ES2712092T3 - Moléculas de ácido nucleico artificiales - Google Patents

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Abstract

Molécula de ácido nucleico artificial que comprende a. al menos un marco de lectura abierto (ORF); b. al menos un elemento de región 3'-no traducida (elemento 3'UTR) que comprende una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de proteína ribosómica o de una variante funcional de la 3'UTR de un gen de proteína ribosómica, donde dicha variante funcional es al menos un 80% idéntica a dicha 3'UTR de un gen de proteína ribosómica y c. una 5'UTR como un elemento adicional 5'-terminal, donde la 5'UTR es una 5' TOP-UTR que no comprende un motivo 5'-TOP.

Description

DESCRIPCION
Moleculas de acido nucleico artificiales.
La invencion se refiere a moleculas de acido nucleico artificiales que comprenden un marco de lectura abierto, un elemento de region no traducida (elemento 3'UTR) y una 5'TOP UTR como elemento 5'UTR adicional y, opcionalmente, una secuencia poli(A) y/o una senal de poliadenilacion. La invencion se refiere ademas a un vector que comprende un elemento 3'UTR, un marco de lectura abierto, un elemento de region no traducida (elemento 3'UTR) y una 5'TOP UTR como elemento 5'UTR adicional, a celula que comprende la molecula de acido nucleico artificial o el vector, a una composicion farmaceutica que comprende la molecula de acido nucleico artificial o el vector y a un kit que comprende una molecula de acido nucleico artificial, el vector y/o la composicion farmaceutica, preferentemente para su uso en el campo de la terapia genica y/o la vacunacion genetica.
La terapia genica y la vacunacion genetica son parte de los metodos mas prometedores y de rapido desarrollo de la medicina moderna. Pueden proporcionar opciones altamente especfficas e individuales para la terapia de una gran variedad de enfermedades. Particularmente, enfermedades geneticas heredadas, pero tambien enfermedades autoinmunes, enfermedades cancerosas o relacionadas con tumores, asf como enfermedades inflamatorias pueden ser el objetivo de tales procedimientos de tratamiento. Tambien, se preve evitar el inicio (precoz) de tales enfermedades mediante estas soluciones.
El concepto fundamental de la terapia genica es la apropiada modulacion de una expresion genica deteriorada asociada a condiciones patologicas de enfermedad especfficas. La expresion genica patologicamente alterada puede dar como resultado una carencia o sobreproduccion de productos genicos esenciales, por ejemplo factores de senalizacion como hormonas, factores de mantenimiento, enzimas metabolicas, protefnas estructurales o similares. La expresion genica alterada puede deberse no solo a la regulacion o transcripcion y/o traduccion defectuosa, sino tambien a mutaciones dentro de un ORF que codifica una protefna particular. Las mutaciones patologicas pueden estar provocadas, por ejemplo, por una aberracion cromosomica o por mas mutaciones especfficas, como mutaciones puntuales o de desplazamiento de marco, todas ellas resultando en una funcionalidad limitada y, potencialmente, perdida total de funcion del producto genico.
Sin embargo, tambien aparecer una regulacion defectuosa de la transcripcion o traduccion cuando las mutaciones afectan a genes que codifican las protefnas implicadas en la maquinaria de transcripcion o de traduccion celular. Tales mutaciones pueden conducir a una sub- o sobre-regulacion patologica de los genes que, como tales, son funcionales. Genes que codifican los productos genicos que ejercen tales funciones reguladoras, pueden ser, por ejemplo, factores de transcripcion, receptores de senal, protefnas mensajeras y similares. Sin embargo, la perdida de funcion de estos genes que codifican protefnas reguladoras bajo ciertas circunstancias puede revertirse por la introduccion artificial de otros factores que actuan adicionalmente aguas abajo del producto genico deteriorado. Tales defectos genicos tambien se pueden compensar con la terapia genica mediante la sustitucion del gen afectado en sf mismo.
La vacunacion genetica permite provocar una respuesta inmunitaria deseada a determinados antfgenos, tales como componentes caracterfsticos de las superficies bacterianas, partfculas virales, antfgenos tumorales o similares. En general, la vacunacion es uno de los logros fundamentales de la medicina moderna. Sin embargo, las vacunas efectivas solo estan actualmente disponibles para una pequena variedad de enfermedades. Por consiguiente, las infecciones que no se pueden prevenir por la vacunacion aun afectan a millones de personas cada ano.
Normalmente, las vacunas se pueden subdividir en vacunas de “primera”, “segunda” y “tercera” generacion. Las vacunas de “Primera generacion” son tfpicamente vacunas de organismos enteros. Se basan tanto en patogenos vivos y atenuados como exterminados, por ejemplo virus, bacterias y similares. La desventaja principal de las vacunas vivas y atenuadas es el riesgo de reversion a las variantes que ponen en peligro la vida. Asf, aunque estan atenuados, tales patogenos aun pueden conllevar intrfnsecamente riesgos no predecibles. Los patogenos exterminados pueden no ser tan eficaces como se desea para generar una respuesta inmunitaria especffica. A fin de minimizar estos riesgos, se desarrollaron vacunas de “segunda generacion”. Estas son tfpicamente vacunas de subunidad, que consisten en antfgenos definidos o componentes de protefna recombinante derivados de patogenos.
Las vacunas geneticas, es decir, vacunas para la vacunacion genetica, generalmente se consideran vacunas de “tercera generacion”. Se componen tfpicamente de moleculas de acido nucleico geneticamente disenadas que permiten la expresion de fragmentos de peptido o protefna (antfgeno) caracterfsticos de un patogeno o de un antfgeno tumoral in vivo. Las vacunas geneticas se expresan con la administracion a un paciente y captacion por las celulas diana. La expresion de los acidos nucleicos administrados da como resultado la produccion de protefnas codificadas. En caso de que estas protefnas sean reconocidas como extranas por el sistema inmunitario del paciente, se desencadena una respuesta inmunitaria.
Como se puede observar de lo anterior, ambos metodos, la terapia genica y la vacunacion genetica, se basan esencialmente en la administracion de moleculas de acido nucleico a un paciente y en la transcripcion y/o traduccion subsecuente de la informacion genetica codificada. Alternativamente, la vacunacion genetica o la terapia genica tambien pueden comprender metodos que incluyen el aislamiento de celulas corporales espedficas de un paciente a tratar, la transfeccion in vitro subsecuente de tales celulas y la re-administracion de las celulas tratadas al paciente.
Como moleculas de acido nucleico para la administracion en el contexto de la terapia genica o la vacunacion genetica se puede emplear ADN y ARN. Es conocido que el ADN es relativamente estable y facil de manejar. Sin embargo, el uso de ADN conlleva el riesgo de insercion indeseada de fragmentos de ADN administrados en el genoma del paciente, dando como resultado una potencial perdida de funcion de los genes deteriorados. Como riesgo adicional, surge una generacion indeseada de anticuerpos anti-ADN. Otra desventaja es el nivel de expresion limitado del peptido o protema codificada que se logra con la administracion de ADN y su transcripcion/traduccion. Entre otras razones, el nivel de expresion del ADN administrado sera dependiente de la presencia de factores de transcripcion espedficos que regulan la transcripcion de ADN. En ausencia de tales factores, la transcripcion de ADN no producira cantidades satisfactorias de ARN. Como resultado, se limita el nivel de peptido o protema traducida obtenida.
Al utilizar ARN en lugar de ADN para la terapia o la vacunacion genetica, el riesgo de integracion y generacion genomica indeseada de anticuerpos anti-ADN se minimiza o evita. Sin embargo, el ARN se considera una especie molecular mas bien inestable que se puede degradar facilmente por ARNasas ubicuas.
In vivo, la degradacion de ARN contribuye a la regulacion del tiempo de vida media del ARN. Ese efecto se considero y probo para afinar la regulacion de la expresion genica eucariotica (Friedel y col., Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life, Nucleic Acid Research, 2009, 1-12). Por consiguiente, cada ARNm de origen natural tiene una vida media individual dependiendo del gen del cual se derive el ARNm. Contribuye a la regulacion del nivel de expresion de este gen. Los ARN inestables son importantes para llevar a cabo la expresion genica transitoria en distintos puntos en el tiempo. Sin embargo, los ARN de larga vida se pueden asociar con la acumulacion de distintas protemas o expresion continua de genes. In vivo, la vida media de los ARNm tambien es dependiente de factores ambientales, como tratamiento hormonal, como se ha observado, por ejemplo, para el factor de crecimiento similar a insulina I, actina y ARNm de albumina (Johnson y col., Newly synthesized RNA: Simultaneous measurement in intact cells of transcription rates and RNA stability of insulin-like growth factor I, actin, and albumin in growth hormone-stimulated hepatocytes, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 88, paginas 5287-5291, 1991).
Para la terapia genica y la vacunacion genetica, se desea un ARN usualmente estable. Esto es, por una parte, debido al hecho de que el producto codificado por la secuencia de ARN se acumulara in vivo. Por otra parte, el ARN tiene que mantener su integridad estructural y funcional cuando se prepara para una forma de dosificacion adecuada, durante su almacenamiento y cuando se administra. Asf, se ha dedicado una atencion considerable a proporcionar moleculas de ARN estables para la terapia genica o la vacunacion genetica a fin de evitar que se vean afectadas por la degradacion o la descomposicion temprana.
Se ha informado que el contenido de G/C de las moleculas de acido nucleico puede influir en su estabilidad. Asf, los acidos nucleicos que comprenden una mayor cantidad de residuos de guanina (G) y/o citosina (C) pueden ser funcionalmente mas estables que los acidos nucleicos que contienen una gran cantidad de adenina (A) y timina (T) o nucleotidos uracilo (U). En este contexto, la WO02/098443 proporciona una composicion farmaceutica que contiene un ARNm que se estabiliza por modificaciones de secuencia en la region traducida. Tal modificacion de secuencia tiene ventajas en la degeneracion del codigo genetico. Por consiguiente, los codones que contienen una combinacion menos favorable de nucleotidos (menos favorable en terminos de estabilidad de ARN) se puede sustituir por codones alternativos sin alterar la secuencia de aminoacidos codificada. Este metodo de estabilizacion de ARN esta limitado por las provisiones de la secuencia de nucleotidos espedfica de cada molecula de ARN individual, no permitiendose dejar el espacio deseado de la secuencia de aminoacidos. Igualmente, este procedimiento esta restringido a las regiones de codificacion del ARN.
Como una opcion alternativa para la estabilizacion del ARNm, se ha descubierto que las moleculas de ARNm eucarioticas de origen natural contienen elementos de estabilizacion caractensticos. Por ejemplo, pueden comprender las llamadas regiones no traducidas (UTR) en su extremo 5' (5'UTR) y/o en su extremo 3' (3'uTr ), asf como otras caractensticas estructurales, como una estructura de cap 5' o una cola 3'-poli(A). Ambas, 5'UTR y 3'UTR se transcriben tfpicamente del ADN genomico y, asf, son un elemento del ARNm prematuro. Los aspectos estructurales caractensticos del ARNm maduro, tal como la cap 5' y la cola 3'-poli(A) (tambien llamada cola poli(A) o secuencia poli(A)) normalmente se agregan al ARNm transcrito (prematuro) durante el procesamiento del ARNm.
Una cola 3'-poli(A) es tfpicamente un tramo de secuencia monotono de nucleotidos de adenina unidos al extremo 3' del ARNm transcripto. Puede comprender hasta aproximadamente 400 nucleotidos de adenina. Se descubrio que la longitud de esta cola 3'-poli(A) es un elemento potencialmente cntico para la estabilidad del ARNm individual.
Tambien, se demuestra que la 3'UTR de un ARNm de a-globina puede ser un factor importante para la estabilidad bien conocida del ARNm de a-globina (Rodgers y col., Regulated a-globina mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3'-to-5' exosome-dependent decapping, RNA, 8, paginas 1526-1537, 20O2 ). La 3'UTR de un ARNm de aglobina esta implicada obviamente en la formacion de un complejo de ribonucleoprotema espedfico, el a-complejo, cuya presencia se relaciona con estabilidad del ARNm in vitro (Wang y col., An mRNA stability complex functions with poli(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro, Molecular and Cellular biology, Vol 19, No. 7, Julio de 1999, paginas 4552­ 4560).
Se ha demostrado ademas una funcion reguladora interesante para las UTR en los ARNm de la protefna ribosomica: mientras que la 5'-UTR de los ARNm de la protefna ribosomica controla la traduccion asociada al crecimiento del ARNm, la 3'-UTR respectiva confiere el rigor de esa regulacion en los ARNm de protefnas ribosomicaes (Ledda et al., Effect of the 3'-UTR length on the translational regulation of 5'-terminal oligopyrimidine mRNAs, Gene, Vol. 344, 2005, p.
213-220). Este mecanismo contribuye al patron de expresion especffico de las protefnas ribosomicaes, que normalmente se transcriben de manera constante, de modo que algunos ARNm de la protefna ribosomica, como la protefna S9 o la protefna L32 del ribosoma, se denominan genes de mantenimiento (Janovick-Guretzky et al., Housekeeping Gene Expression in Bovine Liver is Affected by Physiological State, Feed Intake, and Dietary Treatment, J. Dairy Sci., Vol. 90, 2007, p. 2246-2252). El patron de expresion asociado al crecimiento de las protefnas ribosomicas se debe principalmente a la regulacion en el nivel de traduccion.
Independientemente de los factores que afectan a la estabilidad del ARNm, la traduccion eficaz de las moleculas de acido nucleico administradas por las celulas o tejido objetivo es crucial para cualquier procedimiento que utiliza moleculas de acido nucleico para la terapia genica o la vacunacion genetica. Como se puede observar en los ejemplo citados anteriormente, junto con la regulacion de la estabilidad, tambien la traduccion de la mayorfa de los ARNm se regula por las caracterfsticas estructurales similares a UTR, cap 5' y cola 3'-poli(A). En este contexto, se ha informado que la longitud de la cola poli(A) puede desempenar una funcion importante tambien en la eficiencia de la traduccion. Los elementos de estabilizacion 3', sin embargo, tambien pueden tener un efecto de atenuacion de la traduccion.
La WO 2007/068265 A1 describe una molecula de ADNc que comprende el elemento 3' UTR de la protefna ribosomica L9. Mazuruk K, et al., Biochim Biophys Acta. 1996, describe acidos nucleicos recombinantes con 3' UTR derivados de genes de mantenimiento ribosomica. Sin embargo, ninguno de estos documentos describe una 5' TOP UTR que carece del motivo 5' TOP. La WO 2013/143699 A1 y la WO 2013/143700 A2 se refieren a moleculas de acido nucleico artificiales que comprenden al menos un marco de lectura abierto, un elemento 5' UTR de un gen TOP y un elemento 3' UTR no ribosomica. Es el objeto de la invencion proporcionar moleculas de acido nucleico que pueden ser adecuadas para su aplicacion en la terapia genica y/o la vacunacion genetica. Particularmente, es objeto de la invencion proporcionar una especie de ARNm que esta estabilizada contra la degradacion o deterioro predeterminado sin mostrar una perdida funcional significativa de la eficiencia de traduccion. Es tambien un objeto de la invencion proporcionar una molecula de acido nucleico artificial, preferentemente un ARNm, que se caracteriza por una expresion mejorada de la protefna respectiva codificada por dicha molecula de acido nucleico. Un objeto particular de la invencion es proporcionar un ARNm donde se ha mejorado la eficacia de traduccion de la protefna codificada respectiva. Otro objeto de la presente invencion es proporcionar moleculas de acido nucleico que codifican tal especie de ARNm superior, que pueden ser aptas para su uso en la terapia genica y/o la vacunacion genetica. Es otro objeto adicional de la presente invencion proporcionar una composicion farmaceutica para su uso en la terapia genica y/o la vacunacion genetica. En resumen, es objeto de la presente invencion proporcionar especies de acido nucleico mejoradas que superen las desventajas planteadas en el estado anterior de la tecnica mediante un procedimiento rentable y sencillo.
El objetivo que subyace aquf se resuelve por el contenido de las reivindicaciones.
Por razones de claridad y legibilidad, se proporcionan las siguientes definiciones. Cualquier caracterfstica tecnica mencionada en estas definiciones se puede leer en todas y cada una de las realizaciones de la invencion. Las definiciones y explicaciones adicionales se pueden proporcionar especfficamente en el contexto de estas realizaciones.
Respuesta inmunitaria adaptiva: La respuesta inmunitaria adaptiva se entiende tfpicamente como una respuesta especffica de antfgeno del sistema inmunitario. La especificidad de antfgeno permite generar respuestas que se adaptan a patogenos especfficos o celulas infectadas por patogenos. Normalmente, la capacidad de desarrollar estas respuestas adaptadas es mantenida en el cuerpo por “celulas de memoria”. Si un patogeno infecta el cuerpo mas de una vez, se usan estas celulas de memoria especfficas para eliminarlo rapidamente. En este contexto, la primera etapa de una respuesta inmunitaria adaptiva es la activacion de celulas T especfficas de antfgeno primitivo o diferentes celulas inmunitarias capaces de inducir una respuesta inmunitaria especffica de antfgeno por celulas presentadoras de antfgeno. Esto ocurre en los tejidos linfoides y organos a traves de los cuales las celulas T naive pasan constantemente. Los tres tipos de celulas que pueden servir como celulas presentadoras de antfgeno son celulas dendrfticas, macrofagos y celulas B. Cada una de estas celulas tiene una funcion distinta provocando respuestas inmunitarias. Las celulas dendrfticas pueden tomar antfgenos por fagocitosis y macropinocitosis y pueden volverse a estimular por contacto con, por ejemplo, un antfgeno exterior para migrar al tejido linfoide local, donde se diferencian en celulas dendrfticas maduras. Los macrofagos ingieren antfgenos de partfculas como bacterias y se inducen por agentes infecciosos u otros estfmulos apropiados para expresar las moleculas MHC. La capacidad unica de las celulas B de enlazar e interiorizar antfgenos de protefna solubles por medio de sus receptores tambien puede ser importante para inducir las celulas T. Las moleculas MHC son tfpicamente responsables de la presentacion de un antfgeno a celulas T. A este respecto, presentar el antfgeno en moleculas MHC lleva a la activacion de las celulas T que inducen su proliferacion y diferenciacion en celulas T efectoras armadas. La funcion mas importante de las celulas T efectoras es la eliminacion de celulas infectadas por celulas T citotoxicas CD8+ y la activacion de macrofagos por celulas Th1 que juntos conforman la inmunidad mediada por celula, y la activacion de celulas B por ambas celulas Th2 y Th1 para producir diferentes clases de anticuerpo, conduciendo asf a la respuesta inmunitaria humoral. Las celulas T reconocen un antfgeno por sus receptores de celulas T que no reconocen y enlazan el antfgeno directamente, pero en su lugar reconocen fragmentos peptfdicos cortos, por ejemplo de antfgenos de protefna derivados de patogeno, por ejemplo los llamados epftopos, que se enlazan a moleculas m Hc en las superficies de otras celulas.
Sistema inmunitario adaptativo: El sistema inmunitario adaptativo se dedica esencialmente a eliminar o impedir el crecimiento patogenico. Tfpicamente regula la respuesta inmunitaria adaptiva dotando al sistema inmunitario vertebrado de la capacidad para reconocer y recordar patogenos especfficos (para generar inmunidad) y para desarrollar ataques mas fuertes cada vez que se encuentra el patogeno. El sistema es altamente adaptable debido a la hipermutacion somatica (un proceso de mutaciones somaticas aceleradas) la y recombinacion V(D)j (una recombinacion genetica irreversible de segmentos de gen de receptor de antfgeno). Este mecanismo permite a un numero pequeno de genes generar un gran numero de diferentes receptores de antfgeno, que luego se expresan unicamente en cada linfocito individual. Debido a que el reordenamiento del gen lleva a un cambio irreversible del ADN de cada celula, toda de la progenie (descendencia) de tal celula heredara entonces genes que codifican la misma especificidad de receptor, que incluye celulas B de Memoria y celulas T de Memoria, claves para la inmunidad especffica longeva.
Adyuvante/componente adyuvante: Un adyuvante o un componente adyuvante en el sentido mas amplio es tfpicamente un agente farmacologico y/o inmunologico que puede modificar, por ejemplo mejorar, el efecto de otros agentes, tal como un farmaco o vacuna. Esto debe interpretarse en un sentido amplio y se refiere a un espectro amplio de sustancias. Tfpicamente, estas sustancias son capaces de incrementar la inmunogenicidad de antfgenos. Por ejemplo, los adyuvantes se pueden ser reconocidos por los sistemas inmunitarios innatos y, por ejemplo, pueden provocar una respuesta inmunitaria innata. Los “adyuvantes” tfpicamente no provocan una respuesta inmunitaria adaptiva. A este respecto, los “adyuvantes” no califican como antfgenos. Su modo de accion es distinto de los efectos desencadenados por antfgenos que resultan en una respuesta inmunitaria adaptiva.
Antfgeno: En el contexto de la presente invencion, “antfgeno” se refiere tfpicamente a una sustancia que puede ser reconocida por el sistema inmunitario, preferiblemente por el sistema inmunitario adaptativo, y es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria especffica de antfgeno, por ejemplo por la formacion de anticuerpos y/o celulas T especfficas de antfgeno como parte de una respuesta inmunitaria adaptiva. Tfpicamente, un antfgeno puede ser o puede comprender un peptido o protefna que comprende al menos un epftopo y que se puede presentar por la MHC a celulas T. En el sentido de la presente invencion, un antfgeno puede ser el producto de traduccion de una molecula de acido nucleico provista, preferentemente un ARNm tal como se define aquf. En este contexto, se entienden tambien como antfgenos fragmentos, variantes y derivados de peptidos o protefnas que comprende al menos un epftopo. En el contexto de la presente invencion, los antfgeno tumorales y patogenicos como se definen aquf son particularmente preferentes.
Molecula artificial de acido nucleico: Una molecula artificial de acido nucleico se puede entender tfpicamente como una molecula de acido nucleico, por ejemplo un ADN o un ARN, que no es de origen natural. En otras palabras, una molecula artificial de acido nucleico se puede entender como una molecula de acido nucleico no natural. Tal molecula de acido nucleico puede ser no natural debido a su secuencia individual (que no se presenta naturalmente) y/o debido a otras modificaciones, por ejemplo modificaciones estructurales de nucleotidos que no se presentan naturalmente. Una molecula artificial de acido nucleico puede ser una molecula de ADN, una molecula de ARN o una molecula hfbrida que comprende porciones de ADN y ARN. Tfpicamente, las moleculas artificiales de acido nucleico se pueden disenar y/o generar por metodos de ingenierfa genetica en correspondencia con una secuencia artificial deseada de nucleotidos (secuencia heterologa). En este contexto una secuencia artificial es usualmente una secuencia que no puede presentarse naturalmente, es decir difiere de la secuencia de tipo natural en al menos un nucleotido. El termino “tipo natural” se puede entender como una secuencia presente en la naturaleza. Ademas, el termino “moleculas de acido nucleico artificial” no se restringe a “una molecula individual” sino, tfpicamente, se entiende que comprende un conjunto de moleculas identicas. Por consiguiente, se puede referir a una pluralidad de moleculas identicas contenidas en una alfcuota.
ARN bicistronico, ARN multicistronico: Un ARN bicistronico o multicistronico es tfpicamente un ARN, preferentetemente un ARNm, que puede tener tfpicamente dos (bicistronico) o mas (multicistronico) marcos de lectura abiertos (ORF). Un marco de lectura abierto en este contexto es una secuencia de codones que es traducible en un peptido o protefna.
Portador/portador polimerico: Un portador en el contexto de la invencion puede ser tfpicamente un compuesto que facilita el transporte y/o la formacion de un complejo con otro compuesto (carga). Un portador polimerico es tfpicamente un portador que se forma en un polfmero. Un portador se puede asociar a su carga por interaccion covalente o no covalente. Un portador puede transportar acidos nucleicos, por ejemplo ARN o ADN, a las celulas diana. El portador puede - para algunas realizaciones - ser un componente cationico.
Componente cationico: El termino “componente cationico” se refiere tfpicamente a una molecula cargada que esta cargada positivamente (cation) a un pH tfpico de 1 a 9, de manera preferente un pH de o inferior a 9 (por ejemplo de 5 a 9), de o por debajo de 8 (por ejemplo de 5 a 8), de o por debajo de 7 (por ejemplo de 5 a 7), de manera preferente a pH fisiologico, por ejemplo de 7,3 a 7,4. Por consiguiente, un componente cationico puede ser cualquier compuesto o polfmero cargado positivamente, de manera preferente un peptido o protefna cationico cargado positivamente bajo condiciones fisiologicas, en particular bajo condiciones fisiologicas in vivo. Un “peptido o protema cationica” puede contener al menos un aminoacido cargado positivamente o mas de un aminoacido cargado positivamente, por ejemplo seleccionado de Arg, His, Lys u Orn. Asf, los componentes “policationicos”, que tienen mas de una carga positiva bajo las condiciones dadas, tambien estan dentro del alcance.
Cap 5': Cap 5' es una entidad, tfpicamente una entidad de nucleotidos modificada, que generalmente “cap” el extremo 5' de un ARNm maduro. Un cap 5' se puede formar tfpicamente por un nucleotido modificado, en particular por un derivado de un nucleotido de guanina. De manera preferente, cap 5' se une al extremo 5' mediante un enlace 5'-5'-trifosfato. Un cap 5' puede estar metilado, por ejemplo m7GpppN, donde N es el nucleotido 5' termin al del acido nucleico que lleva el cap 5', tfpicamente el extremo 5' de un ARN. Ejemplos adicionales de estructuras cap 5' incluyen glicerilo, residuo no basico de desoxi invertido (porcion), nucleotido 4',5'- metileno, nucleotido de l-(beta-D-eritrofuranosilo), nucleotido 4'-tio, nucleotido carbocfclico, nucleotido de 1,5-anidrohexitol, L-nucleotidos, alfa-nucleotido, nucleotido base modificado, nucleotido treopentofuranosilo, nucleotido 3',4'-seco acfclico, nucleotido 3,4-dihidroxibutil-acfclico, nucleotido 3,5-dihidroxipentil-adclico, porcion de nucleotido 3'-3'-invertido, porcion abasica 3'-3'-invertida, porcion de nucleotido 3',2'-invertido, porcion abasica 3',2'-invertida, fosfato de 1,4-butanodiol, 3'-fosforamidato, hexilfoshato, fosfato de aminohexilo, 3'-fosfato, 3'-fosforotioato, fosforoditioato, o porcion de metilfosfonato puente o no puente.
Inmunidad celular/respuesta inmunitaria celular: La inmunidad celular se relaciona tfpicamente con la activacion de macrofagos, celulas asesinas naturales (NK), linfocitos T citotoxicos especfficos de antfgeno y la liberacion de diversas citoquinas en respuesta a un antfgeno. En terminos mas generales, la inmunidad celular no se basa en anticuerpos, sino en la activacion de celulas del sistema inmunitario. Tfpicamente, una respuesta inmunitaria celular se puede caracterizar por ejemplo activando linfocitos T citotoxicos especfficos de antfgeno que son capaces de inducir la apoptosis celular, por ejemplo en celulas inmunitarias especfficas como celulas dendrfticas u otras celulas, que detectan epftopos de antfgenos extranos en su superficie. Tales celulas se pueden infectar por virus o con bacterias intracelulares o con celulas de cancer que detectan antfgenos tumorales. Otras caracterfsticas pueden ser la activacion de macrofagos y celulas asesinas naturales, permitiendoles destruir patogenos y la estimulacion de celulas para secretar una variedad de citoquinas que influyen en la funcion de otras celulas implicadas en respuestas inmunitarias adaptativas e innatas.
ADN: ADN es la abreviatura usual para acido desoxirribonucleico. Es una molecula de acido nucleico, es decir un polfmero consistente en nucleotidos. Estos nucleotidos son normalmente monomeros de desoxiadenosin-monofosfato, desoxitimidin-monofosfato, desoxiguanosin-monofosfato y desoxicitidin-monofosfato que son a su vez estan compuestos por una porcion de azucar (desoxirribosa), una porcion base y una porcion fosfato, y se polimerizan en un esqueleto principal caracterfstico. El esqueleto de principal esta formado tfpicamente por uniones fosfodiester entre la porcion de azucar del nucleotido, es decir la desoxirribosa, de una primera porcion fosfato de un segundo monomero adyacente. El orden especffico de los monomeros, es decir el orden de las bases ligadas a la cadena principal azucar/fosfato, se denomina secuencia de ADN. El ADN puede ser mono- o bi-catenario. En la forma de doble hebra, los nucleotidos de la primera hebra se hibridan tfpicamente con los nucleotidos de la segunda hebra, por ejemplo por un apareamiento de bases A/T y G/C.
Epftopo: Los epftopos (tambien llamados 'determinates de antfgeno') pueden distinguirse en epftopos de celulas T y epftopos de celulas B. Los epftopos de celulas T o partes de las protefnas en el contexto de la presente invencion pueden comprender fragmentos que, preferiblemente, tienen una longitud de alrededor de 6 a alrededor de 20 o aun mas aminoacidos, por ejemplo fragmentos tal como se procesan y presentan por moleculas de clase I MHC, preferiblemente con una longitud de alrededor de 8 a alrededor de 10 aminoacidos, por ejemplo 8, 9, o 10, (o aun 11, o 12 aminoacidos), o fragmentos tales como se procesan y presentan por moleculas de clase II MHC, preferiblemente de una longitud de alrededor de 13 o mas aminoacidos, por ejemplo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o aun mas aminoacidos, donde estos fragmentos se pueden seleccionar de cualquier parte de la secuencia de aminoacidos. Estos fragmentos son tfpicamente reconocidos por celulas T en forma de un complejo que consiste en el fragmento de peptido y una molecula MHC, asf, los fragmentos tfpicamente no son reconocidos en su forma nativa. Los epftopos de celulas B son tfpicamente fragmentos ubicados en la superficie externa de protefnas (nativas) o antfgenos de peptido como se define aquf, preferiblemente de 5 a 15 aminoacidos, mas preferiblemente de 5 a 12 aminoacidos, aun mas preferiblemente de 6 a 9 aminoacidos, que pueden ser reconocidos por anticuerpos, esto es en su forma nativa.
Tales epftopos de protefnas o peptidos ademas se pueden seleccionar de cualquiera de las variantes aquf mencionadas de tales protefnas o peptidos. En este contexto, los determinates antigenicos pueden ser epftopos conformacionales y discontinuos que se componen de segmentos de las protefnas o peptidos tal como se definen aquf que son discontinuos en la secuencia de aminoacidos de las protefnas o peptidos como se definen aquf, pero se reunen en la estructura tridimensional, o epftopos continuos o lineales que se componen de una unica cadena de polipeptidos.
Fragmento de una secuencia: Un fragmento de una secuencia es tfpicamente una parte mas corta de una secuencia de longitud completa de, por ejemplo, una secuencia de acido nucleico o de aminoacidos. En consecuencia, un fragmento de una secuencia tfpicamente consiste en una secuencia que es identica al tramo o tramos correspondientes dentro de la secuencia de longitud completa. Un fragmento preferente de una secuencia en el contexto de la presente invencion consiste en un tramo continuo de entidades, como nucleotidos o aminoacidos, que corresponden a un tramo continuo de entidades en la molecula de la que se deriva el fragmento, lo que representa al menos el 5%. 10%, 20%, preferentemente al menos el 30%, con mas preferencia al menos el 40%, con especial preferencia al menos el 50%, incluso con mayor preferencia al menos el 60%, con particular preferencia al menos el 70% y con total preferencial al menos el 80% de la molecula total (esto es longitud completa) de la cual se deriva el fragmento.
Modificado en G/C: Un acido nucleico modificado en G/C puede ser tfpicamente un acido nucleico, preferentemente una molecula artificial de acido nucleico como se define aquf, basada en una secuencia de tipo natural modificada, que comprende un numero preferentemente incrementado de nucleotidos guanosina y/o citosina en comparacion con la secuencia de tipo natural. Tal numero incrementado se puede generar por sustitucion de codones que contienen nucleotidos de adenosina o timidina por codones que contienen nucleotidos de guanosina o citosina. Si el contenido de G/C enriquecido aparece en una region de codificacion de ADN o ARN, hace uso de la degeneracion del codigo genetico. Por consiguiente, las sustituciones del codon preferentemente no alteran los residuos de aminoacidos codificados, sino incrementan exclusivamente el contenido de G/C de la molecula de acido nucleico.
Terapia Genica: La terapia genica se puede entender como un tratamiento de elementos corporales o aislados del cuerpo de un paciente, por ejemplo tejidos/celulas aisladas, con acidos nucleicos que codifican un peptido o protefna. Tfpicamente puede comprender al menos una de las etapas de a) administrar un acido nucleico, de manera preferente una molecula artificial de acido nucleico como se define aquf, directamente al paciente - por cualquier via de administracion - o in vitro a celulas/tejidos aislados del paciente, lo cual tiene como resultado la transfeccion de las celulas del paciente ya sea in vivo/ex vivo o in vitro; b) la transcripcion y/o traduccion de la molecula de acido nucleico introducida; y opcionalmente c) la re-administracion de las celulas transfectadas aisladas al paciente si el acido nucleico no se ha administrado directamente al mismo.
Vacunacion genetica: La vacunacion genetica tfpicamente se puede entender como la vacunacion por administracion de una molecula de acido nucleico que codifica un antfgeno o un inmunogeno o fragmentos de los mismos. La molecula de acido nucleico se puede administrar a un cuerpo del sujeto o a celulas aisladas de un sujeto. Tras la transfeccion de ciertas celulas del cuerpo o tras la transfeccion de las celulas aisladas, el antfgeno o inmunogeno puede ser expresado por aquellas celulas y posteriormente ser presentado al sistema inmunitario, provocando una respuesta inmunitaria adaptiva, esto es especffica de antfgeno. En consecuencia, la vacunacion genetica tfpicamente comprende al menos una de las etapas de a) administrar un acido nucleico, preferiblemente un ARN (aislado) como se define aquf, a un sujeto, preferiblemente un paciente, o a celulas aisladas de un sujeto, preferiblemente de un paciente, que usualmente resulta en la transfeccion de las celulas del sujeto ya sea in vivo o in vitro; b) transcripcion y/o traduccion de la molecula de acido nucleico introducida; y opcionalmente c) re-administracion de celulas aisladas transfectadas al sujeto, preferiblemente al paciente, si el acido nucleico no se ha administrado directamente al paciente.
Secuencia heterologa: Tfpicamente se entiende que dos secuencias son “heterologas” cuando no se derivan del mismo gen, es decir, aunque las secuencias heterologas se pueden derivar del mismo organismo, no se presentan naturalmente (en la naturaleza) en la misma molecula de acido nucleico, tal como en el mismo ARNm.
Inmunidad humoral/respuesta inmunitaria humoral: La inmunidad humoral se refiere tfpicamente a la produccion de anticuerpos y opcionalmente a procesos accesorios que acompanan q la produccion de anticuerpos. Una respuesta inmunitaria humoral se puede caracterizar tfpicamente, por ejemplo, por la activacion de Th2, la produccion de citoquinas, formacion central germinal y cambio de isotipo, maduracion por afinidad y generacion de celulas de memoria. La inmunidad humoral tambien se puede referir tfpicamente a funciones efectoras de los anticuerpos, incluyendo la naturalizacion de patogenos y toxinas, activacion de complemento clasica y la promocion de opsonina de fagocitosis y eliminacion de patogenos.
Inmunogeno: En el contexto de la presente invencion, un inmunogeno se puede entender tfpicamente como un compuesto capaz de estimular una respuesta inmunitaria. Preferentemente, un inmunogeno es un peptido, polipeptido o protefna. En una realizacion particularmente preferente, un inmunogeno en el sentido de la presente invencion es el producto de la traduccion de una molecula de acido nucleico proporcionada, preferentemente una molecula artificial de acido nucleico como se define aquf. Tfpicamente un inmunogeno induce al menos una respuesta inmunitaria adaptativa.
Composicion inmunoestimuladora: En el contexto de la invencion, una composicion inmunoestimuladora se puede entender ffpicamente como una composicion que contiene al menos un componente capaz de inducir una respuesta inmunitaria o del cual se deriva un componente que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. Tal respuesta inmunitaria puede ser preferentemente una respuesta inmunitaria innata o una combinacion de una respuesta inmunitaria adaptativa e innata. De manera preferente, una composicion inmunoestimuladora en el contexto de la invencion contiene al menos una molecula artificial de acido nucleico, en especial un ARN, por ejemplo una molecula de ARNm. El componente inmunoestimulador, tal como el ARNm, se puede complejar con un portador adecuado. Asf, la composicion inmunoestimuladora puede comprender un complejo ARNm/portador. Adicionalmente, la composicion inmunoestimuladora puede comprender un adyuvante y/o un vehffculo adecuado para el componente inmunoestimulador, tal como el ARNm.
Respuesta inmunitaria: Una respuesta inmunitaria puede ser ffpicamente una reaccion espedfica del sistema inmunitario adaptativo a un anffgeno particular (llamada asf respuesta inmunitaria espedfica o adaptativa) o una reaccion no espedfica del sistema inmunitario innato (llamada entonces respuesta inmunitaria no espedfica o innata), o una combinacion de las mismas.
Sistema inmunitario: El sistema inmunitario puede proteger a los organismos de infecciones. Si un patogeno tiene exito traspasando una barrera ffsica de un organismo y entra en este, el sistema inmunitario innato proporciona una respuesta inmediata, pero no espedfica. Si los patogenos evaden esta respuesta innata, los vertebrados tienen una segunda capa de proteccion, el sistema inmunitario adaptativo. Aqm, el sistema inmunitario adapta su respuesta durante una infeccion para mejorar su reconocimiento del patogeno. Esta respuesta mejorada se mantiene asf despues de que el patogeno se ha eliminado en forma de una memoria inmunologica y permite al sistema inmunitario adaptativo desarrollar ataques mas rapidos y fuertes cada vez que se encuentra este patogeno. De acuerdo con esto, el sistema inmunitario comprende el sistema inmunitario innato y el adaptativo. Cada una de estas dos partes ffpicamente contiene los denominados componentes humorales y celulares.
ARN inmunoestimulante: Un ARN inmunoestimulador (isARN) en el contexto de la invencion ffpicamente puede ser un ARN que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria innata. Este usualmente no tiene un marco de lectura abierto y, por tanto, no proporciona un peptido-anffgeno o inmunogeno, pero provoca una respuesta inmunitaria innata, por ejemplo por enlace a una clase espedfica de receptor tipo Toll (TLR) u otros receptores adecuados. Sin embargo, por supuesto tambien los ARNm que tienen un marco de lectura abierto y que codifican para un peptido/protema puede inducir una respuesta inmunitaria innata y, por tanto, pueden ser ARN inmunoestimuladores.
Sistema inmunitario innato: El sistema inmunitario innato, tambien conocido como sistema inmunitario no espedfico (o inespedfico), ffpicamente comprende celulas y mecanismos que defienden al huesped de la infeccion por otros organismos de manera no espedfica. Esto significa que las celulas del sistema innato pueden reconocer y responder a patogenos de forma generica, pero, a diferencia del sistema inmunitario adaptativo, no confiere inmunidad de larga duracion o de proteccion al huesped. El sistema inmunitario innato puede ser, por ejemplo, activado por ligandos de receptores tipo Toll (TLRs) u otras sustancias auxiliares, como lipopolisacaridos, TNF-alfa, ligando CD40, o citoquinas, monoquinas, linfoquinas, interleuquinas o quimiocinas, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta, TNF-alfa, factores de crecimiento y hGH, un ligando de receptor tipo Toll humano TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, un ligando de receptor tipo Toll de murino TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13, un ligando de un receptor tipo NOD, un ligando de un receptor tipo RIG-I, un acido nucleico inmunoestimulador, un ARN inmunoestimulador (isARN), un CpG-ADN, un agente antibacteriano o un agente anti-viral. La composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion puede comprender una o mas de tales sustancias. Tfpicamente, una respuesta del sistema inmunitario innato incluye celulas inmunitarias de reclutamiento a sitios de infeccion mediante la produccion de factores qrnmicos, incluyendo mediadores qrnmicos especializados denominados citoquinas; activacion de la cascada del complemento; identificacion y eliminacion de sustancias extranas presentes en organos, tejidos, sangre y linfa por globulos blancos especializados; activacion del sistema inmunitario adaptativo; y/o actuando como barrera ffsica y qrnmica a agentes infecciosos.
Sitio de clonacion: Un sitio de clonacion se entiende ffpicamente como un segmento de una molecula de acido nucleico adecuada para la insercion de una secuencia de acidos nucleicos, por ejemplo una secuencia de acidos nucleicos que comprende un marco de lectura abierto. La insercion se puede llevar a cabo por cualquier metodo biologico molecular conocido por el experto en la tecnica, por ejemplo por restriccion y ligacion. Un sitio de clonacion comprende ffpicamente uno o mas sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion (sitios de restriccion). Estos sitios de una o mas restricciones pueden ser reconocidos por las enzimas de restriccion que escinden el ADN en estos sitios. Un sitio de clonacion que comprende mas de un sitio de restriccion tambien puede denominarse sitio de clonacion multiple (MCS) o poliligador.
Molecula de acido nucleico: Una molecula de acidos nucleico es una molecula que comprende, preferentemente que consiste en, componentes de acido nucleico. El termino molecula de acido nucleico se refiere preferentemente a moleculas de ADN o ARN. Se utiliza preferentemente como sinonimo del termino “polinucleotido”. De manera preferente, una molecula de acido nucleico es un polfmero que comprende o que consiste en monomeros de nucleotidos que se unen covalentemente entre si por enlaces fosfodiester a un esqueleto azucar/fosfato. El termino “molecula de acido nucleico” tambien abarca moleculas de acido nucleico modificadas, tales como moleculas de ADN o ARN modificadas con base o modificadas con azucar o modificadas en su esqueleto.
Marco de lectura abierto: Un marco de lectura abierto (ORF) en el contexto de la invencion tfpicamente puede ser una secuencia de diversos tripletes de nucleotidos que se pueden traducir en un peptido o protefna. Un marco de lectura abierto preferiblemente contiene un codon de inicio, esto es una combinacion de tres nucleotidos subsiguientes que codifican usualmente para el aminoacido metionina (ATG), en su extremo 5'- y una region posterior que usualmente tiene una longitud multiplo de 3 nucleotidos. Un ORF preferiblemente esta terminado por un codon de parada (por ejemplo TAA, TAG, TGA). Tfpicamente, este es unicamente codon de parada del marco de lectura abierto. Por tanto, un marco de lectura abierto en el contexto de la presente invencion es preferiblemente una secuencia de nucleotidos que consiste en un numero de nucleotidos que se pueden dividir entre tres, que inician con un codon de inicio (por ejemplo ATG) y que preferiblemente terminan con un codon de parada (por ejemplo TAA, TGA, o TAG). El marco de lectura abierto se puede aislar o se puede incorporar en una secuencia de acido nucleico mas larga, por ejemplo en un vector o un ARNm. Un marco de lectura abierto tambien se puede denominar “region de codificacion de protema” o “region de codificacion”.
Peptido: Un peptido o polipeptido es tfpicamente un polfmero de monomeros de aminoacidos unidos por enlaces peptfdicos. Contiene tfpicamente menos de 50 unidades monomericas. No obstante, el termino peptido no excluye moleculas que tienen mas de 50 unidades monomericas. Los peptidos largos tambien se denominan polipeptidos, que tienen tfpicamente entre 50 y 600 unidades monomericas.
Cantidad farmaceuticamente efectiva: Una cantidad farmaceuticamente efectiva en el contexto de la invencion se entiende tfpicamente como una cantidad que es suficiente para inducir un efecto farmaceutico, tal como una respuesta inmunitaria, que altera un nivel patologico de un peptido o protefna expresado, o sustituye un producto carente de gen, por ejemplo, en el caso de una situacion patologica.
Protefna: Una protefna comprende tfpicamente uno o mas peptidos o polipeptidos. Una protefna tfpicamente esta plegada en una forma tridimensional, que puede ser necesaria para que la protefna ejerza su funcion biologica.
Secuencia Poli(A): Una secuencia poli(A), tambien llamada cola poli(A) o cola 3'-poli(A), se entiende tfpicamente como una secuencia de nucleotidos adenina, por ejemplo de hasta 400 nucleotidos de adenina, por ejemplo de aproximadamente 20 a aproximadamente 400, de manera preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 400, de manera mas preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 300, aun de manera mas preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 250, de manera mucho mas preferente de aproximadamente 60 a aproximadamente 250 nucleotidos de adenina. La secuencia poli(A) se situa tfpicamente en el extremo 3' de un ARNm. En el contexto de la presente invencion, una secuencia poli(A) se puede situar dentro de un ARNm o de cualquier otra molecula de acido nucleico, por ejemplo un vector, por ejemplo un vector que sirve como plantilla para la generacion de un ARN, preferentemente un ARNm, por ejemplo por transcripcion del vector.
Poliadenilacion: La poliadenilacion se entiende tfpicamente como la adicion de una secuencia poli(A) a una secuencia de acido nucleico, tal como una molecula de ARN, por ejemplo un ARNm prematuro. La poliadenilacion se puede inducir por una llamada senal de poliadenilacion. Esta senal se situa preferentemente dentro de un tramo de nucleotidos en el extremo 3' de una molecula de acido nucleico, tal como una molecula de ARN, que se poliadenila. Una senal de poliadenilacion comprende tfpicamente un hexamero que consiste en adenina y nucleotidos uracilo/timina, preferentemente la secuencia de hexamero AAUAAA. Otras secuencias, de manera preferente secuencias de hexamero, tambien son concebibles. La poliadenilacion aparece tfpicamente durante el procesamiento de un pre-ARNm (tambien llamado ARNm prematuro). Tfpicamente, la maduracion del ARN (de pre-ARNm a ARNm maduro) comprende la etapa de poliadenilacion.
Sitio de restriccion: Un sitio de restriccion, tambien llamado “sitio de reconocimiento de enzimas de restriccion”, es una secuencia de nucleotidos reconocida por la enzima de restriccion. Un sitio de restriccion es tfpicamente una secuencia de nucleotidos, preferentemente palindromicos corta, por ejemplo una secuencia que comprende de 4 a 8 nucleotidos. Preferentemente, un sitio de restriccion es reconocido por una enzima de restriccion. La enzima de restriccion escinde tfpicamente una secuencia de nucleotidos que comprende un sitio de restriccion en este sitio. En una secuencia de nucleotidos de doble hebra, tal como una secuencia de ADN de doble hebra, la enzima de restriccion corta tfpicamente ambas hebras de la secuencia de nucleotidos.
ARN, ARNm: ARN es la abreviatura usual para el acido ribonucleico. Es una molecula de acido nucleico, es decir un polfmero que consiste en nucleotidos. Estos nucleotidos son usualmente monomeros de adenosina-monofosfato, uridina-monofosfato, guanosina-monofosfato y citidina-monofosfato que se unen entre si a lo largo de un esqueleto principal. El esqueleto principal esta formado por la union fosfodiester entre el azucar, es decir ribosa, de una primera porcion de fosfato y de un segundo monomero adyacente. La sucesion especffica de monomeros se denomina secuencia de ARN. Usualmente el ARN puede ser obtenible por la transcripcion de una secuencia de ADN, por ejemplo dentro de una celula. En las celulas eucarioticas, la transcripcion se lleva a cabo tfpicamente dentro del nucleo de la mitocondria. In vivo, la transcripcion del ADN da por resultado normalmente el llamado ARN prematuro, que tiene que ser procesado en el llamado ARN mensajero, usualmente abreviado como ARNm. El procesamiento del ARN prematuro, por ejemplo en organismos eucarioticos, comprende una variedad de diferentes modificaciones postranscripcionales, como empalme, cap 5', poliadenilacion, exportacion del nucleo o la mitocondria y similares. La suma de estos procesos tambien se denomina maduracion del ARN. El ARN mensajero maduro proporciona usualmente la secuencia de nucleotidos que se puede traducir en una secuencia de aminoacidos de un peptido o protefna particular. Tfpicamente, un ARNm maduro comprende un cap 5', 5'UTR, un marco de lectura abierto, una 3'UTR y una secuencia poli(A). Ademas del ARN mensajero, existen varios tipos de ARN no codificantes que pueden estar implicados en la regulacion de la transcripcion y/o traduccion.
Secuencia de una molecula de acido nucleico: La secuencia de una molecula de acido nucleico se entiende tfpicamente como el orden particular e individual, es decir la sucesion de sus nucleotidos. La secuencia de una protefna o peptido se entiende tfpicamente como el orden, es decir la sucesion de sus aminoacidos.
Identidad de secuencia: Dos o mas secuencias son identicas si tienen la misma longitud y orden de nucleotidos o aminoacidos. El porcentaje de identidad tfpicamente describe el grado en que dos secuencias son identicas, esto es tfpicamente describe el porcentaje de nucleotidos que corresponden en su posicion de secuencia con nucleotidos identicos de una secuencia de referencia. Para determinar el grado de identidad, las secuencias a comparar se consideran de la misma longitud, esto es la longitud de la secuencia mas larga de las secuencias a comparar. Esto significa que una primera secuencia que consiste en 8 nucleotidos es un 80% identica a una segunda secuencia que consiste en 10 nucleotidos que comprende la primera secuencia. En otras palabras, en el contexto de la presente invencion, la identidad de secuencia preferiblemente se refiere al porcentaje de nucleotidos de una secuencia que tiene la misma posicion en dos o mas secuencias de la misma longitud. Los espacios son usualmente considerados como posiciones no identicas, independientemente de su posicion actual en una alineacion.
Molecula de acido nucleico estabilizada: Una molecula de acido nucleico estabilizada es una molecula de acido nucleico, preferentemente una molecula de ADN o ARN, que se modifica de forma que es mas estable a la desintegracion o degradacion, por ejemplo por factores ambientales o digestion enzimatica, tal como por degradacion con exo o endonucleasas, que la molecula de acido nucleico sin la modificacion. De manera preferente, una molecula de acido nucleico estabilizado en el contexto de la presente invencion se estabiliza en una celula, tal como una celula procariotica o eucariotica, de manera preferente en una celula de mamffero, tal como una celula humana. El efecto de estabilizacion tambien se puede ejercer fuera de las celulas, por ejemplo con una solucion tampon, etc., por ejemplo en un proceso de fabricacion para una composicion farmaceutica que comprende la molecula de acido nucleico estabilizada.
Transfeccion: El termino 'transfeccion' se refiere a la introduccion de moleculas de acido nucleico, tal como moleculas de ADN o ARN (por ejemplo ARNm), en celulas, preferiblemente en celulas eucariotas. En el contexto de la presente invencion, el termino 'transfeccion' abarca cualquier metodo conocido por el experto para introducir moleculas de acido nucleico en las celulas, preferiblemente en celulas eucariotas, tal como en celulas de mamffero. Tales metodos abarcan, por ejemplo, electroporacion, lipofeccion, por ejemplo basado en lfpidos cationicos y/o liposomas, precipitacion de fosfato de calcio, transfeccion basada en nanopartfculas, transfeccion basada en virus o transfeccion basada en polfmeros cationicos, tal como DEAE-dextrano o polietilenimina, etc. De manera preferente, la introduccion no es viral.
Vacuna: Una vacuna se entiende tfpicamente como un material profilactico o terapeutico que proporciona al menos un antfgeno, preferiblemente un inmunogeno. El antfgeno o inmunogeno se puede derivar de cualquier material adecuado para la vacunacion. Por ejemplo, el antfgeno o inmunogeno se puede derivar de un patogeno, tal como de bacterias o partfculas virales, etc., o de un tumor o tejido canceroso. El antfgeno o inmunogeno estimula el sistema inmunitario adaptativo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmunitaria adaptiva.
Vector: El termino “vector” se refiere a una molecula de acido nucleico, de manera preferente a una molecula artificial de acido nucleico. Un vector en el contexto de la presente invencion es adecuado para incorporar o alojar una secuencia de acido nucleico deseada, tal como una secuencia de acido nucleico que comprende un marco de lectura abierto. Tales vectores pueden ser vectores de almacenamiento, vectores de expresion, vectores de clonacion, vectores de transferencia, etc. Un vector de almacenamiento es un vector que permite el almacenamiento conveniente de una molecula de acido nucleico, por ejemplo, de una molecula de ARNm. Asf, el vector puede comprender una secuencia que corresponde, por ejemplo, a una secuencia de ARNm deseada o a una parte de la misma, tal como una secuencia que corresponde al marco de lectura abierto y la 3'UTR de un ARNm. Se puede emplear un vector de expresion para la produccion de productos de expresion tales como ARN, por ejemplo ARNm, o peptidos, polipeptidos o protefnas. Por ejemplo, un vector de expresion puede comprender secuencias necesarias para la transcripcion de un tramo de secuencia del vector, tal como una secuencia promotora, por ejemplo una secuencia promotora de ARN. Un vector de clonacion es tipicamente un vector que contiene un sitio de clonacion, que se puede utilizar para incorporar secuencias de acidos nucleicos en el vector. Un vector de clonacion puede ser, por ejemplo, un vector plasmido o bacteriofago. Un vector de transferencia puede ser un vector adecuado para transferir moleculas de acido nucleico en celulas u organismos, por ejemplo vectores virales. Un vector en el contexto de la presente invencion puede ser, por ejemplo, un vector de ARN o un vector de ADN. Preferentemente, un vector es una molecula de ADN. De manera preferente un vector en el sentido de la presente solicitud comprende un sitio de clonacion, un marcador de seleccion, tal como un factor de resistencia a antibioticos, y una secuencia adecuada para multiplicacion del vector, tal como un origen de replicacion. De manera preferente, un vector en el contexto de la presente solicitud es un vector de plasmido.
Vehiculo: Un vehmulo se entiende tfpicamente como un material adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto, tal como un compuesto farmaceuticamente activo. Por ejemplo, puede ser un lfquido fisiologicamente aceptable adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto farmaceuticamente activo.
Region 3' no traducida (3'UTR): En general el termino 3'UTR se refiere a una parte de la molecula de acido nucleico artificial que se localiza 3' (es decir aguas abajo) de un marco de lectura abierto y que no es traducida en la protema. Tfpicamente, una 3'UTR es la parte de un ARNm entre la region de codificacion de la protema (marco de lectura abierto (ORF) o secuencia codificadora (CDS)) y la secuencia poli(A) del ARNm. En el contexto de la invencion, el termino 3'UTR tambien puede comprender elementos que no estan codificados en la plantilla, a partir de los cuales se transcribe un ARN, pero que se anaden despues de la transcripcion durante la maduracion, por ejemplo una secuencia poli (A). Una 3'UTR del ARNm no se traduce en una secuencia de aminoacidos. Una 3'UTR del ARNm no se traduce en una secuencia de aminoacidos. La secuencia 3'UTR es codificada generalmente por el gen que se transcribe en el ARNm respectivo durante el proceso de expresion genica. La secuencia genomica primero se transcribe en el ARNm premaduro, que comprende intrones opcionales. El ARNm pre-maduro luego se procesa adicionalmente en ARNm maduro en un proceso de maduracion. Este proceso de maduracion comprende las etapas de cap 5', empalme del ARNm premaduro para escindir intrones opcionales y modificaciones del extremo 3', tal como poliadenilacion del extremo 3' d el ARNm pre-maduro y escisiones de endo o exonucleasa opcionales, etc. En el contexto de la presente invencion, una 3'UTR corresponde a la secuencia de un ARNm maduro que se situa entre el codon de parada de la region codificante de la protema, preferentemente inmediatamente 3' al codon de parada de la region que codifica a la protema, y la secuencia poli(A) del ARNm. El termino “corresponde a” significa que la secuencia 3'UTR puede ser una secuencia de ARN, tal como en la secuencia de ARNm, utilizada para definir la secuencia 3'UTR, o una secuencia de ADN que corresponde a tal secuencia de ARN. En el contexto de la presente invencion, el termino 3'UTR de un gen”, tal como “3'UTR de un gen de protema ribosomica”, es la secuencia que corresponde a la 3'UTR del ARNm maduro derivado de este gen, es decir el ARNm obtenido por transcripcion del gen y la maduracion del ARNm pre-maduro. El termino “3'UTR de un gen” abarca la secuencia de ADN y la secuencia de ARN (ambas hebras sentido y antisentido y tanto maduro como inmaduro) de la 3'UTR.
Region 5' no traducida (5'UTR): Una 5'UTR se entiende tfpicamente como una seccion particular de un ARN mensajero (ARNm). Se situa 5' del marco de lectura abierto del ARNm. Tfpicamente, la 5'UTR comienza con el sitio de inicio de transcripcion y termina un nucleotido antes del codon de inicio del marco de lectura abierto. La 5'UTR puede comprender elementos para controlar la expresion genica, tambien llamados elementos reguladores. Tales elementos reguladores pueden ser, por ejemplo, sitios de union ribosomicos. La 5'UTR se puede modificar postranscripcionalmente, por ejemplo por la adicion de cap 5'. En el contexto de la presente invencion, una 5'UTR corresponde a la secuencia de un ARNm maduro que se situa entre cap 5' y el codon de inicio. Preferentemente, la 5'UTR corresponde a la secuencia que se extiende de un nucleotido situado 3' a la cap 5', de manera preferente el nucleotido situado inmediatamente 3' a cap 5', a un nucleotido situado 5' al codon de inicio de la region de codificacion de protema, de manera preferente al nucleotido situado inmediatamente 5' al codon de inicio de la region de codificacion de protema. El nucleotido situado inmediatamente 3' a la cap 5' de un ARNm maduro corresponde tfpicamente al sitio de inicio transcripcional. El termino “corresponde a” significa que la secuencia 5'UTR puede ser una secuencia de ARN, tal como en la secuencia ARNm utilizada para definir la secuencia 5'UTR, o una secuencia de ADN que corresponde a tal secuencia de ARN. En el contexto de la presente invencion, el termino “5'UTR de un gen” es la secuencia que corresponde a la 5'UTR del ARNm maduro derivado de este gen, es decir el ARNm obtenido por transcripcion del gen y maduracion del ARNm pre-maduro. El termino “5'UTR de un gen” abarca la secuencia de a Dn y la secuencia de ARN de la 5'UTR. En las realizaciones de la invencion, tal 5'-UTR puede proporcionarse 5'-terminal al ORF. Su longitud tfpicamente es inferior a 500, 400, 300, 250 o menos de 200 nucleotidos. En otras realizaciones, su longitud puede estar en el intervalo de al menos 10, 20, 30 o 40, preferiblemente hasta 100 o 150 nucleotidos.
Tracto de Oligopirimidina 5'-Terminal (TOP): El tracto de Oligopirimidina 5'-terminal (TOP) es tfpicamente un tramo de nucleotidos de pirimidina situados en la region 5'-terminal de una molecula de acido nucleico, tal como la region 5'-terminal de ciertas moleculas de ARNm o la region 5'-terminal de una entidad funcional, por ejemplo la region transcrita de ciertos genes. Esta secuencia inicia con una citidina, que usualmente corresponde al sitio de inicio transcripcional, y sigue usualmente con un tramo de aproximadamente 3 a 30 nucleotidos de pirimidina. Por ejemplo, el t Op puede comprender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o aun mas nucleotidos. El tramo de pirimidina y con ello el 5' TOP termina en un nucleotido 5' al primer nucleotido de purina situado aguas abajo del TOP. El ARN mensajero que contiene un tracto de oligopirimidina 5'-terminal se denomina frecuentemente TOP ARNm. Por consiguiente, los genes que proporcionan tales ARN mensajeros son referidos como genes TOP. Por ejemplo, se han descubierto secuencias t Op en genes y ARNm que codifican factores de alargamiento de peptidos y protefnas ribosomicas.
Motivo TOP: En el contexto de la presente invencion, un motivo TOP es una secuencia de acidos nucleicos que corresponde a un 5'TOP como se define anteriormente. Asf, un motivo TOP en el contexto de la present e invencion preferentemente es un tramo de nucleotidos de pirimidina con una longitud de 3-30 nucleotidos. De manera preferente, el motivo TOP consiste en al menos 3 nucleotidos de pirimidina, en especial al menos 4 nucleotidos de pirimidina, de manera especialmente preferente al menos 5 nucleotidos de pirimidina y en particular al menos 6 nucleotidos, con particular preferencia al menos 7 nucleotidos, con total preferencia al menos 8 nucleotidos de pirimidina, comenzando el tramo de los nucleotidos de pirimidina preferentemente en su extremo 5' con un nucleotido de citosina. En los genes TOP y los ARNm TOP, el motivo TOP comienza preferentemente en su extremo 5' con el sitio de inicio transcripcional y termina con un nucleotido 5' al primer residuo de purina en el gen del ARNm. Un motivo TOP en el sentido de la presente invencion se situa preferentemente en el extremo 5' de una secuencia que representa una 5'UTR o en el extremo 5' de una secuencia que codifica una 5'UTR. Asf, preferentemente un tramo de 3 o mas nucleotidos de pirimidina se denomina “motivo TOP” en el sentido de la presente invencion si este tramo se situa en el extremo 5' de una secuencia respectiva, tal como la molecula artificial de acido nucleico, del elemento 5'UTR de la molecula artificial de acido nucleico o de la secuencia de acidos nucleicos que se deriva de la 5'UTR de un gen TOP como se describe aqm. En otras palabras, un tramo de 3 o mas nucleotidos de pirimidina que no esta en el extremo 5' de una 5'UTR o de un elemento 5'UTR, pero esta en cualquier lugar dentro de una 5'UTR o de un elemento 5'UTR preferentemente no es un “motivo TOP”.
Gen TOP: Los genes TOP se caracterizan tfpicamente por la presencia de un tracto de oligopirimidina 5'-terminal. Ademas, la mayorfa de genes TOP se caracterizan por una regulacion de traduccion asociada al crecimiento. Sin embargo, tambien son conocidos genes TOP con una regulacion traduccional especffica de tejido. Como se ha definido anteriormente, la 5'UTR de un gen TOP corresponde a la secuencia de una 5'UTR de un ARNm maduro derivado de un gen TOP, que se extiende preferentemente del nucleotido situado en 3' al cap 5' al nucleotido situado 5' al codon de inicio. Una 5'UTR de un gen TOP no comprende tfpicamente ninguno de los codones de inicio, preferentemente no AUG aguas arriba (uAUG) o no marcos de lectura abiertos aguas arriba (uORF). Aquf, los AUG aguas arriba y los marcos de lectura abiertos aguas arriba se entienden tfpicamente como AUG y marcos de lectura abiertos presentes en 5' del codon de inicio (AUG) del marco de lectura abierto a ser traducido. Las 5'UTR de los genes TOP son generalmente mas cortas. Las longitudes de las 5'UTRs de los genes TOP pueden variar entre 20 nucleotidos hasta 500 nucleotidos y son tfpicamente inferiores a aproximadamente 200 nucleotidos, preferentemente inferiores a aproximadamente 150 nucleotidos, de manera mas preferente inferiores a aproximadamente 100 nucleotidos. 5'UTR ilustrativas de los genes TOP en el sentido de la presente invencion son las secuencias de acidos nucleicos que se extienden del nucleotido en posicion 5 al nucleotido situado inmediatamente 5' al codon de inicio (por ejemplo a Tg ) en las secuencias de acuerdo con las SEQ ID No. 1-1363 de la solicitud de patente WO2013/143700. En este contexto, un fragmento particularmente preferido de un 5'UTR de un gen TOP es un 5'UTR de un gen TOP que carece del motivo 5'TOP. El termino “5'UTR de un gen TOP” o “5'TOP UTR” se refiere preferiblemente a la 5'UTR de un gen TOP natural.
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a una molecula de acido nucleico artificial que comprende a. al menos un marco de lectura abierto (ORF); y
b. al menos un elemento de region 3'-no traducida (elemento 3'UTR) que comprende una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de una protefna ribosomica o de una variante de la 3'UTR de un gen de una protefna ribosomica, donde dicha variante funcional es identica al menos en un 80% a dicha 3'UTR de un gen de una protefna ribosomica; y
c. una 5'-UTR como un elemento adicional 5'-terminal, donde la 5'-UTR es una 5' TOP-UTR que no comprende un motivo 5'-TOP.
El termino “elemento 3'UTR” se refiere a una secuencia de acido nucleico que comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de una 3'UTR o de una variante de una 3'UTR. Preferentemente un “elemento 3'-UTR” se refiere a una secuencia de acido nucleico que representa una 3'UTR de una secuencia de acido nucleico artificial, tal como un ARNm artificial, o que codifica una 3'UTR de una molecula de acido nucleico artificial. Por consiguiente, en el sentido de la presente invencion, de manera preferente, un elemento 3'UTR puede ser la 3'UTR de un ARNm, de manera preferente de un ARNm artificial, o puede ser la plantilla de transcripcion para una 3'UTR de un ARNm. Asf, un elemento 3'UTR preferentemente es una secuencia de acido nucleico que corresponde a la 3'UTR de un ARNm, de manera preferente a la 3'UTR de un ARNm artificial, tal como un ARNm obtenido por transcripcion de un constructo vector geneticamente disenado. Preferentemente, un elemento 3'UTR en el sentido de la presente invencion funciona como una 3'UTR o codifica una secuencia de nucleotidos que cumple con la funcion de una 3'UTR.
El termino “gen de protema ribosomica” tfpicamente se refiere a un gen que codifica una protema ribosomica. Tal como se usa aquf, el termino se refiere a cualquier gen de la protema ribosomica, independientemente de la especie de la que se deriva. Especfficamente, el termino se refiere a un gen de protefna ribosomica eucariota. Ademas, en el contexto de la invencion, el termino "gen de protefna ribosomica" tambien puede referirse a un gen que es similar a un gen de protefna ribosomica, ya sea estructural o funcionalmente. En particular, el termino tambien comprende genes "similares a protefna ribosomica”, pseudogenes y genes que comparten secuencia o caractensticas estructurales, particularmente en su region 3'-UTR, con un gen de protefna ribosomica. Preferiblemente, el termino se refiere a un gen de protefna ribosomica de vertebrado, mas preferiblemente a un gen de protefna ribosomica de mamffero, incluso mas preferiblemente a un gen de protefna ribosomica de primate, en particular a un gen de protefna ribosomica humana. Ademas, el termino "gen de protefna ribosomica" tambien abarca un gen de protefna ribosomica de roedor, en particular un gen de protefna ribosomica murina. Ejemplos de genes de protefna ribosomica en el significado de la invencion incluyen, pero no se limitan a, protefna ribosomica L9 (RPL9), protefna ribosomica L3 (RPL3), protefna ribosomica L4 (RPL4), protefna ribosomica L5 (RPL5), protefna ribosomica L6 (RPL6), protefna ribosomica L7 (RPL7), protefna ribosomica L7a (RPL7A), protefna ribosomica L11 (RPL11), protefna ribosomica L12 (RPL12), protefna ribosomica L13 (RPL13), protefna ribosomica L23 (RPL23), protefna ribosomica L18 ( RPL18), protefna ribosomica L18a (RPL18A), protefna ribosomica L19 (RPL19), protefna ribosomica L21 (RPL21), protefna ribosomica L22 (RPL22), protefna ribosomica L23a (RPL23A), protefna ribosomica L17 (RPL17), protefna ribosomica L24 (RPL24) ), protefna ribosomica L26 (RPL26), protefna ribosomica L27 (RPL27), protefna ribosomica L30 (RPL30), protefna ribosomica L27a (RPL27A), protefna ribosomica L28 (RPL28), protefna ribosomica L29 (RPL29), protefna ribosomica L31 (RPL31), protefna ribosomica L32 (RPL32), protefna ribosomica L35a (RPL35A), protefna ribosomica L37 (RPL37), protefna ribosomica L37a (RPL37A), protefna ribosomica L38 (RPL38), protefna ribosomica L39 (RPL39), protefna ribosomica grande, P0 (RPLP0), protefna ribosomica grande, P1 (RPLP1), protefna ribosomica grande, P2 (RPLP2), protefna ribosomica S3 (RPS3), protefna ribosomica S3A (RPS3A), protefna ribosomica S4, ligada a X (RPS4X), protefna ribosomica S4 ligada a Y 1 (RpS4Y1), protefna ribosomica S5 (RPS5), protefna ribosomica S6 (RPS6), protefna ribosomica S7 (RPS7), protefna ribosomica S8 (RPS8), protefna ribosomica S9 (RPS9), protefna ribosomica S10 (RPS10), protefna ribosomica S11 (RPS11), protefna ribosomica S12 (RPS12), protefna ribosomica S13 (RPS13), protefna ribosomica S15 (RPS15), protefna ribosomica S15a (RPS15A), protefna ribosomica S16 (RPS16), protefna ribosomica S19 (RPS19), protefna ribosomica S20 (RPS20), protefna ribosomica S21 (RPS21), protefna ribosomica S23 (RPS23), protefna ribosomica S25 (RPS25), protefna ribosomica S26 (RPS26), protefna ribosomica S27 (RPS27), protefna ribosomica S27a (RPS27a), protefna ribosomica S28 (RPS28), protefna ribosomica S29 (RPS29), protefna ribosomica L15 (RPL15), protefna ribosomica S2 (RPS2), protefna ribosomica L14 (RPL14), protefna ribosomica S14 (RPS14), protefna ribosomica L10 (RPL10), protefna ribosomica L10a ( RPL10A), protefna ribosomica L35 (RPL35), protefna ribosomica L13a (RPL13A), protefna ribosomica L36 (RPL36), protefna ribosomica L36a (RPL36A), protefna ribosomica L41 (RPL41), protefna ribosomica S18 (RPS18), protefna ribosomica S24 (RPS24), protefna ribosomica L8 (RPL8), protefna ribosomica L34 (RPL34), protefna ribosomica S17 (RPS17), protefna ribosomica SA (RPSA), ubiquitina A-52 residuo producto de fusion de protefna ribosomica 1 (UBA52), virus del sarcoma Finkel-Biskis-Reilly murino (FBR-MuSV) expresado de forma ubicua (FAU), protefna ribosomica tipo L22 1 (RPL22L1), protefna ribosomica S1 7 (RPS17), protefna ribosomica tipo L39 (RPL39L), protefna ribosomica tipo L10 (RPL10L), protefna ribosomica tipo L36a (RPL36AL), protefna ribosomica tipo L3 (RPL3L), protefna ribosomica tipo S27 (RPS27L), protefna ribosomica tipo L261 (RPL26L1), protefna ribosomica tipo L7 1 (RPL7L1), protefna ribosomica L13a pseudogen (RPL13AP), protefna ribosomica L37a pseudogen 8 (RPL37AP8), protefna ribosomica S10 pseudogen 5 (RPS10P5), protefna ribosomica S26 pseudogen 11 (RPS26P11), protefna ribosomica L39 pseudogen 5 (RPL39P5), protefna ribosomica grande, p0 pseudogen 6 (RPLP0P6) y protefna ribosomica L36 pseudogen 14 (RPL36P14). Preferiblemente, el termino "gen de protefna ribosomica" se refiere a uno de los genes mencionados anteriormente, que se deriva de un mamffero, preferiblemente de Homo sapiens o Mus musculus.
Preferiblemente, el al menos un marco de lectura abierto y el al menos un elemento 3'-UTR son heterologos. El termino "heterologo" en este contexto significa que dos elementos de secuencia comprendidos en la molecula de acido nucleico artificial, como el marco de lectura abierto y el elemento 3'-UTR, no ocurren naturalmente (en la naturaleza) en esta combinacion. Preferiblemente, el elemento 3'-UTR se deriva de un gen diferente que el marco de lectura abierto. Por ejemplo, el ORF se puede derivar de un gen diferente al elemento 3'-UTR, por ejemplo codificando una protefna diferente o la misma protefna pero de una especie diferente, etc. Preferiblemente, el marco de lectura abierto no codifica una protefna ribosomica. En una realizacion preferida, el ORF no codifica una protefna ribosomica humana o una protefna ribosomica de planta (en particular Arabidopsis), en particular la protefna ribosomica humana S6 (RPS6), la protefna ribosomica humana L36 (RPL36AL) o la protefna ribosomica de Arabidopsis S16 (RPS16). En una realizacion preferida adicional, el marco de lectura abierto (ORF) no codifica la protefna ribosomica S6 (RPS6), la protefna ribosomica tipo L36a (RPL36AL) o la protefna ribosomica S16 (RPS16).
En realizaciones especfficas, es preferente que el marco de lectura abierto no codifique para una protefna reporter, por ejemplo seleccionada del grupo consistente en protefnas globina (particularmente beta-globina), protefna luciferasa, protefnas GFP o variantes de las mismas, por ejemplo variantes que tienen al menos un 70% identidad de secuencia con una protefna globina, una protefna luciferasa o una protefna GFP. En una realizacion particularmente preferente, el marco de lectura abierto (ORF) no codifica para un gen reporter o no se deriva de un reporter, donde el gen reporter preferentemente no se selecciona del grupo consistente en protefnas globina (en particular beta-globina), protefna luciferasa, protefna beta-glucuronidasa (GUS) y protefnas GFP o variantes de las mismas, preferentemente no se selecciona de EGFP o de variantes de cualquiera de los genes anteriores que tienen tfpicamente una identidad de secuencia de al menos el 70% con cualquiera de estos genes reporter, preferentemente con una protefna globina, luciferasa o GFP.
Incluso mas preferiblemente, el elemento 3'UTR es heterologo a cualquier otro elemento comprendido en el acido nucleico artificial como se define aquf. Por ejemplo, si el acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion comprende un elemento 3'UTR de un gen dado, preferiblemente no comprende ninguna otra secuencia de acido nucleico, en particular ninguna secuencia de acido nucleico funcional (por ejemplo, elemento de codificacion o secuencia reguladora) del mismo gen, incluidas sus secuencias reguladoras en el extremo 5' y 3' del ORF del gen. En una realizacion particularmente preferida, la molecula de acido nucleico artificial comprende un ORF, un 3'-UTR y un 5'-UTR, todos ellos heterologos entre si, esto es son recombinantes, ya que cada uno de ellos se deriva de diferentes genes (y sus 5' y 3' UTR). En otra realizacion preferente, el 3'UTR no se deriva de un 3'-UTR de un gen viral o no es de origen viral.
Preferentemente, el al menos un elemento 3'UTR se une funcionalmente al ORF. Esto significa preferentemente que el elemento 3'UTR se asocia con el ORF de manera que puede ejercer una funcion, tal como una funcion de estabilizacion de la expresion del ORF o una funcion de estabilizacion en la molecula de acido nucleico artificial. De manera preferente, el ORF y el elemento 3'UTR se asocian en la direccion 5 '^3 '. Asf, de manera preferente, la molecula de acido nucleico artificial comprende la estructura 5'-ORF-ligante(opcional)-elemento 3'UTR-3', donde el ligante puede estar presente o ausente. Por ejemplo, el ligante puede ser uno o mas nucleotidos, tal como un tramo de 1-50 o 1-20 nucleotidos, por ejemplo, que comprende o que consiste en uno o mas sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion (sitios de restriccion).
Preferentemente, el al menos un elemento 3'UTR comprende una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de protema ribosomica de eucariota, preferentemente de la 3'UTR de un gen de protema ribosomica de vertebrado, con especial preferencia de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica de mamffero, incluso mas preferentemente de un gen de protefna ribosomica de primate, en particular un gen de protefna ribosomica humana, o de un gen de protefna ribosomica de roedor, en particular de un gen de protefna ribosomica murina.
En una realizacion preferente, el al menos un elemento 3'UTR comprende o se corresponde con una secuencia de acido nucleico que se deriva de la secuencia 3'UTR de un transcripto seleccionado del grupo consistente en NM_000661.4, NM_001024921.2, NM_000967.3, NM_001033853.1, NM_000968.3, NM_000969.3, NM_001024662.1, NM_000970.3, NM_000971.3, NM_000972.2, NM_000975.3, NM_001199802.1, NM_000976.3, NM_000977.3, NM_033251.2, NM_001243130.1, NM_001243131, NM_000978.3, NM_000979.3, NM_001270490.1, NM_000980.3, NM_000981.3, NM_000982.3, NM_000983.3, NM_000984.5, NM_000985.4, NM_001035006.2, NM_001199340.1, NM_001199341.1, NM_001199342.1, NM_001199343.1, NM_001199344.1, NM_001199345.1, NM_000986.3, NM_000987.3, NM_000988.3, NM_000989.3, NM_000990.4, NM_001136134.1, NM_000991.4, NM-001136135.1, NM_001136136.1, NM_001136137.1, NM_000992.2, NM_000993.4, NM_001098577.2, NM_001099693.1, NM_000994.3, NM_001007073.1, NM_001007074.1, NM_000996.2, NM_000997.4, NM_000998.4, NM_000999.3, NM_001035258.1, NM_001000.3, NM_001002.3, NM_053275.3, NM_001003.2, NM_213725.1, NM_001004.3, NM_001005.4, NM_001256802.1, NM_001260506.1, NM_001260507.1, NM_001006.4, NM_001267699.1, NM_001007.4, NM_001008.3, NM_001009.3, NM_001010.2, NM_001011.3, NM_001012.1, NM_001013.3, NM_001203245.2, NM_001014.4, NM_001204091.1, NM_001015.4, NM_001016.3, NM_001017.2, NM_001018.3, NM_001030009.1, NM_001019.4, NM_001020.4, NM_001022.3, NM_001146227.1, NM_001023.3, NM_001024.3, NM_001025.4, NM_001028.2, NM_001029.3, NM_001030.4, NM_002954, NM_001135592.2, NM_001177413.1, NM_001031.4, NM_001032.4, NM_001030001.2, NM_002948.3, NM_001253379.1, NM_001253380.1, NM_001253382.1, NM_001253383.1, NM_001253384.1, NM_002952.3, NM_001034996.2, NM_001025071.1, NM_001025070.1, NM_005617.3, NM_006013.3, NM_001256577.1, NM_001256580.1, NM_007104.4, NM_007209.3, NM_012423.3, NM_001270491.1, NM_033643.2, NM_015414.3, NM_021029.5, NM_001199972.1, NM_021104.1, NM_022551.2, NM_033022.3, NM_001142284.1, NM_001026.4, NM_001142285.1, NM_001142283.1, NM_001142282.1, NM_000973.3, NM_033301.1, NM_000995.3, NM_033625.2, NM_001021.3, NM_002295.4, NM_001012321.1, NM_001033930.1, NM_003333.3, NM_001997.4, NM_001099645.1, NM_001021.3, NM_052969.1, NM_080746.2, NM_001001.4, NM_005061.2, NM_015920.3, NM_016093.2, NM_198486.2, NG_011172.1, NG_011253.1, NG_000952.4, NR_002309.1, NG_010827.2, NG_009952.2, NG_009517.1, NM_052835.3, NM_011287.2, NM_001162933.1, NM_009076.3, NM_009438.5, NM_025974.2, NM_025586.3, NM_001002239.3, NM_009077.2, NM_029751.4, NM_009078.2, NM_019647.6, NM_009079.3, NM_022891.3, NM_024218.4, NM_011975.3, NM_009081.2, NM_009082.2, NM_009083.4, NM_053257.3, ENSMUST00000081840 (NM_172086.2), NM_026724.2, NM_025592.3, NM_025589.4, NM_026069.3, NM_009084, NM_026055.1, NM_026594.2, NM_001163945.1, NM_024212.4, NM_016980.2, NM_011290.5, NM_011291.5, ENSMUST00000102898 (NM_013721.3), NM_025433.3, NM_012053.2, NM_011292.2, NM_007475.5, NM_018853.3, NM_026020.6, NM_025963.3, NM_013725.4, NM_011295.6, NM_020600.4, NM_009091.2, NM_170669.2, NM_013647.2, NM_009092.3, NM_008503.5, NM_026147.5 / ENSMUST00000138502, NM_207635.1, NM_024266.3, NM_013765.2, NM_024277.2, NM_026467.3, NM_012052.2, NM_016959.4, ENSMUST00000071745, NM_009095.2, NM_009096.3, NM_011300.3, NM_011029.4, NM_018860.4, NM_001277113.1, NM_001277114.1, NM_001271590.1, NM_007990, NM_025919, NM_016738, NM_026517, NM_207523, NM_009080, NM_011289, NM_013762, NM_021338, NM_018730, NM_019865, NM_023372.2, NM_026533.3, NM_009092, NM_011296, NM_023133, ENSMUST00000059080 (NM_025587.2), NM_024175, NM_027015, NM_016844, NM_009093.2, NM_009094, NM_009098, NM_029767, y NM_019883.
La frase “una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica” preferentemente se refiere a una secuencia de acido nucleico que se basa en la secuencia 3'UTR de un gen de protefna ribosomica o en un fragmento o parte de la misma. Este frase incluye secuencias que se corresponden con la secuencia 3'UTR completa, es decir la secuencia 3'UTR de longitud completa de un gen de protefna ribosomica, y secuencias que se corresponden con un fragmento de la secuencia 3'UTR de un gen de protefna ribosomica. Preferentemente, un fragmento de una 3'UTR de un gen de protefna ribosomica consiste en un tramo continuo de nucleotidos que se corresponde con un tramo continuo de nucleotidos de la 3'UTR de longitud completa de un gen de protefna ribosomica, que representa al menos el 5%, 10%, 20%, preferiblemente al menos el 30%, mas preferiblemente al menos el 40%, mas preferiblemente al menos el 50%, incluso mas preferiblemente al menos el 60%, incluso mas preferiblemente al menos el 70%, incluso mas preferiblemente al menos 80% y de manera mucho mas preferente al menos el 90% de la 3'UTR de longitud completa de un gen de protefna ribosomica. Tal fragmento, en el sentido de la presente invencion, preferentemente es un fragmento funcional como se describe aquf. Preferiblemente, el fragmento conserva una funcion reguladora para la traduccion del ORF unido a la 3'-UTR o a un fragmento del mismo. El termino "3'-UTR de un gen de protefna ribosomica" se refiere preferiblemente a la 3'-UTR de un gen de protefna ribosomica natural.
Los terminos “variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica” y “variante de la misma” en el contexto de una 3'UTR de un gen de protefna ribosomica se refieren a una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica de origen natural, de manera preferente a una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica de vertebrado, en especial a una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica de mamffero, de manera aun mas preferente una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica de primate, en particular de un gen de protefna ribosomica humana como se describe anteriormente. Tal variante puede ser una 3'UTR modificada de un gen de protefna ribosomica. Por ejemplo, una variante de 3'UTR puede presentar una o mas deleciones, inserciones, adiciones y/o sustituciones de nucleotidos en comparacion con la 3'UTR de origen natural de la cual la variante se deriva. Preferentemente, la variante de una 3'UTR de un gen de protefna ribosomica es al menos un 80%, de manera aun mas preferible al menos un 90%, de manera mucho mas preferible al menos un 95% identica a la 3'UTR de origen natural de la cual la variante se deriva. La variante es una variante funcional como se describe aquf.
La frase “una secuencia de acido nucleico que se deriva de una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica” preferentemente se refiere a una secuencia de acido nucleico que se basa en una variante de la secuencia 3'UTR de un gen de protefna ribosomica o un fragmento o parte del mismo como se describe anteriormente. El termino incluye secuencias que se corresponden con la secuencia completa de la variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica, es decir la secuencia 3'UTR variante de longitud completa de un gen de protefna ribosomica, y con secuencias que se corresponden con un fragmento de la secuencia 3'UTR variante de un gen de protefna ribosomica. De manera preferente, un fragmento de una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica consiste en un tramo continuo de nucleotidos que se corresponde con un tramo continuo de nucleotidos de la variante de longitud completa de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica, que representa al menos un 20%, preferiblemente al menos el 30%, mas preferiblemente al menos el 40%, mas preferiblemente al menos el 50%, incluso mas preferiblemente al menos el 60%, aun mas preferiblemente al menos el 70%, incluso mas preferiblemente al menos el 80% y de manera mucho mas preferible al menos un 90% de la variante de longitud completa de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica. Tal fragmento de una variante, en el sentido de la presente invencion, preferentemente es un fragmento funcional de una variante como se describe aquf.
Los terminos “variante funcional”, “fragmento funcional” y “fragmento funcional de una variante” (tambien denominado “fragmento variante funcional”) en el contexto de la presente invencion significan que el fragmento de la 3'UTR, la variante de la 3'UTR, el fragmento de una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica satisface al menos una funcion, de manera preferente mas de una funcion de la 3'UTR de origen natural de un gen de protefna ribosomica de la cual la variante, el fragmento o el fragmento de la variante se deriva. Tal funcion puede ser, por ejemplo, estabilizar ARNm y/o estabilizar y/o prolongar la produccion de protefnas de un ARNm y/o incrementar la expresion de protefnas o la produccion de protefnas total de un ARNm, preferentemente de una celula de mamffero, tal como una celula humana. Preferiblemente, la funcion de la 3'-UTR se refiere a la traduccion de la protefna codificada por el ORF. Mas preferiblemente, la funcion comprende mejorar la eficiencia de traduccion del ORF vinculado a la 3'-UTR o al fragmento o variante del mismo. Es particularmente preferente que la variante, el fragmento y el fragmento variante en el contexto de la presente invencion cumpla la funcion de estabilizar un ARNm, preferentemente de una celula de mamffero, tal como una celula humana, comparado con un ARNm que comprende una 3'UTR de referencia o que carece de una 3'UTR, y/o la funcion de estabilizar y/o prolongar la produccion de protemas de un ARNm, de manera preferente de una celula de mamffero, tal como una celula humana, en comparacion con un ARNm que comprende una 3'UTR de referencia o que carece de una 3'UTR, y/o la funcion de incrementar la produccion de protemas de un ARNm, de manera preferente de una celula de mamffero, tal como una celula humana, en comparacion con un ARNm que comprende una 3'UTR de referencia o que carece de una 3'UTR. Una 3'UTR de referencia puede ser, por ejemplo, una 3'UTR de origen natural en combinacion con el ORF. Ademas, una variante funcional, un fragmento funcional o un fragmento variante funcional de una 3'UTR de un gen de protefna ribosomica preferentemente no tienen el efecto de disminuir esencialmente la eficiencia de la traduccion del ARNm que comprende tal variante, fragmento o fragmento variante de una 3'UTR en comparacion con la 3'UTR de tipo natural de la cual la variante, el fragmento o el fragmento variante se deriva. Una funcion particularmente preferente de un “fragmento funcional”, una “variante funcional” o un “fragmento funcional de una variante” de la 3'uTr de un gen de protefna ribosomica en el contexto de la presente invencion es la estabilizacion y/o la prolongacion de la produccion de protefnas por la expresion de un ARNm que lleva el fragmento funcional, la variante funcional o el fragmento funcional de una variante como se describe anteriormente.
De manera preferente, la eficiencia de la una o mas funciones ejercidas por la variante funcional, el fragmento funcional o el fragmento variante funcional, tal como la eficiencia de estabilizacion de la produccion de protefnas y/o ARNm se incrementa en al menos un 5%, mas preferiblemente al menos el 10%, mas preferiblemente al menos el 20%, mas preferiblemente al menos el 30%, mas preferiblemente el 40%, de manera mas preferible al menos 50%, de manera mas preferible al menos 60%, aun de manera mas preferible al menos 70%, aun de manera mas preferible al menos 80%, de manera mucho mas preferible al menos un 90% la eficiencia de estabilizacion de la produccion de ARNm y/o protefnas y/o de la eficiencia de incremento de la produccion de protefnas de la 3'UTR de origen natural de un gen de protefna ribosomica de la cual la variante, el fragmento o el fragmento variante se deriva.
En el contexto de la presente invencion, un fragmento de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica o de una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica preferentemente tiene una longitud de al menos aproximadamente 3 nucleotidos, preferentemente de la menos aproximadamente 5 nucleotidos, mas preferentemente de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25 o 30 nucleotidos, incluso mas preferentemente de al menos aproximadamente 50 nucleotidos, incluso mas preferentemente de al menos aproximadamente 70 nucleotidos. De manera preferente, tal fragmento de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica o de una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica es un fragmento funcional como se describe anteriormente. En una realizacion preferida, la 3'-UTR de un gen de protefna ribosomica o un fragmento o variante del mismo tiene una longitud de entre 3 y aproximadamente 500 nucleotidos, preferiblemente de entre 5 y aproximadamente 150 nucleotidos, mas preferiblemente de entre 10 y 100 nucleotidos, incluso mas preferiblemente entre 15 y 90, con especial preferencia entre 20 y 70.
De manera preferente, el al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion comprende o consiste en un “fragmento funcional”, una “variante funcional” o un “fragmento funcional de una variante” de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica.
En una realizacion preferente, el al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion incrementa la estabilidad de la molecula de acido nucleico artificial, por ejemplo incrementa la estabilidad de un ARNm de acuerdo con la presente invencion, en comparacion con un acido nucleico respectivo (acido nucleico de referencia) que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural, en combinacion con el ORF. De manera preferente, el al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion incrementa la estabilidad de la produccion de protefnas a partir de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de un ARNm de acuerdo con la presente invencion, en comparacion con un acido nucleico respectivo que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural, en combinacion con el ORF. Preferentemente, el al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion prolonga la produccion de protefnas a partir de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de un ARNm de acuerdo con la presente invencion en comparacion con un acido nucleico respectivo que carece de una 3'UTR o que comprende de una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural, en combinacion con el ORF. De manera preferente, el al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion incrementa la expresion de protefnas y/o la produccion total de protefnas a partir de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo un ARNm de acuerdo con la presente invencion, en comparacion con un acido nucleico respectivo que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural, en combinacion con el ORF. De manera preferente, el al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion no influye negativamente en la eficiencia de traduccion de un acido nucleico en comparacion con la eficiencia de traduccion de un acido nucleico respectivo que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural, en combinacion con el ORF. Aun mas preferiblemente, la eficiencia de traduccion se ve aumentada por el 3'UTR en comparacion con la eficiencia de traduccion de la protefna codificada por el ORF respectivo en su contexto natural.
El termino “molecula de acido nucleico respectivo” o “molecula de acido nucleico de referencia” en este contexto significa que - aparte de las diferentes 3'UTR - la molecula de acido nucleico de referencia es comparable, preferentemente identica, a la molecula de acido nucleico artificial de la invencion que comprende el elemento 3'UTR.
El termino “estabilizar y/o prolongar la produccion de protemas” de una molecula de acido nucleico artificial, tal como un ARNm artificial, preferentemente significa que la produccion de protefnas de la molecula de acido nucleico artificial, tal como el ARNm artificial, se estabiliza y/o se prolonga en comparacion con la produccion de protefnas de una molecula de acido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia, por ejemplo que comprende una 3'UTR de referencia o que carece de una 3'UTR, preferentemente en un sistema de expresion mamffero, tal como en celulas HeLa o HDF. Asf, la protefna producida a partir de la molecula de acido nucleico artificial, tal como el ARNm artificial, es observable durante un perfodo de tiempo mas prolongado que lo previsto para una protefna producida de una molecula de acido nucleico de referencia. En otras palabras, la cantidad de protefna producida a partir de la molecula de acido nucleico artificial, tal como el ARNm artificial, medida en el tiempo rebaja el valor de umbral a un punto de tiempo posterior que la cantidad de la protefna producida a partir de una molecula de acido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia, medida a lo largo del tiempo. Tal valor umbral puede ser, por ejemplo, la cantidad de protefnas medidas en la fase inicial de la expresion, tal como 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de la expresion, tal como post-transfeccion de la molecula de acido nucleico.
Por ejemplo, la produccion de protefnas a partir de la molecula de acido nucleico artificial, tal como el ARNm artificial, en una cantidad que es al menos la cantidad observada en la fase inicial de expresion, tal como 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de la expresion, tal como post-transfeccion de la molecula de acido nucleico, se prolonga durante al menos aproximadamente 5 horas, de manera preferente por al menos aproximadamente 10 horas, de manera mas preferente por al menos aproximadamente 24 horas comparada con la produccion de protefnas de una molecula de acido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia, en un sistema de expresion mamffero, tal como en celulas de mamffero, por ejemplo en celulas HeLa o HDF. Asf, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion preferentemente permite la produccion de protefnas prolongada en una cantidad que es al menos la cantidad observada en la fase inicial de la expresion, tal como 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de expresion, tal como post-transfeccion, durante al menos aproximadamente 5 horas, de manera preferente por al menos aproximadamente 10 horas, de manera mas preferente por al menos aproximadamente 24 horas comparada con una molecula de acido nucleico de referencia que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia.
En realizaciones preferidas, la produccion de protefnas de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion se prolonga en al menos 1,5 veces, de manera preferente al menos 2 veces, de manera mas preferente al menos 2,5 veces en comparacion con la produccion de protefnas de una molecula de acido nucleico de referencia que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia.
Este efecto de prolongar la produccion de protefnas se puede determinar (i) midiendo la cantidad de protefnas, por ejemplo obtenidas por la expresion de un o Rf que codifica una protefna reporter, tal como luciferasa, preferentemente en un sistema de expresion mamffero, tal como en celulas HeLa o HDF, con el tiempo, (ii) determinando el punto del tiempo en el cual la cantidad de protefnas esta por debajo de la cantidad de protefnas observadas, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de la expresion, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-transfeccion de la molecula de acido nucleico artificial, y (iii) comparando el punto de tiempo al cual la cantidad de protefnas esta por debajo de la cantidad de protefnas observada en 1, 2, 3, 4, 5, o 6 horas post-inicio de la expresion en dicho momento del tiempo para una molecula de acido nucleico que carece de una 3'uTr o que comprende de una 3'UTR de referencia.
Preferentemente, este efecto de estabilizacion y/o prolongacion de la produccion de protefnas se logra a la vez que la cantidad total de protefnas producidas a partir de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo en un lapso de tiempo de 48 o 72 horas, es al menos la cantidad de protefnas producidas a partir de una molecula de acido nucleico de referencia que carece de una 3'UTR o que comprende de una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural, con el ORF de la molecula de acido nucleico artificial. Asf, la presente invencion proporciona una molecula de acido nucleico artificial que permite una produccion de protefnas prolongada y/o estabilizada en un sistema de expresion mamffero, tal como en celulas de mamffero, por ejemplo celulas HeLa o h Df , como se especffica anteriormente, siendo la cantidad total de protefna producida a partir de la molecula de acido nucleico artificial, por ejemplo en un lapso de tiempo de 48 o 72 horas, al menos la cantidad total de la protefna producida, por en el lapso de tiempo, de una molecula de acido nucleico de referencia que carece de una 3'UTR o que comprende de una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural, con el ORF de la molecula de acido nucleico artificial.
De esta manera, “expresion de protema estabilizada” significa preferentemente que hay una produccion de protefnas mas uniforme a partir de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion durante un perfodo de tiempo predeterminado, tal como durante 24 horas, de manera mas preferente durante 48 horas, aun de manera mas preferente durante 72 horas, cuando se compara con una molecula de acido nucleico de referencia, por ejemplo un ARNm que comprende una 3'UTR de referencia o que carece de una 3'UTR. Por consiguiente, el nivel de produccion de protefnas, por ejemplo en un sistema mamffero, a partir de la molecula de acido nucleico artificial que comprende un elemento 3'UTR de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo un ARNm de acuerdo con la presente invencion, preferentemente no disminuye el grado observado para una molecula de acido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia como se describe anteriormente. Por ejemplo, la cantidad de protefna (codificada por el ORF) observada 6 horas despues del inicio de expresion, por ejemplo 6 horas post-transfeccion de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, en una celula, tal como una celula de mairnfero, puede ser comparable con la cantidad de protema observada 48 horas despues del inicio de la expresion, por ejemplo 48 horas post-transfeccion. Asf, preferentemente la relacion entre la cantidad de protema codificada por el ORF, tal como una protema reporter, por ejemplo luciferasa, observada 48 horas post-inicio de la expresion, por ejemplo 48 horas posttransfeccion, y la cantidad de protema observada 6 horas despues del inicio de la expresion, por ejemplo 6 horas posttransfeccion, es de al menos aproximadamente 0,4, de manera mas preferente al menos aproximadamente 0,5, de manera mas preferente al menos aproximadamente 0,6, aun de manera mas preferente al menos aproximadamente 0,7. Preferentemente, la relacion esta entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 4, de manera preferente entre aproximadamente 0,65 y aproximadamente 3, de manera mas preferente entre aproximadamente 0,7 y 2 para una molecula de acido nucleico de acuerdo con la presente invencion. Para una molecula de acido nucleico de referencia respectiva, por ejemplo un ARNm que comprende una 3'UTR de referencia o que carece de una 3'UTR, la relacion puede estar, por ejemplo, entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,3.
Asf, la presente invencion proporciona una molecula de acido nucleico artificial que comprende un ORF, un elemento 3'UTR y un elemento 5'UTR como se describe anteriormente donde la relacion entre la cantidad de protema (reporter), por ejemplo la cantidad de luciferasa, observada 48 horas despues del inicio de la expresion y la cantidad de protema (reporter) observada 6 horas despues del inicio de la expresion, de manera preferente en el sistema de expresion mairnfero, tal como en celulas de mairnfero, por ejemplo celulas HeLa, preferentemente es superior a aproximadamente 0,4, de manera mas preferente superior a aproximadamente 0,5, de manera mas preferente superior a aproximadamente 0,6, aun de manera mas preferente superior a aproximadamente 0,7, por ejemplo entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 4, de manera preferente entre aproximadamente 0,65 y aproximadamente 3, de manera mas preferente entre aproximadamente 0,7 y 2, donde preferentemente la cantidad total de protema producida a partir de la molecula de acido nucleico artificial, por ejemplo, en un lapso de tiempo de 48 horas, es al menos la cantidad total de la protema producida, por ejemplo en el lapso de tiempo, de una molecula de acido nucleico de referencia que carece de una 3'uTr o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural, con el ORF de la molecula de acido nucleico artificial. En una realizacion preferida, la presente invencion proporciona una molecula de acido nucleico artificial que comprende un ORF, un elemento 3'UTR y un elemento 5'UTR como se describe anteriormente donde la relacion entre la cantidad de protema (reporter), por ejemplo la cantidad de luciferasa, observada 72 horas despues del inicio de la expresion y la cantidad de protema (reporter) observada 6 horas despues del inicio de la expresion, preferentemente en un sistema de expresion mairnfero, tal como en celulas de mairnfero, por ejemplo celulas HeLa, preferentemente esta por encima de aproximadamente 0,4, de manera mas preferente por encima de aproximadamente 0,5, de manera mas preferente por encima de aproximadamente 0,6, aun de manera mas preferente por encima de aproximadamente 0,7, por ejemplo entre aproximadamente 0,4 y 1,5, de manera preferente entre aproximadamente 0,65 y aproximadamente 1,15, de manera mas preferente entre aproximadamente 0,7 y 1,0, donde preferentemente la cantidad total de protema producida a partir de la molecula de acido nucleico artificial, por ejemplo en un lapso de tiempo de 72 horas, es al menos la cantidad total de la protema producida, por ejemplo en el lapso de tiempo, a partir de una molecula de acido nucleico de referencia que carece de una 3'UTR o que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural, con el ORF de la molecula de acido nucleico artificial.
“Expresion de protema incrementada” o “expresion de protema mejorada” en el contexto de la presente invencion significa preferentemente una expresion de protemas incrementada/mejorada en un punto de tiempo despues del inicio de la expresion o una cantidad total incrementada/mejorada de protema expresada en comparacion con la expresion inducida por una molecula de acido nucleico de referencia. Asf, el nivel de protemas observado en un cierto punto de tiempo despues del inicio de la expresion, por ejemplo despues de la transfeccion, de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo despues de la transfeccion de un ARNm de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo 6, 12, 24, 48 o 72 horas post-transfeccion, preferentemente es mas alto que el nivel de protema observada en el mismo punto de tiempo despues del inicio de la expresion, por ejemplo despues de la transfeccion, de una molecula de acido nucleico de referencia, tal como un ARNm de referencia que comprende un 3'UTR de referencia o que carece de una 3'UTR. En una realizacion preferente, la cantidad maxima de protema (determinada, por ejemplo, por la actividad o la masa de la protema) expresada a partir de la molecula de acido nucleico artificial aumenta con respecto a la cantidad de protema expresada a partir de un acido nucleico de referencia que comprende una 3'-UTR de referencia o que carece de una 3'-UTR. Los niveles maximos de expresion se alcanzan preferiblemente dentro de las 48 horas, mas preferiblemente dentro de las 24 horas y aun mas preferiblemente dentro de las 12 horas posteriores a, por ejemplo, la transfeccion.
En una realizacion, la “produccion de protema total incrementada” a partir de una molecula de acido nucleico artificial segun la invencion se refiere a una produccion de protemas incrementada/mejorada durante un lapso de tiempo en el cual la protema se produce a partir de una molecula de acido nucleico artificial, preferentemente en un sistema de expresion de mairnfero, tal como en celulas de mairnfero, por ejemplo celulas HeLa o HDF, en comparacion con una molecula de acido nucleico de referencia que no carece de la 3'-UTR o que comprende una 3'-UTR de referencia. De acuerdo con una realizacion preferente, la cantidad acumulada de protema expresada a lo largo del tiempo aumenta cuando se usa la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion.
De acuerdo con la invencion, se proporciona una molecula de acido nucleico artificial que se caracteriza por la expresion incrementada de la protema codificada en comparacion con una molecula de acido nucleico respectiva que carece de al menos un elemento 3'-UTR o que comprende un 3'-UTR de referencia ("acido nucleico de referenda") que comprende una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'-UTR de un gen de protema ribosomica o de una variante de la 3'-UTR de un gen de protema ribosomica para evaluar la produccion de protema in vivo mediante la molecula de acido nucleico artificial inventiva, la expresion de la protema codificada se determina despues de la inyeccion/transfeccion de la molecula de acido nucleico artificial inventiva en celulas/tejido diana y se compara con la expresion de protema inducida por el acido nucleico de referencia. Los metodos cuantitativos para determinar la expresion de protemas son conocidos en la tecnica (por ejemplo Western-Blot, FACS, ELISA, espectrometna de masas). Particularmente util en este contexto es la determinacion de la expresion de protemas reporter, como luciferasa, protema verde fluorescente (GFP) o fosfatasa alcalina secretada (SEAP). Por tanto, un acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion o un acido nucleico de referencia se introduce en el tejido o celula diana, por ejemplo por transfeccion o inyeccion. Varias horas o dfas (por ejemplo 6, 12, 24, 48 o 72 horas) despues del inicio de la expresion o despues de la introduccion de la molecula de acido nucleico, se recoge una muestra de celulas diana y se mide mediante FACS y/o se lisa. Luego, los lisados se pueden usar para detectar la protema expresada (y asf determinar la eficiencia de la expresion de la protema) usando varios metodos, por ejemplo Western-Blot, FACS, ELISA, espectrometna de masas o por medida de fluorescencia o luminiscencia.
Por tanto, si la expresion de la protema de una molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion se compara con la expresion de la protema de una molecula de acido nucleico de referencia en un momento espedfico (por ejemplo 6, 12, 24, 48 o 72 horas despues del inicio) de expresion o despues de la introduccion de la molecula de acido nucleico), ambas moleculas de acido nucleico se introducen por separado en el tejido/celulas diana, se recoge una muestra del tejido/celulas despues de un momento espedfico, se preparan lisados de protemas segun el protocolo particular ajustado al metodo de deteccion particular (por ejemplo Western Blot, ELISA, etc., tal como se conoce en la tecnica) y la protema se detecta mediante el metodo de deteccion elegido. Como alternativa a la medicion de la cantidad de protema expresada en los lisados celulares, o, ademas de la medicion de la cantidad de protema en los lisados celulares antes de la lisis de las celulas recolectadas o utilizando una almuota en paralelo, la cantidad de protema tambien se puede determinar utilizando un analisis FACS.
Si se va a medir la cantidad total de protema durante un penodo de tiempo espedfico, se pueden recoger tejidos o celulas despues de varios puntos de tiempo despues de introducir la molecula de acido nucleico artificial (por ejemplo 6, 12, 24, 48 y 72 horas despues del inicio de la expresion o despues de la introduccion de la molecula de acido nucleico, generalmente de diferentes animales de ensayo) y la cantidad de protema por punto de tiempo se puede determinar tal como se explico anteriormente. Para calcular la cantidad de protema acumulada se puede utilizar un metodo matematico para determinar la cantidad total de protema, por ejemplo el area bajo la curva (AUC) se puede determinar de acuerdo con la siguiente formula:
Figure imgf000019_0001
Para calcular el area bajo la curva para la cantidad total de protema, se calcula la integral de la ecuacion de la curva de expresion de cada punto final (a y b).
Asf, "produccion total de protemas" se refiere preferiblemente al area bajo la curva (AUC) que representa la produccion de protemas con el tiempo.
Dicho incremento de la estabilidad de la molecula de acido nucleico artificial, dicho incremento de la estabilidad de la produccion de protemas, dicha prolongacion de la produccion de protemas y/o dicho incremento/mejora de la expresion de protemas y/o de la produccion de protemas total se determina preferentemente en comparacion con una molecula de acido nucleico de referencia respectiva que carece de una 3'UTR, por ejemplo un ARNm que carece de una 3'UTR, o de una molecula de acido nucleico de referencia que comprende una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural con el ORF como se describe anteriormente.
El efecto y eficiencia de la estabilizacion de la produccion de ARNm y/o de protemas y/o el efecto y eficiencia de incremento de produccion de protemas de las variantes, fragmentos y/o fragmentos variantes de la 3'UTR de un gen de protema ribosomica, asf como el efecto y la eficiencia de estabilizacion de la produccion de ARNm y/o el efecto y la eficiencia de incremento de produccion de protemas del al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion se puede determinar por cualquier metodo adecuado para este proposito conocido por el experto. Por ejemplo, se pueden generar moleculas de ARNm artificial que comprenden una secuencia de codificacion/marco de lectura abierto (ORF) para una protema reporter, tal como luciferasa, y sin 3'UTR, con una 3'UTR derivada de un gen de origen natural, una 3'UTR derivada de un gen de referencia (es dedr, una 3'UTR de referencia, tal como una 3'UTR de origen natural con el ORF), como 3'UTR una variante de una 3'UTR de un gen de protema ribosomica, como 3'UTR un fragmento de un gen de protema ribosomica de origen natural o como 3'UTR un fragmento de una variante de una 3'UTR de un gen de protema ribosomica como se define anteriormente. Tales ARNm se pueden generar, por ejemplo, por transcripcion in vitro de vectores respectivos, tales como vectores plasmidos, por ejemplo que comprenden un promotor T7 y una secuencia que codifica las secuencias de ARNm respectivas. Las moleculas de ARNm generadas se pueden transfectar en celulas por cualquier metodo de transfeccion adecuado para transfectar ARNm, por ejemplo se pueden electroporar en celulas de mairnfero, como celulas HELA, y las muestras se pueden analizar en ciertos puntos del tiempo despues de la transfeccion, por ejemplo 6, 24, 48 y 72 horas posttransfeccion. Las muestras se pueden analizar en cuanto a cantidades de ARNm y/o cantidades de protemas por metodos bien conocidos por el experto. Por ejemplo, las cantidades de ARNm reporter presentes en las celulas en los puntos de tiempo de muestra se pueden determinar por metodos de PCR cuantitativa. Las cantidades de protema reporter codificada por los ARNm respectivos se puede determinar, por ejemplo, por ensayos ELISA o ensayos reporter, tales como ensayos de luciferasa, dependiendo de la protema reporter utilizada. El efecto de estabilizar la expresion de protemas y/o prolongar la expresion de protemas se puede analizar, por ejemplo, determinando la relacion entre el nivel de protemas observado 48 horas post-transfeccion y el nivel de protemas observado 6 horas post-transfeccion. Mientras mas cercano sea el valor a uno, mas estable es la expresion de protemas que esta en este penodo de tiempo. Tales mediciones por supuesto tambien se pueden llevar a cabo a 72 horas o mas y se puede conocer la relacion entre el nivel de protema observado 72 horas post-transfeccion y el nivel de protema observado 6 horas post-transfeccion para determinar la estabilidad de la expresion de protemas.
En una realizacion preferente, el elemento 3'-UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion se deriva de la region 3'-UTR de un gen que codifica una protema ribosomica, preferiblemente de la region 3'-UTR de la protema ribosomica L9 (RPL9), protema ribosomica l3 (RPL3), protema ribosomica L4 (RPL4), protema ribosomica L5 (RPL5), protema ribosomica L6 (RPL6), protema ribosomica L7 (RPL7), protema ribosomica L7a (RPL7A), protema ribosomica L11 (RPL11), protema ribosomica L12 (RPL12), protema ribosomica L13 (RPL13), protema ribosomica L23 (RPL23), protema ribosomica L18 (RPL18), protema ribosomica L18a (RPL18A), protema ribosomica L19 (RPL19), protema ribosomica L21 ( RPL21), protema ribosomica L22 (RPL22), protema ribosomica L23a (RPL23A), protema ribosomica L17 (RPL17), protema ribosomica L24 (RPL24), protema ribosomica L26 (RPL26), protema ribosomica L27 (RPL27), protema ribosomica L30 (RPL30), protema ribosomica L27a (RPL27A), protema ribosomica L28 (RPL28), protema ribosomica L29 (R PL29), protema ribosomica L31 (RPL31), protema ribosomica L32 (RPL32), protema ribosomica L35a (RPL35A), protema ribosomica L37 (RPL37), protema ribosomica L37a (RPL37A), protema ribosomica L38 (RPL38), protema ribosomica L39 (RPL39), protema ribosomica, grande, P0 (RPLP0), protema ribosomica grande, P1 (RPLP1), protema ribosomica grande P2 (RPLP2), protema ribosomica S3 (RPS3), protema ribosomica S3A (RPS3A), protema ribosomica S4e enlazada a X (RPS4X), protema ribosomica S4 enlazada a Y 1 (RPS4Y1), protema ribosomica S5 (RPS5), protema ribosomica S6 (RPS6), protema ribosomica S7 (RPS7), protema ribosomica S8 (RPS8), protema ribosomica S9 (RPS9), protema ribosomica S10 (RPS10), protema ribosomica S11 (RPS11), protema ribosomica S12 (RPS12), protema ribosomica S13 (RPS13), protema ribosomica S15 (RPS15), protema ribosomica S15a (RPS15A), protema ribosomica S16 ( RPS16), protema ribosomica S19 (RPS19), protema ribosomica S20 (RPS20), protema ribosomica S21 (RPS21), protema ribosomica S23 (RPS23), protema ribosomica S25 (RPS) 25), protema ribosomica S26 (RPS26), protema ribosomica S27 (RPS27), protema ribosomica S27a (RPS27a), protema ribosomica S28 (RPS28), protema ribosomica S29 (RPS29), protema ribosomica L15 (RPL15), protema ribosomica S2 (RPS2 ), protema ribosomica L14 (RPL14), protema ribosomica S14 (RPS14), protema ribosomica L10 (RPL10), protema ribosomica L10a (RPL10A), protema ribosomica L35 (RPL35), protema ribosomica L13a (RPL13A), protema ribosomica L36 (RPL36) , protema ribosomica L36a (RPL36A), protema ribosomica L41 (RPL41), protema ribosomica S18 (RPS18), protema ribosomica S24 (RPS24), protema ribosomica L8 (RPL8), protema ribosomica L34 (RPL34), protema ribosomica S17 (RPS17), protema ribosomica SA (RPSA) o protema ribosomica S17 (RPS17). En una realizacion alternativa, el elemento 3'-UTR se puede derivar de un gen que codifica una protema ribosomica o de un gen seleccionado del producto de fusion de una protema ribosomica de residuo ubiquitina A-52 1 (UBA52), virus de sarcoma murino de Finkel-Biskis-Reilly (FBRMuSV) expresada de manera ubicua (FAU), protema ribosomica tipo L221 (RPL22L1), protema ribosomica tipo L39 (RPL39L), protema ribosomica tipo L10 (RPL10L), protema ribosomica L36a tipo (RPL36AL), protema ribosomica tipo L3 (RPL3L), protema ribosomica tipo S27 (RPS27L), protema ribosomica tipo L26 1 (RPL26L1), protema ribosomica tipo L7 1 (RPL7L1), pseudogen de protema ribosomica L13a (RPL13AP), pseudogen de protema ribosomica L37a 8 (RPL37AP8), pseudogen 5 de protema ribosomica S10 (RPS10P5), pseudogen 11 de protema ribosomica S26 (RPS26P11), pseudogen 5 de protema ribosomica L39 (RPL39P5), pseudogen 6 de protema ribosomica grande P0 (RPLP0P6) y pseudogen 14 de rpotema riboomica L36 (RPL36P14). Ademas, el elemento 3'-UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion se deriva preferiblemente de la region 3'-UTR de un gen seleccionado del grupo que consiste en protema ribosomica tipo S4 (RPS4l), protema ribosomica L13a putativa 60S, protema ribosomica tipo L37a putativa 60S, protema ribosomica tipo S10 putativa 40S, protema ribosomica tipo 1 S26 putativa 40S, protema ribosomica tipo L-395 putativa 60S o protema ribosomica acida 60S tipo OP.
En una realizacion particularmente preferida, el elemento 3'-UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion se deriva de la region 3'-UTR de un gen que codifica una protema ribosomica, preferiblemente de la region 3'UTR de la protema ribosomica L3 (RPL3), protema ribosomica L11 (RPL11), protema ribosomica L13 (RPL13), protema ribosomica L23 (RPL23), protema ribosomica L23a (RPL23A), protema ribosomica L26 (RPL26), protema ribosomica L27 (RPL27), protema ribosomica L35a (RPL35A), protema ribosomica L38 (RPL38), protema ribosomica S4 ligada a X (RPS4X), protema ribosomica S8 (RPS8), protema ribosomica S9 (RPS9), protema ribosomica S13 (RPS13), protema ribosomica S19 (RPS19), protema ribosomica S21 (RPS21), protema ribosomica S23 (RPS23), protema ribosomica S27 (RPS27), protema ribosomica S28 (RPS28), protema ribosomica S29 (RPS29), protema ribosomica L36 (RPL36), protema ribosomica L36a (RPL36A), ribosomica protema S18 (RPS18) o protema ribosomica S17 (RPS17). En otra realizacion preferida, el elemento 3'-UTR se puede derivar de un gen que codifica una protema ribosomica o de un gen seleccionado del producto de fusion de protema ribosomica de residuo ubiquitina A-52 1 (UBA52), virus de sarcoma murino de Finkel-Biskis-Reilly ( FBR-MuSV) expresada de forma ubicua (FAU) y protema ribosomica tipo L221 (RPL22L1).
Preferentemente, el al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente un 80%, de manera mas preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aun mas preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aun mas preferente al menos aproximadamente 99%, de manera mucho mas preferente de 100% con la secuencia de acido nucleico de una 3'UTR de un gen de protema ribosomica, tal como las secuencias de acido nucleico de acuerdo con las SEQ ID No. 10 a 115 o la correspondiente secuencia de ARN: Protema ribosomica de Homo sapiens L9 (RPL9)
g a t c t a a g a g t t a c c t g g c t a c a g a a a g a a g a t g c c a g a t g a c a c t t a a g a c c t a c t t g t g a t a t t t a a a t g a t g c a a t a a a a g a c c t a t t g a t t t g g a c c t t c t t c t t
{SEQ ID N O :10)
Protema ribosomica de Homo sapiens L3 (RPL3)
tgccaggaacagattttgcagttggtggggtctcaataaaagttattttccactgac (SEQ ID NO:11)
Protema ribosomica de Homo sapiens L4 (RPL4)
a c t c t t a a a t t t g a t t a t t c c a t a a a g g t c a a a t c a t t t t g g a c a g c t t c t t t t g a a t a a a g a c c t g a t t a ta c a g g c a g tg a g a a a c a tg
(SEQ ID N O :12)
Protema ribosomica de Homo sapiens L5 (RPL5)
acccagcaattttctatgattttttcagatatagataataaacttatgaacagcaact (SEQ ID NO:13)
Protema ribosomica de Homo sapiens L6 (RPL6)
atgtcttaagaacctaattaaatagctgactac (SEQ ID NO:14)
Protema ribosomica de Homo sapiens L7 (RPL7)
g g t g t c t a c c a t g a t t a t t t t t c t a a g c t g g t t g g t t a a t a a a c a g t a c c t g c t c t c a a a t t g a a a t
(SEQ ID N O :15)
Protema ribosomica de Homo sapiens L7a (RPL7A)
atgtacactgttgagttttctgtacataaaaataattgaaataatacaaattttccttc (SEQ ID NO:16)
Protema ribosomica de Homo sapiens L11 (RPL11)
attcccgtttctatccaaaagagcaataaaaagttttcagtgaaatgtgc (SEQ ID NO:17)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L12 (RPL12)
gcacaaaggaaaacatttcaataaaggatcatttgacaactggtgg (SEQ ID NO:18)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L13 (RPL13)
a g c c c t c c t g g g g a c t t g g a a t c a g t c g g c a g t c a t g c t g g g t c t c c a c g t g g t g t g t t t c g t g g g a a c a a c t g g g c c t g g g a t g g g g c t t c a c t g c t g t g a c t t c c t c c t g c c a g g g g a t t t g g g g c t t t c t t g a a a g a c a g t c c a a g c c c t g g a t a a t g c t t t a c t t t c t g t g t t g a a g c a c t g t t g g t t g t t t g g t t a g t g a c t g a t g t a a a a c g g t t t t c t t g t g g g g a g g t t a c a g a g g c t g a c t t c a g a g t g g a c t t g t g t t t t t t c t t t t t a a a g a g g c a a g g t t g g g c t g g t g c t c a c a g c t g t a a t c c c a g c a c t t t g a g g t tg g c tg g g a g t t c a a g a c c a g c c tg g c c a a c a tg tc a g a a c ta c ta a a a a ta a a g a a a tc a g c c a t g c t t g g t g c t g c a c a c t t g t a g t t g c a g c t c c t g g g a g g c a g a g g t g a g g g a t c a c t t a a c c c a g g a g g c a g a g g c tg c a c tg a g c c a g g a tc a c g c c a c tg c a c tc ta g c 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t t c a c t g a a a g t c a c a g t c t c c a g g g c t g t g t t g c t a a c c t t a c g t t c t c t c c g t t t g c t t a a t c t a t t a a g a g c c c t a a c a g g a g a g g a t g g g c t t t c t c t g t t g t c t g g g g c c c t g c t g t t g g c c g g t g c t c t t a g c a a g a g g t c a t t t t t c t a g g t t g c g c t g g g a c a t t g t g a g t t t g g t g a g g g t c a t g g a t g t g g g c t g g g c tg g g c tg g g c tg g g c c g g g c tg c c tg c tg c c tg c tg c t c c c c ta c c tg a a a tg c a g c ta g tg c g g c t c t g c c c t t c c t g g g g c tg a g g a a g g c t t c t g c a g g a ta g c tg g g g g g c tg g g c a g g tg g g tg a g g c a g c c t c c c t g c t g a c a c t c a g t c c t t g t a g c t g g a g c a a g a t c t c c t g a t c c a g g t a c g g g c c t g t c t g c t c c a a g a a a g a c t c t g c c a c c a g a t g c a a a g g g g c c c t t t g t t t t a a c t t a g t c c c tg g g g a c c g c c tg a t t c a g c a c c tg t c g g c c c a g g a ta c c c c g c 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c t g g g g c a g c c t c c c a c a g t g g g t g g g g c t t tg c c a g c a g tg c c c a c g g g g g tc a tg g g g c c a g g c g c g c tc c g g c g c c tg c a g a a c tg a t c g g g g a ta g tc tc a g g a g g c g c ta g tc a c g tg c c c c g g tg a tc g g g g a ta g tc tc a g a a g g c g c ta g tc t c c tg c c c c g g tg a tc g g g g a ta g tc tc a g g a g g c a c g a g tc g c c tg o c tc g g tg a tg c a c c g t t t c tc a c a c c g g c tg c tc tg g c c c g a g c ta a a g g g g a a g a c g tg tg c g g a ta g g a g c tg c a c a c a a t t t t c c t c c a t g t a t t g t t t a t t t t g c t t t t t c t t t t g g c t a g a c a t t a g g a a t t t c a g t t t t c c c a a g t t g t a t t t t t c c t t t t c t a t t t t a a a a t t a t c a t g c a g g g c t g g g t g a g g t c g c t c a c g c c t a ta g tc tc a a a a c t t tg g g a g g c tg a g g g g g g a g g a tg g c a tg a g c c c a g g a g t t ta a g g c tg c a g tg a g c c g a g a tc g c tc c a c tg tc c tc c a g c c tg c a tg a c a g a 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(SEQ ID N O :19)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L23 (RPL23)
ttctccagtatatttgtaaaaaataaaaaaaaaaactaaacccattaaaaagtatttgtttgc (SEQ ID NO:20)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L18 (RPL18)
ccctggatcctactctcttattaaaaagatttttgctgacagtgc (SEQ ID NO:21)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L18a (RPL18A)
gtgcagggccctcgtccgggtgtgccccaaataaactcaggaacgccccggtgctcgccgc (SEQ ID NO:22)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L19 (RPL19)
a a c c t c c c a c t t t g t c t g t a c a t a c t g g c c t c t g t g a t t a c a t a g a t c a g c c a t t a a a a t a a a a c a a g c c t t a a t c t g c
(SEQ ID NO: 23)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L21 (RPL21)
taggtgttaaaaaaaaaaataaaggacctctgggctac (SEQ ID NO:24)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L22 (RPL22)
a t t t c a t t t a t c t g g a a a a t t t t g t a t g a g t t c t t g a a t a a a a c t t g g g a a c c a a a a t g g t g g t t t a t c c t t g t a t c t c t g c a g t g t g g a t t g a a c a g a a a a t t g g a a a t c a t a g t c a a a g g g c t t c c c t t g g t t c g c c a c t c a t t t a t t t g t a a c t t g a c t t c t t t t t t t t t c t g c t t a a a a a t t t c a a t t c t c g t g g ta a ta c c a g a g ta g a a g g a g a g g g tg a c t t ta c c g a a c tg a c a g c c a t tg g g g a g g c a g a tg c g g g t g t g g a g g t g t g g g c t g a a g g t a g t g a c t g t t t g a t t t t a a a a a g t g t g a c t g t c a g t t g t a t c t g t t g c t t t t c t c a a t g a t t c a g g g a t a c a a a t g g g c t t c t c t c a t t c a t t a a a a g a a a a c g c g a c a t c t t t c t a a g a t t c t c t g t g g g a a a a t g a c t g t c a a t a a a a t g c g g g t t t c t g g g c c a t t c g t c t t a c t t t c a t t t t t t g a t t a c a a a t t t c t c t t g a c g c a c a c a a t t a t g t c t g c t a a t c c t c t t c t t c c t a g a g a g a g a a a c t g t g c t c c t t c a g t g t t g c t g c c a t a a a g g g g t t t g g g g a a t c g a t t g t a a a a g t c c c a g g t t c t a a a t t a a c t a a a t g t g t a c a g a a a t g a a c g t g t a a g t a a t g t t t c t a c a g g t c t t t g c a a c a a a c t g t c a c t t t c g t c t c c a g c a g a g g g a g c t g t a g g a a t a g t g c t t c c a g a t g t g g t c tc c c g tg tg g g g c c c a g c a a tg g g g g c c c c tg a tg c c a a g a g c tc tg g a g g t t c t t g a a a g a g g g g a c a c g a a g g a g g a g tg a c tg g g a a g c c tc c c a tg c c a a g g a g g tg g g a g g tg c c c tg g a a a ta g c t g c c t c a t g c c a c t t a g g c c a t g a c t g g a t t t a a t g t c a g t g g t g t g c c a c a g t g c a g a g g c t a g a c a a c tg a a a g g g g c ta c c a a g g c tg g g a a a a a a a tg c a a t tg t t g c tg tg a g tg a c t t t g a a a g a c t c t g g t g c c t t g t g g t g c c c t t c t g a a a t t c a a a c a g t a a t g c a a a a g t g t c t g c a t t a g a a t t t a c g g t g t c t a a a a t t c a t g t t t t t a a a a g a g c t t g c c t a c a g a t g g t t t c c a c a c t t g a a a t t g t g c c c t g c g a g t t g c a t a g c t g g a a g t t c a a t g c t c a g t c c t a c c t t g g c t c c c a t t a a a c a t t t g g t g c t c t g t g g a t t g a g t t g a a c g t g t t g a g g c t t t g c a a t t t c a c t t g t g t t a a a g g c t c t g g c a t t t t t c c a t t t c t a t g c a a a t t t c t t t g a a g c a g a a t t g c t t g c a t a t t t c t t c t c t g c c g t c a c a g a a a g c a g a g t t t c t t t c a a a c t t c a c t g a g g c a t c a g t t g c t c t t t g g c a a t g t c c c t t a a c c a t g a t t a t t a a c t a a g t t t g t g g c t t g a g t t t a c a a a t t c t a c t t g t t g c a t t g a t g t t c c c a t g t a g t a a g t c a t t t t t a g t t t g g t t g t g a a a a a a c c c t g g g c t g a a g t t g g c a t t t c a g t t a a a a g a a a a a a a g a a a c t a g t c c c a g a t t t g a a a a c t t g t a a t a a a a t t g a a a c t c a c t g g t t t t c t a t g t c t t t t t g a a c t c t t g t a a t c g a g t t t t g a t c a t a t t t t c t a t t a a a g t g g c t a a c a c c t g g c t a c t c t t a c t g t
(SEQ ID N O :25 )
Protefna ribosomica de Homo sapiens L23a (RPL23A)
a c t g a g t c c a g c t g c c t a a t t c t g a a t a t a t a t a t a t a t a t a t c t t t t c a c c a t a t a c a t g c c t g t c t g t c a a t t t c tg g t tg g g c tg g g a g g c c a c a c a c a c a c a c tg a c a tg a c a g g g c t tg g g c a a g a c t c c t g t t c t a c t t a t c c t t t t g a a a t a c c t c a c c c t g c c a c t c c a c c a t g t a t g a t c a t t c c a g a g a t c t t t g t g a c t a g a g t t a g t g t c c t a g g a a a a c c a g a a c t c a g a a c t t g c c t c c a t g g t t g a g t a a c a a g c t g t a c a a g a a c c c c t t t t a t c c c t g g a a g a g g c t g t g t a t g a a a c c a a t g c c c a g g g t t t g a a g g g t g t t a g c a t c c a t t t c a g g g g a g t g t g g a t t g g c t g g c t c t c t g g t a g c a t t t t g t c c t c a c a c a c c c a t c t a c t a t g t c c a a c c g g t c t g t c t g c t t c c c t c a c c c c t t g c c c a a t a a a g g a c a a g g a c t tc a g a g g
(SEQ ID N O :26)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L17 (RPL17)
attcagcattaaaataaatgtaattaaaaggaaaag (SEQ ID NO:27)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L24 (RPL24)
actggcagattagatttttaaataaagattggattataactctag (SEQ ID NO:28)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L26 (RPL26)
agtaatcttatatacaagctttgattaaaacttgaaacaaagagcctg (SEQ ID NO:29)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L27 (RPL27)
atgctttgttttgatcattaaaaattataaag (SEQ ID NO:30)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L30 (RPL30)
a c c t t t t c a c c t a c a a a a t t t c a c c t g c a a a c c t t a a a c c t g c a a a a t t t t c c t t t a a t a a a a t t t g c t t g t t t t a a a a a c a t t g t a t c t
(SEQ ID N O :31)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L27a (RPL27A)
a g c c a c a t g g a g g g a g t t t c a t t a a a t g c t a a c t a c t t t t t c c t t g t g g t g t g a g t g t a g g t t c t t c a g t g g c a c c t c t a c a t c c t g t g t g c a t t g g g a g c c c a g g t t c t a g t a c t t a g g g t a t g a a g a c a t g g g g t c c t c t c c t g a c t t c c c t c a a a t a t a t g g t a a a c g t a a g a c c a a c a c a g a c g t t g g c c a g t t a a a c a t t t c t g t t t a t a a a g t c a g a a t a a t a c c t g t t g a t c a c t g a a a g g c c t g c a t g t a t t g t a c t c t g a a t t t t a c a g t g a a t g a g a g a a t g t a c c c t a a t t g t t c a a c a g g g c t c a a a a g g a a a g a t t c c a t t t t g a t g g g t c a c a t t c t a a a g a g g g g c a g t g t g a t a g g a a t g a g a t g g t c c t t t a g g a c t t a a g t t c t c a g c c c a a g g t t t t t c c a c g t g g c c c c c t c a t c t t t t t t t t t t t t t t a a a c g g a g t c t c t c t t g c c a g g c t g g a g t g c a g t g g c a c g a t c t c g g c t c a c t g c a g c c t c c g c c t c c c a g g t t a a g c g a t t c t c c t g c c t c a g c t t c c t g a c t a a c t g g g a t t a c a g g c g c c c a c c a c c a t g c c c a g c t a a t t t t t g t a t t t t c a g t a g a g a t g g g g t t t c a c c a t g t t g g c c a t g c t g g t c t c t a a c t c c t a a c c t c a a g t g a t c t g c c c a c a t c g g c c t c c a a a a g t t c t g g g a t t a t a g t g t g a g c c a c t g c g c c c g g c c a t g g c t c c t t a a t c t t g a t c c a a a t t a t t g t t a c a t c c a g a a t g t g a t g a a t c a a a a t c t c g a g a t g g g g g t c c a g c a a t c t g a a a t t t c a g t a t g c c a g g g c t t t t c t g t a t g t c a a a g t g g g t t t g a a a t a g t t a a t t t t t c t t c t a g t c t g a a a t g t a t c g g g a a a a t t t g g a a a t c c t g a a g g c t g g a a a t t g a a a t a a g t t t t t c t a g g a t t t g t g t c t c t t g c t a t t g g a a a a c t g a t g g t g a c c a a t t c a t g t t t a c a a a t a a g a t c c t c a t a g a t c t c g g t a a a t t a t a a t t t g c t a c a g t t t t a t g g t t c t t c c t g t g a t t t t g a g c t t t t t t t g a c c c a a a a t a a t a c a g t c t a a a a c t a t a g a c a a a t a a g a t g g c a c t t a g a c t c c t g g g t t t t a g t t a g t g g a g g t t t c c t t a g t g c a c t g t g g g g t c a t a a t a a g c c g a g a a c c a t g g c t g t c t a t g g g a c a c a t c t g t c a g g a c a a c c t t t a g a g g a tg t t g g g g a t c a a a ta g a a g g c a c a g a g a a g c a c t g a a t t g g c t t a c a t a a g a a t a g g c t a g a a t t a c a a g t a g t g a a a c c t c g a t t c a g c t g g a c a a t t t t a a a c a a a t g t a t c a t t t g g c t t g t a t c t t c t g t t g t g c t g g a g a a g t t a g a a a t a a g g g c t c t c c a g a c c a g c c tg a c c a a c c tg g a g a a a c c t t g t c t c t a c ta a a ta c a c a a a a t t a g c c a g g c g tg g tg g c a c a tg c c tg ta a t c c c a g c ta c t t t g g a g g c tg a g c c a g g a g a a t c 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c c g a t c c c c t g g c c t g g g a a a g a a a c a c t g a t t t c g t t g c t g g c t t g t t c a c t c a c c a g a a g c t a c a g c t a c t a a c a g t t c t a a a a a c t g t t t c a t g t g a t g a g g a a c a g a c g a a a a t a g t t t t g a g c c c t a a g t c c g c c g a t t c c a g t g c t t t c t t g a a c c c g c a t t t a c t a a a a t a t t t t c a t g a c t g c c a a g c t t t g a a t a g c c t g c t g t g t t c a t g g a g g c t c a t a c t g g c g a t c t c t a g t g g c t g g c t a a a g c t t g a a t t g c a a a a g a t c t a a t t t c t g g t c t a a t g t a t a t a t g c c t t a a a t a t a g t t g c g t t c a a a c g t g g g a g c t g c a g g t g c a a c t t g a t t t t a t g a c a a a t g g c t g c c a c a t a a t t t g c a c a a g c a g t g c t c g t c a a g g g c a g c ta a a t c a g g c g a g c t t t c a a t c a a a a ta a a tg ta c ta c ta a a c c c ta c t ta g c g g c ta a c ta g c c c a a g a g c a g a c a g c c c a c g g a c g g a c tg c a a g tc g g a 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c t t g t a c a c g g a tg g a a a t a t t c t a g a a g a a c a t a a a a g g a a t t t c c t c t t a g g a g g t t a g g g a a a t g a g c a c g a a g t a t g t t t t g g t g c a g t t t t t t g t t c a a c c c a a t g c g t a t t t t c a t a t t g a g a g g c a a t a t a a a t g g a g c g a a a g t a t c t t g a g a a a a a a a a a a a a a c t a c c a g a a c t t g c c g t t g c t g a a a a g t a a t a t t t t c t c t t t c g a g a g t t t t c a t g g c c t t t t a a a t t a c a c c c c c a c c t c c a c a g g c a a a t a a a t t t g t t t t g g a a t g c a t a c c a c a t c a t c t g g c t c t a g a a a c g t a t t t t g t g t a g c t c c c c t a g c a a g a a t a t a g g t t a a a g c g t a a a t t t a a t t c c t g g c t c t a t t t t a c a t c c c a a t t t t t a t t t t c c t c t c a t t c c c a c t t t a c g t t g t t t c a a a t a a c c t a g t t t g t g t a t c c c t g t a a g t c a t t t t g g t a t a a a g t a g g t t a t a a g t g t a c a t g c g a a a a g a t g t t t t t a a c a a a a a t g t a a c t g
(SEQ ID N O :32)
Proteina ribosomica de Homo sapiens L28 (RPL28)
g c c t tg c tc tg c tc c c c c g c c c c c a g g c a g c c a tc c g c a g g g c c a g c g c c a tc c tg c g c a g c c a g a a g c c tg tg a tg g tg a a g a g g a a g c g g a c c c g c c c c a c c a a g a g c tc c tg a g c c c c c tg c c c c c a g a g c a a t a a a g t c a g c t g g c t t t c t c a c c t g c c t c g a c t g g g c c t c c c t t t t t g a a a c g c t c t g g g g a g c t c t g g c c c t g t g t g t t g t c a t t c a g g c c a t g t c a t c a a a a c t c t g c a t g t c a c c t t g t c c a t c t g g a g g tg a tg tc a a tg g c tg g c c a tg c a g g a g g g g tg g g g ta g c tg c c t tg tc c c tg g tg a g g g c a a g g g t c a c t g t c t t c a c a g a a a a a g t t t g c t g a c t t g t g a t t g a g a c c t a c t g t c c c a t t g t g a g g tg g c c tg a a g a a tc c c a g c tg g g g c a g tg g c t t c c a t t c a g a a g a a g a a a g g c c t t t t c ta g c c c a g a a g g g tg c a g g c tg a g g g c tg g g c c c tg g g c c c tg g tg c tg ta g c a c g g t t tg g g g a c 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g a g t t g g g t g a c t t g g ta c c tg c tc a g g a c c c c c c g c a c tg tc c c a a tc c c a c tc a g g c c c a c c tc c a g c tg g c c tc a c t c c g c tg g tg a c t t c g ta c c tg c t c a g g a g c c c c c a c tg t c c c a g t c c c a c t c a g g c c c a t c t c t g g c t g g c c t c a c tg c g c tg g g a c t c c g c c t t c a ta a g g a g a g c t c a c tg c t c a c g t t a g ta g a tg g c c c c t t c t c g t g a g g c c t c t c c c c t g g c a c c t g c t t c a g t t g t c c t c c a c a g c a c t g a t t t g c a g c c c a c a a g c t g g c a g g t t t a t c t g t c t c a t g t t t g t c t t g t g c t g g t g g g c a a g g g g t t t g t c t a g c a c a c c a g c a t a t a a tg a g a tg c t t g a tg a a tg g tg c a ta t t g a a tg ta ta a a g c c c a c c g g t c c tg a g a g t t t g c t c a c t g g a g a c t t t c t g g a g a t g g a g t c t c g c t c t g t t g c c c a g g c t g g c g a g t g c a a t g g c g c g a t c t t g g c t c a c t g c a g c c t c c a c c t c c t g g g t t c a a g c g a t t c t c c t g c c t c a g c c t c c c g a g t a g c t g g g a t t a c a g g tg g g tg t c a e c a c a c c c a g c t c a g ta t t g t a t t t t t a g c a g a g a tg g g g t t t c a e c a t t t t g c c c a g g c t g g t t t g g a a c t c c t g a c t t c a a a t t a c c c a c c t g c c t c a g c c t c c c a a a g tg c tg g c a t t a c a g g c g c t c g a g g c t t t c t g a tg tg g c tg c tg c tg c t c a g a a g g c c t t g t c c t t a a c c a c c t c c t t g c c t g c c c t g g a g g c t t g t g c c t c t a g g c c c c a c c c c c t g t g g a g t c c t g c t g g c t t t c t c c a t c c c t a t c t g a a t c c t c c c t g c t g t g t g g c c t c c c c t g g t c t c a t c c g t a a c a c a g c c c a g c t t a g tg g g c c t c t g t t c c t g c g g g tg g c c a g c c tg t c t g t g t g g c tg g g c tg g g g a g g c c a c g tc tg g ta tc tg a a tg c ta tc g g tg g g t tg g g g tg g a g g a a c c a g g a g a g g g c tg g a g g g a g g g a g a tg g tc tc a g c c c c a c a g a g t t tg g a g tc c tc a g tg tg c tg a g c a a a c g tg g a g a c a c c a t t t c c c t c c t c t a g a c c t c a t c t t g g a g a g a g a g a t g t t g g a t g g g g c c a t c t a t t c c a g c t t t a t t c a c a c a a a t c a tg t c t g t t g g c c tg g a a a t t g g a a a a c c a g t t a a a c c a a a a a c a tg a ta t t a a g a a a a c a g g c a g g c tc a e c a ta g ta a a a a tg c tg a a a g c c a a a g a c a a a a ttg g g a g a a c a a a a g a a a a g c g tc t tg tc a c a ta c a g a a g g tc c c tg a ta a a g t ta g ta g c tg c c c tc a tc a g a a a c c a g g c c c a g g c a g tg g g g a c a c a tc c a g a g tg c tg a a a g a a c c tc c c c c a g g tc a tc c ta tc c c c a a g a g tg a tg c c c g g c a g c a t tc c c a g c tc a g g g c ta a tg g t tc a c g g a a g c c a g g a a tc a a a c tg c c tg g g t t c c a g t c c c a g c t c t g c c a g t t a t g c c c a g c t g t g g g g a c t t g g g c a g c t c g t t t a g t a g c a c c g t g c c t c a g t t t c c c a t a t g t a a a a g g c c a t t t t g a g t g c c t t t c a c a g c c c t g c a t a a g g c a g g t g t c t c a g t g t t c a c t g c t g t c t c t c c a g c t c t t a g t c c a g t a g c t g c a t g g t g a g t g a g c g t a g g g c g c a c c c tg g a a g g c tg c c a a g c c c a a a g t tg tg c a g a g c g c tg g g g a c tc c a g a c tc c c c a c a g c a g c a g a g a c tc g g g a c tg a g g c a t c c t c t g t t c a c a g g a c a tg c tg g c a t c t a c tg g g t c a g g g c t c t g c t g c t c g g t g g c t g t g c a a c c t t g g g c a a g t t c c t c a a c c t c t c t g t g t c t t c g t a c c c t c a t c t g t a a c a t g c g t g t c g a t a g a c c c t a c t a c t c a g g g t t g a t g a g a a g a t t a a a t g t g c a a a a c c t g c t t g a c t g t g c c c a c a a a t c c t g a t t g t a g g a a t a a a t t a a t g a c t t t t t a t a a a t a t t t t g a t c a g a t g g a c t c a t g a t c a c a g a t g t c t t c a c a t g c c t a t g a c t a a t t t g t a c a c a a a c t a a t g c t c g t g t t t c c c a a g c a c c t g g a a g a c a t g c c a g a t c c a t g t g c a g t a a t g c c t g g t g g c t c c a g g t c t g c c c c g c c g t c c t g t g g g g c t g t g a g c t t t c c c a g c c t c c t g c c c g t g t t t g t g a a t a t c a t t c t g t c c t c a g c t g c a t t t c c a g c c c a g g c t g t t t g g c g c t g c c c a g g a a t g g t a t c a a t t c c c c t g t t t c t c t t g t a g c c a g t t a c t a g a a t a a a a t c a t c t a c t t t
(SEQ ID N O :33)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L28 (RPL28)
t t t t t t a c t g t c a g g c a g g a a g a g c g g t a a c t g c c a t c g c g g c g g g c a t c c c t g g c g c c a g g g t g t t g g t c t g g g t a c c g g c t t c c c t c t c g g c c g a c t t g t c a g c t c t g t g a g c c g c g c g c g t c t g a g c c c g t g t c c t c a c c t g t a a a g t g g a g a a a t g a a a a a g g a c c t g a a c t t c c t c g g t g g t t g t t g a g a g t t a a g g c a c g g g g t t g a t g t t t t c a g a t g a a a t t c t c a a a g c a a g t c a g g g t g g g g a t g g a t g g t t t c a tc c c a c a g g tg g g a a g a t tg a g g
(SEQ ID N O :34)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L28 (RPL28)
g t t t t t c t c a g g t c c t t g a t t g g a a c t g c c t c a g a g c c a a g g g t c c t t t t a c t c a g t g g c a g c a a c a a a c g c a g t c t g t t g g c ta g tg a t c c t c c tg t c t c a g g g a c a c g ta g t c c a g g g a g c a g c c a a t t g c t t g g c a c t t g g g g a c c c c g t t c t g g g g a g t c c t g a a a g c t t t c a c c t c t t g g a t t g c c g a a t a c a tg g g tg g c c c t t c c t a g a c ta a g g g a c tg g c c tg a g tg a g g c tg g g c c t c t c a g c c a a g c tg a tg t t g a a c c a c tg c tg tg g g g a tg g g c c tg g g g t t c c t g g g a a g c tg t t c a ta c c c a t t g c c a g g a g c g tg g g c tc t g g c tg g a c c tg g a t c a g a t c c ta a c tg a a g c g g c a g c t t t c t g g c a tg a g a a a g g a g t g t t t t c a t g g t g g a c a g a a t t g g g c t a t g a g t g t
(SEQ ID N O :35)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L29 (RPL29)
a ta tc tc tg c c a a c a tg a g g a c a g a a g g a c tg g tg c g a c c c c c c a c c c c c g c c c c tg g g c ta c c a t c t g c a t g g g g c t g g g g t c c t c c t g t g c t a t t t g t a c a a a t a a a c c t g a g g c a g g
(SEQ ID NO: 36)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L31 (RPL31)
a g g g a g c c o tc c tg g a a g tg g a tg a g g c c t tg g g tc tc g g c tc t tc a t tg c t tc c tg a g c tg c a g c a g a tg c c t t ta c a a c c a a g c tc a c c g a g g a c g tc tg tc tc c c a ta t ta c c c tg g c a g a g g g c c a g g c c tg t t c ta c a c g g c c g g g g t t t c a a c a a g g ta c tg a tg t c t t c tg c c c t tg c c t c t t c g a c a g g c a a g ta a ta a g a c t ta a g tg a a g a g a a t t c t t t a g g c a c a c a a a t t c a c a t t t g a tg ta a tc t c a t t a t a c t t c c t g a t c t g t g a t t g a a a a c t t t c a t t t c g t a a c t a g t a t g t c t g t c c c a c c t t t a a a a a g t t t t t c a t t a t g a a a g t a a g t a t t t g t t a g a a t t a a g t c t a t t t a a a t g a a a a a a a c t t a g a t a t g a g tc tg c a tg g c c tc a g g a a a a tg a tg t t t t a a a a ta g a g a t t t t a g g t tg t c tg c a c tc ta g c t t t t t t g t c g t t t t c t t a a g g c t t t t t t a a c t g c a t c a a a a a t t c a g a t a c g a a a c a t a c a c t a a a a a a ta a ta c a t c a t a t c t t a a t t t c c a c t g a a c t t g a t t t a a a t t c a g a g t t a c a c a g t a t g a a t a t c a c a a tc a g a ta tg t tc a a a a a g g tc tg a a c a a t tg a t t t t c tg a a a c c a tg a a g g a c ta c
(SEQ ID NO: 37) ' ’ "
Protefna ribosomica de Homo sapiens L31 (RPL31)
a g c c a t t t a a a t t c a t t a g a a a a a t g t c c t t a c c t c t t a a a a t g t g a a t t c a t c t g t t a a g c t a g g g g t g a c a c a c g t c a t t g t a c c c t t t t t a a a t t g t t g g t g t g g g a a g a t g c t a a a g a a t g c a a a a c t g a t c c a ta t c t g g g a tg ta a a a a g g t t g t g g a a a a ta g a a tg c c c a g a c c c g t c t a c a a a a g g t t t
t t a g a g t t g a a a t a t g a a a t g t g a t g t g g g t a t g g a a a t t g a c t g t t a c t t c c t t t a c a g a t c t a c a g a c a g t c a a t g t g g a t g a g a a c t a a t c g c t g a t c g t c a g a t c a a a t a a a g t t a t a a a a t t g c c t t c
(SEQ ID NO: 38}
Protefna ribosomica de Homo sapiens L32 (RPL32)
g c a g c t c a t g t g c a c g t t t t c t g t t t a a a t a a a t g t a a a a a c t g c c a t c t g g c a t c t t c c t t c c t t ; g a t t t t a a g t c t t c a g c t t c t t g g c c a a c t t a g t t t g c c a c a g a g a t t g t t c t t t t g c t t a a g c c c c t t t g g a a t c t c c c a t t t g g a g g g g a t t t g t a a a g g a c a c t c a g t c c t t g a a c a g g g g a a t g t g g c c t c a a g t g c a c a g a c t a g c c t t a g t c a t c t c c a g t t g a g g c t g g g t a t g a g g g g t a c a g a c t t g g a c c t c a c a c c a g g t a g g t t c t g a g a c a c t t g a a g a a g c t t g t g g c t c c c a a g c c a c a a g t a g t c a t t : c t t a g c c t t g c t t t t g t a a a g t t a g g t g a c a a g t t a t t c c a t g t g a t g c t t g t g a g a a t t g a g a a a i a t a t g c a t g g a a a t a t c c a g a t g a a t t t c t t a c a c a g a t t c t t a c g g g a t g c c t a a a t t g c a t c c t ; g t a a c t t c t g t c c a a a a a g a a c a g g a t g a t g t a c a a a t t g c t c t t c c a g g t a a t c c a c c a c g g t t a ) a c t g g a a a a g c a c t t t c a g t c t c c t a t a a c c c t c c c a c c a g c t g c t g c t t c a g g t a t a a t g t t a c a i g c a g t t t g c c a a g g c g g g g a c c t a a c t g g t g a c a a t t g a g c c t c t t g a c t g g t a c t c a g a a t t t a g i t g a c a c g t g g t c c t g a t t t t t t t t g g a g a c g g g g t c t t g c t c t c a c c c a g g c t g g g a g t g c a g t g g i c a c a c t g a c t a c a g c c t t g a c c t c c c c a g g c t c a g g t g a t c t t c c c a c c t c a g c c t t c c a a g t a g c t g g g a c t a c a g a t g c a c a c c t c c a a a c c t g g g t a g t t t t t g a a g t t t t t t t g t a g a g g t g g t c t a g i c c a t g t t g c c t a g g c t c c c g a a c t c c t g a g c t c a a g c a a t c c t g c t t c a g c c t c c c a a a g t a c t g g i g a t t a c a g g c a t c t t c t g t a g t a t a t a g g t c a t g a g g g a t a t g g g a t g t g g t a c t t a t g a g a c a g a i a a t g c t t a c a g g a t g t t t t t c t g t a a c c a t c c t g g t c a a c t t a g c a g a a a t g c t g c g c t g g g t a t a j a t a a a g c t t t t c t a c t t c t a g t c t a g a c a g g a a t c t t a c a g a t t g t c t c c t g t t c a a a a c c t a g t c : a t a a a t a t t t a t a a t g c a a a c t g g t c c t t c
(SEQ ID NO: 39 )
Protefna ribosomica de Homo sapiens L35a (RPL35A)
a c t a a c g a a a a a t c a a t a a a t a a a t g t g g a t t t g t g c t c t t g t a t t t t t a a g t g g a t t a a a a a a c t t a c t a c c t t
(SEQ ID N O :40)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L37 (RPL37)
g a a t g t c a a c g a t t a g t c a t g c a a t a a a t g t t c t g g t t t t a a a a a a t a c a t a t c t g g t t t t g g t a a g g t a t t t t t a a t c a a t t a g g c t t g t a g t a t c a g t g a a a t a c t g t a g g t t t a g g g a c t g g g c t a g c t t c a t a t c a g a t t t a c t t g t t a a g t g a c t g t t t t g g a a t g t t t a c t t t t g g a c t g g g t t t g t a a c a c g g t ta a a g g c a a tg a g a a a c a a g c a g a a t tc c a g g a g tc c t tg a a g c a g a g g g c a c tg g a a g a c a a t a t a g c a g a t t a a a a t a g c a c a g c t c a t g t g g c a t a g g t g g g t a t t t t a g a t g t t t g a g t a a a t t t g a a a g a g t a t g a t g t t t a a a t t a c c t t t a g c a a c a t g t t c a t c t g c t a t g c t g t c a t g a c t a g g g g g a t g a t t a t t a g t c a c a t a g a g c t t g g g a g t a c c a c t g g a a a c g t a t g g g t a g g a g t t t a g g t g g c t t c t g t t t t t c a a a a g a t g a t c t t a t c c t a g t a t c t g t a a t g c t c a c t t g g c a c a c c t g a c t t g t g g g c t g t g t g t a a g g t g g c t a g c t a a g t g a a a a a a g c c t g c t a g g t g t g a g t c a a c t t a a g a a t a t g ta a a ta g g t t tg a g a a a a a g ta g g g c t tg g g tg c a a g ta a a g a t tg a g c a g g a a a ta a a g g a a a a t c a a g t a t a a t c c c t g a g a t t t g t a g a c t a a a g g c a a t g a t g t g g g a c t a c t t g g t c g a a t t t t t t t a g c c c t c a a c t t g g t a a t t g g g t g t t t c t g t g t t a a a g c a c t g a a a c t t g c t g t c g t g c c t t e c t a g t t t t c g t g g t t t a t t g a c a g g g t t g g g g g t t t t t t t t g t t t t t t t a a a a t g a a g g g a c a a a g t c a a c tg g a c tg c tg a g tg a g a g g g c a g g g g c a g t tg a a g g g a a c a tg a a t tg c tg g a a c a g c ta c a ta a a a t a g t g a t g t a g c c a a g t c a t g c t a t t t a a a t t a t a a t t c t c c a c t g t g t t t a g a a t a a c a t c t g a g g t t c t t a a c c t g g c c t t g g a a g g g t a t c a c t t t t a c t t g t a a c c t g g a a t g g c t t t a t a a t g t g c t a g c t a a t t g c t a c t c t c a t c t t g t a t t t t a a c t c c t a a t t t a c c c t t c a g g t c t c a g c t t c a g a a c a t t c a c t t a t a a a g a a a c c c t g c t g a t t a a a t c t c t c t t g g g c t t c c t c c c
(SEQ ID NO: 41)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L37a (RPL37A)
acgctcctctactctttgagacatcactggcctataataaatgggttaatttatgtaac (SEQ ID NO:42)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L38 (RPL38)
accagacacactgattggaactgtattatattaaaatactaaaaatcct (SEQ ID NO:43)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L39 (RPL39)
g g a a t t g c a c a t g a g a t g g c a c a c a t a t t t a t g c t g t c t g a a g g t c a c g a t c a t g t t a c c a t a t c a a g c t g a a a a t g t c a c c a c t a t c t g g a g a t t t c g a c g t g t t t t c c t c t c t g a a t c t g t t a t g a a c a c g t t g g t t g g c t g g a t t c a g t a a t a a a t a t g t a a g g c c t t t c t t t t t
(SEQ ID N O :44 )
Protefna ribosomica de Homo sapiens, grande, P0 (RPLP0)
t c a c c a a a a a g c a a c c a a c t t a g c c a g t t t t a t t t g c a a a a c a a g g a a a t a a a g g c t t a c t t c t t t a a a a a g t
(SEQ ID N O :45)
Protefna ribosomica de Homo sapiens, grande, P1 (RPLP1)
acctcttttataacatgttcaataaaaagctgaacttt (SEQ ID NO:46)
Protefna ribosomica de Homo sapiens, grande, P2 (RPLP2)
attcctgctcccctgcaaataaagcctttttacacatctc (SEQ ID NO:47)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S3 (RPS3)
c a g g g t c t c c t t g g c a g c t g t a t t c t g g a g t c t g g a t g t t g c t c t c t a a a g a c c t t t a a t a a a a t t t t g t a c a a a g a c a c a a g g t c t g a c t a g a c t g t t c a g t a t t c a g a c t g a g g g g c a t g t t g g c c t c t g g a g c a t t a c a t a t c t t c t t g g t t t t a a c c a t a c t t g t g g t a t t t g c a a g g g c c a g a a c a g t a a g a c c c a a g c a g a g c c a a c c a g a g a a a ta a ta t t tg tg tg a ta g a g a a g g c tg a ta g c a a g c a a g g c a g c a c c t t g a t t c g t t g t c c t g t a g t t c a g g a t t g t a g g t t t a g a a g a g g g a t a t g t t t g a g t t t t t c c t a t g c a t a a g g c g a t c c a c g t t g c a c a t a g a a a g t g a a t a t a a a t g g c c a t t a t a t t t t g t g t c a t g c t g t g c t c t a a g t g t t c t t t a c a t a t g t a c t c g t t a a t c a a c c t c t c t a a a g t g t a a a g g a a a t t t g c t t g c a c c a c tg a a g g c a c a t a a g g c t c a g a a g t a a a t t t g c c t a a g c a g t a t a a a g c t a t c a t t a g a a t c c a c a t t c c t a a g t t g t g t t c t c t t a g g g g a t c a t g g a a c c a g t c a t t g g t a c t a c a g g c t a t t a t g t t c t g g a g a a c t g t g a a g a a c a t t t a a a t t g t c t c t g a t t t t a t c t a t c a a t g t t t t g a a g t a t t t t c t a c c a g t g t c t g t a c t t e a c a a g a a a t t c g g c a c t a t t t t t t c a g g c a a a a c t a g t g a g g g a c a g g t t g g c t t g a a a a t c a t g a g a c t g t t g t t a a a t c a g a t g c t g g t t g a t c a c a g a g g g g a c t t c c a g g g a a a g c t g t t a t c a g g t g g c t g c t t c c t g g t g a t g c a g c c t g g c t g a t g a g a t a a c c c t g g c t c c a c a g a t g g c t t a g c . a g g t g c t g t g a t g a t t t g g t t t t c t t c t c a a t t a g a c t g a g c t g c a c a t g g t g t t t a t a t t g c t t g g c a c a t g g t a a g g g c t t a a t a t t t g a g g t a a t t a t g t a g g g c g t a c a c t g a c a a g t a t c t g a c c c c c c c t t c c t t t t t g a c t c a t a a a t t g g t c a t c t t a a c c a t t t a a g t g t a c a c t t c t a t a g t g a c a g a g t t a g c c c t c t g t c c a a g g g a t t t g c a t c t g t g g a t t c a a c c a a c t t t g g g t c a a a a a t a a t c a a a a a g g a t g g t t g t g t g t g t a t t g a a c a t g t a g a c t t a t t t t t c t t a t t t t c a a a a t a c t a t a t t t t c t t g t c a c t t a t t t t c t t g t a c a c t g c a g t t g t a a c a g c t a t g t a g c a t g t a c a t t a g g t a t t a a a a g t a a t c c a g t g a a g a t t g a a a g t c t
(SEQ ID N O :48)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S3 (RPS3)
c a g c c t c t t c c a t g a g t g g g g a g c c c g c t g c t t g t c t c c a g c t c c t a g c a g t g a g t c c t g a t a a t c t c a a a t t t a a g g a c a g t a a c t t t g t c t g g g a t g a g t g t g g g a a a g g a t g t g t t t g g g a a c a g a c g c g a g c c t g c a g a g g t g t t t g t a a c c a t c t c t t t c t a a g t g g t g g g a a g c a g a c a t t t t a t t c t t t a a
c t g t t a a t a t a t a t a g t g t g t g t t t t t t a t g c a t g a a a t a t t t t a t a g t t t t t a a a a a t g c c c a c a c t a c t a t t t t g a a a g t a a a t g a g g t a a t g t a t g t g t c a g a a c c c a a t a c c c a a a g c g a t c g t a g t a a g a g g tg g g g c c t t t g g g a a g g c a t t a a a t t g c t t a g g g a a tg a g g g tg g a a c c c t c a tg a a tg a g a t t a g a g c c t t a t a g g a g a g g t t g g a g g g a g t t g c c t g g c c t c c c t c t c c c a t g t g a a g a c t c a g c a a g a a a a c a t t a t t t a g g a a g c a g a g a g c c c t c a t c a a a c a c c a g a t c t g c tg g c c a c c tg a t c t g g c a c t t t c c a g c c t t c a g a a c t g t g a g a a a t a a a t t t c t g t t g t c t a t
(SEQ ID NO: 49)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S3A (RPS3A)
agttcagacttcaaatagtggcaaataaaaagtgctatttgtgatggtttgcttctg (SEQ ID NO:50)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S3A (RPS3A)
a g c t c a c g t t g a t g t c a a g a c t a c c g a t g g t t a c t t g c t t c g t c t g t t c t g t g t t g g t t t t a c t a a a a a a c g c a a c a a tc a g a ta c g g a a g a c c tc t ta tg c tc a g c a c c a a c a g g tc c g c c a a a tc c g g a a g a a g a tg a tg g a a a tc a tg a c c c g a g a g g tg c a g a c a a a tg a c t tg a a a g a a g tg g tc a a ta a a t t g t a a g t g t t t c t t t g c t t c c t c a c a c a a c a c a a c c t t g a g t a t t g g a t t a t t c c t g a g a t g a g a g a a c g c a t a t g a g a c a a g g t a a a g g t c t g t t g a a a t c c t g t c t g t g a a t c c t t c t a g c t a t a t c t c t t t a a g t g a a a g a g t g t t a a g t a c t c a g t a a a t a t g a t t a t t a t t a c t a t t a t t a t t t g a g t c a g a g t c t t g c t c t g t t g c c c a g g c t c g a g t g c a g t a t t g t g a t c c t c c t t g g c t c a c t g t a a c c a c t g c t t c c t g g g t t c a a g c a g t t c t t g a g c c t c a g c c t c c t g a g t a t c t g g g a a t a c a g g g g a c t g c c a c c a t a c c c a g c t a a t t t t t t t a a a t t t t t a g t a g a g a t g g g g t t t c a t c a t g t t g g c c a g g c t g g t c t t g a a c t c c t g a c t t c a g g t g a t c t g c c a g t a c t c t a a a t g a t a a c a g t t t t t t c g t g t t t a t t t a t t t t g a a t g a a g c t g t c t c a c a g t a g a t g g a g t t g a a g g a c a g g a a a t g t t t t t c c c c t a c t t g g a a a a ta c a c tg a a ta a g t t g a g tg g g g tg g g a tg tg c c tg g a g t c c c a g c ta c t c a g g a g g c tg a g g tg g ta g g a t tg t t tg a g c c c a g g a g t t t g a g g c c a g c c tg g g c a a ta ta g g g a g a c c c tg t c c c a a a a a a ta a a a a a ta ta c g ta ta ta ta ta ta c a c a c a c a a a g a a a a a a ta c a c tg a a ta g a c a a a a c c t t t c a tg a t t a a t g a t g c a c g g g a a t a a g t g a t g a a a a a a g t t t c g g t c c c a g a t g a t g g c c a g t g a t a a c a a c a t t t t t c t g a t g t t c c c a t g c a a t a t a c a g t t a g c t a a g a g g g t g t a a t g g a a a a a g c a t a a g g c t t g g a c t c a g a a g a c t c t a c t a a c t t t g c c a c t a g c t a g c t a t g t a a t t c a g a t c a t c t a t c c t t t a c a t g t g a a a g g t a a a t a a t g g c t t a t c t t a a c a g g a g g a t t t a t g c a g g t t a a a t g a g g t a g g t g t t a t g t g t a g g t t t a t t c c a a g g c t t c t c t a c t t t t a a a g g a a a t g g c t t a t a t c t g a g a a c t a g g a c t t t t a g a a a a a a a t t t a c t g t t a c t g g t t t g c a g g a t t c c a g a c a g c a t t g g a a a a g a c a ta g
(SEQ ID N O :51)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S4, X linked (RPS4X)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S4 ligada a Y 1 (RPS4Y1) attgcagtagcagcatatctttttttctttgcacaaataaacagtgaattctcgtttctt (SEQ ID NO:53)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S5 (RPS5) ttttcccagctgctgcccaataaacctgtctgccctttggggcagtcccagcc (SEQ ID NO:54)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S6 (RPS6)
gattttttgagtaacaaataaataagatcagactctg (SEQ ID NO:55)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S7 (RPS7)
acaaaaatgactaaataaaaagtatatattcacagt (SEQ ID NO:56)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S8 (RPS8) atccttgttttgtcttcacccatgtaataaaggtgtttattgttttgttcccaca (SEQ ID NO:57)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S9 (RPS9)
g t c c a c c t g t c c c t c c t g g g c tg c tg g a t t g t c t c g t t t t c c t g c c a a a ta a a c a g g a t c a g c g c t t t a c
(SEQ ID NO: 58 )
Protefna ribosomica de Homo sapiens S10 (RPS10) aattggagaggattcttttgcattgaataaacttacagccaaaaaacctt (SEQ ID NO:59)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S11 (RPS11)
ggctggacatcggcccgctccccacaatgaaataaagttattttctcattcccaggccagacttgg gatcttccgcg
(SEQ ID NO:60)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S12 (RPS12)
agaaataaatctttggctcac (SEQ ID NO:61)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S13 (RPS13)
atttgtctgtgtactcaagcaataaaatgattgtttaacta (SEQ ID NO:62)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S15 (RPS15)
tggctcagctaataaaggcgcacatgactcc (SEQ ID NO:63)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S15a (RPS15A) ggatgtaatacatatatttacaaataaaatgcctcatggactctggtgcttcc (SEQ ID NO:64)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S16 (RPS16) gcccatcgtgactcaaaactcacttgtataataaacagtttttgagggattttaaagtttcaag (SEQ ID NO:65)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S19 (RPS19)
aacaaaccatgctgggttaataaattgcctcattcgt (SEQ ID NO:66)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S20 (RPS20)
c tg c a t tc tc c tc c g c c a a a a a a g tg a c c a a g c a g a g tc t t tc tc tg tc a c c c a g g c tg g a g tg c a a tg g c g tg a tc tc a g c tc a c tg c a a c c tc tg c c tc c tg g g t t c a a g tg a t t c t c g tg tc tc a g c c t c c tg a g ta g c tg a g a c ta c a g g tg tg c a c c a g tg t t c c c a g c tg a t t t t t g ta t t t t a tg ta g a g a tg g g g t ta tg c c a t t t tg g c c a g g c ta g tc tc g a a c tc c tg a g c tc a g g tg a ta c a c a c a c c tc a g c a a a t c t t t t a a a t t a t a c a t t c t g t g a t a t t t c c t t g a c t t t c t t a t c c a g c a c t t g t a t t g a t t a t t t t t c a t t t t g a t a a t g t t g g g t t t t t a a a a a c t c c t t t a t g a t g g a a a a t t t c
(SEQ ID NO:67)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S20 (RPS20)
g t c a a c t a t t t t a a t a a a t t g a t g a c c a g t t g t t a a c t t c t g t t g g t t t t t a t t c a g a a t a c t g g c a g a t t t t a g g a a t a t a a a g g t g t a c t a t g a g a c t t c c a c t t t t c a g g t g g a a t a t a t g g g t a t c t t a g a g t g g t c t a t c c t g t t t t c g t t g t c g t t t g a g t c a t t t g a a a a c t g g a t t c c g t t a a c t a c a t a a t a t g t g a g a c c t g a c t g g t t t t a t t g g a c a c t g g c a g t t t a t a a c t t t g g c a t a c t c t a g a t a a a t t c t g a t t g g t a t g g g g
(SEQ ID NO:68)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S21 (RPS21) ctggagagaatcacagatgtggaatatttgtcataaataaataatgaaaacct (SEQ ID NO:69)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S23 (RPS23)
a t a t t a a t g g t g a a a a c a c t g t a g t a a t a a a t t t t c a t a t g c c a a a a a a t g t t t g t a t c t t a c t g t c c c c t g t t c t c a c c a c g a a g a t c a t g t t c a t t a c c a c c a c c a c c c c c c c t t a t t t t t t t t a t c c t a a a c c a g c a a a c g c a g g a c c tg ta c c a a t t t t a g g a g a c a a ta a g a c a g g g t tg t t t c a g g a t t c t c t a g a g t t a a t a a c a t t t g t a a c c t g g c a c a g t t t c c c t c a t c c t g t g g a a t a a g a a a a t g g g a t a g a t c t g g a a t a a a t g t g c a g t a t t g t a g t a t t a c t t t a a g a a c t t t a a g g g a a c t t c a a a a a c t c a c t g a a a t t c t a g t g a g a t a c t t t c t t t t t t a t t c t t g g t a t t t t c c a t a t c g g g t g c a a c a c t t c a g t t a c c a a a t t t c a t t g c a c a t a g a t t a t c t t a g g t a c c c t t g g a a a t g c a c a t t c t t g t a t c c a t c t t a c a g g g g c c c a a g a t g a t a a a t a g t a a a c t c a a a a t t g c t c c c c a c t c t g t t t a t t a t t t a a a g g t g t c a g g a t c t g t g t t g t a a t g t g t e t a c a t t a a t g t g t t t a g g a g a a t a c a g g c a t t g g a t e a t t t a g t t g a tg g a a g ta ta tg c c a g g c a a g g g a g a ta a g g ta ta c g a c a a g a c tg a tg t t t t c a g ta t c t t c t c a t g a g g t t g t c a g a g a c c t t c a t g t c t t c a a a g a c t a g t c a g c a a a t g a a g t g g t t t a g t g t a g a g a c a a g a t t g g t t g t g t t t t g a t a a t t t a a g c t a g g t a t t g a g t a c a t g t g g a t t t t g c t g t c c a c a a a t a c t t g t t t c a g a g t t t t c a t g g a t a c a g t g g c a t g g t t g a a a t g a a g c t g t g a g c c t t c t g c t t t a a a t c t g a t g t a a g a a a c t c c t g t t a a c a a a t a g t a a g t a t g g g t t a a t t a g c c c t t t g a t c a a a g c c t a g c t t t a c a t t g t t t a g g a t c t t t g g a a a a c a a t t g g t t t g g t t g c c c a c t t t c c g ta g g a tc a a g a g c a g a a c c t t t c a c a tg g c a c a g a a g a a c c c a g g t tg c g c t t c a ta c c tg c a t a t t c c a g c c t t a g c c t g c c a t t t c t c t c c t t g g c a c t t t g t g c t c c a g c a a c a c t g g t c t c a g t t g g t c a t c c t c a a a c t t g g g t t c c a t a t c c a g c c t c a g g a c c t c t g t t c c t g t t a c t a t g g t t c c t t g c a t g t c g c c t g c t c t t a c t a a a g a g c t c g t g t g t t t t c c a g c a c a c t t c g g t t t a t c t c t t g a t g a t g a t g c t a g t c t c t c c c t c c g c a a g g g c g g a a a g g c t g c c t g t t g g t t t g t a c c a g t g t t t c c t a a c g t g t a g c t g c a g t c a g t a t t t g g c t a a g c t g t t c c c a g g g g c t c a a c a g a t g c t t t c g g a t g a g c c t t a a c t g a c c c a a t c c t t t g t g a tg c g g g a g a g a t t g c ta g g c c t c g c t c a c c tg g c c a g a a c c a g g g a a a g a g g c c g c g g t tg c a g c g c g a t tc c a g g c c c tg g g c g tc a g g c g c g g g g tg g g c a g c tc t c c c c g g g c g g tg g g g c c c t tg tg a c c g c g a g g c g g g g c g c a c c a g g a a g g g a g tg g g a c a g c g c g g g c g c c c a g g g a t g t g g c c t g g t t a c c t g c c t t c t c t g a t a c g t c a a g a c a c c t t c a a c a a t g g c t t g c a g c tg ta c c c tg t t g g c tg c a c c c a g g a c g c c c t t t t c a c tg c ta a g c a g t c c t a c c tg a g g c c c a g g g g c tg c c a g a t tg a c c c a ta a a ta a tc tc c g g c g c c tc a g a tc c a g a a g c tg c tg a g c c tg a t c t t a g t g c c t t c t c c t t t c t c t g t g t g g c c c c c c a g c c c c t t t c c c c a c t g c c t t g t g t c c a a g g c c c t t t c c t t c a tg ta tc c a tg g a g g a g a g a c a a a a a ta c a c a tc a a ta a a a ta a g a ta g g g a a tc c a ta a a ta g a c a t t c a g a a g ta tg g c c a a c g g a t t t a t c t t a a a a c c a a tg g a g g a a g a a g a g t t t c a a t a a a t g t t g t g g a c t t c c a t t t g t c a a a g a c c a a a a c a a a g g a a c c c c a a c c t t a c a tg ta a t a c a a a c t ta a c tc a a a a tg g a tc a ta ta tc ta a a tg ta a a a tg g a a a g c ta ta a a a c tg a a a a c a g a c ta t c t t t a c a a c c t a g g c g t a g g t a t a g t t t t t a g a c a t t a c a c c a a a a g c a c a t g c c g t a a a a g a a a a a a t a g a t a a a t t g g t g g a t t t c a t t a a a a t t a a a a a a c t t t t t c t c t c t g a a a a a t c c t g t t a a g c t g g g c g c t g t g g t t c a t g c c t g t a a t c c c a g c a c t t t g g g a g g c t g a g t t g g g a a g a a a t t a a ta g c t tg a g g c c a g g a g t tc a a g a tc a tc c tg g g c a g c a a a g tc a ta c a c tc t tg a g g g a a g a g a g a g a c c t t c t c a t a t t g t t t t a t a t t g t t t t a t a c t c a g t a c c t g t t t t a a g a a a a a a a c a a g g a a g tg a a a tc a a a g a c a g g c a g c c c g g c a c c a g g c c tg a a a c c a g c c c tg g g c c tg c c tg g c c ta a a
c c t a g t a g t t a a a a a t c a a c t t a c g a c t t a g a a c c t g a t g t t a t c c g t a g a t t c c a a g c a t t g t a t a a a a a a a t t g t g a a a c t c c c t g t t g t g t t c t g t a c c a g t g c a t g a a a c c c c t g t c a c a t a t c c c c t a g a t t g c t c a a t c a a t c a c g a c c c t t t c a t g t g a a a t c t t t a g t g t t g t g a g c c c t t a a a a g g g a c a g a a a t t g t g c a c t t g a g g a g c t c a g a t t t t a a g g c t g t a g c t t g c c g a t g c t c c c a g c t g a a t a a a g c c c t t c c t t c t
(SEQ ID N O :70)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S25 (RPS25)
ataggtccaaccagctgtacatttggaaaaataaaactttattaaatc (SEQ ID NO:71)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S26 (RPS26)
g g a g c t g a g t t c t t a a a g a c t g a a g a c a g g c t a t t c t c t g g a g a a a a a t a a a a t g g a a a t t g t a c t t
(SEQ ID NO:72)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S27 (RPS27)
aagcactctgagtcaagatgagtgggaaaccatctcaataaacacattttggataaatcctg (SEQ ID NO:73)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S27a (RPS27a)
c t g t a t g a g t t a a t a a a a g a c a t g a a c t a a c a t t t a t t g t t g g g t t t t a t t g c a g t a a a a a g a a t g g t t t t t a a g c a c c a a a t t g a t g g t c a c a c c a t t t c c t t t t a g t a g t g c t a c t g c t a t c g c t g t g t g a a t g t t g c c t c t g g g g a t t a t g t g a c c c a g t g g t t c t g t a t a c c t g c c a g g t g c c a a c c a c t t g t a a a g g t c t t g a t a t t t t c a a t t c t t a g a c t a c c t a t a c t t t g g c a g a a g t t a t a t t t a a t g t a a g t t g t c t a a a t a t a a
(SEQ ID NO:74)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S28 (RPS28)
g c t t g g c t g c t c g c t g g g t c t t g g a t g t c g g g t t c g a c c a c t t g g c c g a t g g g a a t g g t c t g t c a c a g t c t g c t c c t t t t t t t t g t c c g c c a c a c g t a a c t g a g a t g c t c c t t t a a a t a a a g c g t t t g t g t t t c a a g t t
(SEQ ID NO:75)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S29 (RPS29)
a t g c t c t t c c t t c a g a g g a t t a t c c g g g g c a t c t a c t c a a t g a a a a a c c a t g a t a a t t c t t t g t a t a t a a a a t a a a c a t t t g a a a a a a c c c t t c
(SEQ ID NO:76)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L15 (RPL15)
t a t a a g t a a a g t t t g t a a a a t t c a t a c t t a a t a a a c a a t t t a g g a c a g t c a t g t c t g c t t a c a g g t g t t a t t t g t c t g t t a a a a c t a g t c t g c a g a t g t t t c t t g a a t g c t t t g t c a a a t t a a g a a a g t t a a a g t g c a a t a a t g t t t g a a g a c a a t a a g t g g t g g t g t a t c t t g t t t c t a a t a a g a t a a a c t t t t t t g t c t t t g c t t t a t c t t a t t a g g g a g t t g t a t g t c a g t g t a t a a a a c a t a c t g t g t g g t a t a a c a g g c t t a a t a a a t t c t t t a a a a g g a g a g a a c t g a a a c t a g c c c t g t a g a t t t g t c t g g t g c a t g t g a t g a a a c c t g c a g c t t t a t c g g a g t g a t g g c a a t g c t c t g c t g g t t t a t t t t c a a g t g g c t g c g t t t t t t t t a g t t t g g c a g g t g t a g a c t t t t t a a g t t g g g c t t t a g a a a a t c t g g g t t a g c c t g a a g a a a a t t g c c t c a g c c t c c a c a g t a c c a t t t t a a a t t c a c a t a a a a g g t g a a a g c t c c t g g t t c a g t g c c a t g g c t t c a t g g c a t t c a g t g a t t a g t g g t a a t g g t a a a c a c t g g t g t g t t t t g a a g t t g a a t g t g c g a t a a a a t t a t t a g c c t t a a g a t t g g t a a g c t a g c a a t g a a t g c t a g g g t g g g a a g c t g g t g a g c c a g t g g c c a t t a g a t a a a t a c c t t t c a a g t g t g a g c t t a g a c g t c a a c c c t a a a a t a c t t a a c c g t a a t g c t a a t t g t g a t c a t t a t g a a t c c c t t c a g t c a c a t t a g g g g g a a a g t a g t t g g c t a t a a g t a c g t c a t t c t t a g t c c a g t c a g t c t t a a a a a c a t c t t g g g t t a c c c a c t c t g t c c a c t c c c a t a g g c t a c a g a a a a a g t c a c a a g c g c a t g g t t t c c a a c c a t a t g t g t t t t c t g c a g t t a t t t c t c t t g t t c t g g c c a a a c a a c c c t a a a a a t c c t t a c c a t t c c a c a a a g t t g g a c c a t c a c t t g t g c a c c c a c t t t g a c t a t g a g t a t a c c a c c a c a t t g c a t t t c t g t t t g c a c c a t g t c t t c c a g g a g a c t a g a c t a c t g t t g t c c a g g g t c a a t t t g a g t g t a a a g a a a a t g t a g a c a a g g a a t t g c c c a a t t t t a a a t t c t g a c t t t g c t g a c t t a a t t t a a a t g c t c g t t c t g a a c c a a t t t t c t c c t a t c t t c t c t a g g g g t t t c a a a a g a c t c a g t t a a t t g a t t t c c a g g a a g t a c t c a t a g c a a g t t c a t a a a a g t t c t t g a g a c c t a a a t t t c t t c a c a a a a a a a g a a a a g a t c t t a a g t c a t a c a t t t t a a t t g t g t a g a g g t t g t t c a a c t g a a g g a a t a a a t g t c t a t t a a a c t a a a a c a a a t g g a c c t t c
<SEQ ID NO:77)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L15 (RPL15)
g c a a t t c t t c t g c c t c g g c c t c c c a a a ta g c c a g g a c ta c a g g c g c a c a c tg c c a tg c c c a g c ta a g t t t t g t a t t t t t a g t a g a g a c t g g g t t t c a c t a t g t t g g c c a g g c t g g t c t c g a a c t c c t g a c c t c a a g tg a tc c a c c tg c c t tg g c c tc c c a a a g tg c tg g g a t ta c a g g c g tg a g c c a c c a c c c c c a g c c c a a t t t t t a t t t t t t g t a c a g a c a g g a t c t c a c t a t g t t g c c c a g g t t g g t c t c a a a c t a c t g g c c t c a a g c a a t c c tg c c t tg g c c tc c c a a a g tg c tg g a a t ta ta g g a a tg a g c c a c c a c a c c g g g c c c a a a t t t a c t t t a g t a a t a a c a a c a a t t g g c t g g g t g c g g t g g c t c a c g c c t g c a a t c c c a a c a c t t t c g g ta a c c a a g g tg g g c t tg a g c tc a tg a g t ta g a g a g c a g c c tg a g c a a c g tg g tg a g a g c c c a tc t c a c a a a a a a ta a c a a a t c a g c tg g g c a tg g tg t t g c a c g c c tg ta g t c t c c g a a a t c a c a c c a c t g c a c t c c c a t c t t g g g t g a t a g a g c c a g a a c t t g t c t c a a a a a t a a c a a t t g g t t t c t t a c a a t c c c a a a a g g tg c a g t t a c t a g t a t t a a t c c t t t t t t g c c a a t g a g g a a a c a c a a a g a t g a a g c a a c t t g c t c a a a g t c a t a c a g t g a c a g t c t g a a t t c a a a t c c t a t a c a c t t a a a g t t t a t t t g t t t t g t t t t g g t t t t t t t t g a g a t g g a g t c t c a c t g t g t c g c a a g g c t g g a g t g c a g t g g c a c g a t c t c a g c tc a c tg c a a c c c g g g t t c a a g c g a t t c t c c t g c c t c a g c c t c c c g a g ta g c tg g g a c ta c a g g c a c g c a c c a c c a c a c c c a g c t a a t t t t t g t a t t t t t a g t a g a g a c g g t t t c a c c a t g t t g g c c a g g a t g g t c t c g a g c t c c t g a c c t c a g g t g a t c c t c c c g c c t t g g c c t c c c a a a g t g c c g g g a t t a c a g g t g t c a g c c a c t g c a c g t g g c c a a c t t a a a g t t t t t g a t a g a t a a t a c a t t a a c g t t a a a a a t t c a a a a g a t a a g t a t a g g c t c t a c a g t a c a a a c c c t t c t g c c t c c t a g t t c c t c t c c c t g g a g g c a a g g t g a t c a g t t t a a c a a t a t t t t t t t a t t t t g a g a c a g g g t c t c a c t g t t g c c c a g g c t g g a g t g t a g t g g c g c g t t c a c a a c t t a c t g t a g c c t c a a c c t c c t g g c t c a a g c a a t c c t c c c a c c t c a g c c t g t c g a g t a g c t g g a a c c a c a g g t g c a c a c c a c c a t g c c a g g c t a a t t t t t g t a t t t t t t g t a g a g a c a g g g t t t c a c c a t g t t g t t c a g g c t g g t c t c a a a g t c c t g g g c t c a a g c a a t c t t c c t g t c t c t g c t t c c c a a a g t g c t g g g a t t a c a g a t g t g g g c c a c g g t g c c t g g c c t a c a t a t g t a t t t t t t c c t t t t c t t c c c c a a g t g g t a g g a t a t g a t a c a c a t t g t t g a t t t t t t t g t t t a g t t a t g t a t c t c a g a g c t t a t t c t t t a t c a g c t c a t g a g g a a c t t c a t t t t t t t t t t t t t t t t t g a g a t g t a g t t t t g c t c t t a t a g c c c a g g t t g g a g ta c a g ta a c a c a a t c t t g g c t c g c a g c a a c t t c t g c c t c c c a g g t t c a a g c g a t t c t c c t g c c t c a g c c t c c g a g t a g c t a g g a t t a c a g g t g c c t g c c a c t a c a t c c a g c t a t t t t t g t a t t t t c a g t a g a g a c g g g g t t t c a c c a t t t t g g c c a a g c t g g t c t c g a a c t c c t g a c c t c a g g t g a tc c g c c c a tc tc a g c c tc c c a a a g ta g tg g g a t ta c a g g c a tg a g c a a c c g tg c c c g g c tg g a a c t t c a t t c t t t t g g t a t a a c t g c a t g g t a t c c c a t c a t g t g g a t g t a c c a t g a t t c a t t g g a t g t g g a c c c t c c t g a t g g a c a t t t a a a t t t c t t c c a a t c t g t t g c t a t t a c a a a a a g a a a a a t g t g t g c a t a c a t c t t t a t t c a t c t g t a g a a t a a a t t c t t a g a a g t
(SEQ ID NO:78)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S2 (RPS2)
ggtttttatacaagaaaaataaagtgaattaagcgtg (SEQ ID NO:79)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L14 (RPL14)
g t g g c a a t c a t a a a a a g t a a t a a a g g t t c t t t t t g a c c t g t t g a c a a a t g t a t t t a a g c c t t t g g a t t t a a a g c c t g t t g a g g c t g g a g t t a g g a g g c a g a t t g a t a g t a g g a t t a t a a t a a a c a t t a a a t a a t c a g t t c
(SEQ ID NO:80)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S14 (RPS14)
acaagattcctcaaaatattttctgttaataaattgccttcatgtaaactgtttc (SEQ ID NO:81)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L10 (RPL10)
g g g c t t c c a a t g t g c t g c c c c c c t c t t a a t a c t c a c c a a t a a a t t c t a c t t c c t g t c c a c c t a t g t c t t t g t a t c t a c a t t c t t g a c g g g g a a g g a a c t t c c t c t g g g a a c c t t t g g g t c a t t g c c c t t t c a c t t c a g a a a c a g g t tg a c a a c tc a g c c c tg c tc a tg a g g c a g c a a a c c c tg c a a a g g g c tg g g a c t g g t g g c c t t a t g t c a g t t g t c t a c t c t g g a g c t t g a c t t g g a c c t c c c c a g g t c c t a g g c a g t a g g t tg a a a a a c a c tg a a g tg c t t t t c a tg a a g c a c a g c tg c a g c a a a g c c t t g c a a t c c c a g g c tg g g g t c a g c c t a c a g t t g t g t t g c t t a t t a c a a c a c a t g c g g a c c a a g a g g g g c t t g t g g g c t a g a g g c t g a c c a g c a g c g t t t a t t t a g c a a g g g t a g g t g t g c a t c a c a t t g g g c t t g t t c t c a c c c a t c t g g t t t g g c c a t t c c t c c t t g g t g g g a a t c a t c c a g g t a c t g c t g a g g t c a c c t g c g a t t t g c c c c a t t t c c t a t c t c t a g c a a c c t c c t g g g c c c c a t g c c c c c a c c c c t t c t a g a a c c t g c a t t c c c a g g g c c t t c a c c a c c t g a c c a a a g g t c t a g g c t a a c c t t t g g t c a t t t g t a a c a a g a c c t c g g a a c a g a c a c g t g t g t g g c a t g g t t t g g c c t g g g g a t c t t a g a t g t c t g a c c t g a a c t a t t g t a g a a c a g c g c t g g c t t t t g g g g g a g c a g c a a a a a tg a g a g g a g tg c ta g g tg g g tg g c c tg a g c a tc tg ta t c c a g g g a c a g g a c t c c a a a g g c t t t t g g t c c c a g a g c t g g g g t a t g t t g g c c c c a g c c c c c a g c c t g t g g c t c c c a a a a g g c c t c t g g t t t t t t g t a a t c t c a g t t t a c a g c c a t t t c t t a g g t t t t t a a t t a c c t t t a t t t t a t t t t g c c a a a c a t a c c t g g g a a t a c c t t t t a t t t t t t t t t t a c c t t g g g g t g a t g g t t c c a a a c c a t a a a t g t g a t t a t a g t t a a c a c a t g a c c c t t c t a g c g t c c c a g c c a g t g t t t t t c c t g a c c t c t g t t c t t t g g a g a g g a g g a t g g a a g g g a g g g g t c c g g c a c g c t g c t g g c a t t t t g c t g t g t c c t g c a g c c c c t t t c c g g g a c a c c t g g g t t c a c a c a g c t t t t t a g c t t a c a t a a c t g g t g c a g a t t t t c t g t g t g g a g a t g t t g c c t t g a c c a g c c t t g g c t g g a c t t t a c c a g g c a t g c a g a a g c c t g t a c c a a c a c a g a c ta c a g c a c c c a g g a g g tg c g a g tg tg g c tg c t c a g c g g t ta ta a c a g g c c tg a c tg c a t t g t t c a c c g g a t t a t a a t g a g c c a a a a t g t t t c c c g g t g t t t g c t g g t t t c a g g g a a g g a g t t t g a t a t a g c a g a t t a a c c a c c c t c c t t g t a g c t a t t g g g g c t t a a t g g t t t c c t g g t g a t t c t t a c c a a t c c a c a a t a a a c a t g g c c c a t t g g c a t a t c t g c
(SEQ ID NO:82)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L10a (RPL10A)
ggcacatttgaataaattctattaccagttc (SEQ ID NO:83)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L35 (RPL35)
ggggcgcattgtcaataaagcacagctggctgagactgc (SEQ ID NO:84)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L13a (RPL13A)
g c c c a a t a a a g a c t g t t a a t t c c t c a t g c g t t g c c t g c c c t t c c t c c a t t g t t g c c c t g g a a t g t a c g g g a c c c a g g g g c a g c a g c a g tc c a g g tg c c a c a g g c a g c c c tg g g a c a ta g g a a g c tg g g a g c a a g g a a a g g g t c t t a g t c a c t g c c t c c c g a a g t t g c t t g a a a g c a c t c g g a g a a t t g t g c a g g t g t c a t t t a t c t a t g a c c a a ta g g a a g a g c a a c c a g t t a c ta tg a g tg a a a g g g a g c c a g a a g a c tg a t t g g a g g g c c c t a t c t t g t g a g t g g g g c a t c t g t t g g a c t t t c c a c c t g g t c a t a t a c t c t g c a g c t g t t a g a a t g t g c a a g c a c t t g g g g a c a g c a t g a g c t t g c t g t t g t a c a c a g g g t a t t t c t a g a a g c a g a a a ta g a c tg g g a a g a tg c a c a a c c a a g g g g t t a c a g g c a t c g c c c a tg c t c c t c a c c tg ta t t t t g t a a t c a g a a a t a a a t t g c t t t t
(SEQ ID NO:85)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L36 (RPL36)
gcccctcccctgccctctccctgaaataaagaacagcttgacag (SEQ ID NO:86)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L36a (RPL36A)
g t g t c a t c t t t t a t t a t g a a g a c a a t a a a a t c t t g a g t t t a t g t t c a c t t c a t t t g t t t g c t g t t c a t c t t t t g g g a g g g a a t a a g c t a g a g c c a t c a a t a c a a t t c c g c t t g t g g g g a a a t t t a t g c c t c t t a c t g g t a c t a c t t g t t t t g c a t t g a a g c t g a c t g g t t g a g t t c a c a t c a t a t g t t g c a a t t t t c t a a t t t g g c a c t t c a a t c a c t a g g g g c c t t a t g a g g c a g t t t g t c a t t a t g c a a t g g t t a t t g g t t a t c a t g t g a g t a g a c a c a t t t c a g g c t a a t a g g g a g a a g t c a g t a a c a c a t t c a t a g t g a a t a t g a g a t g t c t t t g c t a a g a g t t a a g t g t c a g a t c t t t g t t a t a a c a g t t a a t t t a a t a a a g a a t t t t g g c a t t g t t c t t c
(SEQ ID NO:87)
Proteina ribosomica de Homo sapiens L36a (RPL36A)
t t g c c g t a a g g a t a t g c a c t t g t c t c t a g t c c a c a c a c t t c a t g a t a t a g g t a t a g c g t t a g t t t a g c g a a g t t t t c a c t g c a c t g a t a t a t c t a g t a g g t g a t g g a g c t g g g a a t g c a a c t c a t g t c t g a c t a g t c c a c a a t a c t g c a c t a t t t c a g t g t t t a c g a t t t t t t a t c c t t t c c c t t c t g a a g a g g c a a a a a a t t g a g g a a t g t g c c c t g c t t t c c t a a g a a c t g a a g t g t g a g t a c a c t g g t a a a t c c t t t c a t t t g c c t t g t t c c t t a t c t g t c a a t a t g t c t g a a t c c t c g c t t g t t g g t t g c a c t a a g a a t t g t t c t g t t g t t t c t c a t c a c a g a a a t c t g c a g t c a a c t a c c t g t t c t c g t g a a g t c t t a a a a c t c t t a t a g a a t a g c c a t t t a g g c c t t t c t g c t a g c c t c c t g a a t t c t g t a t t c t c a g g c t g a g c g a g t t t c t g t t t a c t c t c a a a c c t t a g g t g a t t t g g c t a a c t c t t a a a g t a a t t a g c a c g a t g a t t g g a a c g g a g c a t t c t c t c c a a c a c a g c a t t t c t t t t g g c a c t t t g c t t c t t g t g c a g t t t a g c t c c a g a a a g t a t t a a g g a a t g a c t t t a g t g c t c a t t t g g a t g c a g t a a g t g g t t t g a t c t c a g g g t g g c a a a a a g a a t g c t t t t t t t a t a c c t t t t c a c a t t c g g a t a a c t t g t t t a g a a g a c a g a g g t t c t a a c t a g g t t t t g g c c ta t t a a g a a c tg c a a a c ta g c a g c a g c a g a a c t c t g g c ta a a g g g g c a a g c t t a t t a g g a a a t t g a g ta t t t a a a a g t t g a g c t a c c a t a t g a t c c a a c a a t c c c a c t g c t g g g t a t a t a c c c a g a a g a a a a t c g g t a t a t c a a a g a g a t a t c t g c a c t c c t a t g t t t g t t g t a g c a c t g t t t a t a a t a g c t a a g a t t t a g a a g c a a c c t t a g tg t c c a t c g g g a tg a a tg g a ta a a g a a a a tg ta c c ta ta c g c g g c c a g g c a c g g t g g c t t g t g c c ta g c a c t t t g g a a a g c c g a g g c g g g tg g a t c a c c tg a g g t c a g g a g t t c g a g a c c a g c c t g g c c a a g a ta g tg a a a c c c c g t c t c t a g ta a a a a ta c a a a a a t t a g c c g g g c t t g t g g tg tg g g c c tg ta a tc tc a g c c a c c c g g g a g g c tg a g g c a g g a g a a tc g c tg g a a c c tg g g a g g c a g a g g c tg c a g tg a g c c g a g a tc a c g c c a c tg ta c tc c a g c c tg g g c g a c a g a g c a a g a c tc c a tc t c a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a g g g a a a a a g a a a a tg c a c c ta ta c a c a g tg g ta c ta t tc a g c c a t a a a a a g a a t g a g a t c c a g t c a t t t a c a a c a a c a t g g g t g g a a c t g g a g a t c g t t a t g t t a a g t g a a a ta g g c a c a c a a a g a c a a g c a t c a c a tg t t c t t g t t t g t g g g a t c t a a a a a t c a a a a c a a g tg g a c t t g t c a t a t a g a g a g t a g a a g g a tg g t t a c c a g a a g c tg a g a a c t t c t g g tg g c g g g a g g tg g g g a tg g t t a a tg g g ta c a a a a a g a a a a a a g a a tg a a t ta g a c c a a c ta t t t g a ta g c a c g a c a g c g tg a c t a a a g t c a a t a a c t t a g t t a c a t a t t t t a a a a t a a c t t a g a g t g t a a t t g g a t t g t t t g t a c c t c a a a g a a a a a a tg c a a ta a a a c t t ta c a g tg g a g a a a c c ta a c a a g c a c ta c c tc a g c c a g g ta a tc a a g g t t a a c a t c a a c a g t c a c g a g t c a t g t t g a t a t a t a c c c t t g a t a a g g t g t g a t g a a a a t g a c a c t t a a a c c t a a a a a t c c a t a a c c c t a t c t a a t g a g a a a a a t a a c a a a t c c c a a g a g g g g c a t t t t a c a a a a t a c t t g a c c a g ta g tg c g g a a a t t g t c a a g g t c a t c a a a a a a g t c t g a g a a a t t g c c a c a g c c a a a g g a g t c t a g a g a c a t g a tg a c ta a a tg t t a g g tg g tg t c c tg c g tg g g g t c c ta g a a c a g a a a a a g g a c a t ta g
(SEQ ID NO:88)
Proteina ribosomica de Homo sapiens L41 (RPL41)
a c c g c ta g c t tg t tg c a c c g tg g a g g c c a c a g g a g c a g a a a c a tg g a a tg c c a g a c g c tg g g g a tg c t g g t a c a a g t t g t g g g a c t g c a t g c t a c t g t c t a g a g c t t g t c t c a a t g g a t c t a g a a c t t c a t c g c c c t c t g a t c g c c g a t c a c c t c t g a g a c c c a c c t t g c t c a t a a a c a a a a t g c c c a t g t t g g t c c t c t g c c c t g g a c c t g t g a c a t t c t g g a c t a t t t c t g t g t t t a t t t g t g g c c g a g t g t a a c a a c c a t a t a a t a a a t c a c c t c t t c c g c t g t t t t a g c t g a a g a a t t a a a t c
(SEQ ID NO:89)
Proteina ribosomica de Homo sapiens S18 (RPS18)
gtctgtaggccttgtctgttaataaatagtttatatac (SEQ ID NO:90)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S24 (RPS24)
a g tg t c t a g c a g t g a g c t g g a g a t t g g a t c a c a g c c g a a g g a g t a a a g g t g c t g c a a t g a t g t t a g c t g t g g c c a c t g t g g a t t t t t c g c a a g a a c a t t a a t a a a c t a a a a a c t t c a t g t g t c t g g t t g t t t g
(SEQ ID NO:91)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S24 (RPS24)
t g t c a c t g c c a t g g c c g c c t t g c t g c a t t t c t g a g g a t g c t t c a t c t c t c c a c c t t c t t c t c c a c t c a g c a g c c a g c a g g g c a c tg tg g a a a tc g g a g tc a c a tg a g c tg g c a c c tc tg t t c a g a a c c c tc c a g g g c t c c a c a tc t c t c t c a c c c a a a tg c c a a a g a c c tc c c c a c g c c c c c a c a a tc c c c c a c g a c c t g g c c a c t g g c c t c c c a c c a c c t t c c a g c t c c a g c g g c t c c t a c c a c a t t t a a g g c t t t c c t t c c t a g t t t t a a t t t t t c c t c g t c a g c a g t t g a t t t t a t t a t t t t c t t g t t t a t t g g t a t t t t c c c a c t a g a a a t g a a g c t g c g t g a a g t t a g a g a t t t t t t t t t t t g g t c t g t g t t c c t a a t t a g c t c a t t g c t a t a c c c c tg g c g c c c a g a a c a a tg c c t t g g a c a c a g ta c g c a g ta g a c ta a a ta a a ta c t t g t t g a a tg a c tg a c tg a c g g a a tg a c g g c tg tg tg g g g a g tg g a t tg g g tc g tg a g g c a g a g g c tg c g g tg g a a a c t c a g g c a g g a g g t g a t g g t g g t t c t t g g g g c t g c g g a a t g c c a a g t t t a g a a g c t c t t c c t c t g c t g t g g c a c a t g a a c c g g t c a c t c g a g a a g g c t t t t a g a t t t a c t t t g c c t a a t c c c c t c t t a g tg c a tg tg g g g a a a c tg a g g ta c a c a a a a g g a a t t c c c c a c c a a g t ta g g g g c a g a a c c ta g c c c c c t t g t c t c c c a g a t g g a t a t c t t c t t t t t t t t t t g a g a c g g a g t c t t g c t c t g t t g c c c a g g c t g g a g t g c a g t g g t a c c a t c t t g g c t c a c t g c a a c c t c t g c t t c c c a g g t t c a a g c g a t t c t c c t g c c t c a g c c t c c t g a g t g t c t g c g a t t a c a g g t g c a c a c a a c c a c g c c t g g c t a a t t t t t g t a t t t t t a g t a g a g a c g g g g t t t c a c c g t g t t g g t c a g g g t g a c c t c a a a c t c c t g a c c t c a t g a t c c a c c c a g c t c a g c c t c c c a a c g t g c t g g g a t t a c a g g c a t g a g c c a c c g t g c c t g g c t g g a c a t c t t g t t a t t a a a g c t t c t t c t c t c t t t g t a g g g g a g g g g g a g a t g c c t c t g g t g g a g a a g a c c a g t g t g g c a g t g a c t g t g t c t g t t a g t g a a c c t g g t g g c t g g t t g a g g g t c t g t c g t g g t g a c t g a g g a c a c a t a c a a a g t g c t t t t c t c a g t g g t c a c c t t g g t g t t g g t g a a t a a g g g t c a g a a g a t g g c t c c t g t c c t a g g g c a c t g c c a g t c g g t t t g g a a g c t g a a a tg c c tg c t t a g c a g t t t g a g g a a a c a c a g a c c t t g g a g g a t c t t c t g g t t g c c t c t t c a a g a a t t c a t t c t a t t c c c c t t c t g c t c c c c a a a t t t g c t t t t c t t g g g g t g g g t c t t g g t t g g c c t a a g c c a a g a a a g t a t g g c a t c t a c t c c t t c c a t a g c a a t a g c t c a g g a a ta g g c a g tg a c c c a g a c c tg a a c c a a tc a g tg c a tg g a a t ta c c c c tg g c c a a a g tg g t tg a t t g a g g c t g g g t g c a a g c a g a g t t g t g a g a a g g c t c c c a t t t g g t g g t t g g a g a g a t c g c a c t t g c t c c a g a g g t c a ta a tg tg c a g a t c t g a g g c t t g g a a c t g c t g c a g a c a t t t t g c t a c c a c a a g t g a a g c c a c c c tg a c g a c a c a g t tg a c a a t t tg g a g c a g g g c a g a g c tg a g a g a a c a g c a g g g a a a c a g c c a g a g t c t t g c t c a a g c c t c c c t g a a g t a t c t a t a c c c c t g g a c t c t a g t t a t g g g g g c t a a t a a a t g t t a t a t a c t g t t t a a g g t
(SEQ ID NO: 92)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L8 (RPL8)
tgctgagggcctcaataaagtttgtgtttatgcc (SEQ ID NO:93)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L34 (RPL34)
a a a a a t g a a a c t t t t t t g a g t a a t a a a a a t g a a a a g a c g c t g t c c a a t a g a a a a a g t t g g t g t g c t g g a g c t a c c t c a c c t c a g c t t g a g a g a g c c a g t t g t g t g c a t c t c t t t c c a g t t t t g c a t c c a g t g a c g t c t g c t t g g c a t c t t g a g a t t g t t a t g g t g a g a g t a t t t a c a c c t c a g c a a a t g c t g c a a a a t c c t g t t t t c c c c c a g a g a g c t g g a g g t t a a a t a c t a c c a g c a c a t c c c t a g a t a c t a c t c a a g t t a c a g t a t a t g a t c a c t a a t a t a g t a t g c t c t t g g t a c c a g g a g c t c t g a t a t a t a t c t g g t a c a t g t t t g a t a a t g a c t t g a t t g t t a t t a t a a g t a c t t a t t a a t a c t t c g a t t c t g t a a a g a g t t t a g g g t t t g a t t t t a t a a a a t c c a a a a t g a g c c t t t t a t t g a a t c c a g t t c t c t a t g t g a c c a g t t c t c t g t a tg a a tg g a a g g g a a a a g a a t ta a a a a tc t tg c a a a g g g g
(SEQ ID NO: 94)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L34 (RPL34)
a a a a a tg a a a c t t t t t t g a g t a a t a a a a a t g a a a a g a c g c t g t c c a a t a g a a a a a g t t g g t g t g c t g g a g c t a c c t c a c c t c a g c t t g a g a g a g c c a g t t g t g t g c a t c t c t t t c c a g t t t t g c a t c c a g t g a c g t c t g c t t g g c a t c t t g a g a t t g t t a t g g t g a g a g t a t t t a c a c c t c a g c a a a t g c t g c a a a a t c c t g t t t t c c c c c a g a g a g c t g g a g g t t a a a t a c t a c c a g c a c a t c c c t a g a t a c t a c t c a a g t t a c a g t a t a t g a t c a c t a a t a t a g t a t g c t c t t g g t a c c a g g a g c t c t g a t a t a t a t c t g g t a c a t g t t t g a t a a t g a c t t g a t t g t t a t t a t a a g t a c t t a t t a a t a c t t c g a t t c t g t a a a g a g t t t a g g g t t t g a t t t t a t a a a a t c c a a a a t g a g c c t t t t a t t g a a t c c a g t t c t c t a t g t g a c c a g t t c t c t g t a tg a a tg g a a g g g a a a a g a a t ta a a a a tc t tg c a a a g g g g
{SEQ ID NO:95)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S17 (RPS17)
attttttctgtagtgctgtattattttcaataaatctgggacaacagc (SEQ ID NO:96)
Protefna ribosomica de Homo sapiens SA (RPSA)
g c t g t t c t t g c a t a g g c t c t t a a g c a g c a t g g a a a a a t g g t t g a t g g a a a a t a a a c a t c a g t t t c t a a a a g t t g t c t t c a t t t a g t t t g c t t t t t a c t c c a g a t c a g a a t a c c t g g g a t t g c a t a t c a a a g c a t a a t a a t a a a t a c a t g t c t c g a c a t g a g t t g t a c t t c t
(SEQ ID NO: 97)
Producto 1 de protefna fusion de residuo A-52 ubiquitina (UBA52)
g g t g g t t c t t t c c t t g a a g g g c a g c c t c c t g c c c a g g c c c c g t g g c c c t g g a g c c t c a a t a a a g t g t c c c t t t c a t t g a c t g g a g c a g c a a t t g g t g t c c t c a t g g c t g a t c t g t c c a g g g a g g t g g c t g a a g a g t g g g c a t c t c c c t t a g g g a c t c t a c t c a g c a c t c c a t t c t g t g c c a c c t g t g g g g t c t t c t g t c c t a g a t t c t g t c a c a t c g g c a t t g g t c c c t g c c c t a t g c c c c t g a c t c t g g a t t t g t c a t c t g t a a a a c t g g a g t a a a a a c c t c a g t c g t g t a a t t g g t g g g a c t g a g g a t c a g t t t t g t c a t t g c t g g g a t c c t g t c a g g c a c t t t g a g g t g t c c c t c a g g c c t t g g c c c t g a a g t g t c t a g g t g t g t g g a g a t g g g t a g a a a a t t a g g t a c a c c c a a t g g t g t a g a a c g t t g a t t c t c a a a t t t t t t t a t t t t a t a c a a a t g g g g t c t c a c t a t g t t g t c c a g g c t g g t c t t g a a c t c c t g g g c t c a a g c c a t c c g c c c a t c t c a g c c c c t c a a a g t g t t g g g a t t a c a a g c a a g a a c t g c c a t g c c t g a c c c a g t t c t c a g t t t t t t g t t t g t t t g t t t g t t t g t t t g t t t t g a g a c g g a g t c t t g c t c t g t c g c c c a g g c t g g a g t g c a g t g g c g c a g t c t c g g c t t a c t a c a a c c t c t g c c t c c g g g g t t c a c a t c c t t c t c c t g c c t c a g c c t c c c g a g t a g c t g g g a c t a c a g g t g c c c g c c a c a a c t c c t g g c t a a t t t t t t g t a t t t t t a g t a g a g a c g g g g t t t c a c t g g g t t a g c c a g g t t g g t c t c g a t c t c c t g a c c t t g t g a t c c a t t c g c c t t g g c c t c c c a g a a t g c t g g t a t t a c a g g c g t g a g c c a g c a c g c c t g g c c c a g t t a c t c a g t t t t g a a t c t g a g g c c g t g a c a t c a c t c a t g g t c t g c a g t c a g t g c t c t g c c c c t g a g c t g t a c c c t c t c c t a t g a t a a t c a c t c t t a a g a a g g g c a a c c c t t g g t g t t t t c c c c t t a a g g t c a c c c a g g c t g g a a t g c a g t g g t g t g g t c a t g g c t c c c t g t a c c c t g g a a c t c a g g c t t g g g t g a t c c t c t c t c c t t t g c c t c c g a a g t a g c c a g g a c t a c a g g t g t g c a c c c a c c a c c a c a c t c a g a t a a t t g c t t t g g t g t t t t t a a a g c t t g t a a t g a tc a g ta g g c tg a g g tg g g c a a a t c a ta a g g t c a a g a g t t t t t t a g a tg g g g tg a g c a c a g a c c a a t t c c t g t t t t a t t t a c t g a t t t a a a a t t t t g a g a c a g t c t c a c t g t c a c c c a g g t t g g g g t g c a g t g g t a g g a t c a t a g c t t g c t g c a g c c t t g a t c t c c c a g g a t c t t g c c t c a g c c t c c c g a g t a g c t g g g a c t g c a t g c t t g t g c c a c c a c a c t c g g t t a a t a t t t t g t a g a g a t g g g g t c t t g c t a t g t t g c c c a g g c t g g c t t c a a a c t c c t g a a c t t a a a a g c c t c c t g t t t a g t t t t g g t t t t t t a t c a c t t t t t t t t t t t t t t t t t g a g a t g g a g c c t t g c t c c c a t c g t g c a g g c t g g a g t g c g g t g g c g c a g t c t c g g c t c a c t g c a g c t t c t g c c t c t c g g g t t c a a g c g a t t c t c c t t t c t c a g c c t c t t g a g t a g c t g g a a t t a c c a g t g t g c g c c a c c a c c a c c a c g c c t g g c t a g t t t t t c t g t t t t t a g t a g a g a c a g g g t t t t g c t a t g t t g g c c a g g c t g g t c t t g a a c t a c t g a c c t c t t g t g a t c t a c c t g t c t t g g c c t t c c a a a g t g c t a g g a t t a c a a g c g t a a g c c a c a g c g c c t g g c c t t g c t a c a t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t a c a g a c a t g g t c t c g c t a t g t t g c c c a g a a t g g t t t t g c a c t g g g t c c a a g c a g t t c t g c c g c a g c c t c c c a a a g t g c t g g g a t t a c a g g g g t g a g g c a c c t t g c t g g c c c c t g t t t t g a t t a g g g t g c a g t g c t g g tg a a g c c g g tg c a c g a g g c c a g tg a tg c a t c c ta a tg a g g g g tg g a g t t g g c g g g a c t t c c t g g g c c a g t t t g g g g a c t t t c a c a a a a g a c c c c c a t g a c t c a g g g t t t t g a g t t c t t a a c t g a t c g a a tg a a g g a t t c a a a a t ta a c c a c tc c a a g g g g g g a t tg a a g g a a g a a c c a c tc t t a a tg g a c a a a a a g a a a g a a a g g g g a g g g a g ta a c a g g g a ta tg a g c tc ta g c c g c c c a a g c ta g c a a tg g c a a c c c t t c t g g g t c c c c t t c c a g c a t g t g g a a g c t t t c c t t t c g c t t c a t t c a a t a a a c a g c t g c t g c t c (SEQ ID NO: 98 )
Homo sapiens, virus de sarcoma murina Finkel-Biskis-Reilly (FBR-MuSV) expresdo ubicuamente (FAU)
gtcttttgtaattctggctttctctaataaaaaagccacttagttcagtcatcgaaaa (SEQ ID NO:99)
Protefna ribosomica de Homo sapiens tipo 1 L22 (RPL22L1)
g c a a a g g c t c c c c t t a c a g g g c t t t g c t t a t t a a t a a a a t a a a t g a a g t a t a c a t g a g a a a t a c c a a g a a a t t g g c t t t t a g t t t a t c a g t g a a t a a a a a a t a t t a t a c t c t t g a a c t t t t g t c t c a t t t t t t t g a g t a t g c t g t t t a t a t g a t t t t g a t t t c c c t c t g a t a a c t a t c a a c a g t a t t t a a a t a g c t t a t a g c t g g t a t a a t t t t t t c c c a c g a t t t c c a a a a t c t t t t a t g t a c t c a g g t a a a a g t a g c g t t a t a t a g g a a a t c t t t t t t t t a g a c a c t c t c g t t c t g t c a c c c a g g c t g g a g t g c a g t g a c t c a g c t t c c t a a a t a g c t g g a a t t a c a g g t g t g a g c c a c c a t g c c c g g c t a a t t t t t t g t a c t t t t a g t a g a g t a g g g t t t g g c c a t g t t g g c c a g g c t g g t t t c a a a c t c c t g a c c t c a a g t g a t c t a c c c a c c t c g g c t t c c c a a a g t g c t g a t t a t a g c t g t g a a c c a c c a t g c c c g g c c a g g a a a t c t t a c t g t a g a a c a a t t t t t t a t a t a g c t g t a t a a a a t g t a t a t g a t t g t c t t g a c a g t c t c a a a t a c t g t t t t t a a t a g c t t g t a a a t g t a a t c t c a a g t g c t t a g a a c a g t t c t t a c a t a t a a g t t g c t c t g t a g t t t g c t c t t a t a g t t a g c c c a a a g a c t c t g g g t g t g a g g c c t g c t g t a a a c c a a t g t t a a a c t g c t t a t t a g a a a g c c c ta a c c a c c tg c t t t g t a g g c a c c a g a a a c t c a a a a c c a a a t c t c a a c t c a g c ta c a g a a t c t a c t g t g g t c c t t g t c t g a a a a a a t t a g t t c a c t c g g t t g g a a t c t t g t c t c a g a g c a t c c t c a t c t c t t t c t c a a a a g c c c c t a c c c c a a c a c c g g c g t g t t g g t t g t c t a t t g a a a c t t a c a a g t g g a t g g a c c c t t t c t c c c g a a t a a a c t g g c c t t t g a a a g c t c t a a t c g a a a t g g t t t g g c a a a a t c c a t a c t g c a g g a g a t t a g g g a g g a c a a g a a t g a t g t g c c t t t t t g t a c t g c t g a g c c t g a t g g t g g t g c c a c t a c t t c a g g t a c t t a g a t g a g t c t t g a t g c t a a t a g a a t t g t g t c g c c a a a c a t a t c t g g a c a g t t a c a a c c t a a t c t a t g c a t t a a t t g g t t t g g g a a t t g c t t g a a a t t a t t g t t t a a t t c a a t g t t t t a a t t c g t t t t c c t a a a a a t t t a a g t g c c c c c a t c a t c g t g c a a t a c c t c a g t g c a g c a a c t c c t t g a t t c t t g g a t g a c t g a a c t t c c t a a c t t g g c t c t g c c c c a t t g t t c c e a t t t t t c a t g t t t t t c a c a a a t a g t t a a c c a g g t a c c t a c t a c t g t g c a c c g c t g c a g a g c a t t g a g g a t g t a t g t g a t g a g t a a a a a c a c c c a g c c t g c t c t g c t g t g t t a g t a t t a t g a c g g a a a c t g a t c a a a t c a c a t g t g a a c a a a t t t a c tg c ta c a a a a g g g a g g g c t t a a ta a a a g g a a t t t c a t c t g g g a a g g c
(SEQ ID N O :100)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S17 (RPS17)
attttttctgtagtgctgtattattttcaataaatctgggacaacagc (SEQ ID NO:101)
Protefna ribosomica de Homo sapiens tipo L39 (RPL39L)
g g a a t t g c a c a t g a g a t g g c a c a c a t a t t t a t g c t g t a t c a a g t t c a c g a t c a t c t t a c g a t a t c a a g c t g a a a a t g t c a c c a c t a c c t g g a c a g t t g c a c a t g t t t t a c t g g g a a t a t t t t t t t c t g t t t t t c t g t a t g c t c t g t g c t a g t a g g g t g g a t t c a g t a a t a a a t a t g t g a a a g c t t t t g t t t c c (SEQ ID N O :102)
Protefna ribosomica de Homo sapiens tipo L10 (RPL10L)
a g g t t t t g g c a g t a c t g t c t c c t t g g g c c a t g c t g g t c t g a c t t a t g c t t a c t a a t a a a t t c t g t t t a c t g g c
(SEQ ID N O :103)
Protefna ribosomica de Homo sapiens tipo L36a (RPL36AL)
a c t t t g g g a t a t t t t t c t t c a a t t t t g a a g a g a a a a t g g t g a a g c c a t a g a a a a g t t a c c c g a g g g a a a a t a a a t a c a g t g a t a t t c t t a c g c
(SEQ ID N O :104 )
Protefna ribosomica de Homo sapiens tipo L3 (RPL3L)
g c tg tg tg g g g tg g a tg a a c c c tg a a g c g c a c c g c a c tg t c tg c c c c a a tg t c ta a c a a a g g c c g g a g g c g a c t c t t c c t g c g a g g t c t c a g a g c g c t g t g t a a c c g c c c a a g g g g t t c a c c t t g c c t g c t g c c ta g a c a a a g c c g a t t c a t ta a g a c a g g g g a a t tg c a a ta g a g a a a g a g ta a t t c a c a c a g a g c t g g c t g t g c g g g a g a c c g g a g t t t t a t g t t t t a t t a t t a c t c a a a t c g a t c t c t t t g a g c
(SEQ ID N O :105 ) "
Protefna ribosomica de Homo sapiens tipo S27 (RPS27L)
t g a t t c a a a c a g c t t c c t g a a t t t t a a t t t t g t g t t g t c t c a c a g a a a g c c t t a t c a t a a a t t c c a t a a t t c t a a t t a a t t t a c c a a g a t a a t g t a a t t a c a t t t g g t t t t g t a a g g t a t a c a g c a g t a a t c t c c t a t t t t g g t g t c a g t t t t t c a a t a a a g t t t t g a t t a t g g g c a a a t c c c c t c t t t t t c t t t t t t t a a a a t a t a t t t g a g t a t g c c a t a c a t t t a t a t a t a t g g t g t a t a t g a a t t t g g t t t a a a c a t t t t a a a a t t t a t t c t g a t t a g t t t g t g t c t t t t t t t t t t t t t t t g a g a g a g a g a g t c c t g c t c t g t c a c t c a a g c t g g a g t g c a g t g g t g c g a t c t c g g c t c a c t g c a a c c t c c g c c t c c c a g g t c c a a g c a a t t c t c t t g c c t t g t c c t c c c a a g t a g c t g g g a t t a t a g g c a c a c a c c a c c a t g c c t g g c t a a t t t g t g t c t c a t t t t c a a g a g t a g a a a c c c t a a a t a t t t t a t t t t c a t t c c t t t t c c a a a t t g c t a t g a a t g g g a t t a a a g g a t t a c a g a t g t a a a g t c t a t t a t t t g t g a a t t c t a a a t g t a g t t c t g c t g t t g t a c c t g t g g a a a c a t c t t a a a g a a g t a c a t a t t t t g c a c g t c c t g c a c g t g t a c c c c a g a a c t t a a a c t a t a a t t a a a a a g a a ta g t t t c a a a a a a a ta c a
(SEQ ID N O :106)
Protefna ribosomica de Homo sapiens tipol L26 (RPL26L1)
a t a g a a c c t g t t g t g c a a c c a c g g t t t a a c c g g a g a t t t t g a g g c t a g g g t g t g t t t c t t t c g a a c t t t t c g g a a t g t c t g g a a c a t t t c a t t t c c t g t t t t g t t a c c t g t g c c t c t g t a a a t c t a c t t t t g c a a t t t t a a g t a a t a a t t t t a t g a a t a a a a a t g g g a a a t g c t t c c t a a t t c c a c a t a g t a t t t g c a t t g t t t t a t a a a t a a a t t c c a c t t a c t a t c
(SEQ ID N O :107 )
Protefna ribosomica de Homo sapiens tipo 1 L7 (RPL7L1)
a c c c a g g t g a g g c a g g g c t g a a a a c t g c c c t t g g g c t g a c t t t t g a t a g g c c a t g c c t t g c c a c t t t a c a a g t t c t t t t t g c a t t t a c t a g t a t t t a a g a g t a a c c t t g a g a t t g g g a g g a a t a g a g g a g g c t g g t a c a a a t a g a t g g a g a c c t g c t g g g a t c a g t g a a t g c c t g a t t a g g a c a t g g g g c t a t g c a t a g c c ta a g a g t t a t a g g c t t a a a g a t g t c g a g t a a c t a a a a a c t g t a t t g c t g g c c g g g c g c g g t g g c tc a c g c c tg ta a tc c c a g c a c t t tg g g a g g c c a a g g c g g g c a g a c c a tg a g g tc a g g a g a t tg a g a c c a t c c t g g c c a a c a t g g t g a a a c c c t g t c t c t a c t a a a a a t a c a a a a a t g a g c t g g g t g t g g t g g c a c g tg c c tg ta g tc c c a g c ta c tc g a g a g g c ta a g g c a g g a a a a tc g c t tg a a c c c a g g a g g c a g a g a t tg c a g tg a g c c a a g a t tg c a c c a g tg c a c tc c a g c tg g g c g a c a g a g c g a g a c tc c a tc t c
(SEQ ID N O :108!
Protefna ribosomica de Homo sapiens L13a pseudogen (RPL13AP)
g tg g a a a a g a a c a tg a a a a a g a a a a c tg a c a a a ta c a c a c a g g tc tc c tc a a g a tc c a tg g a c t t c t g g t c t g a g c c t a a t a a a g a c t g t t t g t t t a t t c c t c a a a a a c a a a c a a a c a a a a a a a a a c c c t c t g t a t t a t a a a t t a t t c t g t g t a a t g g t g t g t t a c c a t a c a t t
(SEQ ID N O :109 )
Protefna ribosomica de Homo sapiens L37a pseudogen 8 (RPL37AP8)
a t g c t c c t c t a c t c t t t g a g a c a t c t c t g g c c t a t a a c a a a t g g g t t a a t t t a t g t t a a a a a a a a a a a a a g a g a g a g a g a g tg a a a c a a c a a t c t a c a c a a t c a g a g a a a a ta t t t g c a a a t c t t a t a t c t g a t t a g a a a t t a g t a t c t g g a a c a t
(SEQ ID N O :110 )
Protefna ribosomica de Homo sapiens S10 pseudogen 5 (RPS10P5) aattggagaggattatttcacattgaataaacttacagccaaaaaa (SEQ ID NO:111)
Protefna ribosomica de Homo sapiens S26 pseudogen 11 (RPS26P11)
g g a g c t g a g t t c t t a a a g a c t g a a g a c a g g c t a t t c t c t g g a g a a a a a t a a a a t g g a a a t t g t a c t t
(SEQ ID N O :112 )
Protefna ribosomica de Homo sapiens L39 pseudogen 5 (RPL39P5)
g g a a t t g a a c a t g a g a t g g c a c a c a t a t t t a t g c t g t c t a a a g g t c a c a a t c a t g t t a c c a t a t c a a g e t g a a a a t g t c a e c a c t a t c t g g a c a g t t g g a c a t g t t t t t t t g g g a a t a t a c t t t t t c t c t c t g a a t c t g t t a g g a a c t t t c t g g t t g g c t g g g t t c c g t a a t a a a t a c a t g a g a c c t t t c a t t t c a a a a a a a a g a a a a a t a g g c c t c c t t c c c a g g g g c t c c g g a t t t c a t c a g c c t t c t g t g c a t g c c c a g c c a ta c a a a c c a c g c a g g g a tg g c tc c a a g tg
(SEQ ID N O :113 )
Protefna ribosomica de Homo sapiens grande P0 pseudogen 6 (RPLP0P6)
t c a c c a a a a a g c a a c c a a c t t a g c c a g c t t t a t t t g c a a a a c a a g g a a a t a a a g g c t t a c t t c t t t a a a a a a ta a a ta a a ta a a ta a a ta a a ta a a ta a ta a a ta a a ta a a ta a a ta a a ta a a ta g a ta a a t a a a t a a a a a g t t t t c t a c t c a c a c t g a a g t g a c g a a g t c
(SEQ ID N O :114)
Protefna ribosomica de Homo sapiens L36 pseudogen 14 (RPL36P14) gcccccttcccctgccctctccctgaaataaagaatagcttgacagaaa (SEQ ID NO:115)
Mas preferiblemente, el al menos un elemento 3'-UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 80%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 90%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 95%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 99%, mas preferiblemente del 100% con la secuencia de acido nucleico de una 3'-UTR de un gen de protefna ribosomica, tal como las secuencias de acido nucleico de acuerdo con las SEC ID NO: 116 a 205 o la secuencia de ARN correspondiente: Protefna ribosomica de Mus musculus L9 (RPL9)
GGAGGCCTCAGTTCCTGGCCCCAGAAACGAGATCCTGACCACATGAACAATTTGGGCTCTTTTGGG AGAATAAAAGACTTATATATTG
(SEQ ID N O :116 )
Protefna ribosomica de Mus musculus L3 (RPL3)
TTCCAGGACCACTTTGTGCAGATGGTGGGGTCTCACCAATAAAATATTTCTACTCACACTGGTTTT CCC
(SEQ ID N O :117)
Protefna ribosomica de Mus musculus L4 (RPL4)
ACTATTAAAAATTGTTAAATTCCAGAGAGCAAGTAGAGACCGCATATTTCAATAAATCAAACATGT GGTGACAAACCCTTGTGTGACTCTTAAATTGTGGATGTTTCCAAGCCCCTTG
(SEQ ID N O :118 )
Protefna ribosomica de Mus musculus L5 (RPL5)
AGCAGTTTTCTATGAAGATTTTTTCATAAAGACAATAAACATATTGATCAAGCAGCTTTTTCTGTG TTAAGCTGTTATTAATGAGACTATAGGAAATAGTGTGAAATTACAAAAGCAAAGAAGTAGATAGTT ATTTAATTAATTAAATTAATTTTACCTTTTGTGTTGCACCATAACCTACCACTGGTGGGATTAAGG GCAAGTATTACCATGCCTAGCTGAGAGTCTTTCTCCAGGAAAAACCAGCTTACATGGGTTCCTGCA AATCTCATGAGTGTTTCTTGGGTTTCTAGTCTTCCTGGGAGGTGTCCTTATCTTTCAGATTTTCAG ATCTGGTAATTAGCATGATCATCAGGACATTTATTACAAACAAATTGATTAGTGGGAAGAAAGTAT CTCAAGGTCAATCTTGGAAGTGAACAACTGGTGCTAATCCATGGCTTTAAAGATTTGAGAACAACG GTGAAATTTGGTTTGAGGAGAAGGGGGTGTCTAGGACGTTTCATTTTTATGGTACATGCCAGACAT GAATGTACATAGGAAAATAACTTGAAAGGGTCAAATATTAAACCTTGAATATCAGGTTCACTTGGG AAAGCATTAGGTGCTTATGCCTCTTAGTAAATAGCCCTTCATCCCAGAAGGAGCAAGAATTGTCTT CCTGACTTAATCCAGTCTTAGCTGAGGTGCTGTGCATCTTTATCATCTTTGCCTTGCCTCACAGTG TCAGGCTCTGTGGTACTGGGGCTACACAGGTCAGGTAAACAGTTAACTGCTTACCTACATCCCCAG CAAAGATAATGTGACGATACTAAGATGAACCTATCAGAGCTTAAAGATAATGAGTTTCAGTCACAG TGATAACTGCATGCTAACTTCAGCATGTAGAATATATGCCGAAGCTAAAAGCCATTCCACAGTTGA CTCCATCTGAAGTTAAAGTGTGTAAGTACACAGTAAATCATGCTATATTAACTGAACTTTTTAATA AATGAGTCATTTGAATTT
(SEQ ID N O :119)
Protefna ribosomica de Mus musculus L6 (RPL6)
ATTGTTAACCTAATTAAACAGCTTCATAGGTTCTTTTGGTGTCCTTTTTGTGTGTTGTGTGTGCAC ATGTTTGTTGGGTGGGTGTTTTGCTGGTGTCTTTTCCTCTGTGTCTTCCTCTGGCCCTTTCTGGAA AGACCTGCTTAATCTGAAGCATGTGAGCTAGGCTAGTCCACTGGGTCCTGCTCTCTGCCCATCCCC AGCTGGCTTTGGATTAGAGGCACATACACTGCCATGGCTGCCTTTTACTGTGGCTGTGGTTTTGCC CTTTTTTTTTAAGCAAATAGAAAATGCTGCTGACTATACTGG
(SEQ ID N O :120)
Protefna ribosomica de Mus musculus L7 (RPL7)
GGTGTCACCCATTGTATTTTTGTAATCTGGTCAGTTAATAAACAGTCACAGCTTGGCAAATTG (SEQ ID NO:121)
Protefna ribosomica de Mus musculus L7a (RPL7A)
AT GTACACTAAATTTTCTGTACCTAAATATAATTACAAAATTATCTT GA (SEQ ID NO:122)
Protefna ribosomica de Mus musculus L11 (RPL11)
ACTTGATCCAAAAAGCTAATAAAATTTTCTCAGAAATGC (SEQ ID NO:123)
Protefna ribosomica de Mus musculus L12 (RPL12)
GAAGCAACAAGAAAATATTCCAATAAAAGACTATCTGATAACCAGTG (SEQ ID NO:124)
Protefna ribosomica de Mus musculus L13 (RPL13)
TTCTGTGTTGGAGAGCTGCAATAAATTTTCCATAAAGCAAAA (SEQ ID NO:125)
Protefna ribosomica de Mus musculus L23 (RPL23)
TTCTCCAGTGTATTTGTAAAATATATTCATTAAAGTCTCTGCTCTGAGAGCTGGTCTTCTTGACAC CTTTTCCAATATCAGCTTTGCAGAAGGAAACTTAAATTTCAGTTCAGGGCATGACCTTCATGACCT TGCAGAACTTCTTCACTTTCCAGGTTAAGTAAAGGCGATCTTTAGGGGCTGTCCAGATGGATCAGC TATAAAGATTCAATTGTAGAAGGTTCACGTCTCAATGCCCACGTGGTAGCTGTAACTTCAATTAAA AAACAAAAACAGCCGGGCGTGGTGGTGCACGCCTTTAATCCCAGCACTTGGGAGGCAGAGGCAGGC GGATTTCTGAGGCCAGCCTGATCTACAGAGTGAGTTCCAGGACAGCCAGGAATACACAGAGAAACC CTTGTCTCCAAAAACCAAAAAAAACAAAACACGCATTCTTTTCAGGTCTTTGCTGGGACCAGGTAC ACATAACACAGATAAATATTAGAGCAAACCATGCACATATGGTAAATTATCTTTGGGTTTTGGGTC CCTAAAATAAAGTGGTGTGTTCATTGTG
(SEQ ID NO:126)
Protefna ribosomica de Mus musculus L18 (RPL18)
CCCTGGATCTTAACTGTTAATAAAAAAAACATTGGATGATGATGGTA (SEQ ID NO:127)
Protefna ribosomica de Mus musculus L18a (RPL18A)
ACACAGAGACCCACTGAATAAAAACTTGAGACTGTCCTTGCTTGTTTGCTTCTATGTCCCTGGAGA. GGTCCCAGTTGGTCCCGTCCCTAACAACATGCTAGCCCTGCTCACCTGCCTGTCAGCCTTGCTCAG TGGCATCTTTCCATAGGTGTGTATCCCCTTAGATTAGCTTCAGCCCCACTACGATTTGTCTAGGAC ATAGCCTGAGCCCTGCCTGTGACACTGAGGGGTAGCAGTCTGTTTCTGGACTCCAGGGTGCTGCTG' TCTCAGGCCTAAGAATTCCAGACATGACTATAATCCAAGCCTGGGGACCTGGTTGAGCTTTTTATC CTGCTGGCTCTAAGCTTCAGCTAGGTGGAAATGAGGCCAGCCAAGCCCCACAGTGAGCTTGCAAGC TTTAGATGGGGACAGGGTTACGCTTTGGTGAATGATGGAGGAAACATGGGGGTTCCTTTTGTTGGG TGCAGCCAGCACGGCATCATCATGGTGCCCAATCTTGAAAGGGCACAGGCCTGAAGCTTCCTGGGA. CTGTTCTGTCACAGGGAGGAACCTACTGCAGTTGCCTACAATTGCTACCTCTGAGGGACTTGCCTC TGGCCCCTTGTAGACATTTCCATGTCTACACATGGCCCAGAGTACTTTCAGGGATAGCAATGTGTGi AATGGCACTTAGAAGATAACATGTGAAAGCCAT
(SEQ ID NO:128)
Protefna ribosomica de Mus musculus L19 (RPL19)
AGCTTCCCTCGTGTCTGTACATAGCGGCCTGGCTGTGGCCTCATGTGGATCAGTCTTTAAAATAAA ACAAGCCTTTGTCTGTTGCCCTCTTGTTTAGC
(SEQ ID NO:129)
Protefna ribosomica de Mus musculus L21 (RPL21)
TGTACACAAAGAAATAAAATACCAGCACCAGGACTGTGAAGTGTTTTCCTTAGACTGTAGTGTGGG GTTTGCTCATTGGCTTTCTTGTTCAGATTTTACTAATTGTTCTAAATGATACAGCTTAGTGTGCAG AAAATATCCTCTTGATTGGAAAATAGCCAAATATTTACAAAACAGGTATACTAGTTTGAAGAGGCT CTATATGGGGGGAGGGGGTGCTGGAAAACATTAGTGGGTGACCAGTAATGGTGGTACAGCTCTAAC TCCTAGCACCAGGAGTCCGAGGCAGGGGGATCTTCAGGCTGCATGATGTGCATAGTAGCATGCTGG TATTAGGGAGTGGGTATCTGTGGTTCCCACTTTGAAAATAACCAAAATTCTCCAAAGTGGGCAGAC CTAAGCCAGGAGAGGGCTGGCCACAGACATTTGGTACTGCTTGCTGAGAAAGCACTGATTGTTTTC CTAACCTAAAGATTATATATGGCCCACCATACCATCTTTGAAACAATGTGTACTGGCCTTTGGTTC ACCTTTCTTGTCTTTGAAGTTGTACTTGGTGGGTGCATTTAACCTTGCCACAGAGTGGGGAGGATA GAGTCTAATGGACCTTAAGTGGTCTCTGGTGGCCATGTCGGCAGTGCTTAGGTTGTAGCCCAGGGT TGGAGTCGGCAGTGACAAGCAAATAACTATATTCTTGCTTGCTGTGGCAGCTATACAGAAATTTAC GGTATAGGTAAGAGGGTTCTCTAGAAGTACTACCTGTCTTAGTGAAAGAGATTGCTTGGTTAACAT CCTGTTATGTAGTGGGGCTACTTTTAAACTGTGTGAAGTCCCCATTAGCCACCTCCATAGGCAATG GAGCTAACATTCTTGCTACAGTGGCCGCAGCTCATTAACACCTAATGATGTGTTTAACATGTGTCC ACATGGTGTGAATGTGGGTACGCATGTGCCCAGTATTCAGTTCACAGAATTGTCATCATCTTCCAT CATGTCTTCAGTGAGGGACTCTGCAGATGCCCACCCCAGTCCTTGGTTGTGGTGATTCTGTTAGCA TTAAATGCACTGGAGAGCTTC
(SEQ ID N O :130 )
Protefna ribosomica de Mus musculus L22 (RPL22)
GACACATTGGTCTGCAATGTTTTGTATTAATTCATAAATAAAATTTAGGAACAAAACCGGTGGTTT ATCCTTGCATCTCTGCAGTGTGGATTGGACAGGAAGTTGGAAATGACAGGGACTTTAACTGGGCTG CTGCTCCTTTGTATATAGACACTTTTTTCCTGCTCAGAAACTTGAGTTCTCCAGTAGCAATGGCCA AACAGAAGAACCAGGCTAGGGGGCTGCATCTGACAGAGCAAGTAGACGAGAGGCTGGGTGGTGGGC TCCGGCCAGCCCGAGTCTTAGAGCTGGTGGTTGGTTATATCTGGTGCCTGTCTCGAGGAGGGCTTG AGACACAGTGTGGTGCTCCTCAGAAGCAGACAGGTGATTTCTTTGTGTGATTTTTCTTTTCCCCTG GGACAATGACAGTCAGTAAGACAGGTTTCAGGGACTTTTGTGTCCAGGTCTGAGCACTAGTCGCTC ACAGTTGTGTGTACTAACCTTCTTCCTTCCTATTGAAATGGCAGGGGTCTTTGAGTCTCACTGCTG CATGTTCTGCCTTCATAGGGATCTGTAAGTATGCTGGGCATCTGGGCTTTTAGGGGGCTCTCTATA GGGTGTCTGAGATAGAGGTCAACAAGGGCTTATAGACAACTCAAACAAAGCCCATGGCTTGAGCAA GTCTGCAACAAGCTGTTTGTCTAGCCTCCAGCAGAGGGCGAGGGAGACAGCTTCCAGATGTTCCCA GTAGGTGGAGCCCCTCCAAGCCCAGGGCTCAGGAGGCTTACAGGGTGGGAACTCCAATACTGGTGG AGGGAGGAGGGCGTTTGATGGGAAGATAGGGAAGTTGCTGCTTCCTAAACTGTCACAACTGGGCTT GGATAGGAGTCATAGTCTGGGACCACAGCCCTGTGGTAGAATGCTAGCCTGGTGTGCTCCAGGTTT AATCTCCATCACTGCAGAAATGAGTCCAAGCTGTGTGTACCTCCAGGGCACTGGGCATGGGGTTCC CTTGCCATTGTGTGTGCCCGGAGAACTGGCAGGCGGGAAATGTCTTTATCAAGGGTTACCTTGGAA GAGGTCCCAACACTGTAGGGTGCTCCTGTTGTCAAAACCTATGCAGAGGCATCTGCTTGCTCTCTA ATAACAGTATGCAATGCTAAAGGGCTCGCTTACAGCCGGTGGCCACACTGGAGGCCTGCACATCAG GTGGCCACAAGTTCTGCTGCTGCGCCTCCC-AGGAAACACTTGGTCCTCCGATCGATTTTAACCTGT TGAGGCTTTGCAATCCCCCTGTGGCAAAGGCTCCAGTGTTTTCTATTTCTATGCAAATTTCTTGAA GCAGAACTGTTACTGTCTTTCTCCTCTGCCCTGGGAGGAGGCGCTAGCGTTTCCTTCCAACTTCAG GTGCAGCCCCCCTCGTGGTTAGCGGTCTTAAGTTCGTGACTTGGGTTTGCAGATCTTTTTTGTTAC ATCGCCGGACCATGTGGTGGTCTTTAGCTGTAAACAACATTAACCCTGGGTTGATTAGCATATGCT TCTAAAAGATGGTCCCAGATTCTGCGACTTGTAATAAAATGGAAACTTGCTGGTTTTTATGCCTTT CTAACTCTTGTATTTGAATGAATGTTGATCACTTTTTGTATTAAAGTGGCTGACACATGGCTACTG TCACTGTG
(SEQ ID N O :131)
Protefna ribosomica de Mus musculus L22 (RPL22)
AATATCTCACCAAAAAATATTTGAAGAAGAACAACCTCCGAGACTGGCTGCGTGTTGTCGCCAACA GCAAAGAGAGTTACGAGCTGCGTTACTTCCAGATTAACCAGGATGAAGAGGAGGAGGAAGACGAGG ATTAGGACACATTGGTCTGCAATGTTTTGTATTAATTCATAAATAAAATTTAGGAACAAAACCGGT GGTTTATCCTTGCATCTCTGCAGTGTGGATTGGACAGGAAGTTGGAAATGACAGGGACTTTAACTG GGCTGCTGCTCCTTTGTATATAGACACTTTTTTCCTGCTCAGAAACTTGAGTTCTCCAGTAGCAAT GGCCAAACAGAAGAACCAGGCTAGGGGGCTGCATCTGACAGAGCAAGTAGACGAGAGGCTGGGTGG TGGGCTCCGGCCAGCCCGAGTCTTAGAGCTGGTGGTTGGTTATATCTGGTGCCTGTCTCGAGGAGG GCTTGAGACACAGTGTGGTGCTCCTCAGAAGCAGACAGGTGATTTCTTTGTGTGATTTTTCTTTTC CCCTGGGACAATGACAGTCAGTAAGACAGGTTTCAGGGACTTTTGTGTCCAGGTCTGAGCACTAGT CGCTCACAGTTGTGTGTACTAACCTTCTTCCTTCCTATTGAAATGGCAGGGGTCTTTGAGTCTCAC TGCTGCATGTTCTGCCTTCATAGGGATCTGTAAGTATGCTGGGCATCTGGGCTTTTAGGGGGCTCT CTATAGGGTGTCTGAGATAGAGGTCAACAAGGGCTTATAGACAACTCAAACAAAGCCCATGGCTTG AGCAAGTCTGCAACAAGCTGTTTGTCTAGCCTCCAGCAGAGGGCGAGGGAGACAGCTTCCAGATGT TCCCAGTAGGTGGAGCCCCTCCAAGCCCAGGGCTCAGGAGGCTTACAGGGTGGGAACTCCAATACT GGTGGAGGGAGGAGGGCGTTTGATGGGAAGATAGGGAAGTTGCTGCTTCCTAAACTGTCACAACTG GGCTTGGATAGGAGTCATAGTCTGGGACCACAGCCCTGTGGTAGAATGCTAGCCTGGTGTGCTCCA GGTTTAATCTCCATCACTGCAGAAATGAGTCCAAGCTGTGTGTACCTCCAGGGCACTGGGCATGGG GTTCCCTTGCCATTGTGTGTGCCCGGAGAACTGGCAGGCGGGAAATGTCTTTATCAAGGGTTACCT TGGAAGAGGTCCCAACACTGTAGGGTGCTCCTGTTGTCAAAACCTATGCAGAGGCATCTGCTTGCT CTCTAATAACAGTATGCAATGCTAAAGGGCTCGCTTACAGCCGGTGGCCACACTGGAGGCCTGCAC ATCAGGTGGCCACAAGTTCTGCTGCTGCGCCTCCGAGGAAACACTTGGTCCTCCGATCGATTTTAA CCTGTTGAGGCTTTGCAATCCCCCTGTGGCAAAGGCTCCAGTGTTTTCTATTTCTATGCAAATTTC TTGAAGCAGAACTGTTACTGTCTTTCTCCTCTGCCCTGGGAGGAGGCGCTAGCGTTTCCTTCCAAC TTCAGGTGCAGCCCCCCTCGTGGTTAGCGGTCTTAAGTTCGTGACTTGGGTTTGCAGATCTTTTTT GTTACATCGCCGGACCATGTGGTGGTCTTTAGCTGTAAACAACATTAACCCTGGGTTGATTAGCAT ATGCTTCTAAAAGATGGTCCCAGATTCTGCGACTTGTAATAAAATGGAAACTTGCTGGTTTTTATG CCTTTCTAACTCTTGTATTTGAATGAATGTTGATCACTTTTTGTATTAAAGTGGCTGACACATGGC TACTGTCACTGTG
(SEQ ID N O :132 )
Protefna ribosomica de Mus musculus L23a (RPL23A)
ACT GAGTCCAGAT GGCTAATTCTAAATAT AT ACTTTTTT CACCATAAA (SEQ ID NO:133)
Protefna ribosomica de Mus musculus L17 (RPL17)
ATTCAGCATAAAATAAAGGCAGATAAAGTTAAAGGTCTTCTGGTGGTCTTTAATGAGCCCTGTTGG GAGTGAGGTGCTTTAACATGGAGAAGCATGTTATTAAACAGTGAAATAGATGGTTCAAAACCACGT GACCATGT
(SEQ ID N O :134 )
Protefna ribosomica de Mus musculus L24 (RPL24)
TGTGGTAGAGCAGAGTTGGAAATAAAGCTCTATCTTTAACTCTAGG (SEQ ID NO:135)
Protefna ribosomica de Mus musculus L26 (RPL26)
AGACATCTCGTGCACGGCTTTCATTAAAGACTGCTTAAGT (SEQ ID NO:136)
Protefna ribosomica de Mus musculus L27 (RPL27)
GTATATTTTTGTTTTGGTCATTAAAAATTAAAAAAAAAAAAATACAAGTGTCTGCCTATTGCATTT GTGTGGGAAGAGACTGG GGAAATAAAACAGGTGTGCTGTTGTG
(SEQ ID N O :137 )
Protefna ribosomica de Mus musculus L30 (RPL30)
ACAAGAAAGTTTTCCTTTAATAAAACTTTGCCAGAGCTCCTTTTG (SEQ ID NO:138)
Protefna ribosomica de Mus musculus L27a (RPL27A)
AAGCCACACCGGAGGTTAATTAAATGCTAACATTTTCCATGTGGTCTTTGCATCCTTCCTTGTCTG CATGTTGGAAATCTGCCTAACATTCTAGGAAGAGGTGAGGTGTGGGCCCTTGAGAGTCAGTCTGTG GGAATAAGTGTAGCCCAACTATGCACAGTTGTAAATTCCTACATCCCCGTGTGTATTGGTCTTGAT ATTCAAAGAATTGATGAATGCCATTACTTTCAGTCCAAAGTGAAGAAACCTGGTCTCAAAAAATCC CGAGGACCAGAAATGAGATGGGTTTTCCTGAAAATCTAAAGTTCTTGAAAAACCTTGCCATCCAGA TTGCTAGCAACTGCCTAGCTTTGTAAGCTTACTGTGATGGACAGGTAGCTCAGGACGACTGGTCAC TTAATACTGGACAGATTAGCATGGAAAACTTAAGGGGAGGAGGAGGTAGTAGGTTCCATCCAGCTT CGCTTTGTTGGTGGCATCTAGGTGTTGTTCCAAGGGAGCATGCCTACCTGCAACAGGACATCACTG GTTGGGAATACTGTAGAACCAGAGCTGTGACCTTTGAACTACTAGAAAGATGAAATTTTATGTAAA GAGTACCTTGGAGTAAATAAATAAAGCCCAAGATCCTGATTGTCTA
(SEQ ID NO:139)
Protefna ribosomica de Mus musculus L28 (RPL28)
GCCCCACACGCCCGAAGCAATAAAGAGTCCACTGACTTCC (SEQ ID NO:140)
Protefna ribosomica de Mus musculus L29 (RPL29)
AAAAGGCTCCTGCCAGTGTGAAGACAGACGGACTGCTGTGACACACCTCCCCACACACTATTTGCA GATGACCAGTGTCCTATGCTGTTCTTACAAATAAACTCAGGCAAGATCTGTTAGCTTG
(SEQ ID NO:141)
Protefna ribosomica de Mus musculus L31 (RPL31)
CCTGCTCGTGTCAAATAAAGTTGCAGAACTGCCTTCAGGGTTTGGTTTTCCTTTCTGTTGTCTGCC TCATGGGTGGAATTTTTGGGTCTACAGGGTGTTGGAAATTAATCTGAGAATCTCTGTTCTGGGTAC ATGGGAAATTAGAAATACGTGAAACATTCTTTTCACAGAAGTCACTTTATTAGGATTGTGGATTTG GGTTGGTTTTGAAACAGGGTTTCTTGTGGCACTGCTTGTTCTATAGAATAGGGTGGCCTTGAACTC AGAAATCCACCTGCCTTTTCCTCCCTAGTATTGGCAATTAAATGCCCAGCTTGTTTGTAAGCTCTC ATTTTCAGTTCCAGGTTTATGTGTGAGCCTAAGATTAGGTAAAGATTGAGGTTATAACTTAAACGT ACTGAATTAACTTATGTTGTGTGGGTCCCAGGAATTGGACCTGGGACATCAACTCTGCCTTTCCAG CCATCTTTGCCAACCAGTAGCTCATCTCTGGGATGTGTCTGCCCTCAAAATGACATTTTAAAAAAG TCAGTACAAAAGAACGATTTTTATTAAAAACCTTGAGGACAAACATT
(SEQ ID NO:142)
Protefna ribosomica de Mus musculus L32 (RPL32)
ATGGCTTGTGTGCATGTTTTATGTTTAAATAAAATCACAAAACCTGCCGTCGTA (SEQ ID NO:143)
Protefna ribosomica de Mus musculus L35a (RPL35A)
ACTAATGGAGAGTAAATAAATAAAAGTAGATTTGTGCTCTTGTATTTTTTTTTCACATCTGTCCTA AA
(SEQ ID NO:144)
Protefna ribosomica de Mus musculus L37 (RPL37)
GGATTTCAATCAGTCATAAAATAAATGTTCTGCTTTCAAAAATTCTGTGGTGATCTAAGGTACTTT AACATCGGTTCAGAGTTCGGTTATATGATTGCTCTGGGATCCTACGCTTCTTCCTTCATAGTTCCT GTGGGTCCGAAGCTGGGAGGGGCTGGGTGGACTCTCGGGAAAGATACTCTGAGCCTGTCTCGGTCC CCATCGTGTTTGCTTGGCCCTGGGCATGGAAGTGGGTGAGTGATGAGCTGAACGAGCAGGCTTGCT AGAGATGAGGACAGTTACTGGTGTGGTTATATCACTACCATGCCTACAGTGTCTTAAGACGCTTAC AGTCTGTAAGGGACTTAAATGATTTGAGCTCTTACTTATCCTGTAGTTTCTGATTTTTAACATTTA CTTGAATAAAGCCAAGCAAGATAAGCCTTTATTCCCAGCACTTGGTGACAGGTGGATCTATGAGTT GGGGATCAGAGCTACACATTAAAACTCTTAATTCATCTTACT
(SEQ ID NO: 145)
Protefna ribosomica de Mus musculus L37 (RPL37)
GGATTTCAATCAGTCATAAAATAAATGTTCTGCTTTCAAAAAAAAAAAAAATTAATCCTCTGTGAT GGCCAGCAGTTAACATTCAACAGTTTCTCTCTAGGCTCTTGATTCTCTGACTATTGTAGGGATTCG ATCAGCACTCGCATACCAGAAGTGTGAGATGGTCCGTCCTTTTTCAAGACAAGATTTCTCTGTGTA GCCCTGGCTGTCCTGGAACCCACTCTGTAGACCAGGCTGGCCTTGAATTTACAGAGATCCCCTTGC CTCCGCTTGCTGAGTGCTAGGATTAAAGGCATGCGCACTATG
(SEQ ID N O :146 )
Protefna ribosomica de Mus musculus L37a (RPL37A)
AAGCCCTGCTGTCTGAGACTTGCCTAGCCTGCAATAAACGGGTTATTTACGTAACTTTTTTTTTTT TGCCTTGTTTGTGGTTAATTAAAACATTTGGTGTGTGTTCTATTTTTTATTTTCGAAAGATGCTTG
TTTTGAGACATACTGTGTGACCCTGGCTGGCCTTGAGTGCCTGGTTCTCCTTACAAGTGTAGATAC ATCTGGCTTAAGATTTTAGTCTTTCAGAAATAAAAATGTTGCTAAGAC
(SEQ ID N O :147)
Protefna ribosomica de Mus musculus L38 (RPL38)
ACCAGCCCTCTGCGTGTGACTATTAAAAACCCTGAAAAGTG (SEQ ID NO:148)
Protefna ribosomica de Mus musculus L39 (RPL39)
GGATTCACACAATGGCAAGACTGAGGATTTATACTGAATTGTCATCAATCAGTCCTACCAGATGGA TTTCAACATTTAAACCTGGAGACTCTTCGTGTCTTGAATTAGGATGTTTGTCCAGTAATAAAATAT AGAACCTTTCAAAATGCTTTTCTGGTTTATAAAGTACTGAATTGCCCTT
(SEQ ID N O :149 )
Protefna ribosomica de Mus musculus grande P0 (RPLP0)
TCCCGCCAAAGCAACCAAGTCAGCCTGCTTAATTTGAGAAAGATGGAAATAAAGGCTTACTTCTCT TAAAACTCCGGTCTGGATTTATTTAGTTTGTTCACTTAAGCAGGATGAAAAAGCAAAACCGCTACT GTTTACTTTGTGTTGGCATCTTTGTTTCTAAAATTAAAGCTCCTAGTGTTTTTGTGGGCTTTGTTT GTTTTTTGAGACAGTCTCTTGACTTGGTGCCATAGCTAGTCTGGGACAAAGATTTTCCAGGTGTGA
ATTAAAGGTGTATGTCATCAA
(SEQ ID NO: 150 )
Protefna ribosomica de Mus musculus, grande, P1 (RPLP1)
ACTGCTTTTGTTAAGTTGGCTAATAAAGAGCTGAACCTGT (SEQ ID NO:151)
Protefna ribosomica de Mus musculus, grande, P2 (RPLP2)
ATTCCTGCTCCCCTGCAAATAAAGTCTTTTTATGTATCTTGA (SEQ ID NO:152)
Protefna ribosomica de Mus musculus S3 (RPS3)
CAGGGTCTTGGCAGCTGCATCTGGAGGCATTTAATAAAATAAAGACATTTAATAAAATCTTGAACA AAGACAAGGCCTGACTGGATTGTGTCCAGTATTCAACTGAGTTATGTTGTCTATGGAGCCATGCTT ATTCTGTTGGTTTAAGCTGGAGGGCATGAGCAGAGCTGACCAGAGAAGTCATGAAGTTGGTGACCC TGTGTTGAACAATTGAGGGTTAGAAGAGCAGTTTGGTTTTGGTGCTCTTGATGGAACCCAGGTGCT TGGACATAGTAAGCACACATAAGACAGAGTAAGACTGCTGTGTCTCTGGCCTGGAGTAGTCTTTCT TGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCTAGAATGAAAGCAGATGGCCCAGCGAGTTAGGTGCTTC CTATGAAAGCATGTGTGCTGGTTTGTCATGCACACAGCCCTGCAGGAGAGAGTATGGCAACACAGC CGCTCAGCATCCCAAGATAAAAAGGGAGTTTCTACTGCCATTTTGAGCTTGGGAGTTTGAAATGTA AAGCCTGTCCATATGTTTTAAGGATCCATGTATTTCTGTTTTGTTTGTTTTTCAAAACAGGGTTTC TCTGTAGCCCTGGCTGTCCTGGAACCCACTCTGTATGTAGACCAGGCTGGCCTTGAACTCAGAAAT CCACCTGCCTCTGGCGATCCATATATTTCTAAGTCCTGTACTTAGACGCTGTTTTGGAAAATTCAT TTTGGAAGCATTTACTGTTGGTGTGTTTTGTGGGGAATGAATGATAGCTTGGGAATTCTTTTCTGT TTGGTGAGAGTGAAGCTGTCAGCCCGGTTGTAGCCTGGCTGGTGCTCAAAGGCTTTCTCTCATTGT CTTCACCTACGTAGCTTTACGTGGGGTAAGGACTTAAGTTACTTAAGTTGGGTGCACACTGACCAT GTCCACAACCTGTTAACCAACTCTACATGATGAGTACAGATGTACCTTTTTAGAAAGTGTTAATGT GTAGCCCTGGCTGGCCTCTGCCTCAGGGTATTATGAATAAAGTGTGCAACCTTCATCTGGTTGATT AAA
(SEQ ID N O :153)
Protefna ribosomica de Mus musculus S3A (RPS3A)
AATCCAGATTTTTAATAGTGACAAATAAAAAGTCCTATTTGTGATCGTT (SEQ ID NO:154)
Protefna ribosomica de Mus musculus S4 ligada a X (RPS4X)
AATGGTCTCTAGGAGACATGCTGGAAAAGTGTTTGTACAAGCCTTTCTAGGCAACATACATGCTAG ATTAAACAGCATGGTGAAACT
(SEQ ID NO: 155 )
Protefna ribosomica de Mus musculus tipo S4 (RPS41)
AGTGGACTCTGAGGGACATTGCGGGGAAGGGGCGTTTACGTTTGTTTATACTTAAAAGTTTTTTAA GCAGCATGTTGAATTAAAAAAGAAAGCAAGCTTC
(SEQ ID N O :156 )
Protefna ribosomica de Mus musculus S5 (RPS5)
TTTCCCAGCTGCTGCCTAATAAACTGTGTCCTTTGGAACAACTAT (SEQ ID NO:157)
Protefna ribosomica de Mus musculus S6 (RPS6)
GTCTTTAAGAGCAACAAATAAATAATGACCTTGAATCTTTCATTGGCTTTCATTAATAGTGTAACT AGATAAATGATGGGAAAGATGAGACAGAAGAAGGAATACATCTATAGGACTGCTAGAATATGGGGA GAGTGATTATTTTCAAATTAATATGTATCGAGCTTCTACCCCAAGGTAAATAAATAACATTTGGAG ACCATTAAAATGTAGGATGGCATAGAAGAGGCCTTTACTAAGATTAATAATTAAAGAAACACAGCC TTTAAAGTAAAAAACACACTGTGCCTTTGAAACTTGCTAAAAAGATTAACTTCTGTCCCAAAAGGT ATCAGCCATGCGCTACCAGCCTCCCTGCCCCTACAGTGGCAGTGGCTGCATTCTTGGTGAATGGTA GTGGAAGGGATTAAACCTAGGCCTCAGTCATGCTTCCCAGTCACTGGTACTGATTTGTATGCACCC GCTTAGGTGTGAAGGTAGTTTTGGTGTGTATCACAAGTTAGCCTGTGTAGCGAAGACAGGTTTTCT CCACCGTGTTTTTTGTTACACATGACTATTCACAAATGTGCTGCAGACAGTAAAATGAGAAATACC CTTCCAAGG
(SEQ ID NO:158)
Protefna ribosomica de Mus musculus S7 (RPS7)
AGAAAATGACTGAATAAAGTGTCATTCATAGTATTTGGTTGTAGTAACTTGTCAAAATCTCAGGGC CATGGGTGCACGACAGCAGTAGCTTCTTGAATGAACTGAAGTTTTCAAGAGGTGCCTGGAAGGTGA AAAACACACTGAAGCCAGTCATGTTGATATGGGGGCATTCTGCTGCTGTGAAACAGACTGGGGTTC ACACCCACCrTGCGGGATTAGAACTTCACTGCCCTCCAACTTCTTTCTTTGTAAACAACTGTCCAC ATTTT
(SEQ ID NO:159}
Protefna ribosomica de Mus musculus S8 (RPS8)
GCCTCATGTGTAGTGTAATAAAGGTGTCTGCTGTTCTATCTG (SEQ ID NO:160)
Protefna ribosomica de Mus musculus S9 (RPS9)
TTAATACTTGGCTGAACTGGAGGATTGTCTAGTTTTCCAGCTGAAAAATAAAAAAGAATTGATACT TGG
(SEQ ID NO:161)
Protefna ribosomica de Mus musculus S10 (RPS10)
AGTTGGAGTTTATGTTGTATTGAATAAACTTTAAAG (SEQ ID NO:162)
Protefna ribosomica de Mus musculus S11 (RPS11)
GGGGACTCTGGCCAATGCCCTAGAACAAATAAAGTTATTTTCCAACG (SEQ ID NO:163)
Protefna ribosomica de Mus musculus S12 (RPS12)
ATAAATTTTGGCTGATTTTTCTCTTGTATTTCTTGTTTGCTGGTATAAAA (SEQ ID NO:164)
Protefna ribosomica de Mus musculus S13 (RPS13)
ATGCTGTTGTGTGCACAAGCAATAAAATCACTTTGAGTAACTT (SEQ ID NO:165)
Protefna ribosomica de Mus musculus S15 (RPS15)
CCGAGGCCAATAAAGACTGGTTTTGGTCCCTGGA (SEQ ID NO:166)
Protefna ribosomica de Mus musculus S15a RPS15A
ACGTAAAGCATAAATAAAAAGCCTTTGTGGACTGTGCTCAGGGTCAGTCCTTTTGAATCTCTGCAG CAGAGTAGCTGGCTGTGCTGACTGGTGACACTTCTGGTGATGCTCAGCTGTGAGGTTTTATGTAGA TATTGAAAGCATGACCATTGTCTTCACTTCACCTCCAGCTTGGGTTGTATGCCAGTAACATCAGCA TAAGGTGGTTAATGACAGGATGGTCCCTTGAGTGTGCAGTGAGTCTGGTTTATTTGCCAATGAGAA GCACAGGCCTCCTGTATGGGTCTTTGCCTACAGCCCCCTTTCATCACCCAGACTTGGTAGACTTAC ATTCTGTCACACTGTTGGCTCTTAATCTCAGCCCTGAAAAATGCCATTTCTTGGGTATCAAGGCTA GTCTAGATTCAGAAACCATATAAAGGTTGACAGCTGGTTTAAAAAAAAAAAGGCTTGGAGCTTGAG TTGGGTTCGCAGGTTATTCCAGGGTATCTGTCTGCACTTTGTCTCCCAGATTTAAAGGTAAGTGCC ACCATGCCTAGCATGGTGACTTATTAGCTTTGTTGCTGTGGAACATACATCAAATGAAACATTGGT ATGGCTCTGGTTTCACTGTCCATGGTTAGTATCTGGTGGGTGGACACCTGGTGGAACCAAGCTGCT CATCCCAGAACTAAGGAGCCATTCCCCAGAGACTTGTCTTCCTACTAAGTTCCATCCCTACAGCTT CTAGTAGTAGCTTCAGAGGTTGTGAATTGTGGACTTAGTCTGCCATAACATTTAAAATAGGTATTA AATTCAAGTCATTTGGTCACTCAGCACCCACGTGGCTCTTCAGAACAACAGAAGCCCCTCGGACTT GTCTGTTGGAAAAACCAGTTTGAAATAATGTACCTGCTTTAGTTGAGAAAACGCTACAACTGGTGC TGTGTCCTGCCATGCTGATGAGCTCTGCTCTGCGACCTGCCGAACTTGGGGGATCTCTACCCCCAG ACTTTGCTCAGATCTGTTGATGATTTGTCCATGCAGGAAAGTTTACAAGGTCTCTGTGTGTCTACT ACTTACTAGTTGCTGTGACAAAAATACTGAAAGTGTTTACTGTGTGTGAGGCACAAAGTTTGTGGG AAGCTGTACCCTCCCTCATTTTGGTGCTGCTCCTGCCTTGACTGACAGGATGAGCTGCCCCAACCA TCGTTGCCATCTTCCATAAGAAGCAGGTGGCTCTATTGAGTTCCCTGGAGGTGATCCCAAGGGAAG GAGGAGCCTGGGAAAGTGGATCTCAAGTCCCCTAGTCTGGCAGTTGGCTGTTTAGGAAAGTCCAGT GTCAGTGTTTGATATGTTGTAAGGAAACAAATTCAGTTTTATTTAGCTTATTGGCTCTGGGGAAAT GGCAGTTCCCATTAATTGGTGCTGTCTTTCTCTTTGAGGATCAAAATTAGCTTCCTGTTCAGTTGT TAAGCATATTTCATAGTCAAATAATCCTCTTATCTTTACAAGTGAGGTTTTCCTTCGAGTGGATAT CAGAGTCCCTCCCACGGCTTCTATCCCTCCTATCCTTGTGTAGGAAGTTAAGCTTGCTCATTTGTA GATTAGTGGTCGGTTACACTGCAATTTAGAGTATCATGTGTACTCTACACATGATTGATTCTAAGC CCCCTTCCCTTTCCATGTCCTTCAAAAATTTTTTTATTCTGAGACAGTGTTAGGATTTTTCCTGGG CTAGCCAAATGCAAGAAGTGTTGGTCCCAGACTTGTAATCTTTCTGCCTTAGCCTCCCAAATTCTA GGATTATAGATTTATGTCATGTGATGAGTGGTCTTTTAAAGATTATCTTTTATTTTTTTTGAGATG GGGTTTTTCTGTGTAGTTTTGGCTTTCTTGGGACTTGCTCTGTAGACCCAGGATGGTCTTTACTCA GATCTGCTTGCCTCTGCCTCCCAACTGCTAGGATTAAAGCATGAGCCTGAGCCTTCATGCCTGGCT GACAGGTGAATTCTCAATACCTACCTAGCCATAGGGAAAGTGATTGTGTCCCCTTCCTCATAGAGG GGCATAGTCACCCAGGCCATACCTTTAGCTTGGGCTTTTGGTCAGTGAAGAAGTATGAAGGGACAA GAACACTATCAAGAGCCTAATGTGCTCTGGCCTGGATGGTCAGCACAAAATGAATAGACTTACCAA ATTCTGCTGTCTCCTTGGTAGATGTGAAGTTGTTGGAAGAGTCCTAAATTTAGCAGACTATACTGT CAGCCTATCAGACTATAGGCTGCCGGAGGGCAAGTCTGCTACCTATTTCCATCTCATGCCTGCATT GTTCATCCCCCTATGTAACCCACCTACCTGTCACTCATTCCTCCATCCAAAAACTATTGTAGGTTC AGTGGAAATTTCAAGCTTGCCTGTCTCAGCATCTTTCTTACCTTACCCCTAAGGATGGCATCTCTC TTGGCTACATCTTTGGTTTATCTGGAGATCCTTGATTAATTTGAACAAGAGCTACCTTGGGTTATG CAGTTTATGCCTCCAGTGTCCCAGAGACCGGCATTTGAGAGATCCCTGATAGCAAACCCATAGGGT GGCCTTTTTTTCATCCACCCCATTCTCCCTCCCACCTCCCTCTTTTGACCTTGAGTCCTCACCAGA GAGAAACCAGGCCCACTTAATTAGTTCTACATGTGTACACTACATGGGTGCAGTGCCCAAGCAGGA GAGGTGTTAGATTCCCTTTTAACTATAGTTAATAGACAGTTTTTAAGCCCCAGTGGATGCTGGGAA GCAAACCTACATCCTCTAGAAGAGCAGCTATTTCTCTGAGCCATTTCTCCAGCACCATTTTCCCCT CTTTTAAAAGCAGGTCTTGCAGTGTGGCCTAGTCTGGCCCCCTGAGGTGTTTGCATTGCATGGCAG GCATGTCCACAGGAACACCATAGTTCTCACCACTCGTACAGCACAGCAAGTGGGGTGCCGCAGGGG ATTATCACTTGAGTATAAAATAAGGGTTGCTTTAGATTGAATAGGATAACCACGCGTTCTCAGAAC AATCAAGGAAGGCTGGGGTGAGCCAGCACCGACCTTAATTGTTTACTTAGTAAACTACTAAATGTA TGCACGTGTAAGCTTTTGCCTTGATTGAGGTCAAGCTGTCGAGAAATGGTTCTCTTTACAGTGGAT CCAGTCAGGATTGGCAGCAAGCACCTTTGCCTGCTGAGCCTACATGTTGTATAGAATGGCAACGTT GTGTAGAATGGCAGTACATTAAATGGGTTTTTCATTTA
(SEQ ID NO:167)
Protefna ribosomica de Mus musculus S16 (RPS16)
GCCCATCTCAAGGATCGGGGTTTACCTTTGTAATAAACATCCTAGGATTTTAACGTTCC (SEQ ID NO:168)
Protefna ribosomica de Mus musculus S19 (RPS19)
AACAAAGGATGCTGGGTTAATAAATTGCCTCATTC (SEQ ID NO:169)
Protefna ribosomica de Mus musculus S20 (RPS20)
GACAACTGAATAAATCGTCTTAATGGTCAAATTTTGCTGGCTTTTGTTCAGGTTTTTTTTT'rTTAA TTCATGTTTATGAGTGTAAATGTGTGTGTCACAGGGGTGTCAGATGTTCTTTGAACCACCATGTAG GTGCTGGAAACCCAACCTGCATCCTCGGAGAGAACAGGTTCCTTAACCACTGAGCAAGTACTGAAG CATTAAACTGCTTTTAAAAATGAAGGTGTGCTAACAGATTGGTCAGGTGAAAAAGAGACGTTAGGT TTCCTGCAGGGGGCGCTAAGCCAATTTAAAGACTAAGTTGGGTTAGAAAAGAGCAGATTGCATCCT TGATCTTTTAAGCCTGGGGATTTTGTTTTGTTTTGGGATAGGGTCCCAACACAGAACAGGCTGACC TCATTAAATATCAATCTTATTTGATTGCCTCTGCTCCCAGAGTACTGGAATTAAAGGCAGGGACCA CTGTATTAGCCATTCTGAGTTATTTGAAATGGACTCTGCAGGCCATACTTGGTCAAAATTCTGCCT TCTCAATTACAGGCATGAGCCACTATGCCTGGTTTACTTACTAATAGATGTCCAAAGACTAGTGTA TGAAAATTTTGCTTTTCCAGGTGATTTGTGAAAGGCAGGGTGGCCTCTCCCATGTCACACTACTTG GGTTACTCATGTTGCAACATATCTGCAACTTTAGGTTGAGGGGATTTGAGCCTGCATGTGCCACTT TGGCCAACTGAACTAATCTTTAATTCCATCTAAAACTTTTAAATCTCAGTCATGTGTTCAACTGGA AAATAACCTAGAGTGTGCTATGTTGACTTCAGGTACACATCAAAGCAGGTTTTAGTGATGTAGAAG CTGTGTTTGAGTTGAACTAGTGTTGAGGCTAGGCTTAGGTACCATAGAACTTTGGTTTTTCAAGAC AGGGTTTCTCTGTGTAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTCACTGTAGACCAGGCTGGCCTTGAACTCAG AAATCTGCCTGCCTGTGCCTCCCAACACACCCAGCTCTAGCTTTAAATTCCTTGCACCAAGAGATG CTTTATCCCTCCGCTGAGAATACAGGTGCATGTCAGCATGCTAAACTCTAGATAAAATTTCATCTT GTTTGAAAGGACAATAATATAAGAAAAGTGTATTTGCACTGTATACCATGCCCTTTTGTGTTTAAA GTTAAACTGGCAACAGTGTCCCATAGAGGTTCCAGAAGAAACTGCTTCTAAGGGGAGGACCATAAA GGGAAATGCTTACCATAGAACTTTTTAAATGTTCCTACAGGTTGTACTCTGGATAGGTATATGAAC ACCTTTCTATTAGAACAGTTTTATAGTAGTACTTAGTGAATATGTAAATAATACTATTTGTGAAAT AGTTTGAGGTTTCTCTATAGTCCTGGCTGGCTTGAGCTCTATACCAGATTGGCTTCTAAATCAGAA ATCTGCCTCTATCTCCTGAATGGTTATGATAGAGATGCAAGTTACTTAATTTCTTACATGAATTGC ACTTTGTACATGCTTTTGGATATGGGCCTAGGCTTTTGCTTTTGGATTAGACTGTCTTTATTACAT TTACTGGCTTGATACTTTACAGTCTTAAGCCCACTTGCCTGGGTGTGATGCACACCTTTAATCCCA GCACTTTGGGATTTCTGAGTTCCAGGACAGCCAGGGCTACGCAGAGAAACCCTGTCTTGGAGGGGA AAAAAAGAAACTTTGGAAATCAAAACTTCTTGGAAAGCCACTTTTAGAGACTTGAATCTAAGGATA ACTAACCAGGTAGTAACCACGAGTCATTGATTCTGTGAATCTTGTATGAGTGGGTTACAGGCAGAA ATTAACTTCCTCTGAGAGCACTGCTGTTTTAGAAATGCGACCTAGTAATTACCAAAGGCATTGAAG CCACTTGACTACAGTCTCAGGTTTCTGCATCTGACATTGCTGGGACTGTGTGGGGTTTATGGGTGT AAAATAAAACAGGCGAAAGGATGTTGAGTGGAAAGCTTTGGCTTCAGAATCAAATTCCAAATCAAT TACCAGATCAAATCAAATGCCAGATCAAATTACAAGACTTCCTTATGACTAAATTCTTCAGTGACT TAGGATACTAATAGTATCTGCCTCAAAAGTGTATGTGGTTATTTTTGTCCCAGTGAAGCCAAGATT CACATGCTATGGGCATGGATTTCCTGAGGACATGCTAGCCTATGGTATGAGTTACTTGAAAGGACT CTGAGAAATCTTAGTCCCCAGCTGTGAGGTTTTTAAAGATCATGCTCAATGGAAAGTGGGGCAGTA ATTTGAGAGCATGGCACAAATGAGGTTTTATCTTTTGAAACTAAGTGAATCTATGTCCTTGGACTA. GCATATTTTAAATCACACATCAAATGAAATTTCTGTTCAATTCCTATAAACAGTTTATTTCATATT TTGTAGTTACCATTTTCATTAACAGCATACACCCTTCAATTGTGTTGCTAAAACTGAGTCACATTA TTCTGTAAGAACTTACTCCAGTATCACAACTTGGTGCTCATCCAATATTTTTATTTTCATTCTATT TTCCCTGTCTAGCCACGTATGGCCCTATTCTCTCTTCTTGGATTGACCCTAGCTTCAACACAAGAA AGCTTGCAGTATTTTTTTTTTGCGCCTGGTTCATTGTTTTGTCCTCAAGTTCTATCCATGTGTCCA GAAATTCGAGGATTTTTTAAAATTTACTTTTCTGCCTAAATACTGGTATGTGGATAGTCTGTTATT TTTACTGTTGGTTGCATATCTGTAGCATATTTCTGTATTTGCAATGACTACATTGAATGTCCCTTA GTTAACCTCATTCTTCTTAACTATTTTGTAGGCGTTTGCTATTCAAAGCACAATCTCAATTAAAAT GTTTTTAATAGCATCTTTCCACTTGGATGTGTAAAGAAAGTATTTCTAGAAGTCTGAATTTTTGTT GCATTGTAGATGTGTACACAATAGGGCTGGGAAAGTAGCTCACAGTGGGTAAAAGCCATTTGTTGC CAATCCTAACAGCCTGAGTTCAATCCCAGAATCTATAAGGTAGAAGAAAAAAACCCCAGCTCCCAC AAGTTATCTGGCCCTCTGCACACATATAAATAGTGCAATAAAAATTAACCATTTAAAAATATAAA
(SEQ ID NO:170)
Protefna ribosomica de Mus musculus S21 (RPS21) GCAGAAGAAATCGGGAATTTGTTACAAATAAAAGTTTTAAGTACCTGTGACAGTTAAG (SEQ ID NO:171) Protefna ribosomica de Mus musculus S23 (RPS23) AATTTGACAATGGAAACACAGTAATAAATTTTCATATTCTGAAAAAATA (SEQ ID NO:172)
Protefna ribosomica de Mus musculus S25 (RPS25) ACAGGTTCAATCAGCTGTACATTTGGAAAAATAAAACTTTATTGAATCAAATGAATGGGTGCATCT GTTTCCTAAGGCAGCCGGGGAGGATTTGGTCTTAGGAATAATAGCTGGAATTGGTTTGTTGGCCAT GAAGTCAGATGCAATTGCGCCTGGGAACCTTCAGCTTTTCCCTTTACGTGGTTGCTTGCTTCTTGT TGCAGCTTCGGTTTTGAATTGATGCCTGAAAGAAAATAAAAACTTAGCAAGACTAATGGTAAATCT
(SEQ ID NO:173)
Protefna ribosomica de Mus musculus S26 (RPS26) AGAGGCCGTTTTGTAAGGACGGAAGGAAAATTACCCTGGAAAAATAAAATGGAAGTTGTACTTTAC ATGGC
(SEQ ID NO:174)
Protefna ribosomica de Mus musculus S27 (RPS27) AAGCCCCTGATTGAAGATGAGTGGGAACCTTCCCAATAAACACGTTTTGGATATAT (SEQ ID NO:175) Protefna ribosomica de Mus musculus S27a (RPS27a) TTGTGTATGCGTTAATAAAAAGAAGGAACTCGTACTTA (SEQ ID NO:176)
Protefna ribosomica de Mus musculus S28 (RPS28) TCTTGCAGCTGGGTTCTGGATATCCACTACTTAGCCCACGGAATGATCTGCAACTGTTAAATAAAG CATTTATATTAATTCTTGTCTAGAAA
(SEQ ID NO:177)
Protefna ribosomica de Mus musculus S29 (RPS29)
GCGACCTTGAATGGATTCGACTGACTACTACCAAGTGGAACCGATCATGCTAGTCTTTGTACACAA AGAATAAAAATGTGAAGAACTTTAA
(SEQ ID NO:178)
Protefna ribosomica de Mus musculus L15 (RPL15) TACACGTGATATTTGTAAAATTCATATCCAATAAACAATTTAGGACAGTCATTTCTGCTTAAAGGT GTTATTTGTTAAAACTAGTCTACAGATTGTCATGAGTGTTCTGTGAAAATGTAGAAGTTAAGTGCA ATAATTGAAAACTGCAGGTGATGGCATATCTTGTTTCTGATGTACTTTGCATTATCTGCTTATGAG ATTAAGTGTATATAGTGTTTGTGCCAAGTGGTGTTCTGTGTGTAAGACCCTGTAAGAGGTAAAAAG TCCTGAAACTGACCCTGGATGTGTTGGTGCATGAGATAGAATCTACAGCTTTACGATGGCATCTTT TGGTTCACTGAAGTGGCTGCTTGGGAGTTTGATGAGTACAAACTTTATAGAGTTGGATTTTGCTTA GAAATGTGTAGGAAGAGAGGGTTTCAAAACCTGTTTTGTGCATAGAAAAGTGAGATCAACTATAAC CCACATTTTGAGAATTGAATCCAGTGTTATTTTCAGAAGACCAGGTAAATTTGTTGGAAGAGGTTT CACTTTCTGTTGGATCTAGAGTATGGATTTGGAGATGAAGGTTGAACATTGGATGTAGTAGGGCTT ATTTAGGGCAGATTATTTCCATTAGATTTGTAAACTTGGTTGTGGTTGCAAGTTAATATCAACCAA GCAAATATAAGTTTGATTAAGCTTGCAGACATTAAGCTTTTCTAGCAGCTGGTGTGTGCAGAGGCA GATGGCTCTCTGGTTCCAGGACTACCTACAATATAGAGAAATTTTCTCTATTCCAGTCAATTCATC ATGGGTAAGAATAGTCCATTTTGGTAGTGTTATTTCATCGTTTACAATCTACCTATGGGTAGTGGC TGGTAACTGCCTGGATGTTGACATTTCACAAAGGCCATACTTAACCACACTTTTATTTCTATTTGT GCGATGCCTTGGAGTAGTTTCCCAAAGTGATTTTGAGTGTGGAAGAAATGGTATTGTCCCCGAACA GCTGGCTTGGTCTCAAAATCTAATTGATGCTTTTATTAAATTGGTTTTCCTTTGGAGATTTTAAAA GGATGATTTGATTTCCAGAAAATACTAGACTCAAAATCTTGATAGCTAAAATTCTTTTCTATTCAG CAAAACAAGTCACTGTATAGAGGTTGTTCAAATCAACTAAAGTAATAAATGTCTTAAACAAGTGG
(SEQ ID NO:179)
Protefna ribosomica de Mus musculus S2 (RPS2) GGGTTTTTATATGAGAAAAATAAAAGAATTAAGTCTGCTGATT (SEQ ID NO:180)
Protefna ribosomica de Mus musculus L14 (RPL14) GGCTACACAGAATAATAAAGGTTCTTTTTGACGGTGGTAAATCTCATGTGTGGACTCTAAGCTTGT CGCCAAGTGGGAAATAGACTGGTGGGATTGTAGATAGGATGGGCTACTTAAACTCATTCTACCCAG GCCTTAGTACTTAGCATACAGCCAGAGTCAAACTGATCCTTTATACAGGGGGTACCATGACAGTAC AACAGTGTCGTTAACCCTAACAAATAAATTTCCCACCAACGGGTGGAATTCCTTCATTTTG
(SEQ ID NO:181)
Protefna ribosomica de Mus musculus S14 (RPS14) ACAGGACTTCTCATTATTTTCTGTTAATAAATTGCTTTGTGTAAGCTA (SEQ ID NO:182)
Protefna ribosomica de Mus musculus L10 (RPL10) AGGCTTCAATAGTTCTCCTATACCCTACCAAATCGTTCAATAATAAAATCTCGCATCAAGTTCGCT
T
(SEQ ID NO:183)
Protefna ribosomica de Mus musculus L10a (RPL10A) GATGCTCCAATAAACCTCACTGCTGCCACTCAG (SEQ ID NO:184)
Protefna ribosomica de Mus musculus L35 (RPL35) GATGACAACGACAATAAAGTGCGAGACTGACTGGCT (SEQ ID NO:185)
Protefna ribosomica de Mus musculus L13a (RPL13A) ACCCAATAAAGACTGTTTGCCTCATGCCTGCCTGGCCTGCCCTTCCTCCGCCGCCAACTAGGGAAG TGGGGACCAAAGGTTCCTTAGGCACTGCTCCTGTGGGTAGAGGGGACATTAGAGAGCTGACAGCGC ACCACCTGCATGAGTTTTTATTAAAGTGCAAACCATGGGATGAATCAGTTGAGCTTCAGTGTTGAA AATGAGTAGCAGGGCTGCCCCACCCACCTGACCAAGTACCCTATTCTGCAGCTATGAAAATGAGAT CTGCACATGAGCTGGGGTTCACAAGTGCACACTTGGAGCACTGCCTTGCTCCTTCCCAGCAGACCA CAAAGCAGTATTTTTCTGGAGGATTTTATGTGCTAATAAATTATTTGACTTAAGTGTG
(SEQ ID NO:186)
Protefna ribosomica de Mus musculus L36 (RPL36)
TGAACCCTCCCCCAATAAAAGATGGTTCCTAC (SEQ ID NO:187)
Protefna ribosomica de Mus musculus L36a (RPL36A) GCAGATTTTGTTATGAAGACAATAAAATCTTGACCTTTCAACCCCTTTGATTGCAGTTGTTCGTTT GGGAGGGAATACATTAAAAGCTTTCAGAAATTACCTG
(SEQ ID NO:188)
Protefna ribosomica de Mus musculus L41 (RPL41) GCCAGCCCGTGCACCTACGACGCCTGCAGGAGCAGAAGTGAGGGATGCTGAGGGCCGGGACAAGCT ATCGGACTGTGTGCTGCCATCGGTAATGAGTCTCAGTAGACCTGGAACGTCACCTCGCCGCGATCG CCTGGAGAAATGACCGCCTTTCTTACAACCAAAACAGTCCCTCTGCCCTGGACCCCCGGCACTCTG GACTAGCTCTGTTCTCTTGTGGCCAAGTGTAGCTCGTGTACAATAAACCCTCTTGCAGTCAGCTGA AGAATCAAACTGC
(SEQ ID NO:189)
Protefna ribosomica de Mus musculus S18 (RPS18) GTCTCTGGGCCTTTGCTGTTAATAAATAGTTTATATACCTATGA (SEQ ID NO:190)
Protefna ribosomica de Mus musculus S24 (RPS24) AATACCTAGCAGTGAGTGGAGATTGGATACAGCCAAAGGAGTAGATCTGCGGTGACTTGATGTTTT GCTGTGATGTGCAGATTTCTGAGAGGACAAATAAACTAAAAAGCTCCTACACGTCTGCTCTGCTGC TTATTGGGCATTAGAAGAATCAGGTGGCTGCTTGGGTGTTGATGCAGTCAAGTGCACTGGGCTTGG TGAAAAGCCCAGTGTAAGAGGCCGGTACAGATCCTTCCTGGCAGAGGGTGGTGATGGAGAGAACAT AAATAACTACATGGGCAAAGTGTAGGACCAATTACCCTGTTAGCATCGTCTTTGCTCAACACCTTT CTGTGTCCCTAGACTCTGAGTTTTTTTCTAATTGATTTTTATTGAACACTGAGTGTTTTGAGGTTT TATTTTTT
(SEQ ID NO:191)
Protefna ribosomica de Mus musculus L8 (RPL8) AGTTCAGGAGCTAATAAAGTACGTCCTTTGGCTAATCCG (SEQ ID NO:192)
Protefna ribosomica de Mus musculus L34 (RPL34)
AT AT GCACATTTTTT AAGTAATAAAAAT CAAGACTTGATCTACGCTTC (SEQ ID NO:193)
Protefna ribosomica de Mus musculus S17 (RPS17) TCTGTTATGCCATATTTTCAATAAACCTGAAAACAA (SEQ ID NO:194)
Protefna ribosomica de Mus musculus SA (RPSA)
GCTGCTGTGCAGGTGCCTGAGCAAAGGGAAAAAAGATGGAAGGAAAATAAAGTTGCTAAAAGCTGT CTTATGGTCCTCACTGCAGACTGTACCTGGATTGGCATTTGGCTATACAACAGAGGCATGGTCCTA CTGACATGTTTTGTGTTGAATACTTAAGCATGTGAACACATGGGTTTTTTTTTTTTTTAATGTAAA ATGTAGTAACACAATGTTTAGGTGGCTTTGGTGTTAGCTCTGGAGACTTCATGTGTCATCTAGGTG AGGTGTTCTTTAACACAGGGTCTCTGTTCTGTCATGCCTCATAGATCCTTCTACCTCCAGATTGGA GAGGGAAAAGGCTTATGTCACTGAACCTGGCCAGATTGGGATTTTGTGTCCCAGGAACAAAGTTAA TGCTAAAAAGTTAATGCCTTGGTGAGACTGATAGTCTGATGGTGTGAATTCACAGTAAGTGGTTGG GATTGCCAGATGGAATTCCCTGAGCTGCCGTGACAGGTGGCATTGCAGAAGTGAAGGATTCAGGAA TTTGAGTGTTGGGTGGGGGCCTGTGAATAGCACTTGGGCTGGGAGGGGAGACTGCTGCCCCTGAAT GTCCTGGAATTCAAGGACAGTACCTGGTTAAATGTTTTTCTAGCTTTTCTAAAAAGTTTGTTAGGC CTGGCATTGGCGGCGCACACCTTTAATCCCAGCACTTGGGAGTCAGGCAGGTGGATTTCTGGCCTG GTCTACAGAGAGTTCCAGGATAGCCAGGGATACACAGAAATCCTGCCTCAGGAAAAAACCAAAAAG AAGTTTGCTAAAAATAAGCATTTTTGCTTGATGGTATTGAAGATTGTAAGACATTAAATTGTGTCA TTACTTCTCCAGGTACT
(SEQ ID NO:195)
Producto 1 protefna de fusion Mus musculus residuo ubiquitina A-52 (UBA52)
AGCTGTGGTCATACCTGGCATGTGACCCCGGGACCAAATAAAGTCCCCTTCCATCCACTGGAGCAG
C
(SEQ ID NO:196)
Visur sarcoma murino de Mus musculus Finkel-Biskis-Reilly (FBR-MuSV) expresada ubicuamente (FAU)
GTCCTATTGCCACCCTGCCATGCTAATAAAGCCACTGTGTCCAGACTTCT (SEQ ID NO:197)
Protefna ribosomica de Mus musculus tipo 1 L22 (RPL22L1)
TTGGCCTCTGCTTGTAATACAATGAAAGTATTCTAAAGAAATATAAAATTGGACTTTATGAGAAAA TAAAAGTCATTTCACTCT
(SEQ ID NO: 198)
Protefna ribosomica de Mus musculus S17 (RPS17)
TCTGTTATGCCATATTTTCAATAAACCTGAAAACAA (SEQ ID NO:199)
Protefna ribosomica de Mus musculus tipo L39 (RPL39L)
GGAACCACACGTACTTATGCTGTAACTTACTGTAGCGTTTACAGCGTTACCGCTGTCTGGACAGCT GAGTGTGTTTCTTAGGAATATAAGTTTTCTTTCTGTGCTTTAGTGAGTTCATTCAGCAGTTCAGTA ATAAATATGTGAAACCTTTTGTTTCGAAAAAAATTGCTTCTGTGTTACAACTTACTTTGTTTTATG GTTCAGGATCATCTGCATAATAGACAAGTATTCTATCAGTGAGCGATATCCTGGATCTTGTTTGTG TAGTTTGGGGTTGAGACAAGTCCAGACTGCCCTAAAACTCACGATCTTCCTTCCTCGGCCTTCTAA ATGATTGGAGGACTCCAAACCTAAGTGATGGAAGTAAAAAGAAACTTATATGTCAAGACTCATTTT CTCTATCATTTCATGTGACAATTGAAATTAGATTATTTCTTTTTTCAATC
(SEQ ID NO: 200)
Protefna ribosomica de Mus musculus tipo L10 (RPL10L)
GGACTTTGCTGGCAGAAAAGAAGTACAGATGAGGTTATAGTTTGAAAAACGTTAATTCCGTTTATT GACTTTAGAATGTTACTTTGCATAGTATAGACCATTACAATGGAAAGTACCTGCCTTAAGAAACAA GAAAACTGCAGTTTATAGAGAAAGAATTTTCAATTTTGACCCATGTACTTAAAATTTTTGGTGTAT ACTGCAGTGTAGCAAATGTTTTGTGGTGACGGTATAAATGGTACTGTTTGTTATCTTGGATTAAGA GTGGCTAGAGAAGTTGGAAGACGTGTGAGAAGTTCTTTATAGAGAATTAAACATGAAAATTACATC TC
[SEQ ID N O :201)
Protefna ribosomica de Mus musculus tipo L36a (RPL36AL)
AACTTGTGTTCTCTGAGAGGAAAATACTGAAGCAGTAGAGAAATGACCTGCTAGAGAATAAAGTTA CTGTTAATGATACC
(SEQ ID NO:202)
Protefna ribosomica de Mus musculus tipo L3 (RPL3L)
GATGTCTGGAATGGAGCACACCTGGGATGTAGCACTCTTGCTATCTGTCCGGTCCTTTTTGTTCAA TAAAGTCCTGAGGCAACTCTCTCTGTC
(SEQ ID NO: 203)
Protefna ribosomica de Mus musculus tipo S27 (RPS27L)
TGAGCTATGAAGTTCCGGAATTTGTGTTTTTCACAGAAAGCCTTACCAACTTCAGTTACTTTACCA AGACAATGTAATTATTGTTTGATTTTATAAAGTCTACAACAATGATCTCCTATTTTGGTGTCAGTT TTTCAATAAAGTTTTAATTA
(SEQ ID NO:204)
Protefna ribosomica de Mus musculus tipo 1 L7 (RPL7L1)
AGCAGGAGCAGGTTTTCCAAAAGCACCCCTCGGAAGTGTTTTTGTCGTCGTTTAAAATTATCAAGT ATCTTCAGAGAAGATTATTTTCTGCCTTCAGAAACTGAAGGAAGGCTTGGGCCTAGAGAACGACAG TAAGGTGCGAGCACCGGAGACACTTAACACAGCTCAGTCCATGGAAGGACGAGTTCCCTCATTGGC TGCCTGTCTCGAAATCCACGCAAGCTGTGGAGGAAAGAATTACCCTGCTCATCCTGCCTTCTATCT TGGTGTTTAATGTTGGGTGGGCAACAAGCACAAACCTCCCTCCCACCCCCTCCAAGACTGTTAGAG CAGTGGGCCAGACCAAGCGGCGCACTTGAACATGGATCAAGAGGGTCCCGGTTTTACTTTTTATTT TTGTCAGGGTAGGCAGTCTTGTGTTTGCTTTGTTCAAAGCAGGGTCTCCCTGTTGGCCCTGGCTGG CCTTATACTCCACAGCAGTCCTGCCTCCTCCTCCTAGGTGCTGGGATTAAAGGCGTGCGCCACCAC GCCCGGCTACAGCCTGCATTTTTATGCACATTGGTCTGTTAAGCTAGTTGCATTCTGTGCTACCGG AGGGGACTGAAGTTTAATCACTTGTCTTCTATTAAAAACTAGTGTTTGCCTGGGCCTGGTGTGTAT ACCTTTAGTTGCAGCGCTTGGGAGGCAGAGGCAGGCAGACTTCATGAGTTCAGGGACAGGCAAGCC TGCTCTACAGATTTCCAGGATACCCAGGGCTACACATAGAGAAAATGTTAAAGATAAACAAAAAGC TGGACAGTGGGGGAGCACACCTTTAATCCCAGCACTCGGGAGGCAGAGGCAGGCGGATTTCTGAGT TCGAGGCCAGCCTGGTCTACAGAGTGAGTTCCAGGACAGCCAGGACTACACAGAGAAACCCTGTCT CAGAAAAAAAACAAAACAAAAACCAATGCAGTGATAGATTGTTGTTTCCTAAACCACATGTACCCA GGAAATGCCCACTAAATTTCACCTGGATCAGTGTTAACTGATCATTGGGAAATGAGGTGACCAAAA ATGCATCGCAACCTTGGACAAACAGCATGGCTATTTAACATTCTGGGATCCTGCAGAATCCTGCAT CTTCCTAAGTAGGGAAGCACTGTAGCATTGGAGAGAGGCCTGGGCGAGCAGAGCTAAGGCTTCCAT TTCTGGCTTGCTTGGAATTTAAAACAAGCTTTTTTCTATATAGTAAAAGATTGTTTTTAAGATTTT TGCGTGTGAGTACATGCCAAAGTAGCCAGGAAGTGTCACTTGCCCTGGAGCTAGAATTACTGGCAA ATGAAGGCTCAGAGGTGGATGCTGGGACCAATTCTAGGCCCTCTGAGAAAGCAGGTGCACTTGGCT TGTGCCTCCAGCCCCAAAGGCGATGGCTTATTGTGAGCCTGAGGCCAGCCAGGGTTACAGAGACTC AAGAAACAAGTGGGGTTGTCCATGTTGCTGGAGATGACCCAGGTCTATTAGGACCTTGACTACATG GATAGACATTCTGGCAGCTAGTATACTGCCATTGGGGCCTATGGAGAAGTAGCCACCGAGCCTATT TAGAAAGAAGGACTGCTGGCAAGCTTGGTGTCACTATGAAGGCAGACAAAGATCGATGTATTAACG ACCCCGACTCCAAAAACACTCGAGGGGGCCCAAGGTGGGCTCAGTGGTTAAGAGCCGTTCGCCCAG GGGCTGGAGAGTTGGCTCAGTGGTACCACATGGTGGCTCACAACCATCTGTAATGAGATCTGACGC CCTCTTCTGGTGTATCTGAAGACAGCTACAGTGTACTTACATAAAATAAATAAATCTTT
(SEQ ID NO: 205)
En una realizacion preferente, el al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 80%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 90%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente 95%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente 99%, con total preferencia del 100% con la secuencia 3'UTR de la protefna ribosomica Small 9 (RPS9). Con especial preferencia, el al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 80%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 90%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 95%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 99%, con total preferencia del 100% con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2
SEQ ID NO: 1
GTCCACCTGTCCCTCCTGGGCTGCTGGATTGTCTCGTTTTCCTGCCAAATAAACAGGATCAGCGCT TTAC
SEQ ID NO: 2
GUCCACCUGUCCCUCCUGGGCUGCUGGAUUGUCUCGUUUUCCUGCCAAAUAAACAGGAUCAGCGCU
UUAC
El al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial acuerdo con la presente invencion puede comprender o consistir en un fragmento de una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad al menos aproximadamente un 80%, de manera mas preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aun mas preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aun mas preferente al menos aproximadamente 99%, de manera mucho mas preferente del 100% con la secuencia de acido nucleico de la 3'UTR de un gen protefna ribosomica, tal como la 3'UTR de una secuencia de acuerdo con las SEQ ID No. 10 a 205, donde el fragmento es preferentemente un fragmento funcional o un fragmento variante funcional como se describe anteriormente. Tal fragmento preferentemente tiene una longitud de al menos aproximadamente 3 nucleotidos, preferentemente de al menos aproximadamente 5 nucleotidos, mas preferentemente de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25 o 30 nucleotidos, incluso mas preferentemente de al menos aproximadamente 50 nucleotidos, con mayor preferencia al menos aproximadamente 70 nucleotidos. , de manera mucho mas preferente al menos aproximadamente 150 nucleotidos. En una realizacion preferida, el fragmento o variante del mismo presenta una longitud de entre 3 y aproximadamente 500 nucleotidos, preferiblemente de entre 5 y aproximadamente 150 nucleotidos, mas preferiblemente de entre 10 y 100 nucleotidos, incluso mas preferiblemente de entre 15 y 90, con total preferencia de entre 20 y 70.
Preferentemente, dichas variantes, fragmentos o fragmentos de variantes son variantes funcionales, fragmentos funcionales o fragmentos variantes funcionales como se describe anteriormente, que tienen al menos una funcion de la secuencia de acido nucleico acuerdo con las SEQ ID No. 10 a 205, tal como la estabilizacion de la molecula de acido nucleico artificial acuerdo con la invencion, estabilizar y/o prolongar la expresion de protefnas a partir de la molecula de acido nucleico artificial acuerdo con la invencion y/o incrementar la produccion de protefnas, preferentemente con una eficiencia de al menos 40%, de manera mas preferente de al menos 50%, de manera mas preferente de al menos 60%, de manera aun mas preferente de al menos 70%, de manera aun mas preferente de al menos 80%, de manera mucho mas preferente de al menos 90% en la estabilizacion de la eficiencia y/o la produccion de protefnas incrementando la eficiencia mostrada por una secuencia de acido nucleico de acuerdo con la s Eq ID No. 1 o la SEQ ID NO. 2.
De manera preferente, el al menos un elemento 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion tiene una longitud de al menos aproximadamente 5 nucleotidos, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25 o 30 nucleotidos, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente 50 nucleotidos, con mayor preferencia al menos aproximadamente 70 nucleotidos. El lfmite superior para la longitud del elemento 3'UTR puede ser de 500 nucleotidos o menos, por ejemplo 400, 300, 200, 150 o 100 nucleotidos. Para otras realizaciones, el lfmite superior puede elegirse dentro del intervalo de 50 a 100 nucleotidos. Por ejemplo, el fragmento o variante del mismo puede tener una longitud de entre 3 y aproximadamente 500 nucleotidos, preferiblemente de entre 5 y aproximadamente 150 nucleotidos, mas preferiblemente de entre 10 y 100 nucleotidos, incluso mas preferiblemente de entre 15 y 90, lo mas preferiblemente de entre 20 y 70.
Ademas, la molecula de acido nucleico artificial acuerdo con la presente invencion puede comprender mas de un elemento 3'UTR como se describe anteriormente. Por ejemplo, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion puede comprender uno, dos, tres, cuatro o mas elementos 3'UTR, pudiendo ser los elementos 3'UTR individuals iguales o diferentes. Por ejemplo, la molecula de acido nucleico artificial acuerdo con la presente invencion puede comprender dos elementos 3'UTR esencialmente identicos como se describe anteriormente, por ejemplo dos elementos 3'UTR que comprenden o consisten en una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica, tal como de una secuencia de acuerdo con las SEQ ID No: 10 a 205, o de un fragmento o una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica, tal como una secuencia de acido nucleico de acuerdo con las SEQ ID No. 1 o 2, variantes funcionales de las mismas, fragmentos funcionales de las mismas o fragmentos variantes funcionales de las mismas como se describe anteriormente.
Sorprendentemente, los inventores han encontrado que una molecula de acido nucleico artificial que comprende un elemento 3'UTR como se describe anteriormente puede representar o puede proporcionar una molecula de ARNm que permite la produccion de protefnas mejorada, prolongada y/o estabilizada. Asf, un elemento 3'UTR como se describe aquf puede mejorar la estabilidad de la expresion de protefnas de una molecula de ARNm y/o mejorar la eficiencia de traduccion.
La molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion puede ser un ARN, tal como un ARNm, un ADN, tal como un vector de ADN, o puede ser una molecula de ARN o ADN modificada. Se puede proporcionar como una molecula de doble hebra que tiene una hebra sentido y otra anti-sentido, por ejemplo como una molecula de ADN que tiene una hebra sentido y una hebra anti-sentido.
La molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion puede comprender ademas opcionalmente una 5'UTR y/o una cap 5'. La cap 5' y/o la 5'UTR opcionales se situan preferentemente 5' al ORF dentro de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion.
Preferentemente, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion comprende ademas una secuencia poli(A) y/o una senal de poliadenilacion. De manera preferente, la secuencia poli(A) opcional se situa 3' al al menos un elemento 3'UTR, preferentemente la secuencia poli(A) opcional se une al extremo 3' del elemento 3'UTR. La union puede ser directa o indirecta, por ejemplo a traves de un tramo de 2, 4, 6, 8, 10, 20, etc. nucleotidos, tal como a traves de un ligante de 1-50, de manera preferente de 1-20 nucleotidos, por ejemplo que comprende o consiste en uno o mas sitios de restriccion.
En una realizacion, la senal de poliadenilacion opcional se situa aguas abajo del 3' del elemento 3'UTR. De manera preferente, la senal de poliadenilacion comprende la secuencia consenso Nn (U/T)ANA, con N = A o U, de manera preferente AA(U/T)AAA o A(U/T)(U/T)AAA. Tal secuencia consenso puede ser reconocida por la mayorfa de los sistemas celulares animales y bacterianos, por ejemplo por los factores de poliadenilacion, tal como el factor de especificidad de escision/poliadenilacion (CPSF) que coopera con CstF, PAP, PAB2, CFI y/o CFII. Preferentemente, la senal de poliadenilacion, en especial la secuencia consenso NNUANA, se situa a menos de aproximadamente 50 nucleotidos, de manera mas preferente a menos de aproximadamente 30 bases, de manera mucho mas preferente a menos de aproximadamente 25 bases, por ejemplo a 21 bases, aguas abajo del extremo 3' del elemento 3'UTR.
La transcripcion de una molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo de una molecula de ADN artificial, que comprende una senal de poliadenilacion aguas abajo del elemento 3'UTR dara por resultado un ARN prematuro que contiene la senal de poliadenilacion aguas debajo de su elemento 3'UTR. Por ejemplo, la transcripcion de una molecula de ADN que comprende un elemento 3'UTR de acuerdo con la SEQ ID No. 1 dara como resultado un ARN que tiene un elemento 3'UTR de acuerdo con la secuencia SEQ ID No: 2.
Utilizando un sistema de transcripcion apropiado, entonces conducira a la union de una secuencia poli(A) al ARN prematuro. Por ejemplo, la molecula de acido nucleico artificial inventiva puede ser una molecula de ADN que comprende un elemento 3'UTR como se describe anteriormente y una senal de poliadenilacion que puede dar como resultado la poliadenilacion de un ARN en la transcripcion de esta molecula de ADN. Por consiguiente, un ARN resultante puede comprender una combinacion del elemento 3'UTR inventivo seguido por una secuencia poli(A).
Sistemas de transcripcion potenciales son sistemas de transcripcion in vitro o sistemas de transcripcion celulares, etc. Por consiguiente, la transcripcion de una molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion, por ejemplo transcripcion de una molecula de acido nucleico artificial que comprende un marco de lectura abierto, un elemento 3'UTR y una senal de poliadenilacion, puede dar como resultado una molecula de ARNm que comprende un marco de lectura abierto, un elemento 3'UTR y una secuencia poli(A).
Asf, la invencion tambien proporciona una molecula de acido nucleico artificial que es una molecula de ARNm que comprende un marco de lectura abierto, un elemento 3'UTR como se describe anteriormente y una secuencia poli(A).
En una realizacion, la invencion proporciona una molecula de acido nucleico artificial que es una molecula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con la SEQ ID No. 1 o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 40% o mas con la SEQ ID No. 1 o un fragmento de la misma como se describe anteriormente. Ademas, la invencion proporciona una molecula de acido nucleico artificial que es una molecula de ARN artificial que comprende un marco de lectura abierto y una secuencia de acuerdo con la s Eq ID No. 2 o una secuencia que tiene una identidad de al menos un 40% o mas con la SEQ ID No. 2 o un fragmento de la misma como se describe anteriormente.
Asf, la invencion proporciona una molecula de acido nucleico artificial que puede servir como una plantilla para una molecula de ARN, de manera preferente para una molecula de ARNm, que se estabiliza y optimiza con respecto a la eficiencia de traduccion. En otras palabras, la molecula de acido nucleico artificial puede ser un ADN, el cual puede emplearse como plantilla para la produccion de un ARNm. El ARNm obtenido puede a su vez traducirse para la produccion de un peptido o protefna deseados codificados por el marco de lectura abierto. Si la molecula de acido nucleico artificial es un ADN, puede emplearse, por ejemplo, como una forma de almacenamiento de doble hebra para la produccion in vitro o in vivo continuada y repetitiva de ARNm.
En otra realizacion, la 3'-UTR de la molecula de acido nucleico artificial segun la invencion no comprende una senal de poliadenilacion o una secuencia de poli (A). Mas preferiblemente, la molecula de acido nucleico artificial segun la invencion no comprende una senal de poliadenilacion o una secuencia de poli (A). Mas preferiblemente, la 3'-UTR de la molecula de acido nucleico artificial, o la molecula de acido nucleico artificial inventiva como tal, no comprende una senal de poliadenilacion, en particular no comprende la senal de poliadenilacion AAU/TAAA.
En una realizacion, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion comprende ademas una secuencia poli(A). Por ejemplo, una molecula de ADN que comprende un ORF seguido de la 3'UTR ribosomica puede contener un tramo de nucleotidos de timidina que pueden transcribirse en una secuencia poli (A) en el ARNm resultante. La longitud de la secuencia poli(A) puede variar. Por ejemplo, la secuencia poli(A) puede tener una longitud de aproximadamente 20 nucleotidos de adenina hasta aproximadamente 300 nucleotidos de adenina, de manera preferente de aproximadamente 40 a aproximadamente 200 nucleotidos de adenina, de manera mas preferente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nucleotidos de adenina, tal como aproximadamente 60, 70, 80, 90 o 100 nucleotidos de adenina. Con mayor preferencia, el acido nucleico de la invencion comprende una secuencia poli (A) de aproximadamente 60 a aproximadamente 70 nucleotidos, en especial de 64 nucleotidos de adenina.
Por ejemplo, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion puede comprender una secuencia de acido nucleico que corresponde a la secuencia de ADN
GTCCACCTGTCCCTCCTGGGCTGCTGGATTGTCTCGTTTTCCTGCCAAATAAACAGGATCAGCGCT
TTACAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAA (SEQ ID No. 3).
La transcripcion de tales secuencias puede dar como resultado moleculas de acido nucleico artificiales que comprenden la secuencia
GUCCACCUGUCCCUCCUGGGCUGCUGGAUUGUCUCGUUUUCCUGCCAAAUAAACAGGAUCAGCGCU
UUACAGAUCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAA (SEQ ID No. 4).
Tales moleculas de ARN artificial, es decir moleculas de acido nucleico artificiales que comprenden una secuencia de acuerdo con la SEQ ID No. 4, tambien pueden obtenerse in vitro por metodos habituales de sfntesis qufmica sin ser transcriptos necesariamente de un progenitor de ADN.
En una realizacion particularmente preferida, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion es una molecula de ARN, de manera preferente una molecula de ARNm que comprende en la direccion 5' a 3' un marco de lectura abierto, un elemento 3'UTR como se describe anteriormente y una secuencia poli(A).
Preferentemente, el marco de lectura abierto no codifica para una protefna ribosomica. En una realizacion preferente, el marco de lectura abierto no codifica para una protefna ribosomica, de donde se deriva el elemento 3'-UTR del acido nucleico artificial de la invencion, particularmente no para una protefna ribosomica de mamffero, siempre que el elemento 3'-UTR sea identico a la 3'-UTR de un gen de protefna ribosomica de mamffero. En algunas realizaciones preferidas adicionales, el marco de lectura abierto no codifica RPS9 o sus variantes, siempre que el elemento 3'-UTR sea una secuencia que sea identica a la SEQ ID No: 1 o la SEQ ID No: 2.
En una realizacion preferida, el ORF no codifica protefnas ribosomicas humana o de plantas, en particular Arabidopsis, en particular no codifica la protefna ribosomica humana S6 (RPS6), la protefna ribosomica humana tipo L36a (RPL36AL) o la protefna ribosomica de Arabidopsis S16 (RPS16). En una realizacion preferida adicional, el marco de lectura abierto (ORF) no codifica la protefna ribosomica S6 (RPS6), la protefna ribosomica tipo L36a (RPL36AL) o la protefna ribosomica S16 (RPS16) de cualquier origen.
En una realizacion, la invencion proporciona una molecula de ADN artificial que comprende un marco de lectura abierto, preferentemente un marco de lectura abierto que codifica un peptido o protefna diferente a una protefna ribosomica, a partir del cual se deriva la 3'UTR; un elemento 3'UTR que comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80%, de manera mas preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aun mas preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aun mas preferente al menos 99%, de manera aun mas preferente un 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID No. 1; y una senal de poliadenilacion y/o una secuencia poli(A). Ademas, la invencion proporciona una molecula de ADN artificial segun las reivindicaciones que comprende un marco de lectura abierto, preferentemente un marco de lectura abierto que codifica cualquier peptido o protefna diferente a una protema ribosomica, a partir del cual se deriva la 3'UTR; un elemento 3'UTR que comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80%, de manera mas preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aun mas preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aun mas preferente al menos 99%, de manera aun mas preferente un 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID No. 3.
Ademas, la invencion proporciona una molecula de ARN artificial, preferentemente una molecula de ARNm artificial o una molecula de ARN viral artificial, que comprende un marco de lectura abierto, preferentemente un marco de lectura abierto que codifica un peptido o protefna diferente a la protema ribosomica, a partir del cual se deriva la 3'UTR; un elemento 3'UTR que comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80%, de manera mas preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aun mas preferente al menos aproximadamente 95%; de manera aun mas preferente al menos 99%; de manera aun mas preferente un 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID No. 2; y una senal de poliadenilacion y/o una secuencia poli(A). Ademas, la invencion proporciona una molecula de ARN artificial, preferentemente una molecula de ARNm artificial o una molecula de ARN viral artificial, que comprende un marco de lectura abierto, preferentemente un marco de lectura abierto que codifica para un peptido o protefna diferente a la protema ribosomica, a partir del cual se deriva la 3'UTR; un elemento 3'UTR que comprende o consiste en una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80%, de manera mas preferente al menos aproximadamente 90%, de manera aun mas preferente al menos aproximadamente 95%, de manera aun mas preferente al menos 99%, de manera aun mas preferente un 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID No. 4. La invencion proporciona una molecula de acido nucleico artificial, preferentemente un ARNm artificial, que se puede caracterizar por una estabilidad mejorada y una expresion prolongada del peptido o protefna codificada. Sin limitarse a ninguna teorfa, la estabilidad mejorada de la expresion de protefnas y asf de la expresion de protefnas prolongada puede ser resultado de la menor degradacion de la molecula de acido nucleico artificial, tal como una molecula de ARNm artificial de acuerdo con la presente invencion. Por consiguiente, el elemento 3'UTR inventivo puede prevenir al acido nucleico artificial de la degradacion y el deterioro.
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico artificial puede comprender un tallo-bucle de histona ademas de la secuencia de acido nucleico derivada de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica. Tal molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo, puede comprender en la direccion 5' a 3' un ORF, un elemento 3'UTR, un tallo-bucle de histona opcional, una secuencia poli(A) opcional o una senal de poliadenilacion y una secuencia poli(C) opcional. Tambien puede comprender en la direccion 5' a 3' un ORF, un elemento 3'UTR, una secuencia opcional poli(A), una secuencia opcional poli(C) y una secuencia opcional de tallo-bucle de histona.
En una realizacion preferida, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion comprende al menos una secuencia de tallo-bucle de histona.
Dichas secuencias de tallo- bucle de histona se seleccionan preferiblemente de las secuencias tallo-bucle de histona que se describen en la WO 2012/019780, cuya descripcion se incorpora aquf como referencia.
Una secuencia tallo-bucle de histona adecuada para ser utilizada en la presente invencion, se selecciona preferiblemente de al menos una de las siguientes formulas (I) o (II):
formula (I) (secuencia tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):
Figure imgf000063_0002
formula (II) (secuencia tallo-bucle con elementos frontera de tallo):
Figure imgf000063_0001
donde:
el elemento frontera de tallo 1 o tallo 2 N1-6 es una secuencia consecutiva de 1 a 6, preferentemente de 2 a 6, de manera mas preferente de 2 a 5, aun de manera mas preferente de 3 a 5, de manera mucho mas preferente de 4 a 5 o 5 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C o un analogo de nucleotido del mismo;
tallo 1 [N0-2GN3-5] es una complementariedad inversa o parcialmente inversa al elemento tallo 2 y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleotidos; siendo N0-2 una secuencia consecutiva de 0 a 2, de manera preferente de 0 a 1, de manera mas preferente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C o un analogo de nucleotido del mismo; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, de manera preferente de 4 a 5, de manera mas preferente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C o un analogo de nucleotido del mismo y donde G es guanosina o un analogo de la misma, y se puede reemplazar opcionalmente por una citidina o un analogo de la misma, con la condicion de que su citidina de nucleotido complementaria en el tallo 2 se reemplace por guanosina;
la secuencia bucle [N0-4(U/T)N0-4] se situa entre los elementos tallo 1 y tallo 2 y es una secuencia consecutiva de 3 a 5 nucleotidos, de manera mas preferente de 4 nucleotidos; donde cada N0-4 es independientemente una secuencia consecutiva de 0 a 4, de manera preferente de 1 a 3, de manera mas preferente de 1 a 2 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C o un analogo de nucleotido del mismo; y donde U/T representa uridina u opcionalmente timidina;
tallo 2 [N3-5CN0-2] es complementariedad inversa o parcialmente inversa con el elemento tallo 1 y es una secuencia consecutiva entre 5 a 7 nucleotidos; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, de manera preferente de 4 a 5, de manera mas preferente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C o un analogo de nucleotido del mismo; donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 a 2, de manera preferente de 0 a 1, de manera mas preferente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C o un analogo de nucleotido del mismo; y donde C es citidina o un analogo de la misma, y se puede reemplazar opcionalmente por una guanosina o un analogo de la misma con la condicion de que su guanosina de nucleotido complementaria en el tallo 1 se reemplace por citidina;
donde
el tallo 1 y tallo 2 son capaces de realizar un apareamiento de bases entre si formando una secuencia complementaria inversa, donde el apareamiento de bases se puede presentar entre el tallo 1 y el tallo 2, por ejemplo un apareamiento de bases Watson-Crick de nucleotidos A y U/T o G y C o un apareamiento de bases no Watson-Crick, por ejemplo un apareamiento de bases por balanceo, un apareamiento de bases Watrson-Crick reverso, un apareamiento de bases Hoogsteen, un apareamiento de bases Hoogsteen reverso o son capaces de un apareamiento de bases uno con otro formando una secuencia parcialmente inversa, donde puede suceder un apareamiento de bases incompleto entre el tallo 1 y el tallo 2, en base a que una o mas bases en un tallo no tienen una base complementaria en la secuencia inversa complementaria del otro tallo.
De acuerdo con una realizacion preferida adicional, la secuencia tallo-bucle de histona puede seleccionarse de acuerdo con al menos una de las siguientes formulas especfficas (la) o (Ila):
formula (la) (secuencia tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):
Figure imgf000064_0001
formula (Ila) (secuencia tallo-bucle con elementos frontera de tallo):
Figure imgf000064_0002
donde:
N, C, G, T y U son como se definio anteriormente.
De acuerdo con otra realizacion particularmente preferente del primer aspecto, la secuencia de acido nucleico artificial puede comprender al menos una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes formulas especfficas (lb) o (I lb):
formula (lb) (secuencia de tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):
Figure imgf000064_0003
formula (Ilb) (secuencia de tallo-bucle con elementos frontera de tallo):
N4_5 [N,GN4] [N2(U/T)N1] [N4CNJ n 4.5
' - n V— ' '-----------v------------- - v-------------- v -------------- }
Elemento tallo 1 bucle tallo 2 Elemento
frontera tallo 1 frontera tallo 2 donde: N, C, G, T y U son como se definio anteriormente
Una secuencia de tallo-bucle de histona preferida particular es la secuencia de acuerdo con la SEQ ID No 5: CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA o, mas preferiblemente, la secuencia de ARN correspondiente de la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No: 5.
Como ejemplo, los elementos individuales pueden estar presentes en la molecula de acido nucleico artificial en el siguiente orden:
cap 5' - 5'UTR - ORF - elemento 3'UTR- tallo-bucle de histona - secuencia poli(A)
cap 5' - 5'UTR - ORF - elemento 3'UTR- secuencia poli(A) - tallo-bucle de histona
cap 5' - 5'UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'-uTr - tallo-bucle de histona - secuencia poli(A)
cap 5' - 5'UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'-UTR - tallo-bucle de histona - secuencia poli(A) - secuencia poli(C) cap 5' - 5'UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'UTR- secuencia poli(A) - tallo-bucle de histona
cap 5' - 5'UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'UTR- secuencia poli(A) - secuencia poli(C)- tallo-bucle de histona cap 5' - 5'UTR - ORF - elemento 3'UTR- secuencia poli(A) - secuencia poli(C) (no reivindicada)
cap 5' - 5'UTR - ORF - elemento 3'UTR - secuencia poli(A) - secuencia poli(C)- tallo-bucle de histona
En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico artificial comprende elementos adicionales, tales como una cap 5', una secuencia poli(C) y/o un motivo IRES. Una cap 5' se puede agregar post-transcripcionalmente al extremo 5' de un ARN. Ademas, la molecula de acido nucleico artificial inventiva, particularmente si el acido nucleico esta en forma de un ARNm o codifica un ARNm, puede modificarse con una secuencia de al menos 10 citidinas, de manera preferente al menos 20 citidinas, de manera mas preferente al menos 30 citidinas (la llamada “secuencia poli(C)”). Particularmente, la molecula de acido nucleico artificial inventiva puede contener, especialmente si el acido nucleico esta en forma de un ARN(m) o codifica un ARNm, una secuencia poli(C) de tfpicamente aproximadamente 10 a 200 nucleotidos de citidina, de manera preferente aproximadamente 10 a 100 nucleotidos de citidina, de manera mas preferente aproximadamente 10 a 70 nucleotidos de citidina o de manera aun mas preferente aproximadamente 20 a 50 o aun de 20 a 30 nucleotidos de citidina. Asf, preferentemente la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion comprende, en especial en la direccion 5' a 3', un ORF, al menos un elemento 3'UTR como se describe anteriormente, una secuencia poli(A) o una senal de poliadenilacion y una secuencia poli(C).
Una secuencia de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) o motivo IRES puede separar varios marcos de lectura abiertos, por ejemplo si la molecula de acido nucleico artificial codifica dos o mas peptidos o protefnas. Una secuencia IRES puede ser particularmente util si el ARNm es un ARN a bi- o multi-cistronico.
La molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion comprende ademas una 5'UTR como un elemento terminal 5' adicional, donde la 5'UTR es una 5' TOP-UTR, que no comprende un motivo 5'-TOP. Ademas, la molecula de acido nucleico artificial puede comprender elementos 5' adicionales, tales como un promotor o un promotor que contiene la secuencia. El promotor puede conducir y/o regular la transcripcion de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo una molecula de ADN artificial de acuerdo con la presente invencion. Ademas, la 5'uTr puede interactuar con el elemento inventivo 3'UTR y, por tanto, puede apoyar el efecto estabilizador del elemento inventivo 3'UTR. Tales elementos pueden apoyar la estabilidad y la eficiencia de traduccion. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la invencion proporciona moleculas de acido nucleico artificiales, preferiblemente moleculas de ARNm, que comprenden en la direccion 5' a 3' al menos una de las siguientes estructuras 5'-cap - 5'-UTR - ORF - elemento 3'UTR - tallo-bucle de histona - secuencia poli(A)/(C);
5'-cap - 5'-UTR - ORF - elemento 3'UTR - secuencia poli(A)/(C)- tallo-bucle de histona;
5'-cap - 5'-UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'Ut R - tallo-bucle de histona - secuencia poli(A)/(C);
5'-cap - 5'-UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'UTR - tallo-bucle de histona - secuencia poli(A)/(C) - secuencia poli(A)/(C);
5'-cap - 5'-UTR - ORF - IRES - ORF - elemento 3'UTR - secuencia poli(A)/(C) - tallo-bucle de histona;
5'-cap - 5'-UTR - ORF -IRES - ORF - elemento 3'UTR - secuencia poli(A)/(C) - secuencia poli(A)/(C) - tallo-bucle de histona;
5'-cap - 5'-UTR - ORF - elemento 3'UTR - secuencia poli(A)/(C) - secuencia poli(A)/(C);
5'-cap - 5'-UTR - ORF - elemento 3'UTR - secuencia poli(A)/(C) - secuencia poli(A)/(C) - tallo-bucle de histona.
En una realizacion particularmente preferida de la presente invencion, el al menos un elemento de la region 5' no traducida (elemento 5'UTR) tiene una longitud inferior a 500, 400, 300, 250, 200, 150 o 100 nucleotidos y/o mas de 20, 30, 40, 50 o 60 nucleotidos.
El elemento 5'UTR no comprende un motivo TOP o 5'TOP, como se definio anteriormente.
La secuencia de acido nucleico, que se deriva de la 5'UTR de un gen TOP, se deriva de un gen TOP eucariotico, preferiblemente un gen TOP animal o vegetal, mas preferiblemente un gen TOP de cordado, incluso mas preferiblemente un gen TOP vertebrado, con total preferencia de un gen TOP de mamffero, tal como un gen TOP humano.
Por ejemplo, el elemento 5'UTR se selecciona preferentemente de elementos 5'UTR que comprenden o consisten en una secuencia de acido nucleico derivada de una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID No. 1-1363, SEQ ID No. 1395, SEQ ID No. 1421 y SEQ ID No. 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, a partir de los homologos de SEQ ID No. 1-1363, SEQ ID No. 1395, SEQ ID No. 1421 y SEQ ID No. 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, de una variante de la misma, o preferiblemente de una secuencia de ARN correspondiente. El termino "homologos de las SEQ ID No. 1-1363, SEQ ID No. 1395, SEQ ID No. 1421 y SEQ ID No.
1422 de la solicitud de patente WO2013/143700” se refiere a secuencias de otras especies que no son homo sapiens que son homologas a las secuencias de acuerdo con las SEQ ID No. 1 -1363, SEQ ID No. 1395, SEQ ID NO. 1421 y SEQ ID No. 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700.
En una realizacion preferente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de una secuencia de acido nucleico que se extiende desde la posicion de nucleotido 5 (es decir, el nucleotido que se encuentra en la posicion 5 en la secuencia) hasta la posicion de nucleotido inmediatamente 5' al codon de inicio (ubicado en el extremo 3' de las secuencias), por ejemplo la posicion del nucleotido inmediatamente 5' respecto a la secuencia ATG, de una secuencia de acido nucleico seleccionada de las SEQ ID No. 1-1363, SEQ ID NO. 1395, SEQ ID NO. 1421 y SEQ ID NO. 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, de homologos de las SEQ ID No. 1-1363, SEQ ID No. 1395, SEQ ID No. 1421 y SEQ ID No. 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, de una variante de la misma, o una secuencia de ARN correspondiente. Es particularmente preferente que el elemento 5'UTR se derive de una secuencia de acido nucleico que se extiende desde la posicion del nucleotido inmediatamente 3' al 5'TOP hasta la posicion del nucleotido inmediatamente 5' al codon de inicio (ubicado en el extremo 3' de las secuencias), por ejemplo la posicion del nucleotido inmediatamente 5' respecto a la secuencia ATG de una secuencia de acido nucleico seleccionada de las SEQ ID No. 1-1363, SEQ ID No. 1395, SEQ ID No. 1421 y SEQ ID No. 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, de los homologos de las SEQ ID No. 1 - 1363, SEQ ID No. 1395, SEQ ID No. 1421 y SEQ ID No. 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, de una variante de la misma, o una secuencia de ARN correspondiente.
En una realizacion particularmente preferida, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de una 5'UTR de un gen TOP que codifica una protefna ribosomica o de una variante de una 5'UTR de un gen TOP que codifica una protefna ribosomica. Por ejemplo, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de una 5'UTR de una secuencia de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID No: 170, 232, 244, 259, 1284, 1285, 1286 , 1287, 1288, 1289, 1290, 1291, 1292, 1293, 1294, 1295, 1296, 1297, 1298, 1299, 1300, 1301, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307, 1308, 1309, 1310, 1311 , 1312, 1313, 1314, 1315, 1316, 1317, 1318, 1319, 1320, 1321, 1322, 1323, 1324, 1325, 1326, 1328, 1329, 1330, 1331, 1332, 1333, 1334, 1335, 1336 , 1337, 1338, 1339, 1340, 1341, 1342, 1343, 1344, 1346, 1347, 1348, 1349, 1350, 1351, 1352, 1354, 1355, 1356, 1357, 1358, 1359, o 1360 de la solicitud de patente WO2013/143700, una secuencia de ARN correspondiente, un homologo de la misma, o una variante de la misma como se describe aquf, preferiblemente que carece del motivo 5'TOP. Como se describio anteriormente, la secuencia que se extiende desde la posicion 5 al nucleotido inmediatamente 5' al ATG (que se encuentra en el extremo 3' de las secuencias) corresponde a la 5'UTR de dichas secuencias.
Preferentemente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de una 5'UTR de un gen TOP que codifica para una protefna ribosomica grande (RPL) o de un homologo o variante de una 5'UTR de un gen TOP que codifica para una protefna ribosomica grande (RPL). Por ejemplo, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de una 5'UTR de una secuencia de acido nucleico segun cualquiera de las SEQ ID No: 67, 259, 1284-1318, 1344, 1346, 1348-1354, 1357, 1358, 1421 y 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, una secuencia de ARN correspondiente, un homologo de la misma o una variante de la misma como se describe aquf, preferiblemente sin el motivo 5'TOP.
En una realizacion particularmente preferente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 5'UTR de un gen de la protema ribosomica grande 32, preferiblemente de un gen Large 32 (L32) de protema ribosomica de vertebrado, mas preferiblemente de un gen Large 32 (L32) de protema ribosomica de mairnfero, con mayor preferencia de un gen Large 32 (L32) de protema ribosomica humana, o de una variante de la 5'UTR de un gen Large 32 de protema ribosomica, preferiblemente de una protema ribosomica de vertebrado gen Large32 (L32), mas preferiblemente de un gen Large32 (L32) de protema ribosomica de mamffero, mas preferiblemente de un gen Large32 (L32) de protema ribosomica humana, donde preferiblemente el elemento 5'UTR no comprende el 5'TOP de dicho gen.
Por consiguiente, en una realizacion particularmente preferente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 40%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 60%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 70%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 80%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 90%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 95%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 99% con la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 6 (5'-UTR de la protema ribosomica humana Large 32 que carece del tracto oligopirimidina terminal 5': GGCGCTCCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC; correspondiente a la SEQ ID No. 1368 de la solicitud de patente W02013/143700) o preferiblemente a una secuencia de ARN correspondiente, o en la que al menos un elemento 5'UTR comprende o consiste en un fragmento de una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 40%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 60%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 70%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 80%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 90%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 95%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 99% con la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 6 o mas preferiblemente de una secuencia de ARN correspondiente, donde, preferiblemente, el fragmento es como se describe anteriormente, es decir un tramo continuo de nucleotidos que representan al menos el 20%, etc., de la 5'UTR de longitud completa. Preferiblemente, el fragmento tiene una longitud de al menos aproximadamente 20 nucleotidos o mas, preferiblemente de al menos aproximadamente 30 nucleotidos o mas, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 40 nucleotidos o mas. Preferentemente el fragmento es un fragmento funcional tal como se describe aqrn.
En algunas realizaciones, el ARN modificado de acuerdo con la invencion comprende un elemento 5'UTR que comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 5'UTR de un gen TOP de vertebrado, tal como un mamffero, por ejemplo un gen TOP humano, seleccionado de RPSA, RPS2, RPS3, RPS3A, RPS4, RPS5, RPS6, RPS7, RPS8, RPS9, RPS10, RPS11, RPS12, RPS13, RPS14, RPS15, RPS15A, RPS16, RPS17, RPS18, RPS19, RPS20, RPS21, RPS23, RPS24, RPS25, RPS26, RPS27, RPS27A, RPS28, RPS29, RPS30, RPL3, RPL4, RPL5, RPL6, RPL7, RPL7A, RPL8, RPL9, RPL10, RPL10A, RPL11, RPL12, RPL13, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL17, RPL18, RPL18A, RPL19, RPL21, RPL22, RPL23A, RPL24, RPL26, RPL27, RPL27A, RPL28, RPL29, RPL30, RPL31, RPL32, RPL34, RPL35, RPL35A, RPL36, RPL36A, RPL37, RPL37A, RPL38, RPL39, RPL40, RPL41, RPLP0, RPLP1, RPLP2, EEF1A1, EEF1B2, EEF1D, EEF1G, EEF2, EIF3E, EIF3F, EIF3H, EIF2S3, EIF3C, EIF3K, EIF3EIP, EIF4A2, PABPC1, HNRNPA1, TPT1, TUBB1, UBA52, NPM1, ATP5G2, GNB2L1, NME2, UQCRB, o de un homologo o variante de los mismos, donde preferentemente el elemento 5'UTR no comprende un motivo TOP o el 5'TOP de dichos ge nes, y donde opcionalmente el elemento 5'UTR comienza en su extremo 5' con un nucleotido ubicado en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aguas abajo del tracto de oligopirimidina 5' terminal (TOP), y donde, ademas, opcionalmente, el elemento 5'UTR, que se deriva de una 5'UTR de un gen TOP termina en su extremo 3' con un nucleotido ubicado en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aguas arriba del codon de inicio (A(U/T)G del gen del que se deriva.
Preferentemente, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, en especial el marco de lectura abierto, esta al menos parcialmente modificado con G/C. Asf, la molecula de acido nucleico artificial inventiva se puede estabilizar termodinamicamente modificando el contenido de G (guanosina)/C (citidina) de la molecula. El contenido G/C del marco de lectura abierto de una molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion se puede incrementar comparado con el contenido G/C del marco de lectura abierto de una secuencia de tipo natural correspondiente, preferentemente empleando la degeneracion del codigo genetico. Asf, la secuencia de aminoacidos codificada de la molecula de acido nucleico preferentemente no esta modificada por la modificacion G/C en comparacion con la secuencia de aminoacidos codificada de la secuencia de tipo natural particular. Los codones de una secuencia de codificacion o una molecula de acido nucleico entera, por ejemplo un ARNm, por tanto, pueden variar en comparacion con la secuencia de codificacion de tipo natural de forma que incluyan una mayor cantidad de nucleotidos G/C mientras la secuencia de aminoacidos traducidas se mantenga. Con respecto al hecho de que varios codones codifican uno y el mismo aminoacido (la llamada degeneracion del codigo genetico), se pueden determinar los codones mas favorables para la estabilidad (el llamado uso de codon alternativo). Por tanto, es posible introducir espedficamente ciertos codones (a cambio de los codones de tipo salvaje respectivos que codifican el mismo aminoacido), que son mas favorables con respecto a la estabilidad del ARN y/o con respecto al uso de codones en un sujeto (la tambien denominada optimizacion de codones).
Dependiendo del aminoacido que es codificado por la region de codificacion de la molecula de acido nucleico inventiva como se define aqrn, existen varias posibilidades de modificacion de la secuencia de acido nucleico, por ejemplo del marco de lectura abierto, comparado con su region de codificacion de tipo natural. En el caso de los aminoacidos que son codificados por codones que contienen exclusivamente nucleotidos G o C, no es necesaria modificacion del codon. Asf, los codones para Pro (CCC o CCG), Arg (CGC o CGG), Ala (GCC o GCG) y Gly (GGC o GGG) no requieren modificacion, puesto que no hay A o U/T.
Por el contrario, los codones que contienen nucleotidos A y/o U/T se pueden modificar sustituyendolos por otros codones que codifican los mismos aminoacidos pero no contienen A y/o U/T. Por ejemplo:
los codones para Pro se pueden modificar de c C(U/T) o CCA a CCC o CCG;
los codones para Arg se pueden modificar de Cg (u/T) o CGA o AGA o AGG a CGC o CGG;
los codones para Ala se pueden modificar de GC(U/T) o GCA a GCC o GCG;
los codones para Gly se pueden modificar de GG(U/T) o GGA a GGC o GGG.
En otros casos, aunque los nucleotidos A o (U/T) no se pueden eliminar de los codones, es posible, sin embargo, disminuir el contenido de A y (U/T) utilizando codones con un contenido mas bajo de nucleotidos A y/o (U/T). Ejemplos de estos son:
los codones para Phe se pueden modificar de (U/T)(U/T)(U/T) a (U/T) (U/T)C;
los codones para Leu se pueden modificar de (U/T) (U/T)A, (U/T) (U/T)G, C(U/T) (U/T) o C(U/T)A a C(U/T)C o C(U/T)G; los codones para Ser se pueden modificar de (U/T)C(U/T) o (U/T)Ca o AG(U/T) a (U/T)CC, (U/T)CG o AGC;
el codon para Tyr se puede modificar de (U/T)A(U/T) a (U/T)AC;
el codon para Cys se puede modificar de (U/T)G(U/T) a (U/T)GC;
el codon para His se puede modificar de CA(U/T) a CAC;
el codon para Gln se puede modificar de CAA a CAG;
los codones para Ile se pueden modificar de A(U/T)(U/T) o A(U/T)A a A(U/T)C;
los codones para Thr se pueden modificar de AC(U/T) o ACA a ACC o ACG;
el codon para Asn se puede modificar de AA(U/T) a AAC;
el codon para Lys se puede modificar de AAA a AAG;
los codones para Val se pueden modificar de G(U/T)(U/T) o G(U/T)A a G(U/T)C o G(U/T)G;
el codon Asp se puede modificar de GA(U/T) a GAC;
el codon para Glu se puede modificar de GAA a GAG;
el codon de parada (U/T)AA se puede modificar a (U/T)AG o (U/T)GA.
En el caso de los codones para Met (A(U/T)G) y Trp ((U/T)GG), por otra parte, no existe posibilidad de modificacion de secuencia sin alterar la secuencia de aminoacidos codificada.
Las sustituciones enumeradas anteriormente se pueden utilizar ya sea individualmente o en todas las combinaciones posibles para incrementar el contenido G/C del marco de lectura abierto de la secuencia de acido nucleico inventiva como se define aqrn, comparada con su marco de lectura abierto de tipo natural particular (es decir la secuencia original). Asf, por ejemplo, todos los codones para Thr que aparecen en la secuencia de tipo natural se pueden modificar a ACC (o ACG).
Preferentemente, el contenido de G/C del marco de lectura abierto de la molecula de acido nucleico artificial inventiva como se define aqrn esta incrementado en al menos un 7%, de manera mas preferente al menos 15%, particularmente de manera preferente al menos 20%, comparado con el contenido G/C de la region de codificacion de tipo natural. De acuerdo con una realizacion espedfica, al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, de manera mas preferente al menos 70%, de manera aun mas preferente al menos 80% y de manera mucho mas preferente al menos 90%, 95% o aun 100% de los codones sustituibles en el marco de lectura abierto de la molecula de acido nucleico artificial inventiva o fragmento, variante o derivado del mismo se sustituyen, incrementado asf el contenido de G/C del marco de lectura abierto.
En este contexto, es particularmente preferible incrementar el contenido de G/C del marco de lectura abierto de la secuencia de acido nucleico inventiva como se define aqrn al maximo (es decir 100% de los codones sustituibles), comparado con el marco de lectura abierto de tipo natural, sin alterar la secuencia de aminoacidos codificados.
Ademas, el marco de lectura abierto preferentemente esta al menos parcialmente optimizado por codon. La optimizacion por codon se basa en el descubrimiento de que la eficiencia de traduccion puede determinarse por una frecuencia diferente en la ocurrencia de ARN de transferencia (ARNt) en las celulas. Asf, si los llamados “codones raros” estan presentes en la region de codificacion de la molecula de acido nucleico artificial inventiva como se define aqrn en un grado incrementado, la traduccion a la secuencia de acido nucleico modificada correspondiente es menos eficiente que en el caso donde los codones que codifican los ARNt relativamente “frecuentes” estan presentes.
Asf, el marco de lectura abierto de la secuencia de acido nucleico inventiva preferentemente esta modificado en comparacion con la region de codificacion de tipo natural correspondiente de forma que al menos un codon de la secuencia de tipo natural que codifica un ARNt que es relativamente raro en la celula se intercambia por un codon que codifica un ARNt que es comparablemente frecuente en la celula y lleva el mismo aminoacido que el ARNt relativamente raro. Con esta modificacion, el marco de lectura abierto de la molecula de acido nucleico artificial inventivo como se define aquf se modifica de forma que los codones por los cuales los ARNt que aparecen frecuentemente estan disponibles pueden reemplazar los codones que corresponden a los ARNt raros. En otras palabras, de acuerdo con la invencion, con tal modificacion todos los codones del marco de lectura abierto de tipo natural que codifica un ARNt se puede intercambiar por un codon que codifica un ARNt que es mas frecuente en la celula y que lleva el mismo aminoacido que el ARNt raro. Los ARNt que aparecen relativamente de manera frecuente en la celula y aquellos que, por el contrario, aparecen de forma relativamente rara son conocidos por el experto en la materia; vease, por ejemplo, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666. Por consiguiente, preferentemente el marco de lectura abierto se optimiza por codon, de manera preferente con respecto al sistema done se va a expresar la molecula de acido nucleico de acuerdo con la presente invencion, de manera preferente con respecto al sistema en el cual la molecula de acido nucleico de acuerdo con la presente invencion se va a traducir. Preferentemente, el uso de codon del marco de lectura abierto se optimiza por codon de acuerdo con el uso de codon de mamffero, de manera mas preferente de acuerdo con el uso de codon humano. De manera preferente, el marco de lectura abierto se optimiza con codon y se modifica el contenido de G/C.
Para mejorar adicionalmente la resistencia a la degradacion, por ejemplo la resistencia a una degradacion in vivo por una exo- o endonucleasa, y/o para mejorar adicionalmente la produccion de protefnas de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, la molecula de acido nucleico artificial puede comprender ademas modificaciones, tales como modificaciones de cadena principal, modificaciones de azucar y/o modificaciones base, por ejemplo modificaciones de lfpidos o similares. Preferentemente, la transcripcion y/o la traduccion de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion no se deteriora significativamente por dichas modificaciones.
En general, la molecula de acido nucleico artificial de la presente invencion puede comprender cualquier nucleotido nativo (natural), por ejemplo guanosina, uracilo, adenosina y/o citosina o un analogo de los mismos. A este respecto, los analogos de nucleotidos se definen como variantes que se producen de forma nativa y no nativa de los nucleotidos de origen natural adenosina, citosina, timidina, guanosina y uridina. Por consiguiente, analogos son, por ejemplo, nucleotidos derivados qufmicamente con grupos funcionales que no se producen de forma nativa, que se agregan o eliminan preferiblemente del nucleotido natural o que sustituyen a los grupos funcionales naturales de un nucleotido. Asf, cada componente del nucleotido natural puede modificarse, a saber, el componente base, el componente de azucar (ribosa) y/o el componente fosfato que forma el esqueleto (ver mas arriba) de la secuencia de ARN. Los analogos de guanosina, uridina, adenosina, timidina y citosina incluyen, sin que ello implique limitacion alguna, cualquier guanosina, uridina, adenosina, timidina o citosina de origen nativo o no nativo que se haya alterado, por ejemplo qufmicamente, por ejemplo por acetilacion, metilacion, hidroxilacion, etc., incluyendo 1-metiladenosina, 1-metilguanosina, 1 -metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 2,6-diaminopurina, 2'-amino-2'-desoxiadenosina, 2'-amino-2'-desoxicitidina, 2'-amino-2'-desoxiguanosina, 2'-amino-2'-desoxiuridina, 2-amino-6-cloropurinribosido, 2-aminopurinaribosido, 2'-araadenosina, 2'-aracitidina, 2'-arauridina, 2'-azido-2'-desoxiadenosina, 2'-azido-2'-desoxicitidina, 2'-azido-2'-desoxiguanosina, 2'-azido-2'-desoxiuridina, 2-cloroadenosina, 2'-fluor-2'-desoxiadenosina, 2'-fluor-2'-desoxicitidina, 2'-fluor-2'- desoxiguanosina, 2'-fluor-2'-desoxiuridina, 2'-fluorotimidina, 2-metiladenosina, 2- metilguanosina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, 2'-O-Metil-2-aminoadenosina, 2'-O-metil-2'-desoxiadenosina, 2'-O-metil-2'-desoxicitidina, 2'-O-metil-2'- desoxiguanosina, 2'-O-metil-2'-desoxiuridina, 2'-O-metil-5-metiluridina, 2'-O-metilinosina, 2'-O-metilpseudouridina, 2-tiocitidina, 2-tiocitosina, 3-metilcitosina, 4-acetilcitosina, 4-tiouridina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5,6-dihidrouridina, 5- aminoalilcitidina, 5-aminoalildesoxiuridina, 5-bromouridina, 5- carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, 5-cloroaracitosina, 5-fluorouridina, 5-yodouridina, 5-metoxicarbonilmetil-uridina, 5-metoxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 6-azacitidina, 6-azauridina, 6-cloro-7-deaza-guanosina, 6-cloropurinribosido, 6-mercaptoguanosina, 6-metil-mercaptopurinribosido, 7-deaza-2'-desoxiguanosina, 7-deazaadenosina, 7-metilguanosina, 8-azaadenosina, 8-bromo-adenosina, 8-bromoguanosina, 8-mercaptoguanosina, 8-oxoguanosina, benzimidazol-ribosido, beta-D-manosilqueosina, dihidrouridina, inosina, N1-metiladenosina, N6-([6-aminohexil]carbamoilmetil)adenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-metiladenosina, N7-metilxantosina, metil ester de acido N-uracil-5-oxiacetico, puromicina, queosina, acido uracil-5-oxiacetico, metil ester de acido uracil-5-oxiacetico, wibutoxosina, xantosina y xiloadenosina. La preparacion de dichos analogos es conocida por los expertos en la tecnica, por ejemplo de las Patentes US 4,373,071, US 4,401,796, US 4,415,732, US 4,458,066, US 4,500,707, US 4,668,777, US 4,973,679, US 5,047,524, US 5,132,418, US 5,153,319, US 5,262,530 y 5,700,642. En el caso de un analogo como se describe anteriormente, se puede dar particular preferencia en ciertas realizaciones de la invencion a aquellos analogos que aumentan la expresion de la protefna o del peptido o protefna codificados o que aumentan la inmunogenicidad de la molecula de acido nucleico artificial de la invencion y/o no interfieren con otra modificacion de la molecula de acido nucleico artificial que se ha introducido.
Segun una realizacion particular, la molecula de acido nucleico artificial de la presente invencion puede contener una modificacion de lfpidos.
En una realizacion preferente, la molecula de acido nucleico artificial comprende, preferiblemente de 5' a 3', los siguientes elementos:
una 5'-UTR;
al menos un marco de lectura abierto (ORF), en el que el ORF comprende preferiblemente al menos una modificacion con respecto a la secuencia de tipo salvaje;
una 3'-UTR derivada de la 3'-UTR de una protefna ribosomica, preferiblemente de una secuencia de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID No: 10 a 115, mas preferiblemente de la 3'-UTR de RPS9, mas preferiblemente de la 3'-UTR de RPS9 humano;
una secuencia poli(A), que comprende preferiblemente 64 adenilatos;
una secuencia poli(C), que comprende preferiblemente 30 citidilatos;
una secuencia tallo-bucle de histona.
En otra realizacion preferida, la molecula de acido nucleico artificial comprende o consiste en una secuencia de nucleotidos como se muestra de acuerdo con la SEQ ID No: 7 (vease la Fig. 3) o la secuencia de ADN complementaria. En una realizacion particularmente preferente, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion puede comprender ademas una o mas de las modificaciones descritas a continuacion:
Modificaciones quimicas:
El termino "modificacion" tal como se usa aquf con respecto a la molecula de acido nucleico artificial puede referirse a modificaciones quimicas que comprenden modificaciones de esqueleto, asi como modificaciones de azucar o modificaciones de bases.
En este contexto, la molecula de acido nucleico artificial, preferentemente una molecula de ARN, como se define aquf puede contener analogos/modificaciones de nucleotidos, por ejemplo modificaciones de esqueleto, modificaciones de azucar o modificaciones de bases. Una modificacion de esqueleto en relacion con la presente invencion es una modificacion donde los fosfatos del esqueleto de los nucleotidos contenidos en una molecula de acido nucleico como se define aquf se modifican quimicamente. Una modificacion de azucar en relacion con la presente invencion es una modificacion quimica del azucar de los nucleotidos de la molecula de acido nucleico como se define aquf. Ademas, una modificacion de bases en relacion con la presente invencion es una modificacion quimica de los residuos bases de los nucleotidos de la molecula de acido nucleico de la molecula de acido nucleico. En este contexto, los analogos o modificaciones de nucleotidos se seleccionan preferiblemente de analogos de nucleotidos que son aplicables para la transcripcion y/o la traduccion.
Modificaciones de azucar:
Los nucleosidos y nucleotidos modificados, que pueden incorporarse en la molecula de acido nucleico artificial, preferentemente un ARN, tal como se describe aquf, pueden modificarse en el resto azucar. Por ejemplo, el grupo 2'-hidroxilo (OH) de una molecula de ARN puede modificarse o reemplazarse con varios sustituyentes "oxi" o "desoxi" diferentes. Ejemplos de modificaciones del grupo 2'-hidroxilo "oxi" incluyen, pero no se limitan a, alcoxi o ariloxi (-OR, por ejemplo R = H, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azucar); polietilenglicoles (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; acidos nucleicos "bloqueados" (LNA) donde el 2'-hidroxilo esta unido por ejemplo por un puente metileno al carbono 4' del mismo azucar ribosa; y grupos amino (-O-amino, donde el grupo amino, por ejemplo NRR, puede ser alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino) o aminoalcoxi.
Las modificaciones "desoxi" incluyen hidrogeno, amino (por ejemplo NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroarilamino o aminoacido); o el grupo amino se puede unir al azucar a traves de un enlazador, comprendiendo el enlazador uno o mas de los atomos C, N y O.
El grupo azucar tambien puede contener uno o mas carbonos con la configuracion estereoqufmica opuesta a la del correspondiente carbono de la ribosa. Por tanto, un ARN modificado puede incluir nucleotidos que contienen, por ejemplo, arabinosa como el azucar.
Modificaciones de esqueleto:
El esqueleto fosfato puede modificarse adicionalmente en los nucleosidos y nucleotidos modificados que pueden incorporarse en la molecula de acido nucleico artificial, preferentemente un ARN, como se describe aquf. Los grupos fosfato del esqueleto pueden modificarse reemplazando uno o mas de los atomos de oxfgeno con un sustituyente diferente. Ademas, los nucleosidos y nucleotidos modificados pueden incluir la sustitucion completa de un grupo fosfato no modificado con un fosfato modificado como se describe aqrn. Ejemplos de grupos fosfato modificados incluyen, pero no se limitan a, fosforotioato, fosforoselenatos, boranofosfatos, esteres de boranofosfato, hidrogenofosfonatos, fosforamidatos, alquil o aril fosfonatos y fosfotriesteres. En los fosforoditioatos ambos oxfgenos no enlazados se han reemplazado por azufre. El enlazador de fosfato tambien puede modificarse sustituyendo un enlace de oxfgeno con nitrogeno (fosforoamidatos puenteados), azufre (fosforotioatos puenteados) y carbono (fosfonatos enlazados con metileno).
Modificaciones de bases:
Los nucleosidos y nucleotidos modificados que pueden incorporarse en la molecula de acido nucleico artificial, preferentemente un ARN, como se describe aqrn pueden modificarse adicionalmente en los residuos nucleobase. Ejemplos de nucleobases encontrados en el ARN incluyen, entre otros, adenina, guanina, citosina y uracilo. Por ejemplo, los nucleosidos y nucleotidos aqrn descritos pueden estar qmmicamente modificados en la cara de la ranura principal. En algunas realizaciones, las principales modificaciones qmmicas de la ranura pueden incluir un grupo amino, un grupo tiol, un grupo alquilo o un grupo halo.
En realizaciones particularmente preferentes de la presente invencion, los analogos/modificaciones de nucleotidos se seleccionan de modificaciones de bases, que se seleccionan preferentemente de 2-amino-6-cloropurinribosido-5'-trifosfato, 2-aminopurinribosido-5'-trifosfato; 2-aminoadenosin-5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxicitidintrifosfato, 2-tiocitidin-5'-trifosfato, 2-tiouridin-5'-trifosfato, 2'-fluorotimidin-5'-trifosfato, 2'-O-metilinosin-5'-trifosfato, 4-tiouridin-5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina-5'-trifosfato, 5-aminoaliluridin-5'-trifosfato, 5-bromocitidin-5'-trifosfato, 5-bromouridin-5'-trifosfato, 5-bromo-2'-desoxicitidin-5'-trifosfato, 5-bromo-2'-desoxiuridin-5'-trifosfato, 5-yodocitidin-5'-trifosfato, 5-yodo-2'-desoxicitidin-5'- trifosfato, 5-yodouridin-5'-trifosfato, 5-yodo-2'-desoxiuridin-5'-trifosfato, 5-metilcitidin-5'-trifosfato, 5-metiluridin-5'-trifosfato, 5-metil-2'-desoxicitidin-5'-trifosfato, 5-propinil-2'-desoxiuridin-5'-trifosfato, 6-azacitidin-5'-trifosfato, 6-azauridin-5'-trifosfato, 6-cloropurinribosido-5'-trifosfato, 7-deazaadenosin-5'-trifosfato, 7-deazaguanosin-5'-trifosfato, 8-azaadenosin-5'-trifosfato, 8-azidoadenosin-5'-trifosfato, bencimidazol-ribosido-5'-trifosfato, N1-metiladenosin-5'-trifosfato, N1-metilguanosin-5'-trifosfato, N6-metiladenosin-5-trifosfato-5'-trifosfato, N6-metiladenosin-5'-trifosfato, O6-metilguanosin-5'-trifosfato, pseudouridin-5'-trifosfato o puromicin-5'-trifosfato, xantosin-5'-trifosfato. Se da particular preferencia a los nucleotidos para las modificaciones de bases seleccionados del grupo de nucleotidos modificados bases consistente en 5-metilcitidin-5'-trifosfato, 7-deazaguanosin-5'-trifosfato, 5-bromocitidin-5'-trifosfato y pseudouridin-5'-trifosfato.
En algunas realizaciones, los nucleosidos modificados incluyen piridin-4-ona ribonucleosido, 5-aza-uridina, 2-tio-5-azauridina, 2-tiouridina, 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxiuridina, 3-metiluridina, 5-carboximetiluridina, 1-carboximetil-pseudouridina, 5-propiniluridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometiluridina, 1-taurinometilpseudouridina, 5-taurinometil-2-tiouridina, 1-taurinometil-4-tiouridina, 5-metiluridina, 1-metilpseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-1-metilpseudouridina, 1-metil-1-deazapseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deazapseudouridina, dihidrouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tiouridina, 4-metoxipseudouridina y 4-metoxi-2-tio-pseudouridina.
En algunas realizaciones, los nucleosidos modificados incluyen 5-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metilcitidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 1-metilpseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolopseudoisocitidina, 2-tiocitidina, 2-tio-5-metilcitidina, 4-tiopseudoisocitidina, 4-tio-1-metilpseudoisocitidina, 4-tio-1 -metil-1 -deaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-azazebularina, 5-metilzebularina, 5-aza-2-tiozebularina, 2-tiozebularina, 2-metoxicitidina, 2-metoxi-5-metilcitidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina y 4-metoxi-1-metilpseudoisocitidina.
En otras realizaciones, los nucleosidos modificados incluyen 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 7-deazaadenina, 7-deaza-8-azaadenina, 7-deaza-2-aminopurina, 7-deaza-8-aza-2-aminopurina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metiladenosina, N6-metiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxi-isopentenil)-adenosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina, N6,N6-dimetiladenosina, 7-metiladenina, 2-metiltioadenina y 2-metoxiadenina.
En otras realizaciones, los nucleosidos modificados incluyen inosina, 1-metilinosina, wiosina, wibutosina, 7-deazaguanosina, 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tioguanosina, 6-tio-7-deazaguanosina, 6-tio-7-deaza-8-azaguanosina, 7-metilguanosina, 6-tio-7-metilguanosina, 7-metilinosina, 6-metoxiguanosina, 1-metilguanosina, N2-metilguanosina, N2,N2-dimetilguanosina, 8-oxoguanosina, 7-metil-8-oxoguanosina, 1-metil-6-tioguanosina, N2-metil-6-tioguanosina y N2,N2-dimetil-6-tioguanosina.
En algunas realizaciones, el nucleotido puede modificarse en la cara principal de ranura y puede incluir reemplazar el hidrogeno en C-5 del uracilo con un grupo metilo o halo.
En realizaciones especfficas, un nucleosido modificado es 5'-O-(1-tiofosfato)-adenosina, 5'-O-(1-tiofosfato)citidina, 5'-O-(l-tiofosfato)guanosina, 5'-O-(1-tiofosfato)uridina o 5'-O-(1-tiofosfato)pseudouridina.
En otras realizaciones especfficas, la molecula de acido nucleico artificial, preferentemente una molecula de ARN, puede comprender modificaciones de nucleosidos seleccionadas de 6-azacitidina, 2-tiocitidina, a-tiocitidina, pseudoisocitidina, 5-aminoaliluridina, 5-yodouridina, N1-metil-pseudouridina, 5,6-dihidrouridina, a-tiouridina, 4-tiouridina, 6-azauridina, 5-hidroxi-uridina, desoxitimidina, 5-metiluridina, pirrolocitidina, inosina, a-tioguanosina, 6-metilguanosina, 5-metilcitidina, 8-oxoguanosina, 7-deazaguanosina, N1-metil-adenosina, 2-amino-6-cloropurina, N6-metil-2-aminopurina, pseudo-isocitidina, 6-cloropurina, N6-metiladenosina, a-tioadenosina, 8-azidoadenosina, 7-deaza-adenosina.
Modificacion de lfpidos:
De acuerdo con una realizacion adicional, la molecula de acido nucleico artificial, preferentemente un ARN, tal como se define aquf puede contener una modificacion de lfpidos. Tal ARN modificado con lfpidos tfpicamente comprende un ARN como se define aquf. Esta molecula de ARN modificada con lfpidos como se define aquf comprende ademas tfpicamente al menos un conector unido covalentemente a esa molecula de ARN y al menos un lfpido unido covalentemente con el enlazador respectivo. Alternativamente, la molecula de ARN modificada con lfpidos comprende al menos una molecula de ARN como se define aquf y al menos un lfpido (bifuncional) unido covalentemente (sin enlazador) a esa molecula de ARN. De acuerdo con una tercera alternativa, la molecula de ARN modificada con lfpidos comprende una molecula de acido nucleico artificial, preferentemente un ARN, como se define aquf, al menos un conector enlazado covalentemente a esa molecula de ARN y al menos un lfpido unido covalentemente al enlazador respectivo, y tambien al menos un lfpido (bifuncional) unido covalentemente (sin enlazador) a esa molecula de ARN. En este contexto, se prefiere particularmente que la modificacion de lfpidos este presente en los extremos terminales de una secuencia de ARN lineal.
Modificacion del extremo 5' del ARN modificado:
De acuerdo con otra realizacion preferente de la invencion, la molecula de acido nucleico artificial, preferentemente un ARN, como se define aqm puede estar modificada por adicion de la estructura denominada "5'-CAP''.
Un 5'-cap es una entidad, tfpicamente una entidad nucleotfdica modificada, que generalmente "tapa" el extremo 5 'de un ARNm maduro. Un 5'-cap puede estar formado tfpicamente por un nucleotido modificado, en particular un derivado de un nucleotido guanina. Preferiblemente, la 5'-cap esta unida al terminal 5' a traves de un enlace 5'-5'-trifosfato. La 5'-cap puede estar metilada, por ejemplo m7GpppN, siendo N el nucleotido 5' terminal del acido nucleico que lleva la cap 5', tfpicamente el extremo 5' de un ARN. m7GpppN es la estructura 5'-cap que se produce naturalmente en el ARNm transcrito por la polimerasa II y, por tanto, no se considera una modificacion comprendida en el ARN modificado segun la invencion. Esto significa que la molecula de acido nucleico artificial, preferentemente una molecula de ARN, de acuerdo con la presente invencion puede comprender un m7GpppN como 5'-cap, pero adicionalmente la molecula de acido nucleico artificial, preferentemente una molecula de ARN, comprende al menos una modificacion adicional como se define aquf.
Otros ejemplos de estructuras 5'-cap incluyen glicerilo, residuo desoxi no basico inverso (resto), 4',5 metilen nucleotido, 1-(beta-D-eritrofuranosil)nucleotido, 4'-tionucleotido, nucleotido carbocfclico, 1,5-anhidrohexitol nucleotido, nucleotidos L, nucleotido alfa, nucleotido base modificado, treo-pentofuranosil nucleotido, nucleotido acfclico 3',4'-seconucleotido, 3,4-dihidroxibutil nucleotido acfclico, 3,5-dihidroxipil nucleotido acfclico, 3'-3'-residuo nucleotido invertido, 3'-3'-residuo nucleotido invertido no basico, 3'-2'-residuo nucleotido invertido, 3'-2'-residuo invertido no basico, 1,4-butanodiol fosfato, 3'-fosforamidato, hexilfosfato, aminohexilfosfato, 3'-fosfato, 3'-fosforotioato, fosforoditioato, o grupos metilfosfonato con o sin puentes. Estas estructuras 5'-cap modificadas se consideran al menos una modificacion comprendida en la molecula de acido nucleico artificial, preferentemente en una molecula de ARN, de acuerdo con la presente invencion.
Estructuras 5'-cap modificadas particularmente preferentes son CAP1 (metilacion de la ribosa del nucleotido adyacente de m7G), CAP2 (metilacion de la ribosa del segundo nucleotido aguas abajo del m7G), CAP3 (metilacion de la ribosa del 3er nucleotido aguas abajo del m7G), CAP4 (metilacion de la ribosa del 4° nucleotido aguas abajo del m7G), ARCA (analogo anti-reverso CAP, ARCA modificado (por ejemplo ARCA modificado con fosfotioato), inosina, N1-metilguanosina, 2'-fluoroguanosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoguanosina, 2-aminoguanosina, LNA-guanosina y 2-azidoguanosina.
En una realizacion preferente, el al menos un marco de lectura abierto codifica una protefna o peptido terapeutico. En otra realizacion, un antfgeno esta codificado por al menos un marco de lectura abierto, tal como un antfgeno patogeno, un antfgeno tumoral, un antfgeno alergenico o un antfgeno autoinmune. En este caso, la administracion de la molecula de acido nucleico artificial que codifica el antfgeno se utiliza en un enfoque de vacunacion genetica contra una enfermedad que involucra a dicho antfgeno. En una realizacion alternativa, un anticuerpo esta codificado por al menos un marco de lectura abierto de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion.
Antigenos
Antigenos patogenos:
La molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion puede codificar una protefna o un peptido que comprende un antfgeno patogeno o un fragmento, variante o derivado del mismo. Dichos antiqenos patogenos se derivan de organismos patogenos, en particular organismos patogenos bacterianos, virales o protozoologicos (multicelulares), que provocan una reaccion inmunologica en un sujeto, en particular un sujeto mamffero, mas particularmente un ser humano. Mas especfficamente, los antigenos patogenos son preferiblemente antigenos de superficie, por ejemplo proteinas (o fragmentos de proteinas, por ejemplo, la porcion exterior de un antfgeno de superficie) ubicadas en la superficie del virus o del organismo bacteriano o protozoologico.
Los antigenos patogenicos son antigenos de peptido o protefna derivados de un patogeno asociado a una enfermedad infecciosa, preferiblemente seleccionados de antigenos derivados de los patogenos Acinetobacter baumannii, Anaplasma genus, Anaplasma phagocytophilum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenale, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides, Aspergillus genus, Astroviridae, Babesia genus, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, virus BK, Blastocystis hominis, Blastomyces dermatitidis, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia genus, Borrelia spp, Brucella genus, Brugia malayi, familia Bunyaviridae, Burkholderia cepacia y otras especies de Burkholderia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, familia de Caliciviridae, Campylobacter genus, Candida albicans, Candida spp, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, CJD prion, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens, Clostridium spp, Clostridium tetani, Coccidioides spp, coronavirus, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, virus de fiebre hemorragica de Crimean-Congo, Cryptococcus neoformans, Cryptosporidium genus, Citomegalovirus (CMV), virus del Dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 and DEN-4), Dientamoeba fragilis, Ebolavirus (EBOV), Echinococcus genus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia genus, Entamoeba histolytica, Enterococcus genus, Enterovirus genus, Enteroviruses, principalmente virus Coxsackie A y Enterovirus 71 (EV71), Epidermophyton spp, Virus Epstein-Barr (EBV), Escherichia coli O157:H7, O111 y O104:H4, Fasciola hepatica y Fasciola gigantica, FFI prion, superfamilia Filarioidea, Flavivirus, Francisella tularensis, Fusobacterium genus, Geotrichum candidum, Giardia intestinalis, Gnathostoma spp, GSS prion, virus Guanarito, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Henipavirus (virus Hendra virus Nipah), Virus de Hepatitis A, Virus de Hepatitis B (HBV), Virus de Hepatitis C (HCV), Virus de Hepatitis D, Virus de Hepatitis E, virus Herpes simple 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2), Histoplasma capsulatum, VIH (Virus de inmunideficiencia humana), Hortaea werneckii, bocavirus humano (HBoV), herpesvirus 6 humano (HHV-6) y herpesvirus 7 humano (HHV-7), metapneumovirus humano (hMPV), virus del papiloma humano (HPV), virus de parainfluenza (HPIV), virus de encefalitis Japonesa, virus JC, virus Junfn, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, Kuru prion, virus Lassa, Legionella pneumophila, Leishmania genus, Leptospira genus, Listeria monocytogenes, Virus de coriomeningitis linfocftica (LCMv ), virus Machupo, Malassezia spp, virus Marburg, virus Measles, Metagonimus yokagawai, Microsporidia phylum, virus Molluscum contagiosum (MCV), virus Mumps, Mycobacterium leprae y Mycobacterium lepromatosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Nocardia spp, Onchocerca volvulus, Orientia tsutsugamushi, familia de Orthomyxoviridae (Influenza), Paracoccidioides brasiliensis, Paragonimus spp, Paragonimus westermani, Parvovirus B19, Pasteurella genus, Plasmodium genus, Pneumocystis jirovecii, Poliovirus, Virus de la rabia, Virus sincitial respiratorio (RSV), Rinovirus, rinovirus, Rickettsia akari, Rickettsia genus, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, virus de la fiebre Rift Valley, Rotavirus, Virus de la rubeola, virus Sabia, genero Salmonella, Sarcoptes scabiei, SARS coronavirus, genero Schistosoma, genero Shigella, virus Sin Nombre, Hantavirus, Sporothrix schenckii, Staphylococcus genus, Staphylococcus genus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, Taenia genus, Taenia solium, Virus de encefalitis transmitido por garrapatas (TBEV), Toxocara canis o Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichophyton spp, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urealyticum, virus zoster de varicela (VZV), Virus zoster de varicela (VZV), Viruela mayor o Viruela menor, vCJD prion, Virus de encefalitis equina venezolana, Vibrio cholerae, virus del Nilo Occidental, Virus de encefalitis equina Occidental, Wuchereria bancrofti, Virus de fiebre amarilla, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, y Yersinia pseudotuberculosis.
En este contexto, son particularmente preferentes antigenos de los patogenos seleccionados de virus de la gripe, virus sincitial respiratorio (RSV), virus de herpes simple (HSV), virus de papiloma humano (HPV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del Dengue, Chlamydia trachomatis, Citomegalovirus (CMV), virus de hepatitis B (HBV), Mycobacterium tuberculosis, virus de la rabia y virus de fiebre amarilla.
Antigenos tumorales:
En una realizacion adicional, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion puede codificar una protefna o un peptido que comprende un peptido o protefna que comprende un antfgeno tumoral, un fragmento, variante o derivado de dicho antfgeno tumoral, preferiblemente donde el antfgeno tumoral es un antfgeno especffico de melanocitos, un antfgeno de cancer de testfculo o un antfgeno especffico de tumor, preferiblemente un antfgeno CT-X, un antfgeno CT no X, un companero de union para un antfgeno de CT-X o un socio de union para un antfgeno CT no X o un antfgeno especffico de tumor, mas preferiblemente un antfgeno CT-X, un companero de union para un antfgeno CT no X o un antfgeno especffico de tumor o un fragmento, variante o derivado de dicho antfgeno tumoral; y donde cada una de las secuencias de acido nucleico codifica un peptido o protefna diferente; y donde al menos una de las secuencias de acido nucleico codifica para 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, alfa-5-beta-1-integrina, alfa-5-beta-6-integrina, alfa-actinina-4/m, alfa-metilacil-coenzima A racemasa, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, beta-catenina / m, BING-4, BRCA1 / m, BRCA2 / m , CA 15-3 / CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, calreticulina, CAMEL, CASP-8/m, catepsina B, catepsina L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33 , CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, protefna similar a coactosina, collage XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, ciclina B1, ciclina D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3 , ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP , GnT- V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, hepsina, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R171, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, homeobox NKX3.1, HOM-TES-14 / SCP-1, HOM-TE S-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1 R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, receptor de laminina inmaduro, kalikrefa-2, kalikrefna-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE-A4, MAGE-A6 , MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B1 6, MAGE-B1 7 , MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, mamaglobina A, MART-1/melan-A, MART-2, MART-2/m, matriz de protefna 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, mesotelina, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-antfgeno, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, miosina clase l/m, NA88-A, N-acetilglucosaminiltransferasa V, Neo-PAP, Neo-PAP/m , NFYC / m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, osteocalcina, osteopontina, p15, p190 minor bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-Quinasa, Pin-1, Pml/PARalfa, POTE, PRAME, PRDX5/m, prostefna, proteinasa-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, survivina, survivina-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGFbeta ,TGFbetaRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, tirosinasa, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, WT1 y un idiotipo de inmunoglobulina de una celula sangufnea linfoide o un idiotipo de receptor de celulas T de una celula sangufnea linfoide, o un fragmento, variante o derivado de dicho antfgeno tumoral; preferiblemente survivina o un homologo de la misma, un antfgeno de la familia MAGE o una pareja de union de la misma o un fragmento, variante o derivado de dicho antfgeno tumoral. Particularmente preferidos en este contexto son los antfgenos tumorales NY-ESO-1, 5T4, MAGE-C1, MAGE-C2, survivina, Muc-1, PSA, PSMA, PSCA, STEAP y PAP.
En una realizacion preferente, la molecula de acido nucleico artificial codifica una protefna o un peptido que comprende una protefna terapeutica o un fragmento, variante o derivado de la misma.
Las protefnas terapeuticas como se definen aquf son peptidos o protefnas beneficiosos para el tratamiento de cualquier enfermedad hereditaria o adquirida, o que mejoran la condicion de un individuo. En particular, las protefnas terapeuticas desempenan un papel importante en la creacion de agentes terapeuticos que podrfan modificar y reparar errores geneticos, destruir celulas cancerfgenas o celulas infectadas con patogenos, tratar trastornos del sistema inmunologico, tratar trastornos metabolicos o endocrinos, entre otras funciones. Por ejemplo, la eritropoyetina (EPO), una hormona proteica, se puede utilizar para tratar a pacientes con deficiencia de eritrocitos, que es una causa comun de complicaciones renales. Ademas, las protefnas adyuvantes, los anticuerpos terapeuticos estan incluidos en las protefnas terapeuticas y tambien la terapia de reemplazo hormonal, que por ejemplo se emplea en la terapia femenina en la menopausia. En enfoques mas recientes, las celulas somaticas de un paciente se utilizan para reprogramarlas en celulas madre pluripotentes, que reemplazan la terapia de celulas madre en disputa. Tambien estas protefnas utilizadas para la reprogramacion de celulas somaticas o usadas para diferenciar las celulas madre se definen aquf como protefnas terapeuticas. Ademas, las protefnas terapeuticas se pueden usar para otros fines, por ejemplo para la curacion de heridas, la regeneracion de tejidos, la angiogenesis, etc. Ademas, los receptores y fragmentos de celulas B especfficos de antfgeno y sus variantes se definen aquf como protefnas terapeuticas.
Por tanto, las protefnas terapeuticas se pueden usar para diversos fines, incluido el tratamiento de diversas enfermedades tales como enfermedades infecciosas, neoplasias (por ejemplo cancer o enfermedades tumorales), enfermedades de la sangre y de los organos hematopoyeticos, enfermedades endocrinas, nutricionales y metabolicas, enfermedades del sistema nervioso, enfermedades del sistema circulatorio, enfermedades del sistema respiratorio, enfermedades del sistema nervioso, del sistema digestivo, enfermedades de la piel y tejido subcutaneo, enfermedades del sistema musculoesqueletico y tejido conectivo y enfermedades del sistema genitourinario, independientemente de si son heredadas o adquiridas.
En este contexto, las protefnas terapeuticas particularmente preferidas que se pueden usar, entre otras, en el tratamiento de trastornos metabolicos o endocrinos se seleccionan entre (entre parentesis la enfermedad particular para la cual se utiliza la protefna terapeutica en el tratamiento): esfingomielinasa acida (enfermedad de Niemann-Pick), adipotida (obesidad), agalsidasa-beta (galactosidasa humana A) (Enfermedad de Fabry previene la acumulacion de lfpidos que podrfan conducir a complicaciones renales y cardiovasculares), alglucosidasa (enfermedad de Pompe (enfermedad de almacenamiento de glucogeno tipo II)), alfa-galactosidasa A (alfa-GAL A, agalsidasa alfa) (enfermedad de Fabry), alfa-glucosidasa (Enfermedad de almacenamiento de glucogeno (GSD), Morbus Pompe), alfa-L-iduronidasa (mucopolisacaridosis (MPS), sfndrome de Hurler, sfndrome de Scheie), alfa-N-acetilglucosaminidasa (sfndrome de Sanfilippo), anfiregulina (cancer, trastorno metabolico), angiopoyetina ((Ang1, Ang2, Ang3, Ang4, ANGPTL2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6, ANGPTL7) (angiogenesis, estabilizacion de vasos), Betacellulina (trastorno metabolico), Beta-glucuronidasa (sfndrome de Sly), protefna morfogenetica osea BMP (BMP1 , BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP10, b Mp 15) (efecto regenerativo, afecciones relacionadas con los huesos, enfermedad renal cronica (ERC)), protefna CLN6 (enfermedad CLN6 - Infancia tardfa atfpica, tardfa Variante de inicio, Juvenil Temprano, Lipofuscinosis Ceroides Neuronales (NCL), Factor de crecimiento epidermico (EGF) (cicatrizacion de heridas, regulacion del crecimiento celular, proliferacion y diferenciacion), Epigen (trastorno metabolico), Epiregulina (trastorno metabolico), Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-1 1, FGF- 12, FGF-13, FGF-14, FGF-1 6, FGF-1 7, FGF-1 7, FGF-1 8, FGF-1 9, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23) (cicatrizacion de heridas, angiogenesis, trastornos endocrinos, regeneracion de tejidos), Galsulfasae (Mucopolisacaridosis VI), Grelina (sfndrome del intestino irritable (SII), obesidad, sfndrome de Prader-Willi, diabetes mellitus tipo II), Glucocerebrosidasa (enfermedad de Gaucher), GM- CSF (efecto regenerativo, produccion de globulos blancos, cancer), factor de crecimiento de union a heparina de tipo EGF (HB-EGF) (cicatrizacion de heridas, hipertrofia cardfaca y desarrollo y funcion del corazon), factor de crecimiento de hepatocitos HGF (efecto regenerativo, cicatrizacion de heridas), hepcidina (trastornos del metabolismo del hierro, beta-talasemia), albumina humana ( Disminucion de la produccion de albumina (hipoproteinemia), aumento de la perdida de albumina (sfndrome nefrotico), hipovolemia, hiperbilirrubinemia, Idursulfasa (lduronato-2-sulfatasa) (Mucopolisacaridosis II (sfndrome de Hunter)), Integrinas aVp3, aVp5 y a5p1 (macromoleculas de matriz de enlace y proteinasas, angiogenesis), luduronato sulfatasa (sfndrome de Hunter), Laronidasa (formas de mucopolisacaridosis I de Hurler y Hurler-Scheie), N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (rhASB); galsulfasa, arilsulfatasa A (ARSA), arilsulfatasa B (ARSB)) (deficiencia de arilsulfatasa B, sfndrome de Maroteaux-Lamy, mucopolisacaridosis VI), N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (sfndrome de Sanfilippo), factor de crecimiento nervioso (NGF, Derivado del Cerebro) Factor (BDNF), Neurotrofina-3 (NT-3) y Neurotrofina 4/5 (NT-4/5) (efecto regenerativo, enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis coronaria, obesidad, diabetes tipo 2, sfndrome metabolico, sfndromes coronarios agudos, demencia, depresion, esquizofrenia, autismo, sfndrome de Rett, anorexia nerviosa, bulimia nerviosa, cicatrizacion de heridas, ulceras cutaneas, ulceras corneales, enfermedad de Alzheimer), neuregulina (NRG1, NRG2, NRG3, NRG4) (trastorno metabolico, esquizofrenia), neuropilina (NRP) 1, NRP-2) (angiogenesis, gufa de axon, supervivencia celular, migracion), Obestatina (sfndrome del intestino irritable (SII), obesidad, sfndrome de Prader-Willi, diabetes mellitus tipo II), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF (PDFF-A) , PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D) (efecto regenerativo, cicatrizacion de heridas, trastorno en angiogenesis, arteriosclerosis, fibrosis, cancer, receptores de TGF beta (endoglina, receptor de TGF-beta 1, receptor de TGF-beta 2, receptor de TGF-beta 3) (fibrosis renal, enfermedad renal, diabetes, enfermedad renal en etapa terminal ( ERT), angiogenesis), trombopoyetina (THPO) (factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos (MGDF)) (trastornos plaquetarios, plaquetas para donacion, recuperacion de recuentos de plaquetas despues de la quimioterapia mielosupresora), factor de crecimiento transformante (TGF (TGF-a, TGF-beta) (TGFbetal, TGFbeta2 y TGFbeta3)) (efecto regenerativo, curacion de heridas, inmunidad, cancer, cardiopatfa, diabetes, sfndrome de Marfan, sfndrome de Loeys-Dietz), VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF) -D, VEGF-E, VEGF-F y PIGF) (efecto regenerativo, angiogenesis, cicatrizacion de heridas, cancer, permeabilidad), Nesiritida (insuficiencia cardfaca congestiva descompensada aguda), tripsina (ulcera de decubito, ulcera varicosa, desbridamiento de la escara, herida dehiscente) , quemadura solar, fleo meconial), hormona adrenocorticotrofica (ACTH) ("enfermedad de Addison, Carcinoma de celulas pequenas, Adrenoleucodistrofia, Hiperplasia suprarrenal congenita, Sfndrome de Cushing, Sfndrome de Nelson, Espasmos infantiles, Peptido atrio-natriuretico (ANP) (trastornos endocrinos), Colecistocinina (diversa), Gastrina (hipogastrinemia), Leptina (Diabetes,hipertrigliceridemia, obesidad), oxitocina (estimulacion de la lactancia materna, no progresion del parto), somatostatina (tratamiento sintomatico del sfndrome carcinoide, hemorragia aguda de las varices y acromegalia, poliquistosis hepatica y renal, acromegalia y sfntomas causados por tumores neuroendocrinos), vasopresina (hormona antidiuretica) (diabetes insfpida), calcitonina (osteoporosis posmenopausica, hipercalcemia, enfermedad de Paget, metastasis oseas, dolor del miembro fantasma, estenosis espinal), exenatida (diabetes tipo 2 resistente al tratamiento con metformina y una sulfonilurea), hormona de crecimiento (HG), somatotropina (fallo de crecimiento debido a deficiencia de GH o insuficiencia renal cronica, sfndrome de Prader-Willi, sfndrome de Turner, perdida del SIDA o caquexia con terapia antiviral), insulina (Diabetes mellitus, cetoacidosis diabetica, hiperpotasemia), factor de crecimiento similar a la insulina 1 IGF-1 (Fallo de crecimiento en ninos con delecion del gen GH o deficiencia primaria grave de IGF1, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad cardiovascular, insuficiencia cardfaca), Mecasermina rionfabato, analogo de IGF-1 (falla de crecimiento en ninos con delecion del gen GH o deficiencia primaria grave de IGF1, enfermedad neurodegenerativa, enfermedades cardiovasculares, insuficiencia cardfaca), Mecasermina, analogo de IGF-1 (falla de crecimiento en ninos con Supresion del gen GH o deficiencia primaria grave de IGF1, enfermedad neurodegenerativa, enfermedades cardiovasculares, insuficiencia cardfaca), Pegvisomant (Acromegalia), Pramlintida (Diabetes mellitus, en combinacion con insulina), Teriparatida (hormona paratiroidea humana residuos 1-34) (osteoporosis severa), Becaplermina (complemento de desbridamiento para las ulceras diabeticas), dibotermina alfa (protefna morfogenetica osea 2) (cirugfa de fusion espinal, reparacion de lesion osea), acetato de histrelina (hormona liberadora de gonadotropina); GnRH) (pubertad precoz), octreotida (acromegalia, alivio sintomatico de los tumores de adenoma secretor de VI P y metastasis de los carcinoides) y palifermina (factor de crecimiento de queratinocitos; KGF) (mucosidad oral grave en pacientes sometidos a quimioterapia, cicatrizacion de heridas).
Se entiende que estas y otras protefnas son terapeuticas, ya que estan destinadas a tratar al sujeto reemplazando su produccion endogena defectuosa de una protefna funcional en cantidades suficientes. Por consiguiente, tales protefnas terapeuticas son tfpicamente mamfferas, en particular protefnas humanas.
Para el tratamiento de trastornos sangufneos, enfermedades del sistema circulatorio, enfermedades del sistema respiratorio, cancer o enfermedades tumorales, enfermedades infecciosas o inmunodeficiencias despues de las protefnas terapeuticas, se pueden usar: Alteplasa (activador tisular del plasminogeno; tPA) (embolia pulmonar, infarto de miocardio, ictus isquemico agudo, oclusion de los dispositivos de acceso venoso central), anistreplasa (trombolisis), antitrombina III (AT-III) (deficiencia hereditaria de AT-III, tromboembolismo), bivalirudina (reduce el riesgo de coagulacion sangufnea en la angioplastia coronaria y trombocitopenia inducida por heparina), Darbepoetina alfa (Tratamiento de la anemia en pacientes con insuficiencia renal cronica e insuficiencia renal cronica (dialisis /-)), Drotrecogina-alfa (protefna C activada) (sepsis grave con alto riesgo de muerte), eritropoyetina, epoetina-alfa, eritropoyetina, ertropoyetina (anemia por enfermedad cronica, mileodisplasia, anemia por insuficiencia renal o quimioterapia, preparacion preoperatoria), Factor IX (Hemofilia B), Factor Vila (hemorragia en pacientes con hemofilia A o B e inhibidores del factor VIII o factor IX), Factor VIII (hemofilia A), Lepirudina (trombocitopenia inducida por heparina), Concentrado de protefna C (Trombosis venosa, Purpura fulminans), Reteplasa (eliminacion de mutefna de tPA) (Manejo del infarto agudo de miocardio, mejorfa de la funcion ventricular), Estreptoquinasa (Infarto de miocardio transmural evolutivo agudo, embolia pulmonar, trombosis venosa profunda, trombosis o embolia arterial, oclusion de la canula arteriovenosa, canula de Tenecte, infarto de miocardio), urocinasa (embolia pulmonar), angiostatina (cancer), inmunotoxina anti-CD22 (recafda de leucemia mieloide aguda CD33+), denileucina diftitox (linfoma cutaneo de celulas T (CCD)), inmunocianina (cancer de vejiga y prostata), MPS (Metalopanstimulina) (Cancer), Aflibercept (Cancer de pulmon no microcftico (CPNM), cancer colorrectal metastasico (mCRC, cancer metastasico refractario a las hormonas, degeneracion macular humeda), Endostatina (cancer, enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn, retinopatfa diabetica, psoriasis y endometriosis), colagenasa (desbridamiento de ulceras dermicas cronicas y areas severamente quemadas, contractura de Dupuytren, enfermedad de Peyronie), desoxiribonucleasa I humana, Dornasa (Fibrosis qufstica; disminuye las infecciones del tracto respiratorio en pacientes seleccionados con FVC superior al 40% de lo previsto), hialuronidasa (utilizada como adyuvante para aumentar la absorcion y dispersion de los farmacos inyectados, particularmente anestesicos en cirugfa oftalmica y ciertos agentes de imagen), papafna (desecho de tejido necrotico o licuefaccion de la muda en lesiones agudas y cronicas, como ulceras por presion, ulceras varicosas y diabeticas, quemaduras, heridas postoperatorias, heridas de quistes pilonidales, carbuncles y otras heridas), L-Asparaginasa (leucemia linfocftica aguda, que requiere una asparagina exogena para la proliferacion ), Peg-asparaginasa (leucemia linfocftica aguda, que requiere asparagina exogena para la proliferacion), Rasburicasa (pacientes pediatricos con leucemia, linfoma y tumores solidos que estan en tratamiento contra el cancer que puede causar el sfndrome de lisis tumoral), gonadotropina corionica humana (HCG) (Reproduccion asistida), Hormona estimulante del folfculo humano (FSH) (Reproduccion asistida), Lutropina -alfa (Infertilidad con deficiencia de la hormona luteinizante), Prolactina (Hipoprolactinemia, deficiencia de prolactina en suero, disfuncion ovarica en mujeres, ansiedad, disfuncion erectil arteriogenica, eyaculacion precoz, oligozoospermia, astenospermia, hipofuncion de vesfculas seminales, hipoandrogenia), Inhibidor de proteinasa (deficiencia de antitripsina congenita), lactasa (gases, distension abdominal, calambres y diarrea debido a la incapacidad de digerir la lactosa), enzimas pancreaticas (lipasa, amilasa, proteasa) (fibrosis qufstica, pancreatitis cronica, insuficiencia pancreatica, post-Billroth II, cirugfa de bypass geriatrica, obstruccion del conducto pancreatico, esteatorrea, mala digestion, gases, distension abdominal), adenosina desaminasa (pegademase bovine, PEG-ADA) (enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave debida a deficiencia de adenosina desaminasa), abatacept (artritis reumatoide (especialmente cuando es refractaria a la inhibicion de TNF)), Alefacept (psoriasis en placas), Anakinra (artritis reumatoide), Etanercept (artritis reumatoide, Artritis reumatoide de curso poliarticular juvenil, artritis psoriasica, espondilitis anquilosante, psoriasis en placas, espondilitis anquilosante), antagonista del receptor de la interleucina 1 (IL-1), Anakinra (inflamacion y degfradacion de cartflago asociada a artritis reumatoide), Thimilina (enfermedades neurodegenerativas, reumatismo, anorexia nerviosa), antagonista de TNF-alfa (trastornos autoinmunes como artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, psoriasis, hidradenitis supurativa, asma refractaria), enfuvirtida (infeccion por VIH-1) y timosina al (hepatitis B y C). (Entre parentesis la enfermedad particular para la cual se utiliza la protefna terapeutica en el tratamiento).
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un vector que comprende
a. un marco de lectura abierto (ORF) y/o un sitio de clonacion, por ejemplo para la insercion de un marco de lectura abierto o de una secuencia que comprende un marco de lectura abierto;
b. al menos un elemento de region 3'-no traducida (elemento 3'UTR) que comprende una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica que es al menos un 80% identico a la variante 3'UTR natural de la cual se deriva y
c. una 5'-UTR como un elemento adicional 5'-terminal, donde la 5'-UTR es una 5' TOP-UTR que no comprende un motivo 5'-TOP.
El al menos un elemento 3'UTR y el ORF se describen aquf anteriormente para la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion. El sitio de clonacion puede ser cualquier secuencia adecuada para introducir un marco de lectura abierto o una secuencia que comprende un marco de lectura abierto, tal como uno o mas sitios de restriccion. Asf, el vector que comprende un sitio de clonacion preferentemente es adecuado para insertar un marco de lectura abierto en el vector, de manera preferente para insertar un marco de lectura abierto 5' al elemento 3'UTR. Preferentemente, el sitio de clonacion o el ORF se situa 5' al elemento 3'UTR, de manera preferente en proximidad cercana al extremo 5' del elemento 3'UTR. Por ejemplo, el sitio de clonacion o el ORF se pueden unir directamente al extremo 5' del elemento 3'UTR o se pueden unir a traves de un tramo de nucleotidos, tal como un tramo de 2, 4, 6, 8, 10, 20, etc., nucleotidos como se describe anteriormente para la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion.
Preferentemente, el vector de acuerdo con la presente invencion es adecuado para producir la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, de manera preferente para producir un ARNm artificial de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo, insertando opcionalmente el marco de lectura abierto o una secuencia que comprende un marco de lectura abierto en el vector y transcribiendo el vector. Asf, preferentemente el vector comprende elementos necesarios para la transcripcion, tal como un promotor, por ejemplo un promotor de ARN polimerasa. De manera preferente, el vector es adecuado para la transcripcion utilizando sistemas de transcripcion eucarioticos, procarioticos, virales o en fago, tales como celulas eucarioticas, celulas procarioticas o sistemas de transcripcion in vitro eucarioticos, procarioticos, virales o en fago. De esta manera, por ejemplo, el vector puede comprender una secuencia promotora que es reconocida por una polimerasa, tal como por una ARN-polimerasa, por ejemplo una ARN-polimerasa eucariotica, procariotica, viral o en fago. En una realizacion preferida, el vector comprende un promotor de ARN-polimerasa en un fago tal como SP6, T3 o T7, preferentemente un promotor T7. De manera preferente, el vector es adecuado para la transcripcion in vitro utilizando un sistema de transcripcion in vitro basado en fago, tal como una ARN polimerasa T7 basada en el sistema de transcripcion in vitro.
En otra realizacion preferente, el vector puede usarse directamente para la expresion del peptido o protefna codificado en celulas o tejidos. Para ello, el vector comprende elementos particulares que son necesarios para la expresion en esas celulas/tejido, por ejemplo secuencias promotoras particulares, tales como un promotor de CMV.
El vector puede comprender ademas una secuencia poli(A) y/o una senal de poliadenilacion como se describe anteriormente para la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion.
El vector puede ser un vector de ARN o un vector de ADN. De manera preferente, el vector es un vector de ADN. El vector puede ser cualquier vector conocido por el experto, tal como un vector viral o plasmido. De manera preferente, el vector es un vector plasmido, de manera preferente un vector plasmido de ADN.
En una realizacion preferente, el vector de acuerdo con la presente invencion comprende la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion.
En una realizacion, un vector de ADN de acuerdo con la invencion comprende una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 80%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 90%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente 95%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 99%, mas preferiblemente del 100% con la secuencia de acido nucleico de una 3'UTR de un gen de protefna ribosomica, tal como con las secuencias de acido nucleico de acuerdo con las SEQ ID No: 10 a 115.
Preferiblemente, un vector de ADN de acuerdo con la presente invencion comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID No 1, SEQ ID No 3, una secuencia complementaria de la SEQ ID No o una secuencia que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 80%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 90%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 95%; incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No 1, SEQ ID No 3, SEQ ID No 7, o un fragmento de las mismas como se describe anteriormente, preferiblemente un fragmento funcional de las mismas.
Preferiblemente, un vector de ARN de acuerdo con la presente invencion comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID No 2, la SEQ ID No 4, la SEQ ID No 7 o una secuencia que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 80%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 90%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 95%; incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No 2, la SEQ ID No 4, la SEQ ID No 7 o un fragmento de las mismas, preferiblemente un fragmento funcional de las mismas.
De manera preferente, el vector es una molecula circular. Preferentemente, el vector es una molecula de doble hebra, tal como una molecula de ADN de doble hebra. Tal molecula de ADN preferente de doble hebra circular se puede utilizar convenientemente como una forma de almacenamiento para la molecula de acido nucleico artificial inventiva. Ademas, se puede utilizar para la transfeccion de celulas, por ejemplo celulas cultivadas. Tambien se puede utilizar para la transcripcion in vitro con el fin de obtener una molecula de ARN artificial de acuerdo con la invencion.
Preferentemente, el vector, en especial el vector circular, es linealizable, por ejemplo por digestion con enzimas de restriccion. En una realizacion preferida, el vector comprende un sitio de escision, tal como un sitio de restriccion, de manera preferente un sitio de escision unico, situado inmediatamente 3' al elemento 3'UTR o - si esta presente -inmediatamente 3' a la secuencia poli(A) o senal de poliadenilacion, o - si esta presente - situado 3' a la secuencia poli(C), o - si esta presente - situado 3' al tallo-bucle de histona. Asf, preferentemente, el producto obtenido al linealizar el vector termina en el extremo 3' con el extremo 3' del elemento 3'UTR o - si esta presente - con el extremo 3' de la secuencia poli(A) o senal de poliadenilacion, o - si esta presente - con el extremo 3' de la secuencia poli(C). En la realizacion, donde el vector de acuerdo con la presente invencion comprende la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, un sitio de restriccion, preferentemente un unico sitio de restriccion, se situa de manera preferente inmediatamente 3' al extremo 3' de la molecula de acido nucleico artificial.
En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a una celula que comprende la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion o el vector segun la presente invencion. La celula puede ser cualquier celula, tal como una celula bacteriana, de insecto, celula vegetal, celula de vertebrado, por ejemplo una celula de mamffero. Tal celula puede emplearse, por ejemplo, para la replicacion del vector de la presente invencion, por ejemplo una celula bacteriana. Adicionalmente, la celula se puede utilizar para transcribir la molecula de acido nucleico artificial o el vector segun la presente invencion y/o traducir el marco de lectura abierto de la molecula de acido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invencion. Por ejemplo, la celula se puede utilizar para producir protefnas recombinantes.
Las celulas de acuerdo con la presente invencion se obtienen, por ejemplo, por metodos de transferencia de acido nucleico estandar, como metodos de transfeccion estandar. Por ejemplo, la molecula de acido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invencion se pueden transferir a la celula por electroporacion, lipofeccion, por ejemplo en base a lfpidos cationicos y/o liposomas, precipitacion de fosfato de calcio, transfeccion basada en nanopartfculas, transfeccion viral virus, o basados en polfmeros cationicos, tales como DEAE-dextrano o polietilenimina, etc.
Preferentemente, la celula es una celula de mamffero, tal como una celula humana, de un animal domestico, un animal de laboratorio, tal como una celula de raton o rata. De manera preferente, la celula es una celula humana. La celula puede ser una celula de una lfnea celular establecida, tal como una celula CHO, BHK, 293T, COS-7, HELA, HEK etc., o puede ser una celula primaria, por ejemplo una celula HDF, preferentemente una celula aislada de un organismo. En una realizacion preferente, la celula es una celula aislada de un sujeto mamffero, de manera preferente de un sujeto humano. Por ejemplo, la celula puede ser una celula inmunitaria, tal como una celula dendrftica, una celula cancerosa o tumoral, o cualquier otra celula somatica, etc., preferentemente de un sujeto mamffero, en especial de un sujeto humano.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion o la celula de acuerdo con la presente invencion. La composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion se puede utilizar, por ejemplo, como vacuna, por ejemplo para la vacunacion genetica. Asf, el ORF puede, por ejemplo, codificar un antfgeno cuando se administra a un paciente para la vacunacion. De esta manera, en una realizacion preferente, la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion es una vacuna. Ademas, la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion se puede utilizar, por ejemplo, para la terapia genica.
Preferentemente, la composicion farmaceutica comprende ademas uno o mas excipientes, vehfculos, cargas y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables. En el contexto de la presente invencion, un vehfculo farmaceuticamente aceptable incluye tfpicamente una base lfquida o no lfquida para la composicion farmaceutica inventiva. En una realizacion, la composicion farmaceutica se proporciona en forma lfquida. En este contexto, preferentemente el vehfculo se basa en agua, tal como agua libre de pirogenos, solucion salina isotonica o soluciones tampon (acuosas), por ejemplo soluciones tampon fosfato, citrato, etc. La solucion tampon puede ser hipertonica, isotonica o hipotonica en relacion al medio de referencia especffico, es decir la solucion tampon puede tener un contenido de sales mas alto, identico o mas bajo en relacion al medio de referencia especffico, donde preferentemente se emplean concentraciones de las sales mencionadas que no conducen al dano de las celulas del mamffero por osmosis u otros efectos de la concentracion. Medios de referencia son, por ejemplo, lfquidos que se emplean en metodos “in vivo", tales como lfquidos sangufneos, linfoides, citosolicos u otros lfquidos corporales, por ejemplo, lfquidos que se pueden utilizar como medios de referencia en metodos “in vitro”, tales como soluciones tampon habituales o lfquidos. Tales soluciones tampon o lfquidos comunes son conocidos del experto. La solucion de lactato de Ringer es particularmente preferente como base lfquida.
Se pueden utilizar una o mas cargas o solidas o liquidas o diluyentes o compuestos encapsulantes adecuados para la administracion a un paciente asf como para la composicion farmaceutica inventiva. El termino “compatible” como se utiliza aquf significa preferentemente que estos componentes de la composicion farmaceutica inventiva son capaces de mezclarse con el acido nucleico inventivo, el vector o las celulas como se definen aquf de manera que no aparece una interaccion que reduce la efectividad farmaceutica de la composicion farmaceutica inventiva bajo las condiciones de uso tfpicas.
La composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion puede comprender opcionalmente ademas uno o mas componentes farmaceuticamente activos adicionales. Un componente farmaceuticamente activo en este contexto es un compuesto que tiene un efecto terapeutico para sanar, mejorar o prevenir una indicacion o enfermedad particular. Tales compuestos incluyen, sin limitacion, peptidos o protefnas, acidos nucleicos, compuestos organicos o inorganicos de bajo peso molecular (terapeuticamente activos) (peso molecular inferior a 5.000, de manera preferente inferior a 1.000), azucares, antfgenos o anticuerpos, agentes terapeuticos ya conocidos en la tecnica anterior, celulas antigenicas, fragmentos celulares antigenicos, fracciones celulares, componentes de pared celular (por ejemplo polisacaridos), patogenos modificados, atenuados o desactivados (por ejemplo qufmicamente o por irradiacion) (virus, bacterias, etc.).
Ademas, la composicion farmaceutica inventiva puede comprender un portador para la molecula de acido nucleico artificial o el vector. Tal portador puede ser adecuado para facilitar la disolucion en lfquidos fisiologicos adeptables, para el transporte y la captacion celular activa de la molecula de acido nucleico artificial farmaceutica o el vector. Por consiguiente, tal portador puede ser un componente que puede ser adecuado para el almacenamiento y la administracion de una molecula de acido nucleico artificial o un vector de acuerdo con la invencion. Tales componentes pueden ser, por ejemplo, portadores o compuestos cationicos o policationicos que pueden servir como agentes de transfeccion o formacion de complejos.
Agentes de transfeccion o formacion de complejos particularmente preferentes en este contexto son compuestos cationicos o policationicos, incluyendo protamina, nucleolina, espermina o espermidina, u otros peptidos o protefnas cationicas, como poli-L-lisina (PLL), poli-arginina, poli-peptidos basicos, peptidos de penetracion de celulas (CPPs), incluyendo peptidos de union a VIH, VIH-1 Tat (VIH), peptidos derivados de Tat, Penetratina, peptidos derivados o analogos de VP22, HSV VP22 (Herpes simple), MAP, kAlA o dominios de transduccion de protefnas (PTDs), PpT620, peptidos ricos en prolina, peptidos ricos en arginina, peptidos ricos en lisina, MPG-peptido(s), Pep-1, L-oligomeros, peptido(s) de calcitonina, peptidos derivados de Antennapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl, FGF, Lactoferrina, Transportano, Buforina-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, peptidos derivados de hCT, SAP, o histonas.
Adicionalmente, tales compuestos cationicos o policationicos o portadores pueden ser peptidos o protefnas cationicas o policationicas, que preferentemente comprenden o estan modificados adicionalmente para comprender al menos una parte -SH. De manera preferente, un portador cationico o policationico se selecciona de peptidos cationicos que tienen la siguiente formula suma (I):
{(Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}; formula (I)
donde I m n o x = 3-100, e I, m, n u o independientemente entre sf es cualquier numero seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 y 91-100 con la condicion de que el contenido total de Arg (Arginina), Lis (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) representa al menos el 10% de todos los aminoacidos del oligopeptido; y Xaa es cualquier aminoacido seleccionado de aminoacidos nativos (= de origen natural) o no nativos excepto Arg, Lis, His u Orn; y x es cualquier numero seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, con la condicion de que el contenido total de Xaa no exceda el 90 % de todos los aminoacidos del oligopeptido. Cualquiera de los aminoacidos Arg, Lis, His, Orn y Xaa se puede situar en cualquier lugar del peptido. En este contexto los peptidos o protefnas cationicas en un intervalo de 7-30 aminoacidos son particularmente preferidos.
Adicionalmente, el peptido o protefna cationica o policationica, cuando se define de acuerdo con la formula {(Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (formula (I)) como se muestra anteriormente, y que comprende o esta modificado adicionalmente para comprender al menos una parte -SH, puede seleccionarse, sin restringirse a, de la formula (Ia):
{(Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa')x (Cys)y} subformula (Ia)
donde (Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o; y x son como se definen aquf, Xaa' es cualquier aminoacido seleccionado de aminoacidos nativos (= de origen natural) o no nativos excepto Arg, Lis, His, Orn o Cys e y es cualquier numero seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80 y 81-90, con la condicion de que el contenido total de Arg (Arginina), Lis (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) representa al menos un 10% de todos los aminoacidos del oligopeptido. Adicionalmente, el peptido cationico o policationico se puede seleccionar de la formula (Ib):
Cysi {(Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} Cys2 subformula (Ib)
donde la formula empfrica {(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (formula (III)) es como se define aquf y forma un nucleo de una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la formula (semi empfrica) (III) y donde Cysi y Cys2 son Cistefnas proximas a, o terminales a (Arg)I;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x.
Compuestos cationicos o policationicos preferidos adicionales que se pueden utilizar como agentes de transfeccion o formacion de complejos pueden incluir polisacaridos cationicos, por ejemplo quitosano, polibreno, polfmeros cationicos, por ejemplo polietilenimina (PEI), lfpidos cationicos, por ejemplo DOTMA: cloruro de [1-(2,3-sioleiloxi)propil)]-N,N,N-trimetilamonio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: dioleil fosfatidiletanol-amina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: dioctadecilamidoglicilespermina, DIMRI: bromuro de dimiristo-oxipropildimetilhidroxietil-amonio, DOTAP: dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano, DC-6-14: cloruro de O,O-ditetradecanoil-N-(a trimetilamonioacetil)dietanolamina, CLIP1: cloruro de rac-[(2,3-dioctadecil-oxipropil)(2-hidroxietil)]dimetilamonio, CLIP6: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropil-oximetiloxi)etil]trimetilamonio, CLIP9: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropil-oxisuccinil-oxi)etil]-trimetilamonio, oligofectamina, o polfmeros cationicos o policationicos, por ejemplo poliaminoacidos modificados, tales como polfmeros p-aminoacido o poliamidas inversas, etc., polietilenos modificados, tales como PVP, bromuro de (poli(N-etil-4-vinilpiridinio)), etc., acrilatos modificados, tales como pDMAEMA (poli(dimetilaminoetil metilacrilato)), etc., amidoaminas modificadas tales como pAMAM (poli(amidoamina)), etc., polibetaaminoester modificado (PBAE), tal como polfmeros de 1,4-butanodiol, diacrilato-co-5-amino-1-pentanol, modificados en el extremo diamina, etc., dendrfmeros, tales como dendrfmeros de polipropilamina o dendrfmeros basados en pAMAM, etc., poliimina(s), como PEI: poli(etilenimina), poli(propilenimina), etc., polialilamina, polfmeros basados en cadena principal de azucar, tales como polfmeros basados en ciclodextrina, polfmeros basados en dextrano, quitosano, etc., polfmeros basados en cadena principal de silano, tales como copolfmeros PMOXA-PDMS, etc., polfmeros en bloque que consisten en una combinacion de uno o mas bloques cationicos (por ejemplo seleccionados de un polfmero cationico como se menciona anteriormente) y uno o mas bloques hidrofflicos o hidrofobicos (por ejemplo polietilenglicol); etc.
De acuerdo con una realizacion, la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion puede comprender un adyuvante para mejorar las propiedades inmunoestimuladoras de la composicion farmaceutica. En este contexto, un adyuvante puede entenderse como cualquier compuesto adecuado para soportar la administracion y el suministro de los componentes tales como la molecula de acido nucleico artificial o el vector comprendido en la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion. Ademas, dicho adyuvante puede, sin estar unido a el, iniciar o aumentar una respuesta inmune del sistema inmune innato, es decir, una respuesta inmune no especffica. En otras palabras, cuando se administra, la composicion farmaceutica segun la invencion tfpicamente inicia una respuesta inmune adaptativa dirigida al antfgeno codificado por la molecula de acido nucleico artificial. Ademas, la composicion farmaceutica segun la invencion puede generar una respuesta inmune innata (de apoyo) debido a la adicion de un adyuvante como se define en el presente documento a la composicion farmaceutica segun la invencion.
Dicho adyuvante puede seleccionarse de cualquier adyuvante conocido por el experto y adecuado para el presente caso, es decir, que respalde la induccion de una respuesta inmune en un mamffero. Preferiblemente, el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en, sin limitarse a, TDM, MDP, dipeptido muramilo, pluronicos, solucion alum, hidroxido de aluminio, ADJUMER™ (polifosfaceno); gel de fosfato de aluminio; glucanos de algas; algamulina; gel de hidroxido de aluminio (alum); gel de hidroxido de aluminio altamente adsorbente de protefna; gel de hidroxido de aluminio de baja viscosidad; AF o SPT (emulsion de esqualeno (5%), Tween 80 (0,2%), Pluronics L121 (1,25%), solucion salina regulada con fosfato, pH 7,4); AVRIDINE™ (propanodiamina); BAY R1005™ ((hidroacetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilamino-b-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoil-amida); CALCITRIOL™ (1-alfa-25-dihidroxivitamina D3); gel de fosfato de calcio; CAPTM (nanopartfculas de fosfato de calcio); holotoxina de colera, protefna de fusion de colera-toxina-AI-protefna-A-D-fragmento, subunidad B de toxina de colera; CRL 1005 (copolfmero de bloqueo P1205); liposomas que contienen citocina; DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio); DHEA (dehidroespiroesterona); DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina); DMPG (dimiristoilfosfatidilglicerol); complejo DOC/alum (sal de sodio de acido desoxicolico); adyuvante completo de Freund; adyuvante incompleto de Freund; gamma-inulina; adyuvante de Gerbu (mezcla de: i) N-acetilglucosaminil-(P1-4)-N- acetilmuramil-L-alanil-D-glutamina (GMDP), ii) cloruro de dimetildioctadecilamonio (DDA), iii) complejo de sal de zinc-L-prolina (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-acetilglucosaminil-(b1-4)-N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina); imiquimod (1-2-metipropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina); ImmTher™ (dipalmitato de N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glicerol); DRV (inmunoliposomas preparados por deshidratacion-rehidratacion de vesfculas); interferon-gamma; interleucina-1-beta; interleucina-2; interleucina-7; interleucina-12; ISCOMS™; ISCOPREP 7.0.3.™; liposomas; LOXORIBINE™ (7-alil-8-oxoguanosina); adyuvante oral LT (Ecoli labil enterotoxina-protoxina); microesferas y micropartfculas de cualquier composicion; MF59™; (emulsion escualeno-agua); MONtAn IDE iSa 51™ (adyuvante de Freund incompleto purificado); MONTANIDE ISA 720™ (adyuvante de aceite metabolizable); MPL™ (3-Q-desacil-4'-monofosforil lfpido A); liposomas MTP-PE y MTP-PE ((Nacetil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2-(sal monosodica de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-(hidroxifosforiloxi))etilamida); MURAMETIDE™ (Nac-Mur-L-Ala-D-GIn-OCH3); MURAPALMITINE™ y D-MURAPALMITINE™ (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-gliceroldipalmitoilo); NAGO (neuraminidasa-galactosa oxidasa); nanoesferas o nanopartfculas de cualquier composicion; NISV (vesfculas surfactantes no ionicas); PLEURAN™ (p-glucano); PLGA, PGA y PLA (homo- y copolfmero de acido lactico y acido glicolico; microesferas/nanoesferas); PLURONIC L121™; p MmA (metacrilato de polimetilo); PORDDS™ (microesferas proteinoides); derivados de carbamato de polietileno; poli-rA: poli-rU (complejo de acido poliadenflico-acido poliuridflico); polisorbato 80 (Tween 80); cocleatos de protefna (Avanti Porlar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULON™ (QS-21); Quil-A (Quil-A saporin); S-28463 (4-amino-otec-dimetil-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-etanol); SAF-1™ ("Formulacion de adyuvante Syntex"); proteoliposomas Sendai y matrices de lfpidos que contienen Sendai; Span-85 (trioleato de sorbitano); Specol (emulsion de Marcol 52, Span 85 y Tween 85); escualeno o Robane® (2,6,10,15,19,23-hexametiltetracosan y 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexano); esteariltirosina (clorhidrato de octadeciltirosina); Theramid® (N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-dipalmitoxipropilamida); Teronil-MDP (Termurtide™ o [thr I ]-MDP; N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina); partfculas Ty (Ty-VLPs o partfculas de tipo virus); liposomas Walter-Reed (liposomas que contienen lfpidos A adsorbidos en hidroxido de aluminio) y lipopeptidos, incluyendo Pam3Cys, en particular sales de aluminio, tales como Adju-phos, Alhydrogel, Rehydragel; emulsiones, incluyendo CFA, SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin; copolfmeros que incluyen Optivax (CRL1005), LI 21, Poloaxmer4010), etc.; liposomas, incluyendo Stealth, cocleatos, incluyendo BIORAL; adyuvantes derivados de plantas, incluyendo QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; adyuvantes adecuados para la coestimulacion que incluyen Tomatino, biopolfmeros, incluyendo PLG, PMM, Inulina; adyuvantes derivados de microbios, incluyendo Romurtide, DETOX, MPL, cWs , Manosa, secuencias de acido nucleico CpG, CpG7909, ligandos de TLR 1 -10 humano, ligandos de murina TLR 1 -13, ISS-1018, IC31, imidazoquinolinas, Ampligen, Ribi529, IMOxine, IRIV, VLP, toxina de colera, toxina termo-labil, Pam3Cys, Flagelina, ancla de GPI, LNFPIII/Lewis X, peptidos antimicrobianos, UC-1V150, protefna de fusion RSV, cdiGMP; y adyuvantes adecuados como antagonistas que incluyen neuropeptidos CGRP.
Tambien pueden seleccionarse adyuvantes adecuados de compuestos cationicos o policationicos donde el adyuvante se prepara preferiblemente despues de la complejacion de la molecula de acido nucleico artificial o el vector de la composicion farmaceutica con el compuesto cationico o policationico. La asociacion o complejacion de la molecula de acido nucleico artificial o del vector de la composicion farmaceutica con compuestos cationicos o policationicos como se definen aquf preferiblemente provee de propiedades adyuvantes y confiere un efecto estabilizador a la molecula de acido nucleico artificial o al vector de la composicion farmaceutica. Son particularmente preferentes los compuestos cationicos o policationicos que se seleccionan de peptidos o protefnas cationicos o policationicos que incluyen protamina, nucleolina, espermina o espermidina u otros peptidos o protefnas cationicos, tales como poli-L-lisina (p Ll ), poli-arginina, polipeptidos basicos, peptidos penetradores de celulas (CPP), incluyendo peptidos de union a VIH, Tat, VIH-1 Tat (VIH), peptidos derivados de Tat, Penetratina, peptidos VP22 derivados o analogos, HSV VP22 (Herpes simple), MAP, KALa o dominios de transduccion de protefna (PTD, PpT620, peptidos ricos en prolina, peptidos ricos en arginina, peptidos ricos en lisina, MPG-peptidos, Pep-1, L-oligomeros, peptido(s) de calcitonina, peptidos derivados de Antenapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, FGF, Lactoferrina, Transportano, Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, peptidos derivados de hCT, SAP, protamina, espermina, espermidina o histonas. Otros compuestos cationicos o policationicos preferidos pueden incluir polisacaridos cationicos, por ejemplo quitosano, polibreno, polfmeros cationicos, por ejemplo polietilenimina (PEI), lfpidos cationicos, por ejemplo DOTMA: cloruro de [1 -(2,3-sioleiloxi)propil)]-N,N,N-trimetilamonio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Choi, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: Dioleil fosfatidiletanolamina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: Dioctadecilamidoglicilspermina, DIMRI: Bromuro de dimiristooxipropil-dimetil-hidroxietil-amonio, DOTAP: dioleoiloxi-3- (trimetilamonio)-propano, DC-6­ 14: cloruro de O,O-ditetradecanoil-N-(a- trimetilamonioacetil)dietanolamina, CLIP1: cloruro de rac-[(2,3-dioctadeciloxipropil)-(2-hidroxietil)]-dimetilamonio, CLIP6: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropil-oximetiloxi)etil]trimetilamonio, CLIP9: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropil-oxisucciniloxijetil-trimetilamonio, oligofectamina, o polfmeros cationicos o policationicos, por ejemplo poliaminoacidos modificados, tal como polfmeros de p-aminoacidos o poliamidas inversas, polietilenos modificados, como PVP (bromuro de poli(N-etil-4-vinilpiridinio)), acrilatos modificados como pDMAEMA (metilacrilato de polidimetilaminoetilo)), amidoaminas modificadas como pAMAM (poli(amidoamina)), polibetaaminoester (PBAE) modificado, como polfmeros de diamina con extremo modificado con 1,4-butanodiol diacrilato-co-5-amino-1-pentanol, dendrfmeros como dendrfmeros de polipropilamina o dendrfmeros a base de pAMAM, poliimina(s), como PEI: poli(etilenimina), poli(propilenimina), polialilamina, polfmeros a base de estructuras de azucar, tales como polfmeros a base de ciclodextrina, polfmeros a base de dextrano, quitosano, polfmeros a base de estructuras siIano, como copolfmeros de PMOXA-PDMS, polfmeros en bloque que consisten en una combinacion de uno o mas bloques cationicos (por ejemplo seleccionados de un polfmero cationico como los que se mencionan arriba) y uno o mas bloques hidrofilos o hidrofobos (por ejemplo polietilenglicol).
De forma adicional, las protefnas o peptidos cationicos o policationicos preferidos que pueden usarse como adyuvante por complejacion con la molecula de acido nucleico artificial o el vector, preferentemente un ARN, de la composicion puede seleccionarse de las siguientes protefnas o peptidos que tienen la siguiente formula general (I): (Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, en la que I m n o x = 8-15, y I, m, n u o, independientemente entre pueden sí, ser un numero seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, siempre y cuando el contenido total de Arg, Lys, His y Orn represente al menos un 50% de todos los aminoacidos del oligopeptido; y Xaa puede ser cualquier aminoacido seleccionado de aminoacidos nativos (= que ocurren naturalmente) o no nativos excepto Arg, Lys, His u Orn; y x puede ser cualquier numero seleccionado de 0, 1, 2, 3 o 4, siempre y cuando el contenido total de Xaa no exceda el 50% de todos los aminoacidos del oligopeptido. Oligoargininas particularmente preferidas en este contexto son por ejemplo Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R, etc.
La relacion entre el acido nucleico artificial o el vector y el compuesto cationico o policationico se puede calcular en base a la relacion nitrogeno/fosfato (relacion N/P) de todo el complejo de acido nucleico. Por ejemplo, 1 pg de ARN tfpicamente contiene aproximadamente 3 nmol de residuos fosfato, siempre que el ARN muestre una distribucion estadfstica de bases. Ademas, 1 pg de peptido tfpicamente contiene aproximadamente x nmol de residuos nitrogeno, dependiendo del peso molecular y la cantidad de aminoacidos basicos. Cuando se calcula a modo de ejemplo para (Arg)9 (peso molecular 1424 g/mol, 9 atomos de nitrogeno), 1 pg de (Arg)9 contiene aproximadamente 700 pmol de (Arg)9 y, por tanto, 700 x 9 = 6300 pmol de aminoacidos basicos = 6,3 nmol de atomos de nitrogeno Para una relacion en masa de aproximadamente 1:1 ARN/(Arg)9, se puede calcular una relacion N/P de aproximadamente 2. Cuando se calcula a modo de ejemplo para protamina (peso molecular de aproximadamente 4250 g/mol, 21 atomos de nitrogeno, cuando se usa protamina de salmon) con una relacion en masa de aproximadamente 2:1 con 2 pg de ARN, se deben calcular 6 nmol de fosfato para el ARN; 1 pg de protamina contiene aproximadamente 235 pmol de moleculas de protamina y, por tanto, 235 x 21 = 4935 pmol de atomos de nitrogeno basicos = 4,9 nmol de atomos de nitrogeno. Para una relacion en masa de aproximadamente 2:1 ARN/protamina, se puede calcular una relacion N/P de aproximadamente 0,81. Para una relacion en masa de aproximadamente 8:1 ARN/protamina, se puede calcular una relacion N/P de aproximadamente 0,2. En el contexto de la presente invencion, una relacion N/P esta preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,1-10, preferiblemente en un intervalo de aproximadamente 0,3-4 y con mayor preferencia en un intervalo de aproximadamente 0,5-2 o 0,7-2 con respecto a la relacion acido nucleico:peptido en el complejo, y con total preferencia en el rango de aproximadamente 0,7-1,5
La solicitud de patente WO2010/037539 describe una composicion inmunoestimuladora y metodos para la preparacion de una composicion inmunoestimuladora. Asf, en una realizacion preferida de la invencion, la composicion se obtiene en dos etapas separadas para obtener tanto un efecto inmunoestimulador eficaz como una traduccion eficiente de la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion. En este documento, un llamado “componente adyuvante" se prepara complejando, en una primera etapa, la molecula o el vector de acido nucleico artificial, preferiblemente un ARN, del componente adyuvante con un compuesto cationico o policationico en una relacion especffica para formar un complejo estable. En este contexto, es importante que no quede compuesto cationico o policationico libre o solo una pequena cantidad despreciable en el componente adyuvante despues de complejar el acido nucleico. Por consiguiente, la proporcion entre el acido nucleico y el compuesto cationico o policationico en el componente adyuvante se selecciona tfpicamente en un intervalo en el que el acido nucleico esta completamente complejado y no hay compuesto cationico o policationico libre o solo queda una pequena cantidad necesaria en la composicion. Preferiblemente, la relacion del componente adyuvante, es decir, la relacion entre el acido nucleico y el compuesto cationico o policationico se selecciona de un intervalo de aproximadamente 6:1 (p/p) a aproximadamente 0,25:1 (p/p), mas preferiblemente de aproximadamente 5:1 (p/p) a aproximadamente 0,5:1 (p/p), incluso mas preferiblemente de aproximadamente 4:1 (p/p) a aproximadamente 1:1 (p/p) o de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 1:1 (p/p), y con total preferencia una relacion de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 2:1 (p/p).
De acuerdo con una realizacion preferente, la molecula de acido nucleico artificial o el vector, preferiblemente una molecula de ARN, segun la invencion, se agrega en un segundo paso a la molecula de acido nucleico complejado, preferiblemente un ARN, del componente adyuvante para formar la composicion (inmunoestimuladora) de la invencion. En ella, la molecula o el vector de acido artificial, preferiblemente un ARN, de la invencion se agrega como acido nucleico libre, es decir, acido nucleico no complejado con otros compuestos. Antes de la adicion, la molecula de acido nucleico artificial libre o el vector no forman complejos y preferiblemente no experimentaran ninguna reaccion de complejacion detectable o significativa tras la adicion del componente adyuvante.
Adyuvantes adecuados pueden seleccionarse ademas de acidos nucleicos de formula (II): GXmGn, donde: G es guanosina, uracilo o un analogo de guanosina o uracilo; X es guanosina, uracilo, adenosina, timidina, citosina o un analogo de los nucleotidos mencionados; l es un numero entero de 1 a 40, donde cuando l = 1 G es guanosina o un analogo de la misma, cuando l > 1 al menos el 50% de los nucleotidos son guanosina o analogos de la misma; m es un numero entero y es al menos 3; donde cuando m = 3 X es uracilo o un analogo del mismo, cuando m > 3 existen al menos 3 uracilos o analogos de uracilo sucesivos; n es un numero entero de 1 a 40, donde cuando n = 1 G es guanosina o un analogo de la misma, cuando n > 1 al menos el 50% de los nucleotidos son guanosina o analogos de la misma.
Otros adyuvantes adecuados pueden seleccionarse ademas de acidos nucleicos de formula (III): CXmCn, donde C es citosina, uracilo o un analogo de citosina o uracilo; X es guanosina, uracilo, adenosina, timidina, citosina o un analogo de los nucleotidos mencionados; l es un numero entero de 1 a 40, donde cuando l = 1 C es citosina o un analogo de la misma, cuando l > 1 al menos el 50% de los nucleotidos son citosina o analogos de la misma; m es un numero entero y es al menos 3; donde cuando m = 3 X es uracilo o un analogo del mismo, cuando m > 3 existen al menos 3 uracilos o analogos de uracilo sucesivos; n es un numero entero de 1 a 40, donde cuando n = 1 C es citosina o un analogo de la misma, cuando n > 1 al menos el 50% de los nucleotidos son citosina o analogos de la misma.
Preferentemente, la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion comprende una “cantidad segura y efectiva” de los componentes de la composicion farmaceutica, particularmente de la secuencia de acido nucleico artificial inventiva, del vector y/o de las celulas como se definen aquf. Como se utiliza aquf, una “cantidad segura y efectiva” significa una cantidad suficiente para inducir significativamente una modificacion positiva de una enfermedad o trastorno como se define aquf. Al mismo tiempo, sin embargo, una “cantidad segura y efectiva” preferentemente evita efectos secundarios serios y permite una relacion sensible entre ventaja y riesgo. La determinacion de estos lfmites esta tfpicamente dentro del alcance del juicio medico sensible.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion para su uso como medicamento, por ejemplo como vacuna (en la vacunacion genetica) o en la terapia genica.
La molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion son particularmente adecuados para cualquier aplicacion medica que hace uso de la accion terapeutica o efecto de los peptidos, polipeptidos o protefnas, o donde es necesaria la suplementacion de un peptido o protefna particular. Asf, la presente invencion proporciona la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion para su uso en el tratamiento o la prevencion de enfermedades o trastornos sensibles al tratamiento por la accion terapeutica o efecto de los peptidos, polipeptidos o protefnas sensibles al tratamiento mediante suplementacion de un peptido, polipeptido o protefna particular. Por ejemplo, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion se pueden utilizar para el tratamiento o la prevencion de enfermedades geneticas, enfermedades autoinmunes, enfermedades cancerosas o relacionadas con tumores, enfermedades infecciosas, enfermedades cronicas o similares, por ejemplo, por vacunacion genetica o terapia genica.
En particular, tales tratamientos terapeuticos que se benefician de una presencia estable, prolongada y/o incrementada de peptidos terapeuticos, polipeptidos o protefnas en un sujeto a tratar son especialmente adecuados como aplicacion medica en el contexto de la presente invencion, ya que el elemento 3'UTR proporciona una expresion del peptido o de la protefna de la molecula de acido nucleico articial segun la invencion o del vector. Asf, una aplicacion medica particularmente adecuada para la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion es la vacunacion. De esta manera, la presente invencion proporciona la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion para la vacunacion de un sujeto, preferentemente un sujeto mamffero, en especial un sujeto humano. Los tratamientos de vacunacion preferentes son la vacunacion contra enfermedades infecciosas, como infecciones bacterianas, protozoarias o virales, y la vacunacion anti-tumoral. Tales tratamientos de vacunacion pueden ser profilacticos o terapeuticos.
El ORF se puede seleccionar dependiendo de la enfermedad a tratar o prevenir. Por ejemplo, el marco de lectura abierto puede codificar una protefna que tiene que ser suministrada a un paciente que sufre de carencia total o al menos perdida parcial de la funcion de una protefna, tal como un paciente que sufre de una enfermedad genetica. Adicionalmente, el marco de lectura abierto se puede elegir de un ORF que codifica un peptido o protefna que influye beneficiosamente en una enfermedad o en la condicion de un sujeto. Adicionalmente, el marco de lectura abierto puede codificar un peptido o protefna que afecta la sub-regulacion de una sobreproduccion patologica de un peptido o protefna natural o por la eliminacion de celulas que expresan patologicamente una protefna o peptido. Tal carencia, perdida de funcion o sobreproduccion pueden aparecer, por ejemplo, en el contexto de tumores y neoplasias, enfermedades autoinmunes, alergias, infecciones, enfermedades cronicas o similares. Adicionalmente, el marco de lectura abierto puede codificar para un antfgeno o inmunogeno. Asf, en realizaciones preferentes, la molecula de acido nucleico artificial o el vector de acuerdo con la presente invencion comprende un ORF que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende o consiste en un antfgeno o inmunogeno, por ejemplo un epftopo de un patogeno o un antfgeno asociado a tumor, un elemento 3'UTR como se describe anteriormente y componentes adicionales opcionales, como una secuencia poli(A), etc.
En el contexto de la aplicacion medica, en particular en el contexto de la vacunacion, es preferente que la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion sea ARN, en especial ARNm, ya que el ADN conlleva el riesgo de inducir una respuesta inmunitaria anti-ADN y tiende a insertarse en el ADN genomico. Sin embargo, en algunas realizaciones, por ejemplo si se utiliza un vehfculo de suministro viral, tal como un vehfculo adenoviral, para la administracion de la molecula de acido nucleico artificial o del vector de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo en el contexto de los tratamientos terapeuticos genicos, puede ser deseable que la molecula de acido nucleico artificial o el vector sea una molecula de ADN.
La molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion se pueden administrar via oral, parenteral, por rociado en inhalacion, via topica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un deposito implantado o inyeccion con pistola. El termino parenteral como se utiliza aquf incluye subcutaneo, intravenoso, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepatica, intralesional, intracraneal, transdermica, intradermica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardiaca, intraarterial, e inyeccion sublingual o tecnicas de infusion. En una realizacion preferente, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion se administran mediante inyeccion sin aguja (por ejemplo, inyeccion con pistola).
Preferentemente, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion se administran parenteralmente, por ejemplo, por inyeccion parenteral, en especial por inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepatica, intralesional, intracraneal, transdermica, intradermica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardiaca, intraarterial, inyeccion sublingual o por tecnicas de infusion. Es particularmente preferente la inyeccion intradermica e intramuscular. Las formas inyectables esteriles de la composicion farmaceutica inventiva puede ser una suspension acuosa u oleosa. Estas suspensiones se pueden formular segun tecnicas conocidas en la tecnica utilizando agentes de dispersion o humectantes y agentes de suspension adecuados. Preferiblemente, las soluciones o suspensiones se administran mediante inyeccion sin aguja (por ejemplo por inyeccion con pistola).
La molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion tambien se pueden administrar oralmente en cualquier forma de dosificacion oralmente aceptable incluyendo, pero sin limitarse a, capsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas.
La molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion tambien se pueden administrar topicamente, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye areas u organos facilmente accesibles por la aplicacion topica, por ejemplo incluyendo enfermedades de la piel o de cualquier otro tejido epitelial accesible. Las formulaciones topicas adecuadas se preparan facilmente para cada una de estas areas u organos. Para aplicaciones topicas, la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion se puede formular en una pomada adecuada suspendidos o disueltos en uno o mas vehfculos.
En una realizacion, el uso como un medicamento comprende la etapa de transfectar celulas de mamffero, preferentemente transfeccion in vitro o ex vivo de celulas de mamffero, en especial transfectar in vitro celulas aisladas de un sujeto a tratar por el medicamento. Si el uso comprende la transfeccion in vitro de celulas aisladas, el uso como medicamento puede comprender ademas la (re)administracion de las celulas transfectadas al paciente. El uso de las moleculas de acido nucleico artificiales inventivas o del vector como un medicamento puede comprender ademas la etapa de seleccionar las celulas aisladas exitosamente transfectadas. Asf, puede ser beneficioso si el vector comprende ademas un marcador de seleccion. Tambien, el uso como medicamento puede comprender la transfeccion in vitro de celulas aisladas y la purificacion de un producto de expresion, es decir la protefna o peptido codificado a partir de estas celulas. Este peptido o protefna purificada se puede administrar subsecuentemente a un sujeto que lo necesite.
Metodos para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno como se describe anteriormente pueden comprender administrar la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion, el vector de acuerdo con la presente invencion, la celula de acuerdo con la presente invencion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion a un sujeto que lo necesite.
Adicionalmente, los metodos para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno pueden comprender la transfeccion de una celula con una molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion o con el vector de acuerdo con la presente invencion. Dicha transfeccion se puede llevar a cabo in vitro, ex vivo o in vivo. En una realizacion preferida, la transfeccion de una celula se lleva a cabo in vitro y la celula transfectada se administra a un sujeto que lo necesite, preferentemente a un paciente humano. De manera preferente, la celula a transfectar in vitro es una celula aislada del sujeto, de manera preferente del paciente humano. Asf, un metodo de tratamiento puede comprender las etapas de aislar una celula de un sujeto, preferentemente de un paciente humano, transfectar la celula aislada con la molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la presente invencion o el vector de acuerdo con la presente invencion, y administrar la celula transfectada al sujeto, preferentemente al paciente humano.
Metodos para tratar o prevenir un trastorno tal como se describe aquf son metodos de vacunacion o ,etodos de terapia genica como se describe anteriormente.
Como se describe anteriormente, el elemento 3'UTR inventivo es capaz de estabilizar una molecula de ARNm y/o de estabilizar y/o prolongar la produccion de protefnas a partir de una molecula de ARNm. De esta manera, en otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para estabilizar una molecula de ARN, preferentemente una molecula de ARNm, que comprende la etapa de asociar la molecula de ARN, en especial de ARNm, o un vector que codifica la molecula de ARN, a un elemento 3'UTR que comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de protefna tal como se arriba en la presente invencion.
Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo in vitro para mejorar, estabilizar y/o prolongar la produccion de protefnas a partir de una molecula de acido nucleico artificial o de un vector, preferentemente de una molecula de ARNm, y/o para estabilizar y/o prolongar la produccion de protefnas a partir de una molecula de acido nucleico artificial o de un vector, preferentemente de una molecula de ARNm, comprendiendo el metodo la etapa de asociar la molecula de acido nucleico o el vector, preferentemente la molecula de ARNm, a un elemento 3'UTR tal como se describe anteriormente en la presente invencion.
El termino “asociar la molecula de acido nucleico artificial o el vector a un elemento 3'UTR” en el contexto de la presente invencion preferentemente significa asociar funcionalmente o combinar funcionalmente la molecula de acido nucleico artificial o el vector con el elemento 3'UTR. Esto significa que la molecula de acido nucleico artificial o el vector y el elemento 3'UTR, preferentemente el elemento 3'UTR como se describe anteriormente, se asocian o acoplan de forma que la funcion del elemento 3'UTR, por ejemplo, se ejerce la funcion de estabilizacion de la produccion de ARN y/o protemas. Tfpicamente, esto significa que el elemento 3'UTR se integra en la molecula de acido nucleico artificial o el vector, preferentemente la molecula ARNm, 3' a un marco de lectura abierto, de manera preferente inmediatamente 3' a un marco de lectura abierto, de manera preferente entre el marco de lectura abierto y una secuencia poli(A) o una senal de poliadenilacion. Preferentemente, el elemento 3'UTR se integra en la molecula de acido nucleico artificial o el vector, de manera preferente el ARNm, como 3'UTR, es decir de forma que el elemento 3'UTR es la 3'UTR de la molecula de acido nucleico artificial o el vector, de manera preferente el ARNm, de forma que se extiende desde el lado 3' del marco de lectura abierto al lado 5' de una secuencia poli(A) o una senal de poliadenilacion, opcionalmente unido a traves un ligante corto, tal como una secuencia que comprende o consiste en uno o mas sitios de restriccion. De esta manera, preferentemente el termino “asociar la molecula de acido nucleico artificial o el vector con un elemento 3'UTR” significa asociar funcionalmente el elemento 3'UTR con un marco de lectura abierto situado dentro de la molecula de acido nucleico artificial o el vector, de manera preferente dentro de la molecula de ARNm. La 3'UTR y el ORF son como se describen en lo anterior para la molecula de acido nucleico artificial acuerdo con la presente invencion, por ejemplo preferentemente el ORF y la 3'UTR son heterologos, esto es derivados de genes diferentes, como se describe anteriormente.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona el uso in vitro de un elemento 3'UTR, preferentemente del elemento 3'UTR como se describe anteriormente, para incrementar la estabilidad de una molecula de ARN, preferentemente de ARNm, donde el elemento 3'UTR comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica tal como se ha definido anteriormente.
Ademas, la presente invencion proporciona el uso in vitro de un elemento 3'UTR, preferentemente el elemento 3'UTR como se describe anteriormente, para incrementar la produccion de protefnas a partir de una molecula de acido nucleico o un vector, de manera preferente una molecula de ARNm, y/o para estabilizar y/o prolongar la produccion de protefna a partir de una molecula de acido nucleico artificial o una molecula vector, de manera preferente de una molecula de ARNm, donde el elemento 3'UTR comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica o de una variante de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica como se describe anteriormente.
Los usos de acuerdo con la presente invencion comprenden preferentemente asociar la molecula de acido nucleico, el vector o el ARN con el elemento 3'UTR como se describe anteriormente.
Los compuestos e ingredientes de la composicion farmaceutica inventiva tambien se pueden fabricar y tratar separadamente entre sf. De esta manera, la invencion se refiere ademas a un kit o kit de partes que comprende una molecula de acido nucleico artificial de acuerdo con la invencion, un vector de acuerdo con la invencion, una celula de acuerdo con la invencion y/o una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion. De manera preferente, tal kit o kit de partes pueden comprender ademas instrucciones de uso, celulas para la transfeccion, un adyuvante, medios para la administracion de la composicion farmaceutica, un portador farmaceuticamente aceptable y/o una solucion farmaceuticamente aceptable para la disolucion o dilucion de la molecula de acido nucleico artificial, el vector, las celulas o la composicion farmaceutica.
Las siguientes Figuras, Secuencias u Ejemplos se proponen para ilustrar la invencion. No deben entenderse como limitativas de su alcance.
Las Figuras 1 a 3 muestran secuencias que codifican ARNm que pueden obtenerse por transcripcion in vitro. Se emplean las siguientes abreviaturas:
• rpl32: 5'-UTR de protema ribosomica grande humana 32 sin el tracto 5' terminal de oligopirimidina
• PpLuc (GC): secuencia de ARNm enriquecida en GC que codifica para luciferasa de Photinus pyralis
• A64: secuencia poli(A) de 64 adenilatos
• ag: centro, parte del complejo a de union a la 3'UTR de a-globina humana
• rps9: elemento 3'UTR derivado de la 3'UTR de protema ribosomica pequena humana 9
• C30: secuencia poli(C) con 30 citidilatos
• histoneSL: una secuencia tallo-bucle de histona tomada de Cakmakci, Lerner, Wagner, Zheng, & William F Marzluff, 2008. Mol. Cell. Biol. 28(3):1182-94;
• albumin: 3'UTR de albumina humana.
Fig. 1: muestra la secuencia que codifica el ARNm rpl32 - PpLuc (GC) - A64 - C30 - histoneSL (SEQ ID NO: 8) Fig. 2: muestra la secuencia que codifica el ARNm rpl32 - PpLuc (GC) - ag - A64 - C30 - histoneSL (SEQ ID NO: 9).
La parte central de union al complejo a de la 3'-UTR de a-globina humana se inserto entre ORF y la poli (A). El ORF de PpLuc (GC) esta resaltado en cursiva. El elemento 3'-UTR derivado de a-globina esta subrayado. Fig. 3: secuencia de ARNm de rpl32 - PpLuc (GC) - rps9 - A64 - C30 - hSL (SEC ID NO: 7). La 3'-UTR de la protefna ribosomica pequena 9 se inserto entre ORF y poli (A). El ORF de PpLuc (GC) esta resaltado en cursiva, el elemento 3'UTR derivado de rps9 esta subrayado.
Fig. 4: muestra que la 3'-UTR de la protefna ribosomica pequena 9 aumenta notablemente la expresion de la protefna del ARNm. Se examino el efecto de la 3'-UTr inventiva de protefna ribosomica pequena 9 humana sobre la expresion de luciferasa a partir de ARNm, en comparacion con la expresion de luciferasa de un ARNm que carece de 3'UTR o que contiene la 3'-UTR de a-globina humana. Asf, diferentes ARNm fueron transfectados en fibroblastos dermicos humanos (HDF) por lipofeccion. Los niveles de luciferasa se midieron a las 6, 24, 48 y 72 horas despues de la transfeccion. La luciferasa se expreso claramente a partir de un ARNm que carece de 3'UTR. Sin embargo, la expresion de luciferasa no aumento con la conocida 3'-UTR de a-globina. En contraste, la 3'UTR de la protefna ribosomica pequena 9 aumento considerablemente la expresion de luciferasa. Los datos se muestran graficamente como media RLU ± SEM (unidades de luz relativas ± error estandar) para transfecciones por triplicado. Las RLU se resumen en el Ejemplo 5.1.
Fig. 5: muestra la secuencia que codifica el ARNm rpl32 - PpLuc (GC) - albumina - A64 - C30 - histoneSL (SEQ ID NO: 206). La 3'UTR de albumina humana se inserto entre ORF y poli (A). El ORF de PpLuc (GC) esta resaltado en cursiva. El elemento 3'-UTR derivado de la albumina esta subrayado.
Fig. 6: muestra que las 3'UTR derivadas de los genes de protefna ribosomica murina rps21, rps29, rps9, rps27, rps28, rps19, rpl35a, rpl13, rpl36 y rpl23a aumentan la expresion de la protefna a partir del ARNm en celulas HDF (fibroblastos dermicos humanos) al menos hasta el el mismo grado que un ARNm que comprende la 3'UTR del gen de albumina, que ya demostro aumentar la expresion de protefnas del ARNm (documento WO2013143698).
Fig. 7: muestra que las 3'UTR derivadas de los genes de protefna ribosomica murina rps21, rps29, rps9, rps27, rps28, rps19, rpl35a, rpl13, rpl36 y rpl23a aumentan la expresion de protefnas del ARNm en celulas HeLa al menos en la misma medida que un ARNm que comprende la 3'UTR del gen de albumina, que ya se demostro que aumenta la expresion de protefnas del ARNm (documento WO2013143698).
Fig. 8: muestra que las 3'UTR derivadas de los genes de protefna ribosomica murina rpl23, uba52, rpl22l1, rpl36a, rps4x, rpl27, rpl3, rps23, rps13, rpl26, rps17, rps18, rps8, rps13, rpl11 y rpl38, rps17, rps18, rps8, rps13, rpl11, rpl11 y rpl38 aumentan la expresion de protefna a partir de ARNm en celulas HDF (fibroblastos dermicos humanos) al menos en la misma medida que un ARNm que comprende la 3'UTR del gen de albumina, que ya mostro aumentar la expresion de protefnas del ARNm (documento WO2013143698).
Fig. 9: muestra que las 3'UTR derivadas de los genes de protefna ribosomica murina rpl23, uba52, rpl22l 1, rpl36a, rps4x, rpl27, rpl3, rps23, rps13, rpl26, rps17, rps18, rps8, rps13, rpl11 y rpl38, rps17, rps18, rps8, rps13, rpl11, rpl11 y rpl38 aumentan la expresion de protefna a partir de ARNm en celulas HeLa al menos en la misma medida que un ARNm que comprende la 3'UTR del gen de albumina, que ya demostro aumentar la expresion de protefnas del ARNm (WO2013143698).
Ejemplos
1. Preparacion de plantillas de ADN
Se construyo un vector para la transcripcion in vitro que contenfa un promotor T7 seguido por una secuencia enriquecida en GC que codifica la luciferasa de Photinus pyralis (PpLuc(GC)). La region no traducida 5' (5'-UTR) de la protefna ribosomica grande 32 se inserto 5' de PpLuc(GC). Se inserto una secuencia poli(A) A64, seguida de C30 y una secuencia tallo-bucle de histona 3' de PpLuc(GC). La secuencia de tallo-bucle de histona fue seguida por un sitio de restriccion utilizado para la linealizacion del vector antes de la transcripcion in vitro. El ARNm obtenido a partir de este vector por transcripcion in vitro se designa "rpl32 - PpLuc (GC) - A64 - C30 - histoneSL".
Este vector se modifico para incluir las secuencias no traducidas 3' del marco de lectura abierto (3'UTR). En resumen, se han generado vectores que comprenden las siguientes secuencias de codificacion de ARNm (algunas de las secuencias de codificacion de ARNm se representan como ejemplos en las Figuras 1 a 3):
rpl32 - PpLuc(GC) - A64 - C30 - histoneSL (SEQ ID NO:8, Fig. 1)
rpl32 - PpLuc(GC) - ag - A64 - C30 - histoneSL (SEQ ID NO:9, Fig. 2)
rpl32 - PpLuc(GC) - rps9 - A64 - C30 - histoneSL (SEQ ID NO:7, Fig. 3)
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps21 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps29 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps9 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps27 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps28 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps19 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rpl35a - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(GC) - rpl13 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rpl36 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rpl23a - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(GC) - rpl23 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - uba52 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(GC) - rpl22l1 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rpl36a - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps4x - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(GC) - rpl27 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rpl3 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps23 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps13 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(GC) - rpl26 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps17 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps18 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - Fau - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rps13 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(GC) - rpl11 - A64 - C30 - histoneSL
rpl32 - PpLuc(Gc) - rpl38 - A64 - C30 - histoneSL
2. Transcripcion in vitro
La plantilla de ADN de acuerdo con el Ejemplo 1 se linealizo y se transcribio in vitro utilizando la T7-Polimerasa. La plantilla de ADN luego se digirio por tratamiento de ADNasa. Los transcriptos de ARNm contenfan una la estructura cap 5' obtenida agregando un exceso de N7-Metil-Guanosin-5'-Trifosfato-5'-Guanosina a la reaccion de transcripcion. El ARNm asf obtenido se purifico y se resuspendio en agua.
3. Expresion de luciferasa por lipofeccion de ARNm
Se sembraron fibroblastos dermicos humanos (HDF) o celulas HeLa en placas de 24 pocillos tres dfas antes de la transfeccion a una densidad de 3104 celulas por pocillo en medio (medio RPMI 1640 con L-glutamina y Hepes 25 mM (Lonza, Basilea, Suiza), donde se anadio 10% FCS, 1% Pen/Strep, 1% Glutamina). Inmediatamente antes de la lipofeccion, las celulas se lavaron en Opti-MEM. Las celulas se sometieron a lipofeccion con 25 ng de ARNm que codifica PpLuc por pocillo complejado con Lipofectamine2000. El ARNm que codifica la luciferasa de Renilla reniformis (RrLuc) se transfecto junto con el ARNm de PpLuc para controlar la eficacia de la transfeccion (2,5 ng de ARNm de RrLuc por pocillo). 90 minutos despues del inicio de la transfeccion, el Opti-MEM se cambio por medio. 6, 24, 48 y 72 horas despues de la transfeccion, se aspiro el medio y las celulas se lisaron en 100 ml de tampon de lisis (tampon de lisis pasivo, Promega). Los lisados se almacenaron a -80°C hasta que se midio la actividad luciferasa.
4. Medida de la luciferasa
La actividad de la luciferasa se midio como unidades de luz relativas (RLU) en un lector de placas Hidex Chameleon. La actividad de PpLuc se midio a los 2 segundos de tiempo de medicion utilizando 20 pl de lisado y 50 pl de tampon de luciferina (Beetle-Juice, PJK GmbH). La actividad de RrLuc se midio a los 2 segundos de tiempo de medicion utilizando 20 pl de lisado y 50 pl de tampon de coelenterazina (RenillaJuice, PJK GmbH).
5. Resultados
5.1 La 3'-UTR de protefna ribosomica prolonga la expresion de protefnas
Para investigar el efecto de la 3'UTR de los genes de protefna ribosomica en la expresion de la protefna del ARNm, se sintetizaron los ARNm con diferentes UTR: los ARNm caredan de una 3'UTR o conteman el centro, la porcion de union del complejo a de los 3'UTR de a-globina humana (ag), o contenfa la 3'UTR de la protefna ribosomica pequena 9 (rps9). Los ARNm codificadores de la luciferasa se transfectaron en fibroblastos dermicos humanos (HDF). Los niveles de luciferasa se midieron a las 6, 24, 48 y 72 horas despues de la transfeccion. A partir de estos datos, se calculo la protefna total expresada de 0 a 72 horas como el area bajo la curva (AUC) (ver Tabla 1 y Figura 4 siguientes).
Tabla 1:
Figure imgf000088_0002
La luciferasa se expreso claramente a partir de ARNm que carece de 3'UTR. Sin embargo, la expresion de luciferasa no aumento con la conocida 3'-UTR de a-globina. En contraste, la 3'UTR de la protefna ribosomica equena 9 aumento considerablemente la expresion de luciferasa.
5.2 La 3'UTR de genes de protefna ribosomica murina aumenta la expresion de protefna
Para investigar el efecto de las 3'UTR de genes de protefna ribosomica murina sobre la expresion de la protefna del ARNm, se sintetizaron ARNm con diferentes UTR: los ARNm conteman la 3'UTR de diferentes protefnas ribosomicas murinas (rps21, rps29, rps9, rps27, rps28, rps19, rpl35a, rpl13, rpl36 y rpl23a) y para comparar la 3'UTR de albumina, que se sabe que aumenta la expresion de protefnas del ARNm (WO2013143698). Los ARNm codificadores de luciferasa se transfectaron en fibroblastos dermicos humanos (HDF). Los niveles de luciferasa se midieron a las 24, 48 y 72 horas despues de la transfeccion. (ver la siguiente
Tabla 2:
Figure imgf000088_0001
Los resultados muestran que se expreso mas luciferasa a partir del ARNm que comprende una 3'UTR de protefnas ribosomicas murinas en comparacion con el ARNm que comprende la 3'UTR de albumina, que ya se ha descrito para aumentar la produccion de protefnas.
5.3 Las 3'UTR de genes de protefna ribosomica murina aumentan la expresion de protefna
Para investigar el efecto de las 3'UTR de los genes de protefna ribosomica murina sobre la expresion de la protefna del ARNm, se sintetizaron ARNm con diferentes UTR: los ARNm conteman la 3'UTR de diferentes protefnas ribosomicas murinas (rps21, rps29, rps9, rps27, rps28, rps19, rpl35a, rpl13, rpl36 y rpl23a) y para comparacion la 3'UTR de albumina. Los ARNm que codifican la luciferasa se transfectaron en celulas HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a las 24, 48 y 72 horas despues de la transfeccion. (Ver la siguiente Tabla 3 y la Figura 7).
Tabla 3:
Figure imgf000089_0001
Los resultados muestran que se expreso mas luciferasa a partir del ARNm que comprende una 3'UTR de protefnas ribosomicas murinas en comparacion con el ARNm que comprende la 3'UTR de albumina, que ya se ha descrito para aumentar la produccion de protefnas.
5.4 Las 3'UTR de genes de protefna ribosomica murina aumentan la expresion de protefna
Para investigar el efecto de las 3'UTR de genes de protefna ribosomica murina en la expresion de la protefna del ARNm, se sintetizaron los ARNm con diferentes UTR: los ARNm contenfan la 3'UTR de diferentes protefnas ribosomicas murinas (rpl23, uba52, rpl22l1, rpl36a, rps4x, rpl27, rpl3, rps23, rps13, rpl26, rps17, rps18, rps8, Fau, rps13, rpl11 y rpl38) y para comparacion la 3'uTr de albumina. Los ARNm codificadores de luciferasa se transfectaron en fibroblastos dermicos humanos (HDF). Los niveles de luciferasa se midieron a las 24, 48 y 72 horas despues de la transfeccion. (ver la siguiente Tabla 4 y la Figura 8).
Tabla 4:
Figure imgf000089_0002
Los resultados muestran que se expreso mas luciferasa a partir del ARNm que comprende una 3'UTR de protefnas ribosomicas murinas en comparacion con el ARNm que comprende la 3'-UTR de albumina, que ya se ha descrito para aumentar la produccion de protefnas.
5.5 Las 3'UTR de genes de protefna ribosomica murina aumentan la expresion de protefnas
Para investigar el efecto de las 3'UTR de los genes de protefna ribosomica murina en la expresion de la protefna del ARNm, se sintetizaron ARNm con diferentes UTR: ARNm contenfan la 3'UTR de diferentes protefnas ribosomicas murinas (rpl23, uba52, rpl122l1, rpl36a, rps4x, rpl27, rpl3, rps23, rps13, rpl26, rps17, rps18, rps8, Fau, rps13, rpl11 y rpl38) y para comparacion 3'UTR de albumina. Los ARNm que codifican la luciferasa se transfectaron en celulas HeLa. Los niveles de luciferasa se midieron a las 24, 48 y 72 horas despues de la transfeccion. (ver la siguiente Tabla 5 y la Figura 9).
Tabla 5:
Figure imgf000090_0001
Los resultados muestran que se expreso mas luciferasa a partir del ARNm que comprende una 3'UTR de protefnas ribosomicas murinas en comparacion con el ARNm que comprende la 3'-UTR de albumina, que ya se ha descrito para aumentar la produccion de protefnas.

Claims (25)

Reivindicaciones
1. Molecula de acido nucleico artificial que comprende
a. al menos un marco de lectura abierto (ORF);
b. al menos un elemento de region 3'-no traducida (elemento 3'UTR) que comprende una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica o de una variante funcional de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica, donde dicha variante funcional es al menos un 80% identica a dicha 3'UTR de un gen de protefna ribosomica y
c. una 5'UTR como un elemento adicional 5'-terminal, donde la 5'UTR es una 5' TOP-UTR que no comprende un motivo 5'-TOP.
2. Molecula de acido nucleico artificial segun la reivindicacion 1, donde el al menos un elemento 3'UTR aumenta, estabiliza y/o prolonga la produccion de protefnas de dicha molecula de acido nucleico artificial.
3. Molecula de acido nucleico artificial segun la reivindicacion 1 o 2, donde la 3'UTR es heterologa al ORF.
4. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el al menos un elemento 3'UTR comprende una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica eucariota, preferentemente de la 3'UTR de un gen de protema ribosomica de vertebrado, mas preferentemente de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica de mamffero, incluso de manera mas preferente de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica de primate, en particular de un gen de protefna ribosomica humana o de un gen de protefna ribosomica de roedor, en particular de un gen de protefna ribosomica murino.
5. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde
el marco de lectura abierto (ORF) no codifica un gen reporter o no se deriva de un gen reporter, preferiblemente el gen reporter no se selecciona del grupo consistente en protefnas globina (particularmente beta-globina), protefna luciferasa, beta-glucuronidasa (GUS) y protefnas GFP o variantes de las mismas, preferiblemente no EGFP, o variantes que tengan al menos un 70% de identidad de secuencia con una protefna globina, una protefna luciferasa o una protefna GFP;
el marco de lectura abierto (ORF) no codifica una protefna ribosomica, preferiblemente no una protefna ribosomica eucariota, donde la protefna ribosomica no se selecciona preferiblemente de protefna ribosomica S6 (RPS6), protefna ribosomica L36 (RPL36AL) o protefna ribosomica S16 (RPS16); o
donde la 3'-UTR no se deriva de un virus.
6. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la 3'UTR, preferiblemente la molecula de acido nucleico artificial, no comprende una secuencia poli(A) o una senal de poliadenilacion, o donde la 3'UTR, preferiblemente la molecula de acido nucleico artificial, comprende ademas una secuencia poli(A) y/o una senal de poliadenilacion, donde la secuencia poli(A) o la senal de poliadenilacion se localiza preferiblemente en el extremo 3' al elemento 3'-UTR.
7. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el al menos un elemento 3'UTR comprende una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de una secuencia seleccionada del grupo consistente en L9 (RPL9), protefna ribosomica L3 (RPL3), protefna ribosomica L4 (RPL4), protefna ribosomica L5 (RPL5), protefna ribosomica L6 (RPL6), protefna ribosomica L7 (RPL7), protefna ribosomica L7a (RPL7A), protefna ribosomica L11 (RPL11), protefna ribosomica L12 (RPL12), protefna ribosomica L13 (RPL13), protefna ribosomica L23 (RPL23), protefna ribosomica L18 ( RPL18), protefna ribosomica L18a (RPL18A), protefna ribosomica L19 (RPL19), protefna ribosomica L21 (RPL21), protefna ribosomica L22 (RPL22), protefna ribosomica L23a (RPL23A), protefna ribosomica L17 (RPL17), protefna ribosomica L24 (RPL24) ), protefna ribosomica L26 (RPL26), protefna ribosomica L27 (RPL27), protefna ribosomica L30 (RPL30), protefna ribosomica L27a (RPL27A), protefna ribosomica L28 (RPL28), protefna ribosomica L29 (RPL29), protefna ribosomica L31 (RPL31), protefna ribosomica L32 (RPL32), protefna ribosomica L35a (RPL35A), protefna ribosomica L37 (RPL37), protefna ribosomica L37a (RPL37A), protefna ribosomica L38 (RPL38), protefna ribosomica L39 (RPL39), protefna ribosomica grande, P0 (RPLP0), protefna ribosomica grande, P1 (RPLP1), protefna ribosomica grande, P2 (RPLP2), protefna ribosomica S3 (RPS3), protefna ribosomica S3A (RPS3A), protefna ribosomica S4, ligada a X (RPS4X), protefna ribosomica S4 ligada a Y 1 (RPS4Y1), protefna ribosomica S5 (RPS5), protefna ribosomica S6 (RPS6), protefna ribosomica S7 (RPS7), protefna ribosomica S8 (RPS8), protefna ribosomica S9 (RPS9), protefna ribosomica S10 (RPS10), protefna ribosomica S11 (RPS11), protefna ribosomica S12 (RPS12), protefna ribosomica S13 (RPS13), protefna ribosomica S15 (RPS15), protefna ribosomica S15a (RPS15A), protefna ribosomica S16 (RPS16), protefna ribosomica S19 (RPS19), protefna ribosomica S20 (RPS20), protefna ribosomica S21 (RPS21), protefna ribosomica S23 (RPS23), protefna ribosomica S25 (RPS25), protefna ribosomica S26 (RPS26), protefna ribosomica S27 (RPS27), protefna ribosomica S27a (RPS27a), protefna ribosomica S28 (RPS28), protefna ribosomica S29 (RPS29), protefna ribosomica L15 (RPL15), protefna ribosomica S2 (RPS2), protefna ribosomica L14 (RPL14), protefna ribosomica S14 (RPS14), protefna ribosomica L10 (RPL10), protefna ribosomica L10a ( RPL10A), protefna ribosomica L35 (RPL35), protefna ribosomica L13a (RPL13A), protefna ribosomica L36 (RPL36), protefna ribosomica L36a (RPL36A), protefna ribosomica L41 (RPL41), protefna ribosomica S18 (RPS18), protefna ribosomica S24 (RPS24), protefna ribosomica L8 (RPL8), protefna ribosomica L34 (RPL34), protefna ribosomica S17 (RPS17), protefna ribosomica SA (RPSA), ubiquitina A-52 residuo producto de fusion de protefna ribosomica 1 (UBA52), virus del sarcoma Finkel-Biskis-Reilly murino (FBR-MuSV) expresado de forma ubicua (FAU), protefna ribosomica tipo L221 (RPL22L1), protefna ribosomica S1 7 (RPS17), protefna ribosomica tipo L39 (RPL39L), protefna ribosomica tipo L10 (RPL10L), protefna ribosomica tipo L36a (RPL36AL), protefna ribosomica tipo l3 (RPL3L), protefna ribosomica tipo S27 (RPS27L), protefna ribosomica tipo L26 1 (RPL26L1), protefna ribosomica tipo L7 1 (RPL7L1), protefna ribosomica L13a pseudogen (RPL13AP), protefna ribosomica L37a pseudogen 8 (RPL37AP8), protefna ribosomica S10 pseudogen 5 (RPS10P5), protefna ribosomica S26 pseudogen 11 (RPS26P11), protefna ribosomica L39 pseudogen 5 (RPL39P5), protefna ribosomica grande, p0 pseudogen 6 (RPLP0P6) y protefna ribosomica L36 pseudogen 14 (RPL36P14).
8. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el al menos un elemento 3'UTR comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico que tiene una identidad de al menos el 80%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 90%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 95%, incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente el 99% con una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID No: 10 a 205.
9. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende ademas una estructura cap 5', una secuencia poli(C), un tallo-bucle de histona y/o un motivo IRES.
10. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el tallo-bucle de histona comprende una secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.
11. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la molecula de acido nucleico artificial, preferiblemente el marco de lectura abierto, esta modificada al menos parcialmente en G/C, preferiblemente donde el contenido de G/C del marco de lectura abierto esta aumentado en comparacion con el marco de lectura abierto de tipo natural, y/o donde el marco de lectura comprende una region optimizada por codon, preferiblemente donde el marco de lectura abierto esta optimizado por codon.
12. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es una molecula de ARN, preferentemente de ARNm.
13. Vector que comprende
a. un marco de lectura abierto y/o un sitio de clonacion;
b. al menos un elemento de region 3'-no traducida (elemento 3'UTR) que comprende una secuencia de acido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica o de una variante funcional de la 3'UTR de un gen de protefna ribosomica, donde dicha variante funcional es al menos un 80% identica a dicha 3'UTR de un gen de protefna ribosomica y
c. una 5'UTR como un elemento adicional 5'-terminal, donde la 5'UTR es una 5' TOP-UTR que no comprende un motivo 5'-TOP.
14. Vector segun la reivindicacion 13, donde el marco de lectura abierto, el al menos un elemento 3'UTR y/o 5'UTR se caracteriza por cualquiera de las caracterfsticas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12 con respecto a la molecula de acido nucleico artificial.
15. Vector segun las reivindicaciones 13 o 14, que es un vector plasmido o un vector viral, preferentemente un vector plasmido.
16. Vector segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que comprende una molecula de acido nucleico acuerdo artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 2-12.
17. Celula que comprende la molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o el vector segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
18. Composicion farmaceutica que comprende la molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1-12, el vector segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 o la celula segun la reivindicacion 17.
19. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 18, que ademas comprende uno o mas vehfculos diluyentes y/o excipientes y/o uno o mas adyuvantes farmaceuticamente aceptables.
20. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1-12, vector segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, celula segun la reivindicacion 17 o composicion farmaceutica segun la reivindicacion 18 o 19, para su uso como un medicamento.
21. Molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1-12, vector segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, celula segun la reivindicacion 17 o composicion farmaceutica segun la reivindicacion 18 o 19, para su uso como una vacuna o para su uso en la terapia genica.
22. Metodo in vitro para aumentar, estabilizar y/o prolongar la produccion de protefnas de una molecula de acido nucleico artificial, preferiblemente de una molecula de ARNm o un vector, comprendiendo el metodo in vitro la etapa de asociar la molecula de acido nucleico, preferiblemente la molecula de ARNm o el vector, con un elemento 3'UTR, donde el elemento 3'UTR se caracteriza por cualquiera de las caracterfsticas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 con respecto a la molecula de acido nucleico artificial.
23. Uso de un elemento 3'UTR para mejorar, estabilizar y/o prolongar la produccion de protefnas a partir de una molecula de acido nucleico in vitro, preferiblemente de una molecula de ARNm o un vector, donde el elemento 3'UTR se caracteriza por cualquiera de las caracterfsticas como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 con respecto a la molecula de acido nucleico artificial.
24. Kit o kit de partes que comprende una molecula de acido nucleico artificial segun cualquiera de las reivindicaciones 1-12, un vector segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, una celula segun la reivindicacion 17 y/o una composicion farmaceutica segun las reivindicaciones 18 o 19.
25. Kit segun la reivindicacion 24, que comprende ademas instrucciones de uso, celulas para transfeccion, un adyuvante, un medio para la administracion de la composicion farmaceutica, un vehfculo farmaceuticamente aceptable y/o una solucion farmaceuticamente aceptable para la disolucion o dilucion de la molecula de acido nucleico artificial, el vector, las celulas o la composicion farmaceutica.
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