MXPA06003828A - Uso de polimorfismos geneticos que se asocian con la eficacia del tratamiento de enfermedad inflamatoria. - Google Patents

Abstract

La region MHC III del cromosoma 6p21.3 aloja a una secuencia de ADN, mas posiblemente dentro del gen TNF o LTA, que tiene influencia sobre la respuesta al pimecrolimus para el tratamiento de dermatitis atopica. De acuerdo con lo anterior, los polimorfismos geneticos en los genes TNF y LTA son utiles como biomarcadores de la eficacia del tratamiento con pimecrolimus de la enfermedad inflamatoria. En contraste, la respuesta al tacrolimus parece ser influenciada por otras sendas biologicas.

Description

USO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS QUE SE ASOCIAN CON LA EFICACIA DEL TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD INFLAMATORIA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere en general a la prueba analítica de muestras de tejido in vitro, y más particularmente al análisis de los polimorfismos genéticos como biomarcadores para la eficacia de los tratamientos de la enfermedad inflamatoria.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA La dermatitis atópica (AD), también conocida como eczema, es una enfermedad inflamatoria de la piel tipificada por la piel Inflamada y con comezón, que se presenta durante |a infancia y la niñez. La enfermedad es uno de los trastornos dermatológicos más comunes en los países occidentales, que afecta a tantos como al 20 por ciento de los niños menores de 5 años de edad. Cookson W. O. y colaboradores, Nature Genetics 27:372-373 (2001 ). El pimecrolimus (EMdel®) es un derivado de macrolactama de ascomicina que fue específicamente desarrollado para el tratamiento de enfermedades inflamatorias de la piel. El tacrolimus (FK506; Protopic® ó Prograf®) es un miembro de la misma clase de compuestos, y también se utiliza para tratar las enfermedades inflamatorias de la piel. Tanto el pimecrolimus como el tacrolimus interfieren con el proceso inflamatorio mediante su enlace de alta afinidad con la m acrof i I ¡ n a- 12 , e inhibiendo la calcineurina, que bloquea la transcripción de las citoquinas tipo Th1 y Th2 en los linfocitos-T. Aunque los dos compuestos son es t ru ct u ra I m e n te similares y tienen mecanismos de acción comparables, el pimecrolimus tiene una afinidad más alta para la piel que el tacrolimus. Durante mucho tiempo se ha reconocido que existe una base genética para las enfermedades atópicas. Se han hecho varios análisis de enlace para definir las regiones de susceptibilidad que contribuyen a la dermatitis atópica, como se revisa en Maclean J. A. y Eidelman F. J., Arch Dermatol 137:1474-1476 (2001 ). Se piensa que cuando menos cinco regiones cromosómicas (3q21 ,5q31-33, 11 q 13 , 13q12-14 y 14q11.2) contienen los loci de susceptibilidad a la dermatitis atópica. El pensamiento actual es que los mecanismos atópicos son primordialmente responsables de la patogénesis de la dermatitis atópica. Sin embargo, otros genes involucrados con la inflamación dérmica también pueden contribuir a la condición. Cookson W. O. y colaboradores, Nature Genetics 27:372-373 (2001). El índice de respuesta entre los pacientes que toman macrolactamas tópicas (pimecrolimus o tacrolimus) actualmente es menor del 50 por ciento. No se sabe la razón por la cual algunos pacientes no responden a estos medicamentos. Por consiguiente, queda una necesidad en la técnica de mejorar la eficacia de las macrolactamas tópicas, tal como mediante la dirección de formulaciones apropiadas de los medicamentos hacia estos pacientes de enfermedad inflamatoria que están genéticamente dispuestos para responder y beneficiarse del tratamiento.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método para el tratamiento de dermatitis atópica, basándose en una determinación de los alelos de TNF del paciente. En una modalidad, se prueba a los pacientes para determinar la presencia de un polimorfismo de TNF (-1031), con el fin de determinar la terapia apropiada. Los pacientes que tengan los alelos TT (SEQ ID NO:1) en ese locus se tratan con crema o ungüento de pimecrolimus, mientras que los pacientes que tengan los alelos CC (SEQ ID NO:2) o los alelos CT (SEQ ID NOs:1 y 2) se tratan con una dosis más alta de crema de pimecrolimus, con crema de pimecrolimus más otro fármaco anti-inflamatorio, o con un fármaco anti-inflamatorio sin crema de pimecrolimus. La invención también proporciona un método general para el tratamiento de psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, o cualquier trastorno para el cual se indique el pimecrolimus (oral, tópico, u otro), basándose en una determinación de los alelos de TNF del paciente. En una modalidad, se prueba a los pacientes para determinar la presencia de un polimorfismo de TNF (-1031), con el fin de determinar la terapia apropiada. Los pacientes con los alelos TT en este locus se tratan con pimecrolimus, mientras que los pacientes con los alelos CC y los alelos CT reciben una dosis más alta de pimecrolimus, pimecrolimus más otro fármaco anti-inflamatorio, o un fármaco anti-inflamatorio sin pimecrolimus. La invención proporciona además un método para el tratamiento de psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, o cualquier trastorno para el cual se indique el pimecrolimus (oral, tópico, u otro), basándose en una determinación de los alelos LTA del paciente. En una modalidad, se prueba a los pacientes para determinar la presencia de un polimorfismo del locus de LTA ASN60THR, con el fin de determinar la terapia apropiada. Los pacientes con los alelos AA (SEQ ID NO:3) o los alelos AC (SEQ ID NOs:3 y 4) y en ese locus, se tratan con pimecrolimus, mientras que los pacientes con los alelos CC (SEQ ID NO: 4) reciben una dosis más alta de pimecrolimus, pimecrolimus más otro fármaco anti-inflamatorio, o un fármaco anti-inflamatorio sin pimecrolimus. La invención también proporciona un método para el tratamiento de psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, o cualquier trastorno para el que se indique el tacrolimus (oral, tópico, u otro), basándose en una determinación de los alelos CCR2 del paciente. En una modalidad, se prueba a los pacientes para determinar la presencia de un polimorfismo del locus CCR2 VAL64ILE, para determinar la terapia apropiada. Los pacientes con los alelos GG (SEQ ID NO:5) en ese locus se tratan con tacrolimus, mientras que los pacientes con los alelos AG (SEQ ID NOs:5 y 6) reciben una dosis más alta de tacrolimus, tacrolimus más otro fármaco anti-inflamatorio, o un fármaco anti-inflamatorio sin tacrolimus. La invención proporciona un método para el tratamiento de dermatitis atópica o cualquier trastorno para el que se indique el pimecrolimus (oral, tópico, u otro), en donde se mide el nivel de proteína ó ARNm de TNF-a presente en el paciente antes de determinar la terapia apropiada. En una modalidad, cuando los niveles de proteína ó ARNm de TNF-a en los fluidos corporales o en las muestras de tejido no inflamado del paciente son bajos o normales, entonces se trata al paciente con pimecrolimus. En otra modalidad, cuando los niveles de proteína ó ARNm de TNF-a son elevados, entonces se trata al paciente con pimecrolimus en combinación con otro fármaco anti-inflamatorio o con una terapia alternativa.

La invención proporciona además un método para la determinación de una estrategia de tratamiento para una condición en un sujeto, en donde la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en dermatitis ató pica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la cual se indique el pimecrolimus, comprendiendo este método analizar el nivel de ARNm de TNF-a ó de proteína de TNF-a en una muestra obtenida del sujeto; y en donde la estrategia de tratamiento comprende la selección de una formulación de pimecrolimus como tratamiento cuando el nivel de ARNm de TNF-a ó de proteína de TNF-a en la muestra es bajo o normal; o la selección de cualquiera de: (A) una formulación de pimecrolimus en combinación con otro inmunosupresor, o (B) otro inmunosupresor como tratamiento cuando sea elevado el nivel de ARNm de TNF-a ó de pro teína de TNF-a en la muestra. De preferencia, esta muestra se toma del tejido no inflamado. La invención proporciona un método para seleccionar sujetos para incluirse en un estudio clínico de enfermedad inflamatoria del piel o cualquier otro trastorno para el que se indique el pimecrolimus, en donde se interrogan los polimorfismos genéticos en el locus TNF (-1031), en el locus LTA de ASN60THR, ó en el locus CCR2 de VAL64ILE de los sujetos candidatos antes de incluirse en el estudio clínico. La invención proporciona un estuche de diagnóstico para utilizarse en la determinación de la estrategia de tratamiento para un paciente con enfermedad inflamatoria de la piel o cualquier otro trastorno para el que se indique el pimecrolimus. En una modalidad, el estuche de diagnóstico contiene reactivos para determinar los niveles de proteína ó ARNm de TNF-a en una muestra obtenida de un sujeto que se vaya a tratar. En otra modalidad, el estuche de diagnóstico contiene reactivos para determinar el genotipo del sujeto en los genes TNF, LTA, ó CCR2. El estuche de diagnóstico también contiene un producto escrito que describe el uso del biomarcador en la determinación de una estrategia de tratamiento para la condición. La invención proporciona además un método para determinar una estrategia de tratamiento para una condición en un sujeto, en donde la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en dermatitis atópica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la que se indique el pimecrolimus o el tacrolimus, comprendiendo este método analizar el genotipo de un sujeto en un locus genético a partir del cúmulo de genes de TNF que indica la eficacia de una formulación de macrolactama seleccionada en el tratamiento de la condición. De preferencia, el genotipo se determina mediante el análisis de una muestra obtenida del sujeto. En una modalidad, se prueba a los sujetos/pacientes para determinar la presencia de un polimorfismo de TNF (-1031), con el fin de determinar la estrategia de tratamiento apropiada. Para los pacientes con alelos TT (SEQ ID NO:1) en ese ¡ocus, se selecciona el pimecrolimus como el tratamiento, mientras que, para los pacientes con alelos CC (SEQ ID NO:2) y alelos CT (SEQ ID NOs:1 y 2), se selecciona como tratamiento una dosis más alta de pimecrolimus, pimecrolimus más otro fármaco antiinflamatorio, o un fármaco anti-inflamatorio sin pimecrolimus. Otra modalidad de la invención dispone que esta estrategia de tratamiento se base en una determinación de los alelos LTA del paciente. En una modalidad preferida, se prueba a los pacientes para determinar la presencia de un polimorfismo del locus LTA de ASN60THR, con el fin de determinar la estrategia de tratamiento. Para los pacientes con alelos AA (SEQ ID NO:3) ó alelos AC (SEQ ID NOs:3 y 4) en ese locus, se selecciona el pimecrolimus como el tratamiento, mientras que para los pacientes con alelos CC (SEQ ID NO:4), se selecciona como tratamiento una dosis más alta de pimecrolimus, pimecrolimus más otro fármaco anti-inflamatorio, o un fármaco anti-inflamatorio sin pimecrolimus. El fármaco anti-inflamatorio de preferencia se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrocortisona, ciclosporina, tacrolimus, y sirolimus.

La invención proporciona un método adicional para determinar una estrategia de tratamiento para un sujeto/paciente afectado por dermatitis atópica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la que se indique el pimecrolimus o el tacrolimus, basándose en una determinación de los alelos CCR2 del paciente. En una modalidad, se prueba al paciente para determinar la presencia de un polimorfismo del locus CCR2 de VAL64ILE, para determinar la estrategia de tratamiento apropiada. Para un paciente con los alelos GG (SEQ ID NO:5) en ese locus, se selecciona el tacrolimus como la estrategia de tratamiento, mientras que, para un paciente con los alelos AG (SEQ ID NOs:5 y 6), se selecciona como estrategia de tratamiento una dosis más alta de tacrolimus, tacrolimus más otro fármaco anti-inflamatorio, o un fármaco anti- inflamatorio sin tacrolimus. El fármaco anti-inflamatorio de preferencia se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrocortisona, ciclosporina, pimecrolimus, y sirolimus. La invención también proporciona el uso de pimecrolimus en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad inflamatoria en una población de pacientes seleccionada, en donde la población de pacientes se selecciona con base en el genotipo de los pacientes en un locus genético a partir del cúmulo de genes de TNF, que indica la eficacia del pimecrolimus en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria. En una modalidad, el genotipo de la población de pacientes seleccionada comprende la presencia de un polimorfismo de TNF (-1031). De preferencia, la población de pacientes seleccionada comprende los alelos TT en ese locus. En otra modalidad, la población de pacientes seleccionada comprende un polimorfismo del locus LTA de ASN60THR. De preferencia, la población de pacientes seleccionada comprende los alelos AA ó los alelos CC en ese locus. Además, la invención proporciona el uso de tacrolimus en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad inflamatoria en una población de pacientes seleccionada, en donde la población de pacientes se selecciona con base en el genotipo de los pacientes en el locus genético CCR2, que indica la eficacia del tacrolimus en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria. En una modalidad, la población de pacientes seleccionada comprende al polimorfismo del locus CCR de VAL64ILE. De preferencia, esta población de pacientes comprende a los alelos GG en ese locus. Por consiguiente, la invención proporciona una manera de mejorar la eficacia de las macrolactamas tópicas, en particular pimecrolimus, mediante la identificación de biomarcadores de la eficacia en los sujetos que se vayan a tratar, y luego se dirigen las formulaciones de macrolactama apropiadas hacia aquéllos que sean más capaces de responder y beneficiarse del tratamiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación diagramática del complejo de histocompatibilidad mayor ( HC) sobre el cromosoma (Ch) 6, que muestra la colocación de LTA (el gen que codifica para la linfotoxina alfa) y TNF (el gen que codifica para el factor de necrosis tumoral alfa; TNF-a) dentro del complejo de histocompatibilidad mayor. Más abajo se muestra con mayor detalle la región de 6p21.3 que contiene al cúmulo de genes de TNF. * denota los polimorfismos, que están regularmente a 2.5 kb de separación, discutidos en la presente. Esta figura está modificada de Field M , Q. J. Med. 94:237-246 (2001).

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La eficacia del tratamiento de dermatitis atópica mediante crema de pimecrolimus al 1 por ciento, pero no del tratamiento con ungüento de tacrolimus al 0.03 por ciento, está asociada con los marcadores polimórficos del cúmulo de TNF sobre 6p21.3. Este descubrimiento proporciona una manera de utilizar los polimorfismos genéticos que se asocian con la eficacia del tratamiento con pimecrolimus en la determinación del tratamiento más efectivo. El locus genético se identificó en un estudio en Fase lllb, que se diseñó como una comparación cabeza con cabeza de la crema de pimecrolimus al 1 por ciento y el ungüento de tacrolimus al 0.03 por ciento. El estudio de investigador-ciego de seis semanas de los sujetos pediátricos con dermatitis atópica moderada, exploró la incidencia de las reacciones en el sitio de aplicación local inducidas por las dos macrolactamas tópicas, así como su eficacia, seguridad, y aceptabilidad cosmética. Se recolectaron muestras de sangre para el análisis farmacogenético a partir de los participantes que consintieron en el estudio clínico, para definir una base genética para la respuesta a cualquier tratamiento. Entre los genes seleccionados para el análisis farmacogenómico estuvieron TLA, que codifica para la linfotoxina alfa (LTa), y TNF, que codifica para el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). Los genes LTA y TNF están localizados en hilera en la región MHCI1I rica en genes de 6 p 21.3 (ver la Figura 1). Ambos genes contienen múltiples polimorfismos, algunos de los cuales se han caracterizado bien, como es revisado por Field M , Q. J. Med. 94:237-246 (2001). Ambos productos genéticos LTA y TNF son citoquinas involucradas en los procesos inflamatorios. Ambas citoquinas señalan a través de los receptores de TNF-a, que se expresan en muchos tejidos diferentes, incluyendo la piel. Rulls S. R. & Sedgwick J.D., Am. J. Hum. Genet. 65:294-301 (1999) . Adicionalmente, tanto LTA como TNF se han implicado en la patogénesis de la enfermedad atópica. Los polimorfismos en ambos genes están asociados con atopia, en particular asma. Trabetti E. y colaboradores, J. Med. Genet. 36:323-5 (1999); Izakovicaova Holla L. y colaboradores, Clin. Exp. Allergy 9:1418-23 (2001); Castro J. y colaboradores, J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 3:149-5 (2000) ; Li Kam Wa T. C. y colaboradores, Clin. Exp. Allergy 29:1204-8 (1999); y Zhu S. y colaboradores, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161:1655-9 (2000). El TNF-a se ha estudiado extensamente para determinar su papel en la inflamación dérmica. Tanto los mastocitos dérmicos como los q ueratinocitos producen TNF-a. Aunque la expresión de TNF-a es constitutiva en la piel, el nivel de expresión se puede inducir adicionalmente mediante una variedad de estímulos. Los niveles de TNF-a son elevados en las lesiones de piel por psoriasis, y varios reportes han sugerido que los fármacos que modulan la función de TNF-a son efectivos en el tratamiento de psoriasis, como es revisado por LaDuca J. R. y Gaspari A. A., Dermatol. Clin. 19:617-635 (2001), y Mease P. J., Ann. Rheum. Dis. 61:298-304 (2002). Aunque la psoriasis es distinta de la dermatitis atópica, la expresión de ambas enfermedades es influenciada por los genes que modulan la inflamación dérmica. Cookson W. O. y colaboradores, Nature Genetics 27:372-373 (2001). En el estudio clínico y en los análisis farmacogenómicos subsecuentes, se encontró una asociación entre la eficacia del pimecrolimus y el polimorfismo de TNF (-1031) en los sujetos pediátricos (de 2 a 17 años de edad) con dermatitis atópica que fueron tratados tópicamente con la formulación en crema de pimecrolimus. El polimorfismo que se asoció con la eficacia del pimecrolimus se localiza a -1031 desde el sitio de inicio de transcripción del gen, y cambia el T de tipo silvestre hasta un C. Los únicos sujetos que experimentaron eficacia en este estudio tuvieron un genotipo TT en TNF (-1031) (SEQ ID NO:1). Ningún paciente con un alelo C (CC (SEQ ID NO:2) ó CT (SEQ ID NOs:1 y 2)) en ese locus respondió al pimecrolimus. Esta asociación no se mantuvo para el tacrolimus. Para un segundo SNP en la misma región cromosómica, LTA de ASN60THR, los datos también sugirieron una tendencia hacia el significado. Se puede esperar razonablemente que estas asociaciones se mantengan para todos los grupos de edades y para sujetos con otras enfermedades inflamatorias de la piel. Más aún, se puede predecir razonablemente la eficacia del pimecrolimus cuando se formule el compuesto como una tableta o como un aerosol. El método se puede emplear para sujetos vertebrados, en particular sujetos mamíferos, y más particularmente para sujetos humanos. Los individuos que llevan los alelos polimórficos de interés (es decir, en los genes del cúmulo TNF, tales como TNF y LTA) se pueden detectar en el ADN, en el ARN, o al nivel de la proteína, utilizando una variedad de técnicas que son bien conocidas en este campo. Las estrategias para la identificación y detección se describen, por ejemplo, en las Patentes Números EP 730,663; EP 717,113, y PCT US97/02102. Los métodos de la invención pueden involucrar la detección de polimorfismos previamente caracterizados, en donde ya se han determinado la localización de la genotipificación y la naturaleza de las formas polimórficas presentes en un sitio (ver la discusión anterior con respecto a los genes LTA y TNF). La disponibilidad de esta información permite diseñar conjuntos de sondas para una identificación específica de las formas polimórficas conocidas. La identificación de los alelos que contengan polimorfismos de nucleótidos individuales pueden involucrar la identificación del ADN a partir de muestras objetivas. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa. Ver en general PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification, (editor Erlich, Freeman Press, Y, N. Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (editores Innis, y colaboradores, Academic Press, San Diego, Calif., 1990). La detección de polimorfismos en secuencias específicas de ADN se puede llevar a cabo mediante una variedad de métodos, incluyendo, pero no limitándose a, detección de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción basándose en la disociación de la endonucleasa de restricción específica del alelo (Kan y Dozy, Lancet 11:910-912 (1978)), hibridación con sondas de oligonucleótidos específicas del alelo (Wallace y colaboradores, Nucí. Acids Res. 6:3543-3557 (1978)), incluyendo oligonucleótidos inmovilizados (Saiki y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A., 86:6230-6234 (1969)) o arreglos de oligonucleótidos ( askos y Southern, Nucí. Acids Res. 21:2269-2270 (1993)), reacción en cadena de la polimerasa específica del alelo (Newton y colaboradores, Nucí. Acids Res. 17:2503-2516 (1989)), detección de reparación de mal emparejamiento (MRD) (Faham y Cox, Genome Res. 5:474-482 (1995)), enlace de proteína utS (Wagner y colaboradores, Nucí. Acids Res. 23:3944-3948 (1995)), electrof oresis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (Fisher y Lerman, Proc. Nati. Acad. Sci. EAU. 80:1579-1583 (1983)), detección de polimorfismo de conformación de una sola cadena (Orita y colaboradores, Genomics 5:874-879 (1983)), disociación de ARNsa en los pares de bases mal emparejados ( yers y colaboradores, Science 230:1242 (1985)), disociación química (Cotton y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. A. U., 8Z:4397-4401 (1988)) o enzimática (Youil y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A. 92:87-91 (1995)) del ADN heterodúplex, métodos basados en la extensión del cebador específica del alelo (Syvanen y colaboradores, Genomics 8:684-692 (1990)), análisis de bits genéticos (GBA) (Nikiforov y colaboradores, Nucí. Acids Res. 22:4167-4175 (1994)), el ensayo de ligamiento de oligonucleótidos (OLA) (Landegren y colaboradores, Science 241:1077 (1988)), la reacción en cadena de ligamiento específica del alelo (LCR) (Barrany, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A. 88:189-193 (1991)), LCR-huevos (Abravaya y colaboradores, Nucí. Acids Res. 23:675-682 (1995)), secuenciación de ADN radioactiva y/o fluorescente empleando procedimientos convencionales bien conocidos en este campo, y ensayos de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) (Orum y colaboradores, Nucí. Acids Res. 21:5332-5336 (1993); Thiede y colaboradores, Nucí. Acids Res. 24:983-984 (1996)). Se proporciona una guía adicional en Sambrook J. y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000). Los niveles de ARNm ó de proteína de TNF-a se pueden determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la materia. Ver las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,566,501; 6,541,620; y 6,537,540. Se proporciona una discusión de los niveles del factor de necrosis tumoral en los trastornos asociados con TNF en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,537,540, y las referencias citadas en la misma (todas las cuales se incorporan como referencia). Como se utiliza en la presente, el nivel de ARNm de TNF-a (SEQ ID NO:7) en la muestra, se determina como "alto" cuando la proporción de la expresión de ARNm de TNF-a a la ß-actina (SEQ ID NO:9; ver Actor J. K. y colaboradores, Comb. Chem. Hígh Throug put Screen 3(4):343-51 (agosto de 2000)) o la expresión de GAPDH (ver Anderson G. D. y colaboradores, J. Clin. Invest. 97(11):2672-9 (junio 1, 1996)) en la muestra, es de aproximadamente el doble o más alta que la proporción de la expresión del ARNm de TNF-a a la ß-actina, comparándose con una muestra de un individuo (o de preferencia de una población de individuos) que no tenga una condición inflamatoria de la piel. Como se utiliza en la presente, el nivel de ARNm de TNF-a en la muestra se determina como "bajo o normal" cuando la proporción de la expresión del ARNm de TNF-a a la de la ß-actina en la muestra es aproximadamente igual o menor que la proporción de la expresión del ARNm de TNF-a a la de ß-actina, comparándose con una muestra de un individuo (o de preferencia de una población de individuos) que no tenga una condición inflamatoria de la piel. Para una guía sobre cuáles niveles de ARNm y proteína de TNF-a en el tejido se espera en general que sean "bajos", "normales", o "altos", ver Van Deventer S. J. H . , Gut 40:443-8 (1997); McAlindon M. E. y Manida Y. R., Aliment Pharmacol Ther. 10 (suplemento 2): 72-4 (1996); Reimund J. M. y colaboradores, J. Clin. Immunol. 16:144-50 (1996); Reinecker H . C. y colaboradores, Clin. Exp. Immunol. 94:174-81 (1993); Murch S. H. y colaboradores, Gut. 34:1705-9 (1993) y Grom A. A. y colaboradores, Arthritis Rheum. 39:1703-1710 (1996). De una manera alternativa, un experto en la materia puede definir un nivel promedio o esperado de expresión de ARNm de TNF-a en una población, por ejemplo, llevando a cabo el ensayo en 10 o más sujetos de control (tal como mediante los métodos mostrados en el EJEMPLO), y obteniendo el promedio y la desviación estándar. Las muestras para la determinación de los polimorfismos genéticos, los niveles de ARN de TNF (SEQ ID NO:7), o los niveles de proteína de TNF (SEQ ID NO:8), se pueden recolectar de los sujetos mediante cualquier método apropiado conocido por los expertos en la técnica médica. Las muestras pueden ser muestras fluidas, tales como de sangre, moco, fluido linfático, fluido sinovial, fluido cerebroespinal, saliva, fluido amniótico, sangre de cordón amniótico, orina, fluido vaginal, y semen u otro fluido corporal. De una manera alternativa, las muestras pueden ser muestras de tejido, tales como de muestras de biopsias, homogenatos, lisados, o extractos preparados a partir de un organismo entero, o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos. Una muestra también puede ser un medio, tal como un caldo nutriente o un gel en donde se haya propagado un organismo que contenga componentes celulares, tales como proteínas o moléculas de ácidos nucleicos. La guía para el uso de la crema de pimecrolimus al 1 por ciento es proporcionar por Novartis Pharmaceuticals Corp., Elidel® Prescribing Information, T2003-01, 89014902, 492573/1 US (Revisado en abril de 2003). Se proporciona una guía adicional para el uso de pimecrolimus en Nghiem P. y colaboradores, J. Am. Acad. Dermatol. 46:228-241 (2002), y en las referencias citadas en el mismo (todos los cuales se incorporan como referencia), y en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,912,238; 6,352,998 y 6,423,722. La guía para el uso del ungüento de tacrolimus (al 0.03 por ciento ó al 0.1 por ciento) es proporcionada por Fujisawa Healthcare Inc., Protopic® Prescribing Information, 45670 (diciembre de 2000). La guía para el uso de Prograf® (cápsula oral o inyectable) es proporcionada por Fujisawa Healthcare Inc., Prograf® Prescribing Information, ZL40306, y Fujisawa Healthcare Inc., Prograf® monografía del producto.

Se proporciona una guía adicional para el uso de tacrolimus en Nghiem P. y colaboradores, J. Am. Acad. Dermatol 46:228-241 (2002) , y en las referencias citadas en el mismo (todos los cuales se incorporan como referencia). Como se utiliza en la presente, una "dosis alta de pimecrolimus" es una dosis sustancialmente más alta que la dosis recomendada de pimecrolimus. Por ejemplo, para adultos y niños mayores de 2 años de edad, se aplica una capa delgada de crema de pimecrolimus al 1 por ciento al área afectada dos veces al día, y luego se frota suavemente. Una dosis sustancialmente más alta que la dosis recomendada puede ser la aplicación cuatro veces al día. De una manera alternativa, una dosis sustancialmente más alta que la dosis recomendada puede ser la aplicación dos veces al día de una formulación de pimecrolimus con una concentración del 2 por ciento o más alta, si está disponible. De la misma manera, una "dosis alta de tacrolimus" es una dosis sustancialmente más alta que la dosis recomendada de tacrolimus. El uso de otros i n m u n os u p res o re s , tales como inmunocortisona, ciclosporina, o sirolimus (rapamicina) en dermatología en general, y en particular para dermatitis atópica, es bien conocido por los expertos en la técnica médica. Ver arsland AM y Griffiths CE, Eur. J. Dermatol. 2(6):618-22 (noviem re-diciembre de 2002), y Nghiem P. y colaboradores, J. Am. Acad. Dermatol. 46:228-241 (2002). El diagnóstico de la dermatitis atópica es bien conocido por los expertos en la técnica médica. Ver Cookson W. O. y colaboradores, Nature Genetics 27:372-373 (2001); Nghiem P. y colaboradores, J. Am. Acad. Dermatol. 46:228-241 (2002), y las referencias citadas en el mismo (todos los cuales se incorporan como referencia). Polimorfismos de Un Solo Nucleótido. La variación de secuencia en el genoma humano consiste primordialmente en polimorfismos de un solo nucleótido ("SNPs"), siendo el resto de las variaciones de secuencia repeticiones cortas en hilera (incluyendo micro-satélites), repeticiones largas en hilera (mini-satélite), y otras inserciones y supresiones. Un polimorfismo de un solo nucleótido es una posición en donde se presentan dos bases alternadas a una frecuencia apreciable (es decir, > 1 por ciento) en la población humana. Se dice que un polimorfismo de un solo nucleótido es "alélico" porque, debido a la existencia del polimorfismo, algunos miembros de una especie pueden tener la secuencia no mutada (es decir, el "alelo" original), mientras que otros miembros pueden tener una secuencia mutada (es decir, el alelo variante o muíante). En el caso más simple, solamente puede existir una secuencia mutada, y se dice que el polimorfismo es dialélico. La presentación de mutaciones alternadas puede dar lugar a polimorfismo trialélicos, etc. Los polimorfismos de un solo nucleótido están ampliamente extendidos a través de todo el genoma, y los polimorfismos de un solo nucleótido que alteran la función de un gen pueden dirigir contribuyentes a la variación genotípica. Debido a su prevalencia y a su naturaleza ampliamente extendida, los polimorfismos de un solo nucleótido tienen el potencial para ser importantes herramientas para la localización de genes que estén involucrados en las condiciones de enfermedades humanas, ver, por ejemplo, Wang y colaboradores, Science 280:1077-1082 (1998), que da a conocer un estudio piloto en donde se mapearon 2,227 polimorfismos de un solo nucleótido sobre una región de 2.3 megabases del ADN. Una asociación entre un polimorfismo de un solo nucleótido y un fenotipo particular no indica ni requiere que el polimorfismo de un solo nucleótido sea causativo del fenotipo. En lugar de eso, esta asociación puede indicar solamente que el polimorfismo de un solo nucleótido se localiza cerca del sitio sobre el genoma en donde existen factores determinantes para el fenotipo, y por consiguiente, es más probable que se encuentren en asociación con estos factores determinantes, y por consiguiente, con el fenotipo de interés. Por lo tanto, un polimorfismo de un solo nucleótido puede estar en desequilibrio de enlace (LD) con la variante funcional "verdadera". El desequilibrio de enlace, también conocido como asociación alélica, existe cuando los aielos en dos localizaciones distintas del genoma están más altamente asociados que lo esperado. Por consiguiente, un polimorfismo de un solo nucleótido puede servir también como un marcador que tiene valor en virtud de su proximidad a una mutación que causa un fenotipo particular. Los polimorfismos de un solo nucleótido que están asociados con la enfermedad, también pueden tener un efecto directo sobre la función del gen en donde se localizan. Una variante de secuencia puede dar como resultado un cambio de aminoácidos, o puede alterar el empalme de exones-intrones, modificando de esta manera directamente la proteína pertinente, o puede existir en una región reguladora, alterando el ciclo de expresión o la estabilidad del ARNm, ver Nowotny P. Current Opinions in Neurobiology 11:637-641 (2001). Crecientemente está más claro que el riesgo de desarrollar muchos trastornos comunes, y el metabolismo de los medicamentos utilizados para tratar estas condiciones, son sustancialmente influenciados por las variaciones genómicas subyacentes, aunque los efectos de cualquier variante podrían ser pequeños. Por consiguiente, una asociación entre un polimorfismo de un solo nucleótido y un fenotipo clínico sugiere: (1) que el polimorfismo de un solo nucleótido es funcionalmente responsable del fenotipo, ó (2) que existen otras mutaciones cerca de la localización del polimorfismo de un solo nucleótido sobre el genoma que causan el fenotipo. La segunda posibilidad se basa en la biología de la herencia. Se heredan pedazos grandes de ADN, y los marcadores en estrecha proximidad unos a otros pueden no haberse recombinado en los indi iduos que no estén relacionados por muchas generaciones, es decir, los marcadores están en desequilibrio de enlace (LD). Identificación y Caracterización de Polimorfismos de un So/o Nucleótido. Se han empleado muchas técnicas diferentes para identificar y caracterizar los polimorfismos de un solo nucleótido, incluyendo el análisis del polimorfismo de la conformación de una sola cadena, el análisis heterodúplex mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento con desnaturalización (DHPLC), secuenciaclón directa del ADN, y métodos de computación, ver Shi M. . , Clin. Chem. 47:164-172 (2001). Gracias a la gran cantidad de información de secuencia que existen en las bases de datos públicas, se pueden utilizar las herramientas de computación para identificar los polimorfismos de un solo nucleótido in silico, mediante la alineación de secuencias independientemente sometidas para un gen dado (ya sea secuencias de ADNc ó genómicas). La comparación de los polimorfismos de un solo nucleótido obtenidos experimentalmente y mediante métodos in silico, demostró que el 55 por ciento de los polimorfismos de un solo nucleótido candidatos encontrados por SNPFinder (h tt p : //I pgws . n ci . n i h . g ov: 82/perl/sn p/sn p_cg i . pl) , también se han descubierto experimentalmente, ver Cox y colaboradores, Hum. Mutat. 17:141-150 (2001 ). Sin embargo, estos métodos in silico solamente podrían encontrar el 27 por ciento de los verdaderos polimorfismos de un solo nucleótido. Los métodos de tipificación más comunes de polimorfismos de un solo nucleótido incluyen en la actualidad hibridación, extensión de cebador, y métodos de disociación. Cada uno de estos métodos se debe conectar con un sistema de detección apropiado. Las tecnologías de detección incluyen polarización fluorescente (ver Chan X. y colaboradores, Genome Res. 9:492-499 (1999)), detección I u m i n o m étri ca de liberación de pirofosfato (piro-secuenciación) , (ver Ahmadiian A. y colaboradores, Anal. Biochem. 280:103-10 (2000)), ensayos de disociación basados en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), DHPLC, y espectrometría de masas (ver Shi M . M . , Clin. Chem. 47:164-172 (2001) y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,300,076 B1). Otros métodos para detectar y caracterizar los polimorfismos de un solo nucleótido son los que se dan a conocer en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,297,018 B1 y 6,300,063 B1. Las divulgaciones de las referencias anteriores se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. En una modalidad particularmente preferida, la detección del polimorfismo se puede llevar a cabo por medio de la denominada tecnología INVADERMR (disponible en Third Wave Technologies Inc., Madison, Wis.). En este ensayo, un oligonucleótido "invasor" corriente arriba específico, y una sonda corriente abajo parcialmente traslapada, forman juntos una estructura específica cuando se enlazan a la plantilla de ADN complementarla. Esta estructura es reconocida y cortada en un sitio específico por la enzima Cleavasa, y esto da como resultado la liberación de la aleta 5' del oligonucleótido de sonda. Entonces este fragmento sirve como el oligonucleótido "invasor" con respecto a los objetivos secundarios sintéticos y a las sondas de señales secundarias fluorescentemente marcadas contenidas en la mezcla de reacción. Esto da como resultado una disociación específica de las sondas de señales secundarias mediante la enzima Cleavasa. La señal de fluorescencia se genera cuando se disocia esta sonda secundaria, marcada con moléculas de tinte capaces de tener transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, las Cleavasas tienen requerimientos estrictos en relación con la estructura formada por las secuencias o aletas de ADN traslapadas, y por consiguiente, se pueden utilizar para detectar específicamente malos emparejamientos de pares de bases indi iduales inmediatamente corriente arriba del sitio de disociación sobre la cadena de ADN corriente abajo. Ver Ryan D. y colaboradores, Molecular Diagnosis 4(2) : 135- 144 (1999) y Lyamichev V. y colaboradores, Nature B iotech n oí og y 17:292-296 (1999), ver también las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,846,717 y 6,001,567 (las divulgaciones de las cuales se incorporan a la presente como referencia en su totalidad). En algunas modalidades, una composición contiene dos o más oligonucleótidos de genotipificación diferentemente marcados para el sondeo simultáneo de la identidad de los nucleótidos en dos o más sitios polimórficos. También se contempla que las composiciones de los cebadores puedan contener dos o más conjuntos de pares de cebadores específicos del alelo para permitir la dirección y amplificación simultánea de dos o más regiones que contengan un sitio polimórfico. Los oligonucleótidos de genotipificación de la invención también se pueden inmovilizar sobre, o se pueden sintetizar sobre, una superficie sólida, tal como un microchip, una perla, o un portaobjetos de vidrio (ver, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Números WO 98/20020 y WO 98/20019). Estos oligonucleótidos de genotipif icación inmo ilizados se pueden utilizar en una variedad de ensayos de detección de polimorfismos, incluyendo, pero no se limitándose a, ensayos de hibridación de sonda y de extensión de polimerasa. Los oiigonucleótidos de genotipif icación inmovilizados de la invención pueden comprender un arreglo ordenado de oiigonucleótidos diseñados para rastrear rápidamente una muestra de ADN para determinar los polimorfismos en múltiples genes al mismo tiempo. Un cebador de ol ig o n ucleótido específico del alelo de la invención tiene un nucleótido 3'-terminal, o de preferencia un nucleótido 3'-penúltimo, que es complementario para solamente un nucleótido de un polimorfismo de un solo nucleótido particular, actuando de esta manera como un cebador para la extensión mediada por polimerasa solamente si está presente el alelo que contenga a este nucleótido. La invención contempla cebadores de oiigonucleótidos específicos del alelo que se hibriden ya sea a la cadena codificante o a la no codificante. Se podría desarrollar un cebador de ASO para detectar los polimorfismos genéticos empleando técnicas conocidas por los expertos en este campo. Otros oiigonucleótidos de genotipif icación de la invención se hibridan a una región objetiva localizada a uno a varios nucleótidos corriente abajo de uno de los sitios polimórficos novedosos identificados en la presente. Estos oligonucleótidos son útiles en los métodos de extensión del cebador mediada por polimerasa para detectar uno de los polimorfismos novedosos descritos en la presente, y por consiguiente, estos oligonucleótidos de genotipif icación son referidos en la presente como "oligonucleótidos de extensión del cebador". En una modalidad preferida, el término 3' de un oligonucleótido de extensión del cebador es un desoxinucleótido com lementario para el nucleótido localizado inmediatamente adyacente al sitio polimórfico. En otra modalidad, la invención proporciona un estuche que comprende cuando menos dos oligonucleótidos de genotipificación empacados en recipientes separados. El estuche también puede contener otros componentes, tales como un regulador de hibridación (en donde los oligonucleótidos se van a utilizar como una sonda) empacado en un recipiente separado. De una manera alternativa, cuando los oligonucleótidos se van a utilizar para amplificar una región objetiva, el estuche puede contener, empacados en recipientes separados, una polimerasa y un regulador de reacción optimizado para la extensión del cebador mediada por la polimerasa, tal como reacción en cadena de la polimerasa. Las composiciones de oligonucleótidos anteriormente descritas y los estuches son útiles en los métodos para genotipificar y haplotipificar el gen en un individuo. Como se utilizan en la presente, los términos "genotipo" y "haplotipo" significan el genotipo o el haplotipo que contiene el par de nucleotidos o al nucleótido, respectivamente, que está presente en uno o más de los sitios polimórficos novedosos descritos en la presente, y o p c i o n a I m e n te también puede incluir al par de nucleotidos o al nucleótido presentes en uno o más sitios polimórficos adicionales del gen. Los sitios polimórficos adicionales pueden ser sitios polimórficos actualmente conocidos, o sitios que se descubran subsecuentemente. Una modalidad del método de genotipificación involucra aislar a partir del individuo, una mezcla de ácido nucleico que comprenda las dos copias del gen, o un fragmento del mismo, que estén presentes en el individuo, y determinar la identidad del par de nucleotidos en uno o más de los sitios polimórficos en las dos copias, para asignar un genotipo al individuo. Como será fácilmente entendido por el experto, las dos "copias" de un gen en un individuo pueden ser el mismo alelo o pueden ser alelos diferentes. En una modalidad particularmente preferida, el método de genotipificación comprende determinar la identidad del par de nucleotidos en cada sitio polimórfico. Típicamente, la mezcla de ácidos nucleicos se aisla a partir de una muestra biológica tomada del individuo, tal como una muestra de sangre o una muestra de tejido. Las muestras de tejido adecuadas incluyen sangre entera, semen, saliva, lágrimas, orina, materia fecal, sudor, exudado bucal, piel, y pelo. La mezcla de ácidos nucleicos puede estar comprendida de ADN genómico, ARNm, ó ADNc, y en los últimos dos casos, la muestra biológica se debe obtener de un órgano en donde se exprese el gen. Además, será entendido por el experto, que no se utilizarían preparaciones de ARNm ó de ADNc para detectar polimorfismos localizados en intrones o en las regiones no transcritas 5' y 3'. Si se aisla un fragmento genético, debe contener los sitios polimórficos que se vayan a genotipificar. Una modalidad del método de haplotipificación comprende aislar del individuo una molécula de ácido nucleico que contenga solamente una de las dos copias del gen, o un fragmento del mismo, que esté presente en el individuo, y determinar en esa copia la identidad del nucleótido en uno o más sitios polimórficos de esa copia, para asignar un aplotipo al individuo. El ácido nucleico se puede aislar empleando cualquier método capaz de separar las dos copias del gen o fragmento, incluyendo, pero no limitándose a, uno de los métodos descritos anteriormente para la preparación de isogenes, siendo el planteamiento preferido la clonación dirigida in vivo. Como será fácilmente apreciado por los expertos en la materia, cualquier clon individual solamente proporcionará la información del haplotipo sobre una de las dos copias del gen presentes en un individuo. Si se desea la información del haplotipo para la otra copia del individuo, se necesitará examinar clones adicionales. Típicamente, se deben examinar cuando menos cinco clones para tener una probabilidad mayor del 90 por ciento de haplotipificación de ambas copias del gen en un individuo. En una modalidad particularmente preferida, se identifica el nucleótido en cada uno de los sitios polimórficos. En una modalidad preferida, se determina un par de haplotipos para un individuo mediante la identificación de la secuencia en fase de nucleótidos en uno o más de los sitios polimórficos de cada copia del gen que esté presente en el individuo. En una modalidad particularmente preferida, el método de haplotipificación comprende identificar la secuencia en fase de nucleótidos en cada sitio polimórfico de cada copia del gen. Cuando se haplotipifican ambas copias del gen, el paso de identificación de preferencia se lleva a cabo colocando con cada copia del gen en recipientes separados. Sin embargo, también se prevé que, si las dos copias se van a marcar con diferentes marcas, o van a ser de otra manera distinguibles o identificables por separado, sería posible en algunos casos llevar a cabo el método en el mismo recipiente. Por ejemplo, si se marcan las primera y segunda copias del gen con diferentes primero y segundo tintes fluorescentes, respecti amente, y se marca un oligonucleótido específico del alelo con todavía un tercer tinte fluorescente diferente, para ensayar los sitios polimórficos, entonces la detección de una combinación de los primero y tercer tintes identificaría el polimorfismo en la primera copia del gen, mientras que la detección de una combinación de los segundo y tercer tintes identificaría el polimorfismo en la segunda copia del gen. En ambos métodos de genotipificación y haplotipificación, se puede determinar la identidad de un nucleótido (o par de nucleótidos) en un sitio polimórfico mediante la amplificación de una región objetiva que contenga al sitio polimórfico directamente a partir de una o ambas copias del gen, o fragmento del mismo, y se determina la secuencia de las regiones amplificadas mediante métodos convencionales. Será fácilmente apreciado por el experto que solamente se detectará un nucleótido en un sitio polimórfico en los individuos que sean homoc i góticos en ese sitio, mientras que se detectarán dos nucleótidos diferentes si el individuo es heterocigótico para ese sitio. El polimorfismo se puede identificar directamente, conocido como identificación de tipo positivo, o por inferencia, referido como identificación de tipo negativo. Por ejemplo, cuando se sabe que un polimorfismo de un solo nucleótido es guanina y citosina en una población de referencia, se puede determinar positivamente un sitio como de guanina o citosina para un individuo homocigótico en ese sitio, o para tanto guanina como citosina si el individuo es heterocigótico en ese sitio. De una manera alternativa, el sitio se puede determinar negativamente como que no es guanina (y por lo tanto citosina/citosina) o no es citosina (y por lo tanto guanina/guanina). En adición, la identidad de los alelos presentes en cualquiera de los sitios polimórficos novedosos descritos en la presente se puede determinar de una manera indirecta mediante la genotipificación de un sitio polimórfico no dado a conocer en la presente, es decir, en desequilibrio de enlace con el sitio polimórfico que sea de interés. Se dice que dos sitios están en desequilibrio de enlace si la presencia de una variante particular en un sitio mejora la posibilidad de predicción de otra variante en el segundo sitio (ver Stevens J. C, Mol. Diag. 4:309-317 (1999)). Los sitios polimórficos en desequilibrio de enlace con los sitios polimórficos actualmente dados a conocer se pueden localizar en las regiones del gen, o en otras regiones genómicas no examinadas en la presente. La genotipificación de un sitio polimórfico en desequilibrio de enlace con los sitios polimórficos novedosos descritos en la presente, se puede llevar a cabo mediante, pero no limitándose a, cualquiera de los métodos anteriormente mencionados para la detección de la identidad del alelo en un sitio polimorfico. Las regiones objetivas se pueden amplificar empleando cualquier método de amplificación dirigida al oligonucleótido, incluyendo, pero no limitándose a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,965,188), reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Barany y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A. 88:189-193 (1991); Solicitud de Patente del TCP Número WO 90/01069), y ensayo de ligamiento de oligonucleótido (OLA) (Landegren y colaboradores, Science 241:1077-1080 (1988)). Los oligonucleótidos útiles como cebadores o sondas en estos métodos deben hibridarse de una manera específica a una región del ácido nucleico que contenga o esté adyacente al sitio polimorfico. Típicamente, los oligonucleótidos son de entre 10 y 35 nucleótidos de longitud, y de preferencia, de entre 15 y 30 nucleótidos de longitud. De una manera más preferible, los oligonucleótidos son de 20 a 25 nucleótidos de largo. La longitud exacta del oligonucleótido dependerá de muchos factores que son considerados y practicados rutinariamente por el experto. Se pueden emplear otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos con el fin de amplificar la región objetiva, incluyendo los sistemas de amplificación basada en la transcripción (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,130,238; Patente Europea Número EP 329,822; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,169,766; Publicación Internacional Número WO 89/06700), y los métodos isotérmicos (Walker y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A. 89:392-396 (1992)). También se puede ensayar un polimorfismo en la región objetiva antes o después de la amplificación, empleando uno de varios métodos basados en la hibridación conocidos en la técnica. Típicamente, se utilizan oligonucleótidos específicos del alelo en la realización de estos métodos. Los oligonucleótidos específicos del alelo se pueden utilizar como pares de sondas diferentemente marcadas, mostrando un miembro del par un emparejamiento perfecto con una variante de una secuencia objetiva, y mostrando el otro miembro un emparejamiento perfecto con una variante diferente. En algunas modalidades, se puede detectar más de un sitio polimórfico a la vez, utilizando un conjunto de oligonucleótidos o pares de oligonucleótidos específicos del alelo. De preferencia, los miembros del conjunto tienen temperaturas de fusión dentro de 5°C, y más preferiblemente dentro de 2°C, uno del otro, cuando se hibridan a cada uno de los sitios polimórficos que se estén detectando.

La hibridación de un oligonucleótido específico del alelo a un polinucleotido objetivo se puede llevar a cabo con ambas entidades en solución, o esta hibridación se puede llevar a cabo con ya sea el oligonucleótido o bien el polinucleotido objetivo covalentemente o no covalentemente fijado a un soporte sólido. La unión puede ser mediada, por ejemplo, por interacciones de anticuerpo-antígeno, poli-L-Lys, estreptavidina o avidina-biotina, puentes de sal, interacciones h I d rof ó b i ca s , enlaces químicos, horneo reticulante con ultravioleta, etc. Los oligonucleótidos específicos del alelo se pueden sintetizar directamente sobre el soporte sólido, o se pueden unir al soporte sólido subsecuentemente a la síntesis. Los soportes sólidos adecuados para utilizarse en los métodos de detección de la invención incluyen sustratos hechos de silicio, vidrio, plástico, papel, y similares, los cuales se pueden formar, por ejemplo, en pozos (como en las placas de 96 pozos), portaobjetos, hojas, membranas, fibras, chips, platos, y perlas. El soporte sólido se puede tratar, recubrir, o derivar para facilitar la inmovilización del oligonucleótido específico del alelo o del ácido nucleico objetivo. También se puede determinar el genotipo o haplotipo para el gen de un individuo mediante la hibridación de una muestra nucleica que contenga una o ambas copias del gen, a arreglos y sub-arreglos de ácido nucleico, tales como se describen en la Publicación Internacional Número WO 95/11995. Los arreglos contendrían una batería de o I i g on u el e ó i d os específicos del alelo que representen cada uno de los sitios polimórficos que se vayan a incluir en el genotipo o haplotipo. La identidad de los polimorfismos también se puede determinar utilizando una técnica de detección de mal emparejamiento, incluyendo, pero no limitándose a, el método de protección de ARNsa utilizando ribo-sondas (Wlnter y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A. 82:7575 (1985); Meyers y colaboradores, Science 230:1242 (1985)), y proteínas que reconozcan los malos emparejamientos de nucleótidos, tales como la proteína mutS de E. col i (Modrich P. Am. Rev. Genet. 25:229-253 (1991 )). De una manera alternativa, se pueden identificar los alelos variantes mediante el análisis de polimorfismo de conformación de una sola cadena (SSCP) (Orita y colaboradores, Gen o mi es 5:874-879 (1989); Humphries y colaboradores, en Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, R. Elles, editor, páginas 321-340 (1996)), o electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (Wartell y colaboradores, Nucí. Acids Res. 18:2699-2706 (1990); Sheffield y cola oradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A. 86:232-236 (1989)). También se puede emplear un método de extensión del cebador mediada por polimerasa, con el fin de identificar los polimorfismos. Se han descrito varios de estos métodos en la literatura de patente y científica, e incluyen el método de "Análisis de Bit Genético" (Publicación Internacional Número WO 92/15712), y el análisis de bit genético mediado por ligasa/polimerasa (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,679,524). Se dan a conocer métodos relacionados en las Publicaciones Números WO 91/02087, WO 90/09455, y WO 95/17676; y en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,302,509 y 5,945,283. Se pueden detectar los cebadores extendidos que contengan un polimorfismo mediante espectrometría de masas, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,605,798. Otro método de extensión del cebador es la reacción en cadena de la polimerasa específica del alelo (Ruafio y colaboradores, Nucí. Acids Res. 17:8392 (1989); Ruafio y colaboradores, Nucí. Acids Res. 19:6877-6882 (1991); Publicación Internacional Número WO 93/22456; Turki y colaboradores, J. Clin. Invest. 95:1635-1641 (1995)). En adición, se pueden investigar múltiples sitios polimórficos mediante la amplificación simultánea de múltiples regiones del ácido nucleico utilizando conjuntos de cebadores específicos del alelo, como se describen en la Publicación Internacional Número WO 89/10414. En una modalidad preferida, se examinan los datos de frecuencia de haplotipo para cada grupo etnogeográf ico, con el fin de determinar si son consistentes con el equilibrio de Hardy-Weinberg. El equilibrio de Hardy-Weinberg (D. L. Hard y colaboradores, Principies oí Population Genomics, 3a Edición (Sinaucr Asociates, Sunderland, MA, 1997)), postula que la frecuencia de encontrar el par de haplotipos H-i/H2 es igual a PH-w (H 1 /H 2) = 2p(H1)p(H2) si H1 ? H2 y PH-W (Hn/H2) = p(Hj)p(H2) si -i = H2. Una diferencia estadísticamente significativa entre las frecuencias de haplotipos observadas y esperadas, se podría deber a uno o más factores, incluyendo la endogamia significativa en el grupo de población, una fuerte presión selectiva sobre el gen, inclinación del muestreo, y/o errores en el proceso de genotipificación. Si se observan grandes desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg en un grupo etnogeográfico, se puede aumentar el número de individuos en ese grupo para ver si la desviación se debe a una inclinación del muestreo. Si un tamaño de muestra más grande no reduce la diferencia entre las frecuencias de pares de haplotipos observadas y esperadas, entonces se podría desear considerar hacer la haplotipificación del individuo utilizando un método de haplotipificación directa, tal como, por ejemplo, la tecnología CLASPER SystemMR (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,866,404), SMD, o reacción en cadena de la polimerasa de intervalo largo específica del alelo (M ichalotos-Beloin y colaboradores, Nucí. Acids Res. 24:4841-4843 (1996)). En una modalidad de este método para predecir un par de haplotipos, el paso de asignación involucra llevar a cabo el siguiente análisis. Primero, se compara cada uno de los posibles pares de haplotipos con los pares de haplotipos de la población de referencia. En general, solamente uno de los pares de haplotipos de la población de referencia se empareja con un posible par de haplotipos, y se asigna ese par al individuo. Ocasionalmente, solamente un haplotipo representado en los pares de haplotipos de referencia es consistente con un posible par de haplotipos para un individuo, y en esos casos, se asigna al individuo un par de haplotipos que contiene este haplotipo conocido y un nuevo haplotipo derivado mediante la sustracción del haplotipo conocido del par de haplotipos posible. En raros casos, ningún haplotipo de la población de referencia es consistente con los posibles pares de haplotipos, o de una manera alternativa, múltiples pares de haplotipos de referencia son consistentes con los posibles pares de haplotipos. En estos casos, el individuo de preferencia se haplotipifica utilizando un método de haplotipificación molecular directa, tal como, por ejemplo, la tecnología CLASPER SystemMR (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,866,404), SMD, o reacción en cadena de la polimerasa de intervalo largo específica del alelo (M ichalotos-Beloi n y colaboradores, Nucí. Acids Res. 24:4841-4843 (1996)). La invención también proporciona un método para determinar la frecuencia de un genotipo o haplotipo en una población. El método comprende determinar el genotipo o el par de haplotipos para el gen que esté presente en cada miembro de la población, en donde el genotipo o haplotipo comprende al par de nucleótidos o al nucleótido detectado en uno o más de los sitios polimórficos del gen, y calcular la frecuencia en que se encuentra cualquier genotipo o haplotipo particular en la población. La población puede ser una población de referencia, una población de familia, una población del mismo sexo, un grupo de población, una población de rasgo (por ejemplo, un grupo de individuos que exhiben un rasgo de interés tal como una condición médica o una respuesta a un tratamiento terapéutico). En otro aspecto de la invención, se utilizan los datos de frecuencia para los genotipos y/o haplotipos encontrados en una población de referencia, en un método para identificar una asociación entre un rasgo y un genotipo o un haplotipo. El rasgo puede ser cualquier fenotipo detectable, incluyendo, pero no limitándose a, la susceptibilidad a una enfermedad o la respuesta a un tratamiento. El método involucra obtener datos sobre la frecuencia de los genotipos o haplotipos de interés en una población de referencia, así como en una población que exhiba el rasgo. Los datos de frecuencia para una o ambas poblaciones de referencia y de rasgo, se pueden obtener mediante la genotipificación o haplotipificación de cada indi iduo de las poblaciones, empleando uno de los métodos descritos anteriormente. Los haplotipos para la población de rasgo se pueden determinar directamente, o de una manera alternativa, mediante el planteamiento de genotipo predictivo para el haplotipo descrito anteriormente. En otra modalidad, los datos de frecuencia de las poblaciones de referencia y/o de rasgo, se obtienen accesando a datos de frecuencia previamente determinados, los cuales pueden estar en una forma escrita o electrónica. Por ejemplo, los datos de frecuencia pueden estar presentes en una base de datos que sea accesible mediante una computadora. Una vez que se obtienen los datos de frecuencia, se comparan las frecuencias de los genotipos o haplotipos de interés en las poblaciones de referencia y de rasgo. En una modalidad preferida, se comparan las frecuencias de todos los genotipos y/o haplotipos observados en las poblaciones. Si un genotipo o haplotipo particular para el gen es más frecuente en la población de rasgo que en la población de referencia por una cantidad estadísticamente significativa, entonces se predice que el rasgo está asociado con ese genotipo o haplotipo. En una modalidad preferida, se lleva a cabo un análisis estadístico mediante la utilización de las pruebas ANOVA convencionales, con una corrección de Bonferroni y/o un método de determinación propia que simula la correlación del genotipo/fenotipo mgchas veces, y calcula un valor de significado. Cuando se están analizando muchos polimorfismos, se puede llevar a cabo una corrección para el factor, con el fin de corregir una asociación significativa que se pudiera encontrar por azar. Para utilizar los métodos estadísticos en los métodos de esta invención, ver: Statistical Methods in Biology, 3a Edición, Bailey NTJ, (Cambridge Univ. Press, 1997); Introduction to Computational Biology, Waterman M S (CRC Press, 2000) y Bioinformatics, Baxevanis AD & Ouellette BFF editores (John Wiley & Sons, Inc., 2001 ). En una modalidad preferida del método, el rasgo de interés es una respuesta clínica exhibida por un paciente a algún tratamiento terapéutico, por ejemplo, la respuesta a una dirección de fármaco, o la respuesta a un tratamiento terapéutico para una condición médica. En otra modalidad de la invención, se puede utilizar un genotipo o haplotipo detectable que esté en desequilibrio de enlace con el genotipo o haplotipo de interés, como un marcador subrogado. Se puede descubrir un genotipo que esté en desequilibrio de enlace con un genotipo mediante la determinación de si un genotipo o haplotipo particular para el gen es más frecuente en la población que también demuestre el genotipo marcador subrogado potencial, que en la población de referencia, por una cantidad estadísticamente significativa, y luego se predice que el genotipo marcador está asociado con ese genotipo o haplotipo, y entonces se puede utilizar como un marcador subrogado en lugar del genotipo. Definiciones. Como se utiliza en la presente, "condición médica" incluye, pero no se limita a, cualquier condición o enfermedad manifestada como uno o más síntomas físicos y/o psicológicos para los que sea deseable el tratamiento, e incluye las enfermedades previamente y recién identificadas, y otros trastornos. Como se utiliza en la presente, el término "respuesta clínica" significa cualquiera o todos los siguientes: una medida cuantitativa de la respuesta, ninguna respuesta, y una respuesta adversa (es decir, efectos secundarios). Con el objeto de deducir una correlación entre la respuesta clínica a un tratamiento y un genotipo o haplotipo, se obtienen datos sobre las respuestas clínicas exhibidas por una población de individuos que recibieron el tratamiento, denominada posteriormente en la presente como la "población clínica". Estos datos clínicos se pueden obtener mediante el análisis de los resultados de un estudio clínico que ya se haya ejecutado, y/o los datos clínicos se pueden obtener diseñando y llevando a cabo uno o más estudios clínicos nuevos. Como se utiliza en la presente, el término "estudio clínico" significa cualquier estudio de investigación diseñado para recopilar datos clínicos sobre las respuestas a un tratamiento particular, e incluye, pero no se limita a, estudios clínicos en fase I, en fase II, y en fase III. Se emplean métodos convencionales para definir la población de pacientes y para inscribir a los sujetos. Se prefiere que los individuos incluidos en la población clínica se hayan calificado para determinar la existencia de la condición médica de interés. Esta calificación de los pacientes potenciales podría emplear un examen físico estándar, o una o más pruebas de laboratorio. De una manera alternativa, la calificación de los pacientes podría utilizar la haplotipificación para situaciones en donde haya una fuerte correlación entre el par de haplotipos y la susceptibilidad o severidad de la enfermedad. El tratamiento terapéutico de interés se administra a cada individuo de la población de estudio, y se mide la respuesta al tratamiento de cada individuo empleando uno o más criterios previamente determinados. Se contempla que, en muchos casos, la población de estudio exhibirá un número de respuestas, y que el investigador elegirá el número de grupos respondentes (por ejemplo, bajo, medio, alto) formado por las diferentes respuestas. En adición, el gen para cada individuo de la población de estudio se genotipifica y/o haplotipifica, lo cual se puede hacer antes o después de administrar el tratamiento. Después de que se han obtenido tanto los datos clínicos como del polimorfismo, se crean correlaciones entre la respuesta del individuo y el contenido de genotipo o haplotipo. Las correlaciones se pueden producir de varias maneras. En un método, se agrupan los individuos por su genotipo o haplotipo (o par de haplotipos) (también referido como un grupo de polimorfismo), y luego se calculan los promedios y las desviaciones estándares de las respuestas clínicas exhibidas por los miembros de cada grupo de polimorfismo. Entonces estos resultados se analizan para determinar si cualquier variación observada en la respuesta clínica entre los grupos de polimorfismo es estadísticamente significativa. Los métodos de análisis estadístico que se pueden emplear se describen en L. D. Fisher y G. vanBelle, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences (Wiley-I nte rsci e n ce , Nueva York, 1993). Este análisis también puede incluir un cálculo de regresión en donde los sitios polimórficos del gen dan la contribución más significativa a las diferencias en el fenotipo.

Un segundo método para encontrar correlaciones entre el contenido de haplotipo y las respuestas clínicas, utiliza modelos predictivos basados en algoritmos de optimización con minimización de errores. Uno de los muchos posibles algoritmos de optimización es un algoritmo genético (R. Judson, "Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry" en Reviews in Computational Chemistry, Volumen 10, páginas 1-73, K. B. Lipkowitz & D. B. Boyd, editores (VCH Publishers, Nueva York, 1997). También se podrían utilizar templado simulado (Press y colaboradores, "Numerical Recipes in C: The Art of Scientific Computing", Cambridge University Press (Cambridge) 1992, Capítulo 10), redes neurales (E. Rich y K. Knight, "Artificial I ntelligence", 2a Edición (M cG raw-H i 11 , Nueva York, 1991, Capítulo 18)), métodos descendientes de gradiente convencionales (Press y colaboradores, supra Capítulo 10), u otros planteamientos de optimización global o local (ver la descripción en Judson, supra). Las correlaciones también se pueden analizar empleando técnicas de análisis de variación (ANOVA), con el fin de determinar cuánto de la variación en los datos clínicos es explicado por diferentes subconjuntos de los sitios polimórficos del gen. Se utiliza el ANOVA para probar hipótesis acerca de si una variable de respuesta es causada por, o está correlacionada con, uno o más rasgos o variables que se puedan medir (Fisher y vanBelle, su ra, Capítulo 10).

A partir de los análisis descritos anteriormente, el experto que prediga la respuesta clínica como una función del contenido de genotipo o haplotipo, puede construir fácilmente un modelo matemático. La identificación de una asociación entre una respuesta clínica y un genotipo o haplotipo (o par de haplotipos) para el gen, puede ser la base para diseñar un método de diagnóstico para determinar los individuos que responderán o no al tratamiento, o de una manera alternativa, que responderán en un nivel más bajo, y por lo tanto, puedan requerir más tratamiento, es decir, una mayor dosis de un fármaco. El método de diagnóstico puede tomar una de varias formas: por ejemplo, una prueba de ADN directa (es decir, genotipificación o haplotipificación de uno o más de los sitios polimórficos del gen), una prueba serológica, o una medición de examen físico. El único requerimiento es que haya una buena correlación entre los resultados de la prueba de diagnóstico y el genotipo o haplotipo subyacente, a su vez está correlacionado con la respuesta clínica. En una modalidad preferida, este método de diagnóstico emplea el método de haplotipificación predictiva descrito anteriormente. Una computadora puede implementar cualquiera o todas las operaciones analíticas y matemáticas involucradas en la práctica de los métodos de la presente invención. En adición, la computadora puede ejecutar un programa que genere vistas (o pantallas) exhibidas en un dispositivo de despliegue visual, y con las cuales pueda interactuar el usuario para ver y analizar grandes cantidades de información en relación con el gen y su variación genómica, incluyendo localización del cromosoma, estructura del gen, y familia genética, datos de expresión del gen, datos de polimorfismo, datos de secuencia genética, y datos de población de datos clínicos (por ejemplo, datos sobre el origen etnogeográf ico, respuestas clínicas, genotipos, y haplotipos para una o más poblaciones). Los datos de polimorfismo descritos en la presente se pueden almacenar como parte de una base de datos de relación (por ejemplo, una instancia de una base de datos Oracle, o un conjunto de archivos llanos en ASCII). Estos datos de polimorfismo se pueden almacenar en el disco duro de la computadora, o, por ejemplo, se pueden almacenar en una CD-ROM, o en uno o más dispositivos de almacenamiento diferentes accesibles mediante la computadora. Por ejemplo, los datos se pueden almacenar en una o más bases de datos en comunicación con la computadora por medio de una red. En otras modalidades, la invención proporciona métodos, composiciones, y estuches para haplotipificar y/o genotipificar el gen en un individuo. La composición contiene sondas de oligonucleótidos y cebadores diseñados para hibridarse específicamente a una o más regiones objetivas que contengan, o que estén adyacentes a, un sitio polimórfico. Los métodos y composiciones para establecer el genotipo o haplotipo de un individuo en los sitios polimórficos novedosos descritos en la presente, son útiles para estudiar el efecto de los polimorfismos en la etiología de las enfermedades afectadas por la expresión y función de la proteína, para estudiar la eficacia de la dirección de fármacos, para predecir la susceptibilidad individual a las enfermedades afectadas por la expresión y función de la proteína, y para predecir la respuesta individual a los fármacos que se dirigen al producto genético. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar una asociación entre un genotipo o haplotipo y un rasgo. En las modalidades preferidas, el rasgo es la susceptibilidad a una enfermedad, la severidad de una enfermedad, la etapa de una enfermedad, o la respuesta a un fármaco. Estos métodos tienen aplicabilidad en el desarrollo de pruebas de diagnóstico y tratamientos terapéuticos para todas las aplicaciones f a rm a co g e n ét i cas en donde exista el potencial de una asociación entre un genotipo y un resultado de tratamiento, incluyendo mediciones de eficacia, mediciones de quinasa de proteína, y mediciones de efectos secundarios. La invención también proporciona un sistema de computación para almacenar y exhibir los datos de polimorfismo determinados para el gen. El sistema de computación comprende una unidad de procesamiento de computadora; un despliegue visual; y una base de datos que contiene los datos de polimorfismo. Los datos de polimorfismo incluyen los polimorfismos, los genotipos, y los haplotipos identificados para el gen en una población de referencia. En una modalidad preferida, el sistema de computación es capaz de producir un despliegue visual que muestre los haplotipos organizados de acuerdo con sus relaciones de evolución. En otro aspecto, la invención proporciona sondas de polimorfismos de un solo nucleótido, las cuales son útiles en la clasificación de las personas de acuerdo con sus tipos de variación genética. Las sondas de polimorfismos de un solo nucleótido de conformidad con la invención son oligonucleótidos, los cuales pueden discriminar entre los alelos de un ácido nucleico de un polimorfismo de un solo nucleótido en ensayos de discriminación alélica convencionales. Como se utiliza en la presente, un "ácido nucleico de polimorfismo de un solo nucleótido" es una secuencia de ácido nucleico, la cual comprende un nucleótido que es variable dentro de una secuencia de nucleótidos de otra manera idéntica entre individuos o grupos de individuos, y por lo tanto, que existen como alelos. Estos ácidos nucleicos de polimorfismos de un solo nucleótido pueden ser parte de un cromosoma, o pueden ser una copia exacta de una parte de un cromosoma, por ejemplo mediante la amplificación de esta parte de un cromosoma mediante reacción en cadena de la polimerasa, o mediante clonación. Los ácidos nucleicos de polimorfismos de un solo nucleótido son referidos posteriormente en la presente simplemente como "SNPs" (polimorfismos de un solo nucleótido). Las sondas de polimorfismos de un solo nucleótido de acuerdo con la invención, son oligonucleótidos que son complementarios para un ácido nucleico de un polimorfismo de un solo nucleótido. Como se utiliza en la presente, el término "complementario" significa exactamente complementario a través de toda la longitud del ol igonucleótido en el sentido de la palabra de Watson y Crick. En ciertas modalidades preferidas, los oligonucleótidos de conformidad con este aspecto de la invención, son complementarios para un alelo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido, pero no para cualquier otro alelo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido. Los oligonucleótidos de acuerdo con esta modalidad de la invención, pueden discriminar entre los alelos del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido de diferentes maneras. Por ejemplo, bajo condiciones de hibridación restringente, un oligonucleótido de la longitud apropiada se hibridará a un alelo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido, pero no a cualquier otro alelo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido. El oligonucleótido se puede marcar mediante una radiomarca o una marca fluorescente. De una manera alternativa, se puede utilizar un oligonucleótido de la longitud apropiada como un cebador para la reacción en cadena de la polimerasa, en donde el nucleótido 3'-terminal es complementario para un alelo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido, pero no para cualquier otro alelo. En esta modalidad, la presencia o ausencia de amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa, determina el haplotipo del ácido nucleico del polimorfismo de un solo nucleótido. Los fragmentos genómicos y de ADNc de la invención comprenden cuando menos un sitio polimórfico novedoso identificado en la presente, y tienen una longitud de cuando menos 10 nucleótidos, y pueden abarcar la longitud completa del gen. De preferencia, un fragmento de acuerdo con la presente invención es de entre 100 y 3,000 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente de entre 200 y 2,000 nucleótidos de longitud, y de una manera muy preferible de entre 500 y 1,000 nucleótidos de longitud.

En la descripción de los sitios polimórficos identificados en la presente, se hace referencia a la cadena en sentido del gen para mayor conveniencia. Sin embargo, como es reconocido por el experto, las moléculas de ácidos nucleicos que contengan al gen pueden ser complementarias para las moléculas de doble cadena, y por lo tanto, la referencia a un sitio particular en la cadena en sentido se refiere también al sitio correspondiente en la cadena anti-sentido complementaria. Por consiguiente, se puede hacer referencia al mismo sitio polimórfico en cualquier cadena, y se puede diseñar un oligonucleótido para hibridarse específicamente a cualquier cadena en una región objetiva que contenga el sitio polimórfico. Por lo tanto, la invención tam ién incluye polinucleótidos de una sola cadena que son complementarios para la cadena en sentido de las variantes genómicas descritas en la presente. En una modalidad preferida, este estuche puede comprender además un elemento de recopilación de muestras de ADN. En particular, la composición cebadora de genotipificación puede comprender cuando menos dos conjuntos de pares de cebadores específicos del alelo. De preferencia, los dos oligonucleótidos de genotipificación se empacan en recipientes separados. Se debe entender que los métodos de la invención descritos en la presente pueden comprender además en general el uso de un estuche de acuerdo con la invención. En términos generales, los métodos de la invención se pueden llevar a cabo ex vivo, y estos métodos ex vivo están específicamente contemplados por la presente invención. También, donde un método de la invención pueda incluir pasos que se puedan practicar en el cuerpo humano o animal, la presente invención contempla específicamente los métodos que solamente comprendan los pasos que no sean practicados en el cuerpo humano o animal. Se pueden investigar los efectos de los polimorfismos identificados en la presente sobre la expresión, mediante la preparación de células y/u organismos recombinantes, de preferencia animales recombinantes, que contengan una variante polimórfica del gen. Como se utiliza en la presente, "expresión" incluye, pero no se limita a, una o más de las siguientes: transcripción del gen en un ARNm precursor; empalme y otro procesamiento del ARNm precursor para producir el ARNm maduro; estabilidad del ARNm; traducción del ARNm maduro en proteína (incluyendo uso de codones y disponibilidad del ARNt); y glicosilación y/u otras modificaciones del producto de traducción, si se requiere, para una expresión y función apropiadas. Con el fin de preparar una célula recombinante de la invención, se puede introducir el isogén deseado en la célula en un vector, de tal manera que el isogén siga siendo extracromosómico. En esta situación, el gen será expresado por la célula a partir de la localización extracromosómica. En una modalidad preferida, el isogén se introduce en una célula de tal manera que se recombine con el gen endógeno presente en la célula. Esta recombinación requiere de la presentación de un evento de recombinación doble, dando como resultado de esta manera el polimorfismo genético deseado. Los vectores para la introducción de genes tanto para la recom inación como para el mantenimiento extracromosómico son conocidos en la técnica, y se puede utilizar en la invención cualquier vector o construcción de vector adecuado. En este campo se conocen los métodos, tales como electroporación, bombardeo de partículas, co-precipitación con fosfato de calcio, y transducción viral, para introducir ADN en las células; por consiguiente, la elección del método puede quedar dentro de la competencia y preferencia del experto. Se preparan organismos recom binantes, es decir, animales transgénicos, que expresen un gen variante, empleando procedimientos convencionales conocidos en la materia. De preferencia, se introduce una construcción que comprenda al gen variante en un animal no humano o en un ancestro del animal en una etapa embrionaria, es decir, la etapa de una célula, o en general no más tarde de aproximadamente la etapa de 8 células. Se pueden hacer animales transgénicos que lleven las construcciones de la invención mediante varios métodos conocidos por los expertos en este campo. Un método involucra transfectar en el embrión un retrovirus construido para contener uno o más elementos aislantes, un gen o genes de interés, y otros componentes conocidos por el experto para proporcionar un vector de lanzamiento completo que aloje a los genes aislados como un transgén, ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,610,053. Otro método involucra la inyección directa de un transgén en el embrión. Un tercer método involucra el uso de células totipotentes embrionarias. Los ejemplos de los animales en los que se pueden introducir isogenes incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, otros roedores, y primates no humanos (ver "The Introduction of Foreign Genes into Mice", y las referencias citadas en el mismo, en: Recombinant DNA, Editores, J . D. Watson, . Gilman, J. Witkowski, y . Zoller; W. H. Freeman and Company, Nueva York, páginas 254-272). Se pueden utilizar animales transgénicos que expresen establemente un isogén humano, y que produzcan la proteína humana, como los modelos biológicos para estudiar las enfermedades relacionadas con la expresión y/o actividad anormal, y para rastrear y ensayar diferentes fármacos candidatos, compuestos, y regímenes de tratamiento para reducir los síntomas o efectos de estas enfermedades. En la práctica de la presente invención, se emplean muchas técnicas convencionales en biología molecular, microbiología, y ADN recombinante. Estas técnicas son bien conocidas, y se explican, por ejemplo, en "Current Protocols in Molecular Biology", Volúmenes I — I II» Ausubel Editor (1997); Sambrook y colaboradores, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Y (1989); "DNA Cloning: A Practical Approach" , Volúmenes I y II, Glover, Editor (1985); "Oligon ucleotide Synthesis", Gait, Editor (1984); "Nucleic Acid Hybridization" , Hames y Higgins, Editores (1985); " Transe ript ion and Translation" , Hames y Higgins, Editores (1984); "Animal Cell Culture", Freshney, Editor (1986); "Immobilized Cells and Enzymes", IRL Press (1986); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning"; la serie, Methods in Enzymol., Academic Press, Inc. (1984); "Gene Transfer Vectors Mammalían Cells", Miller y Calos, Editores, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1987); y Methods in Enzymology, Volúmenes 154 y 155, Wu y Grossman, y Wu, Editores, respectivamente. Entonces se compararían los niveles de control estándar del producto de expresión genética, así determinados en los diferentes grupos de control, con el nivel medido de un producto de expresión genética en un paciente dado. Este producto de expresión genética podría ser el ARNm característico asociado con este grupo de genotipo particular, o el producto de expresión genética del polipéptido de ese grupo de genotipo. Entonces se podría clasificar o asignar al paciente a un grupo de genotipo particular basándose en la similitud de los niveles medidos, al compararse con los niveles de control para un grupo dado. Como lo entenderá un experto en la materia, habrá cierto grado de incertidumbre involucrada al hacer esta determinación. Por consiguiente, se utilizarían desviaciones estándares de los niveles del grupo de control para hacer una determinación probabilística , y serían aplicables los métodos de esta invención sobre un amplio número de determinaciones de grupos de genotipos basadas en la probabilidad. Por lo tanto, por ejemplo, y no a manera de limitación, en una modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética cae dentro de 2.5 desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los grupos de control, entonces ese individuo se puede asignar a ese grupo de genotipo. En otra modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética cae dentro de 2.0 desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los grupos de control, entonces ese individuo se puede asignar a ese grupo de genotipo. En todavía otra modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética cae dentro de 1.5 desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los grupos de control, entonces ese individuo se puede asignar a ese grupo de genotipo. En todavía otra modalidad, si el nivel medido del producto de expresión genética es de 1.0 ó menos desviaciones estándares del promedio de cualquiera de los niveles de los grupos de control, entonces ese individuo se puede asignar a ese grupo de genotipo. Por consiguiente, este proceso permitirá hacer la determinación, con diferentes grados de probabilidad, de en cuál grupo se debe colocar un paciente específico, y esta asignación a un grupo de genotipo determinaría entonces la categoría de riesgo en donde se debe poner al individuo. Los métodos para detectar y medir los niveles de ARNm y los niveles de productos de expresión genética de polipéptidos son bien conocidos en la materia, e incluyen el uso de micro-arreglos de nucleótidos y métodos de detección de polipéptidos que involucran espectrómetros de masas y/o técnicas de detección y cuantificación de anticuerpos. Ver también, Human Molecular Genetics, 2a Edición, Tom Strachan y Andrew, Read (John Wiley and Sons, Inc. Publication, Y , 1999). Adicionalmente, se puede emplear la detección de la concentración del producto de expresión del polipéptido (proteína) del gen en los fluidos o tejidos corporales, para determinar la presencia o ausencia del polimorfismo, y se puede utilizar el nivel relativo del producto de expresión del polipéptido para determinar si está presente el polimorfismo en un estado homocigótico o eterocigótico, y por consiguiente, la categoría de riesgo del individuo. Como se utiliza en la presente, "condición médica" incluye, pero no se limita a, cualquier condición o enfermedad manifestada como uno o más síntomas físicos y/o psicológicos para los cuales sea deseable el tratamiento, e incluye las enfermedades previamente y recién identificadas, y otros trastornos. Como se utiliza en la presente, el término "polimorfismo" significará cualquier variante de secuencia presente a una frecuencia de >1 por ciento en una población. La variante de secuencia puede estar presente a una frecuencia significati amente mayor que el 1 por ciento, tal como el 5 por ciento ó el 10 por ciento o más. También, el término se puede utilizar para referirse a la variación de secuencia observada en un individuo en un sitio polimórfico. Los polimorfismos incluyen sustituciones de nucleótidos, inserciones, supresiones, y microsatélites, y pueden, pero no necesitan, dar como resultado diferencias detectables en la expresión genética o en la función de la proteína. Como se utiliza en la presente, el término "respuesta clínica" significa cualquiera o todas las siguientes: una medida cuantitativa de la respuesta, ninguna respuesta, y una respuesta adversa, es decir, efectos secundarios. Como se utiliza en la presente, el término "alelo" significará una forma particular de un gen o secuencia de ADN en una localización cromosómica específica {locus). Como se utiliza en la presente, el término "genotipo" significará una secuencia 5' a 3' fuera de fase de pares de nucleótidos encontrada en uno o más sitios polimórficos en un locus sobre un par de cromosomas homólogos de un indi iduo. Como se utiliza en la presente, el genotipo incluye un genotipo completo y/o un sub-genotipo. Como se utiliza en la presente, el término "polinucleótido" significará cualquier ARN ó ADN, que puede ser ARN ó ADN no modificado o modificado. Los polinucleótidos incluyen, sin limitación, ADN de una sola cadena y de doble cadena, ADN que sea una mezcla de regiones de una sola cadena y de doble cadena, ARN de una sola cadena y de doble cadena, y ARN que sea una mezcla de regiones de una sola cadena y de doble cadena, moléculas híbridas que comprendan ADN y ARN que pueden ser de una sola cadena, o más típicamente de doble cadena, o una mezcla de regiones de una sola cadena y de doble cadena. En adición, el polinucleótido se refiere a las regiones de triple cadena que comprenden ARN ó ADN, o tanto ARN como ADN. El término "polinucleótido" también incluye ADNs ó ARNs que contengan una o más bases modificadas, y ADN ó ARNc con estructuras base modificadas para la estabilidad o por otras razones. Como se utiliza en la presente, el término "gen" significará un segmento de ADN que contenga toda la información para la biosíntesis regulada de un producto de ARN, incluyendo promotores, exones, intrones, y otras regiones no traducidas que controlen la expresión. Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido" significará cualquier polipéptido que comprenda dos o más aminoácidos unidos unos a otros por enlaces peptídicos o por enlaces peptídicos modificados, es decir, ¡soésteres peptídicos. El polipéptido se refiere a ambas cadenas cortas, comúnmente referidas como péptidos, glicopéptidos, u oligómeros, y a cadenas más largas, generalmente referidas como proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados por el gen. Los polipéptidos incluyen secuencias de aminoácidos modificadas ya sea mediante procesos naturales, tales como procesamiento posterior a la traducción, o bien mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en este campo. Estas modificaciones se describen bien en los textos básicos, y en las monografías más detalladas, así como en la literatura de investigación voluminosa. Como se utiliza en la presente, el término "sitio polimórfico" significará una posición dentro de un locus en donde se encuentren cuando menos dos secuencias alternadas en una población, la más frecuente de las cuales tiene una frecuencia no mayor del 99 por ciento. Como se utiliza en la presente, el término "par de nucleótidos" significará los nucleótidos que se encuentran en un sitio polimórfico sobre las dos copias de un cromosoma de un individuo. Como se utiliza en la presente, el término "en fase" significa, cuando se aplica a una secuencia de pares de nucleótidos para dos o más sitios polimórficos en un ¡ocus, que se conoce la combinación de nucleótidos presentes en esos sitios polimórficos sobre una sola copia del locus. Con el objeto de deducir una correlación entre la respuesta clínica a un tratamiento, y un genotipo o haplotipo, es necesario obtener los datos sobre las respuestas clínicas exhibidas por una población de individuos que recibieron al tratamiento, denominada posteriormente en la presente como la "población clínica". Estos datos clínicos se pueden obtener mediante el análisis de los resultados de un estudio clínico que ya se haya ejecutado, y/o se pueden obtener los datos clínicos mediante el diseño y la realización de uno o más estudios clínicos nuevos. Como se utiliza en la presente, el término "estudio clínico" significa cualquier estudio de investigación diseñado para recopilar datos clínicos sobre las respuestas a un tratamiento particular, e incluye, pero no se limita a, estudios clínicos en fase I, II, y III. Se utilizan métodos convencionales para definir la población de pacientes, y para inscribir a los sujetos. Como se utiliza en la presente, el término "locus" significará una localización sobre un cromosoma o molécula de ADN correspondiente a un gen o a una característica física o fenotípica. El tratamiento terapéutico de interés se administra a cada individuo de la población de estudio, y se mide la respuesta al tratamiento de cada individuo empleando uno o más criterios previamente determinados. Se contempla que, en muchos casos, la población en estudio exhibirá un número de respuestas, y que el investigador elegirá el número de grupos respondentes, por ejemplo, bajo, medio, y alto, formados por las diferentes respuestas. En adición, se genotipifica y/o haplotipifica el gen para cada individuo de la población en estudio, lo cual puede hacer antes o después de administrar el tratamiento. La Detección de Ácidos Nucleicos y Proteínas como Marcadores. En una modalidad particular, se puede determinar el nivel de ARNm correspondiente al marcador, tanto en un formato in situ como in vitro, en una muestra biológica, empleando los métodos conocidos en este campo. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células, fluidos biológicos, y aislados de los mismos, aislados de un sujeto, así como tejidos, células, y fluidos presentes adentro de un sujeto. Muchos métodos de detección de expresión utilizan ARN aislado. Para los métodos in vitro, se puede utilizar cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento del ARNm para la purificación del ARN a partir de las células. Ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Curr. Prot. Mol. Biol., John Wiley & Sons, N Y (1987-1999). Adicionalmente, se pueden procesar fácilmente grandes números de muestra de tejido empleando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de un solo paso de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,843,155. El ARNm aislado se puede utilizar en ensayos de hibridación o de amplificación que incluyen, pero no se limitan a, análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa, y arreglos de sondas. Un método de diagnóstico preferido para la detección de los niveles de ARNm involucra poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que pueda hibridarse al ARNm codificado por el gen que se esté detectando. La-sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de cuando menos 7, 15, 30, 50, 100, 250, ó 500 nucleótidos de longitud, y suficientes para hibridarse específicamente bajo condiciones restringentes a un ARNm ó a un ADN genómico que codifique un marcador de la presente invención. Otras sondas adecuadas para utilizarse en los ensayos de diagnóstico de la invención se describen en la presente. La hibridación de un ARNm con la sonda, indica que se está expresando el marcador en cuestión. En un formato, se inmoviliza el ARNm sobre una superficie sólida, y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo, pasando el ARNm aislado sobre un gel de agarosa, y transfiriendo el ARNm desde el gel hasta una membrana, tal como nitrocelulosa. En un formato alternativo, las sondas se inmovilizan sobre una superficie sólida, y se pone en contacto el ARNm con las sondas, por ejemplo, en un arreglo de chip genético Affymetrix. Un experto puede adaptar fácilmente los métodos de detección de ARNm conocidos para utilizarse en la detección del nivel de ARNm codificado por los marcadores de la presente invención. Un método alternativo para determinar el nivel de ARNm correspondiente a un marcador de la presente invención en una muestra, involucra el proceso de amplificación del ácido nucleico, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (la modalidad experimental estipulada en Mullís, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,683,202 (1987); reacción en cadena de la ligasa, Barany (1991), supra; réplica de secuencia auto-sostenida, Guatelli y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A., Volumen 87, páginas 1874-1878 (1990); sistema de amplificación de transcripción, Kwoh y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. E. U. A., Volumen 86, páginas 1173-1177 (1989); replicada Q-beta, Lizardi y cola oradores, Biol. Technology, Volumen 6, página 1197 (1988); réplica de círculo rodante, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,854,033 (1988); o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido por la detección de las moléculas amplificadas empleando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de las moléculas de ácidos nucleicos, si estas moléculas están presentes en números muy bajos. Como se utilizan en la presente, los cebadores de amplificación se definen como un par de moléculas de ácidos nucleicos que pueden templarse a las regiones 5' o 3' de un gen (cadenas más y menos, respectivamente, o viceversa), y contienen una región corta entre las mismas. En general, los cebadores de amplificación son de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos de longitud, y flanquean una región de aproximadamente 50 a 200 nucleótidos de longitud. Bajo condiciones apropiadas y con los reactivos apropiados, estos cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprenda la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores . Para los métodos in situ, no se necesita aislar el ARNm de las células antes de la detección. En estos métodos, se prepara/procesa una muestra de células o tejido, empleando métodos histológicos conocidos. Luego se inmoviliza la muestra sobre un soporte, típicamente un portaobjetos de vidrio, y entonces se pone en contacto con una sonda, que puede hibridarse al ARNm que codifique el marcador. Como una alternativa a hacer determinaciones basándose en el nivel de expresión absoluto del marcador, las determinaciones se pueden basar en el nivel de expresión normalizado del marcador. Los niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto de un marcador, comparando su expresión con la expresión de un gen que no sea un marcador, por ejemplo un gen de mantenimiento que se exprese de una manera constitutiva. Los genes adecuados para la normalización incluyen los genes de mantenimiento, tales como el gen de actina o los genes específicos de las células epiteliales. Esta normalización permite hacer la comparación del nivel de expresión en una muestra, por ejemplo una muestra de pacientes, con otra muestra, o entre muestras de diferentes fuentes. De una manera alternativa, el nivel de expresión se puede proporcionar como un nivel de expresión relativo. Con el fin de determinar un nivel de expresión relativo de un marcador, se determina el nivel de expresión del marcador para 10 ó más muestras biológicas normales contra muestras biológicas de enfermedad, de preferencia 50 ó más muestras, antes de la determinación del nivel de expresión para la muestra en cuestión. Se determina el nivel de expresión promedio de cada uno de los genes ensayados en el número más grande de muestras, y se utiliza como un nivel de expresión de la línea base para el marcador. Entonces se divide el nivel de expresión del marcador determinado para la muestra de prueba (nivel de expresión absoluto) entre el valor de expresión promedio obtenido para ese marcador. Esto proporciona un nivel de expresión relativo. De preferencia, las muestras utilizadas en la determinación de la línea base serán de pacientes que no tengan el polimorfismo. La elección de la fuente de células depende del uso del nivel de expresión relativo. El uso de la expresión encontrada en tejidos normales como un puntaje de expresión promedio ayuda a validar si el marcador ensayado es específico (contra las células normales). En adición, a medida que se acumulan más datos, se puede revisar el valor de expresión promedio, proporcionando valores de expresión relativos mejorados, basándose en los datos acumulados. Detección de Polipéptidos. En otra modalidad de la presente invención, se detecta un polipéptido correspondiente a un marcador. Un agente preferido para detectar un polipéptido de la invención es un anticuerpo capaz de enlazarse a un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención, de preferencia un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente son monoclonales. Se puede utilizar un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo, por ejemplo Fab ó F(ab')2. El término "marcado", con respecto a la sonda o al anticuerpo, pretende abarcar el marcado directo de la sonda o del anticuerpo mediante acoplamiento, es decir, enlace físico, de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que sea directamente marcado. Los ejemplos del marcado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario fluorescentemente marcado, y un marcado de extremo de una sonda de ADN con biotina, de tal manera que se pueda detectar con la estreptavídina fluorescentemente marcada. Se pueden aislar proteínas de individuos empleando técnicas que son bien conocidas por los expertos en este campo. Los métodos de aislamiento de proteínas empleados, por ejemplo, pueden ser tales como los descritos en Harlow y Lañe (1988), supra. Se pueden emplear una variedad de formatos para determinar si una muestra contiene una proteína que se enlace con un anticuerpo dado. Los ejemplos de estos formatos incluyen, pero no se limitan a, EIA; radioinmunoensayo (RIA), análisis Western blot, y ELISA. Un experto puede adaptar fácilmente los métodos conocidos de detección de proteínas/anticuerpos para utilizarse en la determinación de las células que expresen un marcador de la presente invención y la concentración relativa de ese producto de expresión de polipéptido específico en la sangre o en otros tejidos corporales. En un formato, se pueden utilizar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en los métodos, tales como Western blots o técnicas de inmunofluorescencia, para detectar las proteínas expresadas. En tales usos, en general es preferible inmovilizar ya sea el anticuerpo o las proteínas sobre un soporte sólido. Los soportes o portadores en fase sólida adecuados incluyen cualquier soporte capaz de enlazarse a un antígeno o a un anticuerpo. Los soportes o portadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabbros, y magnetita. Un experto en la materia conocerá muchos otros portadores adecuados para enlazar el anticuerpo o el antígeno, y será capaz de adaptar este soporte para utilizarse con la presente invención. Por ejemplo, la proteína aislada de las células del paciente se puede pasar sobre electroforesis en gel de poliacrilamida, y se puede inmovilizar sobre un soporte en fase sólida, tal como nitrocelulosa. Luego se puede lavar el soporte con reguladores adecuados, seguido por el tratamiento con un anticuerpo detectablemente marcado. El soporte en fase sólida se puede lavar entonces con el regulador una segunda vez para remover el anticuerpo no enlazado. Luego se puede detectar la cantidad de marca enlazada sobre el soporte sólido por medios convencionales, y esta medición se traduce hasta un nivel o concentración de proteína en sangre o en otro tejido corporal . La invención también abarca estuches para detectar la presencia de un polipéptido o ácido nucleico correspondiente a un marcador de la invención en una muestra biológica, por ejemplo, cualquier fluido corporal, incluyendo, pero no limitándose a, suero, plasma, linfa, fluido quístico, orina, heces, csf, fluido ascítico, o sangre, e incluyendo muestras de biopsia del tejido corporal. Por ejemplo, el estuche puede comprender un compuesto marcado o agente capaz de detectar un polipéptido o un ARNm que codifique un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención en una muestra biológica, y elementos para determinar la cantidad del polipéptido ó ARNm en la muestra, por ejemplo, un anticuerpo que se enlace con el polipéptido, o una sonda de oligonucleótido que se enlace con el ADN ó el ARNm que codifique el polipéptido. Los estuches también pueden incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el estuche. Para los estuches basados en anticuerpos, el estuche puede comprender, por ejemplo, 1) un primer anticuerpo, por ejemplo unido a un soporte sólido, que se enlace a un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención; y o p ci o n a I m e n te 2) un segundo anticuerpo diferente que se enlace ya sea al polipéptido o bien al primer anticuerpo, y que se conjugue a una marca detectable. Para los estuches basados en oligonucleótido, el estuche puede comprender, por ejemplo, 1) un oligonucleótido, por ejemplo un oligonucleótido detectablemente marcado, que se hibride a una secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención; o 2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico correspondiente a un marcador de la invención. El estuche también puede comprender, por ejemplo, un agente regulador del pH, un conservador, o un agente estabilizante de proteína. El estuche puede comprender además los componentes necesarios para detectar la marca detectable, por ejemplo una enzima o un sustrato. El estuche también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control, que se pueden ensayar y comparar con la muestra de control. Cada componente del estuche se puede encerrar dentro de un recipiente individual, y todos los diferentes recipientes pueden estar dentro de un solo paquete, junto con instrucciones para interpretar los ensayos llevados a cabo utilizando el estuche. Estuches. Los estuches de la invención pueden contener un producto escrito sobre o dentro del recipiente del estuche. El producto escrito describe la manera de utilizar los reactivos contenidos en el estuche para predecir si un paciente responderá efectivamente a un tratamiento con macrolactama, en especial un tratamiento con pimecrolimus. En varias modalidades, el uso de los reactivos puede ser de acuerdo con los métodos de la invención.

EJEMPLO ANÁLISIS FARMACOGENETICO DE LA RESPUESTA DE LOS PACIENTES A LA TERAPIA EN EL ESTUDIO CLÍNICO: ASOCIACIÓN POTENCIAL DE LA EFICACIA DE PIMECROLIMUS CON LOS POLIMORFISMOS EN EL CÚMULO DE GENES DE TNF. G en o ti p i fi c a c i ? n de los Genes Candidatos Seleccionados. Se analizaron 46 pacientes, correspondientes a 24 pacientes que recibieron tacrolimus y 22 pacientes que recibieron p i m e ero I i m us , para determinar las posibles asociaciones entre los marcadores genéticos y la eficacia del tratamiento. Se analizaron 31 sitios polimórficos únicos en un total de 22 genes. La Tabla 1 enlista las frecuencias de genotipos para cada polimorfismo de un solo nucleótido examinado en la población en estudio que consintió a la participación en el análisis f armacogenético . Cada polimorfismo de un solo nucleótido se identifica mediante tres piezas de información: (1) REF_ACC, o el número de acceso Genbank, donde se puede encontrar la secuencia genómica para el gen, (2) Posición, que se refiere a la posición del nucleótido dentro del REF_ACC que se interrogó, y (3) TWT SNP#, que se refiere al número asignado por Third Wave Technologies al ensayo que se diseñó para evaluar el genotipo en la posición definida por los puntos 1 y 2. La localización se refiere al sitio dentro del gen que aloja el polimorfismo, si se conoce. TABLA 1 Lista de polimorfismos examinados en el análisis farmacogenomico TNF Factor de 128148 M16441 0.80(G) 0.20(A) 3787 promotor necrosis (SEQ ID tumoral a NO:7) TNFSF6 Súper-familia 128153 X81335 0.58(G) 0.42(A) 1110 promotor del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro 6 + Este polimorfismo de un solo nucleótido no es polimórfico en esta población de pacientes. * Esta población no está en equilibrio de Hardy Weinberg para este polimorfismo de un solo nucleótido.

No se genofipificó el gen FKBP1A (SEQ ID NO:13), que codifica para la Proteína 1A de Enlace de FK506 (macrofilina-12), el objetivo de pimecrolimus y tacrolimus (FK506), debido a que se encontró que el gen no contiene polimorfismos de un solo nucleótido. No se han reportado sitios polimórficos en FKBP1A en las bases de datos publicados. Secuenciamos el gen FKBP1A para buscar polimorfismos de un solo nucleótido desconocidos, pero no encontramos ninguno. Con el fin de interrogar el genotipo en cada locus de interés, se diseñaron conjuntos de sondas flanqueando el polimorfismo de un solo nucleótido, utilizando las bases de datos públicamente disponibles, tales como OMIM, el SNP Consortium, LocusLink y dNSP. Los conjuntos de sondas fueron sintetizados por Third Wave Technologies Inc. (TWT, 5 Madison Wl). La genotipificación se llevó a cabo con 60 nanogramos de ADN genómico, utilizando el ensayo Invader® desarrollado por Third Wave Technologies, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lyamichev V. y colaboradores, Nat. Biotechnol. 17:292-6 (1999) y Ryan D. 10 Mol. Diagn. 4:135-44 (1999). Genotipificación de AS N 60TH R LTA. Con el fin de confirmar los resultados del ensayo de genotipificación de Third Wave Technologies para ASN60THR LTA (TWT #229383), se utilizó un planteamiento de reacción en cadena 15 de la polimerasa (PCR) anida. Todos los o I i g o n u c I eót i d os se adquirieron en Research Genetics (Huntsville, AL). Primero, se amplificó un fragmento de 481 pares de bases, utilizando los cebadores con las siguientes secuencias: hacia adelante (5'-acaccacctg aacgtctcttc-3' ; SEQ ID NO:14), en reversa (5'- 2o tctcaatccctgaggaagtgg-3'; SEQ ID N 0 : 15 ) . Ver el número de acceso Genbank M 559 3 , para ver la secuencia completa de LTA (SEQ ID NO:11). El amplicón se purificó utilizando columnas Microcon 100 (Amlidon, Beverly, MA), y se utilizó como una plantilla para amplificar un fragmento de 163 pares „ de bases, utilizando los cebadores con las siguientes secuencias: hacia adelante (5'-tcagccaaaccttgagccctagag-3'; SEQ ID N0:16), y en reversa (5'-atgtttaccaatgaggtgagcagcaggtttgcgg-3' ; SEQ ID N0:17). Ambas reacciones en cadena de la polimerasa se llevaron a cabo en un termociclador Perkin Elmer 9700, utilizando 80 nanogramos de ADN genómico, 60 nanogramos de cada cebador, 1.0 unidades (U) de polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer), y dNTP 200 µ IVI (Pharmacia, Piscataway, N. J.), en un regulador consistente en KCI 50 mM, TRIS-HCI 10 mM (pH de 8.3), gCI 1.5 mM, y gelatina al 0.01 por ciento. Los ciclos de reacción en cadena de la polimerasa para ambas aplicaciones consistieron en los siguientes: 94°C, 5 minutos; 94°C, 30 segundos; 57°C, 30 segundos; y 72°C, 30 segundos, por 35 ciclos; 72°C, 10 minutos, luego 4°C. El amplicón de 163 pares de bases de digirió con Fau I (New England, Beverly MA), y se pasó por electroforesis sobre un gel de agarosa al 4 por ciento. Un alelo G produjo un fragmento cortado de 163 pares de bases, mientras que un A produjo fragmentos de 35 y 128 pares de bases. Ambos fragmentos de 128 y 163 pares de bases se vieron en los individuos heterocigóticos. Todos salvo dos de los genotipos determinados por la tecnología de Third Wave Technologies, se pudieron confirmar mediante digestión de restricción. Genotipificación de (-1031) TNF. Con el fin de confirmar los resultados del ensayo de genotipificación para TNF -1031 , se amplificó con reacción en cadena de la polimerasa un fragmento de 1113 pares de bases del promotor TNF, y se secuenció para cada muestra. Los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa tuvieron las siguientes secuencias: hacia adelante (5'-TGGGAGTGAGAACTTCCCAG-3'; SEQ ID NO:18) y en reversa (5'-TGAGCTCATCTGGAGGAAGC-3'; SEQ ID NO:19). Ver el número de acceso Genbank M16441, para ver la secuencia completa del TNF humano. Las reacciones en cadena de la polimerasa se llevaron a cabo empleando las mismas condiciones descritas anteriormente. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se purificaron a través de columnas Mícrocon 100 (Amlidon, Beverly, MA). En seguida de la purificación del amplicón, se utilizaron 5 nanogramos por 100 pares de bases para secuenciarse con el estuche ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing kit as recommended (Estuche de secuenciación de ciclo de terminador de tinte ABI Prism), como se recomienda (Perkin Elmer, Foster City, CA). Las reacciones de secuenciación contenían ya sea el cebador hacia adelante (5'-TGGGAGTGAGAACTTCCCAG-3'; SEQ ID NO:20), o bien el cebador en reversa (5'-CTTAAACGTCCCCTGTATTC-3'; SEQ ID NO:21), y se ejecutaron como sigue: 96°C, 5 minutos; 96°C, 10 segundos, 50°C, 5 segundos, y 60°C, 4 minutos por 25 ciclos; luego 4°C. Las reacciones de secuenciación se purificaron con columnas de centrifugación Centrisep (Princeton Separation, Adelphia, NJ), y se ejecutaron en el secuenciador ABI 373A. Las secuencias de ADN se analizaron utilizando el software ABI Prism Sequence Analysis V3.3 (Análisis de Secuencia ABÍ Prism Versión 3.3). Análisis Estadístico. Se utilizaron los puntajes de evaluación global del investigador (IGA) como el marcador primario de eficacia en los estudios f armacogenéticos. Los puntajes IGA al final de la fase del Investigador Ciego del estudio (Día 43) se utilizaron como el punto del tiempo principal para la comparación. La última observación llevó adelante imputaciones en donde solamente se requirió de un sujeto en el día 43. En este caso, no hubo puntaje IGA disponible después del Día 29, y se utilizó el puntaje de este día en lugar del puntaje IGA de un día 43. Los puntajes IGA se volvieron a codificar, como se hizo para evaluar la eficacia en el estudio mismo. Un puntaje IGA de 0 ó 1 se consideraba un tratamiento de éxito, y los puntaje IGA de 2 a 5 se contaron como fracaso del tratamiento. También se utilizó la severidad del prurito como un marcador de eficacia. Los puntajes de prurito se dicotomizaron en ausencia (puntaje = 0) o en la presencia (puntaje = 1 , 2, ó 3) de prurito. Se empleó el modelo exacto de Fisher para examinar el efecto del genotipo sobre cada variable de eficacia. Todos los análisis estadísticos se hicieron utilizando el software SAS versión 8.2. Con fin de corregir la prueba múltiple, se aplicó el método de corrección de Bonferroni a todos los resultados. La ecuación utilizada para corregir los puntajes de significado (valores P) es: Bonferroni = P X ?, en donde P = valor p para la asociación entre el fenotipo y la eficacia del tratamiento, y ? número de marcadores polímórficos genotipificados en el estudio. Participantes en el Estudio Demográfico. Como se demuestra en la Tabla 2, los sujetos del estudio que consintieron al análisis farmacogenóm ico (PG) fueron representativos de la población de pacientes en el estudio globalmente en términos de género, edad, etnicidad, y respuesta al tratamiento.

TABLA 2 Demográfica de los participantes del análisis farmacoqenómico, comparándose con los suietos en estudio Estudio* Pimecro- Farmacogenóm ica, Muestras* tacrolimus limus tacrolimus pimecroli mus Edad (años) 7.8 8.1 8.7 8.5 Raza Caucásica 31 (41%) 45 (63%) 12(48%) 17 (77%) + Hubo 70 sujetos en el grupo de tacrolimus del estudio, y 71 sujetos en el grupo de pimecrolimus del estudio. * 24 sujetos que tomaron tacrolimus, y 22 pacientes que tomaron pimecrolimus, se analizaron en el análisis farmacogenómico. $ Los puntajes IGA se tomaron en la selección. # Número y (porcentaje) de pacientes que experimentaron eficacia, definida como un puntaje IGA de 0 ó 1 , registrado en el día 43 del tratamiento (final de la porción ciega del estudio).

Asociación entre TNF (-1031) y la Eficacia de la Macrolactama. Como se informó anteriormente, la variable de eficacia primaria utilizada en el análisis estadístico de cada marcador genético fue un puntaje IGA re-codificado. Se genotipificaron un total de 31 loe i en 22 genes. De los 31 loe/ que se genoti ificaron, 5 no eran polimórficos en la población del análisis farmacogenómico, y se sacaron del análisis. Ver la Tabla 1 anterior. Por consiguiente, la pena por la prueba múltiple en este análisis es de 26. Cuando se analizó el estudio como un todo (ambos grupos combinados), uno de los 26 polimorfismos de un solo nucleótido analizados mostró una asociación estadísticamente significativa con la eficacia. El factor de necrosis tumoral alfa, TNF, se localiza en el cúmulo de MHC rico en genes sobre 6p21.3 (ver la Figura 1), y muchos de los genes de esta región tienen papeles importantes en los procesos inflamatorios. El promotor de TNF es altamente polimórfico. Un polimorfismo de un solo nucleótido localizado a -1031 pares de bases desde el sitio de inicio de transcripción del gen, se asoció con la eficacia (p = 0.04, ver la Tabla 3 más adelante). Estos datos demuestran que los pacientes que alojan un alelo C (ya sea homocigotos CC ó heterocigotos CT) en TNF (-1031), tenían menos probabilidades de responder al tratamiento (4/17; índice de éxito del 24 por ciento) que los pacientes TT (17/29; índice de éxito del 59 por ciento) . TABLA 3 Asociación entre TNF (-1031) y la eficacia de la macrolactama Genotipo TNF (-1031) La Tabla 3 demuestra el número de sujetos con cada genotipo que respondieron o no respondieron al tratamiento (referido como "éxito" o "ningún éxito", respectivamente), como se determinó mediante los puntajes IGA en el día 43 del tratamiento. Cada cuadro contiene el número de individuos con el genotipo dado que se ajusta en la categoría de respuesta, seguido por el porcentaje. El valor P para la asociación es de 0.04 (Exacto de Fisher). En seguida examinamos la asociación entre TNF (-1031) y la eficacia para el tratamiento con tacrolimus y pimecrolimus, de una manera independiente. Como se ve en la Tabla 4, los sujetos que respondieron al pimecrolimus se pueden segregar de los no respondentes, basándose en el TNF (-1031). Solamente los sujetos con un genotipo TT (SEQ ID NO:1) en TNF (-1031) respondieron al tratamiento con pimecrolimus. Ninguno de los 10 sujetos con un alelo C (SEQ ID NO:2; CC ó CT) respondió al tratamiento con pimecrolimus. Aunque el índice de respuesta entre los pacientes CC y CT fue del 0 por ciento, el 67 por ciento de los TTs experimentaron remisión de su dermatitis atópica después de tomar pimecrolimus.

TABLA 4 Asociación entre TNF (-1031) V la eficacia del pimecrolimus (Genotipo TNF (-1031) La Tabla 4 demuestra el número de sujetos tratados con pimecrolimus con cada genotipo que respondieron o no respondieron al tratamiento (referido como "éxito" o "ningún éxito", respectivamente), como se determinó mediante los puntajes IGA en el día 43 del tratamiento. Cada cuadro contiene e número de individuos con el genotipo dado que se ajusta a la categoría de respuesta, seguido por el porcentaje. El valor P para la asociación es de 0.003 (Exacto de Fisher). Sin embargo, el genotipo en este locus no parece tener influencia sobre la eficacia del tacrolimus. Ver la Tabla 5 más adelante. En realidad, de los sujetos que utilizaron tacrolimus, los respondentes parecen ser solamente con probabilidades de TT como CT ó CC. Por lo tanto, la asociación que se ve entre el eficacia en el estudio como un todo y el TNF (-1031) se mantiene solamente para el pimecrolimus, y no para las macrolactamas en general.

TABLA 5 Asociación entre TNF (-1031) y la eficacia del tacrolimus Genotipo TNF (-1031) Respuesta al CC CT TT Total tacrolimus Ningún éxito 1 (50%) 2 (40%) 8 (47%) 11 (IGA >2) La Tabla 5 demuestra el número de sujetos tratados con tacrolimus con cada genotipo, que respondieron o que no respondieron al tratamiento (referidos como "éxito" o "ningún éxito", respectivamente), como se determinó mediante los puntajes IGA en el día 43 del tratamiento. Cada cuadro contiene el número de individuos con el genotipo dado que se ajusta a la categoría de respuesta, seguido por el porcentaje. No se encontró asociación alguna entre la respuesta del genotipo TNF (-1031) al tacrolimus. El valor P para la asociación es 1.0 (Exacto de Fisher). Asociación entre ASN60THR LTA y ¡a Eficacia efe la M aero I a ctam a . Cuando se analizaron juntos ambos grupos del estudio, solamente se encontró una asociación con la eficacia con el TNF (-1031). Es interesante que los datos para un segundo polimorfismo sugirieron una tendencia hacia el significado. Un polimorfismo C?A en el exón 3 de LTA (SEQ ID NO:3), que da como resultado la producción de treonina en lugar de asparagina en el 60° aminoácido de la proteína (ASN60THR), se asoció con la eficacia en el estudio clínico ( = 0.07 , ver la Tabla 6 más adelante). LTA se localiza en hilera con TNF sobre 6p21.3, y numerosos reportes sugieren que los marcadores en TNF y LTA están en un fuerte desequili rio de enlace. Bouma G. y colaboradores, Scand J. Immunol. 43:456-63 (1996); Noguchi E. y colaboradores, Am. J. Respir Crit. Care Med. 166:43-6 (2002); Moffart M. y Cookson W. Hum. Molec. Genet. 6:551 -4 (1997); Messer G. y colaboradores, J. Exp. Med. 173:209-19 (1991). Los genotipos en este locus se determinaron en los participantes en el análisis farmacogenómico utilizando un Ensayo Invasor (TWT#229383) , y se confirmaron mediante digestión de restricción. Los datos demuestran que los pacientes que alojan un A, el alelo de tipo silvestre (SEQ ID NO:3) en este locus, tuvieron más probabilidades de responder al tratamiento; el índice de respuesta entre los sujetos con un alelo A (SEQ ID NO:4); (AA o AC) fue del 57 por ciento (17/30), mientras que solamente el 25 por ciento (4/16) de estos sujetos con un genotipo CC experimentaron eficacia en el estudio. TABLA 6 Asociación entre ASN60THR LTA y la eficacia de la macrolactama (ambos grupos combinados) Genotipo ASN60THR LTA Respuesta a) AA AC CC Total tratam iento Ningún éxito 3 (30%) 10 (50%) 12 (75%) 25 (IGA >2) La Tabla 6 demuestra el número de sujetos en el estudio clínico con cada genotipo que respondieron o que no respondieron al tratamiento (referido como "éxito" o "ningún éxito", respectivamente), como se determinó mediante los puntajes IGA en el día 43 del tratamiento. Cada cuadro contiene el número de individuos con el genotipo dado que se ajusta a la categoría de respuesta, seguido por el porcentaje. Aunque no se encontró una asociación significativa (valor P = 0.07, Exacto de Fisher), el valor P se aproxima al significado, y sugiere una posible asociación. En seguida examinamos la asociación entre ASN60THR LTA y cada grupo del estudio clínico de una manera independiente. Como se anticipó, se encontró una asociación significativa para el pimecrolimus (P = 0.02, ver la Tabla 7 más adelante), y se vio un efecto de la dosificación con el polimorfismo. Los pacientes con un genotipo CC en este loe us respondieron pobremente al pimecrolimus (1/8 u 11 por ciento fueron tratados con éxito). Sin embargo, los pacientes con un genotipo AC respondieron mejor (4/10, ó índice de respuesta del 40 por ciento), y todos los pacientes con un genotipo AA respondieron al tratamiento (3/3).

TABLA 7 Asociación entre ASN60THR LTA y la eficacia del pimecrolimus Genotipo ASN60THR LTA La Tabla 7 demuestra el número de sujetos tratados con pimecrolimus con cada genotipo que respondieron o que no respondieron al tratamiento (referido como "éxito" o "ningún éxito", respectivamente), como se determinó mediante los puntajes IGA en el día 43 del tratamiento. Cada cuadro contiene el número de individuos con el genotipo dado que se ajusta a la categoría de respuesta, seguido por el porcentaje. El valor P para la asociación es de 0.02 (Exacto de Fisher). No se encontró una relación similar entre ASN60THR LTA y la eficacia del tacrolimus. Como se ve en la Tabla 8, la presencia del alelo A en ASN60THR L TA no tuvo influencia alguna sobre la respuesta al tacrolimus. Como se encontró con el TNF (-1031), la asociación entre ASN60THR LTA y la eficacia en el estudio clínico es impulsada por el grupo de pimecrolimus del estudio.

TABLA 8 Asociación entre ASN60THR LTA y la eficacia del tacrolimus Genotipo ASN60THR LTA La Tabla 8 demuestra el número de sujetos tratados con tacrolimus con cada genotipo, que respondieron o que no respondieron al tratamiento (referido como "éxito" o "ningún éxito", respectivamente), como se determina mediante los puntajes IGA en el día 43 del tratamiento. Cada cuadro contiene el número de individuos con el genotipo dado que se ajusta a la categoría de respuesta, seguido por el porcentaje. No se encontró asociación alguna entre el genotipo ASN60THR LTA y la respuesta al tacrolimus. El valor P para la asociación es de 1.0 (Exacto de Fisher). Asociación Entre los Marcadores Polimórficos y el Alivio del Prurito. Una variable de eficacia secundaria utilizada en el estudio fue el prurito. Se hizo un análisis para ver si el ASN60THR LTA y el TNF (-1031) se asociaban con esta variable de eficacia (evaluada en el día 43). Los resultados del análisis para ASN60THR LTA y TNF (-1031) se muestran en las Tablas 9 y 10, respectivamente. Pocos sujetos (7/46) del grupo farmacogenómico experimentaron alivio de la comezón. Los descubrimientos para la variable de eficacias primaria (IGA) sugirieron que la presencia de un alelo C en ASN60THR LTA reducía la posibilidad de respuesta al tratamiento. Aunque no se encontró una asociación estadísticamente significativa entre ASN60THR LTA y el prurito, ningún sujeto que fuera CC homocigótico en este locus experimentó alivio de la comezón como un resultado del tratamiento en este estudio. Para TNF (-1031); aunque el análisis de la variable de eficacia primaria IGA sugirió que los sujetos TT tenían mucho más probabilidades de responder al tratamiento, no se puede decir lo mismo cuando se analizaron los puntajes de prurito para el estudio como un todo. Los dos grupos del estudio no se pudieron separar para el análisis de prurito, debido a que el número de respondentes es demasiado pequeño. Solamente dos sujetos de pimecrolimus en las muestras del análisis f arm a cog e n óm i co experimentaron alivio de la comezón. Sin embargo, ambos sujetos de pimecrolimus que experimentaron eficacia con respecto al prurito eran TT en TNF (-1031).

TABLA 9 Asociación entre ASN60THR LTA y prurito (ambos grupos combinados) Genotipo ASN60THR LTA La Tabla 9 demuestra el número de sujetos con cada genotipo en el locus ASN60THR L TA estudiado, que respondieron o que no respondieron al tratamiento, como se determina mediante los puntajes de prurito en el día 43 del tratamiento. Se consideró que el tratamiento tuvo éxito si el paciente reportaba que no tenía prurito (puntaje = 0). Cada cuadro contiene el número de individuos con el genotipo dado que se ajusta a la categoría de respuesta, seguido por el porcentaje. No se encontró una asociación significativa entre el genotipo ASN60THR LTA y el alivio del prurito (P = 0.06, Exacto de Fisher); sin embargo, el valor P para la asociación se aproximó al significado.

TABLA 10 Asociación entre TNF (-1031) y prurito en seguida del tratamiento (ambos grupos combinados) Genotipo TNF (-1031) La Tabla 10 demuestra el número de sujetos con cada genotipo en TNF (-1031) que respondieron o que no respondieron al tratamiento, como se determinó mediante los puntajes de prurito en el día 43 del tratamiento. Se consideró que el tratamiento tuvo éxito si el paciente no reportaba prurito (puntaje = 0). Cada cuadro contiene el número de individuos con el genotipo dado que se ajusta a la categoría de respuesta, seguido por el porcentaje. No se encontró asociación alguna (P = 1.0, Exacto de Fisher). Genotipos en TNF (-1031) y ASN60THR LTA. Se obtuvieron genotipos de pacientes anónimos en estos dos loci 6p21.3. Solamente los sujetos con un genotipo TT en TNF (-1031) respondieron a la terapia con pim ecrolim us. La observación de que los individuos que son homocigotos TT para TNF (-1031) son ya sea homocigotos AA, heterocigotos AC, u homocigotos CC, o para ASN60THR LTA, muestran que TNF (-1031) y AS N60THR no están en un desequilibrio de enlace com pleto.

TABLA 11 Secuencia de nucleótidos que rodea a los polimorfismos de ASN60TH LTA y TNF (-1031) Asociaciones entre el pimecroUmus y tacroli us y otros marcadores tipificados. Se verificaron todos los otros marcadores moleculares para ver si segregaban a los res p o n d e ntes de los no respondentes para cada grupo del estudio de una manera independiente. No se encontraron asociaciones adicionales para el pimecrolimus, aunque se encontró una asociación para el tacrolimus. Un polimorfismo G?A en la región codificante de CCR2 (SEQ ID NO:6; ver TWT #47987), que da como resultado un cambio en una valina hasta isoleucina (VAL64ILE) se asoció con la respuesta al tratamiento con tacrolimus (p = 0.04, ver la Tabla 11 anterior). El valor P para la asociación entre la eficacia del pimecrolimus y VAL64ILE CCR2 fue de 1.0 (Exacto de Fisher). CCR2 codifica al receptor 2 del motivo de quimiocina (C-C), un receptor para la proteína-1 q u i m i o a t raye n t e de monocitos, y una quimiocina que media la infiltración de monocitos en las enfermedades inflamatorias. CCR codifica para ambas isoformas conocidas del receptor para la proteína-1 q u i m i o at ray e n te de monocitos (MCP-1, también conocida como SCYA2), una quimiocina que media específicamente la quimiotaxis de monocitos. Se ha demostrado que MCP-1 está involucrada con las enfermedades inflamatorias como artritis reumatoide y ateroesclerosis. Boring L. y colaboradores, Nature 394:894-7 (1998). El polimorfismo VAL64ILE se presenta en la primera región transmembrana de CCR2, y se ha estudiado en el contexto de la infección de HIV-1 y en el SIDA. Mimmidi S. y colaboradores, Nature Med. 4:786-93 (1998). La asociación encontrada fue p = 0.04. Estos datos demuestran que un alelo A en VAL64ILE CCR2 tenía más probabilidades de responder al tratamiento con tacrolimus; 8/10 ó el 80 por ciento de los sujetos AG experimentaron eficacia, comparándose con 4/13 ó 31 por ciento de los sujetos GG. (No hubo sujetos AA en la población). Esta asociación es más débil que las asociaciones que se ven con la eficacia del pimecrolimus, en particular para TNF (-1031) y la eficacia de pimecrolimus (p = 0.003). TABLA 12 Asociación entre VAL63ILE CCR2 (TWT #47987) y la eficacia del tacrolimus Genotipo VAL63ILE CCR2 La Tabla 12 demuestra el número de sujetos tratados con tacrolimus con cada genotipo en VAL63ILE CCR2, que respondieron o que no respondieron al tratamiento (determinado mediante los puntajes IGA en el día 43 del tratamiento). Cada cuadro contiene el número de individuos con el genotipo dado que se ajusta a la categoría de respuesta, seguido por el porcentaje. El valor P para la asociación fue de 0.04 (Exacto de Fisher). LTB (SEQ ID NO: 12); ver TWT #128095) también se localiza en el cúmulo de genes de TNF sobre 6p21.3. También se tipificó un polimorfismo en LTB en este análisis (SEQ ID NO:22). Sin embargo, como se muestra más adelante, no hay asociación alguna entre TWT#128095 y la eficacia en el estudio clínico. No se encontró asociación alguna cuando se analizaron independientemente los sujetos de pimecrolimus y de tacrolimus tampoco. TABLA 13 Relación entre la eficacia en el estudio (ambos grupos combinados) y LTB (TWT#128095) : los datos no demuestran asociación alguna (p = 1.0. Exacto de Fisher) LTB (TWT#128095) Respuesta al AC ce Total tratam iento Ningún éxito (IGA >_ 2) 3 (50%) 20 (54%) 23 Éxito (IGA = 0 ó 1) 3 (50%) 17 (46%) 20 Total 16 26 43 TABLA 14 Relación entre la eficacia entre los sujetos tratados con pimecrolimus y LTB (TWT#128095) ; los datos no demuestran asociación alguna (p = 1.0, Exacto de Fisher) LTB (TWT#128095) TABLA 15 Relación entre la eficacia entre los sujetos tratados con tacrolimus y LTB (TWT#128095) : los datos no demuestran asociación alguna (p = 1.0. Exacto de Fisher) LTB (TWT#128095) Respuesta al AC CC Total tacrolim us Ningún éxito (IGA > 2) 3 (60%) 8 (44%) 11 Éxito (IGA = 0 ó 1) 2 (40%) 10 (56%) 12 Total 5 18 23 Estos datos ayudan a localizar la región genética que es responsable de la respuesta al pimecrolimus; el polimorfismo biológicamente relevante no parece estar localizado próximo al TNF. En resumen, ya sea LTA ó TNF tiene un papel importante en la determinación de la eficacia del pimecrolimus en el tratamiento de dermatitis atópica pediátrica. En contraste, la respuesta al tacrolimus parece estar influenciada por otras sendas biológicas. Por consiguiente, diferentes mecanismos biológicos tienen influencia sobre la respuesta al pimecrolimus y al tacrolimus. Aunque el pimecrolimus y el tacrolimus tienen similitudes estructurales sustanciales, y ambos dirigen la macrofilina-12 con el efecto final de inhibir la calcineurina, se sabe que los dos compuestos tienen propiedades distintas. Nghiem P. y colaboradores, J. Am. Acad. Dermatol. 46:228-241 (2002), y las referencias citadas en el mismo. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan a la presente como referencia en su totalidad y para todos los propósitos hasta el mismo grado como si cada publicación o patente o solicitud de patente individual fuera específica o individualmente indicada como incorporada por referencia en su totalidad para todos los propósitos. En adición, todos los números de acceso Genbank, números Unigene Cluster, y números de acceso de proteínas citados en la presente, se incorporan a la presente como referencia en su totalidad y para todos los propósitos, hasta el mismo grado como si cada uno de estos números fuera específica e individualmente indicado como incorporado por referencia en su totalidad para todos los propósitos. La presente invención no debe limitarse en términos de las modalidades particulares descritas en esta solicitud, las cuales pretenden ser solamente ilustraciones de los aspectos individuales de la invención. Se pueden hacer muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será aparente para los expertos en la materia. Los métodos y aparatos funcionalmente equivalentes dentro del alcance de la invención, en adición a aquéllos enumerados en la presente, serán aparentes para los expertos en este campo, a partir de la descripción anterior y de los dibujos acompañantes. Se pretende que estas modificaciones y variaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se debe limitar solamente por los términos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los que tienen derecho tales reivindicaciones.

Claims (45)

REIVINDICACIONES

1. El uso de pimecrolimus en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad inflamatoria en una población de pacientes seleccionada, en donde la población de pacientes se selecciona con base en el genotipo de los pacientes en un locus genético a partir del cúmulo de genes de TNF, que indica la eficacia del pimecrolimus en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria.

2. El uso de tacrolimus en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad inflamatoria en una población de pacientes seleccionada, en donde la población de pacientes se selecciona con base en el genotipo de los pacientes en el locus genético CCR2, que indica la eficacia del tacrolimus en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria.

3. Un método para el tratamiento de una condición en un sujeto, en donde la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en dermatitis atópica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la que se indique pimecrolimus o tacrolimus, el cual comprende los pasos de: (a) obtener el genotipo de un sujeto en un locus genético a partir del cúmulo de genes de TNF, que indique la eficacia de una formulación de macrolactama seleccionada en el tratamiento de la condición; (b) administrar al sujeto, ya sea la formulación de macrolactama seleccionada, o bien un tratamiento alternativo para la condición. 5

4. El método de la reivindicación 3, en donde la formulación de macrolactama seleccionada comprende pimecrolimus.

5. El método de la reivindicación 3, en donde la formulación de macrolactama seleccionada comprende ]0 tacrolimus.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde el locus genético es el gen TNF humano, o un gen en una especie vertebrada homólogo al gen TNF humano. 15

7. El uso de la reivindicación 1 , o el método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde el locus genético es el locus TNF (-1031) del gen TNF humano, o un locus correspondiente en una especie de vertebrado homólogo al gen TNF humano. 20

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6, ó 7, en donde la formulación de macrolactama seleccionada comprende pimecrolimus, cuando el locus genético TNF (-1031) tiene un genotipo TT.

9. El método de cualquiera de las „ reivindicaciones 3 a 7, en donde el tratamiento alternativo para la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en una alta dosis de pimecrolimus, pimecrolimus y un inmunosupresor alternativo, y un i nmunosupresor alternativo, cuando el locus TNF (-1031) tiene un genotipo CC ó CT.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el inmunosupresor alternativo se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrocortisona, ciclosporina, tacrolimus, y sirolim us.

11. El uso de la reivindicación 1 , o el método de la reivindicación 3, en donde el locus genético es el gen LTA humano, o un gen en una especie de vertebrado homólogo al gen LTA humano.

12. El uso de la reivindicación 1 u 11, o el método de la reivindicación 3 u 11, en donde el locus genético es el locus ASN60THR LTA del gen L TA humano, o un locus correspondiente en una especie de vertebrado homólogo al gen L TA humano.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3, 11, ó 12, en donde la formulación de caprolactama seleccionada comprende pimecrolimus, cuando el locus genético ASN60THR L TA tiene un genotipo AA ó AC.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3, 11, ó 12, en donde el tratamiento alternativo para la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en una alta dosis de pimecrolimus, pimecrolimus, y un inmunosupresor alternativo, y un inmunosupresor alternativo, cuando el locus ASN60THR LTA tiene un genotipo CC.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el inmunosupresor alternativo se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrocortisona, ciclosporina, tacrolimus, y sirolimus.

16. Un método para el tratamiento de una condición en un sujeto, en donde la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en dermatitis atópica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la que se indique pimecrolimus o tacrolimus, el cual comprende los pasos de: (a) obtener el genotipo de un sujeto en un locus genético que indique la eficacia de una formulación de macrolactama seleccionada en el tratamiento de la condición, en donde el locus genético es el gen CCR2 humano, o un gen en una especie de vertebrado homólogo al gen CCR2 humano; (b) administrar al sujeto, ya sea la formulación de macrolactama seleccionada, o bien un tratamiento alternativo para la condición.

17. El uso de la rei indicación 2, o el método de la reivindicación 16, en donde el locus genético es el locus VAL64ILE CCR2 del gen CCR2 humano, o un locus correspondiente en una especie de vertebrado, homólogo al gen CCR2 humano.

18. El método de la reivindicación 16 ó 17, en donde la formulación de macrolactama seleccionada comprende tacrolimus, cuando el locus genético VAL64ILE CCR2 tiene un genotipo GG.

19. El método de la reivindicación 16 ó 17, en donde el tratamiento alternati o para la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en una alta dosis de tacrolimus, tacrolimus y un inmunosupresor alternativo, y un inmunosupresor alternativo, cuando el locus VAL64ILE CCR2 tiene un genotipo AG.

20. El método de la reivindicación 16, 17, ó 19, en donde e] inmunosupresor alternativo se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrocortisona, ciclosporina, pimecrolimus, y sirolimus.

21. Un método para el tratamiento de una condición en un sujeto, en donde la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en dermatitis atópica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la que se indique pimecrolimus, el cual comprende los pasos de: (a) obtener una medición del nivel de ARNm de TNF-a en una muestra de un sujeto, en donde la muestra se toma del tejido no inflamado; y (b) cualquiera de: (i) administrar una formulación de pimecrolimus al sujeto cuando el nivel de ARNm de TNF-a en la muestra sea bajo o normal; o (ii) administrar cualquiera de: (A) una formulación de pimecrolimus en combinación con otro inmunosupresor, o (B) otro inmunosupresor, al sujeto, cuando se eleve el nivel de ARNm de TNF-a en la muestra.

22. Un método para el tratamiento de una condición en un sujeto, en donde la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en dermatitis a tópica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la que se indique pimecrolimus, el cual comprende los pasos de: (a) obtener una medición del nivel de proteína de TNF-a en una muestra de un sujeto, en donde la muestra se toma del tejido no inflamado; y (b) cualquiera de: (i) administrar una formulación de pimecrolimus al sujeto cuando el nivel de proteína de TNF-a en la muestra sea bajo o normal; o (i i) administrar cualquiera de: (A) una formulación de pimecrolimus en combinación con otro inmunosupresor, o (B) otro inmunosupresor, al sujeto, cuando se eleve el nivel de proteína de TNF-a en la muestra.

23. Un método para determinar una estrategia de tratamiento para una condición en un sujeto, en donde la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en dermatitis atópica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la cual se indique el pimecrolimus, comprendiendo este método analizar el nivel de ARNm de TNF-a ó de proteína de TNF-a en una muestra del sujeto; y en donde la estrategia de tratamiento comprende la selección de una formulación de pimecrolimus como tratamiento cuando el nivel de ARNm de TNF-a ó de proteína de TNF-a en la muestra sea bajo o normal; o la selección de cualquiera de: (a) una formulación de pimecrolimus en combinación con otro inm unosupresor, o (b) otro ¡nmunosupresor, como tratamiento cuando se eleve el nivel de ARNm de TNF-a ó de proteína de TNF-a en la muestra.

24. Un método para elegir sujetos para incluirse en un estudio clínico para determinar la eficacia de una formulación de pimecrolimus, el cual comprende los pasos de: (a) interrogar el genotipo de un sujeto en el locus de polimorfismo de TNF (-1031); (b) entonces: (i) incluirse en el estudio si son TT en este locus; (ii) excluirse si son CC ó CT en este locus; ó (ii¡) tanto (i) como (ii) .

25. Un estuche para utilizarse en la determinación de una estrategia de tratamiento para una condición, en donde la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en dermatitis atópica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la que se indique pimecrolimus o tacrolimus, el cual comprende: (a) un reactivo para detectar un biomarcador de eficacia de tratamiento de la condición mediante una formulación de macrolactama; (b) un recipiente para el reactivo; y (c) un producto escrito sobre o dentro del recipiente, que describa el uso del biomarcador en la determinación de una estrategia de tratamiento para la condición.

26. El estuche de la reivindicación 25, en donde el biomarcador es un polimorfismo genético en un gen seleccionado a partir del grupo que consiste en TNF, LTA, y CCR2.

27. El. estuche de la reivindicación 25 ó 26, en donde el reactivo para detectar el biomarcador es un conjunto de pares de cebadores que se hibridan a un polinucleótido sobre el lado del polimorfismo genético en el gen seleccionado a partir del grupo que consiste en TNF, LTA, y CCR2, y que define una región de nucleótidos que se extiende en el polimorfismo genético.

28. El estuche de la reivindicación 25, en donde el biomarcador es el nivel de ARNm de TNF-a en una muestra de un sujeto que se vaya a tratar.

29. El estuche de la reivindicación 25, en donde el biomarcador es el nivel de proteína de TNF-a en una muestra de un sujeto que se vaya a tratar.

30. Un método para determinar una estrategia de tratamiento para una condición en un sujeto, en donde la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en dermatitis atópica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la cual se indique el pimecrolimus o el tacrolimus, comprendiendo este método analizar el genotipo de un sujeto en un locus genético a partir del cúmulo de genes de TNF, que indique la eficacia de una formulación de macrolactama seleccionada en el tratamiento de la condición.

31. El método de la reivindicación 30, en donde el locus genético es el gen TNF humano o un gen en una especie de vertebrado homólogo al gen TNF humano.

32. El método de la reivindicación 30 ó 31, en donde el locus genético es el locus TNF (-1031) del gen TNF humano, o un ¡ocus correspondiente en una especie de vertebrado homólogo al gen TNF humano.

33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en donde la estrategia de tratamiento comprende la selección de una formulación de macrolactama que comprende pimecrolimus como tratamiento, 5 cuando el locus genético TNF (-1031) tiene un genotipo TT.

34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en donde la estrategia de tratamiento comprende la selección de una dosis alta de pimecrolimus, pimecrolimus y un i n m u n o s u p res o r alternativo, 10 o un inmunosupresor alternativo, como tratamiento, cuando el locus TNF (-1031) tiene un genotipo CC ó CT.

35. El método de la reivindicación 34, en donde el inmunosupresor alternati o se selecciona a partir del grupo que consiste en h i d roco rt i so n a , c i c I os p o r i n a , tacrolimus, y 15 sirolimus.

36. El método de la reivindicación 30, en donde el locus genético es el LTA humano, o un gen en una especie de vertebrado homólogo al gen LTA humano.

37. El método de la reivindicación 36, en donde el 20 locus genético es el locus ASN60THR L TA del gen L TA humano, o un locus correspondiente en una especie de vertebrado homólogo al gen L TA humano.

38. El método de la reivindicación 36 ó 37, en donde la estrategia de tratamiento comprende la selección de , una formulación de macrolactama que comprende pimecrolimus como tratamiento, cuando el locus genético ASN60THR L TA tiene un genotipo AA ó AC.

39. El método de la reivindicación 36 ó 37, en donde la estrategia de tratamiento comprende la selección de una dosis alta de pimecrolimus, pimecrolimus y un i n m u n os u p res o r alternativo, o un inmunosupresor alternativo como tratamiento, cuando el locus ASN60THR LTA tiene un genotipo CC.

40. El método de la rei indicación 39, en donde el inmunosupresor alternativo se selecciona a partir del grupo que consiste en h i d ro co rt iso n a , ci c I ospo ri n a , tacrolimus, y si ro I i m u s .

41. Un método para determinar una estrategia de tratamiento para una condición en un sujeto, en donde la condición se selecciona a partir del grupo que consiste en dermatitis atópica, psoriasis, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, u otra condición para la cual se indique el pimecrolimus o el tacrolimus, comprendiendo este método analizar el genotipo de un sujeto en un locus genético que indique la eficacia de una formulación de macrolactama seleccionada en el tratamiento de la condición, en donde el locus genético es el gen CCR2 humano, o un gen en una especie de vertebrado homólogo al gen CCR2 humano.

42. El método de la reivindicación 41, en donde el locus genético es el locus VAL64ILE CCR2 del gen CCR2 humano, o un locus correspondiente en una especie de vertebrado homólogo al gen CCR2 humano.

43. El método de la reivindicación 41 ó 42, en donde la estrategia de tratamiento comprende la selección de una formulación de macrolactama que comprende tacrolimus como tratamiento, cuando el locus genético VAL64ILE CCR2 tiene un genotipo GG.

44. El método de la reivindicación 41 ó 42, el cual comprende la selección de una dosis alta de tacrolimus, tacrolimus y un inmunosupresor alternativo, o un i n m u n o s u p res o r alternativo como tratamiento, cuando el locus VAL64ILE CCR2 tiene un genotipo AG.

45. El método de la reivindicación 44, en donde el inmunosupresor alternativo se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrocortisona, ciclosporina, p i m ecr o I i m u s , y sirolim us.