정화 용매는 소포를 방해하지 않고 예비형성된 지질 소포의 막을 탈안정화시키기에 효과적이다.　
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 접합된 지질을 사용하여 제형화될 수 있다. 　비제한적 예에서, 접합된 지질은 Lin 등의 미국 공개특허 US 20120264810(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같은 화학식을 가질 수 있다.　접합된 지질은 양이온성 지질, 중성 지질, 및 응집을 감소시킬 수 있는 지질을 추가로 포함하는 지질 입자를 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 Fitzgerald 등의 미국 특허출원 20120244207(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같은 중성 리포좀 제형으로 제형화될 수 있다. 　어구 "중성 리포좀 제형"은 생리학적 pH에서 거의 중성이거나 중성 표면 전하를 갖는 리포좀 제형을 의미한다. 생리학적 pH는, 예를 들면, 약 7.0 내지 약 7.5, 또는, 예를 들면, 약 7.5, 또는, 예를 들면, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5, 또는, 예를 들면, 7.3, 또는, 예를 들면, 7.4일 수 있다. 중성 리포좀 제형의 예는 이온화 가능한 지질 나노입자(iLNP)이다. 중성 리포좀 제형은 이온화 가능한 양이온성 지질, 예를 들면, DLin-KC2-DMA를 포함할 수 있다.　
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 하전된 지질 또는 아미노 지질을 사용하여 제형화될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "하전된 지질"은 1개 또는 2개의 지방 아실 또는 지방 알킬 쇄 및 4차 아미노 헤드 그룹을 갖는 지질을 포함하는 것을 의미한다. 4차 아민은 영구 양 전하를 지닌다. 헤드 그룹은 생리학적 pH에서 양성자화될 수 있는 1차, 2차 또는 3차 아민과 같은 이온 가능한 그룹을 임의로 포함할 수 있다. 4차 아민의 존재는 4차 아민이 없는 구조적으로 유사한 화합물 (예를 들면, 4차 아민은 3차 아민으로 대체된다)의 이온화 가능한 그룹의 pKa에 상대적으로 이온화 가능한 그룹의 pKa를 변화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 하전된 지질은 "아미노 지질"로서 언급된다. 비제한적 예에서, 임의의 아미노 지질은 Hope 등의 미국 공개특허 US 20110256175 (이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 아미노 지질일 수 있다. 예를 들면, 아미노 지질은 Hope의 표 3 내지 7에 개시된 구조, 예컨대 구조(II), DLin-K-C2-DMA, DLin-K2-DMA, DLin-K6-DMA 등을 가질 수 있다. 생성된 약제학적 제제는 Hope에 따라 동결건조될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예에서, 아미노 지질은 Hope 등의 미국 공개특허 20110117125 (이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 임의의 아미노 지질, 예컨대 구조 (I)의 지질, DLin-K-DMA, DLin-C-DAP, DLin-DAC, DLin-MA, DLin-S-DMA 등 일 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 아미노 지질은 Manoharan 등의 국제 공개공보 WO 2009132131(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같은 구조 (I), (II), (III) 또는 (IV), 또는 4-(R)-DUn-K-DMA (VI), 4-(S)-DUn-K-DMA (V)를 가질 수 있다. 　다른 비제한적 예에서, 본원에 기재된 임의의 제형에 사용되는 하전된 지질은 Manoharan 등의 EP2509636 (이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 임의의 하전된 지질일 수 있다.
일 실시형태에서,　본 개시내용의 saRNA는 지질, 리포좀 또는 리포플렉스를 함유하는 연합 복합체를 사용하여 제형화될 수 있다. 　비제한적 예에서, 연합 복합체는 Manoharan 등의 미국 특허번호 8034376(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 화학식 (I)로 정의된 구조를 각각 가지는 하나 이상의 화합물, 화학식 (XV)로 정의된 구조를 갖는 PEG-지질, 스테로이드 및 핵산을 포함한다. 　saRNA는 미국 특허번호 8034376(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 임의의 연합 복합체를 사용하여 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 역 헤드 그룹 지질을 사용하여 제형화될 수 있다.　비제한적 예로서, saRNA는 Leung 등의 국제 공개공보　WO 2011056682(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 구조 (A) 또는 구조 (I)을 갖는 지질과 같은 헤드 그룹을 포함하는 쌍성 이온성 지질(여기서, 양 전하는 아실 쇄 영역 가까이에 위치하고, 음 전하는 헤드 그룹의 원위 말단부에 위치한다)을 사용하여 제형화될 수 있다. 　
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 지질 이중층 운반체 내로 제형화될 수 있다. 　비제한적 예로서, saRNA는 Cullis 등의 국제 공개공보 WO 1999018933(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 약 5 몰% 내지 약 20 몰%의 양의 응집 방지제, 약 0.5 몰% 내지 약 50 몰%의 양의 양이온성 지질, 및 융합성 지질 및 세제의 지질 혼합물을 포함하는 지질-세제 혼합물과 배합되어 핵산-지질-세제 혼합물을 제공하고; 이어서, 완충된 염 용액에 대하여 상기 핵산-지질-세제 혼합물을 투석하여 상기 세제를 제거하고, 상기 핵산을 지질 이중층 운반체에 캡슐화하고, 지질 이중층-핵산 조성물을 제공할 수 있으며, 여기서, 상기 완충된 염 용액은 상기 핵산의 약 40% 내지 약 80%를 캡슐화하기에 충분한 이온 강도를 가진다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 saRNA를 심장, 간 또는 종양 조직 부위로 선택적으로 표적화할 수 있는 핵산-지질 입자로 제형화될 수 있다. 　예를 들면, 핵산-지질 입자는 Cullis 등의 유럽 공개특허 EP1328254(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 (a) 핵산;　(b) 1.0 몰% 내지 45 몰%의 양이온성 지질;　(c) 0.0 몰% 내지 90 몰%의 다른 지질;　(d) 1.0 몰% 내지 10 몰%의 이중층 안정화 성분;　(e) 0.0 몰% 내지 60 몰%의 콜레스테롤; 및　(f) 0.0 몰% 내지 10 몰%의 양이온성 중합체 지질을 포함할 수 있다. Cullis는 상기 양이온성 지질, 이중층 안정화 성분, 다른 지질, 콜레스테롤 및 양이온성 중합체 지질 각각의 양의 변화가 심장, 간 또는 종양 조직 부위에 대한 조직 선택성을 부여하고, 이에 의해 핵산을 상기 심장, 간 또는 종양 조직 부위로 선택적으로 표적화할 수 있는 핵산-지질 입자를 확인할 수 있는 것을 교시한다.
중합체, 생분해성 나노입자 및 코어-쉘 나노입자
본 개시내용의 saRNA는 천연 및/또는 합성 중합체를 사용하여 제형화될 수 있다. 전달에 사용될 수 있는 중합체의 비제한적인 예에는 MIRUS® Bio(Madison, WI) 및 Roche Madison(Madison, WI)의 DYNAMIC POLYCONJUGATE®(Arrowhead Research Corp., Pasadena, CA) 제형, PHASERX™ 중합체 제형, 예컨대 비제한적으로 SMARTT POLYMER TECHNOLOGY™(PHASERX®, Seattle, WA), DMRI/DOPE, 폴록사머, Vical(San Diego, CA)의 VAXFECTIN® 보조제, 키토산, Calando Pharmaceuticals(Pasadena, CA)의 시클로덱스트린, 덴드리머 및 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) 중합체가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. RONDEL™ (RNAi/올리고뉴클레오티드 나노입자 전달) 중합체(Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA) 및 pH 반응성 코-블록 중합체, 예컨대 비제한적으로 PHASERX(®(Seattle, WA).
키토산 제형의 비제한적 예에는 양전하를 띤 키토산의 코어 및 음전하를 띤 기질의 바깥 부분이 포함된다 (미국 공개특허 20120258176; 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 키토산은 N-트리메틸 키토산, 모노-N-카르복시메틸 키토산(MCC), N-팔미토일 키토산(NPCS), EDTA-키토산, 저분자량 키토산, 키토산 유도체, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 사용된 중합체는 중합체 표면에 대한 원치 않는 물질, 비제한적인 예로서, 박테리아의 부착을 감소 및/또는 억제하기 위한 가공을 거쳤다. 중합체는 당해 기술분야에 공지 및/또는 기재되어 있고/있거나 국제 공개공보 WO2012150467 (본원에 그 전체 내용이 참조로 포함됨)에 개시된 방법에 의해 가공될 수 있다.
PLGA 제형의 비제한적 예에는 PLGA 주사용 데포(예: 66% N-메틸-2-피롤리돈(NMP)에 PLGA를 용해시켜 형성된 ELIGARD® 및 나머지 수성 용매 및 류프롤리드(leuprolide)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일단 주입되면, PLGA와 류프롤리드 펩티드가 피하 공간으로 침전된다.
이러한 중합체 접근법 중 다수는 생체 내에서 올리고뉴클레오티드를 세포질로 전달하는 효능을 입증하였다 (de Fougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132 에서 리뷰됨; 그 전문이 본원에 참고로 포함된다). 핵산의 강력한 생체 내 전달을 가능케 하는 두 가지 중합체 접근 방식(이 경우 작은 간섭 RNA(siRNA) 사용)은 동적 폴리컨쥬게이트와 시클로덱스트린 기반 나노입자이다. 이러한 전달 접근 방식 중 첫 번째는 동적 폴리컨쥬게이트를 사용하며 생쥐의 생체 내에서 siRNA를 효과적으로 전달하고 간세포에서 내인성 표적 mRNA를 침묵시키는 것으로 나타났다 (Rozema et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:12982-12887; 그 전문이 본원에 참고로 포함된다). 이 특별한 접근법은 핵산(이 경우 siRNA)이 이황화 결합을 통해 공유 결합되고, PEG(전하 마스킹용)와 N-아세틸갈락토사민(간세포 표적용) 그룹이 pH 민감성 결합을 통해 연결된 막-활성 중합체를 주요 특징으로 하는 다성분 중합체 시스템이다 (Rozema et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2007 104:12982-12887; 그 전문이 본원에 참고로 포함된다). 간세포에 결합하여 엔도좀으로 진입하면, 중합체 복합체는 낮은 pH 환경에서 분해되며, 중합체가 그의 양전하를 노출하여 중합체로부터 siRNA의 엔도좀 탈출 및 세포질 방출로 이어진다. N-아세틸갈락토사민 기를 만노스 기로 대체함으로써, 아시알로당단백질 수용체-발현 간세포에서 동굴 내피(sinusoidal endothelium) 세포 및 쿠퍼(Kupffer) 세포로의 표적화를 변경할 수 있음이 밝혀졌다. 또 다른 중합체 접근법은 트랜스페린 표적화 시클로덱스트린 함유 다중양이온 나노입자를 사용하는 것을 포함한다. 이들 나노입자는 트랜스페린 수용체-발현 유잉 육종(Ewing's sarcoma) 종양 세포에서 EWS-FLI1 유전자 생성물 의 표적화된 침묵을 입증하였고 (Hu-Lieskovan et al., Cancer Res.2005 65: 8984-8982; 그 전문이 본원에 참고로 포함됨) 및 이들 나노입자에서 제형화된 siRNA는 비인간 영장류에서 잘 용인되었다 (Heidel et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21; 그 전문이 본원에 참고로 포함된다). 이러한 전달 전략은 표적 전달 및 엔도좀 탈출 메커니즘을 둘 모두 사용하는 합리적인 접근 방식을 통합한다.
중합체 제형은 saRNA의 서방출 또는 지연 방출(예를 들어, 근육내 또는 피하 주사 후)을 허용할 수 있다. saRNA에 대한 변경된 방출 프로파일은 예를 들어 장기간에 걸쳐 인코딩된 단백질의 번역을 초래할 수 있다. 생분해성 중합체는 이전에 핵산을 분해로부터 보호하기 위해 사용되었으며 생체 내에서 페이로드의 지속적인 방출을 초래하는 것으로 나타났다 (Rozema et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:12982-12887; Sullivan et al., Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:1433-1446; Convertine et al., Biomacromolecules. 2010 Oct 1; Chu et al., Acc Chem Res. 2012 Jan 13; Manganiello et al., Biomaterials. 2012 33:2301-2309; Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Singha et al., Nucleic Acid Ther. 2011 2:133-147; de Fougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132; Schaffert and Wagner, Gene Ther. 2008 16:1131-1138; Chaturvedi et al., Expert Opin Drug Deliv. 2011 8:1455-1468; Davis, Mol Pharm. 2009 6:659-668; Davis, Nature 2010 464:1067-1070; 이들 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 서방출 제형일 수 있다. 추가 실시형태에서, 서방출 제형은 피하 전달을 위한 것일 수 있다. 서방출 제형에는 PLGA 마이크로구, 에틸렌 비닐 아세테이트(EVAc), 폴록사머, GELSITE®(Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX®(Halozyme Therapeutics, San Diego CA), 수술용 밀봉제, 예를 들어 피브리노겐 중합체(Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL®(Baxter International, Inc Deerfield, IL), PEG 기반 밀봉제 및 COSEAL®(Baxter International, Inc Deerfield, IL)가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
비제한적인 예로서, saRNA는 조정 가능한 방출 속도(예를 들어, 일수 및 주수)로 PLGA 마이크로구를 제조하고 캡슐화 과정 동안 saRNA의 무결성을 유지하면서 saRNA를 PLGA 마이크로구에 saRNA를 캡슐화함으로써 PLGA 마이크로구에 제형화될 수 있다. EVAc는 비생분해성, 생체적합성 중합체로 전임상 서방출 임플란트 응용 분야에 광범위하게 사용된다 (예를 들어, 연장 방출 제품 Ocusert 녹내장용 필로카르핀 안과 삽입물 또는 프로게스타서트(progestasert) 서방출 프로게스테론 자궁내 장치; 경피 전달 시스템 Testoderm, Duragesic 및 Selegiline; 카테터). Poloxamer F-407 NF는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌의 친수성 비이온성 계면활성제 삼중 블록 공중합체로 5℃ 미만의 온도에서 낮은 점도를 가지고 15℃ 초과의 온도에서는 고체 겔을 형성한다. PEG 기반 수술용 밀봉재는 전달 장치에 혼합된 2개의 합성 PEG 성분을 포함하며, 이는 1분 안에 준비되고 3분 안에 밀봉되며 30일 이내에 재흡수된다. GELSITE® 및 천연 중합체는 투여 부위에서 인시츄(in-situ) 겔화가 가능하다. 이는 이온 상호작용을 통해 단백질 및 펩티드 치료 후보물질과 상호작용하여 안정화 효과를 제공하는 것으로 나타났다.
중합체 제형은 또한 엽산, 트랜스페린 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)에 의해 비제한적으로 예시되는 바와 같이 다양한 리간드의 발현을 통해 선택적으로 표적화될 수 있다 (Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Rozema et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2007 104:12982-12887; Davis, Mol Pharm. 2009 6:659-668; Davis, Nature 2010 464:1067-1070; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다).
본 개시내용의 saRNA는 중합체성 화합물과 함께 또는 중합체성 화합물 내에 제형화될 수 있다. 중합체는 적어도 하나의 중합체, 예컨대 비제한적으로 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(1-리신)(PLL), PLL에 그래프팅된 PEG, 양이온성 지질중합체, 생분해성 양이온성 지질중합체, 폴리에틸렌이민(PEI), 가교형 분지화 폴리(알킬렌 이민), 폴리아민 유도체, 변형 폴록사머, 생분해성 중합체, 탄성 생분해성 중합체, 생분해성 블록 공중합체, 생분해성 랜덤 공중합체, 생분해성 폴리에스테르 공중합체, 생분해성 폴리에스테르 블록 공중합체, 생분해성 폴리에스테르 블록 랜덤 공중합체, 다중 블록 공중합체, 선형 생분해성 공중합체, 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산)(PAGA), 생분해성 가교 양이온 다중 블록 공중합체, 폴리카보네이트, 폴리무수물, 폴리히드록시산, 폴리프로필푸메레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 폴리아민, 폴리리신, 폴리(에틸렌 이민), 폴리(세린 에스테르), 폴리(L-락타이드- 코-L-리신), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르), 아크릴 중합체, 아민 함유 중합체, 덱스트란 중합체, 덱스트란 중합체 유도체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
비제한적인 예로서, 본 개시내용의 saRNA는 미국 특허번호 6,177,274 (그 전체는 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이 PLL로 그래프트된 PEG의 중합체성 화합물로 제형화될 수 있다. 제형화는 시험관 내에서 세포를 형질감염시키기 위해 또는 saRNA의 생체 내 전달을 위해 사용될 수 있다. 또 다른 예시에서, saRNA는, 미국 공개특허 20090042829 및 20090042825 (이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같이, 양이온성 중합체를 갖는 용액 또는 매질, 건조 제약 조성물 또는 건조될 수 있는 용액에 현탁될 수 있다.
또 다른 비제한적 예로서, 본 개시내용의 saRNA는 PLGA-PEG 블록 공중합체(미국 공개특허 US20120004293 및 미국 특허번호 8,236,330 참조, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 또는 PLGA-PEG-PLGA 블록 공중합체(미국 특허번호 6,004,573호 참조, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)으로 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 개시내용의 saRNA는 PEG와 PLA 또는 PEG와 PLGA의 이중블록 공중합체로 제형화될 수 있다 (미국 특허번호 8,246,968 참조, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다).
폴리아민 유도체는 핵산을 전달하거나 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용되거나 또는 이식형 또는 주사형 장치에 포함되어 사용될 수 있다 (미국 공개번호 20100260817, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 비제한적인 예로서, 약제학적 조성물은 미국 공개번호 20100260817 (그 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다)에 개시된 saRNA 및 폴리아민 유도체를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 개시내용의 saRNA는 폴리아미드 중합체, 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 올리고아민을 포함하는 딜카인 단위와 탄수화물 디아지드 단량체를 조합하여 제조된 1,3-쌍극성 첨가 중합체 (미국 특허번호 8,236,280; 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 포함하는 중합체를 사용하여 전달될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 국제 공개번호 WO2011115862, WO2012082574 및 WO2012068187, 및 미국 공개번호 20120283427 (이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 적어도 하나의 중합체 및/또는 그의 유도체로 제형화될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 WO2011115862 (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같이 화학식 Z의 중합체로 제형화될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, saRNA는 국제 공개번호 WO2012082574 또는 WO2012068187 및 미국 공개번호 2012028342 (이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이 화학식 Z, Z' 또는 Z"의 중합체로 제형화 될 수 있다. 본 개시내용의 saRNA로 제형화된 중합체는 국제 공개번호 WO2012082574 또는 WO2012068187 (이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 방법에 의해 합성될 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 적어도 하나의 아크릴 중합체로 제형화될 수 있다. 아크릴 중합체는 아크릴산, 메타크릴산, 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 시아노에틸 메타크릴레이트, 아미노 알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 폴리시아노아크릴레이트 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. .
본 개시내용의 saRNA의 제형은 예컨대 비제한적으로 폴리리신, 폴리에틸렌 이민, 폴리(아미도아민) 덴드리머 또는 이들의 조합과 같은 적어도 하나의 아민 함유 중합체를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 개시내용의 saRNA는 폴리(알킬렌 이민), 생분해성 양이온성 지질중합체, 생분해성 블록 공중합체, 생분해성 중합체, 또는 생분해성 랜덤 공중합체, 생분해성 폴리에스테르 블록 공중합체, 생분해성 폴리에스테르 중합체, 생분해성 폴리에스테르 랜덤 공중합체, 선형 생분해성 공중합체, PAGA, 생분해성 가교 양이온 다중 블록 공중합체 또는 이들의 조합을 포함하는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 생분해성 양이온성 지질중합체는 당업계에 공지되어 있고/있거나 미국 특허번호 6,696,038, 미국 출원번호 20030073619 및 20040142474 (이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리(알킬렌 이민)은 당업계에 공지된 방법 및/또는 미국 공개번호 20100004315 (본원에 그 전체 내용이 참조로 포함됨)에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 생분해성 중합체, 생분해성 블록 공중합체, 생분해성 랜덤 공중합체, 생분해성 폴리에스테르 블록 공중합체, 생분해성 폴리에스테르 중합체, 또는 생분해성 폴리에스테르 랜덤 공중합체는 당업계에 공지된 방법 및/또는 미국 특허번호 6,517,869 및 6,267,987 (이의 내용은 각각 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 선형 생분해성 공중합체는 당업계에 공지된 방법 및/또는 미국 특허번호 6,652,886에 개시된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. PAGA 폴리머는 당업계에 공지된 방법 및/또는 미국 특허번호 6,217,912 (그 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. PAGA 중합체는 비제한적으로 폴리-L-리신, 폴리아르긴, 폴리오르니틴, 히스톤, 아비딘, 프로타민, 폴리락티드 및 폴리(락티드-코-글리콜리드)와 같은 중합체로 공중합체 또는 블록 공중합체를 형성하도록 공중합될 수 있다. 생분해성 가교 양이온성 다중블록 공중합체는 당업계에 공지된 방법 및/또는 미국 특허번호 8,057,821 또는 미국 공개번호 2012009145 (이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같은 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 다중블록 공중합체는 분지형 폴리에틸렌이민과 비교하여 뚜렷한 패턴을 갖는 선형 폴리에틸렌이민(LPEI) 블록을 사용하여 합성될 수 있다. 또한, 조성물 또는 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 방법, 본원에 기재된 방법, 또는 미국 공개번호 20100004315 또는 미국 특허번호 6,267,987 및 6,217,912 (각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 다중양이온성 측쇄를 함유할 수 있는 적어도 하나의 분해성 폴리에스테르로 제형화될 수 있다. 분해성 폴리에스테르에는 폴리(세린 에스테르), 폴리(L-락타이드-코-L-리신), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르) 및 이들의 조합이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 실시형태에서, 분해성 폴리에스테르는 PEG화 중합체를 형성하기 위해 PEG 접합을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 적어도 하나의 가교성 폴리에스테르로 제형화될 수 있다. 가교성 폴리에스테르는 당업계에 공지되어 있고 미국 공개번호 20120269761 (본원에 그 전체 내용이 참조로 포함됨)에 개시된 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 중합체는 지질 종결 PEG에 접합될 수 있다. 비제한적인 예로서, PLGA는 지질 종결 PEG에 접합되어 PLGA-DSPE-PEG를 형성할 수 있다. 또 다른 비제한적 예로서, 본 개시내용과 함께 사용하기 위한 PEG 접합체는 국제 공개번호 WO2008103276 (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. 중합체는 리간드 접합체, 예를 들어, 비제한적으로, 미국 특허번호 8,273,363 (본원에 그 전체 내용이 참조로 포함됨)에 개시된 접합체를 사용하여 접합될 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 기재된 saRNA는 또 다른 화합물과 접합될 수 있다. 접합체의 비제한적 예는 미국 특허번호 7,964,578 및 7,833,992 (이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 미국 특허번호 7,964,578 및 7,833,992 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같이 화학식 1 내지 122의 접합체와 접합될 수 있다. 본원에 기재된 saRNA는 금속, 예컨대, 비제한적으로 금과 접합될 수 있다. (예를 들어, Giljohann et al. Journ. Amer. Chem. Soc. 2009 131(6): 2072-2073 참조; 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다). 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 saRNA는 금-나노입자에 접합 및/또는 캡슐화될 수 있다 (국제 공개번호 WO201216269 및 미국 공개번호 20120302940; 이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다).
미국 공개번호 20100004313에 개시된 바와 같이, 유전자 전달 조성물은 뉴클레오티드 서열 및 폴록사머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 saRNA는 미국 공개번호 20100004313에 개시된 폴록사머와 함께 유전자 전달 조성물에 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 중합체 제형은 양이온성 담체를 포함할 수 있는 중합체 제형을 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜 기에 공유 결합될 수 있는 양이온성 지질중합체와 접촉시킴으로써 안정화될 수 있다. 중합체 제형은 미국 공개번호 20090042829 (그 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 방법을 사용하여 양이온성 지질중합체와 접촉될 수 있다.
양이온성 담체는 폴리에틸렌이민, 폴리(트리메틸렌이민), 폴리(테트라메틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-b-시클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(리신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화 젤라틴, 덴드리머, 키토산, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 1-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-히드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일]콜레스테롤 염산염(DC-콜레스테롤 HCl) 디헵타데실아미도글리실 스페르미딘 (DOGS), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC) 및 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 saRNA는 하나 이상의 중합체의 폴리플렉스로 제형화될 수 있다 (미국 공개번호 20120237565 및 20120270927; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다). 일 실시형태에서, 폴리플렉스는 2개 이상의 양이온성 중합체를 포함한다. 양이온성 중합체는 선형 PEI와 같은 폴리(에틸렌 이민)(PEI)을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 또한 중합체, 지질, 및/또는 기타 생분해성 제제, 예컨데 비제한적으로 인산칼슘의 조합을 사용하여 나노입자로서 제형화될 수 있다. 구성요소는 코어-쉘, 하이브리드 및/또는 층별 아키텍처로 결합되어 나노입자의 미세 조정을 허용하여 saRNA의 전달이 향상될 수 있다 (Wang et al., Nat Mater. 2006) 5:791-796; Fuller et al., Biomaterials. 2008 29:1526-1532; DeKoker et al., Adv Drug Deliv Rev. 2011 63:748-761; Endres et al., Biomaterials. 2011 32:7721-7731 Su et al., Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):774-87; 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 비제한적인 예로서, 나노입자는 비제한적으로 친수성-소수성 중합체(예: PEG-PLGA), 소수성 중합체(예: PEG) 및/또는 친수성 중합체와 같은 복수의 중합체를 포함할 수 있다 (국제 공개번호 WO20120225129; 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다).
생분해성 인산칼슘 나노입자는 지질 및/또는 중합체와 결합하여 생체 내에서 saRNA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 아니사미드와 같은 표적화 리간드도 함유할 수 있는 지질 코팅된 인산칼슘 나노입자는 본 개시내용의 saRNA를 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 마우스 전이성 폐 모델에서 siRNA를 효과적으로 전달하기 위해 지질 코팅된 인산칼슘 나노입자가 사용되었다 (Li et al., J Contr Rel. 2010 142: 416-421; Li et al., J Contr Rel. 2012 158: 108-114; Yang et al., Mol Ther. 2012 20:609-615; 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 이 전달 시스템은 siRNA의 전달을 개선하기 위해 표적 나노입자와 엔도솜 탈출을 향상시키는 성분인 인산칼슘 둘 다를 결합시킨다.
일 실시형태에서, PEG-다중음이온 블록 공중합체를 갖는 인산칼슘은 saRNA를 전달하는데 사용될 수 있다 (Kazikawa et al., J Contr Rel. 2004 97:345-356; Kazikawa et al., J Contr Rel. 2006 111:368- 370; 그 전문이 참조로 본원에 포함된다).
일 실시형태에서, PEG-전하-전환 중합체 (Pitella et al., Biomaterials. 2011 32:3106-3114)를 사용하여 본 개시내용의 saRNA를 전달하기 위한 나노입자를 형성할 수 있다. PEG-전하-전환 중합체는 산성 pH에서 다중양이온으로 절단됨으로써 PEG-다중음이온 블록 공중합체를 개량하여 엔도좀 탈출을 향상시킬 수 있다.
코어-쉘 나노입자의 사용은 양이온성 가교 나노겔 코어 및 다양한 쉘을 합성하기 위한 고처리량 접근법에 추가적으로 초점을 맞추었다 (Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2011 108:12996-13001). 중합체성 나노입자의 복합체화, 전달 및 내재화는 나노입자의 코어 및 쉘 성분 둘 모두의 화학적 조성을 변경함으로써 정밀하게 제어될 수 있다. 예를 들어, 코어-쉘 나노입자는 콜레스테롤을 나노입자에 공유적으로 부착한 후 saRNA를 마우스 간세포에 효율적으로 전달할 수 있다.
일 실시형태에서, 중간 PLGA 층 및 PEG를 함유하는 외부 중성 지질 층을 포함하는 중공 지질 코어가 본 개시내용의 saRNA의 전달에 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 루시퍼라제 발현 종양이 있는 마우스에서 지질-중합체-지질 하이브리드 나노입자는 기존의 리포플렉스와 비교하여 루시퍼라제 발현을 유의하게 억제하는 것으로 확인되었다 (Shi et al, Angew Chem Int Ed. 2011 50:7027-7031; 본원에 그 전문이 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 지질 나노입자는 본원에 개시된 saRNA의 코어 및 중합체 쉘을 포함할 수 있다. 중합체 쉘은 본원에 기재된 임의의 중합체일 수 있으며 당업계에 공지되어 있다. 추가 실시형태에서, 중합체 쉘은 코어의 변형된 핵산을 보호하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 saRNA와 함께 사용하기 위한 코어-쉘 나노입자는 미국 특허 번호 8,313,777 (그 전체 내용이 참조로 본원에 포함됨)에 개시된 방법에 의해 형성될 수 있다.
일 실시형태에서, 코어-쉘 나노입자는 본원에 개시된 saRNA의 코어, 및 중합체 쉘을 포함할 수 있다. 중합체 쉘은 본원에 기재된 임의의 폴리머일 수 있으며 당업계에 공지되어 있다. 추가 실시예에서, 중합체 쉘은 코어의 saRNA를 보호하는 데 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 코어-쉘 나노입자는 눈 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 공개특허 20120321719 참조, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다).
일 실시형태에서, 본원에 기재된 제형과 함께 사용되는 중합체는 국제 공개번호 WO2011120053 (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 개시된 바와 같은 개질된 중합체 (예컨대 비제한적으로 개질된 폴리아세탈)일 수 있다.
전달
본 개시내용은 약물 전달 과학의 진보와 유사하게 고려되는 임의의 적절한 경로에 의해 치료, 예방, 약제, 진단 또는 영상화 중 어느 하나를 위한 saRNA의 전달을 포함한다. 전달은 나형(naked)이거나 제형화될 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 세포에 나형으로 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 "나형"란, 형질감염 촉진제가 없이 saRNA를 전달하는 것을 의미한다. 예를 들면, 세포에 전달되는 saRNA는 어떠한 변형도 함유할 수 없다. 나형의 saRNA는 당업계에 공지된 투여 경로 및 본원에 기재된 투여 경로를 사용하여 세포에 전달될 수 있다.
본 개시내용의 saRNA는 본원에 기재된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 변형되고/되거나 변형될 수 없는 saRNA를 함유할 수 있다. 제형은 세포 관통제, 약제학적으로 허용되는 담체, 전달제, 생분해성 또는 생체적합성 중합체, 용매 및 서방출 전달 데포를 추가로 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. 제형화된 saRNA는 당업계에 공지된 투여 경로 및 본원에 기재된 투여 경로를 사용하여 세포에 전달될 수 있다.
조성물은 또한 카테터를 통해, 겔, 분말, 연고, 크림, 겔, 로션 및/또는 점적제에 의해, 조성물로 피복되거나 함침된 직물 또는 생분해성 물질 등과 같은 기재를 사용함으로써 기관 또는 조직으로의 직접 전달을 위해 직접 침지 또는 입욕(bathing)을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계의 수개 방식 중 어느 하나의 방식으로 제형화될 수 있다. 본 개시내용의 saRNA는 또한 레트로바이러스 복제 벡터(RRV)로 클로닝되어 세포에 형질도입될 수 있다.
투여
본 개시내용의 saRNA는 치료적으로 유효한 결과를 초래하는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 이들은 장관, 위장관, 경막외, 경구, 경피, 경막외(경막 주위), 내뇌(대뇌내), 뇌실내(대뇌실내), 피내(피부상으로의 적용), 진피내(피부 자체 내), 피하(피부 아래), 비강 투여(코를 통해), 정맥내(정맥 내로), 동맥내(동맥 내로), 근육내(근육 내로), 심장내(심장 내로), 골내 주입(골수 내로), 복강내(척추관 내로), 복강내(복막 내로의 주입 또는 주사), 방광내 주입, 유리체내(눈을 통해), 음경해면체내 주사(음경의 기저부), 질내 투여, 자궁내, 양막외 투여, 경피(전신 분포를 위한 무손상 피부를 통한 확산), 경점막(점막을 통한 확산), 흡입(코흡입), 설하, 구순하, 관장, 점안제(결막 상으로) 또는 점이제를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 조성물은 이들이 혈뇌 장벽, 혈관 장벽 또는 기타 상피 장벽을 가로지르도록 허용하는 방식으로 투여될 수 있다. 2012년 12월 14일자로 출원된 국제 공개공보 WO 2013/090648(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 투여 경로는 본 개시내용의 saRNA를 투여하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 종양 내로 전달된다.
투여 형태
본원에 기재된 약제학적 조성물은 국소, 비강내, 기관내 또는 주사가능한(예를 들면, 정맥내, 안구내, 유리체내, 근육내, 심장내, 복강내, 피하) 형태와 같은 본원에 기재된 투여형으로 제형화될 수 있다. 2012년 12월 14일자로 출원된 국제 공개공보 WO 2013/090648(이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 액체 투여형, 주사가능 제제, 폐형(pulmonary forms) 및 고체 투여형은 본 개시내용의 saRNA를 위한 투여형으로서 사용될 수 있다.
III. 사용 방법
본 개시내용의 한 측면은 본 개시내용의 saRNA 및 상기 saRNA 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 saRNA는 그의 표적 유전자의 발현을 조절한다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA를 투여하는 것을 포함하는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 표적 유전자의 발현은 본 개시내용의 saRNA의 부재 하에서의 표적 유전자의 발현과 비교하여 본 개시내용의 saRNA의 존재 하에 적어도 5, 10, 20, 30, 40%, 또는 적어도 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75% 또는 적어도 80% 증가된다. 추가 실시형태에서, 표적 유전자의 발현은 본 개시내용의 saRNA의 부재 하에서의 표적 유전자의 발현과 비교하여 본 개시내용의 saRNA의 존재 하에 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배, 또는 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50배, 또는 적어도 60, 70, 80, 90, 100배 증가된다.
스팅(TMEM173) 유전자
본 출원의 한 측면은 본 개시내용의 TMEM173-saRNA를 투여하는 것을 포함하는 스팅 [인터페론 반응 자극제 CGAMP 인터랙터 (Stimulator Of Interferon Response CGAMP Interactor); 스팅1; TMEM173] 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, TMEM173 유전자의 발현은 본 개시내용의 TMEM173-saRNA의 부재 하의 TMEM173 유전자의 발현과 비교하여 본 개시내용의 TMEM173-saRNA의 존재 하에서 적어도 20, 30, 40% 또는 적어도 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75% 또는 적어도 80% 증가한다. 추가 실시형태에서, TMEM173 유전자의 발현은 본 개시내용의 TMEM173-saRNA의 부재 하의 TMEM173 유전자의 발현과 비교하여 본 개시내용의 TMEM173-saRNA의 존재 하에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배, 또는 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50배, 또는 적어도 60, 70, 80, 90, 100배증가한다. TMEM173 유전자의 발현 조절은 TMEM173 mRNA 수준의 변화에 의해 반영되거나 결정될 수 있다.
TMEM173 유전자는 선천성 면역 신호 전달에 중요한 소포체 어댑터 단백질을 암호화한다. 이는 시클릭 GMP-AMP(cGAMP)에 의해 활성화되어 다운스트림 선천적 면역 신호를 유발한다. cGAMP는 cGAS가 세포내 외부 DNA를 감지할 때 합성되며 cGAMP-스팅 경로의 활성화는 종양 면역치료에 매우 중요하다. 스팅은 프로모터 과메틸화에 의해 다양한 유형의 종양에서 하향조절되는 것으로 나타났다. DNA 메틸화 억제제에 의한 스팅 발현의 회복은 종양 성장의 제어를 개선한다 (Kitajima et al., Cancer Discovery, vol.9(1):34 (2019)). 본 개시내용의 TMEM173-saRNA는 스팅과 연관된 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 TMEM173-saRNA는 암, TMEM173-관련 혈관병증, 영아 발병 및 가족성 동상 루푸스와 같은 질환을 예방하거나 치료하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 TMEM173 유전자와 관련된 임의의 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 암을 앓고 있거나, 암에 걸린 것으로 의심되거나, 암에 걸릴 소인이 있는 대상체에게 본 개시내용의 saRNA의 치료적 유효량를 투여하는 것을 포함한다. 본 개시내용에 따르면, 암은 통제되지 않는 세포 증식, 예를 들어, 과다증식을 특징으로 하는 임의의 질환 또는 질병을 포괄한다. 암은 종양, 예를 들어, 고형 종양 또는 임의의 신생물을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 고형 종양이다.
또한, 일부 실시형태에서, 본 발명의 saRNA는 크기(중량, 표면적 또는 부피)의 순값으로 측정하든지 또는 시간 경과에 따른 비율로 측정하든 다양한 유형의 종양에서 종양 성장을 억제하는데 효과적이다.
일부 실시형태에서, 종양의 크기는 본 개시내용의 saRNA로 치료한 후 약 60% 이상 감소한다. 일부 실시형태에서, 종양의 크기는 무게 및/또는 면적 및/또는 부피의 측정에서 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 감소한다.
다양한 실시형태에서, 암은 청신경종, 급성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 골수성 백혈병(단핵구, 골수 모세포, 선암종, 혈관 육종, 성상 세포종, 골수 단핵구 및 전골수성), 급성 T 세포 백혈병, 기저 세포 암종, 담관암종, 방광암, 뇌암, 유방암, 기관지성 암종, 자궁경부암, 연골육종, 척색종, 융모막암종, 만성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성(과립구) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장암, 대장 암 두개인두종, 낭선암종, 미만성 거대 B세포 림프종, 버킷 림프종, 증식이상 변화(이형성증 및 화생증), 배아암종, 자궁내막암, 내피육종, 상의세포종, 상피암종, 적백혈병, 식도암, 에스트로겐 수용체 양성 유방암, 본태혈소판증가증 유잉종양, 섬유육종, 여포성 림프종, 생식세포 고환암, 신경교종, 중쇄질환, 혈관모세포종, 간종, 간세포암, 호르몬 무감각 전립선암, 평활근육종, 지방육종, 폐암, 림프내피육종, 림프관육종, 림프구성 백혈병, 림프종(호지킨병 및 비호지킨병), 방광, 유방, 결장, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 피부 및 자궁의 악성종양 및 과다증식성 질환, T 세포 또는 B세포 기원의 림프성 악성종양, 백혈병, 림프종, 수질암종, 수모세포종 흑색종, 수막종, 중피종, 다발성 골수종, 골수성 백혈병, 골수종, 점액육종, 신경모세포종, 비소세포폐암, 희돌기교종, 구강암, 골성육종, 난소암, 췌장암, 유두선암종, 유두상암종, 송과체종, 진성적혈구증가증, 전립선암, 직장암, 신세포암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 피지선암종, 정상피종, 피부암, 소세포폐암종, 고형종양(암종 및 육종), 소세포폐암, 위암, 편평세포암종, 윤활막종, 땀샘 암종, 갑상선암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 고환 종양, 자궁암 및 윌름스 종양. 기타 암에는 원발암, 전이암, 구인두암, 하인두암, 간암, 담낭암, 담관암, 소장암, 요로암, 신장암, 요로상피암, 여성 생식기암, 자궁암, 임신 융모세포암이 포함된다. 질환, 남성생식기암, 정낭암, 고환암, 생식세포종양, 내분비선종양, 갑상선암, 부신암, 뇌하수체암, 혈관종, 뼈 및 연조직에서 발생한 육종, 카포시육종, 신경암, 안구암 수막암, 교모세포종, 신경종, 신경모세포종, 신경초종, 백혈병과 같은 조혈 악성 종양에서 발생하는 고형 종양, 전이성 흑색종, 재발성 또는 지속성 난소 상피암, 나팔관암, 원발성 복막암, 위장관 간질 종양, 대장암, 위암, 흑색종, 다형성 교모세포종, 비편평 비소세포폐암, 악성 신경교종, 상피성 난소암, 원발성 복막 장액암, 전이성 간암, 신경내분비암종, 난치성 악성 종양, 삼중 음성 유방암, HER2 증폭 유방암, 비인두암 암, 구강암, 담도계, 간세포암종, 두경부 편평세포암종(SCCHN), 비수질갑상선암종, 재발성 다형성 교모세포종, 제1형 신경섬유종증, 중추신경계(CNS)암, 지방육종, 평활근육종, 타액선암, 점막 흑색 종, 말단/흑자성 흑색종, 부신경절종, 크롬친화세포종, 진행성 전이암, 고형 종양, 삼중음성 유방암, 대장직장암, 육종, 흑색종, 신장암종, 자궁내막암, 갑상선암, 횡문근육종, 다발성 골수종, 난소암, 교모세포종, 위장관 간질 종양, 맨틀 세포 림프종 및 난치성 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 암은 고형 종양이다.
일부 실시형태에서, 암은 간세포 암종과 같은 간암, 췌장암 또는 난소암이다.
본 개시내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 암은 일반적으로 포유동물에서 발생한다. 포유동물에는 예를 들어 인간, 인간이 아닌 영장류, 개, 고양이, 쥐, 생쥐, 토끼, 흰 족제비, 기니피그, 말, 돼지, 양, 염소 및 소가 포함된다.
IV. 키트 및 장치
키트
본 개시내용은 본 개시내용의 방법을 편리하게 및/또는 효과적으로 수행하기 위한 다양한 키트를 제공한다. 전형적으로, 키트는 사용자가 대상(들)에 대해 다중 치료를 수행하고/하거나 다중 실험을 수행할 수 있도록 하는 충분한 양 및/또는 수의 구성요소를 포함할 것이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 saRNA, 또는 본 개시내용의 saRNA, 다른 유전자를 조정하는 saRNA, siRNA, miRNA 또는 다른 올리고뉴클레오티드 분자의 조합을 포함하는, 시험관 내 또는 생체 내에서 유전자의 발현을 조절하기 위한 키트를 제공한다.
키트는 제형 조성물을 형성하기 위한 포장 및 설명서 및/또는 전달제를 추가로 포함할 수 있다. 전달제는 식염수, 완충 용액, 리피도이드, 덴드리머 또는 본원에 개시된 임의의 전달제를 포함할 수 있다.
하나의 비제한적 예에서, 완충 용액은 염화나트륨, 염화칼슘, 포스페이트 및/또는 EDTA를 포함할 수 있다. 다른 비제한적 예에서, 완충 용액은 식염수, 2mM 칼슘 함유 식염수, 5% 수크로오스, 2mM 칼슘 함유 5% 수크로오스, 5% 만니톨, 2mM 칼슘 함유 5% 만니톨, 링거 락테이트, 염화나트륨, 2mM 칼슘 함유 염화나트륨 및 만노스를 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다(미국 공개특허 US 20120258046 참조; 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다). 또 다른 비제한적 예에서, 완충 용액은 침전될 수 있거나 동결건조될 수 있다. 각 성분의 양은 일관되게 재현가능한 높은 농도의 식염수 또는 단순한 완충 제형을 가능하도록 달라질 수 있다. 성분은 또한 기간에 걸쳐 및/또는 다양한 조건 하에 완충 용액 중에서 saRNA의 안정성을 증가시키기 위해서 달라질 수 있다.
장치
본 개시내용은 본 개시내용의 saRNA가 혼입될 수 있는 장치를 제공한다. 이들 장치는 인간 환자와 같은 이를 필요로 하는 대상체에게 즉시 전달되도록 이용가능한 안정한 제형을 포함한다.
장치의 비제한적 예는 펌프, 카테터, 니들, 경피 패치, 가압 후각 전달 장치, 이온영동 장치 및 다층 미세유체 장치를 포함한다. 장치는 단일, 복수 또는 분할-투약 요법에 따라 본 개시내용의 saRNA를 전달하는데 사용될 수 있다. 장치는 생물학적 조직을 가로질러, 피내로, 피하로 또는 근육내로 본 발명의 saRNA를 전달하는데 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 전달하는데 적합한 장치의 더 많은 예는 2012년 12월 14일자로 출원된 국제 공개공보 WO 2013/090648(그 내용은 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
정의
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어 및 어구의 의미는 하기에 제공된다. 본 명세서의 다른 부분의 용어의 용법과 본 섹션에서 제공된 용어의 정의 사이에 명백한 불일치가 존재한 다면, 본 섹션의 정의가 우선한다.
약: 본원에 사용되는 용어 "약"은 인용된 값의 +/- 10%를 의미한다.
병용하여 투여되는: 본원에 사용되는 용어 "병용하여 투여되는" 또는 "병용 투여"란, 2개 이상의 제제가 환자에 대해 각 제제의 효과의 중복이 존재할 수 있도록 동일한 시간에서 또는 간격 내에서 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 이들은 서로 약 60, 30, 15, 10, 5 또는 1분 내에 투여된다. 일부 실시형태에서, 제제의 투여는 병용(예를 들면, 상승) 효과가 달성되기에 충분히 함께 가까이 이격되어 있다.
아미노산: 본원에 사용되는 용어 "아미노산" 및 "아미노산들"은 모든 자연적으로 발생하는 L-알파-아미노산을 의미한다. 아미노산은 다음과 같이 1-문자 또는 3-문자 지정에 의해 확인된다: 아스파르트산 (Asp:D), 이소류신 (Ile:I), 트레오닌 (Thr:T), 류신 (Leu:L), 세린 (Ser:S), 티로신 (Tyr:Y), 글루탐산 (Glu:E), 페닐알라닌 (Phe:F), 프롤린 (Pro:P), 히스티딘 (His:H), 글리신 (Gly:G), 리신 (Lys:K), 알라닌 (Ala:A), 아르기닌 (Arg:R), 시스테인 (Cys:C), 트립토판 (Trp:W), 발린 (Val:V), 글루타민 (Gln:Q), 메티오닌 (Met:M), 아스파라긴 (Asn:N), 여기서, 아미노산은 먼저 열거된 후, 각각 3개 및 1개의 문자 코드에 의해 삽입구로서 열거된다.
동물: 본원에 사용되는 용어 "동물"은 동물계의 모든 구성원을 의미한다. 일부 실시형태에서, "동물"은 발생의 임의의 단계에서의 인간을 의미한다. 일부 실시형태에서, "동물"은 발생의 임의의 단계에서 비-인간 동물을 의미한다. 특정 실시형태에서, 비-인간 동물은 포유동물(예를 들면, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 또는 돼지)이다. 일부 실시형태에서, 동물은 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류 및 벌레를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 동물은 유전자이식 동물, 유전자 조작 동물 또는 클론이다.
대략: 하나 이상의 관심대상의 값에 적용될 때, 본원에 사용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 표시된 기준 값과 유사한 값을 의미한다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되지 않거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않다면, 표시된 기준 값의 (초과 또는 미만의) 한쪽 방향으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내를 충족하는 값의 범위를 의미한다(이러한 수치가 가능한 값을 100%를 초과하는 것은 제외함).
와 연합된: 2개 이상의 모이어티에 관해서 사용될 때, 본원에 사용되는 용어 "와 연합된", "접합된", "결합된", "부착된" 및 "테더링된"은 모이어티들이 직접 또는 결합제로서 작용하는 하나 이상의 추가의 모이어티를 통해, 서로 물리적으로 연합되거나 연결되어, 구조가 사용되는 조건, 예를 들면, 생리학적 조건 하에 모이어티들이 여전히 물리적으로 연합되도록 충분히 안정한 구조를 형성하는 것을 의미한다. "연합"은 엄격하게 직접 공유 화학 결합을 통할 필요는 없다. 이것은 또한 "연합된" 실체가 여전히 물리적으로 연결되어 있도록 충분히 안정한 연결에 기초하여 이온 결합 또는 수소 결합 또는 하이브리드화를 제시할 수 있다.
이(2)기능성 또는 이중 기능성의: 본원에 사용되는 용어 "이기능성" 또는 "이중 기능성의"란, 적어도 2가지 기능을 유지할 수 있는 임의의 물질, 분자 또는 잔기를 의미한다. 기능은 동일한 결과 또는 상이한 결과에 영향을 미칠 수 있다. 기능을 생성하는 구조는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 이기능성 saRNA는 세포독성 펩티드(제1 기능)를 포함할 수 있는 반면, saRNA를 포함하는 뉴클레오시드는 그 자체로 세포독성(제2 기능)을 가지고 있다.
생체적합성: 본원에 사용되는 용어 "생체적합성"은 면역계에 의해 손상, 독성 또는 거부의 위험을 거의 제기하지 않는, 살아있는 세포, 조직, 기관 또는 계와의 적합성을 의미한다.
생분해성: 본원에 사용되는 용어 "생분해성"은 생물체의 작용에 의해 무해한 생성물로 분쇄될 수 있는 것을 의미한다.
생물학적으로 활성: 본원에 사용되는 어구 "생물학적으로 활성"은 생물학적 시스템 및/또는 유기체에서 활성을 갖는 임의의 물질의 특징을 의미한다. 예를 들면, 유기체에 투여될 때 그 유기체에 생물학적 영향을 미치는 물질은 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 비록 saRNA의 일부가 생물학적으로 활성이거나 생물학적으로 간주되는 활성을 모방할 지라도 생물학적으로 활성인 것으로 간주될 수 있다.
암: 본원에 사용되는 개체에서의 용어 "암"은 제어되지 않는 증식, 불멸, 전이 잠재성, 급속 성장 및 증식 속도 및 특정한 특징적인 형태학적 특징과 같은 암-유발 세포를 대표하는 특징을 보유하는 세포의 존재를 의미한다. 종종, 암세포는 종양의 형태일 것이지만, 이러한 세포는 개체 내에 단독으로 존재할 수 있거나, 백혈구 세포와 같은 독립적인 세포로서 혈류에서 순환할 수 있다.
세포 성장: 본원에 사용되는 용어 "세포 성장"은 원칙적으로 세포 구성원에서의 성장과 관련되는데, 비록 성장의 작은 성분이 특정 상황에서 개별 세포의 세포 크기 또는 세포질 용적의 증가로 인해서 일 수 있지만, 이는 후자의 속도가 세포 사멸(예를 들면, 아폽토시스 또는 괴사에 의해)의 속도 보다 높아서 세포의 집단의 크기로 증가할 때 세포 생식(즉, 증식)에 의해 일어난다. 따라서, 세포 성장을 억제하는 제제는 이들 두 반대 과정 사이의 평형이 변화되도록 증식을 저해하거나 세포사를 자극하거나 이들 둘 다에 의해 그렇게 할 수 있다.
세포 유형: 본원에 사용되는 용어 "세포 유형"은 소정의 공급원 (예를 들면, 조직, 기관)으로부터의 세포 또는 주어진 분화 상태에서의 세포, 또는 주어진 병리학 또는 유전자 구성과 관련된 세포를 의미한다.
염색체: 본원에 사용되는 용어 "염색체"는 세포에서 발견되는 DNA 및 단백질의 조직화된 구조를 의미한다.
상보적인: 본원에 사용되는 용어 "상보적인"은 이것이 핵산에 관한 것일 때, 뉴클레오티드들 또는 핵산들 사이의 염기쌍 형성 또는 하이브리드화를 의미하며, 예를 들면, 이중 가닥의 DNA 분자의 2개의 가닥 사이 또는 올리고뉴클레오티드 프로브와 표적 사이는 상보적이다.
상태: 본원에 사용되는 용어 "상태"는 임의의 세포, 기관, 기관계 또는 유기체의 상황을 의미한다. 상태는 질병 상태 또는 단순히 생리학적 제시 또는 독립체의 상황을 반영할 수 있다. 상태는 질병의 육안 제시와 같은 표현형 상태 또는 상태와 관련된 단백질 발현 프로파일 또는 기본 유전자와 같은 유전자형 상태로서 특성화될 수 있다. 상태는 양성 또는 악성일 수 있다.
제어된 방출: 본원에 사용되는 용어 "제어된 방출"은 치료 결과를 가져오도록 특정 패턴의 방출에 따르는 약제학적 조성물 또는 화합물 방출 프로파일을 의미한다.
세포증식억제: 본원에 사용되는 "세포증식억제"란, 세포(예를 들면, 포유동물 세포(예를 들면, 인간 세포)), 세균, 바이러스, 진균, 원생동물, 기생충, 프리온 또는 이들의 조합의 성장, 분열 또는 증식을 저해, 감소 또는 억제하는 것을 의미한다.
세포독성: 본원에 사용되는 "세포독성"은 세포(예를 들면, 포유동물 세포(예를 들면, 인간 세포)), 세균, 바이러스, 진균, 원생동물, 기생충, 프리온 또는 이들의 조합에 대한 사멸 또는 손상 유발, 독성 또는 치명적인 효과를 의미한다.
전달: 본원에 사용되는 "전달"은 화합물, 물질, 독립체, 잔기, 화물 또는 페이로드(payload)를 전달하는 작용 또는 방식을 의미한다.
전달제: 본원에 사용되는 "전달제"는 적어도 부분적으로, 본 발명의 saRNA의 표적화된 세포로의 생체내 전달을 용이하게 하는 임의의 물질을 의미한다.
탈안정화된: 본원에 사용되는 용어 "탈안정한", "탈안정화하다" 또는 "탈안정화 영역"은 동일 영역 또는 분자의 초기 야생형 또는 본래의 형태 보다 덜 안정한 영역 또는 분자를 의미한다.
검출가능한 표지: 본원에 사용되는 "검출가능한 표지"는 방사선, 형광, 화학발광, 효소 활성, 흡광도 등을 포함한 당업계에 공지된 방법에 의해 용이하게 검출되는 다른 독립체와 부착되거나, 도입되거나 연결되는 하나 이상의 마커, 신호 또는 잔기를 의미한다. 검출가능 표지는 방사성 동위원소, 형광단, 발색단, 효소, 염료, 금속 이온, 리간드, 예를 들면, 비오틴, 아비딘, 스트렙타아비딘 및 합텐, 양자점 등을 포함한다. 검출가능 표지는 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드의 임의의 위치에 위치할 수 있다. 이들은 뉴클레오티드 내에 있거나 또는 5' 또는 3' 말단에 위치할 수 있다.
캡슐화하다: 본원에 사용되는 용어 "캡슐화하다"는 포위하거나 둘러싸거나 감싸는 것을 의미한다.
조작된: 본원에 사용되는, 본 개시내용의 실시형태는 이들이 구조적이든지 화학적이든지 개시점, 야생형 또는 토종 분자로부터 변하는 특징 또는 특성을 가지도록 설계될 때 "조작된"다.
동등한 대상체: 본원에 사용되는, "동등한 대상체"는 예를 들면, 유사한 연령, 성별 및 건강, 예를 들면, 간 건강 또는 암 단계의 대상체일 수 있거나, 본 개시내용에 따른 치료 전에 동일한 대상체일 수 있다. 대응하는 대상체는 본 개시내용에 따른 saRNA에 의한 치료를 받지 않는 점에서 "미처리된"다 그러나, 본 개시내용의 saRNA에 의해 치료되는 대상체가 동일하거나 동등한 통상적인 항암 치료를 받는다면, 대상체는 통상적인 항암 치료를 받을 수 있다.
엑소좀: 본원에 사용되는, "엑소좀"은 포유동물 세포에 의해 분비된 소포를 의미한다.
발현: 본원에 사용되는 핵산 서열의 "발현"은 하나 이상의 하기 이벤트를 의미한다: (1) DNA 서열로부터 RNA 주형의 생성 (예를 들면, 전사에 의해); (2) RNA 전사체의 가공 (예를 들면, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성 및/또는 3' 말단 가공); (3) RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역 후 변형.
특징: 본원에 사용되는 "특징"은 특질, 특성 또는 독특한 요소를 의미한다.
제형: 본원에 사용되는 "제형"은 적어도 본 개시내용의 saRNA 및 전달제를 포함한다.
단편: 본원에서 사용되는 "단편"은 일부를 의미한다. 예를 들면, 단백질의 단편은 배양된 세포로부터 단리된 전체길이 단백질을 분해시킴으로써 수득된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 단편은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 영역으로 구성될 수 있다.
기능성: 본원에 사용되는 "기능성" 생물학적 분자는 특징적인 특성 및/또는 활성을 발휘하는 형태의 생물학적 분자이다.
유전자: 본원에 사용되는 용어 "유전자"는 대조군 및 폴리펩티드 또는 전구물질을 생성하는데 필요한 가장 빈번한 암호화 서열을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 그러나, 유전자는 번역될 수 없고, 그 대신에 조절 또는 구조 RNA 분자를 암호화할 수 있다.
유전자는 식물, 진균, 동물, 세균 게놈 또는 에피좀, 진핵세포, 핵 또는 플라스미드 DNA, cDNA, 바이러스 DNA 또는 화학적으로 합성된 DNA를 포함한 당업계에 공지된 임의의 공급원으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래할 수 있다. 유전자는 발현 산물의 생물학적 활성 또는 화학 구조, 발현의 속도 또는 발현 조절의 방식에 영향을 미칠 수 있는 암호화 또는 미번역 영역에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 삽입, 결손 및 치환을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 유전자는 연속적인 암호화 서열을 구성하거나, 이것은 적절한 스플라이스 접합에 의해 결합되는 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다.
유전자 발현: 본원에 사용되는 용어 "유전자 발현"은 핵산 서열이 성공적인 전사 및 대부분의 경우에는 단백질 또는 펩티드를 생성하기 위한 번역을 수행하는 과정을 의미한다. 명확화를 위해, "유전자 발현"의 측정에 대해 언급될 때, 이것은 측정물이 전사의 핵산 산물, 예를 들면, RNA 또는 mRNA, 또는 번역의 아미노산 산물, 예를 들면, 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. RNA, mRNA, 폴리펩티드 및 펩티드의 양 또는 수준의 측정 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
게놈: 용어 "게놈"은 핵 DNA 성분, 염색체 또는 염색체외 DNA 뿐만 아니라 세포질 도메인(예를 들면, 미토콘드리아 DNA)을 포함한 유기체의 전체 DNA 성분을 포함하는 것으로 의도된다.
상동성: 본원에 사용되는 용어 "상동성"은 중합체성 분자들 사이, 예를 들면, 핵산 분자들 (예를 들면, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자들 사이의 전체적 관련성을 의미한다. 일부 실시형태에서, 중합체성 분자들은 이들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일 또는 유사하다면 서로 "상동"인 것으로 간주된다. 용어 "상동"은 반드시 적어도 2개의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열) 상이의 비교를 의미한다. 본 개시내용에 따르면, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열은 이들이 암호화하는 폴리펩티드가 적어도 약 20개의 아미노산의 적어도 하나의 스트레치에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 99% 라면, 상동인 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 상동 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 4 내지 5개의 독특하게 특정된 아미노산의 스트레치를 암호화하는 능력을 특징으로 한다. 길이가 60개의 뉴클레오티드 미만인 폴리뉴클레오티드 서열의 경우, 상동성은 적어도 4 내지 5개의 독특하게 특정된 아미노산의 스트레치를 암호화하는 능력에 의해 측정된다. 본 개시내용에 따르면, 2개의 단백질 서열은 단백질이 적어도 약 20개의 아미노산의 적어도 하나의 스트레치에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일하다면, 상동인 것으로 간주된다.
용어 "과증식성 세포"는 동등한 건강한 세포("대조군"으로서 언급될 수 있다)의 증식 속도와 비교하여 비정상적으로 높은 속도로 증식하는 임의의 세포를 의미할 수 있다. "동등한 건강한" 세포는 정상적이고 건강한 세포의 대응물이다. 따라서, 이것은 비교측정 세포로서 동일한 기능(들)을 수행하는, 예를 들면, 동일 기관으로부터의 동일한 유형의 세포이다. 예를 들면, 과증식성 간 세포의 증식은 건강한 간 세포를 기준으로 하여 평가되어야 하는 반면, 과증식성 전립선 세포의 증식은 건강한 전립선 세포를 기준으로 하여 평가되어야 한다.
증식의 "비정상적으로 높은" 속도란, 동등한 건강한 (비-과증식성) 세포의 증식 속도와 비교하여 과증식성 세포의 증식의 속도는 적어도 20, 30, 40%, 또는 적어도 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75%, 또는 적어도 80% 증가하는 것을 의미한다. 증식의 "비정상적으로 높은" 속도란, 또한 동등한 건강한 세포의 증식 속도와 비교하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배, 또는 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50배, 또는 적어도 60, 70, 80, 90, 100배 증가하는 속도를 의미할 수 있다.
과증식성 장애: 본원에 사용되는 "과증식성 장애"는 상기에서 정의된 바와 같은 과증식성 세포를 포함하는 임의의 장애일 수 있다. 과증식성 장애의 예는 암, 건선성 관절염, 류마티스 관절염과 같은 신생물 장애, 염증성 장 질환과 같은 위장 과증식성 장애, 건선, 라이터 증후군, 모공성 홍색 비강진을 포함하는 피부 질환, 및 각질화 장애의 과증식성 변이체를 포함한다.
당업계의 숙련가들은 과증식성 세포를 동정하는 방법을 충분히 인지하고 있따. 동물에서 과증식성 세포의 존재는 X-선, MRI 또는 CT 스캔과 같은 스캔을 사용하여 동정할 수 있다. 과증식성 세포는 또한 동정될 수 있거나, 세포의 증식은 MTT, XTT, MTS 또는 WST-1 검정과 같은 세포 증식 검정을 사용하여 시험관내에서 샘플의 배양을 통해 검정될 수 있다. 시험관내 세포 증식은 또한 유세포측정법을 사용하여 측정될 수 있다.
동일성: 본원에 사용되는 용어 "동일성"은 중합체성 분자들 사이, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 분자들 (예를 들면, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자들 사이의 전반적인 관련성을 의미한다. 예를 들면, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성의 계산은 최적 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들면, 캡이 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있으며, 비-동일성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 특정 실시형태에서, 비교 목적을 위해 정렬되는 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 이다. 이어서, 상응하는 뉴클레오티드 위치에서의 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자들은 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭의 수를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수, 및 2개의 서열의 최적 정렬을 도입하기 위해 필요한 각 갭의 길이의 함수이다. 2개의 서열 사이의 서열의 비교와 퍼센트 동일성의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 2개의 뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성은 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991] (이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 것과 같은 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 문헌[Meyers and Miller, CABIOS, 1989, 4:11-17] 에 개시된 알고리즘을 사용하여 측정할 수 있으며, 이 문헌은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 도입되었다. 대안으로, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지에 GAP 프로그램을 사용하여 측정하였다. 서열들 사이에 퍼센트 동일성을 측정하는데 흔히 사용되는 방법은 문헌[Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)](이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 것들을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 동일성의 측정 기술은 대중이 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 성분화되어 있다. 2개의 서열 사이의 상동성을 측정하기 위한 컴퓨터 소프트웨어의 예는 GCG 프로그램 패키지[Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)], BLASTP, BLASTN 및 FASTA[Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)] 를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
유전자의 발현을 억제하다: 본원에 사용되는 어구 "유전자의 발현을 저해하다"는 유전자의 발현 산물의 양의 감소를 초래하는 것을 의미한다. 발현 산물은 유전자(예를 들면, mRNA)로부터 전사된 RNA 또는 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 전형적으로, mRNA의 수준의 감소는 이로부터 번역된 폴리펩티드의 수준의 감소를 초래한다. 발현 수준은 mRNA 또는 단백질을 측정하기 위한 표준 기술을 사용하여 측정할 수 있다.
시험관 내: 본원에 사용되는 용어 "시험관 내"는 유기체 (예를 들면, 동물, 식물 또는 미생물)가 아니라 인공 환경에서, 예를 들면, 시험관 또는 반응 용기에서, 세포 배양물에서, 페트리 디쉬 등에서 일어나는 이벤트를 의미한다.
생체 내: 본원에 사용되는 용어 "생체 내"는 유기체 (예를 들면, 동물, 식물, 미생물 또는 이의 세포 또는 조직) 내에서 일어나는 이벤트를 의미한다.
단리된: 본원에 사용되는 용어 "단리된"은 연합되는(자연적이든지 실험 환경이든지) 성분의 적어도 일부로부터 분리된 물질 또는 독립체를 의미한다. 단리된 물질은 이들이 연합된 물질에 관하여 다양한 수준의 순도를 가질 수 있다. 단리된 물질 및/또는 독립체는 이들이 초기에 연합되는 다른 성분의 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 그 이상으로부터 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 초과, 또는 약 99% 초과의 순도이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 물질은 다른 성분이 실질적으로 없다면 "순수"하다. 실질적으로 단리된: "실질적으로 단리된"은 화합물이 형성되거나 검출된 환경으로부터 실질적으로 분리되는 것을 의미한다. 부분적 분리는, 예를 들면, 본 발명의 화합물이 농축된 조성물을 포함할 수 있다. 실질적 분리는 본 발명의 화합물 또는 이의 염의 적어도 약 50중량%, 적어도 약 60중량%, 적어도 약 70중량%, 적어도 약 80중량%, 적어도 약 90중량%, 적어도 약 95중량%, 적어도 약 97중량% 또는 적어도 약 99중량% 함유하는 조성물을 포함할 수 있다. 화합물 및 이의 염을 단리하는 방법은 당업계에서 통상적이다.
표지: 용어 "표지"는 물질, 화합물 또는 목적물이 검출가능할 수 있도록 목적물에 도입되는 물질 또는 화합물을 의미한다.
링커: 본원에 사용되는 링커는 원자의 그룹, 예를 들면, 10 내지 1,000개의 원자를 의미하며, 탄소, 아미노, 알킬아미노, 산소, 황, 설폭사이드, 설포닐, 카보닐 및 이민과 같은 원자 또는 그룹을 포함할 수 있으나 이들로 제한되지 않는다. 링커는 핵염기 또는 제1 말단의 당 잔기 상에서 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 부착될 수 있고, 제2 말단에서 페이로드, 예를 들면, 검출제 또는 치료제에 부착될 수 있다. 링커는 핵산 서열로의 도입을 방해하지 않는 충분한 길이일 수 있다. 링커는 본원에 기재된 바와 같이 saRNA 접합체의 형성 뿐만 아니라 페이로드의 투여와 같은 임의의 유용한 목적을 위해 사용될 수 있다.
링커에 도입될 수 있는 화학 그룹의 예는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아미도, 아미노, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 알킬렌, 헤테로알킬렌, 아릴 또는 헤테로사이클릴을 포함하나 이들로 제한되지 않으며, 이들의 각각은 본원에 기재된 바와 같이 임의로 치환될 수 있다. 링커의 예는 불포화 알칸, 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들면, 에틸렌 또는 프로필렌 글리콜 단량체 단위, 예를 들면, 디에틸렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜 또는 테트라에틸렌 글리콜), 및 덱스트란 중합체 및 이의 유도체를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 다른 예는 링커 내에 절단가능한 잔기, 예를 들면, 디설파이드 결합(-S-S-) 또는 아조 결합(-N=N-)(이들은 환원제 또는 광분해를 사용하여 절단될 수 있다)를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 선택적으로 절단가능한 결합의 비제한적 예는, 예를 들면, 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 다른 환원제 및/또는 광분해의 사용에 의해 절단될 수 있는 아미도 결합 뿐만 아니라, 예를 들면, 산성 또는 염기성 가수분해에 의해 절단될 수 있는 에스테르 결합을 포함한다.
전이: 본원에 사용되는 용어 "전이"는 암이 원발성 종양으로서 처음 발생하는 장소로부터 체내의 먼 위치까지 침입하여 퍼지는 과정을 의미한다. 전이성은 또한 일차 종양의 확산으로부터 유발된 암을 의미한다. 예를 들면, 유방암을 앓고 있는 인간은 림프계, 간, 골 또는 폐에서의 전이를 나타낼 수 있다.
변형된: 본원에 사용되는 "변형된"은 본 개시내용의 분자의 하전된 상태 또는 구조를 의미한다. 분자는 화학적으로, 구조적으로 및 작용기적으로 다수의 방식으로 변형될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 saRNA는 비-천연 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드의 도입에 의해 변형된다.
자연적으로 발생하는: 본원에 사용되는 "자연적으로 발생하는"은 인공 보조제 없이 자연에 존재하는 것을 의미한다.
핵산: 본원에 사용되는 용어 "핵산"은 하나 이상의 뉴클레오티드, 즉, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 둘 다를 포함하는 분자를 의미한다. 상기 용어는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체 및 단량체를 포함하며, 여기서 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드는 중합체의 경우에 5' 내지 3' 결합을 통해 함께 결합한다. 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드 중합체는 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 그러나, 결합은 당업계에 공지된 임의의 결합, 예를 들면, 5' 내지 3' 결합을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 자연적으로 발생하거나, 자연적으로 발생하는 염기쌍과 염기쌍 형성 관계를 형성할 수 있는 합성으로 제조된 유사체일 수 있다. 염기쌍 형성 관계를 형성할 수 있는 비-자연적으로 발생하는 염기의 예는 아자 및 데아자 피리미딘 유사체, 아자 및 데아자 퓨린 유사체, 및 기타 헤테로사이클릭 염기 유사체를 포함하나 이들로 제한되지 않으며, 여기서, 피리미딘 환의 탄소 및 질소 원자의 하나 이상은 헤테로원자, 예를 들면, 산소, 황, 셀레늄, 인 등에 의해 치환된다.
환자: 본원에 사용되는 "환자"는 치료를 추구하거나 치료의 필요성이 있거나 치료를 필요로 하거나 치료를 받고 있거나 치료를 받을 예정인 대상체 또는 특정 질병 또는 상태 동안 훈련된 전문가에 의해 치료 중인 대상체를 의미한다.
펩티드: 본원에 사용되는 "펩티드"는 50개 이하의 길이의 아미노산, 예를 들면, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 길이의 아미노산이다.
약제학적으로 허용되는: 본원에서 사용되는 어구 "약제학적으로 허용되는"은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 인간 및 동물의 조직과의 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 유익/위험 비에 따르는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 의미한다.
약제학적으로 허용되는 부형제: 본원에서 사용되는 어구 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 본원에 기재된 화합물 이외의 다른 임의의 성분 (예를 들면, 활성 화합물을 현탁시키거나 용해시킬 수 있는 비히클)을 의미하며, 환자에서 실질적으로 무독성 및 비-염증성인 특성을 가진다. 부형제는, 예를 들면, 부착 방지제, 산화 방지제, 결합제, 코팅, 압축 보조제, 붕해제, 염료(착색제), 연화제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅, 향미제, 향료, 활주제 (유동 개선제), 윤활제, 보존제, 인쇄 잉크, 흡착제, 현탁제, 분산제, 감미료 및 수화수를 포함한다. 부형제의 예는 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 탄산칼슘, 인산칼륨 (이염기), 칼슘 스테아레이트, 크로스카멜로오스, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토오스, 마그네슘 스테아레이트, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미세결정질 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전호화분 녹말, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 쉘락, 이산화규소, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 나트륨 시트레이트, 나트륨 전분 글리콜레이트, 소르비톨, 전분 (옥수수), 스테아르산, 수크로오스, 탈크, 이산화티탄, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C 및 자일리톨을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.
약제학적으로 허용되는 염: 본 개시물은 또한 본원에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다 본원에 사용되는 "약제학적으로 허용되는 염"은 기존 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환시킴으로써(예를 들면, 유리 염기 그룹과 적절한 유기산을 반응시킴으로써) 모 화합물이 변형되는 개시된 화합물의 유도체를 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산 또는 유기산 염; 카복시산과 같은 산 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 대표적인 산 부가 염은 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설포네이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 굴루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올리에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토 금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등 뿐만 아니라, 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 아민 양이온을 포함한다. 본 개시물의 약제학적으로 허용되는 염은, 예를 들면, 무독성 무기염 또는 유기염으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 무독성 염을 포함한다. 본 개시물의 약제학적으로 허용되는 염은 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 통상적인 화학 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리산 또는 염기 형태와 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산을 물 중에서 또는 유기 용매 중에서 또는 이들 둘 다의 혼합물 중에서 반응시킴으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, and Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977); 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다.
약제학적으로 허용되는 용매화물: 본원에 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 용매화물"은 적합한 용매의 분자가 결정 격자에 혼입되어 있는 본 개시내용의 화합물을 의미한다. 적합한 용매는 투여되는 투여형에서 생리학적으로 내약성이다. 예를 들면, 용매화물은 유기 용매, 물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용매로부터 결정화, 재결정화 또는 침전에 의해 제조할 수 있다. 적합한 용매의 예는 에탄올, 물(예를 들면, 1수화물, 2수화물 및 3수화물), N-메틸피롤리디논(NMP), 디메틸 설폭사이드(DMSO), N,N'-디메틸포름아미드(DMF), N,N'-디메틸아세트아미드(DMAC), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논(DMEU), 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2-(1H)-피리미디논(DMPU), 아세토니트릴(ACN), 프로필렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 2-피롤리돈, 벤질 벤조에이트 등이다. 물이 용매일 때, 용매화물은 "수화물"로 언급된다.
약리 효과: 본원에 사용되는 "약리 효과"는, 유기체 또는 시스템이 외인성 제제와 접촉되거나 이에 노출된 후에 일어나는 유기체 또는 시스템의 측정가능한 생물학적 현상이다. 약리 효과는 하나 이상의 증상의 치료, 개선, 질병, 장애, 상태 또는 감염의 개시의 진단, 예방 및 지연과 같은 치료적으로 유효한 결과를 유발할 수 있다. 이러한 생물학적 현상의 측정은 다른 생물학적 현상에 대해 정량적, 정성적 또는 상대적일 수 있다. 정량적 측정은 통계학적으로 유의할 수 있다. 정량적 측정은 정도 또는 종류에 의해 상이할 수 있으며, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 상이할 수 있다. 이들은 존재 또는 부재로서, 보다 양호 또는 보다 불량, 보다 큼 또는 보다 작음으로 관찰할 수 있다. 외인성 제제는, 약리 효과를 언급할 때, 전체적으로 또는 부분적으로, 유기체 또는 시스템에 대한 이물질이다. 예를 들면, 야생형 생체분자에 대한 변형은, 구조적이 든지 화학적이 든지 간에, 외인성 제제를 생성할 것이다. 마찬가지로, 야생형 분자를 유기체 또는 시스템에서 자연스럽게 발견되지 않는 화합물, 분자 또는 물질로 도입하거나 이들과의 조합하는 것은 또한 외인성 제제를 생성할 것이다.
본 개시내용의 saRNA는 외인성 제제를 포함한다. 약리 효과의 예는 호중구, 망상 적혈구, 과립구, 적혈구(적혈구), 거핵구, 혈소판, 단핵구, 결합 조직 대식세포, 상피 랑게르한스 세포, 파골 세포, 수지상 세포, 미세아교 세포, 호중구, 호산구, 호염구, 비만 세포, 헬퍼 T 세포, 억제인자 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포 또는 망상 적혈구의 증가 또는 감소와 같은 세포 수치의 변화를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 약리 효과는 또한 혈액 화학, pH, 헤모글로빈, 헤마토크리트의 변화, 간 효소 AST 및 ALT와 같으나 이에 제한되지 않는 효소의 수준의 변화, 지질 프로파일 변화, 전기 분해, 대사 마커, 호르몬 또는 기타 마커 또는 당업계의 숙련가들에게 공지된 프로파일에서의 변화를 포함할 수 있다.
물리화학적: 본원에서 사용된 "물리화학적"은 물리적 및/또는 화학적 특성을 의미하거나 이와 관련된다.
예방: 본원에 사용되는 용어 "예방"은 감염, 질환, 장애 및/또는 상태의 발생을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 하나 이상의 증상, 특징, 또는 특정 감염, 질환, 장애 및/또는 상태의 임상학적 소견의 발생을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 하나 이상의 증상, 특징, 또는 특정 감염, 질환, 장애 및/또는 상태의 소견의 발생을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 감염, 특정 질환, 장애 및/또는 상태로부터 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시키는 것; 및/또는 감염, 질환, 장애 및/또는 상태와 관련된 병리학을 발생시킬 위험을 감소시키는 것을 포함한다.
프로드럭: 본 개시물은 또흔 본원에 기재된 화합물의 프로드럭을 포함한다. 본원에 사용되는 "프로드럭"은 물질, 분자 또는 독립체가 화학적 또는 물리적 변화시에 치료제로서 작용할 것으로 예상되는 형태인 임의의 물질, 분자 또는 독립체를 의미한다. 프로드럭은 일부 방식으로 공유 결합되거나 격리되며, 포유동물 대상체에게 투여전, 투여시 또는 투여후 활성 약물 잔기로 방출되거나 전환된다. 프로드럭은 변형물이 통상의 조작으로 또는 생체내에서 모 화합물로 절단되는 방식으로 화합물에 존재하는 작용성 그룹을 변형시킴으로써 제조될 수 있다. 프로드럭은 하이드록실, 아미노, 설피드릴, 또는 카복실 그룹이 포유동물 대상체에 투여될 때 절단되어 유리 하이드록실, 아미노 설피드릴 또는 카복실 그룹을 각각 형성하는 임의의 그룹에 결합되는 화합물을 포함한다. 프로드럭의 제조 및 사용은 문헌 (T. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987; 이들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에서 논의된다.
예후(Prognosing): 본 문서에 사용된 용어 "예후"는 특정 생물학적 이벤트가 미래에 일어나거나 일어날 가능성이 매우 큰 진술 또는 주장을 의미한다.
진행: 본원에 사용되는 용어 "진행" 또는 "암 진행"은 질환 또는 상태의 진행악화 또는 이들로의 악화를 의미한다.
증식하다: 본원에 사용되는 용어 "증식하다"는 성장하거나, 확장하거나, 증가하거나, 급격하게 성장, 확장 및 증가를 일으키는 것을 의미한다. "증식성"은 증식하는 능력을 갖는 것을 의미한다. "항-증식성"은 증식 특성에 반대되거나 부적절한 특성을 갖는 것을 의미한다.
단백질: "단백질"은 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기들의 중합체를 의미한다. 본원에 사용되는 상기 용어는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드를 의미한다. 그러나, 전형적으로, 단백질은 적어도 50개 길이의 아미노산일 것이다. 일부 예에서, 암호화된 단백질은 약 50개의 아미노산 보다 작다. 이 경우, 폴리펩티드는 펩티드로 지칭된다. 단백질이 짧은 펩티드라면, 이것은 적어도 약 10개의 길이의 아미노산 잔기일 것이다. 단백질은 자연적 발생, 재조합, 합성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 단백질은 또한 자연적으로 발생하는 단백질 또는 펩티드의 단편을 포함할 수 있다. 단백질은 단일 분자일 수 있거나, 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질이란 용어는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공적 화학 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다.
단백질 발현: 용어 "단백질 발현"은 아미노산 서열 또는 단백질의 검출가능한 수준이 발현되도록 핵산 서열이 번역을 수행하는 과정을 의미한다.
정제된: 본원에 사용되는, "정제하다", "정제된" 및 "정제"는 원하지 않는 성분, 물질 오염, 혼합물 또는 결함으로부터 실질적으로 순수하거나 깨끗하게 하는 것을 의미한다.　
퇴행: 본원에 사용되는 용어 "퇴행" 또는 "퇴행의 정도"는 암 진행의 표현형 또는 유전자형의 반전을 의미한다. 암 진행의 서행 또는 정지는 퇴행으로서 간주될 수 있다.
샘플: 본원에 사용되는 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 조직, 세포 또는 성분 부분(예를 들면, 혈액, 점액, 림프액, 활액, 뇌척수액, 타액, 양수, 양막 제대혈, 소변, 질액 및 정액을 포함하나 이들로 제한되지 않는 체액)의 서브세트를 의미한다. 샘플은 예를 들면, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부의 외부 부분, 호흡기, 장관, 및 비뇨 생식관, 눈물, 타액, 젖, 혈액 세포, 종양, 기관을 포함하나 이들로 제한되지 않는, 조직, 세포 또는 성분 부분의 전체 유기체 또는 하위부분으로부터 제조된 균질물, 동결건조물 또는 추출물, 또는 분획 또는 이의 부분을 추가로 포함할 수 있다. 샘플은 단백질 또는 핵산 분자와 같은 세포 성분을 함유할 수 있는 영양 브로쓰 또는 겔와 같은 배지를 의미한다.
신호 서열: 본원에 사용되는 어구는 "신호 서열"은 단백질의 수송 또는 국소화를 유도할 수 있는 서열을 의미한다.
신호 단위 용량: 본원에 사용되는 "신호 단위 용량"은 1회 용량/한꺼번에/단일 경로/단일 접촉점, 즉 단일 투여 이벤트로 투여되는 임의의 치료제의 용량이다.
유사성: 본원에 사용되는 용어 "유사성"은 중합체성 분자들 사이, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 분자들(예를 들면, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 사이 및/또는 폴리펩티드 분자들 사이의 전반적인 관련성을 의미한다. 중합체성 분자들 서로의 퍼센트 유사성의 계산은 퍼센트 유사성의 계산이 당업계에서 이해되는 바와 같이 보존적 치환을 고려하는 것을 제외하고는 퍼센트 동일성의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있다.
분할 용량: 본원에 사용되는 "분할 용량"은 단일 단위 용량 또는 총 1일 용량을 2개 이상의 용량으로 분할하는 것이다.
안정한: 본원에 사용되는 "안정한"은 반응 혼합물로부터 순도의 유용한 정도까지 단리하기에 충분히 강건(robust)함을 의미하고, 일 실시형태에서, 강력한 치료제로 제형화할 수 있는 화합물을 의미한다.
안정화된: 본원에 사용되는 용어 "안정화하다", "안정화된", "안정화된 영역"은 안정하게 하거나 안정해지는 것을 의미한다.
대상체: 본원에 사용되는 용어 "대상체" 또는 "환자"는 예를 들면, 실험, 진단, 예방 및/또는 치료 목적으로 본 개시내용에 따른 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 의미한다. 전형적인 대상체는 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 및 인간) 및/또는 식물을 포함한다.
실질적으로: 본원에 사용되는 용어 "실질적으로"는 관심대상의 특징 또는 특성의 총 또는 거의 총 크기 또는 정도를 나타내는 정량적 상태를 의미한다. 생물학 기술 분야의 당업계의 숙련가들은 생물학적 및 화학적 현상이 설령 가능하더라도 드물게 완료되고/되거나 완성도까지 진행하거나 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 본원에 사용되어 다수의 생물학적 및 화학적 현상에 내재하는 완성도의 잠재적 부족을 포괄한다.
실질적으로 동일한: 본원에 사용되는 바와 같이, 이것은 용량 사이의 시간 차이에 관한 것일 때, 용어는 +/- 2%를 의미한다.
실질적으로 동시에: 본원에 사용되는 바와 같이, 이것이 복수의 용량에 관한 것일 때, 용어는 2초 이내를 의미한다.
앓고 있는: 질환, 장애 및/또는 상태를 "앓고 있는" 개체들은 질환, 장애 및/또는 상태의 하나 이상으로 진단 받았거나 이들을 나타낸다.
에 감수성인: 질환, 장애 및/또는 상태에 "에 감수성인" 개체는 질환, 장애 및/또는 상태의 증상으로 진단을 받지 않았고/았거나 이들을 나타낼 수 없지만, 질환 또는 이의 증상을 발전시킬 경향을 품고 있다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 및/또는 상태(예를 들면, 암)에 걸리기 쉬운 개체는 다음 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다. (1) 질환, 장애 및/또는 상태의 발생과 관련된 유전자 돌연변이; (2) 질환, 장애 및/또는 상태의 발생과 관련된 유전자 다형성; (3) 질환, 장애 및/또는 상태와 관련된 단백질 및/또는 핵산의 발현 및/또는 활성의 증가 및/또는 감소; (4) 질환, 장애 및/또는 상태의 발생과 관련된 거동 및/또는 생활방식; (5) 질환, 장애 및/또는 상태의 가족력; 및 (6) 질환, 장애 및/또는 상태의 발생과 관련된 미생물에 대한 노출 및/또는 이에 의한 감염. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 및/또는 상태에 걸리기 쉬운 개체는 질환, 장애 및/또는 상태를 발생시킬 것이다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 및/또는 상태에 걸리기 쉬운 개체는 질환, 장애 및/또는 상태를 발생시키지 않을 것이다.
서방출: 본원에 사용된 용어 "서방출"은 특정 기간에 걸쳐 방출 속도에 따르는 약제학적 조성물 또는 화합물 방출 프로파일을 의미한다.
합성: 용어 "합성"은 인간의 손에 의해 생성, 제조 및/또는 제작되는 것을 의미한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 기타 분자의 합성은 화학적 또는 촉매적일 수 있다.
표적 세포: 본원에 사용되는 "표적 세포"는 관심대상의 임의의 하나 이상의 세포를 의미한다. 세포는 시험관 내, 생체 내, 인 시츄(in situ) 또는 유기체의 조직 또는 기관에서 발견될 수 있다. 유기체는 동물일 수 있고, 일 실시형태에서, 포유동물, 또는 인간일 수 있고, 일 실시형태에서, 환자일 수 있다.
치료제: 용어 "치료제"는 대상체에게 투여될 때, 치료적, 진단적 및/또는 예방적 효과를 가지고/거나 목적하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 유도하는 임의의 제제를 의미한다.
치료적 유효량: 본원에 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 감염, 질환, 장애 및/또는 상태를 앓고 있거나 이들에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여될 때, 감염, 질환, 장애 및/또는 상태의 증상을 치료 또는 개선하거나 이들의 발생을 진단, 예방 및/또는 지연시키기에 충분한 전달될 제제(예를 들면, 핵산, 약물, 치료제, 진단제, 예방제 등)의 양을 의미한다.
치료적으로 유효한 결과: 본원에 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 결과"는 감염, 질환, 장애 및/또는 상태를 앓고 있거나 이들에 걸리기 쉬운 대상체에서 감염, 질환, 장애 및/또는 상태의 증상을 치료 또는 개선하거나 이들의 발생을 진단, 예방 및/또는 지연시키기에 충분한 결과를 의미한다.
총 1일 용량: 본원에 사용되는, "총 1일 용량"은 24시간 내에 제공되거나 처방되는 양이다. 이것은 단일 단위 용량으로 투여될 수 있다.
전사 인자: 본원에 사용되는 용어 "전사 인자"는 예를 들면, 전사의 활성화 또는 억제에 의해 DNA의 RNA로의 전사를 조절하는 DNA-결합 단백질을 의미한다. 일부 전사 인자는 단독으로 전사의 조절을 가져오는 반면, 다른 것들은 다른 단백질과 협력하여 작용한다. 일부 전사 인자는 특정 조건 하에 전사를 활성화와 억제 둘 다 할 수 있다. 일반적으로, 전사 인자는 특정 표적 서열 또는 표적 유전자의 조절 영역에서 특정한 공통 서열과 매우 유사한 서열에 결합한다. 전사 인자는 표적 유전자의 전사를 단독으로 또는 자신과 복합체(동이합체)로 또는 다른 분자와 복합체(이합체)로 조절할 수 있다. 이러한 각각의 복합체 형성은 단일 전사 인자로부터 여러 가지 조절 기능을 유도할 수 있다.
치료: 본원에 사용되는 용어 "치료"는 특정 감염, 질환, 장애 및/또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 개시를 부분적으로 또는 완전히 완화, 개선, 향상, 경감 또는 지연시키거나 이들의 진행을 억제하거나, 이들의 중증도를 감소시키고/거나 이들의 발생을 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들면, 암의 "치료"란, 종양의 생존, 성장 및/또는 확산을 억제하는 것을 의미한다. 치료제는 질환, 장애 및/또는 상태의 징후를 나타내지 않는 대상체에게 및/또는 질환, 장애 및/또는 상태와 관련된 병변을 발생시킬 위험을 감소시킬 목적으로 질환, 장애 및/또는 상태의 조기 징후만을 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다.
어구 "치료 방법" 이의 균등물은, 예를 들면, 암에 적용될 때, 개체에서 암 세포의 수를 감소, 제거 또는 예방하거나 임의 증상을 완화시키도록 디자인된 작용의 절차 또는 과정을 의미한다. 암 또는 다른 증식성 장애의 "치료 방법"은 반드시 암 세포 또는 다른 장애가 실제로 완전히 제거될 것, 세포 또는 장애의 수가 실제로 감소할 것, 또는 암 또는 다른 장애의 증상이 실제로 완화될 것을 의미하지는 않는다. 종종, 암의 치료 방법은 심지어 성공 가능성이 낮아도 수행될 것이지만, 개체의 병력 및 추정 생존 예방이 그럼에도 불구하고 전반적인 유익한 작용 과정으로 간주된다.
종양 성장: 본원에 사용되는 용어 "종양 성장" 또는 "종양 전이 성장"은, 달리 명시되지 않는다면, 종양유전자에 흔히 사용되는 바와 같이 사용되며, 상기 용어는 원칙적으로 주로 종양 세포 성장의 결과로서 종양 또는 종양 전이의 질량 또는 용적의 증가와 관련된다.
종양 부하: 본원에 사용되는 용어 "종양 부하"는 대상체에 있는 3mm 초과의 직경을 갖는 모든 종양 소절의 총 종량 용적을 의미한다.
종양 용적: 본원에 사용되는 용어 "종양 용적"은 종량의 크기를 의미한다. 종양 용적(mm3)은 다음 수학식에 의해 계산된다: 용적 = (넓이)2 x 길이/2
변형되지 않은: 본원에 사용되는 "변형되지 않은"은 어떤 방법으로든 변화되기 전의 임의의 물질, 화합물 또는 분자를 의미한다. 변화되지 않은은, 항상은 아니지만, 생체분자의 야생형 또는 토종 형태를 의미한다. 분자는 일련의 변형을 겪을 수 있고, 이에 의해 각각의 변형된 분자는 후속적 변형을 위한 "변형된" 시작 분자로서 작용할 수 있다.
균등물 및 범위
당업계의 숙련가들은 본원에 기재된 본 개시내용에 따른 특정 실시형태에 대한 다수의 균등물을 통상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있다. 본 개시내용의 범위는 상기 상세한 설명으로 한정되는 것으로 의도되지 않고 첨부된 청구범위에서 설명된 바와 같다.
청구범위에서, 단수("a" "an") 및 "상기(the)"와 같은 표현은 달리 반대로 명시되거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않다면 하나 이상을 의미한다. 그룹의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는" 을 포함하는 청구범위 또는 상세한 설명은 그룹 구성원의 1개, 1개 이상 또는 모두가 존재하거나 사용되거나 달리 소정의 생성물 또는 방법과 관련되지 않거나 달리 이와 반대로 명시되지 않거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않다면, 만족된 것으로 간주된다. 본 개시내용은 그룹의 정확히 하나의 구성원이 존재하거나 사용되거나 달리 소정의 생성물 또는 방법과 관련되지 않는 실시형태를 포함한다. 본 개시내용은 그룹의 정확히 하나 이상 또는 모든 구성원이 존재하거나 사용되거나 달리 소정의 생성물 또는 방법과 관련되지 않는 실시형태를 포함한다.
용어 "포함하는"은 개방적인 것으로 의도되며, 추가의 요소 또는 단계를 포함하는 것을 허용한다.
범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 더욱이, 달리 명시되지 않거나 달리 문맥 및 당업계의 숙련가들의 이해로부터 명백하지 않다면, 범위로서 표현된 값은, 맥락에 의해 명백히 지시되지 않을 경우, 본 개시내용의 상이한 실시형태에서 명시된 범위 내의 임의의 구체적 값 또는 하위범위를 그 범위의 하한치의 단위의 1/10까지 추정할 수 있다.
또한, 종래 기술 내에 속하는 본 개시내용의 임의의 특정 실시형태는 청구항들 중 어느 하나 이상의으로부터 명백하게 배제될 수 있음이 이해될 것이다. 상기 실시형태는 당업계의 숙련가들에게 공지되어 있는 것으로 간주되기 때문에, 본원에서 배제가 명백하게 제시되어 있지 않더라도, 상기 실시형태는 배제될 수 있다. 본 개시내용의 조성물의 임의의 특정 실시형태(예를 들면, 임의의 핵산 또는 이에 의해 암호화된 단백질; 임의의 제조 방법; 임의의 사용 방법 등)는, 종래 기술의 존재에 관련되든지 관련되지 않든지 간에, 어느 하나 이상의 청구항으로부터 배제될 수 있다.
모든 인용된 출처, 예를 들면, 참조문헌, 공보, 데이터베이스, 데이터베이스 항목, 및 본원에 인용된 종래 기술은 비록 인용에서 명백히 진술되지 않더라도 본 출원에 참조로서 인용된다. 인용된 출처와 본 출원의 진술이 상충하는 경우, 본 출원의 진술이 우선할 것이다.
본 개시내용은 하기의 비제한적 실시예에 의해 추가로 설명할 것이다.
실시예
재료 및 절차:
saRNA의 형질감염
saRNA의 센스 및 안티센스 가닥이 합성되었다. 먼저 90℃에서 변성 단계를 거친 후 Tris-EDTA 기반 완충액에서 어닐링한 다음 실온까지 점진적인 어닐링 단계를 거쳤다. 24-웰 플레이트에 웰당 0.25 내지 1x105개 세포를 씨딩하고 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Life Technologies)을 사용하여 형질감염시켰다. 1uL의 리포펙타민 2000을 사용하여 표시된 올리고뉴클레오티드 농도로 씨딩한 후 즉시 형질감염을 수행했다. 그런 다음 24시간 후에 세포를 형질감염시키고 씨딩 후 48시간 및 72시간에 분석을 위해 수확했다.
RT-PCR
각 실험에 표시된 대로 씨딩 후 48시간 내지 96시간에 총 RNA를 수확했다. 제조업체의 권장 사항에 따라 RNeasy Mini 키트(QIAGEN)을 사용하여 RNA를 회수하고 QIAxpert 머신(QIAGEN)을 사용하여 정량화했다. RNA 샘플을 정규화하고 제조업체의 권장 사항에 따라 Quantitech 역전사 키트(Qiagen)를 사용하여 역전사했다. 상대적 발현 수준은 QIAGEN의 검증된 QuantiTech SYBR 프라이머가 장착된 PowerUp SYBR Green Master Mix(QIAGEN)를 사용하여 실시간 PCR로 결정되었다.
웨스턴 블롯
프로테아제 및 포스파타제 억제제(Fisher Scientific)가 보충된 방사면역침전 분석(RIPA) 완충액을 사용하여 세포를 용해시키고, 용해물을 얼음 위에서 10분간 배양한 후 30초씩 3회 초음파 처리했다. 총 단백질 수준은 Rapid Gold BCA 단백질 분석 키트(Pierce)에 의해 측정되었으며, 용해물은 로딩 전 총 단백질 함량으로 정규화되었다. 표적 단백질의 발현 수준은 12-230 kDa Wes 분리 모듈 및 항-래빗 검출 모듈을 사용하여 Wes 시스템(Biotechne)에 의해 결정되었다. 표적은 TMEM173 특이적 항체(Cell Signaling)로 검출되었다. 총 단백질 함량은 총 단백질 검출 모듈을 사용하여 확인되었다.
실시예1. 시험관 내에서 saRNA를 사용한 TMEM173 mRNA 발현의 상향조절
본 연구에서, 인간 HepG2 세포(간세포 암종)를 10nM의 대조 FLuc 올리고 또는 TMEM173(스팅)을 표적으로 하는 saRNA의 다양한 변이체로 형질감염시켰다. 72시간에 RNA를 추출하고 TMEM173 mRNA의 발현 수준을 RT-qPCR로 측정하였다 (도 2 및 도 3).
도 2에 도시된 바와 같이, TMEM173-Pr-1, TMEM173-Pr-32, TMEM173-Pr-48, TMEM173-Pr-70, TMEM173-Pr-89, TMEM173-Pr-121, TMEM173-Pr-161 및 TMEM173-Pr-164는 TMEM173 mRNA를 상향조절했다.
도 3에 도시된 바와 같이, TMEM173-Pr-70, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m2, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m1, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-0, TMEM173-Pr-70- invAb-Se-p1 및 TMEM173-Pr-70-invAb-Se-p2는 모두 TMEM173 mRNA를 상향조절했다.
또 다른 연구에서, 인간 A549 세포(폐 선암종)를 10nM의 대조 FLuc 올리고 또는 TMEM173(스팅)을 표적으로 하는 saRNA의 다양한 변이체로 형질감염시켰다. 72시간에 RNA를 추출하고 TMEM173 mRNA의 발현 수준을 RT-qPCR로 측정하였다 (도 4). 대조 saRNA의 서열은 표 5에 제시되어 있다.
도 4에 나타낸 바와 같이, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m1은 TMEM173 mRNA를 상향조절하였고, TMEM173-Pr-70-invAb-As-m1은 더 적은 활성을 가졌다. 음성 대조군 TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m1-seedmut는 TMEM173 mRNA를 상향 조절하지 않았다.
또 다른 연구에서, 처리되지 않은 A549 세포(UNTR), A549 세포를 10nM의 대조 FLuc 올리고 또는 TMEM173(스팅)을 표적으로 하는 saRNA로 형질감염시켰다. 72시간에 RNA와 단백질을 추출하고 TMEM173 mRNA와 TMEM173 단백질의 발현 수준을 각각 RT-qPCR과 Wes Protein Simple 분석으로 측정하였다 (도 5).
도 5에 도시된 바와 같이, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m1은 TMEM173 mRNA(도 5(A)) 및 TMEM173 단백질(도 5(B))을 상향조절했다. 총 단백질 정량은 Wes 분석에 대해 3개 샘플 모두의 동일한 로딩을 보여주었다.
또 다른 연구에서, 인간 A549 세포를 10nM의 대조 FLuc 올리고 또는 TMEM173(스팅)을 표적으로 하는 saRNA의 다양한 변이체로 형질감염시켰다. 72시간에 RNA를 추출하고 TMEM173 mRNA의 발현 수준을 RT-qPCR로 측정하였다 (도 6).
도 6에 도시된 바와 같이, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m1 및 TMEM173-Pr-70-m1-emod51은 둘 다 TMEM173 mRNA를 상향조절했다.
또 다른 연구에서, 인간 A549 세포를 다양한 농도(0.37 - 50 nM)의 대조 FLuc 올리고 또는 TMEM173(스팅)을 표적으로 하는 saRNA의 다양한 변이체로 형질감염시켰다. 표시된 시점에서 RNA를 추출하고 TMEM173 mRNA의 발현 수준을 RT-qPCR로 측정했다 (도 7).
도 7에 도시된 바와 같이, TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m1 및 TMEM173-Pr-70-m1-emod51은 둘 다 모든 시점에서 용량 의존적 방식으로 TMEM173 mRNA를 상향조절했다.
기타 실시형태
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 상기 설명은 본 발명을 예시하고자 하는 것이고 이의 범위를 제한하는 것이 아니며, 이의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 한정됨을 이해하여야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MINA THERAPEUTICS LIMITED <120> TMEM173 SARNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE <130> 2058.1034PCT <140> <141> <150> US63/166,390 <151> 2021-03-26 <150> US63/318,927 <151> 2022-03-11 <160> 85 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4001 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtcacagagg ccttcagaat gaagacccaa agacagaggg caaattgtct atttttacgt 60 ttaggttcat taaagtatgg acacccttgt tgaaatataa ttggacagaa agggtatgct 120 ctaatgctaa tagaatgagt ggggaaaccc agcctcgccc gtctgtctag attcttcttg 180 gcctctctga gcgtgtgttc cttctttctg agtgtggggc agggccctct ctggaagggg 240 gattttataa tctacactca aacaatgtag gtcagacctt cccttccctt cccttccctt 300 cccttccttc ctttctctct ctctcttttt ctttctttct tctctttttt ttttttttga 360 gacggagttt tgctcttgtc gcccaggctg gagtgcaatg gcacgatctc ggctcagtgc 420 aacctccgcc tcccaggttc aagcagttct cctgcctcag cctcccaaga agctgggatt 480 acaggcatgc gccatcacgc ccagctaatt ttttgtattt ttagtagaga tggggtttct 540 ccatgttggt caggatggtc ttgaactcct gacctcaggt gatctgcctg ccttggcctc 600 ccaaattgct gggattatag gagtgagcca ctgcacccgg cctttttttt tttttttttt 660 gagatggagt ttgactcttg ttgccgaggc tggagtgcag tggcatgatc tcggctcacc 720 gcaagctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcctga gtagctggga 780 ttataggcac ccgccaccac gcccagcgaa ttttttgtac ttttagtaga gatggggttt 840 cactatgttg gccaggctgg tctcgaactc ctgacctcaa gtgatccatt tgccttggcc 900 tcccaaagtg cgaggattac aaggatgagc cattgcgcct ggcctatttt tttttttttt 960 tttttgagat agggtatcac tctgtcactt aggctggagt gcagtggtgc catcacaact 1020 cactgcaacc tctacctcca ggggtcaagt gatgctccca cctcagcctc ccaagtagct 1080 gggactatag gcgtgttccg tcatgcttgg ctaatttttt tttttttttt ttgtagagat 1140 gggatctccc tgtgttgctt aggctggtct caaacttctg ggctcaagtg atcctcctgc 1200 cttggcctcc caaagtgctg ggattactgg aatgaaatca aggcacagag caagctgggc 1260 tttggagcaa cccaccaggc ttcaagtccc cactctcaat tacttaaacc agttatttca 1320 cctccctgag cctcggatta tccatctata aaatggggct agaattatac ctacctgaca 1380 gggtggctgg tgaaatgata tacaagtgaa gtgatatatg caacacttgg cataatgtct 1440 ggaacaaggt aaacacttta ttattattat tattattata atttaggttg atgcatgggg 1500 attttataac ctacactcaa acaatgtagg tcagatcatt tttcttttct tttcttttct 1560 tttcttttga gacagtctcg ctcttgttgc ccaggctgga gtgcagtggc ctaatctctg 1620 ctcactgcaa cttccacctc tcaggttcca gcgattctcc tgcctcagcc tcccaagtag 1680 ctaagattac aagcgcccac caccacgcct ggctaatttt tgtttttagt agagatgggg 1740 tttcaccatg ttgctcaggc tggtcttgaa ctcctgacct caagtgatcc acccatctcg 1800 gcctcccaaa gcgctgggat tacaggcatg agccactgtg ccaggcctgc aattactttt 1860 gctcctacct aatatcatcc ccacaaccgc cttctgggca gaaaccggca ggctctcttg 1920 gagaagtcac aggcgtggcc atttcctgca aagagccaaa cccccattcc tctgtgcccc 1980 tcctctccca ccaagtgctt tataaaaata gctcttgtta ccggaaataa ctgttcattt 2040 ttcactcctc cctcctaggt cacacttttc agaaaaagaa tctgcatcct ggaaaccaga 2100 agaaaaatat gagacgggga atcatcgtgt gatgtgtgtg ctgcctttgg ctgagtgtgt 2160 ggagtcctgc tcaggtgtta ggtacagtgt gtttgatcgt ggtggcttga ggggaacccg 2220 ctgttcagag ctgtgactgc ggtgagtgtt tctaaacacc cttggtttgg gggtagcaaa 2280 gggcaatgga atggaggctt tctcaaacct cacccctgac cccaggactc aggcccagct 2340 catcagggct ttgagggaag gttcctacct cccttcctga ggaacaggaa ataccctcct 2400 tcccagcacc agtaaagctg cggtttggag aaacgccagg gctagagtgt tgtggagaaa 2460 ccaatcgttg ttaacatctc attttcaggc tgcactcaga gaagctgccc ttggctgctc 2520 gtagcgccgg gccttctctc ctcgtcatca tccagagcag ccagtgtccg ggaggcagaa 2580 ggtaggctca agatcagcct ggcagaacgc caaacctagg gcccctggca cccagaggcg 2640 agggggtgcc tgctggctgc cctgtcccca ctccctgagc tctgttttcc actttgttga 2700 ctaaggtcct ccctggggtg ggttccgggg acaggggaac ccaggtcccc aagggttctt 2760 ggttgggtac ggctgcacag gacagcttca agtctgggtc tgggatagtt gctgccttct 2820 ttcttcacca cacctgtggt ctccctgggt cttggtgggg cgtgtatgtg caggccctgc 2880 tctgttttca gcaaacctcg ctgagacagg agctttgggg tgacttattc ccagcctgcc 2940 tcctagaggt gtctctaaga gcagcctctg ggagtggctg ggcaccaggg aaaggggaac 3000 tgggaggaag tgcccagcca gagcctcagt cccagaaggg caggagggca aggggagaat 3060 ggtcatggat ttcttggtgc ccacagatgc cccactccag cctgcatcca tccatcccgt 3120 gtcccagggg tcacggggcc cagaaggcag ccttggttct gctgagtgcc tgcctggtga 3180 ccctttgggg gctaggagag ccaccagagc acactctccg gtacctggtg ctccacctag 3240 cctccctgca gctgggactg ctgttaaacg gggtctgcag cctggctgag gagctgcgcc 3300 acatccactc caggtgactc actgcagtac ccagggacgg ggtatccaac gtgtgtcact 3360 cccttgatgc ctagccctgc ccctccttga acctctctgg ctgagctggg ctgggggctg 3420 gggtctgggg tctggctgtc actcacaggt accggggcag ctactggagg actgtgcggg 3480 cctgcctggg ctgccccctc cgccgtgggg ccctgttgct gctgtccatc tatttctact 3540 actccctccc aaatgcggtc ggcccgccct tcacttggat gcttgccctc ctgggcctct 3600 cgcaggcact gaacatcctc ctgggcctca aggtatgaca cagggggagg tagaagctct 3660 ggccaagtgg tggctgtggc tggtgtgacc tgccctgagc tgagtactgg gagtgggact 3720 ggtttaaagg ctggagtcca tggagtagaa cctataatgt cctggaacag tgggtttggc 3780 aatggcaaaa gagggatcaa gtcaggagca ggttgggaag ccttggagga ggaggaggag 3840 ttctctgggt gtccttgatg gaggcccccc agccacatcc tgctgtccac agggcctggc 3900 cccagctgag atctctgcag tgtgtgaaaa agggaatttc aacgtggccc atgggctggc 3960 atggtcatat tacatcggat atctgcggct gatcctgcca g 4001 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcagatatcc gatgtaata 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ccaagtgttg catatatca 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtgtttacct tgttccaga 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgagatgtt aacaacgat 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 acgattggtt tctccacaa 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aaccaagggt gtttagaaa 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gtaggaacct tccctcaaa 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 caggatcagc cgcagatat 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gggagggagt agtagaaat 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tcctgtctca gcgaggttt 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 aacgattggt ttctccaca 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 caacgattgg tttctccac 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 aaccaagggu guuuagaaa 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 guaggaaccu ucccucaaa 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 caggaucagc cgcagauau 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 gggagggagu aguagaaau 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 uccugucuca gcgagguuu 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 aacgauuggu uucuccaca 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 caacgauugg uuucuccac 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 cgauugguuu cuccacaac 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 gauugguuuc uccacaaca 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 uauuacaucg gauaucugc 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 ugauauaugc aacacuugg 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 ucuggaacaa gguaaacac 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 aucguuguua acaucucau 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 uuguggagaa accaaucgu 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 uuucuaaaca cccuugguu 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 uuugagggaa gguuccuac 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 auaucugcgg cugauccug 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 auuucuacua cucccuccc 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 aaaccucgcu gagacagga 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 uguggagaaa ccaaucguu 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 guggagaaac caaucguug 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 guuguggaga aaccaaucg 19 <210> 43 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 uguuguggag aaaccaauc 19 <210> 44 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 44 gcagauaucc gauguaauau u 21 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 45 ccaaguguug cauauaucau u 21 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 46 guguuuaccu uguuccagau u 21 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 47 augagauguu aacaacgauu u 21 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 48 acgauugguu ucuccacaau u 21 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 49 aaccaagggu guuuagaaau u 21 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 50 guaggaaccu ucccucaaau u 21 <210> 51 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 51 caggaucagc cgcagauauu u 21 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 52 gggagggagu aguagaaauu u 21 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 53 uccugucuca gcgagguuuu u 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 54 aacgauuggu uucuccacau u 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 55 caacgauugg uuucuccacu u 21 <210> 56 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 56 cgauugguuu cuccacaacu u 21 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 57 gauugguuuc uccacaacau u 21 <210> 58 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> Inverted abasic nucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(22) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 58 nacgauuggu uucuccacaa uu 22 <210> 59 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> Inverted abasic nucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(22) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 59 naacgauugg uuucuccaca uu 22 <210> 60 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> Inverted abasic nucleotide <220> <221> modified_base <222> (21)..(22) <223> 2'-OMe modified nucleotide <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 60 ncaacgauug guuucuccac uu 22 <210> 61 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> Inverted abasic nucleotide 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Claims (19)

  1. 표적 유전자의 발현을 상향 조절하는 합성 단리된 소형 활성화 RNA(saRNA)로서, 표적 유전자는 TMEM173 이고,
    saRNA는 표적 유전자의 표적 서열에 적어도 80% 상보적인 안티센스 가닥을 포함하고, 표적 서열은 서열번호: 2 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    안티센스 가닥은 14개 내지 30개의 뉴클레오티드를 갖는, saRNA.
  2. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥이 서열번호: 30 내지 43으로부터 선택된 서열을 포함하는, saRNA.
  3. 제2항에 있어서, 안티센스 가닥이 3' 돌출부를 포함하는, saRNA.
  4. 제3항에 있어서, 3' 돌출부는 uu, UU 또는 UUU인, saRNA.
  5. 제4항에 있어서, 안티센스 가닥이 서열번호: 69 내지 82로부터 선택된 서열을 포함하는, saRNA.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, saRNA는 이중 가닥이고 센스 가닥을 추가로 포함하는, saRNA.
  7. 제6항에 있어서, 센스 가닥이 서열번호: 16 내지 29로부터 선택된 서열을 포함하는, saRNA.
  8. 제7항에 있어서, 센스 가닥이 3' 돌출부 및/또는 5' 돌출부를 포함하는, saRNA.
  9. 제8항에 있어서, 3' 돌출부는 uu, UU 또는 UUU인, saRNA.
  10. 제8항에 있어서, 5' 돌출부는 dT, ddT, inv ddT 또는 invAb인, saRNA.
  11. 제8항에 있어서, 센스 가닥이 서열번호: 44 내지 68로부터 선택된 서열을 포함하는, saRNA.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, saRNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, saRNA.
  13. 제1항에 있어서, saRNA는 TMEM173-Pr-70-invAb-Se-m1 또는 TMEM173-Pr-70-m1-emod51인, saRNA.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 saRNA 및 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 표적 유전자의 발현을 상향 조절하는 방법으로서, 상기 표적 유전자가 TMEM173이고, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 saRNA를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 표적 유전자의 발현이 적어도 30%, 40%, 또는 50% 증가되는, 방법.
  17. 암 치료가 필요한 대상체의 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 saRNA 또는 제13항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 암 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 암은 고형 종양인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 암은 간세포 암종, 췌장암 또는 난소암인, 방법.
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