ES2896755T3 - Composiciones que comprenden polinucleótidos sintéticos que codifican proteínas relacionadas con CRISPR y ARNsg sintéticos y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido sintético donde la uridina se reemplaza al 100 % por 1-metil-pseudouridina, el polinucleótido sintético que comprende una primera región de nucleósidos enlazados, codificando dicha primera región una proteína relacionada con CRISPR seleccionada de entre el grupo que consiste en proteínas relacionadas con CRISPR que tienen cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO 61, 7, 8, 9, 62, 63, 64 o 65 o codificadas por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO 1-6, o 110-112.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden polinucleótidos sintéticos que codifican proteínas relacionadas con CRISPR y ARNsg sintéticos y procedimientos de uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está dirigida a composiciones que comprenden y procedimientos de uso de polinucleótidos sintéticos y ARN de guía corta (ARNsg). Los polinucleótidos sintéticos son, por ejemplo, ARN modificado sintético que codifica proteínas relacionadas con CRISPR, por ejemplo, proteínas de fusión del dominio efector dCAS9 y dCAS9. Los ARNsg sintéticos se dirigen a un gen de interés. Los polinucleótidos sintéticos y los ARNsg sintéticos se pueden usar para modular la transcripción, por ejemplo, en entornos terapéuticos y/o clínicos y de investigación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) de bacterias y arqueas se basan en ARN CRISPR (ARNcr) en un complejo con proteínas asociadas a CRISPR (CAS) para dirigir la degradación de secuencias complementarias presentes en el ADN viral y plásmido invasor (Mali y col. Science. 2013. 339:823-826.

En los sistemas de CRISPR/Cas tipo II, se producen ARNcr usando un mecanismo diferente donde un ARN transactivador (ARNcrtra) complementario con las secuencias de repetición en el pre-ARNcr desencadena el procesamiento mediante una ARNasa III específica de cadena doble en presencia de la proteína Cas9. CAS9 (anteriormente CSN1) es la proteína clave en los sistemas CRISPR de tipo II y se cree que es la única proteína responsable del silenciamiento guiado por ARNcr de ADN extraño (Jinek y col. Science. 2012. 337:816-821. También se plantea la hipótesis de que la proteína CAS9 está involucrada tanto en la maduración del ARNcr como en la interferencia del ADN guiada por ARNcr (Jinek y col. Science. 2012. 337:816-821.

La familia de endonucleasas CAS9 se puede programar con moléculas de ARN individuales para escindir sitios de ADN específicos que pueden usarse para desarrollar un sistema versátil dirigido por ARN para generar rupturas de ADNds para la selección y edición del genoma (Jinek y col. Science. 2012. 337:816-821. Este uso de CAS9 podría mejorar la facilidad de la ingeniería del genoma.

The Church Lab diseñó el sistema CRISPR de bacterias y arqueas tipo II para que funcione con ARN guía personalizado (ARNg) en células humanas (Mali y col. Science. 2013. 339:823-826.

Se ha demostrado que la fusión de la proteína dCas9 catalíticamente inactiva asociada a CRISPR con distintos dominios efectores (por ejemplo, VP64, p65AD, KRAB y Mxi1) permite la represión o activación de la transcripción en células humanas y de levadura, con el sitio de entrega determinado únicamente por un ARN guía corto coexpresado (ARNsg). El acoplamiento de dCas9 a un dominio represor transcripcional puede silenciar la expresión de múltiples genes endógenos, sin dianas externas detectables como se verifica mediante análisis de secuencia de ARN. (Qi y col. Cell. 2013. 152:1173-1183)

Un ejemplo de una proteína Cas9 catalíticamente inactiva es la proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes mutante (D10A, H840A), normalmente denominada dCAS9 (Qi y col. Cell. 2013. 152:1173-1183; Gilbert y col. Cell. 2013. 154:1-10). Se ha descrito un Streptococcus thermophiles Cas9 con 2 dominios de endonucleasa y sustitución de un solo aminoácido (D31A, H858A) que también resultó en Cas9 catalíticamente inactivo (Sapranauskas y col. Nucleic Acids Research. 2011. 39:9275-9282).

Otras publicaciones que describen los sistemas CRISPR, Cas9 y dCas9 incluyen las siguientes Cong y col (2013); Jinek y col. (2012); Lei y col. (2013); Gilbert y col. (2013); Pérez-Pinela y col (2013); Maider y col (2013).

Se ha demostrado que ciertas secuencias de ARNm modificadas tienen el potencial de ser terapéuticas con beneficios más allá de simplemente evadir, evitar o disminuir la respuesta inmune. Dichos estudios se detallan en las publicación internacional de solicitudes pendientes de tramitación publicadas n.° WO2012019168 depositada el 5 de agosto de 2011 y publicación internacional n° WO2012045075 depositada el 3 de octubre de 2011, publicación internacional n° WO2013052523 depositada el 3 de octubre de 2011.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Lo que antecede y otros objetivos, características y ventajas serán evidentes a partir de la siguiente descripción, tal como se ilustra en los dibujos adjuntos, en las cuales caracteres de referencia similares se refieren a las mismas partes en las distintas vistas. Los dibujos no están necesariamente a escala y, en cambio, se coloca un énfasis en la ilustración de los principios de diversas realizaciones de la invención.

La FIG. 1 es un esquema de un polinucleótido sintético de la presente invención.

La FIG. 2 muestra los resultados de anti-FLAG Western e inmunoprecipitación realizadas en los lisados de células HeLa transfectadas con construcciones o controles Cas9 marcados con FLAG.

La FIG. 3 muestra los resultados de un análisis western de células HeLa que se transfectaron con ARNm de Gilbert Cas9 marcado con HA utilizando ARNm de Cas9 marcado con Trilink-HA como control positivo.

La FIG. 4 muestra los resultados de una cuantificación del péptido LC-PRM Cas9 en lisados celulares de células HeLa transfectadas con construcciones Maeder y Gilbert Cas9 frente a células HeLa no tratadas. Cada gráfico muestra la cuantificación de un fragmento de péptido de la construcción Cas9. La Figura 4A representa la cuantificación del péptido GNELALPSK (SEQ ID NO: 120). La Figura 4B representa la cuantificación del péptido YFDTTIDR (SEQ ID nO: 121). La Figura 4C representa la cuantificación del péptido IPYYVGPLAR (SEQ ID No : 122).

La FIG. 5 muestra los resultados de anti-FLAG Western e inmunoprecipitación realizados en los lisados de hígados de ratón de animales a los que se les administró 14 pg de Cas9 lNp (MC3) o simulacro. WCE = extracto de células enteras (Whole Cell Extract). IP = inmunoprecipitación con perlas de agarosa M2 (Sigma). Escalera = Consulte el marcador de proteínas preteñido Blue Plus 2™ (LifeTech).

Descripción detallada

La presente invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que los ARNm pueden expresarse en el citoplasma y translocarse al núcleo. La tecnología de ARNm de la invención es sorprendentemente adecuada para el suministro de proteínas intracelulares. La tecnología de ARNm de la invención también es adecuada para el suministro de múltiples ARNm. Las metodologías de la invención evitan o esquivan problemas asociados con estrategias de terapia génica convencionales, tales como toxicidad, integración de ADN en el genoma del huésped y similares. Las metodologías de la invención son particularmente adecuadas para la administración de una pluralidad de ARNm, sin inducir un sistema inmune innato y sin efectos secundarios indeseables asociados con estrategias convencionales de terapia génica. En particular, la tecnología de administración de ARNm de la invención facilita la expresión tanto del ARNm que codifica proteínas relacionadas con CRISPR, por ejemplo, Cas9, dCas9 y variantes de las mismas, en combinación con uno o más ARN guía (ARNsg) para permitir la regulación génica in vitro e in vivo.Usando composiciones farmacéuticas basadas en ARNm, la tecnología proporciona aplicaciones terapéuticas de las tecnologías CRISPR que antes eran inalcanzables.

Los datos presentados en esta invención evidencian que es posible lograr la expresión intracelular de proteínas relacionadas con CRISPR, incluidas proteínas diseñadas para incluir secuencias reguladoras que facilitan la regulación de la expresión de proteínas, y las secuencias dirigidas a ARNm correspondientes (es decir, ARNsg). Los datos presentados en esta invención demuestran que es posible lograr la expresión de proteínas intracelulares de proteínas relacionadas con CRISPR, en particular, mediante la administración in vivo de composiciones farmacéuticas que contienen ARNm modificados que codifican tales proteínas.

La invención se define en las reivindicaciones. Por lo tanto, la presente invención proporciona un polinucleótido sintético donde la uridina se reemplaza al 100 % por 1-metil-pseudouridina, el polinucleótido sintético que comprende una primera región de nucleósidos enlazados, codificando dicha primera región una proteína relacionada con CRISPR seleccionada de entre el grupo que consiste en proteínas relacionadas con CRISPR que tienen cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO 61, 7, 8, 9, 62, 63, 64 o 65 o codificadas por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO 1-6, o 110-112.

Otros aspectos de la invención también se definen en las reivindicaciones.

En esta invención se describen composiciones (incluidas composiciones farmacéuticas) y procedimientos para el diseño, preparación, fabricación y/o formulación de polinucleótidos sintéticos que codifican una o más proteínas relacionadas con CRISPR, por ejemplo, dCAS9 y/o proteínas de fusión dCAS9-efectoras. También se describen en esta invención composiciones (incluidas composiciones farmacéuticas) y procedimientos para el diseño, preparación, fabricación y/o formulación de uno o más ARN guía pequeños sintéticos ("ARNsg") que se dirigen a un gen de interés. Tanto los polinucleótidos sintéticos como los ARNsg se fabrican típicamente mediante transcripción in vitro. El polinucleótido sintético y el ARNsg pueden modificarse, por ejemplo, comprender al menos un nucleótido modificado. También se describe en esta invención un procedimiento de modulación de la expresión de un gen de interés utilizando un polinucleótido sintético que codifica una proteína relacionada con CRISPR y un ARNsg que se dirige al gen de interés. Se incluyen procedimientos in vitro e in vivo, por ejemplo, procedimientos de tratamiento de una enfermedad correlacionada con la expresión del gen de interés. También se proporcionan sistemas, procedimientos, dispositivos y kits para la selección, diseño y/o utilización de los polinucleótidos sintéticos y ARNsg sintéticos descritos en esta invención.

Una limitación clave de los sistemas de CRISPR/inhibición/activación (CRISPR/I/A) descritos hasta la fecha es su dependencia del suministro de ADN por vectores virales para impulsar la transcripción intracelular (del ARNsg) y la transcripción y traducción de proteínas de fusión Cas9, dCas9 o dCas9 tales como dCas9-VP64 y dCas9-KRAB. Hay varias implicaciones de esta limitación para los sistemas in vivo que utilizan activación/represión transcripcional ya que esto requerirá una dosificación repetida. En primer lugar, el suministro de ADN por pseudovirus inducirá una activación inmune innata mensurable (por ejemplo, a través de TLR) y esto afectará la eficacia de la transfección y tendrá efectos secundarios indeseables. En segundo lugar, la dosificación repetida de cápsides virales podría inducir y probablemente inducirá una respuesta inmunitaria adaptativa en la dosificación repetida. En tercer lugar, el uso de ^a Dⁿ y el riesgo de dCas9 activado crónicamente representan un riesgo significativo de seguridad y toxicidad para la terapéutica in vivo.

El polinucleótido sintético modificado (p. ej., ARNm modificado) presenta una plataforma ideal para la traducción clínica de esta plataforma procariota. En esta invención se describen tecnologías para la administración segura de ARNm modificado in vivo que codifica la proteína relacionada con CRISPR, por ejemplo, dCA9, de una manera limitada en el tiempo y, potencialmente, dirigida al tipo celular. Además, el uso de ARNm modificado evitará el riesgo de una activación inmune innata significativa y disminuirá el riesgo de respuestas adaptativas.

I. Polinucleótidos sintéticos que codifican proteínas relacionadas con CRISPR

La presente divulgación proporciona polinucleótidos sintéticos que codifican una o más proteínas relacionadas con CRISPR, por ejemplo, proteínas de fusión dCAS9 y dCAS9. La expresión "polinucleótido", en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que comprenda un polímero de nucleótidos. Polinucleótidos ejemplares de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos treósicos (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados ( LNA, incluyendo LNA que tiene una configuración p-D-ribo, a-LNA que tiene una configuración a-L-ribo (un diastereómero de LNA), 2'-amino-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino y 2'-amino-a-LNA que tiene una funcionalización 2'-amino) o híbridos de los mismos.

El polinucleótido sintético puede ser un ARN mensajero sintético (ARNm). Tal como se usa en esta invención, el término "ARN mensajero" (ARNm) se refiere a cualquier polinucleótido, que puede ser sintético, que codifica un polipéptido, por ejemplo, una proteína relacionada con CRISPR, y que es capaz de traducirse para producir el polipéptido codificado in vitro. in vivo, in situ o ex vivo.En esta invención divulgación, el ARNm codifica una proteína relacionada con CRISPR, por ejemplo, proteínas de fusión dCAS9 y dCA9-efectoras (activador o inhibidor). A continuación se encuentran descripciones y secuencias adicionales de proteínas relacionadas con CRISPR.

La presente divulgación amplía el alcance de la funcionalidad de las moléculas de ARNm tradicionales al proporcionar polinucleótidos sintéticos que comprenden una o más modificaciones y/o alteraciones químicas que imparten propiedades útiles a los polinucleótidos, incluida la falta de una inducción sustancial de la respuesta inmune innata de una célula donde se introduce el polinucleótido. Tal como se usa en esta invención, una característica o modificación "estructural" es aquella donde dos o más nucleótidos enlazados se insertan, eliminan, duplican, invierten o aleatorizan en un polinucleótido sintético, construcción primaria o ARNmm sin modificación química significativa de los propios nucleótidos. Debido a que los enlaces químicos necesariamente se romperán y reformarán para efectuar una modificación estructural, las modificaciones estructurales son de naturaleza química y, por lo tanto, son modificaciones químicas. Sin embargo, las modificaciones estructurales darán como resultado una secuencia diferente de nucleótidos. Por ejemplo, el polinucleótido "ATCG" (SEQ ID NO: 123) puede modificarse químicamente a "AT-5meC-G" (SEQ ID NO: 124). El mismo polinucleótido se puede modificar estructuralmente de "ATCG" (SEQ ID NO: 123) a "ATCCCG" (SEQ ID NO: 125). Aquí, se ha insertado el dinucleótido "CC", dando como resultado una modificación estructural del polinucleótido.

Proteínas relacionadas con CRISPR

Los polinucleótidos sintéticos de la divulgación codifican una proteína relacionada con CRISPR. El término "proteína relacionada con CRISPR" incluye pero no se limita a proteínas de fusión CAS9, CSY4, dCAS9 y dominio dCAS9-efector (dominio activador y/o inhibidor). En las Tablas siguientes se encuentran ejemplos de secuencias de polipéptidos de proteínas y secuencias de polinucleótidos relacionadas con CRISPR.

La proteína relacionada con CRISPR puede ser de cualquier número de especies que incluyen, sin limitación, Streptococcus pyogenes, Listeria innocua y Streptococcus thermophilus.

El polinucleótido sintético puede codificar la secuencia de tipo silvestre de la proteína relacionada con CRISPR o una proteína relacionada con CRISPR variante. Las variantes se describen más detalladamente en esta invención. Como se describe con más detalle en esta invención, el polinucleótido sintético puede incluir el uso de codones de tipo silvestre o el uso de codones optimizados para una aplicación particular, por ejemplo, optimización de codones humanos para terapias humanas.

Según la presente divulgación, los polinucleótidos sintéticos comprenden al menos una primera región de nucleósidos enlazados que codifican al menos una proteína relacionada con CRISPR. En las Tablas siguientes se enumeran ejemplos de proteínas relacionadas con CRISPR. Para cualquier proteína relacionada con CRISPR en particular, pueden existir una o más variantes o isoformas. Los expertos en la técnica apreciarán que se describen en las Tablas regiones flanqueantes potenciales. Estas se codifican en cada transcripción ya sea en 5' (corriente arriba) o 3' (corriente abajo) del ORF o región de codificación. La región codificante se describe de manera definitiva y específica al enseñar la secuencia de la proteína. En consecuencia, las secuencias enseñadas flanqueantes que codifican la proteína se consideran regiones flanqueantes. También es posible caracterizar adicionalmente las regiones flanqueantes 5' y 3' utilizando una o más bases de datos o algoritmos disponibles. Las bases de datos tienen anotadas las características contenidas en las regiones flanqueantes de las transcripciones y estas están disponibles en la técnica.

La proteína relacionada con CRISPR puede ser dCAS9. Secuencias típicas se incluyen en las tablas siguientes.

La proteína relacionada con CRISPR puede ser una proteína de fusión del dominio efector dCAS9. El dominio efector puede ser un dominio de activación o un dominio de inhibición, dependiendo de la aplicación. Ejemplos de dominios efectores son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, KRAB, CSD, WRPW, VP64 o p65AD.

La proteína relacionada con CRISPR puede ser proteínas de fusión dCAS9-KRAB o dCAS9-VP64. Se proporcionan ejemplos de secuencias en las Tablas siguientes y en el listado de secuencias.

Otras construcciones útiles en varios aspectos de la divulgación incluyen las establecidas como SEQ ID NO: 1-9.

Arquitectura de polinucleótidos sintéticos

Los polinucleótidos sintéticos modificados o de la presente divulgación se distinguen del ARNm de tipo natural en sus características de diseño funcional y/o estructural que sirven para, como se evidencia en esta invención, superar los problemas existentes de producción efectiva de polipéptidos usando agentes terapéuticos basados en ácidos nucleicos.

La Figura 1 muestra una construcción primaria de polinucleótidos representativa 100 de la presente divulgación. Tal como se usa en esta invención, el término "construcción primaria" o "construcción de ARNm primario" se refiere a una transcripción de polinucleótidos que codifica uno o más polipéptidos de interés y que retiene suficientes características estructurales y/o químicas para permitir la traducción del polipéptido de interés codificado en el mismo. Las construcciones primarias pueden ser polinucleótidos de la divulgación. Cuando se modifica estructural o químicamente, la construcción primaria puede denominarse polinucleótidos sintéticos modificados o ARNmm.

Volviendo a la FIG. 1, la construcción primaria 100 aquí contiene una primera región de nucleótidos enlazados 102 que está flanqueada por una primera región flanqueante 104 y una segunda región flanqueante 106. Tal como se usa en esta invención, la "primera región" puede denominarse "región de codificación" o "región que codifica" o simplemente la "primera región". Esta primera región puede incluir, pero no se limita, al polipéptido codificado de interés, es decir, la proteína relacionada con CRISPR. El polipéptido de interés puede comprender en su extremo 5' una o más secuencias señal codificadas por una región de secuencia señal 103. La primera región flanqueante 104 puede comprender una región de nucleótidos enlazados que comprenden una o más secuencias 5' UTR completas o incompletas. La primera región flanqueante 104 también puede comprender una región de protección del extremo 5' 108. La primera región flanqueante 106 puede comprender una región de nucleótidos enlazados que comprenden una o más 3' UTR completas o incompletas. La segunda región flanqueante 106 también puede comprender una secuencia de descolado 3' 110.

Uniendo el extremo 5' de la primera región 102 y la primera región flanqueante 104 hay una primera región operativa 105. Tradicionalmente, esta primera región operativa comprende un codón de inicio. La región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de la traducción que incluya un codón de inicio.

Uniendo el extremo 3' de la primera región 102 y la segunda región flanqueante 106 hay una segunda región operativa 107. Tradicionalmente, esta segunda región operativa comprende un codón de parada. La segunda región operativa puede comprender alternativamente cualquier secuencia o señal de inicio de la traducción que incluya un codón de parada. También se pueden usar múltiples codones de parada en serie.

En algunos casos, el polinucleótido sintético, la construcción primaria o el ARNmm incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 100.000 nucleótidos (p. ej., de 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 1000, de 30 a 1.500, de 30 a 3.000, de 30 a 5.000, de 30 a 7.000, de 30 a 10.000, de 30 a 25.000, de 30 a 50.000, de 30 a 70.000, de 100 a 250, de 100 a 500, de 100 a 1,000, de 100 a 1,500, de 100 a 3,000, de 100 a 5,000, de 100 a 7,000, de 100 a 10,000, de 100 a 25,000, de 100 a 50,000, de 100 a 70,000, de 100 a 100,000, de 500 a 1,000, de 500 a 1,500, de 500 a 2,000, de 500 a 3,000, de 500 a 5,000, de 500 a 7,000, de 500 a 10,000, de 500 a 25,000, de 500 a 50,000, de 500 a 70,000, de 500 a 100,000, de 1,000 a 1,500, de 1,000 a 2,000, de 1,000 a 3,000, de 1,000 a 5,000, de 1,000 a 7.000, de 1,000 a 10,000, de 1,000 a 25,000, de 1,000 a 50,000, de 1,000 a 70,000, f de 1,000 a 100,000, de 1,500 a 3.000, de 1,500 a 5,000, de 1,500 a 7,000, de 1,500 a 10,000, de 1,500 a 25,000, de 1,500 a 50,000, de 1,500 a 70.000, de 1,500 a 100,000, de 2,000 a 3,000, de 2.000 a 5.000, de 2.000 a 7.000, de 2.000 a 10.000, de 2.000 a 25.000, de 2.000 a 50.000, de 2.000 a 70.000 y de 2.000 a 100.000).

Generalmente, la longitud de la primera región que codifica el polipéptido de interés, p. ej., la proteína relacionada con CRISPR de la presente divulgación es mayor que aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (p. ej., al menos o mayor que aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 o hasta e incluyendo 100.000 nucleótidos).

Según la presente divulgación, la primera y segunda regiones flanqueantes pueden variar independientemente de 15 a 1000 nucleótidos de longitud (por ejemplo, más de 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140), 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 y 900 nucleótidos o al menos 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 y 1000 nucleótidos).

Según la presente divulgación, la secuencia de descolado 3' puede variar desde ausente hasta 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 nucleótidos). Cuando la secuencia de descolado es una cola de poliA, la longitud puede determinarse en conjuntos de o en función de la unión de la proteína de unión a poliA. En este caso, la cola de poliA es lo suficientemente larga para unir al menos 4 monómeros de proteína de unión de poliA. Los monómeros de la proteína de unión a poliA se unen a tramos de aproximadamente 38 nucleótidos. Como tal, se ha observado que las colas de poliA de aproximadamente 80 nucleótidos y 160 nucleótidos son funcionales.

Según la presente divulgación, la región de protección del extremo 5' puede comprender una sola capa o una serie de nucleótidos que forman la capa. La región de protección puede tener una longitud de 1 a 10, por ejemplo, 2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, o al menos 2, o 10 o menos nucleótidos de longitud. En algunos casos, la región de protección está ausente.

Según la presente divulgación, la primera y segunda regiones operativas pueden variar de 3 a 40, por ejemplo, 5-30, 10-20, 15, o al menos 4, o 30 o menos nucleótidos de longitud y pueden comprender, además de un codón de inicio y/o parada, una o más señales y/o secuencias de restricción.

Polinucleótidos sintéticos cíclicos

Según la presente divulgación, un polinucleótido sintético puede ciclarse o concatemerizarse para generar una molécula competente en traducción para ayudar a las interacciones entre las proteínas de unión a poli-A y las proteínas de unión del extremo 5'. El mecanismo de ciclación o concatemerización puede ocurrir a través de al menos 3 rutas diferentes: 1) química, 2) enzimática y 3) catalizada por ribozimas. El enlace 5'-/3' recién formado puede ser intramolecular o intermolecular.

En la primera ruta, el extremo 5' y el extremo 3' del ácido nucleico contienen grupos químicamente reactivos que, cuando están juntos, forman un nuevo enlace covalente entre el extremo 5' y el extremo 3' de la molécula. El extremo 5' puede contener un grupo reactivo éster NHS y el extremo 3' puede contener un nucleótido terminado en 3' amino de manera que en un disolvente orgánico el nucleótido terminado en 3' amino en el extremo 3' de una molécula de ARNm sintético sufrirá un ataque nucleofílico en el resto del éster 5'-NHS formando un nuevo enlace 5'-/3'-amida. En la segunda ruta, la ARN ligasa T4 puede usarse para enlazar enzimáticamente una molécula de ácido nucleico fosforilado en 5' al grupo hidroxilo 3' de un ácido nucleico formando un nuevo enlace fosforodiéster. En una reacción de ejemplo, se incuba 1 pg de una molécula de ácido nucleico a 37°C durante 1 hora con 1-10 conjuntos de ARN ligasa T4 (New England Biolabs, Ipswich, MA) según el protocolo del fabricante. La reacción de ligación puede producirse en presencia de un oligonucleótido dividido capaz de parearse con las regiones 5' y 3' en yuxtaposición para ayudar a la reacción de ligación enzimática.

En la tercera ruta, el extremo 5' o 3' de la plantilla de ADNc codifica una secuencia de ribozima ligasa de modo que durante la transcripción in vitro, la molécula de ácido nucleico resultante puede contener una secuencia de ribozima activa capaz de ligar el extremo 5' de una molécula de ácido nucleico al extremo 3' de una molécula de ácido nucleico. La ribozima ligasa puede derivarse del intrón del grupo I, virus de la hepatitis delta, ribozima de horquilla o puede seleccionarse mediante SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial). La reacción de la ribozima ligasa puede tardar de 1 a 24 horas a temperaturas entre 0 y 37°C.

Multímeros de polinucleótidos sintéticos

Según la presente divulgación, se pueden unir entre sí múltiples polinucleótidos sintéticos distintos a través del extremo 3' usando nucleótidos que se modifican en el extremo 3'. Puede usarse conjugación química para controlar la estequiometría del suministro a las células. Por ejemplo, las enzimas del ciclo del glioxilato, isocitrato liasa y malato sintasa, se pueden suministrar a las células HepG2 a una relación 1:1 para alterar el metabolismo celular de los ácidos grasos. Esta proporción puede controlarse uniendo químicamente polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm utilizando un nucleótido terminado en 3'-azido en un polinucleótido, construcción primaria o especie de ARNm y un nucleótido que contiene etinilo o alquinilo C5 en el polinucleótido opuesto, construcción primaria o especies de ARNmm. El nucleótido modificado se añade postranscripcionalmente usando transferasa terminal (New England Biolabs, Ipswich, MA) según el protocolo del fabricante. Después de la adición del nucleótido modificado en 3', los dos polinucleótidos, la construcción primaria o las especies de ARNmm pueden combinarse en una solución acuosa, en presencia o ausencia de cobre, para formar un nuevo enlace covalente mediante un mecanismo químico de clic como se describe en la bibliografía.

En otro ejemplo, más de dos polinucleótidos pueden unirse entre sí usando una molécula enlazadora funcionalizada. Por ejemplo, una molécula de sacárido funcionalizada puede modificarse químicamente para contener múltiples grupos reactivos químicos (SH-, NH²-, N³ , etc.) para reaccionar con el resto afín en una molécula de ARNm funcionalizada en 3' (es decir, un éster 3'-maleimida, éster 3'-NHS, alquinilo). El número de grupos reactivos en el sacárido modificado se puede controlar de una manera estequiométrica para controlar directamente la relación estequiométrica de polinucleótido conjugado, construcción primaria o ARNmm.

Combinaciones y conjugados de polinucleótidos sintéticos

Para mejorar aún más la producción de proteínas, los polinucleótidos sintéticos de la presente divulgación pueden diseñarse para conjugarse con otros polinucleótidos, colorantes, agentes intercalantes (p.ej. acridinas), reticulantes (p.ej. psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, Sapfirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (por ejemplo, EDTA), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG² , poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorción (p. ej., aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas, proteínas, p. ej., glicoproteínas o péptidos, p. ej., moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos, p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo celular, como una célula cancerosa, una célula endotelial o una célula ósea, hormonas y receptores de hormonas, especies no peptídicas, como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores o un fármaco.

La conjugación puede resultar en una mayor estabilidad y/o semivida y puede ser particularmente útil para dirigir los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm a sitios específicos en la célula, tejido u organismo.

El ARNmm o las construcciones primarias en esta invención se pueden administrar con, o codificar además, uno o más agentes de ARNi, siRNA, ARNsh, ARNmi, sitios de unión de ARNmi, ARN antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARNt, ARN que inducen la formación de triple hélice, aptámeros o vectores y similares.

Polinucleótidos sintéticos bifuncionales

También se describen polinucleótidos bifuncionales (p. ej., construcciones primarias bifuncionales o ARNmm bifuncional). Como su nombre lo indica, los polinucleótidos bifuncionales son aquellos que tienen o son capaces de al menos dos funciones. Estas moléculas también pueden denominarse por convención multifuncionales.

Las múltiples funcionalidades de los polinucleótidos bifuncionales pueden estar codificadas por el ARN (la función puede no manifestarse hasta que se traduzca el producto codificado) o puede ser una propiedad del propio polinucleótido. Puede ser estructural o química. Los polinucleótidos modificados bifuncionales pueden comprender una función que está asociada covalente o electrostáticamente con los polinucleótidos. Además, las dos funciones pueden proporcionarse en el contexto de un complejo de un ARNmm y otra molécula.

Los polinucleótidos bifuncionales pueden codificar péptidos que son antiproliferativos. Estos péptidos pueden ser helicoidales lineales, cíclicos, restringidos o aleatorios. Pueden funcionar como aptámeros, moléculas de señalización, ligandos o imitadores o miméticos de los mismos. Los péptidos antiproliferativos pueden, traducidos, tener una longitud de 3 a 50 aminoácidos. Pueden tener 5-40, 10-30 o aproximadamente 15 aminoácidos de longitud. Pueden ser de cadena única, de cadenas múltiples o ramificadas y pueden formar complejos, agregados o cualquier estructura de conjuntos múltiples una vez traducidos.

Polinucleótidos no codificantes y construcciones primarias

Como se describe en esta invención, se proporcionan polinucleótidos y construcciones primarias que tienen secuencias que son parcial o sustancialmente no traducibles, por ejemplo, que tienen una región no codificante. Tal región no codificante puede ser la "primera región flanqueante" de la construcción primaria. Alternativamente, la región no codificante puede ser una región distinta de la primera región. Estas moléculas generalmente no se traducen, pero pueden ejercer un efecto sobre la producción de proteínas mediante uno o más de la unión y el secuestro de uno o más componentes de la maquinaria de traducción, como una proteína ribosómica o un ARN de transferencia (ARNt), reduciendo así de manera efectiva la expresión de proteínas en el tejido celular o modular una o más vías o cascadas en una célula que a su vez altera los niveles de proteína. El polinucleótido o construcción primaria puede contener o codificar uno o más ARN no codificantes largos (lncARN o lincARN) o una parte del mismo, un ARN nucleolar pequeño (sno-ARN), micro ARN (ARNmi), ARN de interferencia pequeño (siRNA) o ARN que interactúa con Piwi (ARNpi). Polipéptido de interés (proteínas relacionadas con CRISPR)

Según la presente divulgación, el polinucleótido sintético está diseñado para codificar uno o más polipéptidos de interés o fragmentos de los mismos. Los polipéptidos de interés incluyen proteínas relacionadas con CRISPR, por ejemplo, proteínas de fusión CAS9, dCAS9 y dominio efector dCAS9 (dominio activador y/o inhibidor). Proteínas relacionadas con CRISPR se describen con más detalle en esta invención.

Un polipéptido de interés puede incluir, entre otros, polipéptidos completos, una pluralidad de polipéptidos o fragmentos de polipéptidos, que independientemente pueden estar codificados por uno o más ácidos nucleicos, una pluralidad de ácidos nucleicos, fragmentos de ácidos nucleicos o variantes de cualquiera de los antes mencionados. Tal como se usa en esta invención, el término "polipéptidos de interés" se refiere a cualquier polipéptido que se selecciona para ser codificado en la construcción primaria de la presente divulgación. Tal como se usa en esta invención, "polipéptido" significa un polímero de residuos de aminoácidos (naturales o no naturales) unidos entre sí con mayor frecuencia mediante enlaces peptídicos. El término, como se usa en esta invención, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. En algunos aspectos, el polipéptido codificado tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos y, a continuación, se denomina un péptido. Si el polipéptido es un péptido, tendrá una longitud de al menos aproximadamente 2, 3, 4 o al menos 5 residuos de aminoácidos. Por lo tanto, los polipéptidos incluyen productos génicos, polipéptidos de origen natural, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los que anteceden. Un polipéptido puede ser una única molécula o puede ser un complejo de múltiples moléculas, tal como un dímero, trímero o tetrámero. Estos también pueden comprender polipéptidos de cadena simple o de cadena múltiple, tales como anticuerpos o insulina, y pueden estar asociados o unidos. Los enlaces disulfuro más comunes se encuentran en los polipéptidos de cadena múltiple. El término polipéptido también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos, en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural.

La expresión "variante de polipéptido" se refiere a moléculas que difieren en su secuencia de aminoácidos de una secuencia de referencia o natural. Las variantes de la secuencia de aminoácidos pueden poseer sustituciones, deleciones e/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos, en comparación con una secuencia nativa o de referencia. Normalmente, las variantes tendrán al menos aproximadamente 50 % de identidad (homología) con una secuencia de referencia o natural y, preferentemente, serán idénticas (homólogas) en al menos aproximadamente 80 %, más preferentemente al menos aproximadamente 90 % a una secuencia de referencia o natural.

Se describen los "imitadores de variantes". Tal como se usa en esta invención, la expresión "imitador de variante" es uno que contiene uno o más aminoácidos que imitarían una secuencia activada. Por ejemplo, el glutamato puede servir como un imitador de fosforo-treonina y/o fosforo-serina. De manera alternativa, los imitadores de variantes pueden producir la desactivación o un producto inactivado que contiene el imitador, por ejemplo, la fenilalanina puede actuar como una sustitución inactivante de la tirosina, o la alanina puede actuar como una sustitución inactivante para serina.

"Homología", tal como se aplica a las secuencias de aminoácidos, se define como el porcentaje de residuos en la secuencia de aminoácidos candidata que sean idénticos a los residuos en la secuencia de aminoácidos de una segunda secuencia a continuación de alinear las secuencias e introducir huecos, de ser necesario, para lograr el mayor porcentaje de homología. Procedimientos y programas informáticos para la alineación son bien conocidos en la técnica. Se entiende que la homología depende de un cálculo del porcentaje de identidad, pero puede diferir en valor debido a los huecos y las penalizaciones introducidas en el cálculo.

Por "homólogos", tal como se aplica a secuencias de polipéptidos, se entiende la secuencia correspondiente de otra especie que tiene una identidad sustancial con una segunda secuencia de una segunda especie.

Se pretende que "análogos" incluya variantes polipeptídicas que difieran en una o más alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, adiciones o deleciones de residuos aminoácidos que aún conservan una o más de las propiedades del polipéptido original o inicial.

La presente divulgación contempla varios tipos de composiciones que están basados en polipéptidos, inclusive variantes y derivados. Estos incluyen variantes y derivados de sustitución, inserción, deleción y covalentes. El término "derivado" se usa como sinónimo del término "variante", pero generalmente se refiere a una molécula que ha sido modificada y/o cambiada de cualquier manera en comparación con una molécula de referencia o molécula inicial. Como tales, los polipéptidos que codifican ARNmm que contienen sustituciones, inserciones y/o adiciones, deleciones y modificaciones covalentes con respecto a secuencias de referencia, en particular las secuencias de polipéptidos descritas en esta invención, quedan comprendidos por el alcance de la presente descripción. Por ejemplo, los marcadores de secuencia o aminoácidos, tales como una o más lisinas, pueden agregarse a las secuencias de péptidos de la descripción (por ejemplo, en los extremos N o C). Pueden usarse marcadores de secuencia para la purificación o localización de péptidos. Pueden usarse lisinas para aumentar la solubilidad de péptidos o para permitir la biotinilación. De manera alternativa, los residuos de aminoácidos ubicados en las regiones de los extremos amino y carboxi de la secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína pueden eliminarse de manera opcional para proporcionar secuencias truncadas. Determinados aminoácidos (por ejemplo, residuos del extremo C o extremo N) pueden eliminarse de manera alternativa, dependiendo del uso de la secuencia, como, por ejemplo, expresión de la secuencia como parte de una secuencia mayor que sea soluble, o que esté unida a un soporte sólido.

"Variantes de sustitución", cuando se refieren a polipéptidos, son las que han eliminado al menos un residuo de aminoácidos en una secuencia natural o inicial y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser simples, donde solo se sustituyó una molécula de aminoácido, o pueden ser múltiples, cuando se sustituyeron dos o más aminoácidos en la misma molécula.

Tal como se usa en esta invención, la expresión “sustitución de aminoácido conservadora” se refiere a la sustitución de un aminoácido que está presente normalmente en la secuencia con un aminoácido diferente de tamaño, carga o polaridad similar. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina y leucina, por otro residuo no polar. De manera similar, ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrofílico) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, y entre glicina y serina. De manera adicional, la sustitución de un residuo básico, tal como lisina, arginina o histidina, por otro, o la sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro residuo ácido, son ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras. Ejemplos de sustituciones no conservadoras incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrofóbico), tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina, por un residuo polar (hidrofílico), tal como, cisteína, glutamina, ácido glutámico o lisina, y/o un residuo polar por un residuo no polar.

"Variantes de inserción", cuando se refiere a polipéptidos, son las que tienen uno o más aminoácidos insertados de manera inmediatamente adyacente a un aminoácido en una posición particular en una secuencia natural o inicial. "Inmediatamente adyacente" a un aminoácido significa conectado al grupo funcional alfa-carboxi o alfa-amino del aminoácido.

"Variaciones de deleción", cuando se refiere a polipéptidos, son las que tienen uno o más aminoácidos eliminados en la secuencia de aminoácidos natural o inicial. De manera común, las variantes de deleción tendrán uno o más aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.

"Derivados covalentes", cuando se refiere a polipéptidos, incluyen modificaciones de una proteína natural o inicial con un agente de derivación proteináceo o no proteináceo orgánico, y/o modificaciones postraduccionales. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente mediante la reacción de residuos de aminoácidos dirigidos de la proteína con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con residuos extremos o cadenas laterales seleccionadas, o mediante mecanismos de aprovechamiento de modificaciones postraduccionales que funcionan en células hospedadoras recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para verificar la actividad biológica, para inmunoensayos, o para la preparación de anticuerpos contra proteínas para la purificación por inmunoafinidad de la glicoproteína recombinante. Dichas modificaciones se encuentran dentro del conocimiento de la técnica y se llevan a cabo sin experimentación innecesaria.

Determinadas modificaciones postraduccionales son el resultado de la acción células hospedadoras recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo a menudo se desamidan de forma postraduccional y se convierten en los residuos aspartilo y glutamilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones moderadamente ácidas. Cualquier forma de estos residuos puede estar presente en los polipéptidos producidos según la presente descripción.

Otras modificaciones postraduccionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo y treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de histidina, lisina y arginina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)). Las "características", cuando se hace referencia a polipéptidos, son definidas como componentes distintos basados en secuencias de aminoácidos de una molécula. Las características de los polipéptidos codificados por el ARNmm de la presente descripción incluyen manifestaciones en la superficie, forma conformacional local, pliegues, bucles, semibucles, dominios, semidominios, sitios, extremos o cualquier combinación de los mismos.

Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, la expresión "manifestación en la superficie" se refiere a un componente basado en polipéptidos de una proteína que aparece en la última superficie externa.

Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, la expresión "forma conformacional local" significa una manifestación estructural basada en polipéptidos de una proteína que está ubicada dentro de un espacio definible de la proteína.

Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "pliegue" se refiere a la conformación resultante de una secuencia de aminoácidos al minimizar la energía. Puede producirse un pliegue en el nivel secundario o terciario del procedimiento de plegado. Ejemplos de pliegues secundarios incluyen láminas beta y hélices alfa. Ejemplos de pliegues terciarios incluyen dominios y regiones formadas debido a la agregación o separación de fuerzas energéticas. Regiones formadas de este modo incluyen cavidades hidrofóbicas e hidrofílicas, y similares. Tal como se usa en esta invención, el término "giro" en relación con la conformación de una proteína significa una rotación que altera la dirección de la estructura principal de un péptido o polipéptido y puede implicar uno, dos, tres o más residuos de aminoácidos.

Tal como se usa en esta invención en referencia a polipéptidos, el término "bucle" se refiere a una característica estructural de un polipéptido que puede servir para revertir la dirección de la estructura principal de un péptido o polipéptido. Cuando el bucle se encuentra en un polipéptido y solo altera la dirección de la estructura principal, puede comprender cuatro o más residuos de aminoácidos. Oliva y col. identificaron al menos 5 clases de bucles de proteínas (J. Mol Biol 266 (4): 814-830; 1997). Los bucles pueden ser abiertos o cerrados. Los bucles cerrados o "cíclicos" pueden comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos entre los restos de puenteo. Dichos restos de puenteo pueden comprender un puente cisteína-cisteína (Cys-Cys) típico en polipéptidos que tienen puentes disulfuro o, de manera alternativa, los restos de puenteo pueden no estar basados en proteínas, tal como el agente dibromocililo, tal como se usan en esta invención.

Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "semibucle" se refiere a una parte de un bucle identificado que tiene al menos la mitad de la cantidad de aminoácidos que forman el bucle del cual se derivan. Se entiende que los bucles no siempre contienen una cantidad par de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, en aquellos casos en los que un bucle contiene o se identifica que comprende un número impar de aminoácidos, un semibucle del bucle impar comprenderá la porción de número entero o la siguiente porción de número entero del bucle (número de aminoácidos del bucle/2+/- 0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un bucle identificado como un bucle de 7 aminoácidos puede producir semibucles de 3 aminoácidos o de 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 puede ser 3 o 4). Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "dominio" se refiere a un motivo de un polipéptido que tenga una o más características o propiedades funcionales o estructurales identificables (por ejemplo, capacidad de unión, servir como sitio para interacciones entre proteínas).

Tal como se usa en esta invención al hacer referencia a polipéptidos, el término "semidominio" se refiere a una parte de un dominio identificado que tiene al menos la mitad de la cantidad de aminoácidos que forman el dominio del cual se derivan. Se entiende que los dominios no siempre contienen una cantidad par de residuos de aminoácidos. Por lo tanto, en los casos donde un dominio contiene o se identifica que comprende una cantidad impar de aminoácidos, un semidominio de un dominio con una cantidad impar de aminoácidos comprenderá la porción de número entero, o la porción del próximo número entero del dominio (cantidad de aminoácidos en el dominio/2+/-0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un dominio identificado como un dominio de 7 aminoácidos puede producir semidominios de 3 aminoácidos o de 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 puede ser 3 o 4). También se entenderá que pueden identificarse subdominios dentro de dominios o semidominios, estos subdominios poseen menos que la totalidad de propiedades funcionales o estructurales identificadas en los dominios o semidominios de los cuales se derivan. También se entenderá que los aminoácidos que comprenden cualquier tipo de dominio en esta invención no necesitan ser contiguos a lo largo de la estructura principal del polipéptido (es decir, los aminoácidos no adyacentes pueden plegarse estructuralmente para producir un dominio, semidominio o subdominio).

Tal como se usa en esta invención en referencia a polipéptidos, el término “sitio”, en lo referente a aspectos basados en aminoácidos, se usa como sinónimo de “residuo de aminoácidos” y “cadena lateral de aminoácidos”. Un sitio representa una posición dentro de un péptido o polipéptido que puede modificarse, manipularse, alterarse, derivarse o variarse dentro de las moléculas basadas en polipéptidos de la presente descripción.

Tal como se usa en esta invención los términos "extremos" o "extremo", en referencia a polipéptidos, se refieren a una extremidad de un péptido o polipéptido. Dicha extremidad no se limita únicamente al sitio inicial o final del péptido o polipéptido, sino que puede incluir aminoácidos adicionales en las regiones de los extremos. Las moléculas basadas en polipéptidos de la presente descripción pueden caracterizarse como moléculas que tienen tanto un extremo N (terminado en un aminoácido con un grupo amino libre (NH2)) como un extremo C (terminado en un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). En algunos casos, las proteínas de la descripción están compuestas de cadenas de polipéptidos que están unidas mediante enlaces disulfuro o mediante fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estos tipos de proteínas tendrán múltiples extremos N y C. De manera alternativa, los extremos de los polipéptidos pueden modificarse de manera que comiencen o terminen, según sea el caso, con un resto no basado en polipéptidos, tal como un conjugado orgánico.

Una vez que cualquiera de estas características ha sido identificada o definida como componente deseado de un polipéptido a ser codificado por la construcción primaria del ARNmm de la descripción, puede llevarse a cabo cualquiera de varias manipulaciones y/o modificaciones de estas características mediante movimiento, intercambio, inversión, deleción, aleatorización o duplicación. Además, se entenderá que la manipulación de características puede producir el mismo resultado que una modificación de las moléculas de la descripción. Por ejemplo, una manipulación que implica la deleción de un dominio daría como resultado la alteración de la longitud de una molécula solamente como la modificación de un aminoácido para codificar menos de lo que lo haría una molécula de longitud completa.

Las modificaciones y manipulaciones pueden lograrse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, de modo no taxativo, mutagénesis dirigida a sitio. Las moléculas modificadas resultantes pueden a continuación evaluarse para verificar su actividad mediante el uso de ensayos in vitro o in vivo, tales como los descritos en esta invención o cualquier otro ensayo de selección adecuado conocido en la técnica.

Según la presente descripción, los polipéptidos pueden comprender una secuencia de consenso que se descubre a través de ciclos de experimentación. Tal como se usa en esta invención, una secuencia "de consenso" es una secuencia individual que representa una población colectiva de secuencias que permite la variabilidad en uno o más sitios.

Como reconocerán los expertos en la técnica, los fragmentos de proteína, dominios de proteína funcional y proteínas homólogas, también se consideran dentro del alcance de los polipéptidos de interés de la presente descripción. Por ejemplo, se proporciona en esta invención cualquier fragmento de proteína (que significa una secuencia de polipéptidos que en su longitud tiene un residuo de aminoácidos menos que una secuencia de polipéptidos de referencia, pero idéntica en los demás aspectos) de una proteína de referencia con una longitud de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mayor que 100 aminoácidos. En otro ejemplo, puede utilizarse según la invención cualquier proteína que incluya una extensión de 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, o aproximadamente 100 aminoácidos que sea 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 100 % idéntica a las secuencias descritas en esta descripción. En algunas realizaciones, un polipéptido incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones, según se muestra en cualquiera de las secuencias que se proporcionan o a las que se hace referencia en esta invención.

Polipéptidos variantes de interés

Los polipéptidos sintéticos descritos en esta invención pueden codificar polipéptidos variantes, por ejemplo, proteínas relacionadas con CRISPR variantes que tienen una cierta identidad con una secuencia polipeptídica de referencia. Tal como se usa en esta invención, una "secuencia polipeptídica de referencia" se refiere a una secuencia polipeptídica de partida. Las secuencias de referencia pueden ser secuencias de tipo natural o cualquier secuencia a la que se haga referencia en el diseño de otra secuencia. Una "secuencia polipeptídica de referencia" puede ser, por ejemplo, cualquier CAS9 codificante, dCAS9, una proteína de fusión del dominio activador de dCAS9, una proteína de fusión del dominio inhibidor de dCAS9, y/o variantes de los mismos.

Tal como se conoce en la técnica, el término "identidad" hace referencia a una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos o polinucleótidos determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, la identidad también hace referencia al grado de relación entre secuencias según se determina por la cantidad de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos o residuos de ácido nucleico. La identidad mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de huecos (si los hubiera) conforme a un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos"). Es posible calcular la identidad de péptidos relacionados mediante procedimientos conocidos. Dichos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo y col., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988). La variante de polipéptido puede tener la misma actividad o similar que el polipéptido de referencia. Alternativamente, la variante puede tener una actividad alterada (por ejemplo, aumentada o disminuida) con respecto a un polipéptido de referencia. Generalmente, las variantes de un polinucleótido o polipéptido particular de la divulgación tendrán al menos aproximadamente 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % pero menos del 100 % de identidad de secuencia con ese polinucleótido o polipéptido de referencia particular según se determina mediante programas y parámetros de alineación de secuencia descritos en esta invención y conocidos por los expertos en la técnica. Tales herramientas para la alineación incluyen las de la suite BLAST (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.) En esta invención se describen otras herramientas, específicamente en la definición de "Identidad".

Los parámetros predeterminados en el algoritmo BLAST incluyen, por ejemplo, un umbral esperado de 10, tamaño de palabra de 28, Puntuaciones Match/Mismatch 1, -2, Costos de Gap lineales. Se puede aplicar cualquier filtro, así como una selección de repeticiones específicas de especies, por ejemplo, Homo sapiens.

Regiones flanqueantes: Regiones no traducidas (UTR - Untranslated Regions)

Como se describe en esta invención, los polinucleótidos sintéticos de la divulgación incluyen regiones no traducidas.

Las regiones no traducidas (UTR) de un gen se transcriben pero no se traducen. La UTR 5' comienza en el sitio de inicio de la transcripción y continúa hasta el codón de inicio, pero no incluye el codón de inicio; mientras que la UTR 3' comienza inmediatamente después del codón de parada y continúa hasta la señal de terminación de la transcripción. Existe un cuerpo creciente de evidencia sobre las funciones reguladoras que desempeñan las UTR en términos de estabilidad de la molécula de ácido nucleico y traducción. Las características reguladoras de una UTR se pueden incorporar en los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm de la presente divulgación para mejorar la estabilidad de la molécula. Las características específicas también se pueden incorporar para asegurar una regulación hacia abajo controlada de la transcripción en caso de que estén mal dirigidas a sitios de órganos no deseados. Ejemplos de UTR incluyen, entre otros, los que se encuentran a continuación.

Las tablas 2 y 3 de la solicitud de patente provisional pendiente de tramitación n.° 61/737.130 depositada el 14 de diciembre de 2012 de la cual la solicitud publicada WO/2013/151666 reivindica prioridad proporciona una lista de UTR ejemplares que pueden utilizarse en la construcción primaria de la presente divulgación como regiones flanqueantes. Pueden utilizarse variantes de UTR 5' o 3' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluidos A, T, C o G.

Debe entenderse que los enumerados son ejemplos y que cualquier UTR de cualquier gen puede incorporarse en la respectiva primera o segunda región flanqueante de la construcción primaria. Además, se pueden utilizar múltiples UTR de tipo silvestre de cualquier gen conocido. También es posible proporcionar UTR artificiales que no sean variantes de genes de tipo natural. Estas UTR o partes de las mismas pueden colocarse en la misma orientación que en la transcripción de la que fueron seleccionados o pueden estar alteradas en orientación o ubicación. Por tanto, una UTR 5' o 3' puede invertirse, acortarse, alargarse, hacerse quimérica con una o más de otras UTR 5' o UTR 3'. Tal como se usa en esta invención, el término "alterado" en lo que se refiere a una secuencia UTR, significa que la UTR se ha cambiado de alguna manera en relación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, una UTR 3' o 5' puede alterarse con respecto a una UTR de tipo natural o nativa por el cambio en la orientación o ubicación como se enseñó anteriormente o puede ser alterada por la inclusión de nucleótidos adicionales, deleción de nucleótidos, intercambio o transposición de nucleótidos. Cualquiera de estos cambios que produzcan una UTR "alterada" (ya sea 3' o 5') comprende una UTR variante.

La UTR puede seleccionarse de entre las UTR descritas en la extensa tabla 21 de la solicitud pendiente de tramitación provisional de EE.UU. N° US 61/775.509, depositada el 9 de marzo de 2013, de la cual la solicitud publicada WO/2014/164253 reivindica la prioridad titulada Heterologous Untranslated Regions for mRNA y en la tabla 21 extensa y en la tabla 22 en la solicitud pendiente de tramitación provisional de EE. UU. N°. US 61/829.372, depositada el 31 de mayo de 2013, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151666 reivindica la prioridad titulada Heterologous Untranslated Regions for mRNA.

En algunos casos, se puede utilizar una UTR doble, triple o cuádruple, como una UTR 5' o 3'. Tal como se usa en esta invención, una UTR "doble" es aquella donde dos copias de la misma UTR están codificadas en serie o sustancialmente en serie. Por ejemplo, se puede usar una UTR 3' doble beta-globina como se describe en la publicación de patente de EE.UU. 20100129877.

También es posible tener UTR con patrones. Tal como se usa en esta invención, "UTR con patrón" son aquellas UTR que reflejan un patrón repetido o alterno, como ABABAB o AABBAABBAABB o ABCAbCa BC o variantes de los mismos repetidos una, dos o más de 3 veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa una UTR diferente a nivel de nucleótidos.

Las regiones flanqueantes pueden seleccionarse de entre una familia de transcripciones cuyas proteínas comparten una función, estructura y característica de propiedad comunes. Por ejemplo, polipéptidos de interés pueden pertenecer a una familia de proteínas que se expresan en una célula, tejido particular o en algún momento durante el desarrollo. Las UTR de cualquiera de estos genes pueden intercambiarse por cualquier otra UTR de la misma familia de proteínas o de una diferente para crear una nueva transcripción primaria quimérica. Tal como se usa en esta invención, una "familia de proteínas" se usa en el sentido más amplio para referirse a un grupo de dos o más polipéptidos de interés que comparten al menos una función, estructura, característica, localización, origen o patrón de expresión.

Los polinucleótidos sintéticos de la divulgación pueden comprender una región no traducida que no es heteróloga de la proteína codificada de interés. Como ejemplo no limitativo, la región no traducida puede comprender la totalidad o una porción o fragmento de las mismas de una o más de las regiones no traducidas se describe en la solicitud pendiente de tramitación provisional de EE. UU. n.° 61/775,509, depositada el 9 de marzo de 2013, de la cual se publicó la solicitud Wo/2014/164253 que reclama prioridad titulada Heterologous Untranslated Regions for mRNA y la solicitud provisional de EE. UU. n.° US 61/829,372, depositada el 15 de marzo de 2013, de la cual se publicó la solicitud WO/2013/151666 que reivindica la prioridad titulada Heterologous Untranslated Regions for mRNA.

UTR 5' e inicio de traducción

Los polinucleótidos sintéticos de la divulgación normalmente incluyen una UTR 5'. Las UTR 5' naturales tienen características que desempeñan un papel en el inicio de la traducción. Albergan firmas como las secuencias de Kozak, que comúnmente se sabe que están involucradas en el procedimiento por el cual el ribosoma inicia la traducción de muchos genes. Las secuencias de Kozak tienen el consenso CCR(A/G)CCAUGG (SEQ ID NO: 126), donde R es una purina (adenina o guanina) tres bases corriente arriba del codón de inicio (AUG), que va seguido de otra "G". También se sabe que la UTR 5' forma estructuras secundarias que están implicadas en la unión del factor de alargamiento. Mediante la ingeniería de las características que se encuentran típicamente en genes abundantemente expresados de órganos diana específicos, se puede mejorar la estabilidad y la producción de proteínas de los polinucleótidos sintéticos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación. Por ejemplo, introducción de UTR 5' de ARNm expresado en hígado, como albúmina, amiloide A sérico, apolipoproteína A/B/E, transferrina, alfafetoproteína, eritropoyetina o factor VIII podrían usarse para mejorar la expresión de una molécula de ácido nucleico, como un ARNmm, en líneas de células hepáticas o en el hígado. Asimismo, es posible el uso de UTR 5' de otro ARNm específico de tejido para mejorar la expresión en ese tejido: para músculo (MyoD, miosina, mioglobina, miogenina, herculina), para células endoteliales (Tie-1, CD36), para células mieloides (C/EBP, AML1, G-CSF, GM-CSF, CD11b, MSR, Fr-1, i-NOS), para leucocitos (C^d45, CD18), para tejido adiposo (C^d36, GLUT4, ACRP30, adiponectina) y para células epiteliales pulmonares (SP-A/B/C/D).

Se pueden incorporar otras secuencias no UTR en las UTR 5' (o UTR 3'). Por ejemplo, pueden incorporarse intrones o porciones de secuencias de intrones en las regiones flanqueantes de los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación. La incorporación de secuencias intrónicas puede incrementar la producción de proteínas así como los niveles de ARNm.

La UTR 5' que se puede seleccionar para su uso en esta divulgación puede ser una UTR estructurada tal como, pero sin limitarse a, UTR 5' para controlar la traducción. Como un ejemplo no limitante, una UTR 5' estructurada puede ser beneficiosa cuando se utiliza cualquiera de las modificaciones terminales descritas en la solicitud provisional de EE. UU. en tramitación n.° 61/758,921 depositada el 31 de enero de 2013, de la cual se publicó la solicitud WO/2014/081507 reivindica la prioridad titulada Differential Targeting Using RNA Constructs; solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/781,139 depositada el 14 de marzo de 2013, de la cual se publicó la solicitud WO/2013/151666 reivindica la prioridad titulada Differential Targeting Using RNA Constructs; solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/729,933, depositada el 26 de noviembre de 2012 de la cual se publicó la solicitud WO/2013/151666 reivindicada la prioridad titulada Terminally Optimized RNAs: solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/737,224 depositada el 14 de diciembre de 2012 de la cual se publicó la solicitud WO/2013/151666 que reivindica la prioridad titulada Terminally Optimized RNAs y solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/829,359 depositada el 31 de mayo de 2013 de la cual se publicó la solicitud WO/2013/151666 que reivindica la prioridad titulada Terminally Optimized RNAs.

UTR 3’ y los elementos ricos en AU

Los polinucleótidos sintéticos de la divulgación normalmente incluyen una UTR 3' . Se sabe que las UTR 3' tienen tramos de Adenosinas y Uridinas incrustados en ellos. Estas firmas ricas en AU son particularmente frecuentes en genes con altas tasas de rotación. Según sus características de secuencia y propiedades funcionales, los elementos ricos en AU (ARE - AU Rich Elements) se pueden separar en tres clases (Chen y col, 1995): Los ARE de clase I contienen varias copias dispersas de un motivo AUUUA dentro de regiones ricas en U. C-Myc y MyoD contienen ARE de clase I. Los ARE de Clase II poseen dos o más nonámeros UUAUUUA(U/A)(U/A) que se solapan. Las moléculas que contienen este tipo de ARE incluyen GM-CSF y TNF-a. Los ARES de clase III están menos definidos. Estas regiones ricas en U no contienen un motivo AUUUA. c-Jun y Myogenin son dos ejemplos bien estudiados de esta clase. Se sabe que la mayoría de las proteínas que se unen a los ARE desestabilizan al mensajero, mientras que se ha documentado que los miembros de la familia ELAV, sobre todo HuR, aumentan la estabilidad del ARNm. HuR se une a los ARE de las tres clases. La ingeniería de los sitios de unión específicos de HuR en la UTR 3' de las moléculas de ácido nucleico conducirá a la unión de HuR y, por lo tanto, a la estabilización del mensaje in vivo.

La introducción, eliminación o modificación de elementos ricos en AU (ARE) de UTR 3' se puede usar para modular la estabilidad de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación. Cuando se manipulan polinucleótidos específicos, construcciones primarias o ARNmm, se pueden introducir una o más copias de un ARE para hacer que los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación sean menos estables y de ese modo acortar la traducción y disminuir la producción de la proteína resultante. Asimismo, los ARE se pueden identificar y eliminar o mutar para aumentar la estabilidad intracelular y así aumentar la traducción y producción de la proteína resultante. Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes, usando polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación y la producción de proteínas se puede ensayar en varios puntos de tiempo después de la transfección. Por ejemplo, las células se pueden transfectar con diferentes moléculas de ingeniería de ARE y usando un kit ELISA para la proteína relevante y la proteína de ensayo producida a las 6 h, 12 h, 24 h, 48 h y 7 días después de la transfección.

Sitios de unión de UTR 3' y microARN

Los polinucleótidos sintéticos de la divulgación pueden incluir un sitio de unión de miARN en la UTR 3'. Un microARN (o miARN) es un ARN no codificante de 19-25 nucleótidos de longitud que se une a la UTR 3' de las moléculas de ácido nucleico y regula negativamente la expresión génica, ya sea reduciendo la estabilidad de la molécula de ácido nucleico o inhibiendo la traducción. Polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación pueden comprender una o más secuencias diana de microARN, secuencias de microARN, sitios de unión de microARN o semillas de microARN. Dichas secuencias pueden corresponder a cualquier microARN conocido, como los que se enseñan en la publicación de EE. UU. US2005/0261218 y publicación de EE. UU. US2005/0059005, o los enumerados en la Tabla 7 de la solicitud pendiente de tramitación ^uSSⁿ 61/758,921 depositada el 31 de enero de 2013 (número de expediente de abogado 2030.1039).

Ejemplos de UTR 3' que contienen sitios de unión de miARN incluyen, pero no se limitan a, los que se encuentran en las Tablas siguientes.

Una secuencia de microARN comprende una región "semilla", es decir, una secuencia en la región de posiciones 2-8 del microARN maduro, cuya secuencia tiene una complementariedad de Watson-Crick perfecta con la secuencia diana de miARN. Una semilla de microARN puede comprender las posiciones 2-8 o 2-7 de un microARN maduro. Una semilla de microARN puede comprender 7 nucleótidos (p. ej., nucleótidos 2-8 del microARN maduro), donde el sitio complementario de la semilla en el correspondiente miARN diana está flanqueado por una adenina (A) opuesta a la posición 1 del microARN. Una semilla de microARN puede comprender 6 nucleótidos (p. ej., nucleótidos 2-7 del microARN maduro), donde el sitio complementario de la semilla en el miARN diana correspondiente está flanqueado por una adenina (A) opuesta a la posición 1 del microARN. Véase, por ejemplo, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 julio 6;27(1):91-105. Las bases de la semilla de microARN se complementan completamente con la secuencia diana. Mediante ingeniería de secuencias diana de microARN en la UTR 3' de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación pueden alcanzar a la molécula para degradación o traducción reducida, siempre que el microARN en cuestión esté disponible. Este procedimiento reducirá el riesgo de efectos fuera de diana sobre el suministro de moléculas de ácido nucleico. Se ha informado sobre la identificación de microARN, regiones diana de microARN y sus patrones de expresión y función en biología (Bonauer y col., Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras y Rao Leukemia 2012 26:404-413 (20 de diciembre de 2011 doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf y col., Cell, 2007 129:1401-1414).

Por ejemplo, si la molécula de ácido nucleico es un ARNm y no está destinada a ser entregada al hígado pero termina allí, a continuación miR-122, un microARN abundante en el hígado, puede inhibir la expresión del gen de interés si se diseñan uno o múltiples sitios diana de miR-122 en la UTR 3' de los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm. La introducción de uno o múltiples sitios de unión para diferentes microARN se puede diseñar para disminuir aún más la longevidad, estabilidad y traducción de proteínas de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm. Tal como se usa en esta invención, el término "sitio de microARN" se refiere a un sitio diana de microARN o un sitio de reconocimiento de microARN, o cualquier secuencia de nucleótidos a la que un microARN se une o se asocia. Debe entenderse que la "unión" puede seguir las reglas tradicionales de hibridación de Watson-Crick o puede reflejar cualquier asociación estable del microARN con la secuencia diana en o de manera adyacente al sitio de microARN. A la inversa, para los propósitos de los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación, los sitios de unión de microARN pueden diseñarse a partir de (es decir, eliminarse de) secuencias donde se producen naturalmente para aumentar la expresión de proteínas en tejidos específicos. Por ejemplo, los sitios de unión de miR-122 pueden eliminarse para mejorar la expresión de proteínas en el hígado. La regulación de la expresión en múltiples tejidos se puede lograr mediante la introducción o eliminación o uno o varios sitios de unión de microARN.

Ejemplos de tejidos donde se sabe que los microARN regulan el ARNm y, por lo tanto, la expresión de proteínas, incluyen, entre otros, hígado (miR-122), músculo (miR-133, miR-206, miR-208), células endoteliales (miR -17-92, miR-126), sistema nervioso (mir-124a, miR-9), células pluripotentes (miR-302, miR-367, miR-290, miR-371, miR-373), células de los islotes pancreáticos ( miR-375), células mieloides (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), tejido adiposo (let-7, miR- 30c), corazón (miR-1d, miR-149), riñón (miR-192, miR-194, miR-204) y células epiteliales del pulmón (let-7, miR-133, miR-126).

El microARN también puede regular procedimientos biológicos complejos como la angiogénesis (miR-132) (Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). En los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación, los sitios de unión para microARN que están involucrados en dichos procedimientos pueden eliminarse o introducirse, con el fin de adaptar la expresión de los polinucleótidos, construcciones primarias o expresión de ARNmm a tipos celulares biológicamente relevantes o para el contexto de los procedimientos biológicos relevantes.

También se sabe que los microARN se expresan en las células inmunitarias (también llamadas células hematopoyéticas), por ejemplo, las células presentadoras de antígenos (por ejemplo, células dendríticas y macrófagos). Los microARN específicos de células inmunes están involucrados en la inmunogenicidad, autoinmunidad, la respuesta inmune a la infección, la inflamación, así como la respuesta inmune no deseada después de la terapia génica y trasplante de tejidos/órganos. Por ejemplo, miR-142 y miR-146 se expresan exclusivamente en las células inmunes, particularmente abundantes en las células dendríticas mieloides. La introducción del sitio de unión de miR-142 en el 3'-UTR de un polinucleótido o una construcción de administración de genes puede suprimir selectivamente la expresión génica en las células presentadoras de antígenos a través de la degradación del ARNm mediada por miR-142, lo que limita la presentación de antígenos en APC profesionales (p. ej., células dendríticas) y de ese modo previniendo la respuesta inmune mediada por antígenos después de la administración del gen (véase, Annoni A y col., Blood, 2009, 114, 5152-5161. En los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación, se pueden introducir sitios de unión para microARN que están involucrados en dichos procedimientos, con el fin de reducir la expresión de los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación en APC y someter la respuesta inmune mediada por antígenos.

Por último, mediante la comprensión de los patrones de expresión de microARN en diferentes tipos celulares, se pueden diseñar polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm para una expresión más dirigida en tipos celulares específicos o solo bajo condiciones biológicas específicas. Mediante la introducción de sitios de unión de microARN específicos de tejido, podrían diseñarse polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm que serían óptimos para la expresión de proteínas en un tejido o en el contexto de una condición biológica.

Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes, utilizando polinucleótidos modificados genéticamente, construcciones primarias o ARNmm y la producción de proteínas se puede analizar en varios puntos de tiempo después de la transfección. Por ejemplo, las células se pueden transfectar con diferentes polinucleótidos de ingeniería del sitio de unión de microARN, construcciones primarias o ARNmm y mediante el uso de un kit ELISA para la proteína relevante y la proteína de ensayo producida a las 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 hr y 7 días después de la transfección.También se pueden realizar experimentos in vivo utilizando moléculas diseñadas en el sitio de unión de microARN para examinar cambios en la expresión específica de tejido de polinucleótidos formulados, construcciones primarias o ARNmm.

Secuencias virales

Se pueden diseñar e insertar secuencias virales adicionales como, entre otras, la secuencia que mejora la traducción del virus de la enana amarilla de cebada (BYDV-PAV) en la UTR 3' de los polinucleótidos sintéticos, polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación. y puede estimular la traducción de la construcción in vitro y in vivo.Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y el día 7 después de la transfección.

Protección de 5'

Los polinucleótidos sintéticos de la divulgación pueden incluir una región de protección 5' o una capa 5'. La estructura de capa 5' de un ARNm está involucrada en la exportación nuclear, aumentando la estabilidad del ARNm y se une a la proteína de unión a la capa de ARNm (CBP), que es responsable de la estabilidad del ARNm en la célula y la capacidad de traducción a través de la asociación de CBP con la proteína de unión a poli (A) para formar la especie de ARNm cíclico maduro. La capa ayuda además a la eliminación de los intrones proximales 5' durante el empalme del ARNm.

Las moléculas de ARNm endógeno pueden estar protegidas en el extremo 5' generando un enlace 5'-ppp-5'-trifosfato entre un residuo terminal de la capa de guanosina y el nucleótido sentido transcrito en el extremo 5' de la molécula de ARNm. Esta capa de 5'-guanilato puede a continuación metilarse para generar un residuo de N7-metil-guanilato. Los azúcares ribosa de los nucleótidos transcritos de extremo y/o anteextremos del extremo 5' del ARNm pueden opcionalmente estar también 2'-O-metilados. El decapado 5' mediante hidrólisis y escisión de la estructura de capa de guanilato puede alcanzar a una molécula de ácido nucleico, como una molécula de ARNm, para su degradación. Las modificaciones de los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNmm de la presente divulgación pueden generar una estructura de capa no hidrolizable que impide el decapado y, por lo tanto, aumenta la vida media del ARNm. Debido a que la hidrólisis de la estructura de la capa requiere la escisión de los enlaces fosforodiéster 5'-ppp-5', se pueden usar nucleótidos modificados durante la reacción de protección. Por ejemplo, se puede usar una enzima de protección contra Vaccinia de New England Biolabs (Ipswich, MA) con nucleótidos de a-tioguanosina según las instrucciones del fabricante para crear un enlace fosforotioato en la capa 5'-ppp-5'. Pueden usarse nucleótidos de guanosina modificados adicionales tales como nucleótidos de a-metil-fosfonato y selenofosfato.

Las modificaciones adicionales incluyen, pero no se limitan a, 2'-O-metilación de los azúcares ribosa de 5'-terminal y/o 5'-nucleótidos anteterminales del ARNm (como se mencionó anteriormente) en el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar. Se pueden usar múltiples estructuras de capa 5' distintas para generar la capa 5' de una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ARNm.

Análogos de capa, que en esta invención también se denominan análogos de capa sintética, capas químicas, análogos de capa química o análogos de capas estructurales o funcionales, difieren de las capas 5' naturales (es decir, endógenas, de tipo silvestre o fisiológicas) en su estructura química, manteniendo la función de capa. Análogos de capa pueden sintetizarse químicamente (es decir, no enzimáticamente) o enzimáticamente y/enlazados a una molécula de ácido nucleico.

Por ejemplo, la capa Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) contiene dos guaninas unidas por un grupo 5'-5'-trifosfato, donde una guanina contiene un grupo metilo N7 así como un grupo 3'-O-metilo (es decir, N7,3'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina (m7G-3'mppp-G; que puede denominarse equivalentemente 3' O-Mem7G(5')ppp(5')G). El átomo 3'-O de la otra guanina, no modificada, se une al nucleótido terminal 5' de la molécula de ácido nucleico protegida (por ejemplo, un ARNm o un ARNmm). La guanina N7- y 3'-O-metilizada proporciona el resto terminal de la molécula de ácido nucleico protegida (por ejemplo, ARNm o ARNmm).

Otra capa ejemplar es mCAP, que es similar a ARCA pero tiene un grupo 2'-O-metilo en la guanosina (es decir, N7,2'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina, m7Gm-ppp-G).

Mientras los análogos de capa permiten la protección concomitante de una molécula de ácido nucleico en una reacción de transcripción in vitro, hasta el 20 % de las transcripciones permanecen sin protección. Esto, así como las diferencias estructurales de un análogo de capa de las estructuras endógenas de la capa 5' de los ácidos nucleicos producidas por la maquinaria de transcripción celular endógena, pueden conducir a una competencia de traducción reducida y una estabilidad celular reducida.

Los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNmm de la divulgación también pueden bloquearse postranscripcionalmente, utilizando enzimas, para generar estructuras de capa 5' más auténticas. Tal como se usa en esta invención, la frase "más auténtico" se refiere a una característica que refleja o imita, estructural o funcionalmente, una característica endógena o de tipo silvestre. Es decir, una característica "más auténtica" es mejor representativa de una función y/o estructura celular endógena, de tipo silvestre, natural o fisiológica en comparación con características sintéticas o análogas, etc., de la técnica anterior, o que supera a la característica endógena, de tipo silvestre, natural, o fisiológica correspondiente en uno o más aspectos. Ejemplos no limitantes de estructuras de capa 5' más auténticas de la presente divulgación son aquellas que, entre otras cosas, tienen una unión mejorada de las proteínas de unión a la capa, una vida media aumentada, una susceptibilidad reducida a las endonucleasas 5' y/o decapado 5' reducido, en comparación con las estructuras de capa 5' sintéticas conocidas en la técnica (o con una estructura de capa 5' de tipo silvestre, natural, o fisiológica). Por ejemplo, la enzima recombinante de protección contra el virus Vaccinia y la enzima 2'-O-metiltransferasa recombinante pueden crear un enlace 5'-5'-trifosfato canónico entre el nucleótido 5'-terminal de un ARNm y un nucleótido de capa de guanina donde la capa de guanina contiene una metilación de N7 y el nucleótido 5'-terminal del ARNm contiene un 2'-O-metilo. Esta estructura se denomina estructura Capl. Esta capa da como resultado una mayor competencia de traducción y estabilidad celular y una activación reducida de citocinas proinflamatorias celulares, en comparación, por ejemplo, con otras estructuras análogas de capa 5' conocidas en la técnica. Las estructuras de capa incluyen 7mG(5')ppp(5')N, pN2p (capa 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (capa 1) y 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (capa 2).

Debido a que los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNmm pueden estar bloqueados postranscripcionalmente, y debido a que este procedimiento es más eficiente, casi el 100 % de los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNmm pueden estar bloqueados. Esto contrasta con ~80 % cuando un análogo de capa se une a un ARNm en el curso de una reacción de transcripción in vitro.

Según la presente divulgación, las capas terminales 5' pueden incluir capas endógenas o análogos de capas. Según la presente divulgación, una capa terminal 5' puede comprender un análogo de guanina. Análogos de guanina útiles incluyen inosina, N1-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina y 2-azido-guanosina.

Secuencias de IRES:

Además, se proporcionan polinucleótidos sintéticos, construcciones primarias o ARNmm que pueden contener un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES - internal ribosome entry site). Identificado por primera vez como una característica del ARN del virus Picorna, el IRES desempeña un papel importante en el inicio de la síntesis de proteínas en ausencia de la estructura de la capa 5'. Un IRES puede actuar como el único sitio de unión al ribosoma, o puede servir como uno de los múltiples sitios de unión al ribosoma de un ARNm. Los polinucleótidos sintéticos, las construcciones primarias o el ARNmm que contienen más de un sitio de unión de ribosoma funcional pueden codificar varios péptidos o polipéptidos que son traducidos independientemente por los ribosomas ("moléculas de ácido nucleico multicistrónico"). Cuando se proporcionan polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm con un IRES, se proporciona además opcionalmente una segunda región traducible. Ejemplos de secuencias de IRES que se pueden usar según la invención incluyen, sin limitación, las de picornavirus (p. ej., FMDV), virus de plagas (CFFV), virus de la polio (PV), virus de encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la peste porcina clásica (CSFV), virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS) o virus de la parálisis del grillo (CrPV).

Codones de parada

Las construcciones primarias de la presente divulgación pueden incluir al menos dos codones de parada antes de la región no traducida 3' (UTR). El codón de parada puede ser seleccionado de entre TGA, TAA y ^tA^g . En un aspecto, las construcciones primarias de la presente divulgación incluyen el codón de parada TGA y un codón de parada adicional. En un aspecto adicional, el codón de parada de la adición puede ser TAA.

Las construcciones primarias de la presente divulgación pueden incluir tres codones de parada antes de la región no traducida 3' (UTR).

Secuencias señal

Las construcciones primarias o ARNmm también pueden codificar características adicionales que facilitan el tráfico de los polipéptidos a sitios terapéuticamente relevantes. Una de esas características que ayuda en el tráfico de proteínas es la secuencia señal. Tal como se usa en esta invención, una "secuencia señal" o "péptido señal" es un polinucleótido o polipéptido, respectivamente, que tiene una longitud de aproximadamente 9 a 200 nucleótidos (3-60 aminoácidos) que se incorpora en el extremo 5' (o extremo N) de la región codificante o polipéptido codificado, respectivamente. La adición de estas secuencias da como resultado el tráfico del polipéptido codificado al retículo endoplásmico a través de una o más vías secretoras. Algunos péptidos señal son escindidos de la proteína por la peptidasa señal después de que se transportan las proteínas.

Las secuencias señal pueden ser seleccionadas de entre cualquiera de las listadas en las solicitudes de patente en tramitación: La solicitud de patente provisional de EE.UU. n.° 61/618.862, depositada el 2 de abril de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151666 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Biologics; la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.645, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Biologics; la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.130, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151666 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Biologics; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/618.866, depositada el 2 de abril de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies; la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.647, depositada el 10 de agosto de 2012,, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Polinucleótidos Modificados para la Producción de Anticuerpos: solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.134, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies: solicitud de patente provisional de EE. u U. n.° 61/618.868, depositada el 2 de abril de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/090648 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.648, presentada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines: solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.135, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicadan WO 2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines; solicitud de patente provisional de EE. u U. n.° 61/618.870, depositada el 2 de abril de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.649, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.139, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/618.873, depositada el 2 de abril de 2012,, de la cual la solicitud publicada WO 2013/090648 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins: solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.650, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.147, presentada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins;solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/618.878, depositada el 2 de abril de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.654, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.152, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/618.885, depositada el 2 de abril de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cvtoskeletal Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.658, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cvtoskeletal Proteins;solicitud de patente provisional de EE. U^u . n.° 61/737.155, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins;solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/618.896, depositada el 2 de abril de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins;solicitud de patente provisional de ^e E. UU. n.° 61/668.157, depositada el 5 de julio de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.661, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.160, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/618.911, depositada el 2 de abril de 2012,, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; solicitud de patente provisional de EE.UU. n.° 61/681.667, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.168, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/618.922, depositada el 2 de abril de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins;solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.675, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada W^o 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.174, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151670, reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins;solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/618.935, depositada el 2 de abril de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.687, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.184, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; solicitud de patente provisional de EE. U^u . n.° 61/618.945, depositada el 2 de abril de 2012,, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease;solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.696, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737.191, depositada el 14 de diciembre de 2012,, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/618.953, depositada el 2 de abril de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/681.704, depositada el 10 de agosto de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151736 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease;solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 61/737,203, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO 2013/151670 reivindica la prioridad titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, solicitud internacional n.° PCT/US2013/030062, depositada el 9 de marzo, 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; solicitud internacional n.° PCT/US2013/030063, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides; solicitud internacional n.° PCT/US2013/030064, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; solicitud Internacional n.° PCT/US2013/030059, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins; solicitud internacional n.° PCT/US2013/030066, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; solicitud internacional n.° PCT/US2013/030067, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; solicitud internacional n.° PCT/US2013/030060, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; solicitud internacional n.° PCT/US2013/030061, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; solicitud internacional n.° PCT/US2013/030068, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides; y solicitud internacional n.° PCT/US2013/030070, depositada el 9 de marzo de 2013, titulada Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides; solicitud de patente internacional n.° PCT/US2013/031821, depositada el 15 de marzo de 2013, titulada In Vivo Production of Proteins. Secuencias señal de proteínas que pueden incorporarse para codificar los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación incluyen secuencias señal de a-1-antitripsina, G-CSF, factor IX, prolactina, albúmina, HMMSP38, ornitina carbamoiltransferasa, subunidad de citocromo C oxidasa 8A, tipo III, bacteriano, viral, señales de secreción, Vrg-6, PhoA, OmpA, STI, STII, amilasa, factor alfa, endoglucanasa V, señal de secreción, hongos, fibronectina e interleucinas (p. ej., IL12).

En la tabla de solicitudes de patente pendientes de tramitación, SS es señal de secreción y MLS es señal líder mitocondrial (mitochondrial leader signal). Las construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación pueden diseñarse para codificar cualquiera de las secuencias señal o fragmentos o variantes de las mismas. Estas secuencias se pueden incluir al comienzo de la región codificante del polipéptido, en el medio o en el extremo o alternativamente en una región flanqueante.

Las secuencias de señal adicionales que pueden utilizarse en esta invención divulgación incluyen las enseñadas, por ejemplo, en bases de datos como las que se encuentran en http://www.signalpeptide.de/ o http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/ o aquellas descritas en Patentes EE. UU. 8.124.379; 7.413.875 y 7.385.034. Señales y sitios de escisión de proteínas

Los polipéptidos de la presente divulgación pueden incluir al menos una señal de escisión de proteínas que contiene al menos un sitio de escisión de proteínas. El sitio de escisión de la proteína puede estar ubicado en el extremo N, el extremo C, en cualquier espacio entre los extremos N y C tales como, pero no limitado a, a mitad de camino entre los extremos N y C, entre el extremo N y el punto medio, entre el punto medio y el extremo C, y combinaciones de los mismos.

Los polipéptidos de la presente divulgación pueden incluir, pero no se limitan a, una proproteína convertasa (o prohormona convertasa), trombina o señal de escisión de proteína del factor Xa. Las proproteínas convertasas son una familia de nueve proteinasas, que comprenden siete serina proteinasas similares a las subtilisinas específicas de aminoácidos básicos relacionadas con la cexina de levadura, conocida como prohormona convertasa 1/3 (PC1/3), PC2, furina, PC4, PC5/6, enzima de escisión de aminoácidos básicos pareados 4 (PACE4) y PC7, y otras dos subtilasas que se escinden en residuos no básicos, llamadas subtilisina cexina isoenzima 1 (SKI-1) y proproteinconvertasa subtilisina cexina 9 (PCSK9).

Las construcciones primarias y el ARNmm de la presente divulgación se pueden diseñar de manera que la construcción primaria o el ARNmm contenga al menos una señal de escisión de proteína codificada. La señal de escisión de la proteína codificada puede estar ubicada antes del codón de inicio, después del codón de inicio, antes de la región de codificación, dentro de la región de codificación, como, entre otros, en la mitad de la región de codificación, entre el codón de inicio y el punto medio, entre el punto medio y el codón de parada, después de la región de codificación, antes del codón de parada, entre dos codones de parada, después del codón de parada y combinaciones de los mismos.

Las construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación pueden incluir al menos una señal de escisión de proteína codificada que contiene al menos un sitio de escisión de proteína. La señal de escisión de proteína codificada puede incluir, pero no se limita a, una proproteína convertasa (o prohormona convertasa), trombina y/o señal de escisión de proteína del factor Xa. Un experto en la técnica puede usar la Tabla 1 a continuación u otros procedimientos conocidos para determinar la señal de escisión de proteína codificada apropiada para incluir en las construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación. Por ejemplo, partiendo de una secuencia señal y considerando los codones de la Tabla 1, se puede diseñar una señal para la construcción primaria que puede producir una señal proteica en el polipéptido resultante.

Los polipéptidos de la presente divulgación pueden incluir al menos una señal y/o sitio de escisión de proteínas. Como ejemplo no limigtativo, Pat. EE. UU. n.° 7.374.930 y Pub. EE. UU. n.° 20090227660, usan un sitio de escisión de furina para escindir la metionina del extremo N de GLP-1 en el producto de expresión del aparato de Golgi de las células. En un caso, los polipéptidos de la presente divulgación incluyen al menos una señal y/o sitio de escisión de proteínas con la condición de que el polipéptido no sea GLP-1.

En algunos casos, las construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación incluyen al menos una señal y/o sitio de escisión de proteína codificada.

En algunos casos, las construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación incluyen al menos una señal y/o sitio de escisión de proteína codificada con la condición de que la construcción primaria o el ARNmm no codifique GLP-1.

Las construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación pueden incluir más de una región codificante. Cuando están presentes múltiples regiones codificantes en la construcción primaria o ARNmm de la presente divulgación, las múltiples regiones codificantes pueden separarse mediante sitios de escisión de proteínas codificadas. Como ejemplo no limitativo, la construcción primaria o el ARNmm se puede firmar en un patrón ordenado. En tal patrón sigue la forma AXBY donde A y B son regiones codificantes que pueden ser regiones codificantes iguales o diferentes y/o pueden codificar polipéptidos iguales o diferentes, y X e Y son señales de escisión de proteínas codificadas que pueden codificar señales de escisión de proteínas iguales o diferentes. Un segundo tal patrón sigue la forma AXYBZ donde A y B son regiones codificantes que pueden ser regiones codificantes iguales o diferentes y/o pueden codificar polipéptidos iguales o diferentes, y X, Y y Z son señales de escisión de proteínas codificadas que pueden codificar señales de escisión de proteínas iguales o diferentes. Un tercer patrón sigue la forma ABXCY donde A, B y C son regiones codificantes que pueden ser regiones codificantes iguales o diferentes y/o pueden codificar polipéptidos iguales o diferentes, y X e Y son señales de escisión de proteínas codificadas que pueden codificar señales de escisión de proteínas iguales o diferentes.

Los polipéptidos, construcciones primarias y ARNmm también pueden contener secuencias que codifican sitios de escisión de proteínas de modo que los polipéptidos, construcciones primarias y ARNmm pueden liberarse de una región portadora o una pareja de fusión mediante tratamiento con una proteasa específica para dicho sitio de escisión de proteínas.

Colas Poli-A

Los polinucleótidos sintéticos de la divulgación típicamente incluyen secuencias de descolado 3', por ejemplo, una cola poli-A. Durante el procesamiento del ARN, se puede agregar una cadena larga de nucleótidos de adenina (cola poli-A) a un polinucleótido, como moléculas de ARNm, para aumentar la estabilidad. Inmediatamente después de la transcripción, el extremo 3' del transcrito se puede escindir para liberar un hidroxilo 3'. A continuación, la polimerasa poli-A agrega una cadena de nucleótidos de adenina al ARN. El procedimiento, llamado poliadenilación, agrega una cola poli-A que puede tener entre 100 y 250 residuos de largo.

Se ha descubierto que las longitudes de cola poli-A únicas proporcionan ciertas ventajas a los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación.

Generalmente, la longitud de una cola poli-A de la presente divulgación es mayor de 30 nucleótidos de longitud. En otro caso, la cola poli-A tiene más de 35 nucleótidos de longitud (por ejemplo, al menos o más de aproximadamente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000 nucleótidos). En algunos casos, el polinucleótido, la construcción primaria o ARNmm incluye de aproximadamente 30 a aproximadamente 3000 nucleótidos (p. Ej., De 30 a 50, de 30 a 100, de 30 a 250, de 30 a 500, de 30 a 750, de 30 a 1000, de 30 a 1500, de 30 a 2000, de 30 a 2500, de 50 a 100, de 50 a 250, de 50 a 500, de 50 a 750, de 50 a 1000, de 50 a 1500, de 50 a 2000, de 50 a 2500, de 50 a 3000, de 100 a 500, de 100 a 750, de 100 a 1000, de 100 a 1500, de 100 a 2000, de 100 a 2500, de 100 a 3000, de 500 a 750, de 500 a 1000, de 500 a 1500, de 500 a 2000, de 500 a 2500, de 500 a 3000, de 1000 a 1500, de 1000 a 2000, de 1000 a 2500, de 1000 a 3000, de 1500 a 2.000, de 1.500 a 2.500, de 1.500 a 3.000, de 2.000 a 3.000, de 2.000 a 2.500 y de 2.500 a 3.000).

En algunos casos, la cola poli-A se diseña en relación con la longitud de los polinucleótidos totales, construcciones primarias o ARNmm. Este diseño puede basarse en la longitud de la región codificante, la longitud de una característica o región particular (como la primera región o las regiones flanqueantes), o basarse en la longitud del producto final expresado a partir de los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm.

En este contexto, la cola poli-A puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % mayor en longitud que los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm o característica de los mismos. La cola poli-A también puede diseñarse como una fracción de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm al que pertenece. En este contexto, la cola poli-A puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % o más de la longitud total de la construcción o la longitud total de la construcción menos la cola poli-A. Además, los sitios de unión diseñados y la conjugación de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm para la proteína de unión Poly-A pueden mejorar la expresión. Además, múltiples polinucleótidos distintos, construcciones primarias o ARNmm se pueden unir a la PABP (proteína de unión Poly-A) a través del extremo 3' usando nucleótidos modificados en el extremo 3' de la cola poli-A. Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y el día 7 después de la transfección.

En un aspecto, las construcciones primarias de polinucleótidos de la presente divulgación están diseñadas para incluir un cuarteto poliA-G. El cuarteto G es una matriz cíclica con enlaces de hidrógeno de cuatro nucleótidos de guanina que pueden formarse mediante secuencias ricas en G tanto en el ADN como en el ARN. En este aspecto, el cuarteto G se incorpora al final de la cola poli-A. La construcción de ARNmm resultante se analiza para determinar la estabilidad, la producción de proteínas y otros parámetros, incluida la vida media en varios puntos de tiempo. Se ha descubierto que el cuarteto poliA-G da como resultado una producción de proteínas equivalente a al menos el 75 % de la observada usando una cola poli-A de 120 nucleótidos sola.

II. ARN de guía pequeña sintéticos (ARNsg)

La divulgación también incluye ARN de guía pequeña sintéticos o ARNsg. Un ARNsg sintético se dirige a un gen de interés, por ejemplo, un gen donde se desea la modulación de la transcripción. Un ARNsg sintético incluye una secuencia, típicamente de 20-25 nucleótidos de longitud, que es complementaria a una cadena de la UTR 5' del gen de interés corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción. El ARNsg sintético también incluye una secuencia de andamio guía. Una secuencia típica de andamio guía es la siguiente:

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC

GTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGGTGC

(SEQ ID NO:100)

Se puede encontrar una descripción del diseño de ARNsg en, por ejemplo, Mali y col. Science. 2013. 339:823-826.

Se pueden encontrar ejemplos de secuencias de ARNsg en las Tablas siguientes.

Genes de interés

El ARNsg se dirige a un gen de interés, lo que hace que la proteína relacionada con CRISPR codificada por el polinucleótido sintético interactúe con el gen de interés. El gen de interés se selecciona según la aplicación. Ejemplos de genes de interés incluyen VEGF, TPO, y/o genes de apoptosis o genes de senescencia.

III. Diseño y síntesis de polinucleótidos sintéticos y ARNsgs

Los polinucleótidos sintéticos y los ARNsg de la divulgación se pueden preparar según cualquier técnica disponible que incluye, pero no se limita a, síntesis química; síntesis enzimática, que generalmente se denomina transcripción in vitro (IVT); o escisión enzimática o química de un precursor más largo, etc. Los procedimientos de síntesis de ARN son conocidos en la técnica (ver, p.ej., Gait, M.J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; y Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005).

El procedimiento de diseño y síntesis de las construcciones primarias, por ejemplo, polinucleótidos sintéticos que codifican una proteína relacionada con CRISPR o ARNsg sintético, de la divulgación generalmente incluye las etapas de construcción de genes, producción de ARNm sintético (con o sin modificaciones) y purificación. En el procedimiento de síntesis enzimática, primero se selecciona una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína relacionada con CRISPR o ARNsg para su incorporación en un vector que se amplificará para producir una plantilla de ADNc. Opcionalmente, la secuencia de polinucleótidos de proteína relacionada con CRISPR y/o cualquier secuencia flanqueante puede tener codones optimizados. La plantilla de ADNc se usa a continuación para producir ARNm o ARNsg a través de la transcripción in vitro (IVT). Después de la producción, el ARNm o ARNsg pueden someterse a procedimientos de purificación y limpieza. Cuyas etapas se proporcionan con más detalle a continuación.

Construcción génica del polinucleótido sintético que codifica una proteína relacionada con CRISPR

La etapa de construcción de genes puede incluir, pero no se limita a, síntesis de genes, amplificación de vectores, purificación de plásmidos, linealización y limpieza de plásmidos, y síntesis y limpieza de plantillas de ADNc.

Una vez que se selecciona un polipéptido de interés, por ejemplo, una proteína relacionada con CRISPR, por ejemplo, dCAS9 o una proteína de fusión del dominio efector dCAS9, para la producción, se diseña una construcción primaria. Dentro de la construcción primaria, se puede construir una primera región de nucleósidos enlazados que codifican el polipéptido de interés usando un marco de lectura abierto (ORF - open reading frame) de un transcrito de ácido nucleico (ADN o ARN) seleccionado. El ORF puede comprender el ORF de tipo natural, una isoforma, variante o un fragmento del mismo. Tal como se usa en esta invención, un "marco de lectura abierto" u "ORF" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (ADN o ARN) que es capaz de codificar un polipéptido de interés. Los ORF a menudo comienzan con el codón de inicio, ATG y terminan con un codón o señal sin sentido o de terminación.

Además, la secuencia de nucleótidos de la primera región puede tener codones optimizados. Los procedimientos de optimización de codones se conocen en la técnica y pueden ser útiles en los esfuerzos por lograr uno o más de varios objetivos. Estos objetivos incluyen hacer coincidir las frecuencias de los codones en los organismos diana y hospedadores para garantizar un plegamiento adecuado, sesgar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm o reducir las estructuras secundarias, minimizar los codones repetidos en tándem o las corridas de bases que pueden afectar la construcción o expresión de genes, personalizar las regiones de control de la transcripción y la traducción, insertar o eliminar secuencias de tráfico de proteínas, eliminar/agregar sitios de modificación postraducción en proteínas codificadas (por ejemplo, sitios de glicosilación), agregar, eliminar o mezclar dominios de proteínas, insertar o eliminar sitios de restricción, modificar sitios de unión de ribosomas y sitios de degradación de ARNm, ajustar las tasas de traducción para permitir que los diversos dominios de la proteína se plieguen adecuadamente, o reducir o eliminar las estructuras secundarias problemáticas dentro del ARNm. Las herramientas, algoritmos y servicios de optimización de codones son conocidos en la técnica; ejemplos no taxativos incluyen servicios de GeneArt (Life Technologies), y/o DNA2.0 (Menlo Park, CA). En algunas realizaciones, se optimiza la secuencia de marco de lectura abierto (ORF) con algoritmos de optimización. Las opciones de codones para cada aminoácido se dan en la Tabla 1.

T l 1 i n n

Una vez que se ha optimizado el codón de una secuencia, se puede evaluar más a fondo para las regiones que contienen sitios de restricción. Al menos un nucleótido dentro de las regiones del sitio de restricción puede reemplazarse con otro nucleótido para eliminar el sitio de restricción de la secuencia, pero el reemplazo de nucleótidos sí altera la secuencia de aminoácidos que está codificada por la secuencia de nucleótidos con codón optimizado. En algunas partes de la divulgación, una UTR 5' y/o una UTR 3' se pueden proporcionar como regiones flanqueantes. Pueden incluirse múltiples UTR 5' o 3' en las regiones flanqueantes y pueden ser las mismas o de secuencias diferentes. Cualquier porción de las regiones flanqueantes, incluida ninguna, puede tener codones optimizados y cualquiera puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de codones. Pueden incluirse combinaciones de características en la primera y segunda regiones flanqueantes y pueden estar contenidas dentro de otras características. Por ejemplo, el ORF puede estar flanqueado por una UTR 5' que puede contener una fuerte señal de inicio de la traducción de Kozak y/o una UTR 3' que puede incluir una secuencia oligo(dT) para la adición de plantilla de una cola poli-A.

Después de la optimización (si se desea), los componentes de la construcción primaria se reconstituyen y se transforman en un vector como, entre otros, plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. Por ejemplo, la construcción optimizada se puede reconstituir y transformar en E. coli químicamente competente, levadura, neurospora, maíz, drosophila, etc., donde se producen estructuras cromosómicas o similares a plásmidos de alto número de copias mediante los procedimientos descritos en esta invención.

Amplificación de vector

El vector que contiene la construcción primaria, que codifica el polinucleótido sintético que codifica una proteína relacionada con CRISPR o el ARNsg, a continuación se amplifica y el plásmido se aísla y purifica usando procedimientos conocidos en la técnica tales como, pero no limitado a, una maxi prep usando el kit PURELINK™ HiPure Maxiprep de Invitrogen (Carlsbad, CA).

Linealización de plásmidos

A continuación, el plásmido puede linealizarse usando procedimientos conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, el uso de enzimas de restricción y tampones. La reacción de linealización se puede purificar utilizando procedimientos que incluyen, por ejemplo, el micro kit PURELINK™ PCR de Invitrogen (Carlsbad, CA) y procedimientos de purificación basados en HPLC como, entre otros, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa. (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC) y el kit de PCR estándar PURELINK™ de Invitrogen (Carlsbad, CA). El procedimiento de purificación puede modificarse dependiendo del tamaño de la reacción de linealización que se llevó a cabo. El plásmido linealizado se usa a continuación para generar ADNc para reacciones de transcripción in vitro (IVT).

Síntesis de plantilla de ADNc

Se puede sintetizar una plantilla de ADNc haciendo que un plásmido linealizado se someta a la reacción en cadena de polimerasa (PCR). La Tabla 4 de la solicitud de patente de EE. UU. n.° 13/791,922 depositada el 9 de marzo de 2013 proporciona una lista de cebadores y sondas que pueden ser útiles en las reacciones de PCR de la presente divulgación. Debe entenderse que la lista no es exhaustiva y que el diseño de sonda-cebador para cualquier amplificación está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. Las sondas también pueden contener bases modificadas químicamente para aumentar la fidelidad del emparejamiento de bases a la molécula diana y la fuerza del emparejamiento de bases.

El ADNc puede presentarse para un análisis de secuenciación antes de proceder a la transcripción.

Producción de ARNm

El procedimiento de producción de polinucleótidos sintéticos o ARNsg puede incluir, entre otros, transcripción in vitro, eliminación de plantillas de ADNc y limpieza de ARN, y protección de ARN y/o reacciones de descolado. Alternativamente, el polinucleótido sintético o ARNsg se puede sintetizar químicamente.

Transcripción in vitro

El ADNc producido en el etapa anterior se puede transcribir utilizando un sistema de transcripción in vitro (IVT). El sistema típicamente comprende un tampón de transcripción, nucleótidos trifosfatos (NTP), un inhibidor de RNasa y una polimerasa. Los NTP se pueden fabricar internamente, se pueden seleccionar de un proveedor o se pueden sintetizar como se describe en esta invención. Los NTP pueden seleccionarse, pero no se limitan a, los descritos en esta invención, incluidos los NTP naturales y no naturales (modificados). La polimerasa puede seleccionarse de entre, pero no se limita a, ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3 y polimerasas mutantes tales como, pero sin limitarse a, polimerasas capaces de incorporar ácidos nucleicos modificados. La pirofosfatasa inorgánica se puede incluir en el sistema de transcripción.

Polimerasas de ARN

Puede usarse cualquier número de ARN polimerasas o variantes en el diseño de las construcciones primarias de la presente divulgación.

Las ARN polimerasas se pueden modificar por inserción o deleción de aminoácidos de la secuencia de ARN polimerasa. Como ejemplo no limitativo, la ARN polimerasa puede modificarse para exhibir una mayor capacidad para incorporar un nucleótido trifosfato modificado en 2 en comparación con una ARN polimerasa no modificada (ver publicación internacional WO2008078180 y patente de EE. UU. 8.101.385.

VSe pueden obtener variantes desarrollando una ARN polimerasa, optimizando el aminoácido ARN polimerasa. y/o secuencia de ácido nucleico y/o utilizando otros procedimientos conocidos en la técnica. Como ejemplo no limitativo, las variantes de la ARN polimerasa T7 pueden evolucionar utilizando el sistema de evolución continua dirigida establecido por Esvelt y col. (Nature (2011) 472(7344):499-503) donde los clones de la ARN polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación como, entre otros, lisina en la posición 93 sustituida por treonina (K93T), I4M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T243N, G259D, M267I, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699I, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N o L864F. Como otro ejemplo no limitante, las variantes de la ARN polimerasa T7 pueden codificar al menos una mutación como se describe en las publicaciones de EE.UU. n.° 20100120024 y 20070117112. Las variantes de la ARN polimerasa también pueden incluir, pero no se limitan a, variantes de sustitución, sustitución conservadora de aminoácidos, variantes de inserción, variantes de deleción y/o derivados covalentes.

La construcción primaria puede diseñarse para ser reconocida por las ARN polimerasas de tipo silvestre o variantes. Al hacerlo, la construcción primaria puede modificarse para contener sitios o regiones de cambios de secuencia de la construcción primaria original o de tipo silvestre.

La construcción primaria puede diseñarse para incluir al menos una sustitución y/o inserción corriente arriba de un sitio de unión o reconocimiento de ARN polimerasa, corriente abajo del sitio de unión o reconocimiento de ARN polimerasa, corriente arriba de la secuencia de la caja TATA, corriente abajo de la secuencia de la caja TATA de la construcción primaria pero corriente arriba de la región codificante de la construcción primaria, dentro de la UTR 5', antes de la UTR 5' y/o después de la UTR 5'.

Una UTR 5' de una construcción primaria descrita en esta invención puede reemplazarse por la inserción de al menos una región y/o cadena de nucleótidos de la misma base. La región y/o la cadena de nucleótidos puede incluir, pero no se limita a, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 nucleótidos y los nucleótidos pueden ser naturales y/o antinatural. Como ejemplo no limitante, el grupo de nucleótidos puede incluir 5-8 adenina, citosina, timina, una cadena de cualquiera de los otros nucleótidos descritos en esta invención y/o combinaciones de los mismos.

Una UTR 5' de una construcción primaria descrita en esta invención puede ser reemplazada por la inserción de al menos dos regiones. y/o cadenas de nucleótidos de dos bases diferentes tales como, pero sin limitarse a, adenina, citosina, timina, cualquiera de los otros nucleótidos descritos en esta invención y/o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la UTR 5' se puede reemplazar insertando 5-8 bases de adenina seguido de la inserción de 5-8 bases de citosina. En otro ejemplo, la UTR 5' se puede reemplazar insertando 5-8 bases de citosina seguido de la inserción de 5-8 bases de adenina.

La construcción primaria puede incluir al menos una sustitución y/o inserción corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción que puede ser reconocido por una ARN polimerasa. Como ejemplo no limitativo, al menos una sustitución y/o la inserción puede producirse corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción mediante la sustitución de al menos un ácido nucleico en la región justo debajo del sitio de inicio de la transcripción (tales como, pero no limitado a, 1 a 6). Los cambios en la región de nucleótidos justo debajo del sitio de inicio de la transcripción pueden afectar las tasas de inicio, aumentar los valores constantes de reacción de nucleótido trifosfato (NTP) aparente y aumentar la disociación de transcripciones cortas del complejo de transcripción que cura la transcripción inicial (Brieba y col, Biochemistry (2002) 41: 5144-5149). La modificación, sustitución y/o la inserción de al menos un ácido nucleico puede provocar una mutación silenciosa de la secuencia de ácido nucleico o puede provocar una mutación en la secuencia de aminoácidos.

La construcción primaria puede incluir la sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12 o al menos 13 bases de guanina corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción.

La construcción primaria puede incluir la sustitución de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 bases de guanina en la región inmediatamente corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción. Como ejemplo no limitante, si los nucleótidos en la región son GGGAGA (SEQ ID NO: 127) las bases de guanina pueden estar sustituidas con al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 nucleótidos de adenina. En otro ejemplo no limitante, si los nucleótidos en la región son GGGAGA (SEQ ID NO: 127) las bases de guanina pueden estar sustituidas con al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 bases de citosina. En otro ejemplo no limitante, si los nucleótidos en la región son GGGAGA (SEQ ID NO: 127) las bases de guanina pueden estar sustituidas por al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 timina, y/o cualquiera de los nucleótidos descritos en esta invención.

La construcción primaria puede incluir al menos una sustitución y/o inserción corriente arriba del codón de inicio. En aras de la claridad, un experto en la técnica apreciaría que el codón de inicio es el primer codón de la región codificante de la proteína, mientras que el sitio de inicio de la transcripción es el sitio donde comienza la transcripción. La construcción primaria puede incluir, pero no se limita a, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 sustituciones y/o inserciones de bases de nucleótidos. Las bases de nucleótidos pueden insertarse o sustituirse en 1, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 ubicaciones corriente arriba del codón de inicio. Los nucleótidos insertados y/o sustituido puede ser la misma base (por ejemplo, todo A o todo C o todo T o todo G), dos bases diferentes (por ejemplo, A y C, A y T, o C y T), tres bases diferentes (por ejemplo, A, C y T o A, C y T) o al menos cuatro bases diferentes. Como ejemplo no limitante, la base de guanina corriente arriba de la región codificante en la construcción primaria puede sustituirse con adenina, citosina, timina o cualquiera de los nucleótidos descritos en esta invención. En otro ejemplo no limitante, la sustitución de bases de guanina en la construcción primaria puede diseñarse para dejar una base de guanina en la región corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción y antes del codón de inicio (ver Esvelt y col. Nature (2011) ) 472(7344):499-503). Como ejemplo no limitante, se pueden insertar al menos 5 nucleótidos en 1 ubicación corriente abajo del sitio de inicio de la transcripción pero corriente arriba del codón de inicio y los al menos 5 nucleótidos pueden ser del mismo tipo de base.

Eliminación y limpieza de plantillas de ADNc

La plantilla de ADNc puede eliminarse usando procedimientos conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, el tratamiento con desoxirribonucleasa I (DNasa I). La limpieza del ARN también puede incluir un procedimiento de purificación como, entre otros, el sistema AGENCOURT® CLEANSEQ® de Beckman Coulter (Danvers, MA), procedimientos de purificación basados en HPLC como, entre otros, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC).

Reacciones de protección y/o de descolado

La construcción primaria o el ARNmm también pueden someterse a reacciones de protección y/o de descolado. Puede realizarse una reacción de protección mediante procedimientos conocidos en la técnica para añadir una capa 5' al extremo 5' de la construcción primaria. Los procedimientos para la protección incluyen, pero no se limitan a, el uso de una enzima de protección contra Vaccinia (New England Biolabs, Ipswich, MA).

Se puede realizar una reacción de descolado de poli-A mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, 2 O-metiltransferasa y mediante procedimientos como se describe en esta invención. Si la construcción primaria generada a partir de ADNc no incluye un poli-T, puede ser beneficioso realizar la reacción de descolado de poli-A antes de limpiar la construcción primaria.

Las muestras que se someten a reacciones de protección pueden tener cantidades variables de estructuras protegidas en 5' que van de 0 a 100 %. En algunos casos, la muestra comprende 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o 100 % de ARN protegido en 5'.

Purificación de polinucleótidos sintéticos y ARNsg

La purificación del polinucleótido sintético o ARNsg puede incluir, pero no se limita a, limpieza, garantía de calidad y control de calidad del ARN. La limpieza del ARN se puede realizar mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como, entre otros, perlas AGENCOURT® (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), perlas poli-T, sondas de captura de oligo-T LNA™ (EXIQON® Inc, Vedbaek, Dinamarca), procedimientos de purificación basados en HPLC como, entre otros, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC) o tratamiento con ARNasa III (un ejemplo no limitante de tratamiento de ARNm con ARNasa III se describe por Meis y col. en la publicación internacional n.° WO2013102203). El término "purificado" cuando se usa en relación con un polinucleótido tal como un "ARN purificado" se refiere a uno que está separado de al menos un contaminante. Tal como se usa en esta invención, un "contaminante" es cualquier sustancia que hace que otra sea inadecuada, impura o inferior. Por lo tanto, un polinucleótido purificado (p. ej., ADN y ARN) está presente en una forma o entorno diferente de aquel donde se encuentra en la naturaleza, o en una forma o entorno diferente del que existía antes de someterlo a un tratamiento o procedimiento de purificación. .

Una garantía de calidad y/o verificación del control de calidad se puede realizar utilizando procedimientos como, entre otros, electroforesis en gel, absorbancia UV o HPLC analítica.

El ARN puede secuenciarse mediante procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, PCR con transcriptasa inversa.

El ARNm o ARNmm se puede cuantificar utilizando procedimientos como, entre otros, espectroscopia ultravioleta visible (UV/Vis). Un ejemplo no limitativo de espectrómetro UV/Vis es un espectrómetro NANODROP® (ThermoFisher, Waltham, MA). El ARNm o ARNmm cuantificado puede analizarse para determinar si el ARNm o ARNmm puede ser del tamaño adecuado, comprobar que no se ha producido degradación del ARNm o ARNmm. La degradación del ARNm y/o ARNmm se puede comprobar mediante procedimientos como, entre otros, electroforesis en gel de agarosa, procedimientos de purificación basados en HPLC como, entre otros, HPLC de intercambio aniónico fuerte, HPLC de intercambio aniónico débil, HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y HPLC de interacción hidrofóbica (HIC-HPLC), cromatografía líquida-espectrometría de masas (LCMS), electroforesis capilar (CE) y electroforesis capilar en gel (CGE).

IV.Polinucleótidos sintéticos modificados y ARNsg

Los polinucleótidos sintéticos y los ARNsg de la divulgación se modifican típicamente. En esta invención, en un polinucleótido (tal como polinucleótido sintético o ARNsg), los términos "modificación" o, según sea apropiado, "modificado" se refieren a la modificación con respecto a los ribonucleótidos A, G, U o C. En general, en esta invención, estas expresiones no hacen referencia a las modificaciones de ribonucleótidos en restos de capa de ARNm de extremo 5' de origen natural. Se pueden encontrar ejemplos de modificaciones en la solicitud de patente de EE.UU. 13/644.072, depositada el 03 de octubre de 2012 y publicada como US20130115272.

Las modificaciones pueden ser varias modificaciones distintas. La región codificante, las regiones flanqueantes y/o las regiones extremas pueden contener una, dos o más modificaciones de nucleósidos o nucleótidos (opcionalmente diferentes). Un polinucleótido modificado, construcción primaria o ARNmm introducido en una célula puede presentar una degradación reducida en la célula, en comparación con un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm sin modificar.

Los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNmm pueden incluir cualquier modificación útil, por ejemplo, de un enlace internucleósido, un azúcar o una nucleobase (por ejemplo, a un fosfato enlazador, a un enlace fosfodiéster o a la estructura principal de fosfodiéster). Uno o más átomos de una nucleobase de pirimidina pueden reemplazarse o sustituirse con amino opcionalmente sustituido, tiol opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido (por ejemplo, metilo o etilo) o halo (por ejemplo, cloro o flúor). En ciertos casos, están presentes modificaciones (por ejemplo, una o más modificaciones) en cada uno de los enlaces de azúcar y entre nucleósidos. Las modificaciones según la presente divulgación pueden ser modificaciones de ácidos ribonucleicos (ARN) a ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos treósicos (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o híbridos de los mismos). En esta invención se describen modificaciones adicionales.

Como se describe en esta invención, los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNmm de la divulgación no inducen sustancialmente una respuesta inmune innata de una célula donde se introduce el ARNm. Las características de una respuesta inmune innata inducida incluyen 1) aumento de la expresión de citocinas proinflamatorias, 2) activación de PRR intracelulares (RIG-I, MDA5, etc. y/o 3) terminación o reducción de la traducción de proteínas.

Puede ser conveniente degradar intracelularmente una molécula de ácido nucleico modificada introducida en la célula. Por ejemplo, puede ser preferible la degradación de una molécula de ácido nucleico modificada si se desea un tiempo preciso de la producción de proteínas. Por tanto, en algunos casos, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico modificada que contiene un dominio de degradación, sobre el que se puede actuar de manera dirigida dentro de una célula.

Los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNm pueden incluir opcionalmente otros agentes (p. ej., agentes inductores de ARNi, agentes ARNi, siRNA, ARNsh, ARNmi, ARN antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARNt, ARN que inducen la formación de triple hélice, aptámeros, vectores, etc.).

En algunos casos, el polinucleótido, construcción primaria o ARNmm (p. ej., la primera región, la primera región flanqueante o la segunda región flanqueante) incluye un número n de nucleósidos enlazados que tienen cualquier base, azúcar, estructura principal, bloque de construcción u otra estructura o fórmula, incluidos, entre otros, los de Fórmula I a IX o cualquier subestructura de los mismos como se describe en la publicación internacional n.° WO2013052523 depositada el 3 de octubre de 2012, titulada Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof. Tales estructuras incluyen modificaciones del azúcar, nucleobase, enlace internucleosídico o combinaciones de los mismos.

Las combinaciones de modificaciones químicas incluyen aquellas enseñadas que incluyen pero no se limitan a las descritas en la publicación internacional n.° WO2013052523 depositada el 3 de octubre de 2012, titulada Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof.

La síntesis de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación puede realizarse según los procedimientos descritos en la publicación internacional n.° WO2013052523 depositada el 3 de octubref de 2012, titulada Modified Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof.

La nucleobase puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en citosina, guanina, adenina y uracilo.

La nucleobase modificada descrita en esta invención puede ser un uracilo modificado Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen un uracilo modificado incluyen pseudouridina (^y ), piridin-4-ona ribonucleósido, 5-aza-uridina, 6-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-uridina (s2U), 4-tio-uridina (s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxi-uridina (ho5U), 5-aminoallil-uridina, 5-halo-uridina (p.ej., 5-yodo-uridina o 5-bromo-uridina), 3-metil-uridina (m3U), 5-carboximetil-uridina (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uridina (chm5U), 5-carboxihidroximetil-uridina metil ester (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetil-uridina (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridina (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridina (mnm5U), 5-metilaminometil-2-tiouridina (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridina (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uridina (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uridina (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina (cmnm5s2U), 5-propinil-uridina, 1­ propinil-pseudouridina, 5-taurinometil-uridina (Tm5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tiouridina(Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 5-metil-uridina (m5U, es decir, que tiene la nucleobase desoxitimidina), 1-metil-pseudouridina (m1^ ), 5-metil-2-tio-uridina (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3^ ), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidrouridina (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouridina, 5-metil-dihidrouridina (m5D), 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxi-uridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxipseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, N1-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3 ^y ), 5-(isopentenilaminometil)uridina (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tio-uridina (inm5s2U), a-tio-uridina, 2'-O-metil-uridina (Um), 5,2'-O-dimetil-uridina (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridina (^m), 2-tio-2'-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5­ carbamoilmetil-2'-O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetiluridina (m3Um), 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1 -tio-uridina, deoxitimidina, 2'-F-ara-uridina, 2'-F-uridina, 2'-OH-ara-uridina, 5-(2-carbometoxivinil) uridina, y 5-[3-(1-E-propenilamino)uridina.

En algunos casos, la nucleobase modificada es una citosina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una citosina modificada incluyen 5-aza-citidina, 6-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina (m3C), N4-acetil-citidina (ac4C), 5-formil-citidina (f®C), N4-metil-citidina (m4C), 5-metil-citidina (m5C), 5-halo-citidina (p.ej., 5-yodocitidina), 5-hidroximetil-citidina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tiocitidina (s2C), 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deazapseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tiozebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metil-citidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-1-metilpseudoisocitidina, lisidina (k²C), a-tio-citidina, 2'-O-metil-citidina (Cm), 5,2'-O-dimetil-citidina (m5Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidina (ac4Cm), N4,2'-O-dimetil-citidina (m4Cm), 5-formil-2'-O-metil-citidina (f®Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidina (m⁴²Cm), 1-tio-citidina, 2'-F-ara-citidina, 2'-F-citidina, y 2'-OH-ara-citidina.

En casos ejemplares, la nucleobase modificada es un uracilo modificado seleccionado de entre pseudouridina (^y ) y 1-metilpseudouridina. En algunos casos, la nucleobase modificada es un uracilo modificado en combinación con una citosina modificada, por ejemplo, 5-metilcitosina.

Un polinucleótido de la invención está completamente modificado con 1-metilpseudouridina (m1^ ), opcionalmente en combinación con 5-metilcitosina.

En algunos casos, las moléculas de ARNm tienen codones optimizados.

En algunos casos, la nucleobase modificada es una adenina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una adenina modificada incluyen 2-amino-purina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-halo-purina (por ejemplo, 2­ amino-6-cloro-purina), 6-halo-purina (por ejemplo, 6-cloro-purina), 2-amino-6-metil-purina, 8-azido-adenosina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-amino-purina, 7-deaza-8-aza-2-amino-purina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metil-adenosina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metiladenosina (m6A), 2-metiltio-N6-metil-adenosina (ms2m6A), N6-isopentenil-adenosina (i6A), 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina (ms2i6A), N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (io6A), 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina (ms2io6A), N6-glicinilcarbamoil-adenosina (g6A), N6-treonilcarbamoil-adenosina (t6A), N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina (m6t6A), 2-metiltio-N6-treonilcarbamoil-adenosina (ms2g6A), N6,N6-dimetil-adenosina (m⁶²A), N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (hn6A), 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenosina (ms2hn6A), N6-acetiladenosina (ac6A), 7-metil-adenina, 2-metiltio-adenina, 2-metoxi-adenina, a-tio-adenosina, 2'-O-metil-adenosina (Am), N6,2'-O-dimetil-adenosina (m6Am), N6,N6,2'-O-trimetil-adenosina (m⁶²Am), 1,2'-O-dimetil-adenosina (m1Am), 2'-O-ribosiladenosina (fosfato) (Ar(p)), 2-amino-N6-metil-purina, 1-tio-adenosina, 8-azido-adenosina, 2'-F-ara-adenosina, 2'-F-adenosina, 2'-Oh-ara-adenosina-OH-ara-adenosina y N6-(19-amino-pentaoxanonadecil)-adenosina.

En algunos casos, la nucleobase modificada es una guanina modificada. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 4­ demetil-wiosina (imG-14), isowiosina (imG2), wibutosina (yW), peroxiwibutosina (o²yW), hidroxiwibutosina (OHyW), hidroxiwibutosina submodificada (OHyW*), 7-deaza-guanosina, queuosina (Q), epoxiqueuosina (oQ), galactosilqueuosina (galQ), mannosil-queuosina (manQ), 7-ciano-7-deaza-guanosina (preQü), 7-aminometil-7-deaza-guanosina (preQ¹), arcaeosina (G+), 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-deaza-guanosina, 6-tio-7-deaza-8-azaguanosina, 7-metil-guanosina (m7G), 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metil-inosina, 6-metoxi-guanosina, 1-metil-guanosina (m1G), N2-metil-guanosina (m2G), N2,N2-dimetil-guanosina (m²²G), N2,7-dimetil-guanosina (m2'7G), N2, N2,7-dimetilguanosina (m2'2'7G), 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxo-guanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina, N2,N2-dimetil-6-tio-guanosina, a-tio-guanosina, 2'-O-metil-guanosina (Gm), N2-metil-2'-O-metil-guanosina (m2Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m²²Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanosina (m1Gm), N2,7-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m2'7Gm), 2'-O-metil-inosina (Im), 1,2'-O-dimetil-inosina (m1Im), y 2'-O-ribosilguanosina (fosfato) (Gr(p)).

La nucleobase del nucleótido puede seleccionarse independientemente de entre una purina, una pirimidina, una purina o un análogo de pirimidina. Por ejemplo, cada nucleobase puede seleccionarse independientemente de entre adenina, citosina, guanina, uracilo o hipoxantina. La nucleobase también puede incluir, por ejemplo, derivados naturales y sintéticos de una base, incluidas pirazolo[3,4-d] pirimidinas, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-propil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo (p. ej., 8-bromo), 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas 8-sustituidas y guaninas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, deazaguanina, 7-deazaguanina, 3-deazaguanina, deazaadenina, 7-deazaadenina, 3-deazaadenina, pirazolo [3,4-d] pirimidina, imidazo [1,5-a] 1,3,5 triazinonas, 9-deazapurinas, imidazo [4,5-d] pirazinas, tiazolo [4, 5-d] pirimidinas, pirazin-2-onas, 1,2,4-triazina, piridazina; y 1,3,5 triazina. Cuando los nucleótidos se representan usando la abreviatura A, G, C, T o U, cada letra se refiere a la base representativa y/o derivados de las mismas, por ejemplo, A incluye adenina o análogos de adenina, por ejemplo, 7-deaza adenina).

Se pueden preparar nucleósidos y nucleótidos modificados (por ejemplo, moléculas de bloques de construcción) según los procedimientos sintéticos descritos en Ogata y col., J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal y col., Nucl. Acids Res. 22(1): 72-78, (1994); Fukuhara y col., Biochemistry, 1(4): 563-568 (1962); y Xu y col., Tetrahedron, 48(9): 1729­ 1740 (1992).

Los polipéptidos, las construcciones primarias y el ARNmm de la divulgación pueden modificarse o no de manera uniforme a lo largo de toda la longitud de la molécula. Por ejemplo, uno o más o todos los tipos de nucleótidos (p. ej., purina o pirimidina, o uno cualquiera o más o todos de A, G, U, C) pueden modificarse uniformemente o no en un polinucleótido de la divulgación, o en una región de secuencia predeterminada dada del mismo (p.ej., una o más de las regiones de secuencia representadas en la Figura 1). En algunas realizaciones, todos los nucleótidos X de un polinucleótido de la presente descripción (o de una región de secuencia determinada del mismo) son nucleótidos modificados, donde X puede ser cualquiera de los nucleótidos A, G, U, C, o cualquiera de las combinaciones A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C o A+G+C.

Diferentes modificaciones de azúcar, modificaciones de nucleótidos, y/o enlaces internucleosídicos (p. ej., estructuras de cadena principal) pueden existir en varias posiciones en el polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm.

Un experto en la técnica entenderá que los análogos de nucleótidos u otra modificación o modificaciones se pueden encontrar en cualquier posición de un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm de manera que la función del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm no se vea sustancialmente afectada. La modificación puede ser una modificación en el extremo 5' o 3'. El polinucleótido, construcción primaria o ARNmm puede contener entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 100 % de nucleótidos modificados (ya sea con relación al contenido de nucleótidos general, o en relación con uno o más tipos de nucleótidos, es decir, uno o más de A, G, U o C) o cualquier porcentaje interviniente (es decir, de 1 % a 20 %, de 1 % a 25 %, de 1 % a 50 %, de 1 % a 60 %, de 1 % a 70 %, de 1 % a 80 %, de 1 % a 90 %, de 1 % a 95 %, de 10 % a 20 %, de 10 % a 25 %, de 10 % a 50 %, de 10 % a 60 %, de 10 % a 70 %, de 10 % a 80 %, de 10 % a 90 %, de 10 % a 95 %, de 10 % a 100 %, de 20 % a 25 %, de 20 % a 50 %, de 20 % a 60 %, de 20 % a 70 %, de 20 % a 80 %, de 20 % a 90 %, de 20 % a 95 %, de 20 % a 100 %, de 50 % a 60 %, de 50 % a 70 %, de 50 % a 80 %, de 50 % a 90 %, de 50 % a 95 %, de 50 % a 100 %, de 70 % a 80 %, de 70 % a 90 %, de 70 % a 95 %, de 70 % a 100 %, de 80 % a 90 %, de 80 % a 95 %, de 80 % a 100 %, de 90 % a 95 %, de 90 % a 100 % y de 95 % a 100 %).

En algunos casos, un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm descrito en esta invención puede incluir una pirimidina modificada (p. ej., una uracil/uridina/U o citosina/citidina/C modificada). En algunos casos, el uracilo o la uridina (generalmente: U) en un polinucleótido, construcción primaria o molécula de ARNm se puede reemplazar con de aproximadamente 1 % a aproximadamente 100 % de un uracilo modificado o uridina modificada (p. ej., de 1 % a 20 %, del 1 % al 25 %, del 1 % al 50 %, del 1 % al 60 %, del 1 % al 70 %, del 1 % al 80 %, del 1 % al 90 %, del 1 % al 95 %, del 10 % al 20 %, del 10 % al 25 %, del 10 % al 50 %, del 10 % al 60 %, del 10 % al 70 %, del 10 % al 80 %, del 10 % al 90 %, del 10 % al 95 %, del 10 % al 100 %, del 20 % al 25 %, del 20 % al 50 %, del 20 % al 60 %, del 20 % al 70 %, del 20 % al 80 %, del 20 % al 90 %, del 20 % al 95 %, del 20 % al 100 %, del 50 % al 60 %, del 50 % al 70 %, del 50 % al 80 %, del 50 % al 90 %, del 50 % al 95 %, del 50 % al 100 %, del 70 % al 80 %, del 70 % al 90 %, del 70 % al 95 %, del 70 % al 100 %, del 80 % al 90 %, del 80 % al 95 %, del 80 % al 100 %, del 90 % al 95 %, del 90 % al 100 % y del 95 % al 100 % de un uracilo modificado o uridina modificada). El uracilo o la uridina modificados se pueden reemplazar por un compuesto que tiene una estructura única simple o por una pluralidad de compuestos que tienen estructuras diferentes (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas, como se describe en esta invención).

En algunos casos, la citosina o citidina (generalmente: C) en el polinucleótido, construcción primaria o molécula de ARNm se puede reemplazar con de aproximadamente 1 % a aproximadamente 100 % de una citosina modificada o citidina modificada (p. ej., de 1 % a 20 %, del 1 % al 25 %, del 1 % al 50 %, del 1 % al 60 %, del 1 % al 70 %, del 1 % al 80 %, del 1 % al 90 %, del 1 % al 95 %, del 10 % al 20 %, del 10 % al 25 %, del 10 % al 50 %, del 10 % al 60 %, del 10 % al 70 %, del 10 % al 80 %, del 10 % al 90 %, del 10 % al 95 %, del 10 % al 100 %, del 20 % al 25 %, del 20 % al 50 %, del 20 % al 60 %, del 20 % al 70 %, del 20 % al 80 %, del 20 % al 90 %, del 20 % al 95 %, del 20 % al 100 %, del 50 % al 60 %, del 50 % al 70 %, del 50 % al 80 %, del 50 % al 90 %, del 50 % al 95 %, del 50 % al 100 %, del 70 % al 80 %, del 70 % al 90 %, del 70 % al 95 %, del 70 % al 100 %, del 80 % al 90 %, del 80 % al 95 %, del 80 % al 100 %, del 90 % al 95 %, del 90 % al 100 % y del 95 % al 100 % de una citosina modificada o citidina modificada). La citosina o citidina modificada se puede reemplazar por un compuesto que tiene una estructura única única o por una pluralidad de compuestos que tienen estructuras diferentes (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas, como se describe en esta invención).

En algunos casos, al menos el 25 % de las citosinas se reemplazan por un compuesto de fórmula (b10) -(b14) (p. ej., al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o aproximadamente 100 %).

En algunos casos, al menos el 25 % de los uracilos puede ser reemplazado por un compuesto de fórmula (b1) -(b9) (p. ej., al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o aproximadamente 100 %).

En algunos casos, al menos el 25 % de las citosinas se reemplazan por un compuesto de fórmula (b10) -(b14), y al menos el 25 % de los uracilos son reemplazado por un compuesto de fórmula (b1) - (b9) (p. ej., al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, o aproximadamente 100 %).

En un aspecto, el polinucleótido sintético y/o ARNsg incluye una modificación en extremo. La modificación ern extremo puede ser una modificación descrita en la solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/729,933, depositada el 26 de noviembre de 2012, de la cual se publicó la solicitud WO/2014/081507 reivindica la prioridad titulada Terminally Optimized RNAs; solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/737.224, depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual se publicó la solicitud WO/2014/081507 reivindica la prioridad titulada Terminally Optimized RNAs;solicitud provisional de EE. UU. n.° US61/758.921, depositada el 31 de enero de 2013, de la cual se publicó la solicitud WO/2014/081507 reivindica la prioridad titulada Differential Targeting Using RNA Constructs; solicitud provisional de EE. UU. n.° US 61/781.139, depositada el 14 de marzo de 2013, de la cual se publicó la solicitud WO/2014/081507 reivindica la prioridad titulada Differential Targeting Using RNA Constructs;solicitud provisional de EE. UU. n.° US 61/829.359, depositada el 31 de mayo de 2013, de la cual se publicaron solicitudes WO/2014/081507 reivindica la prioridad titulada Differential Targeting Using RNA Constructs; solicitud provisional de EE. UU. n.° US 61/839.903, depositada el 27 de junio de 2013, de la cual se publicó la solicitud WO/2013/081507 reivindica la prioridad titulada Differential Targeting Using RNA Constructs;solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/842.709, depositada el 3 de julio de 2013, de la cual se publicó la solicitud WO/2014/081507 reivindica la prioridad titulada Differential Targeting Using RNA Constructs. La modificación química puede ser una modificación descrita en publicación internacional n.° WO2013052523. V. Composiciones farmacéuticas: formulación, administración, suministro y dosificación

La divulgación incluye polinucleótido sintético y/o composiciones y complejos de ARNsg en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir opcionalmente una o más sustancias activas adicionales, por ejemplo, sustancias terapéuticamente y/o profilácticamente activas. Es posible encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Lippincott Williams & Wilkins, 2005. Polinucleótidos sintéticos y/o ARNsg sintéticos

En un aspecto, el polinucleótido sintético y/o ARNsg son formulados. Como ejemplo no limitativo, los polinucleótidos sintéticos y/o los ARNsg sintéticos se pueden formular mediante los procedimientos descritos en la publicación internacional n.° WO2013090648 y/o solicitud provisional pendientes de tramitación de EE. UU. n.° US 61/821.406, depositada el 14 de marzo de 2013, de la cual se publicó la solicitud WO/2014/152211 reivindica la prioridad titulada Formulation and Delivery of Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions.Solicitud provisional de EE. UU. N.° 61/821.406, depositada el 9 de mayo de 2013, de la cual se publicó la solicitud WO/2014/152211 reivindica la prioridad titulada Formulation and Delivery of Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions y la solicitud provisional de EE. UU. n.° US 61/840.510, depositada el 28 de junio de 2013, de la cual se publicó la solicitud WO/2014/152211 reivindica la prioridad titulada Formulation and Delivery of Modified Nucleoside, Nucleotide, and Nucleic Acid Compositions.

Si bien las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en esta invención se orientan principalmente a las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración a seres humanos, el experto en la técnica comprenderá que tales composiciones son adecuadas, en términos generales, para la administración a cualquier otro animal, por ejemplo, a animales no humanos, por ejemplo, mamíferos no humanos. Es conocida la modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a seres humanos para hacerlas adecuadas para la administración a diversos animales y el experto farmacéutico veterinario puede diseñar y/o llevar a cabo dicha modificación con experimentación meramente de rutina, si hubiese. Los sujetos para los cuales se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, entre otros, seres humanos y/o primates; mamíferos, incluyendo mamíferos pertinentes en términos comerciales, tales como ganado, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas; y/o aves, incluyendo aves pertinentes en términos comerciales, tales como aves de corral, pollos, patos, gansos y/o pavos.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos de preparación incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes accesorios y, a continuación, si fuera necesario y/o deseable, dividir, formar y/o envasar del producto en un conjunto de dosis única o de dosis múltiples deseado.

Una composición farmacéutica según la invención puede prepararse, empaquetarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria individual y/o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Tal como se usa en esta invención, una «dosis unitaria» es la cantidad discreta de composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es, por lo general, equivalente a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de tal dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosificación.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la invención variarán conforme a la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y adicionalmente según la vía de administración de la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre el 0,1 y el 100 %, por ejemplo, entre el ,5 y el 50 %, entre el 1 - 30 %, entre el 5 - 80 % o al menos el 80 % (p/p) de ingrediente activo.

Formulaciones

Los ARNm de la descripción se pueden formular usando uno o más excipientes para: (1) aumentar la estabilidad, (2) aumentar la transfección de células; (3) permitir la liberación sostenida o demorada (por ejemplo, a partir de una formulación de depósito del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm); (4) alterar la biodistribución (por ejemplo, direccionar el polinucleótido, construcción primaria o ARNmm a tejidos o tipos celulares específicos); (5) aumentar la traducción de proteína codificada in vivo; y/o (6) alterar el perfil de liberación de proteína codificada in vivo.Además de los excipientes tradicionales tales como todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, los excipientes de la presente divulgación pueden incluir, sin limitación, lípidos, liposomas, nanopartículas lipídicas, polímeros, lipoplejos, nanopartículas núcleo-capa, péptidos, proteínas, células transfectadas con polinucleótido, construcción primaria o ARNm (por ejemplo, para trasplante en un sujeto), hialuronidasa, imitadores de nanopartículas y combinaciones de los mismos. Por consiguiente, las formulaciones de la divulgación pueden incluir uno o más excipientes, cada uno en una cantidad que en conjunto aumenta la estabilidad del polinucleótido, construcción primaria o ARNm, aumenta la transfección celular por el polinucleótido, construcción primaria o ARNm, aumenta la expresión de polinucleótido, construcción primaria o proteína codificada por ARNmm y/o altera el perfil de liberación de polinucleótidos, construcción primaria o proteínas codificadas por ARNmm. Además, los ARNmm de la presente descripción pueden formularse usando nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas. Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos preparatorios incluyen el etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más de otros ingredientes accesorios.

Una composición farmacéutica según la invención puede prepararse, empaquetarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria individual y/o como una pluralidad dosis unitarias individuales. Tal como se usa en esta invención, una «dosis unitaria» es la cantidad discreta de composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es, por lo general, equivalente a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de tal dosificación incluyendo, sin limitación, la mitad o un tercio de tal dosificación.

Cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la presente divulgación puede variar, conforme a la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y adicionalmente según la vía de administración de la composición. Por ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1 % y 99 % (p/p) del ingrediente activo.

Las formulaciones descritas en esta invención pueden contener al menos un polinucleótido sintético. Como un ejemplo no limitante, las formulaciones pueden contener 1, 2, 3, 4 o 5 ARNmm. La formulación puede contener proteínas codificantes de ARNm modificado seleccionadas de entre categorías tales como, entre otras, proteínas humanas, proteínas veterinarias, proteínas bacterianas, proteínas biológicas, anticuerpos, proteínas inmunogénicas, péptidos y proteínas terapéuticos, proteínas secretadas, proteínas de la membrana plasmática, citoplasmáticas y proteínas citoesqueléticas, proteínas unidas a la membrana intracelular, proteínas nucleares, proteínas asociadas con enfermedades humanas y/o proteínas asociadas con enfermedades no humanas. En un aspecto, la formulación contiene al menos tres proteínas que codifican ARNm modificado. En un aspecto, la formulación contiene al menos cinco proteínas que codifican ARNm modificado.

Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, tal como se utiliza en esta invención, incluye todos los solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes activos de superficie, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según corresponda a la forma de dosificación particular deseada. En la técnica, se conocen varios excipientes para la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Salvo en la medida que algún medio excipiente convencional no sea compatible con una sustancia o sus derivados, tal como en la producción de un efecto biológico no deseado o, de otro modo, en la interacción de forma nociva con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica, se pretende que su uso se encuentre dentro del alcance de la presente invención.

En algunos casos, el tamaño de partícula de la nanopartícula lipídica puede aumentarse y/o disminuirse. El cambio en el tamaño de partícula puede ayudar a contrarrestar una reacción biológica tal como, entre otras, la inflamación, o puede aumentar el efecto biológico del ARNm modificado administrado a mamíferos.

Excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados en la elaboración de composiciones farmacéuticas incluyen, de modo no taxativo, diluyentes inertes, agentes activos de superficie y/o emulsionantes, conservantes, agentes tampones, agentes lubricantes y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en composiciones farmacéuticas de la divulgación.

Lipidoides

La síntesis de lípidoides se ha descrito ampliamente y las formulaciones que contienen estos compuestos son particularmente adecuadas para el suministro de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm (véase Mahon y col., Bioconjug Chem. 201021:1448-1454; Schroeder y col., J Intern Med. 2010267:9-21; Akinc y col., Nat Biotechnol.

2008 26:561-569; Love y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2010107:1864-1869; Siegwart y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-3001).

Si bien estos lípidoides se han utilizado para administrar eficazmente pequeñas moléculas de ARN interferente de doble cadena en roedores y primates no humanos (ver Akinc y col., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Frank-Kamenetsky y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2008105:11915-11920; Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879; Love y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2010107:1864-1869; Leuschner y col., Nat Biotechnol. 201129:1005-1010), la presente divulgación describe su formulación y uso en el suministro de polinucleótidos monocatenarios, construcciones primarias o ARNmm. Se pueden preparar complejos, micelas, liposomas o partículas que contengan estos lípidos y, por lo tanto, pueden dar como resultado un suministro efectivo del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm, según se juzgue por la producción de una proteína codificada, después de la inyección de una formulación lipidoide a través de vías de administración localizadas y/o sistémicas. Complejos lipidoides de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm pueden administrarse por diversos medios que incluyen, pero no se limitan a, las vías intravenosa, intramuscular o subcutánea.

La administración in vivo de ácidos nucleicos puede verse afectada por muchos parámetros, que incluyen, entre otros, la composición de la formulación, la naturaleza de la PEGilación de las partículas, el grado de carga, la relación entre oligonucleótidos y lípidos y parámetros biofísicos como el tamaño de las partículas (Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879). Como ejemplo, pequeños cambios en la longitud de la cadena de anclaje de los lípidos de poli(etilenglicol) (PEG) pueden resultar en efectos significativos sobre la eficacia in vivo. Formulaciones con los diferentes lípidos, que incluyen, pero no se limitan a clorhidrato de penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilenetetramina (TETA-5LAP; también conocido como 98N12-5, véase Murugaiah y col., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)), C12-200 (incluidos derivados y variantes) y MD1, se pueden probar para determinar la actividad in vivo.

El lípidoide al que se hace referencia en esta invención como "98N12-5" es descrito por Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879. (Véase la figura 2)

El lípidoide al que se hace referencia en esta invención como "C12-200" se describe por Love y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869 (véase la Figura 2) y Liu and Huang, Molecular Therapy. 2010669-670 (véase Figura 2). Las formulaciones de lípidos pueden incluir partículas que comprenden 3 o 4 o más componentes además del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm. Como ejemplo, las formulaciones con ciertos lípidos incluyen, pero no se limitan a, 98N12-5 y pueden contener 42 % de lípido, 48 % de colesterol y 10 % de PEG (longitud de la cadena de alquilo C14). Como otro ejemplo, las formulaciones con ciertos lípidos incluyen, pero no se limitan a, C12-200 y pueden contener 50 % de lípido, 10 % de disteroilfosfatidilcolina, 38,5 % de colesterol y 1,5 % de PEG-DMG.

En un aspecto, un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm formulado con un lípido para administración intravenosa sistémica puede dirigirse al hígado Por ejemplo, una formulación intravenosa optimizada final que utiliza polinucleótido, construcción primaria o ARNmm, y que comprende una composición molar de lípidos de 42 % 98N12-5, 48 % de colesterol y 10 % de PEG-lípido con una relación en peso final de aproximadamente 7,5 a 1 de lípido total a polinucleótido, construcción primaria o ARNmm, y una longitud de cadena de alquilo C14 en el lípido de PEG, con un tamaño medio de partícula de aproximadamente 50-60 nm, puede dar como resultado que la distribución de la formulación sea superior al 90 % al hígado (ver, Akinc y col., Mol Ther.2009 17:872-879). En otro ejemplo, una formulación intravenosa que usa un C12-200 (ver solicitud provisional de EE. UU. 61/175.770 del cual la solicitud publicada WO/2010/129709 reivindica prioridad y la solicitud internacional publicada WO2010129709) el lipidoide puede tener una relación molar de 50/10/38,5/1,5 de C12-200/disteroilfosfatidil colina/colesterol/PEG-DMG, con una relación en peso de 7 a 1 lípido total a polinucleótido, construcción primaria o ARNmm, y un tamaño de partícula medio de 80 nm puede ser efectivo administrar polinucleótidos, construcción primaria o ARNmm a los hepatocitos (ver, Love y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869). En otro aspecto, se puede usar una formulación que contiene lípidos MD1 para administrar efectivamente polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm a hepatocitos in vivo.Las características de las formulaciones de lípidos optimizadas para las rutas intramuscular o subcutánea pueden variar significativamente dependiendo del tipo celular diana y la capacidad de las formulaciones para difundirse a través de la matriz extracelular hacia el torrente sanguíneo. Si bien se puede desear un tamaño de partícula de menos de 150 nm para una administración efectiva de hepatocitos debido al tamaño de las fenestras endoteliales (ver, Akinc y col., Mol Ther. 2009 17:872-879), el uso de un polinucleótido formulado con lípidos, una construcción primaria o un ARNmm para administrar la formulación a otros tipos celulares, incluidas, entre otras, las células endoteliales, las células mieloides y las células musculares puede no tener un tamaño similar. Se ha informado del uso de formulaciones de lípidos para administrar siRNA in vivo a otras células que no sean hepatocitos, como las células mieloides y el endotelio (ver Akinc y col., Nat Biotechnol. 200826:561-569; Leuschner y col., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-10l 0; Cho y col. Adv. Funct. Mater. 2009 19:3112-3118; 8a Conferencia Internacional Judah Folkman, Cambridge, MA 8 al 9 de octubre de 2010). La administración efectiva a células mieloides, como los monocitos, las formulaciones de lípidos pueden tener una proporción molar de componentes similar. Se pueden usar diferentes proporciones de lípidoides y otros componentes que incluyen, pero no se limitan a, disteroilfosfatidilcolina, colesterol y PEG-DMG, para optimizar la formulación del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm para la administración a diferentes tipos celulares, incluidos, entre otros, a, hepatocitos, células mieloides, células musculares, etc. Por ejemplo, la relación molar del componente puede incluir, pero no se limita a, 50 % C12-200, 10 % disteroilfosfatidilcolina, 38,5 % colesterol y %1,5 PEG-DMG (ver Leuschner y col., Nat Biotechnol 201129:1005-1010). El uso de formulaciones de lípidos para el suministro localizado de ácidos nucleicos a las células (tales como, pero no limitado a, células adiposas y células musculares) por vía subcutánea o intramuscular, puede no requerir todos los componentes de la formulación deseados para el suministro sistémico, y como tal, puede comprender solo el lípidoide y el polinucleótido, construcción primaria o ARNmm.

Pueden usarse combinaciones de diferentes lípidos para mejorar la eficacia de la producción de proteína dirigida por polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm, ya que los lípidos pueden aumentar la transfección celular por el polinucleótido, construcción primaria o ARNmm; y/o aumentar la traducción de la proteína codificada (ver Whitehead y col., Mol. Ther. 2011, 19:1688-1694).

Liposomas, lipoplexos y nanopartículas lipídicas

El polinucleótidos, contrucción primaria y ARNmm de la divulgación pueden formularse mediante el uso de uno o más liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas. En un aspecto, las composiciones farmacéuticas de polinucleótido, construcción primaria o ARNmm incluyen liposomas. Los liposomas son vesículas preparadas artificialmente que pueden estar compuestas principalmente por una bicapa lipídica y pueden usarse como vehículo de suministro para la administración de nutrientes y formulaciones farmacéuticas. Los liposomas pueden ser de diferentes tamaños como, entre otros, una vesícula multilaminar (MLV) que puede tener cientos de nanómetros de diámetro y puede contener una serie de bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos estrechos, una pequeña vesícula unicelular (SUV) que puede ser menor de 50 nm de diámetro y una gran vesícula unilaminar (LUV) que puede tener entre 50 y 500 nm de diámetro. El diseño de liposomas puede incluir, pero no se limita a, opsoninas o ligandos con el fin de mejorar la unión de los liposomas a tejidos no saludables o para activar eventos tales como, pero sin limitarse a, endocitosis. Los liposomas pueden contener un pH alto o bajo para mejorar la administración de las formulaciones farmacéuticas.

La formación de liposomas puede depender de las características fisicoquímicas tales como, de modo no taxativo, la formulación farmacéutica atrapada y los ingredientes liposómicos, la naturaleza del medio donde las vesículas lipídicas se dispersan, la concentración efectiva de la sustancia atrapada y su potencial toxicidad, cualquier procedimiento adicional implicado durante la aplicación y/o suministro de las vesículas, el tamaño de optimización, la polidispersidad y la vida útil de las vesículas para la aplicación prevista y la reproducibilidad lote a lote y la posibilidad de una producción a gran escala de productos liposómicos eficientes y seguros.

En un aspecto, las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención pueden incluir, de modo no taxativo, liposomas tales como aquellos que se forman a partir de liposomas de 1,2-dioleiloxi-W,W-dimetilaminopropano (DODMA), liposomas de DiLa2 de Marina Biotech (Bothell, WA), 1,2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), y MC3 (US20100324120) y liposomas que pueden administrar fármacos de moléculas pequeñas tales como, de modo no taxativo, DOXIL® de Janssen Biotech, Inc. (Horsham, PA).

En un aspecto, las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención pueden incluir, sin limitación, liposomas tales como los formados a partir de la síntesis de partículas plásmido-lípido estabilizadas (SPLP) o partículas lipídicas de ácido nucleico estabilizadas (SNALP) que se han descrito previamente y se ha demostrado que son adecuadas. para la administración de oligonucleótidos in vitro e in vivo (ver Wheeler y col. Gene Therapy. 19996:271-281; Zhang y col. Gene Therapy. 19996:1438-1447; Jeffs y col. Pharm Res. 200522:362-372; Morrissey y col., Nat Biotechnol.

2005 2:1002-1007; Zimmermann y col., Nature. 2006 441:111-114; Heyes y col. J Contr Rel. 2005 107:276-287; Semple y col. Nature Biotech. 201028:172-176; Judge y col. J Clin Invest. 2009 119:661-673; de Fougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132). El procedimiento de fabricación original de Wheeler y col. fue un procedimiento de diálisis de detergente, que fue mejorado más adelante por Jeffs y col. y se denomina procedimiento espontáneo de formación de vesículas. Las formulaciones de liposomas se componen de 3 a 4 componentes lipídicos además del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm. Como ejemplo, un liposoma puede contener, pero no se limita a, 55 % de colesterol, 20 % de disteroilfosfatidilcolina (DSPC), 10 % de PEG-S-DSG y 15 % de 1,2-dioleiloxi-W,W-dimetilaminopropano (DODMA), según descrito por Jeffs y col. Como otro ejemplo, ciertas formulaciones de liposomas pueden contener, pero no se limitan a, 48 % de colesterol, 20 % de DSPC, 2 % de PEG-c-DMA y 30 % de lípido catiónico, donde el lípido catiónico puede ser 1,2-diestearloxi-W,W-dimetilaminopropano (DSDMA), DODMA, DLin-DMA, o 1,2-dilinoleniloxi-3-dimetilaminopropano (DLenDMA), según descrito por Heyes y col.

Los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm se puede formular en una vesícula lipídica que puede tener enlaces cruzados entre bicapas lipídicas funcionalizadas.

Los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm se puede formular en un complejo lípido-policatión. La formación del complejo lípido-policatión puede lograrse mediante procedimientos conocidos en la técnica y/o como se describe en la Pub. de EE. UU. n.° 20120178702. A modo de ejemplo no taxativo, el policatión puede incluir un polipéptido o péptido catiónico, tal como, de modo no taxativo, polilisina, poliornitina y/o poliarginina. En otro caso, los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNm se pueden formular en un complejo lípido-policatión que puede incluir además un lípido neutro tal como, pero sin limitarse a, colesterol o dioleoil fosfatidiletanolamina (DOpE).

Una formulación de nanopartículas lipídicas puede verse afectada, de modo no taxativo, por la selección del componente lipídico catiónico, el grado de saturación lipídica catiónica, la naturaleza de la PEGilación, la relación de todos los componentes y parámetros biofísicos tales como el tamaño. En un ejemplo de Semple y col. (Semple y col. Nature Biotech. 201028:172-176), la formulación de liposomas estaba compuesta de 57,1 % de lípido catiónico, 7,1 % de dipalmitoilfosfatidilcolina, 34,3 % de colesterol y 1,4 % de PEG-c-DMA. Como otro ejemplo, cambiar la composición del lípido catiónico podría entregar siRNA de manera más efectiva a varias células presentadoras de antígenos (Basha y col. Mol Ther. 2011 19:2186-22003.

La proporción de PEG en las formulaciones de LNP puede aumentar o disminuir y/o la longitud de la cadena de carbono del lípido PEG puede modificarse de C14 a C18 para alterar la farmacocinética y/o biodistribución de las formulaciones de LNP. Como ejemplo no limitante, las formulaciones de LNP pueden contener 1-5 % de la relación molar de lípidos de PEG-c-DOMG en comparación con el lípido catiónico, DSPC y colesterol. En otra modalidad, es posible reemplazar PEG-c-DOMG con un lípido con PEG tal como, de modo no taxativo, PEG-DSG (1,2-distearoil-snglicerol, metoxipolietilenglicol), o PEG-DMG (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol). El lípido catiónico se puede seleccionar de entre cualquier lípido conocido en la técnica tal como, de modo no taxativo, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 y DLin-KC2-DMA.

El lípido catiónico puede seleccionarse, de modo no taxativo, de entre un lípido catiónico descrito en las Publicaciones internacionales n.° WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865 y WO2008103276, Patentes EE. UU. n.° 7.893.302 y 7.404.969 y Publicación de Patente EE. UU. n.° US20100036115. En otro caso, el lípido catiónico puede seleccionarse de entre, pero sin limitarse a, la fórmula A descrita en Publicaciones internacionales n.° WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365 y WO2012044638. En otro caso más, el lípido catiónico puede seleccionarse de entre, pero sin limitarse a, la fórmula CLI-CLXXIX de la Publicación internacional n.° WO2008103276, fórmula CLI-CLXXIX de la Patente de EE. UU. n.° 7,893.302, fórmula CLI -CLXXXXII de la Patente de EE. UU. n.° 7.404.969 y fórmula I-VI de la Publicación de Patente de EE. UU. n.° US20100036115. Como ejemplo no limitante, el lípido catiónico se puede seleccionar de entre (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonacosa-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimemilhexacosa-17,20-dien-9-amina, (1 Z, 19Z)-N5N~dimetilpentacosa~16, 19-dien-8-amina, (13Z,16z)-N,N-dimetildocosa-13J16-dien-5-amina, (12Z,15Z)-NJN-dimetilhenicosa-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-6-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-7-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptacosa-18,21-dien-10-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetracosa-15,18-dien-5-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltricosa-14,17-dien-4-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimeihiloctacosa-19,22-dien-9-amina, (18Z,21 z )-N,N-dimetilheptacosa- 18 ,21 -dien-8 -amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilhexacosa- 17"20-dien-7-amina, (16Z;19Z)-N,N-dimetilpentacosa-16,19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentriaconta-22,25-dien- 10-amina, (21 Z ,24^z )-N;N-dimetiltriaconta-21 ,24-dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptacos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilhexacos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-NJN-dimetiloctacosa-19,22-dien-7-amina, N,N-dimetilheptacosan-10-amina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonacosa-20J23-dien-10-amina, 1-[(11Z,14Z)-l-nonilicosa-l 1, 14-dien-l-il] pyrrolidina, (20Z)-N,N-dimetilheptacos-20-en-l 0-amina, (15Z)-N,N-dimetil eptacos-15-en-l 0-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonacos-14-en-l 0-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonacos-17-en-l 0-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriacont-24-en-l 0-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonacos-20-en-l 0­ amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriacont-22-en-l 0-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentacos-16-en-8-amina, (12Z, 15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenico sa- 12 , 15 -dien- 1 -amina, (13Z, 16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-l 3, 16-dien-l — amina, N,N-dimetil-l-[(l S,2R)-2-octilciclopropil] eptadecan-8-amina, 1 -[(1 S,2R)-2-hexilciclopropil]-N,N-dimetilnonadecan- 10-amina, N,N-dimetil- 1 - [(1 S ,2R)-2-octilciclopropil]nonadecan- 10-amina, N,N-dimetil-21~[(lS,2R)-2-octilciclopropil]henicosan-l 0-amina, N,N-dimetil- 1 -[(1 S ,2S)-2- { [(lR,2R)-2-pentilciclopropil]metil} ciclopropil]nonadecan- 10-amina, N,N-dimetil- 1 -[(1 S,2R)-2-octilciclopropil]hexadecan-8-amina, N,N-dimetiH -[(1R,2S)-2-undecilciclopropil]tetradecan-5-amina, N,N-dimetil-3- {7-[(1 S,2R)-2-octilciclopropil]heptil} dodecan- 1 -amina, 1 - [(1R,2 S)-2-hepti lciclopropi 1] -N,N-dimetiloctadecan-9 -amina, 1-[(1 S,2R)-2-decilciclopropil]-N,N-dimetilpentadecan-6-amina, N,N-dimetil-l-[(lS,2R)-2-octilciclopropil]pentadecan-8-amina, R -N,N-dimetil-1- [(9^z ,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3 -(octiloxi)propan-2-amina, S -N,N-dimetil-1- [(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-3 -(octiloxi)propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]-1-[(octiloxi)metil]etil}pirrolidina, (2S)-N,N-dimetil-1 -[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -iloxi]-3-[(5Z)-oct-5-en-1 -iloxi]propan-2-amina, 1 -{2-[(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1 iloxi]-1 -[(octiloxi) metil]etil}azetidina, (2S)-1-(hexiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2S)-1-(heptiloxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloxi)-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-octadec-9-en-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina (Compuesto 9); (2S)-N,N-dimetil-1-[(6Z,9Z,12Z)-octadeca-6,9,12-trien-1-iloxi]-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(pentiloxi)propan-2-amina, (2S)-1-(hexiloxi)-3-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z)-icosa-11,14-dien-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1 -[(13Z, 16Z)-docosa-l3,16-dien-l-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2S)-1 -[(13Z, 16Z)-docosa-13,16-dien-1 -iloxi]-3 -(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-3-(hexiloxi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-docos-13-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-hexadec-9-en-1-iloxi]-N,N-dimetil-3-(octiloxi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoylo ctil)oxi]-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, (2R)-1-[(3,7-dimetiloctil)oxi]-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(octiloxi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciclopropil]metil}ciclopropil]octil}oxi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-oclylciclopropil)octil]oxi}-3-(octiloxi)propan-2-amina y (1lE,20Z,23Z)-N;N-dimetilnonacosa-l1,20,2-trien-10-amina o una sal o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de los mismos.

El lípido catiónico se puede sintetizar mediante procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en las Publicaciones internacionales n.° WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724 y WO201021865.

Las formulaciones de LNP de los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm pueden contener PEG-c-DOMG con una relación molar de lípidos de 3 %. En otro caso, las formulaciones de LNP de los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNm pueden contener PEG-c-DOMG con una relación molar de lípidos de 1,5 %. Las composiciones farmacéuticas de los polinucleótidos, construcciones primarias. y/o ARNmm pueden incluir al menos uno de los lípidos PEGilados descritos en la Publicación internacional n.° 2012099755.

La formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000 (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fofoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000). En algunas realizaciones, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, un lípido catiónico conocido en la técnica y al menos un componente adicional. En algunas realizaciones, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, un lípido catiónico conocido en la técnica y DSPC y colesterol. Como ejemplo no limitante, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol. Como ejemplo no limitante adicional, la formulación de LNP puede contener PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC y colesterol en una relación molar de 2:40:10:48 (véase Geall y col., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines, PNAS 2012; PMID: 22908294).

La formulación de LNP se puede formular mediante los procedimientos descritos en Publicaciones internacionales n.° WO2011127255 o WO2008103276. Como ejemplo no limitante, el ARN modificado descrito en esta invención puede encapsularse en formulaciones de LNP como se describe en WO2011127255 y/o WO2008103276.

Las formulaciones de LNP descritas en esta invención pueden comprender una composición policatiónica. A modo de ejemplo no taxativo, la composición policatiónica puede seleccionarse de entre la fórmula 1-60 de la publicación de patente de EE. UU. n.° US20050222064. En otro caso, las formulaciones de LNP que comprenden una composición policatiónica puede usarse para la administración del ARN modificado descrito en esta invención in vivo y/o in vitro. Las formulaciones de LNP descritas en esta invención pueden comprender adicionalmente una molécula que mejore la permeabilidad. Se describen ejemplos de moléculas que mejoran la permeabilidad no taxativos en la publicación de patente de EE. UU. n.° US20050222064.

Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en liposomas tales como, entre otros, liposomas DiLa2 (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES® (Marina Biotech, Bothell, WA), DOPC neutro (liposomas de 1,2-dioleoil-snglicero basados en -3-fosfocolina) (por ejemplo, suministro de siRNA para cáncer de ovario (Landen y col. Cancer Biology & Therapy 20065(12)1708-1713)) y liposomas recubiertos de hialuronano (Quiet Therapeutics, Israel). Las formulaciones de nanopartículas lipídicas pueden mejorarse al reemplazar el lípido catiónico con un lípido catiónico biodegradable que se sepa que es una nanopartícula lipídica de eliminación rápida (reLNP - rapidly eliminated lipid nanoparticle). Se ha demostrado que los lípidos catiónicos ionizables, tales como, de modo no taxativo, DLinDMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-DMA, se acumulan en plasma y los tejidos con el tiempo y pueden ser una fuente potencial de toxicidad. El metabolismo rápido de los lípidos de eliminación rápida puede mejorar la tolerabilidad e índice terapéutico de las nanopartículas lipídicas en un orden de magnitud de una dosis de 1 mg/kg a una dosis de 10 mg/kg en ratas. La inclusión de un enlace de éster degradado de forma enzimática puede mejorar el perfil de degradación y metabolismo del componente catiónico, mientras que igual se mantiene la actividad de la formulación de reLNP. El enlace de éster puede ubicarse internamente dentro de la cadena lipídica o puede encontrarse de forma terminal en un extremo de la cadena lipídica. El enlace de éster interno puede reemplazar cualquier carbono de la cadena lipídica.

El enlace éster interno puede estar ubicado en cualquier lado del carbono saturado Ejemplos no limitantes de reLNP incluyen,

Se puede provocar una respuesta inmune administrando una nanopartícula lipídica que puede incluir una nanoespecie, un polímero y un inmunógeno. (Publicación de EE. UU. n.° 20120189700 y Publicación internacional n.° WO2012099805). El polímero puede encapsular la nanoespecie o encapsular parcialmente la nanoespecie.

Las nanopartículas lipídicas pueden diseñarse para alterar las propiedades superficiales de las partículas, de manera que las nanopartículas lipídicas puedan penetrar la barrera de mucosa. La mucosa está ubicada en el tejido mucoso, tales como, por ejemplo, oral (por ejemplo, las membranas bucales y esofágicas y el tejido de las amígdalas), oftálmico, gastrointestinal (por ejemplo, estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, recto), nasal, respiratorio (por ejemplo, membrana nasal, faríngea, traqueal y bronquial), genital (por ejemplo, membrana vaginal, del cuello del útero y uretral). Se creía que las nanopartículas mayores que 10-200 nm que se prefieren por su mayor eficacia de encapsulación del fármaco y la capacidad de proporcionar administración sostenida para un conjunto amplio de fármacos, eran muy grandes como para difundirse rápidamente a través de las barreras de mucosa. La mucosa se secreta, dispersa, descarta o digiere y recicla continuamente, de manera que la mayoría de las partículas atrapadas puedan eliminarse del tejido mucoso en segundos o en unas pocas horas. Las nanopartículas poliméricas mayores (con un diámetro entre 200 nm y 500 nm) que se han recubierto de forma densa con un polietilenglicol (PEG) de peso molecular bajo se difunden a través de la mucosa solamente de 4 a 6 veces más lentamente que la difusión de las mismas partículas en agua (Lai y col. PNAS 2007 104(5): 1482-487; Lai y col. Adv Drug Deliv Rev. 200961(2): 158­ 171). El transporte de nanopartículas puede determinarse mediante el uso de velocidades de permeación y/o técnicas de microscopía fluorescente, inclusive, de modo no taxativo, recuperación de fluorescencia a continuación de fotoblanqueo (FRAP) y rastreo de partículas múltiples (MPT) de alta resolución.

Las nanopartículas lipídicas diseñadas para penetrar la mucosa pueden comprender un material polimérico (es decir, un núcleo polimérico) y/o un conjugado de polímero y vitamina y/o un copolímero de tribloque. El material polimérico puede incluir, de modo no taxativo, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poli(estirenos), poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimeacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos. El material polimérico puede ser biodegradable y/o biocompatible. Ejemplos no taxativos de polímeros específicos incluyen poli(caprolactona) (PCL), polímero de acetato de etilenvinilo (EVA), ácido (poli)láctico (PLA), ácido (poli)(L-láctico (PLA), ácido (poli)glicólico (PGA), ácido (poli)láctico-co-glicólico (PlGa ), ácido (poli)L-láctico-co-glicólico (PLGA), poli(D,L-láctido) (PDLA), poli(L-láctido) (PLA), poli(D,L-láctido-co-caprolactona), poli(D,L-láctido-co-caprolactona-co-glicólido), poli(D,L-láctido-co-PEO-co-D,L-láctido), poli(D,L-láctido-co-PPO-co-D,L-láctido), cianoacrilato de polialquilo, poliuretane, poli-L-lisina (PL), hidroxipropil metacrilato (HPMA), polietileneglicol, ácido poli-L-glutámico, ácidos (poli)hidroxi, polianhídridos, poliortoésteres, amidas de (poli)éster, poliamidas, éteres de (poli)éster, policarbonatos, polialquilenos, tales como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles, tales como poli(etilenglicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO), tereftalatos de polialquileno, tales como tereftalato de (poli)etileno, alcoholes polivinílicos (PVA), éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, tales como acetato de (poli)vinilo, haluros de polivinilo, tales como cloruro de (poli)vinilo (PVC), polivinilpirrolidona, polisiloxanos, poliestireno (PS), poliuretanos, celuloses derivadas, tales como alquil celulosas, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, polímeros of ácidos acrílicos, tales como poli(metil(met)acrilato) (PMMA), poli(etil(met)acrilato), poli(butil(met)acrilato), poli(isobutil(met)acrilato), poli(hexil(met)acrilato), poli(isodecil(met)acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), poli(octadecil acrilato) y copolímeros y mezclas de los mismos, polidioxanona y sus copolímeros, polihidroxialcanoatos, fumarato de polipropileno, polioximetileno, poloxámeros, poli(orto)ésteres, ácido (poli)butírico, ácido (poli)valérico, poli(láctido-co-caprolactona, y carbonato de trimetileno, polivinilpirrolidona. Las nanopartículas lipídicas pueden recubrirse o asociarse con un copolímero, tal como, de modo no taxativo, un copolímero de bloque y copolímero de tribloque (poli(etilenglicol))-óxido de (poli)etileno-(poli(etilenglicol))(ver Publicación EE. UU. 20120121718 y Publicación EE. UU. 201000033370). El copolímero puede ser un polímero que se considera en general seguro (GRAS) y la formación de la nanopartícula lipídica puede ser de una manera tal que no se creen entidades químicas nuevas. Por ejemplo, la nanopartícula lipídica puede comprender poloxámeros que recubren nanopartículas de PLGA sin formar entidades químicas nuevas que todavía son capaces de penetrar rápidamente en la mucosa humana (Yang y col. Chem. Int. Ed. 2011 50:2597-2600).

La vitamina del conjugado de polímero-vitamina puede ser vitamina E. La porción de vitamina del conjugado se puede sustituir con otros componentes adecuados como, por ejemplo, vitamina A, vitamina E, otras vitaminas, colesterol, un resto hidrofóbico o un componente hidrofóbico de otros surfactantes (por ejemplo, cadenas de esterol, ácidos grasos, cadenas de hidrocarburos y cadenas de óxido de alquileno).

La nanopartícula lipídica modificada para penetrar la mucosa puede incluir agentes que modifican la superficie como, entre otros, ARNmm, proteínas aniónicas (por ejemplo, albúmina de suero bovino), surfactantes (por ejemplo, surfactantes catiónicos como, por ejemplo, bromuro de dimetildioctadecil-amonio), azúcares o derivados de azúcares (por ejemplo, ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (por ejemplo, heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (por ejemplo, N-acetilcisteína, artemisa, bromelaina, papaína, clerodendrum, acetilcisteína, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domyodol, letosteína, estepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4 dornasa alfa, neltenexina, erdosteína) y diversas DNasas incluido rhDNasa. El agente que altera la superficie puede incrustarse o incorporarse en la superficie de la partícula, o disponerse (por ejemplo, mediante recubrimiento, adsorción, enlace covalente u otro procedimiento) en la superficie de la nanopartícula lipídica (Ver Publicación EE. UU. 20100215580 y Publicación EE. UU. 20080166414).

En una modalidad, las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa pueden comprender al menos un ARNmm descrito en esta invención. El ARNmm puede encapsularse en la nanopartícula lipídica y/o disponerse en la superficie de la partícula. El ARNmm puede acoplarse de forma covalente a la nanopartícula lipídica. Las formulaciones de nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa pueden comprender una pluralidad de nanopartículas. Además, las formulaciones pueden contener partículas que pueden interactuar con la mucosa y alterar las propiedades estructurales y/o adhesivas de la mucosa circundante para disminuir la mucoadhesión, lo cual puede aumentar la administración de las nanopartículas lipídicas que penetran la mucosa en el tejido mucoso.

En un aspecto, el polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm se formula como un lipoplex, como, entre otros, el sistema ATUPLEX ™, el sistema DACC, el sistema DBTC y otra tecnología de siRNA-lipoplex de Silence Therapeutics (Londres, Reino Unido), STEMFECT™ de STEM^g EⁿT® (Cambridge, MA) y polietilenimina (PEI) o entrega dirigida y no dirigida de ácidos nucleicos a base de protamina (Aleku y col. Cancer Res. 200868:9788-9798; Strumberg y col. Int J Clin Pharmacol Ther 201250:76-78; Santel y col., Gene Ther 200613:1222-1234; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier y col., Pulm Pharmacol. Ther. 201023:334-344; Kaufmann y col. Microvasc Res 2010 80:286-293Weide y col. J Immunother. 2009 32:498-507; Weide y col. J Immunother. 2008 31:180-188; Pascolo Expert Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek y col., 2011 J. Immunother. 34:1-15; Song y col., Nature Biotechnol. 2005, 23:709-717; Peer y col., Proc Natl Acad Sci USA. 20076;104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther. 200819:125-132).

Dichas formulaciones también pueden construirse o modificarse las composiciones de manera que se dirijan pasiva o activamente a diferentes tipos celulares in vivo, incluidos, entre otros, hepatocitos, células inmunes, células tumorales, células endoteliales, células presentadoras de antígenos y leucocitos (Akinc y col. Mol Ther. 201018:1357-1364; Song y col., Nat Biotechnol. 200523:709-717; Judge y col., J Clin Invest. 2009 119:661-673; Kaufmann y col., Microvasc Res 2010 80:286-293; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel y col., Gene Ther 2006 13:1360-1370; Gutbier y col., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Basha y col., Mol. Ther. 2011 19:2186-2200; Fenske and Cullis, Expert Opin Drug Deliv. 20085:25-44; Peer y col., Science. 2008319:627-630; Peer y Lieberman, Gene Ther.

2011 18:1127-1133). Un ejemplo de direccionamiento pasivo de formulaciones a células hepáticas incluye las formulaciones de nanopartículas lipídicas a base de DLin-DMA, DLin-KC2-DMA y DLin-MC3-DMA, que han demostrado unirse a la apoliproteína E y promover la unión y absorción de estas formulaciones en hepatocitos in vivo (Akinc y col. Mol Ther. 2010 18:1357-1364). Las formulaciones también pueden dirigirse selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos en su superficie, como se ejemplifica, pero no se limita a, folato, transferrina, N-acetilgalactosamina (GalNAc) y estrategias dirigidas a anticuerpos (Kolhatkar y col., Curr Drug Discov Technol. 2011 8:197-206; Musacchio and Torchilin, Front Biosci. 2011 16:1388-1412; Yu y col., Mol Membr Biol. 201027:286-298; Patil y col., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 200825:1-61; Benoit y col., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714Zhao y col., Expert Opin Drug Deliv. 20085:309-319; Akinc y col., Mol Ther. 201018:1357-1364; Srinivasan y col., Methods Mol Biol. 2012820:105-116; Ben-Arie y col., Methods Mol Biol.2012757:497-507; Peer 2010 J Control Release. 20:63-68; Peer y col., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:4095-4100; Kim y col., Methods Mol Biol. 2011 721:339-353; Subramanya y col., Mol Ther. 201018:2028-2037; Song y col., Nat Biotechnol. 200523:709-717; Peer y col., Science.

2008319:627-630; Peer and Lieberman, Gene Ther. 2011 18:1127-1133).

En algunos casos, el polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm se formula como una nanopartícula lipídica sólida. Una nanopartícula lipídica sólida (SLN) puede ser esférica con un diámetro promedio de entre 10 y 1000 nm. La SLN posee una matriz central lipídica sólida que puede solubilizar moléculas lipofílicas y puede estabilizarse con tensioactivos y/o emulsionantes. La nanopartícula lipídica puede ser una nanopartícula lípido-polímero autoensamblada (ver Zhang y col., ACS Nano, 2008, 2 (8), pp. 1696-1702).

Pueden usarse liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas para mejorar la eficacia de la producción de proteína dirigida por polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm, ya que estas formulaciones pueden aumentar la transfección celular por el polinucleótido, construcción primaria o ARNm; y/o aumentar la traducción de la proteína codificada. Un ejemplo de esto implica el uso de la encapsulación de lípidos para facilitar la administración sistémica efectiva de ADN de plásmido poliplejo (Heyes y col. Mol Ther. 2007 15:713-720). También pueden utilizarse los liposomas, lipoplejos o nanopartículas lipídicas para aumentar la estabilidad del polinucleótido.

Los polinucleótidos, construcciones primarias, y/o el ARNmm de la presente divulgación se puede formular para liberación controlada y/o entrega dirigida. Tal como se usa en esta invención, “liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se conforma a un patrón particular de liberación para efectuar un resultado terapéutico. Los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNm pueden encapsularse en un agente de administración descrito en esta invención y/o conocido en la técnica para liberación controlada y/o administración dirigida. Tal como se usa en esta invención, el término "encapsular" significa envolver, encerrar o rodear. En lo que se refiere a la formulación de los compuestos de la divulgación, la encapsulación puede ser sustancial, completa o parcial. El término "sustancialmente encapsulado" significa que al menos más del 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,9 o más del 99,999 % de la composición farmacéutica o compuesto de la la divulgación puede estar envuelta, rodeada o encerrada dentro del agente de entrega. “Encapsulación parcial” significa que menos que 10, 10, 20, 30, 40, 50 % o menos de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción puede encontrarse envuelto, encerrado o rodeado dentro del agente de entrega. Ventajosamente, la encapsulación puede estar determinada mediante la medición del escape o la actividad de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción mediante el uso de fluorescencia y/o micrografía electrónica. Por ejemplo, al menos 1,5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más que 99,99 % de la composición farmacéutica o compuesto de la descripción se encuentra encapsulado en el agente de administración.

Los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNm pueden encapsularse en una nanopartícula lipídica o una nanopartícula lipídica de eliminación rápida y las nanopartículas lipídicas o una nanopartícula lipídica de eliminación rápida pueden encapsularse en un polímero, hidrogel y/o sellador quirúrgico descrito en esta invención y/o conocido en la técnica. Como ejemplo no limitativo, el polímero, hidrogel o sellador quirúrgico puede ser PLGA, etileno acetato de vinilo (EVAc), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), selladores quirúrgicos tales como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), selladores a base de PEG y COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL). En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica puede encapsularse en cualquier polímero conocido en la técnica que pueda formar un gel al inyectarse en un sujeto. Como otro ejemplo no taxativo, la nanopartícula lipídica puede encapsularse en una matriz de polímero que puede ser biodegradable.

El polinucleótido, la construcción primaria o la formulación de ARNm para liberación controlada y/o administración dirigida también puede incluir al menos un recubrimiento de liberación controlada. Los recubrimientos de liberación controlada incluyen, de modo no taxativo, OPADRY®, copolímero de polivinilpirrolidona/vinilacetato, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, EUDRAGIT RL®, EUDRAGIT RS® y derivados de celulosa tales como dispersiones acuosas de etilcelulosa (AQUACOAT® y SURELEASE®). La formulación de liberación controlada y/o liberación dirigida puede comprender al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, de modo no taxativo, éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otra modalidad, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado. Los polinucleótidos, construcciones primarias, y/o el ARNmm de la presente divulgación puede encapsularse en una nanopartícula terapéutica. Las nanopartículas terapéuticas pueden formularse mediante procedimientos descritos en esta invención y conocidos en la técnica tales como, de forma no taxativa, Pub Internacional n.° W02010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, US Pub. n.° US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, y Pat EE. UU. n.° 8,206,747). En otro caso, las nanopartículas poliméricas terapéuticas pueden identificarse mediante los procedimientos descritos en la publicación de EE.UU. n.° US20120140790.

La nanopartícula terapéutica de puede formularse para liberación sostenida. Tal como se usa en esta invención, "liberación sostenida" hace referencia a una composición farmacéutica o compuesto que se conforma a una velocidad de liberación en un período específico de tiempo. El período de tiempo puede incluir, de modo no taxativo, horas, días, semanas, meses y años. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula de liberación sostenida puede comprender un polímero y un agente terapéutico como, entre otros, los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNm de la presente divulgación (ver Publicación Internacional n.° 2010075072 y Pub EE. UU. n.° US20100216804 y US20110217377.

Las nanopartículas terapéuticas se pueden formular para que sean específicas de la diana. A modo de ejemplo no taxativo, las nanopartículas terapéuticas pueden incluir un corticoesteroide (ver Pub. International n.° WO2011084518). Las nanopartículas terapéuticas se pueden formular para que sean específicas para cáncer. A modo de ejemplo no taxativo, las nanopartículas terapéuticas pueden formularse en las nanopartículas descritas en las Pub Internacionales n.° WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 y Pub EE. UU. n.° US20100069426, US20120004293y US20100104655.

Las nanopartículas pueden comprender una matriz polimérica. A modo de ejemplo no taxativo, la nanopartícula puede comprender dos o más polímeros tales como, de modo no taxativo, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli(ortoésteres), policianoacrilatos, alcoholes polivinílicos, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli(etilenimina), éster de poli(serina), poli(L-láctidoco-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) o combinaciones de los mismos.

El copolímero dibloque puede incluir PEG en combinación con un polímero tal como, pero sin limitarse a, polietilenos, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polipropilfumeratos, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli (ortoésteres), policianlatos, polivinilalcoholes, poliuretanos, polifosfacenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli (etilen imina), poli (éster de serina), poli (L-lactida-co-L-lisina), poli (4-hidroxi-L-éster de prolina) o combinaciones de los mismos.

En un aspecto, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero de dibloque. A modo de ejemplo no taxativo, la nanopartícula terapéutica comprende un copolímero en bloque PLGA-PEG (ver la Pub. EE. UU. n.° US20120004293 y Pat EE. UU. n.° 8,236,330). En otro ejemplo no limitativo, la nanopartícula terapéutica es una nanopartícula furtiva que comprende un copolímero dibloque de PEG y PLA o PEG y P^lG^a (ver Pat EE. UU. n.° 8.246.968).

La nanopartícula terapéutica puede comprender al menos un polímero acrílico. Los polímeros acrílicos incluyen, de modo no taxativo, ácido acrílico, ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico y ácido acrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de amino alquil metacrilato, ácido (poli)acrílico, ácido (poli)metacrílico, policianoacrilatos y combinaciones de los mismos.

Las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un polímero catiónico descrito en esta invención y/o conocido en la técnica.

Las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un polímero que contiene amina tal como, pero sin limitarse a, polilisina, polietilenimina, dendrímeros de poli (amidoamina) y combinaciones de los mismos.

Las nanopartículas terapéuticas pueden comprender al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, de modo no taxativo, éster de poli(serina), poli(L-láctidoco-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otra modalidad, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.

La nanopartícula terapéutica puede incluir una conjugación de al menos un ligando de direccionamiento.

La nanopartícula terapéutica se puede formular en una solución acuosa que se puede utilizar para alcanzar el cáncer (ver Pub Internacional n.° WO2011084513 y Pub UU. n.° US20110294717).

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm pueden encapsularse en, unirse a y/o asociarse con nanoportadores sintéticos Los nanoportadores sintéticos se pueden formular utilizando los procedimientos conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención. A modo de ejemplo no taxativo, los nanoportadores sintéticos pueden formularse mediante los procedimientos descritos en las Pub Internacionales n.° W02010005740, WO2010030763 y Pub. EE. UU. n.° US20110262491, US20100104645 y US20100087337. Las formulaciones de nanoportadores sintéticos pueden liofilizarse mediante procedimientos descritos en las Pub. Internacional n.° WO2011072218 y Pat EE. UU. n.° 8.211.473.

Los nanoportadores sintéticos pueden contener grupos reactivos para liberar los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm descrito en esta invención (ver publicación internacional n.° WO20120952552 y Pub EE. UU. n.° US20120171229).

Los nanoportadores sintéticos pueden contener un agente inmunoestimulante para mejorar la respuesta inmunitaria a partir de la administración del nanoportador sintético. Como un ejemplo no taxativo, el nanoportador sintético puede comprender un agente inmunoestimulador de Th1 que puede mejorar una respuesta basada en Th1 del sistema inmunitario (ver Pub Internacional n.° WO2010123569 y Pub. EE. UU. n.° US20110223201).

Los nanoportadores sintéticos pueden formularse para la liberación dirigida. El nanoportador sintético puede formularse para liberar los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm a un pH especificado y/o después de un intervalo de tiempo deseado. Como ejemplo no limitativo, la nanopartícula sintética puede formularse para liberar los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm después de 24 horas y/o a un pH de 4,5 (ver Pub.Internacionales n.° WO2010138193 y WO2010138194 y Pub EE. UU. n.° US20110020388 y US20110027217).

Los nanoportadores sintéticos pueden formularse para la liberación controlada y/o sostenida de los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNm descritos en esta invención. A modo de ejemplo no taxativo, los nanoportadores sintéticos para liberación sostenida pueden formularse mediante procedimientos conocidos en la técnica, descritos en esta invención y/o descritos en la Pub Internacional n.° WO2010138192 y Pub EE. UU. n.° 20100303850.

Divulgación de polímeros, nanopartículas biodegradables y nanopartículas Core-Shell

El polinucleótido, construcción primaria y ARNmm de la divulgación se pueden formular utilizando polímeros naturales y/o sintéticos. Ejemplos no limitantes de polímeros que pueden usarse para la administración incluyen, pero no se limitan a, formulaciones Dynamic POLYCONJUGATE™ de MIRUS® Bio (Madison, WI) y Roche Madison (Madison, WI), formulaciones de polímero PHASERX™ tales como, sin limitación, SMARTT PO^lYMER TECHNOLOGY™ (Seattle, WA), DMRI/DOPE, poloxámero, adyuvante VAXFECTIN® de Vical (San Diego, CA), quitosano, ciclodextrina de Calando Pharmaceuticals (Pasadena, CA), dendrímeros y polímeros de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). RONDEL™ (ARNi/Oligonucleotide Nanoparticle Delivery) polímeros (Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA) y polímeros de co-bloque sensibles al pH tales como, pero sin limitarse a, PHASERX™ (Seattle, WA).

Un ejemplo no limitante de formulaciones de PLGA incluye, entre otros, depósitos inyectables de PLGA (p. ej., ELIGARD® que se forma disolviendo PLGA en 66 % de N-metil-2-pirrolidona (NMP) y el resto es disolvente acuoso y leuprolida. Una vez inyectados, el péptido PLGA y leuprolida precipita en el espacio subcutáneo).

Muchas de estas estrategias de polímeros han demostrado su eficacia para administrar oligonucleótidos in vivo en el citoplasma celular (revisado en de Fougerolles Hum Gene Ther. 200819:125-132). Dos estrategias de polímeros que han producido un suministro robusto in vivo de ácidos nucleicos, en este caso con ARN de interferencia pequeño (siRNA), son los policonjugados dinámicos y las nanopartículas basadas en ciclodextrina. La primera de estas estrategias de administración utiliza policonjugados dinámicos y se ha demostrado in vivo en ratones para administrar de manera efectiva siRNA y silenciar el ARNm diana endógeno en los hepatocitos (Rozema y col., Proc Natl Acad Sci US A. 2007 104:12982-12887). Esta estrategia particular es un sistema de polímero multicomponente cuyas características clave incluyen un polímero de membrana activa al que el ácido nucleico, en este caso siRNA, se acopla covalentemente a través de un enlace disulfuro y donde tanto PEG (para enmascaramiento de carga) como grupos N-acetilgalactosamina (para alcanzar hepatocitos) son enlazados a través de enlaces sensibles al pH (Rozema y col., Proc Natl Acad Sci uS A. 2007 104:12982-12887). Al unirse al hepatocito y entrar en el endosoma, el complejo polimérico se desmonta en el entorno de pH bajo, con el polímero exponiendo su carga positiva, lo que conduce al escape endosómico y la liberación citoplasmática del siRNA del polímero. Mediante el reemplazo del grupo N-acetilgalactosamina por un grupo manosa, se demostró que se podía alterar la dirección de los hepatocitos que expresan el receptor de asialoglicoproteína al endotelio sinusoidal y las células de Kupffer. Otra estrategia de polímero implica el uso de nanopartículas de policatión que contienen ciclodextrina dirigidas a transferrina. Estas nanopartículas han demostrado el silenciamiento dirigido del producto del gen EWS-FLI1 en células tumorales del sarcoma de Ewing que expresan el receptor de transferrina (Hu-Lieskovan y col., Cancer Res. 200565: 8984-8982) y siRNA formulado en estas nanopartículas fue bien tolerado en primates no humanos (Heidel y col., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21). Ambas estrategias de administración incorporan estrategias racionales que utilizan tanto la administración dirigida como los mecanismos de escape endosómico.

La formulación de polímero puede permitir la liberación sostenida o retardada del polinucleótido, construcción primaria 0 ARNmm (por ejemplo, después de una inyección intramuscular o subcutánea). El perfil de liberación alterado para el polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm puede dar como resultado, por ejemplo, la traducción de una proteína codificada durante un período de tiempo prolongado. La formulación de polímero también se puede usar para aumentar la estabilidad del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm. Los polímeros biodegradables se han utilizado anteriormente para proteger los ácidos nucleicos distintos del ARNmm de la degradación y se ha demostrado que producen una liberación sostenida de cargas útiles in vivo (Rozema y col., Proc Natl Acad Sci US A. 2007 104:12982-12887; Sullivan y col., Expert Opin Drug Deliv. 20107:1433-1446; Convertine y col., Biomacromolecules.

1 de octubre de 2010; Chu y col., Acc Chem Res. 13 de enero de 2012; Manganiello y col., Biomaterials. 201233:2301-2309; Benoit y col., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Singha y col., Nucleic Acid Ther. 2011 2:133-147; de Fougerolles Hum Gene Ther. 200819:125-132; Schaffert y Wagner, Gene Ther. 200816:1131-1138; Chaturvedi y col., Expert Opin Drug Deliv. 2011 8:1455-1468; Davis, Mol Pharm. 20096:659-668; Davis, Nature 2010464:1067-1070).

Las composiciones farmacéuticas pueden ser formulaciones de liberación sostenida. Las formulaciones de liberación sostenida pueden ser para administración subcutánea. Como un ejemplo no taxativo, el polímero, hidrogel o sellador quirúrgico puede ser PLGA, acetato de etilenvinilo (EVAc), poloxámero, GELSITE® (Nanotherapeutics, Inc. Alachua, Fl ), HYLENEX® (Halozyme Therapeutics, San Diego CA), selladores quirúrgicos como polímeros de fibrinógeno (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL), selladores basados en PEG y COSEAL® (Baxter International, Inc Deerfield, IL).

Como ejemplo no limitante, se puede formular ARNm modificado en microesferas de PLGA preparando las microesferas de PLGA con tasas de liberación ajustables (por ejemplo, días y semanas) y encapsulando el ARNm modificado en las microesferas de PLGA mientras se mantiene la integridad del ARNm modificado durante el procedimiento de encapsulación. Los EVAc son polímeros biocompatibles no biodegradables que se utilizan ampliamente en aplicaciones preclínicas de implantes de liberación sostenida (por ejemplo, productos de liberación prolongada Ocusert, un inserto oftálmico de pilocarpina para el glaucoma o progestágeno, un dispositivo intrauterino de progesterona de liberación sostenida; sistemas de administración transdérmica Testoderm, Duragesic y Selegiline; catéteres). Poloxamer F-407 NF es un copolímero tribloque hidrofílico, tensioactivo no iónico de polioxietilenopolioxipropileno-polioxietileno que tiene una baja viscosidad a temperaturas inferiores a 5 °C y forma un gel sólido a temperaturas superiores a 15 °C. Los selladores quirúrgicos a base de PEG comprenden dos componentes sintéticos de PEG mezclados en un dispositivo de administración que se puede preparar en un minuto, se sella en 3 minutos y se reabsorbe en 30 días. GELSITE® y los polímeros naturales pueden gelificarse in situ en el lugar de administración. Se ha demostrado que interactúan con los candidatos terapéuticos de proteínas y péptidos a través de la interacción iónica para proporcionar un efecto estabilizador.

Las formulaciones de polímeros también pueden dirigirse selectivamente a través de la expresión de diferentes ligandos como se ejemplifica, pero no se limita a, folato, transferrina y N-acetilgalactosamina (GalNAc) (Benoit y col., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Rozema y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 104:12982-12887; Davis, Mol Pharm. 20096:659-668; Davis, Nature 2010464:1067-1070).

Los polinucleótidos, construcciones primarias y/o el ARNmm de la divulgación se puede formular con o en un compuesto polimérico. El polímero puede incluir al menos un polímero como, entre otros, polietenos, polietilenglicol (PEG), poli (l-lisina) (PLL), PEG injertado en PLL, lipopolímero catiónico, lipopolímero catiónico biodegradable, polietilenimina (PEI), poli(alquilen iminas) ramificadas reticuladas, un derivado de poliamina, un poloxámero modificado, un polímero biodegradable, copolímero de bloque biodegradable, copolímero aleatorio biodegradable, copolímero de poliéster biodegradable, copolímero de bloque de poliéster biodegradable, copolímero aleatorio de bloque de poliéster biodegradable, copolímero lineal biodegradable, ácido poli[a-(4-aminobutil)-L-glicólico) (PAGA), copolímeros multibloques catiónicos reticulados biodegradables, policarbonatos, polianhídridos, polihidroxiácidos, polifumeratos de polipropileno, policaprolactonas, poliamidas, poliacetales, poliéteres, poliésteres, poli (ortoésteres), polianoacrilatos, poliacrilatos, alcoholes polimetacrilatos, policianoacrilatos, poliureas, poliestirenos, poliaminas, polilisina, poli (etilen imina), poli (éster de serina), poli (L-láctido-co-L-lisina), poli (éster de 4-hidroxi-L-prolina), polímeros acrílicos, polímeros que contienen aminas o combinaciones de los mismos.

Como ejemplo no limitativo, los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm de la divulgación se puede formular con el compuesto polimérico de PEG injertado con PLL como se describe en Pat. EE. UU. n.° 6.177.274. La formulación puede usarse para transfectar células in vitro o para el suministro in vivo de polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm. En otro ejemplo, los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm puede ser suspendido en una solución o medio con un polímero catiónico, en una composición farmacéutica seca o en una solución que es capaz de ser secada como se describe en Pub EE. UU.. n.° 20090042829 y 20090042825 . Como otro ejemplo no limitante, los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación se pueden formular con un copolímero de bloque PLGA-PEG (ver Pub EE.UU. n.° US20120004293 y Pat EE. UU. n.° 8.236.330). Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación se pueden formular con un copolímero dibloque de PEG y PLA o PEG y PLGA (ver Patente EE.UU. n.° 8.246.968).

Puede usarse un derivado de poliamina para administrar ácidos nucleicos o para tratar y/o impedir una enfermedad o ser incluido en un dispositivo implantable o inyectable (Pub. EE. UU. No. 20100260817). Como un ejemplo no limitante, una composición farmacéutica puede incluir los ácidos nucleicos modificados y ARNmm y el derivado de poliamina se describe en Pub de EE. UU. n.° 20100260817.

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación se pueden formular con al menos un polímero acrílico. Los polímeros acrílicos incluyen, de modo no taxativo, ácido acrílico, ácido metacrílico, copolímeros de ácido metacrílico y ácido acrílico, copolímeros de metacrilato de metilo, metacrilatos de etoxietilo, metacrilato de cianoetilo, copolímero de amino alquil metacrilato, ácido (poli)acrílico, ácido (poli)metacrílico, policianoacrilatos y combinaciones de los mismos.

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación pueden formularse con al menos un polímero descrito en Publicaciones Internacionales n.° WO2011115862, WO2012082574 y WO2012068187. Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm se pueden formular con un polímero de fórmula Z como se describe en WO2011115862. Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm se pueden formular con un polímero de fórmula Z, Z' o Z» como se describe en WO2012082574 o WO2012068187. Los polímeros formulados con el ARN modificado de la presente divulgación pueden sintetizarse mediante los procedimientos descritos en WO2012082574 o WO2012068187.

Las formulaciones de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación pueden incluir al menos un polímero que contiene amina tal como, pero sin limitarse a, polilisina, polietilenimina, dendrímeros de poli (amidoamina) o combinaciones de los mismos.

Por ejemplo, los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm de la divulgación se puede formular en un compuesto farmacéutico que incluye una poli (alquilen imina), un lipopolímero catiónico biodegradable, un copolímero de bloque biodegradable, un polímero biodegradable o un copolímero aleatorio biodegradable, un copolímero de bloque de poliéster biodegradable, un polímero de poliéster biodegradable, un copolímero aleatorio de poliéster biodegradable, un copolímero biodegradable lineal, PAGA, un copolímero multibloque catiónico reticulado biodegradable o combinaciones de los mismos. El lipopolímero catiónico biodegradable se puede fabricarse mediante procedimientos conocidos en la técnica y/o descritos en la Pat. EE.UU. n.° 6.696.038, Solicitud de EE.UU. n.° 20030073619 y 20040142474. La poli (alquilen imina) se puede preparar usando procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en Pub. de EE. UU. n.° 20100004315. El polímero biodegradable, el copolímero de bloques biodegradable, el copolímero aleatorio biodegradable, el copolímero de bloques de poliéster biodegradable, el polímero de poliéster biodegradable o el copolímero aleatorio de poliéster biodegradable se pueden preparar usando procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en la Pat. de EE.UU. n.° 6.517.869 y 6.267.987. El copolímero biodegradable lineal se puede preparar usando procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en la Pat. de EE.UU. n.° 6.652.886. El polímero PAGA se puede fabricar usando procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en la Pat. de EE.UU. n.° 6.217.912 . El polímero PAGA puede copolimerizarse para formar un copolímero o copolímero de bloques con polímeros tales como, pero sin limitarse a, poli-L-lisina, poliarginina, poliornitina, histonas, avidina, protaminas, polilactidas y poli (lactida-co-glicólidos). Los copolímeros multibloques catiónicos reticulados biodegradables pueden hacerse mediante procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en la Pat. de EE.UU. n.° 8.057.821 o Pub. de EE.Uu . n.° 2012009145. Por ejemplo, los copolímeros multibloques se pueden sintetizar usando bloques de polietilenimina lineal (LPEI) que tienen patrones distintos en comparación con las polietileniminas ramificadas. Además, la composición o composición farmacéutica se pueden preparar por los procedimientos conocidos en la técnica, descritos en esta invención, o como se describe en la Pub. de EE.UU. n.° 20100004315 o Pat. de EE.UU. 6.267.987 y 6.217.912.

Los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNmm de la divulgación se pueden formular con al menos un poliéster degradable que puede contener cadenas laterales policatiónicas. Los poliésteres degradables incluyen, de modo no taxativo, éster de poli(serina), poli(L-láctido-co-L-lisina), éster de poli(4-hidroxi-L-prolina) y combinaciones de los mismos. En otra modalidad, los poliésteres degradables pueden incluir una conjugación de PEG para formar un polímero PEGilado.

Los polímeros descritos en esta invención se pueden conjugar con un PEG que termina en lípidos. Como ejemplo no limitante, PLGA puede conjugarse con un PEG que termina en lípidos formando PLGA-DSPE-PEG. Como otro ejemplo no limitante, los conjugados de PEG para su uso con la presente divulgación se describen en la publicación internacional n.° WO2008103276.

Los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm descrito en esta invención puede conjugarse con otro compuesto. Se describen ejemplos no limitantes de conjugados en Patentes de EE. UU. n.° 7.964.578 y 7.833.992. En otro caso, los polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm de la presente divulgación se puede conjugar con conjugados de fórmula 1-122 como se describe en Patentes de EE. UU. n.° 7.964.578 y 7.833.992.

Como se describe en la Pub. EE. UU. n.° 20100004313, una composición de administración de genes puede incluir una secuencia de nucleótidos y un poloxámero. Por ejemplo, el polinucleótido, construcción primaria y/o ARNmm de la presente descripción se puede usar en una composición de administración de genes con el poloxámero se describe en la Pub. de EE.UU. n.° 20100004313.

La formulación polimérica puede estabilizarse poniendo en contacto la formulación polimérica, que puede incluir un portador catiónico, con un lipopolímero catiónico que puede unirse covalentemente a grupos colesterol y polietilenglicol La formulación de polímero puede ponerse en contacto con un lipopolímero catiónico usando los procedimientos descritos en la Pub de EE. UU. n.° 20090042829. El vehículo catiónico puede incluir, pero no se limita a, polietilenimina, poli (trimetilenimina), poli (tetrametilenimina), polipropilenimina, aminoglucósido-poliamina, didesoxi-diamino-bciclodextrina, espermina, espermidina, poli (2-dimetilamino) etil metacrilato, poli (lisina), poli (histidina), poli (arginina), gelatina cationizada, dendrímeros, quitosano, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilammonium cloruro (DOTMA), 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinium cloruro (^dO^{t i}M), 2,3-dioleiloxi-N-[2(sperminecarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminiumtrifluoroacetato (DOSPA), 3B-[N— (N',N'-Dimetilaminoetane)-carbamoil]Cholesterol Clorhidrato (DC-colesterol HCl) diheptadecilamidoglicil espermidina (DOGS), bromuro de N, N-diestearil-N, N-dimetilamonio (DDAB), N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il) -N, N-dimetil-N -bromuro de hidroxietil amonio (DMRIE), cloruro de N,N-dioleil-N, N-dimetilamonio DODAC) y combinaciones de los mismos.

El polinucleótido, la construcción primaria y el ARNmm de la divulgación también se pueden formular como una nanopartícula usando una combinación de polímeros, lípidos, y/o otros agentes biodegradables, tales como, pero sin limitarse a, fosfato de calcio. Los componentes pueden combinarse en un núcleo-capa, híbrido, y/o arquitectura capa por capa, para permitir el ajuste fino de la nanopartícula de modo que se pueda mejorar la entrega del polinucleótido, la construcción primaria y el ARNmm (Wang y col., Nat Mater. 2006 5:791-796; Fuller y col., Biomaterials. 2008 29:1526-1532; DeKoker y col., Adv Drug Deliv Rev. 201163:748-761; Endres y col., Biomaterials. 2011 32:7721-7731; Su y col., Mol Pharm. 2011 junio 6;8(3):774-87 ).

Nanopartículas de fosfato de calcio biodegradables en combinación con lípidos y/o polímeros se ha demostrado que liberan polinucleótidos, construcciones primarias y ARNmm in Wvo.Puede usarse una nanopartícula de fosfato cálcico recubierta de lípidos, que también puede contener un ligando de direccionamiento tal como anisamida, para administrar el polinucleótido, la construcción primaria y el ARNmm de la presente divulgación. Por ejemplo, para administrar eficazmente siRNA en un modelo de pulmón metastásico de ratón, se utilizó una nanopartícula de fosfato cálcico recubierta de lípidos (Li y col., J Contr Rel. 2010142: 416-421; Li y col., J Contr Rel. 2012 158:108-114; Yang y col., Mol Ther. 2012 20:609-615). Este sistema de entrega combina una nanopartícula dirigida y un componente para mejorar el escape endosomal, fosfato de calcio, con el fin de mejorar la entrega del siRNA.

El fosfato de calcio con un copolímero de bloque de polianión-PEG puede usarse para administrar polinucleótidos, construcciones primarias y ARNmm (Kazikawa y col., J Contr Rel. 2004 97:345-356; Kazikawa y col., J Contr Rel.

2006 111:368-370).

Un polímero de conversión de carga de PEG (Pitella y col., Biomaterials. 2011 32:3106-3114) puede usarse para formar una nanopartícula para administrar los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNmm de la presente divulgación. El polímero de conversión de carga de PEG puede mejorar los copolímeros de bloque de polianión de PEG al escindirse en un policatión a pH ácido, mejorando así el escape endosómico.

El uso de nanopartículas de núcleo-capa se ha centrado además en una estrategia de alto rendimiento para sintetizar núcleos de nanogel catiónicos reticulados y varias capas (Siegwart y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 108:12996-13001). La complejación, la liberación y la internalización de las nanopartículas poliméricas se pueden controlar con precisión alterando la composición química en los componentes del núcleo y de la cubierta de la nanopartícula. Por ejemplo, las nanopartículas de núcleo-capa pueden entregar eficazmente siRNA a los hepatocitos de ratón después de que unen covalentemente el colesterol a la nanopartícula.

Se puede usar un núcleo lipídico hueco que comprende una capa media de PLGA y una capa lipídica neutra externa que contiene PEG para administrar el polinucleótido, la construcción primaria y el ARNmm de la presente divulgación Como ejemplo no limitativo, en ratones con un tumor que expresa luciferasa, se determinó que la nanopartícula híbrida lípido-polímero-lípido suprimió significativamente la expresión de luciferasa, en comparación con un lipoplex convencional (Shi y col, Angew Chem Int Ed 2011 50:7027-7031).

Péptidos y proteínas

Los polinucleótidos sintéticos y/o los ARNsg sintéticos se pueden formular con péptidos y/o proteínas para aumentar la transfección de células por el polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm. Se pueden usar péptidos tales como, pero sin limitarse a, péptidos y proteínas que penetran en las células y péptidos que permiten la administración intracelular para administrar formulaciones farmacéuticas. Un ejemplo no limitante de un péptido de penetración celular que puede usarse con las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación incluye una secuencia de péptido de penetración celular unida a policationes que facilita la administración al espacio intracelular, por ejemplo, péptido TAT derivado del VIH, penetratinas, transportans, o péptidos penetrantes de células derivados de hCT (ver, por ejemplo, Caron y col., Mol. Ther. 3(3):310-8 (2001); Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL, 2002); El-Andaloussi y col., Curr. Pharm. Des. 11(28):3597-611 (2003); y Deshayes y col., Cell. Mol. Life Sci. 62(16):1839-49 (2005)). Las composiciones también pueden formularse para incluir un agente de penetración celular, por ejemplo, liposomas, que mejoran el suministro de las composiciones al espacio intracelular. Los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNmm de la divulgación pueden formar complejos con péptidos. y/o proteínas como, entre otras, péptidos y/o proteínas de Aileron Therapeutics (Cambridge, MA) y Permeon Biologics (Cambridge, MA) para permitir la administración intracelular (Cronican y col., ACS Chem. Biol. 2010 5:747-752; McNaughton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 2009 106:6111-6116; Sawyer, Chem Biol Drug Des. 200973:3-6; Verdine e Hilinski, Methods Enzymol. 2012;503:3-33).

El polipéptido que penetra en las células puede comprender un primer dominio y un segundo dominio. El primer dominio puede comprender un polipéptido sobrecargado. El segundo dominio puede comprender una pareja de unión a proteínas. Tal como se usa en esta invención, "pareja de unión a proteínas" incluye, pero no se limita a, anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, proteínas de andamio o péptidos. El polipéptido que penetra en las células puede comprender además una pareja de unión intracelular para la pareja de unión a proteínas. El polipéptido que penetra en las células puede ser capaz de secretarse a partir de una célula donde se puede introducir el polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm.

Las formulaciones de los péptidos o proteínas incluidos pueden usarse para aumentar la transfección celular por el polinucleótido, construcción primaria o ARNmm, alterar la biodistribución del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm (por ejemplo, dirigiéndose a tejidos o tipos celulares específicos), y/o aumentar la traducción de la proteína codificada.

Células

El polinucleótido, la construcción primaria y el ARNmm de la divulgación se pueden transfectar ex vivo en células, que posteriormente se trasplantan a un sujeto. Como ejemplos no limitantes, las composiciones farmacéuticas pueden incluir glóbulos rojos para administrar ARN modificado al hígado y células mieloides, virosomas para administrar ARN modificado en partículas similares a virus (VLP) y células electroporadas tales como, entre otras, de MAXCYTE® (Gaithersburg, MD) y de ERYTECH® (Lyon, Francia) para entregar ARN modificado. Se han documentado ejemplos del uso de glóbulos rojos, partículas virales y células electroporadas para entregar cargas útiles distintas del ARNmm (Godfrin y col., Expert Opin Biol Ther. 2012 12:127-133; Fang y col., Expert Opin Biol Ther. 2012 12:385-389; Hu y col., Proc Natl Acad Sci US A. 2011 108:10980-10985; Lund y col., Pharm Res. 201027:400-420; Huckriede y col., J Liposome Res. 2007;17:39-47; Cusi, Hum Vaccin. 20062:1-7; de Jonge y col., Gene Ther. 200613:400-411).

Los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNmm pueden administrarse en VLP sintéticas sintetizadas mediante los procedimientos descritos en Pub. Internacional n.° WO2011085231 y Pub. EE. UU. n.° 20110171248. Las formulaciones basadas en células del polinucleótido, la construcción primaria y el ARNmm de la divulgación se pueden usar para asegurar la transfección celular (por ejemplo, en el vehículo celular), alterar la biodistribución del polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm (por ejemplo, dirigiéndose al portador de células a tejidos o tipos celulares específicos), y/o aumentar la traducción de la proteína codificada.

Se conocen en la técnica una variedad de procedimientos y son adecuados para la introducción de ácido nucleico en una célula, incluidas técnicas mediadas por virus y sin virus. Ejemplos de técnicas típicas no mediadas por virus incluyen, entre otras, electroporación, transferencia mediada por fosfato de calcio, nucleofección, sonoporación, choque térmico, magnetofección, transferencia mediada por liposomas, microinyección, transferencia mediada por microproyectiles (nanopartículas), transferencia mediada por polímeros catiónicos (DEAE-dextrano, polietilenimina, polietilenglicol (PEG) y similares) o fusión celular.

La técnica de sonoporación, o sonicación celular, es el uso de sonido (por ejemplo, frecuencias ultrasónicas) para modificar la permeabilidad de la membrana plasmática celular. Los procedimientos de sonoporación son conocidos por los expertos en la técnica y se utilizan para administrar ácidos nucleicos in vivo (Yoon y Park, Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:321-330; Postema y Gilja, Curr Pharm Biotechnol. 2007 8:355-361; Newman y Bettinger, Gene Ther.

2007 14:465-475). Los procedimientos de sonoporación son conocidos en la técnica y también se enseñan, por ejemplo, en lo que se refiere a bacterias en la Publicación de patente de EE. UU. 20100196983 y en lo que se refiere a otros tipos celulares en, por ejemplo, la Publicación de patente de EE. UU. 20100009424.

Las técnicas de electroporación también son bien conocidas en la técnica y se utilizan para administrar ácidos nucleicos in vivo y clinicamente (Andre y col., Curr Gene Ther. 2010 10:267-280; Chiarella y col., Curr Gene Ther.

2010 10:281-286; Hojman, Curr Gene Ther. 201010:128-138 ). Los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNmm pueden administrarse mediante electroporación como se describe en el Ejemplo 26.

Hialuronidasa

La inyección localizada intramuscular o subcutánea de polinucleótido, construcción primaria o ARNmm de la divulgación puede incluir hialuronidasa, que cataliza la hidrólisis de hialuronano. Al catalizar la hidrólisis del hialuronano, un componente de la barrera intersticial, la hialuronidasa reduce la viscosidad del hialuronano, lo que aumenta la permeabilidad del tejido (Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-4403). Es útil para agilizar su dispersión y distribución sistémica de proteínas codificadas producidas por células transfectadas. Alternativamente, la hialuronidasa puede usarse para aumentar el número de células expuestas a un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm de la divulgación administrado por vía intramuscular o subcutánea.

Imitadores de nanopartículas

El polinucleótido, construcción primaria o ARNmm de la divulgación puede encapsularse en y/o ser absorbido a un imitador de nanopartículas. Un imitador de nanopartículas puede imitar la función de administración de organismos o partículas tales como, entre otros, patógenos, virus, bacterias, hongos, parásitos, priones y células. Como ejemplo no limitante, el polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm de la divulgación pueden encapsularse en una partícula que no es de virón que puede imitar la función de administración de un virus (ver la publicación internacional n.° WO2012006376).

Nanotubos

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación se pueden juntar o unir de otro modo a al menos un nanotubo como, entre otros, nanotubos de roseta, nanotubos de roseta que tienen bases gemelas con un enlazador, nanotubos de carbono y/o nanotubos de carbono de pared simple, polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm pueden unirse a los nanotubos a través de fuerzas tales como, entre otras, estéricas, iónicas, covalentes y/o otras fuerzas.

En algunos casos, el nanotubo puede liberar uno o más polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm en las células. El tamaño y/o la estructura de la superficie de al menos un nanotubo puede alterarse para gobernar la interacción de los nanotubos dentro del cuerpo y/o para unir o unirse a los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm descritos en esta invención. El bloque de construcción y/o los grupos funcionales unidos al bloque de construcción del al menos un nanotubo pueden modificarse para ajustar las dimensiones y/o propiedades del nanotubo. Como ejemplo no limitativo, la longitud de los nanotubos se puede alterar para impedir que los nanotubos pasen a través de los orificios en las paredes de los vasos sanguíneos normales, pero aún lo suficientemente pequeños para pasar a través de los orificios más grandes en los vasos sanguíneos del tejido tumoral.

Al menos un nanotubo también puede recubrirse con compuestos que mejoran la administración, incluidos polímeros, tales como, pero sin limitarse a, polietilenglicol. En otro caso, al menos un nanotubo y/o los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm pueden mezclarse con excipientes y/o vehículos de entrega farmacéuticamente aceptables.

En un aspecto, los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNmm están unidos y/o de otro modo ligados a al menos un nanotubo de roseta. Los nanotubos de roseta pueden formarse mediante un procedimiento conocido en la técnica y/o por el procedimiento descrito en la Publicación Internacional n.° WO2012094304. Al menos un polinucleótido, construcción primaria y/o el ARNmm puede estar unido y/o ligado de otra manera a al menos un nanotubo de roseta mediante un procedimiento como se describe en la publicación internacional n.° WO2012094304, donde los nanotubos de roseta o módulos que forman nanotubos de roseta se mezclan en medio acuoso con al menos un polinucleótido, construcción primaria y/o ARNmm en condiciones que pueden hacer que al menos un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm se junte o se una de otro modo a los nanotubos de roseta.

Conjugados

Los polinucleótidos, construcciones primarias y ARNmm de la divulgación incluyen conjugados, como un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm unidos covalentemente a un vehículo o grupo diana, o que incluyen dos regiones codificantes que juntas producen una proteína de fusión (p. ej., que lleva a un grupo diana y proteína o péptido terapéutico).

Los conjugados de la divulgación incluyen una sustancia de origen natural, como una proteína (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina); un carbohidrato (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético, un oligonucleótido (por ejemplo, un aptámero). Ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácido es una polilisina (PLL), poli L-ácido aspártico, poli L-ácido glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli (L-lactida-co-glicolizado), copolímero de divinil éter-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, poli (ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímero, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal de una poliamina o un péptido de hélice alfa.

Patentes de EE. UU. representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de polinucleótidos particularmente de ARN, comprenden, pero no se limitan a, Pat. EE. UU. n.° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538 5.578.717 5.580.731 5.591.584 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439 5.578.718 5.608.046 4.587.044 4.605.735 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582 4.958.013 5.082.830 5.112.963 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506 5.262.536 5.272.250 5.292.873 5.317.098; 5.371.241; 5.391.723 5.416.203; 5.451.463; 5.510.475 5.512.667 5.514.785 5.565.552 5.567.810 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297 7.037.646.

El conjugado puede funcionar como vehículo de polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNmm de la presente divulgación. El conjugado puede comprender un polímero catiónico tal como, pero sin limitarse a, poliamina, polilisina, polialquilenimina y polietilenimina que pueden injertarse con poli (etilenglicol). Como ejemplo no limitante, el conjugado puede ser similar al conjugado polimérico y el procedimiento de síntesis del conjugado polimérico descrito en la Patente de EE.UU. n.° 6.586.524.

Los conjugados también pueden incluir grupos diana, por ejemplo, un agente dirigido a célula o tejido, por ejemplo, una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico tal como una célula de riñón. Un grupo diana puede ser tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína tensioactiva A, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetilgulucosamina manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glucosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un imitador del péptido RGD o un aptámero.

Los grupos diana pueden ser proteínas, p. ej., glucoproteínas o péptidos, p. ej., moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos, p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo celular específico, como una célula cancerosa, una célula endotelial, o célula ósea. Los grupos diana también pueden incluir hormonas y receptores hormonales. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, manosa multivalente N-acetilgulucosamina, fucosa multivalente o aptámeros. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido o un activador de p38 MAP quinasa.

El grupo diana puede ser cualquier ligando que sea capaz de dirigirse a un receptor específico. Ejemplos incluyen, sin limitación, folato, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6P, apatameros, ligandos de receptores de integrina, ligandos de receptores de quimiocinas, transferrina, biotina, ligandos de receptores de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, LDL y ligandos de HDL. En un caso particular, el grupo diana es un aptámero. El aptámero puede no estar modificado o tener cualquier combinación de modificaciones descritas en esta invención.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir modificaciones químicas tales como, pero sin limitación, modificaciones similares a ácidos nucleicos bloqueados.

Patentes de EE. UU. representativas que enseñan la preparación de ácido nucleico bloqueado (LNA), como las de Santaris, incluyen, entre otras, las siguientes: Pat. EE. UU. n.° 6.268.490; 6.670.461; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.084.125; y 7.399.845.

Patentes representativas de EE. UU. que enseñan la preparación de compuestos de ANP comprenden, pero no se limitan a, Patentes EE. UU n.° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Se puede encontrar más información sobre los compuestos de PNA en Nielsen y col., Science, 1991,254, 14971500.

La divulgación incluye polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleósidos con otras cadenas principales modificadas, y en particular --CH²--NH--CH²--, -CH2— N(CH3)—O—CH2-[conocido como cadena principal de metileno (metilimino) o MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--,-CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH²-- y --N(CH3)--CH2--CH2--[donde la cadena principal del fosfodiéster nativo se representa como --O— P(O)²--O--CH²--] de la antes vista Pat. de EE. UU. n.° 5,489,677, y las cadenas principales de amida de la antes vista Pat. EE. UU. n.° 5.602.240. En algunos casos, los polinucleótidos presentados en la esta invención tienen estructuras de cadena principal de morfolino de la antes vista Patente de EE. UU. n.° 5.034.506.

Las modificaciones en la posición de 2' también pueden ayudar en la entrega. Preferiblemente, las modificaciones en la posición 2' no están ubicadas en una secuencia codificante de polipéptido, es decir, no en una región traducible. Modificaciones en la posición 2' se pueden ubicar en una UTR 5', una UTR 3' y/o una región de descolado. Modificaciones en la posición 2 pueden incluir una de las siguientes en la posición 2': H (es decir, 2'-desoxi); F; O-, S­ o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C¹ a C¹⁰ sustituido o no sustituido o alquenilo y alquinilo C² a C¹⁰ . Modificaciones adecuadas ejemplares incluyen O[(CH²)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH²)nNH² , O(CH²) nCH3, O(CH²)nONH², y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. En otro caso, los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm incluyen uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C¹ a C¹⁰ , alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH³ , OCN, Cl, Br, CN, CF³ , OCF³ , SOCH³ , SO²CH³ , ONO² , NO² , N³ , NH² , heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar la propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En un caso, la modificación incluye 2'-metoxietoxi (² -O-CH²CH²OCH³, también conocido como 2'-O-(2-metoxietil) o 2'-MOE) (Martin y col., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) es decir, es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otra modificación ejemplar es 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos en esta invención a continuación, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2, que también se describe en los ejemplos en esta invención a continuación. Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (² -OCH³), 2'-aminopropoxi (2'-OCH²CH²CH²NH²) y 2'-fluoro (2'-F). También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones, particularmente en la posición 3' del azúcar en el nucleótido del extremo 3' o en dsARN enlazados 2'-5' y la posición 5' del nucleótido del extremo 5'. Polinucleótidos de la invención también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos de ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Patentes representativas de los EE. UU. que enseñan la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas comprenden, pero no se limitan a, Pat. EE. UU. n.° 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; and 5.700.920.

En otras realizaciones más, el polinucleótido, construcción primaria o ARNmm se conjuga covalentemente con un polipéptido que penetra en las células. El péptido que penetra en las células también puede incluir una secuencia señal. Los conjugados de la invención pueden diseñarse para que tengan una mayor estabilidad; aumento de la transfección celular; y/o la biodistribución alterada (p. ej., dirigida a tejidos o tipos celulares específicos).

Nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas

Las nanopartículas autoensambladas tienen un tamaño bien definido que puede controlarse con precisión, ya que las cadenas de ácido nucleico pueden reprogramarse fácilmente. Por ejemplo, el tamaño de partícula óptimo para un vehículo de nanoentrega dirigida al cáncer es de 20-100 nm ya que un diámetro mayor de 20 nm evita la eliminación por los riñones y mejora el suministro a ciertos tumores a través de una mayor permeabilidad y efecto de retención. Usando nanopartículas de ácido nucleico autoensambladas, una sola población uniforme en tamaño y forma tiene una orientación espacial y una densidad controladas con precisión de ligandos dirigidos al cáncer para una entrega mejorada. Como ejemplo no limitativo, las nanopartículas de oligonucleótidos se preparan utilizando el autoensamblaje programable de fragmentos cortos de ADN y siRNA terapéuticos. Estas nanopartículas son molecularmente idénticas con tamaño de partícula controlable y ubicación y densidad del ligando diana. Los fragmentos de ADN y los siRNA se autoensamblaron en una reacción de una sola etapa para generar nanopartículas tetraédricas de DNA/siRNA para administración in vivo dirigida (Lee y col., Nature Nanotechnology 20127:389-393).

Excipientes

Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, tal como se utiliza en esta invención, incluye todos los solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes activos de superficie, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según corresponda a la forma de dosificación particular deseada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) describe varios excipientes utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de los mismos. Salvo en la medida que algún medio excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como en la producción de un efecto biológico no deseado o en la interacción de forma nociva con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica, se pretende que su uso se encuentre dentro del alcance de la presente invención.

En algunas realizaciones, un excipiente farmacéuticamente aceptable es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % puro. En algunas realizaciones, un excipiente se aprueba para su uso en animales o para uso veterinario. En algunas realizaciones, un excipiente es aprobado por la administración de alimentos y medicamentos de los EE. UU.. En algunas realizaciones, un excipiente tiene un grado farmacéutico. En algunas realizaciones, un excipiente cumple con los estándares de la Farmacopea de los EE. UU. (USP), la Farmacopea europea (EP), la Farmacopea británica y/o la Farmacopea internacional.

Excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, entre otros, diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o granulantes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes, y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en composiciones farmacéuticas.

Diluyentes ejemplares incluyen, de modo no taxativo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, lactosa fosfato de sodio, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Ejemplos de agentes de granulación y/o dispersión incluyen, de modo no taxativo, almidón de papa, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón de sodio, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio de cationes, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, poli(vinilpirrolidona) reticulada (crospovidona), almidón de carboximetilo de sodio (glicolato de almidón de sodio), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón no soluble en agua, carboximetilcelulosa de calcio, aluminosilicato de magnesio (VEEGUM®), laurilsulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Ejemplos de agentes activos de superficie y/o emulsionantes incluyen, de modo no taxativo, emulsionantes naturales (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantana, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, lanolina, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (por ejemplo, bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM® [aluminosilicato de magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de peso molecular alto (por ejemplo, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, alcohol polivinílico), carbómeros (por ejemplo, carboxi polimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenano, derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®20], polioxietileno de sorbitán [TWEENn®60], monooleato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitá [Span®60], tri estearato de sorbitá [Span®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ásteres de polioxietileno (por ejemplo, monoestearato de polioxietileno [MYRJ®45], aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTOL®), ásteres de ácido graso de sacarosa, ásteres de ácido graso de polietilenglicol (por ejemplo, CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno (por ejemplo, lauril éter de polioxietileno [BRIJ®30]), poli(vinilpirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, lauril sulfato de sodio, PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato sódico, etc. y/o combinaciones de los mismos.

Agentes aglutinantes ejemplares incluyen, de modo no taxativo, almidón (por ejemplo, almidón de maíz y pasta de almidón), gelatina; azúcares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol,), gomas naturales y sintéticas (por ejemplo, acacia, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscara de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinilpirrolidona), aluminosilicato de magnesio (Veegum®), y arabogalactano de lárice); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácidos silícicos; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; etc.; y combinaciones de los mismos.

Los conservantes ejemplares pueden incluir, entre otros, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos y/u otros conservantes. Los antioxidantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y/o sulfito de sodio. . Los agentes quelantes ejemplares incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Los conservantes antimicrobianos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, fenetidina, fenetidina, imidureaxidinio, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Conservantes antifúngicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y/o ácido sórbico. Los conservantes de alcohol ejemplares incluyen, pero no se limitan a, etanol, polietilenglicol, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Los conservantes ácidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, entre otros, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitoluenado butilado (BHT), etilendiamina, lauril sulfato de sodio (SLS), lauril éter sulfato de sodio (SLES), bisulfito, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™, y/o EUXYL®.

Los ejemplos de agentes tamponadores incluyen, pero no se limitan a, soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido D-glucónico, calcio. glicerofosfato, lactato cálcico, ácido propanoico, levulinato cálcico, ácido pentanoico, fosfato cálcico dibásico, ácido fosfórico, fosfato cálcico tribásico, hidróxido fosfato cálcico, acetato potásico, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua sin pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico, etc., etc., y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes lubricantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, betanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio, etc., etc., y combinaciones de los mismos.

Los aceites ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almendra, semilla de albaricoque, aguacate, babasú, bergamota, semilla de corriente negra, borraja, cade, manzanilla, canola, alcaravea, carnauba, ricino, canela, manteca de cacao, coco, hígado de bacalao, café., maíz, semilla de algodón, emú, eucalipto, onagra, pescado, linaza, geraniol, calabaza, semilla de uva, avellana, hisopo, miristato de isopropilo, jojoba, nuez kukui, lavandina, lavanda, limón, litsea cubeba, nuez de macademia, malva, semilla de mango, semilla de espuma de prado, visón, nuez moscada, aceituna, naranja, reloj anaranjado, palma, almendra de palma, almendra de melocotón, maní, semilla de amapola, semilla de calabaza, colza, salvado de arroz, romero, cártamo, sándalo, sasquana, sabroso, espino amarillo, sésamo, manteca de karité, silicona, soja, girasol, árbol de té, cardo, tsubaki, vetiver, nuez y aceites de germen de trigo. Los ejemplos de aceites incluyen, pero no se limitan a, estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona y/o combinaciones de los mismos.

Excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y/o perfumantes pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador.

Administración

La presente divulgación abarca la administración de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm para cualquiera de los tratamientos terapéuticos, farmacéuticos, de diagnóstico o de formación de imágenes por cualquier ruta apropiada teniendo en cuenta los probables avances en las ciencias de la administración de fármacos. La administración puede ser desnuda o formulada.

Administración desnuda

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm de la presente invención se pueden administrar a una célula desnuda. Tal como se usa en esta invención, "desnudo" se refiere a administrar polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm libre de agentes que promuevan la transfección. Por ejemplo, los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNm suministrados a la célula pueden no contener modificaciones. Los polinucleótidos desnudos, las construcciones primarias o el ARNm pueden administrarse a la célula usando rutas de administración conocidas en la técnica y descritas en esta invención.

Administración formulada

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm de la presente invención pueden formularse usando los procedimientos descritos en esta invención. Las formulaciones pueden contener polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm que pueden estar modificados y/o sin modificar. Las formulaciones pueden incluir además, pero no se limitan a, agentes de penetración celular, un vehículo farmacéuticamente aceptable, un agente de administración, un polímero bioerosionable o biocompatible, un disolvente y un depósito de liberación sostenida. Los polinucleótidos formulados, las construcciones primarias o el ARNm pueden administrarse a la célula usando rutas de administración conocidas en la técnica y descritas en esta invención.

Las composiciones también se pueden formular para la administración directa a un órgano o tejido de varias formas en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, remojo o baño directo, a través de un catéter, mediante geles, polvos, ungüentos, cremas, geles, lociones y/o gotas, utilizando sustratos tales como tejidos o materiales biodegradables revestidos o impregnados con las composiciones y similares.

Administración

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía que dé como resultado un resultado terapéuticamente efectivo. Estos incluyen, entre otros, administración enteral, gastroenteral, epidural, oral, transdérmica, epidural (peridural), intracerebral (en el cerebro), intracerebroventricular (en los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación en la piel), intradérmica, (en la piel misma), subcutánea (debajo de la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardíaca (en el corazón), perfusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal, (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea (a través del ojo), inyección intracavernosa (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para distribución sistémica), transmucosa (difusión a través de una membrana mucosa), insuflación (inhalación), sublingual, sublabial, enema, colirio (sobre la conjuntiva), o en gotas para los oídos. En un caso específico, las composiciones se pueden administrar de una manera que les permita cruzar la barrera hematoencefálica, la barrera vascular u otra barrera epitelial. Las vías de administración no limitantes para los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm de la presente divulgación se describen a continuación.

Administración parenteral e inyectable

Las formas de dosificación líquida para administración por vía oral y parenteral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquida pueden comprender diluyentes inertes que se usan comúnmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes, y/o perfumantes. En determinados casos para administración parenteral, las composiciones se mezclan con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos.

Es posible formular preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones estériles inyectables acuosas o suspensiones oleaginosas, según la técnica conocida, usando agentes de dispersión, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o solventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Entre los solventes y vehículos aceptables que pueden ser empleados se encuentran agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro de sodio. Se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como un solvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. En la preparación de inyectables también se pueden usar ácidos grasos como el ácido oleico.

Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es deseable ralentizar la absorción del ingrediente activo por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tenga baja solubilidad en agua. Entonces, la velocidad de absorción del fármaco depende de su velocidad de disolución, la que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. De manera alternativa, la absorción retardada de una forma de fármaco administrado parenteralmente se logra al disolver o suspender el fármaco en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices de microcápsulas de los fármacos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. En función de la relación del fármaco respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular utilizado se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectables también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales

Administración rectal y vaginal

Las composiciones para administración rectal o vaginal son típicamente supositorios que pueden prepararse mezclando composiciones con excipientes adecuados no irritantes como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y por lo tanto se funden en el recto o cavidad vaginal y liberan el ingrediente activo.

Administración por vía oral

Las formas de dosificación sólidas para administración por vía oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, un ingrediente activo se mezcla con al menos un excipiente inerte, farmacéuticamente aceptable, tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o cargas o extensores (por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico), aglutinantes (por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y goma arábiga), humectantes (por ejemplo, glicerol), agentes desintegrantes (por ejemplo, agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio), retardantes de solución agentes (por ejemplo, parafina), aceleradores de la absorción (p.ej., compuestos de amonio cuaternario), agentes humectantes (p.ej., alcohol cetílico y monoestearato de glicerol), absorbentes (por ejemplo, caolín y arcilla de bentonita) y lubricantes (p.ej., talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio) y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosificación puede comprender agentes tamponadores.

Administración tópica o transdérmica

Como se describe en esta invención, las composiciones que contienen los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNm de la divulgación pueden formularse para su administración por vía tópica. La piel puede ser un lugar diana ideal para la administración, ya que es fácilmente accesible. La expresión génica puede estar restringida no solo a la piel, evitando potencialmente la toxicidad inespecífica, sino también a capas específicas y tipos celulares dentro de la piel.

El sitio de expresión cutánea de las composiciones administradas dependerá de la ruta de administración del ácido nucleico. Se consideran comúnmente tres vías para administrar polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm a la piel: (i) aplicación tópica (por ejemplo, para tratamiento local/regional y/o aplicaciones cosméticas); (ii) inyección intradérmica (por ejemplo, para tratamientos locales/regionales y/o aplicaciones cosméticas); y (iii) administración sistémica (por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades dermatológicas que afectan a regiones tanto cutáneas como extracutáneas), se pueden administrar polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm a la piel mediante varios enfoques diferentes conocidos en la técnica. Se ha demostrado que la mayoría de las estrategias de administración tópica funcionan para la administración de ADN, como, entre otros, la aplicación tópica de complejo liposoma-ADN no catiónico, complejo liposoma-ADN catiónico, mediado por partículas (biolística), transfecciones genéticas mediadas por punción y estrategias de administración viral. Después de la administración del ácido nucleico, se han detectado productos génicos en varios tipos celulares cutáneas diferentes, incluidos, entre otros, queratinocitos basales, células de las glándulas sebáceas, fibroblastos dérmicos y macrófagos dérmicos.

La divulgación proporciona una variedad de apósitos (por ejemplo, apósitos para heridas) o vendajes (por ejemplo, vendas adhesivas) para llevar a cabo de manera conveniente y/o efectiva los procedimientos de la presente divulgación. Normalmente, los apósitos o vendajes pueden comprender cantidades suficientes de composiciones farmacéuticas y/o polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm descritos en esta invención para permitir que un usuario realice múltiples tratamientos de un sujeto.

La divulgación prevé que los polinucleótidos, las construcciones primarias o las composiciones de ARNmm se administren en más de una inyección.

Antes de la administración tópica y/o transdérmica, al menos un área de tejido, como la piel, puede someterse a un dispositivo y/o solución que puede aumentar la permeabilidad. El tejido puede someterse a un dispositivo de abrasión para aumentar la permeabilidad de la piel (ver Publicación de Patente de EE. UU. n.° 20080275468). En otro caso, el tejido puede someterse a un dispositivo de mejora de ultrasonidos. Un dispositivo de mejora por ultrasonido puede incluir, entre otros, los dispositivos descritos en la Publicación EE. UU. n.° 20040236268 y Patentes EE. UU. n.° 6.491.657 y 6.234.990. Los procedimientos para mejorar la permeabilidad del tejido se describen en las Publicaciones EE. UU. n.° 20040171980 y 20040236268 y Pat. EE. UU. n.° 6.190.315.

Puede usarse un dispositivo para aumentar la permeabilidad del tejido antes de administrar las formulaciones de los polinucleótidos, las construcciones primarias y el ARNm descritos en esta invención. La permeabilidad de la piel se puede medir usando procedimientos conocidos en la técnica. y/o como se describe en la Patente de EE.UU. n.° 6.190.315. Como ejemplo no limitativo, se puede administrar una formulación de ARNm modificado mediante los procedimientos de administración de fármacos descritos en la Patente EE. UU. n.° 6.190.315.

En otro ejemplo no limitativo, el tejido puede tratarse con una crema de mezcla eutéctica de anestésicos locales (EMLA) antes, durante y/o después de que el tejido pueda someterse a un dispositivo que puede aumentar la permeabilidad. Katz y col. (Anesth Analg (2004); 98:371-76) demostraron que utilizando la crema EMLA en combinación con una energía baja, se observó un inicio de la analgesia cutánea superficial tan rápido como 5 minutos después de un pretratamiento con una ecografía de baja energía.

Pueden aplicarse potenciadores al tejido antes, durante y/o después de que el tejido haya sido tratado para aumentar la permeabilidad. Los potenciadores incluyen, pero no se limitan a, potenciadores de transporte, potenciadores físicos y potenciadores de cavitación. Se describen ejemplos no limitantes de potenciadores en la Patente EE. UU. n.° 6.190.315.

Se puede usar un dispositivo para aumentar la permeabilidad del tejido antes de administrar formulaciones de polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNm descritos en esta invención, que además pueden contener una sustancia que invoca una respuesta inmune. En otro ejemplo no limitante, una formulación que contiene una sustancia para invocar una respuesta inmune puede administrarse mediante los procedimientos descritos en las Publicaciones EE. UU. n.° 20040171980 y 20040236268.

Las formas de dosificación para la administración tópica y/o transdérmica de una composición pueden incluir pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes y/o parches. Generalmente, un ingrediente activo se mezcla en condiciones estériles con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier conservante y/o tampón necesarios según se requiera.

Además, la presente divulgación contempla el uso de parches transdérmicos, que a menudo tienen la ventaja añadida de proporcionar una administración controlada de un compuesto al cuerpo. Tales formas de dosificación se pueden elaborar, por ejemplo, al disolver y/o dispersar el compuesto en el medio apropiado. Alternativa o adicionalmente, la velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad y/o dispersando el compuesto en una matriz de polímero y/o gel.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen, entre otras, preparaciones líquidas y/o semilíquidas como linimentos, lociones, emulsiones de aceite en agua y/o de agua en aceite como cremas, ungüentos y/o pastas y/o soluciones. y/o suspensiones. Las formulaciones administrables tópicamente pueden comprender, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % (p/p) de ingrediente activo, aunque la concentración de ingrediente activo puede ser tan alta como el límite de solubilidad del ingrediente activo en el disolvente. Las formulaciones para administración tópica pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención.

Administración por depósito

Como se describe en esta invención, la composición se puede formular en depósitos para liberación prolongada. Generalmente, un órgano o tejido específico (un "tejido diana") es alcanzado para administración.

En algunos aspectos de la divulgación, los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNm se retienen espacialmente dentro o cerca de un tejido diana. Se proporciona un procedimiento para proporcionar una composición a un tejido diana de un sujeto mamífero poniendo en contacto el tejido diana (que contiene una o más células diana) con la composición en condiciones tales que la composición, en particular el o los componentes de ácido nucleico de la composición, se retiene sustancialmente en el tejido diana, lo que significa que al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más del 99,99 % de la composición se retiene en el tejido diana. Ventajosamente, la retención se determina midiendo la cantidad de ácido nucleico presente en la composición que entra en una o más células diana. Por ejemplo, al menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, ^{9 6} , 97, 98, 99, 99,9, 99,99 o más del 99,99 % de los ácidos nucleicos administrados al sujeto están presentes intracelularmente en un período de tiempo después de la administración. Por ejemplo, la inyección intramuscular a un sujeto mamífero se realiza usando una composición acuosa que contiene un ácido ribonucleico y un reactivo de transfección, y la retención de la composición se determina midiendo la cantidad de ácido ribonucleico presente en las células musculares. Los aspectos de la invención están dirigidos a procedimientos para proporcionar una composición a un tejido diana de un sujeto mamífero, poniendo en contacto el tejido diana (que contiene una o más células diana) con la composición en condiciones tales que la composición se retenga sustancialmente en el tejido diana. . La composición contiene una cantidad efectiva de un polinucleótido, construcción primaria o ARNm de manera que el polipéptido de interés se produzca en al menos una célula diana. Las composiciones contienen generalmente un agente de penetración celular, aunque también se contempla un ácido nucleico "desnudo" (tal como ácidos nucleicos sin un agente de penetración celular u otro agente) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas circunstancias, la cantidad de proteína producida por las células en un tejido aumenta de forma deseable. Preferiblemente, este aumento en la producción de proteínas se restringe espacialmente a las células dentro del tejido diana. Por tanto, se proporcionan procedimientos para aumentar la producción de una proteína de interés en un tejido de un sujeto mamífero. Se proporciona una composición que contiene polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm caracterizada porque se ha determinado una cantidad unitaria de composición para producir el polipéptido de interés en un porcentaje sustancial de células contenidas dentro de un volumen predeterminado del tejido diana. En algunas realizaciones, la composición incluye una pluralidad de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm diferentes, donde uno o más de uno de los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm codifica un polipéptido de interés. Opcionalmente, la composición también contiene un agente de penetración celular para ayudar en el suministro intracelular de la composición. Se hace una determinación de la dosis de la composición requerida para producir el polipéptido de interés en un porcentaje sustancial de células contenidas dentro del volumen predeterminado del tejido diana (generalmente, sin inducir una producción significativa del polipéptido de interés en el tejido adyacente al volumen predeterminado, o distalmente al tejido diana). Posteriormente a esta determinación, la dosis determinada se introduce directamente en el tejido del sujeto mamífero.

En un aspecto, prevé que los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNmm se administren en más de una inyección o mediante inyecciones de dosis divididas.

En un aspecto, el polinucleótido se puede retener cerca del tejido diana usando un pequeño depósito de fármaco desechable o una bomba de parche. Los ejemplos no limitantes de bombas de parche incluyen las fabricadas y/o vendidas por BD® (Franklin Lakes, NJ), Insulet Corporation (Bedford, MA), SteadyMed Therapeutics (San Francisco, CA), Medtronic (Minneapolis, MN), UniLife (York, pA), Valeritas (Bridgewater, New Jersey) y SpringLeaf Therapeutics (Boston, MA).

Administración pulmonar

Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Tal formulación puede comprender partículas secas que comprenden el ingrediente activo y que tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 7 nm o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 6 nm. Dichas composiciones están convenientemente en forma de polvos secos para la administración usando un dispositivo que comprende un depósito de polvo seco al cual se puede dirigir una corriente de propulsor para dispersar el polvo y/o usando un recipiente dispensador de polvo/disolvente autopropulsado, tal como un dispositivo que comprende el ingrediente activo disuelto y/o suspendido en un propulsor de bajo punto de ebullición en un recipiente sellado. Dichos polvos comprenden partículas donde al menos el 98 % de las partículas en peso tienen un diámetro superior a 0,5 nm y al menos el 95 % de las partículas en número tienen un diámetro inferior a 7 nm. Alternativamente, al menos el 95 % de las partículas en peso tienen un diámetro mayor de 1 nm y al menos el 90 % de las partículas en número tienen un diámetro menor de 6 nm. Las composiciones de polvo seco pueden incluir un diluyente de polvo fino sólido tal como azúcar y se proporcionan convenientemente en forma de dosis unitaria.

Los propulsores de bajo punto de ebullición generalmente incluyen propulsores líquidos que tienen un punto de ebullición por debajo de los 65 °F a presión atmosférica. Generalmente, el propulsor puede constituir del 50 % al 99,9 % (p/p) de la composición, y el ingrediente activo puede constituir del 0,1 % al 20 % (p/p) de la composición. Un propulsor puede comprender además ingredientes adicionales tales como un tensioactivo líquido no iónico y/o aniónico sólido y/o un diluyente sólido (que puede tener un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que comprenden el ingrediente activo).

Las composiciones farmacéuticas formuladas para administración pulmonar pueden proporcionar un ingrediente activo en forma de gotitas de una solución y/o suspensión. Dichas formulaciones pueden prepararse, empaquetarse y/o venderse como soluciones y/o suspensiones acuosas y/o alcohólicas diluidas, opcionalmente estériles, que comprenden ingrediente activo, y pueden administrarse convenientemente usando cualquier dispositivo de nebulización y/o atomización. Dichas formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero no se limitan a, un agente aromatizante como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tamponador, un agente tensioactivo y/o un conservante como metilhidroxibenzoato. Las gotitas proporcionadas por esta vía de administración pueden tener un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm.

Administración intranasal, nasal y bucal

Las formulaciones descritas en esta invención como útiles para la administración pulmonar son útiles para la administración intranasal de una composición farmacéutica. Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y que tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 pm a 500 pm. Dicha formulación se administra de la manera en que se toma el rapé, es decir, mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente del polvo que se mantiene cerca de la nariz.

Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, comprender desde aproximadamente un 0,1 % (p/p) hasta un 100 % (p/p) de ingrediente activo, y pueden comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. . Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración bucal. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de comprimidos y/o pastillas preparadas usando procedimientos convencionales, y pueden, por ejemplo, de 0,1 % a 20 % (p/p) de ingrediente activo, comprendiendo el resto un ingrediente activo que se disuelve por vía oral y/o composición degradable y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. Alternativamente, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo y/o una solución y/o suspensión aerosolizada y/o atomizada que comprende un ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo, aerosolizadas y/o en aerosol, cuando se dispersan, pueden tener un tamaño medio de partículas y/o gotas en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención.

Administración oftálmica

Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración oftálmica. Tales formulaciones pueden estar, por ejemplo, en forma de gotas para los ojos que incluyen, por ejemplo, una solución y/o suspensión al 0,1/1,0 % (p/p) del ingrediente activo en un excipiente líquido acuoso o aceitoso. Dichas gotas pueden comprender además agentes tamponantes, sales y/o uno o más de cualquier ingrediente adicional descrito en esta invención. Otras formulaciones de administración oftálmica que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina y/o en una preparación liposomal. Se contemplan gotas para los oídos y/o gotas para los ojos.

Administración de carga útil: agentes detectables y agentes terapéuticos

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm descritos en esta invención se pueden usar en varios escenarios diferentes en los que se desea la administración de una sustancia (la "carga útil") a una diana biológica, por ejemplo, la entrega de sustancias detectables para la detección de la diana, o administración de un agente terapéutico. Los procedimientos de detección pueden incluir, entre otros, procedimientos de obtención de imágenes in vitro e in vivo, p.ej., por ejemplo, inmunohistoquímica, imágenes de bioluminiscencia (BLI), imágenes de resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET), microscopía electrónica, tomografía computarizada de rayos X, imágenes Raman, tomografía de coherencia óptica, imágenes de absorción, imágenes térmicas, imágenes de reflectancia de fluorescencia, microscopía de fluorescencia, imágenes de tomografía molecular de fluorescencia, imágenes de resonancia magnética nuclear, imágenes de rayos X, imágenes de ultrasonido, imágenes fotoacústicas, ensayos de laboratorio o en cualquier situación en la que se requiera etiquetado/tinción/formación de imágenes. Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm pueden diseñarse para incluir tanto un enlazador como una carga útil en cualquier orientación útil. Por ejemplo, un enlazador que tiene dos extremos se usa para unir un extremo a la carga útil y el otro extremo a la nucleobase, como en las posiciones C-7 o C-8 de la deaza-adenosina o deazaguanosina o a las posiciones N-3 o C-5 de citosina o uracilo. El polinucleótido de la divulgación puede incluir más de una carga útil (por ejemplo, una etiqueta y un inhibidor de la transcripción), así como un enlazador escindible. En un aspecto, el nucleótido modificado es un trifosfato de 7-deaza-adenosina modificado, donde un extremo de un enlazador escindible está unido a la posición C7 de 7-deaza-adenina, el otro extremo del enlazador está unido a un inhibidor (p. ej., a la posición C5 de la nucleobase en una citidina), y una etiqueta (p. ej., Cy5) se une al centro del enlazador (ver, p. ej., el compuesto 1 de A*pCp C5 Parg Capless en la Fig. 5 y columnas 9 y 10 de la Pat. EE. UU. n.° 7.994.304). Tras la incorporación del trifosfato de 7-deaza-adenosina modificado a una región codificante, el polinucleótido resultante tendrá un enlazador escindible unido a una etiqueta y un inhibidor (por ejemplo, un inhibidor de la polimerasa). Tras la escisión del enlazador (por ejemplo, con condiciones reductoras para reducir un enlazador que tiene un resto disulfuro escindible), se liberan la etiqueta y el inhibidor. En esta invención se describen enlazadores y cargas útiles adicionales (por ejemplo, agentes terapéuticos, etiquetas detectables y cargas útiles que penetran en las células).

Por ejemplo, los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm descritos en esta invención pueden usarse en células madre pluripotentes inducidas (células iPS), que pueden rastrear directamente las células que se transfectan en comparación con las células totales en el grupo. En otro ejemplo, un fármaco que puede unirse a los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm a través de un enlazador y puede marcarse con fluorescencia se puede usar para rastrear el fármaco in vivo, p.ej, intracelularmente. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el uso de un polinucleótido, construcción primaria o ARNm en la administración reversible de fármacos a las células.

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm descritos en esta invención pueden usarse en el direccionamiento intracelular de una carga útil, e.g., un agente detectable o terapéutico, a un orgánulo específico. Los ejemplos de dianas intracelulares pueden incluir, pero no se limitan a, la localización nuclear para el procesamiento de ARNm avanzado, o una secuencia de localización nuclear (NLS) unida al ARNm que contiene un inhibidor.

Además, los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm descritos en esta invención pueden usarse para administrar agentes terapéuticos a células o tejidos, por ejemplo, en animales vivos. Por ejemplo, los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNm unidos al agente terapéutico a través de un enlazador pueden facilitar la penetración del miembro permitiendo que el agente terapéutico viaje al interior de una célula para alcanzar una diana intracelular..

La carga útil puede ser un agente terapéutico como una citotoxina, un ion radiactivo, un agente quimioterapéutico u otro agente terapéutico. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que pueda ser perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinadiona, mitoxantrona, 1-dehidraminicinidiona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, maitansinoides, p.ej., maitansinol (ver Pat. EE. UU. n.° 5.208.020 ), raquelmicina (CC-1065, ver Pat. EE. UU. n.° 5.475.092, 5.585.499, y 5.846.545), y análogos u homólogos de los mismos. Los iones radiactivos incluyen, pero no se limitan a, yodo (por ejemplo, yodo 125 o yodo 131), estroncio 89, fósforo, paladio, cesio, iridio, fosfato, cobalto, itrio 90, samario 153 y praseodimio. Otros agentes terapéuticos incluyen, entre otros, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tiotepa clorambucilo, raquelmicina (CC-1065), melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina antibióticos (p. ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina, vinblastina, taxol y maitansinoides).

La carga útil puede ser un agente detectable, como varias moléculas pequeñas orgánicas, compuestos inorgánicos, nanopartículas, enzimas o sustratos enzimáticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes (por ejemplo, luminol), materiales bioluminiscentes (por ejemplo, luciferasa, luciferina y aequorina), materiales quimioluminiscentes, materiales radiactivos (p. ej., 18F, 67Ga, 81mKr, 82Rb, 111In, 123I, 133Xe, 201Tl, 125I, 35S, 14C, 3H, or 99mTc (p.ej., como pertecnetato (tecnetato(VII), TcO4-)), y agentes de contraste (p.ej., oro (p.ej., nanopartículas de oro), gadolinio (p. ej., Gd quelado), óxidos de hierro (p. ej., óxido de hierro superparamagnético (SPIO), nanopartículas de óxido de hierro monocristalino (MION) y óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño (USPIO)), quelatos de manganeso (p. ej., Mn-DPDP), sulfato de bario, medios de contraste yodados (iohexol), microburbujas o perfluorocarbonos). Dichas etiquetas ópticamente detectables incluyen, por ejemplo, sin limitación, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilben-2,2'disulfónico; acridina y derivados (por ejemplo, acridina e isotiocianato de acridina); ácido 5-(2'-aminoetil) aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato; N-(4-anilino-l-naftil) maleimida; antranilamida; BODIPY; Amarillo brillante; cumarina y derivados (por ejemplo, cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120) y 7-amino-4-trifluorometilcumarina (Coumarin 151)); tintes de cianina; cianosina; 4', 6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5'5"-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (rojo de bromopirogalol); ácido 7­ dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodihidroestilben-2,2'-disulfónico; ácido 4,4'-diisotiocianatostilben-2,2'-disulfónico; 5-[dimetilamino]-naftalen-1-sulfonil cloruro (DNS, dansilcloruro); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados (por ejemplo, eosina e isotiocianato de eosina); eritrosina y derivados (por ejemplo, eritrosina B e isotiocianato de eritrosina); etidio; fluoresceína y derivados (por ejemplo, 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il) aminofluoresceína (DTAF), 2', 7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, 5- (y-6) -isotiocianato de X-rodamina (QFITC o XRITC) y fluorescamina); 2-[2-[3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2Hbenz[e]indol-2-ilidene]etiliden]-2-[4-(etoxicarbonil)-1-piperazinil]-1-ciclopenten-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulforpropil)-1H-benz[e]indolium hidróxido, sal interna, compuesto con n,n-dietiletanamina(1:1) (IR144); 5-cloro-2-[2-[3-[(5-cloro-3-etil-2(3H)-benzotiazol- iliden)etiliden]-2-(difenilamino)-1 -ciclopenten-1 -il]etenil]-3-etil perclorato de benzotiazolio (IR140); Isotiocianato verde de malaquita; ortocresolftaleína de 4-metilumbeliferona; nitrotirosina; pararosanilina; Fenol rojo; B-ficoeritrina; o-ftaldialdehído; pireno y derivados (por ejemplo, pireno, butirato de pireno y succinimidil 1-pireno); puntos cuánticos de butirato; Rojo reactivo 4 (rojo brillante CIBACRON™ 3B-A); rodamina y derivados (p. ej., 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6^g ), lisamina rodamina B cloruro de sulfónico rodamina (Hodgkin), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, linfogranuloma B, linfogranuloma 101, derivado de cloruro de sulfónico de sulforrodamina 101 (rojo Texas), N,N,N', N'tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA) tetrametil rodamina e isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC)); riboflavina; ácido rosólico; derivados de quelato de terbio; Cianina-3 (Cy3); Cianina-5 (Cy5); cianina-5.5 (Cy5.5), cianina-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Alexa 647; La Jolta Blue; ftalocianina; y naftalocianina.

El agente detectable puede ser un precursor no detectable que se vuelve detectable tras la activación (p. ej., construcciones fluorogénicas de tetrazina-fluoróforo (p. ej., Tetrazina-BODIPY FL, tetrazina-Oregon Green 488 o tetrazina-BODIPY TMR-X) o agentes fluorogénicos activable por enzima (por ejemplo, PROSENSE® (VisEn Medical))).Ensayos in vitro donde se pueden usar las composiciones marcadas con enzimas incluyen, entre otros, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos de inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, inmunoensayos enzimáticos (EIA), radioinmunoensayos (RIA) y análisis de transferencia Western.

Combinaciones

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNm pueden usarse en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos, profilácticos, de diagnóstico o de formación de imágenes. Por "en combinación con", no se pretende implicar que los agentes deben administrarse al mismo tiempo y/o que deben formularse para su administración conjunta, aunque estos procedimientos de administración están dentro del alcance de la presente descripción. Las composiciones se pueden administrar simultáneamente con, antes o después de, uno o más de otros procedimientos terapéuticos o médicos deseados. En general, cada agente se administrará a una dosis y/o en un horario determinado para ese agente. En esta invención se describe la administración de composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir y/o modificar su metabolismo, inhibir su excreción y/o modificar su distribución dentro del cuerpo. Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos, las construcciones primarias y/o el ARNmm pueden usarse en combinación con un agente farmacéutico para el tratamiento del cáncer o para controlar las células hiperproliferativas. En la Pat. EE. UU. n.° 7.964.571, se describe una terapia de combinación para el tratamiento de tumores sólidos primarios o metastatizados usando una composición farmacéutica que incluye un plásmido de ADN que codifica la interleucina-12 con un lipopolímero y también administra al menos un agente anticanceroso o quimioterapéutico. Además, los polinucleótidos, las construcciones primarias y/o el ARNm de la presente divulgación que codifica moléculas antiproliferativas pueden estar en una composición farmacéutica con un lipopolímero (ver, por ejemplo, Pub. EE. UU. n.° 20110218231, que reivindica una composición farmacéutica que comprende un plásmido de ADN que codifica una molécula antiproliferativa y un lipopolímero) que se puede administrar con al menos un agente quimioterapéutico o anticanceroso.

Dosificación

La presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden la administración de polinucleótidos, construcciones primarias y/o ARNm y sus proteínas o complejos codificados de acuerdo con la divulgación a un sujeto que lo necesite, ácidos nucleicos, proteínas o complejos, o composiciones farmacéuticas, de formación de imágenes, de diagnóstico o profilácticas del mismo, se puede administrar a un sujeto usando cualquier cantidad y cualquier vía de administración efectiva para impedir, tratar, diagnosticar o obtener imágenes de una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, una enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con déficits de memoria de trabajo). La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad y similares. Las composiciones de acuerdo con la invención se formulan típicamente en forma de conjunto de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Sin embargo, se entenderá que el médico tratante puede decidir el uso diario total de las composiciones de la presente invención dentro del alcance del buen juicio médico. El nivel de dosis de formación de imágenes específico terapéuticamente efectivo, profilácticamente efectivo o apropiado para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o coincidentemente con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

En ciertas realizaciones, las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden administrarse a niveles de dosificación suficientes para administrar desde aproximadamente 0,0001 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta aproximadamente 0,05 mg/kg, desde aproximadamente 0,005 mg./kg hasta aproximadamente 0,05 mg/kg, desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta aproximadamente 0,005 mg/kg, desde aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 0,5 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente De 0,1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de formación de imágenes deseado. La dosis deseada se puede administrar tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tercer día, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. En determinadas realizaciones, es posible administrar la dosis deseada en administraciones múltiples (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones).

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que la administración de ARNm en regímenes de dosis divididas produce niveles más altos de proteínas en sujetos mamíferos. Tal como se usa en esta invención, una "dosis dividida" es la división de la dosis unitaria única o la dosis diaria total en dos o más dosis, por ejemplo, dos o más administraciones de la dosis unitaria única. Tal como se usa en esta invención, una "dosis unitaria única" es una dosis de cualquier terapéutico administrado en una dosis/en un momento/vía única/punto único de contacto, es decir, un evento de administración única. Tal como se usa en esta invención, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un período de 24 horas. Puede administrarse como una dosis unitaria única. En una realización, el ARNm de la presente invención se administra a un sujeto en dosis divididas. El ARNmm se puede formular en tampón solamente o en una formulación descrita en esta invención.

Formas de dosificación

Una composición farmacéutica descrita en esta invención puede formularse en una forma de dosificación descrita en esta invención, como tópica, intranasal, intratraqueal o inyectable (por ejemplo, intravenosa, intraocular, intravítrea, intramuscular, intracardíaca, intraperitoneal, subcutánea).

Formas de dosificación líquidas

Las formas de dosificación líquida para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquida pueden comprender diluyentes inertes que se usan comúnmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. En determinadas realizaciones para la administración parenteral, las composiciones se pueden mezclar con agentes solubilizantes tales como CREMOPHOR®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos.

Inyectables

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida y pueden incluir agentes dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser soluciones, suspensiones y/o emulsiones inyectables estériles en diluyentes y/o solventes parenteralmente aceptables no tóxicos, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Entre los solventes y vehículos aceptables que pueden ser empleados se encuentran, sin limitación, agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro de sodio. Se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos mono o diglicéridos sintéticos. En la preparación de inyectables también se pueden usar ácidos grasos como el ácido oleico.

Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es deseable ralentizar la absorción del ingrediente activo por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tenga baja solubilidad en agua. La velocidad de absorción del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm depende a continuación de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un polinucleótido, una construcción primaria o un ARNmm administrados por vía parenteral se puede lograr disolviendo o suspendiendo el polinucleótido, una construcción primaria o ARNmm en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. Dependiendo de la relación de polinucleótido, construcción primaria o ARNmm a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de polinucleótidos, construcción primaria o ARNmm. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen, sin lkimitación, poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito pueden prepararse atrapando el polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con los tejidos corporales.

Pulmonar

Las formulaciones descritas en esta invención como útiles para la administración pulmonar también pueden usarse para la administración intranasal de una composición farmacéutica. Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y que tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 pm a 500 pm. Dicha formulación se administra de la manera en que se toma el rapé, es decir, mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente del polvo que se mantiene cerca de la nariz.

Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, comprender desde aproximadamente un 0,1 % (p/p) hasta un 100 % (p/p) de ingrediente activo, y pueden comprender uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. . Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración bucal. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de comprimidos y/o pastillas preparadas usando procedimientos convencionales, y pueden contener, por ejemplo, alrededor de 0,1 % a 20 % (p/p) de ingrediente activo, donde el resto puede comprender un ingrediente activo por vía oral. composición soluble y/o degradable y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. Alternativamente, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo y/o una solución y/o suspensión aerosolizada y/o atomizada que comprende un ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo, aerosolizadas y/o en aerosol, cuando se dispersan, pueden tener un tamaño medio de partículas y/o gotas en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención.

Es posible encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

Recubrimientos o cubiertas

Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden comprender agentes opacificantes y pueden ser de una composición que liberen el ingrediente o los principios activos solo, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden emplear incluyen ceras y sustancias poliméricas. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como rellenos en cápsulas de gelatina rellenas duras y blandas usando excipientes tales como lactosa o glúcidos de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Propiedades de composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden caracterizar por uno o más de biodisponibilidad, ventana terapéutica y/o volumen de distribución.

Biodisponibilidad

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm, cuando se formulan en una composición con un agente de administración como se describe en esta invención, pueden exhibir un aumento en la biodisponibilidad en comparación con una composición que carece de un agente de administración como se describe en esta invención. Tal como se usa en esta invención, el término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica de una cantidad dada de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm administrado a un mamífero. La biodisponibilidad se puede evaluar midiendo el área bajo la curva (AUC) o la concentración máxima en suero o plasma (Cmax) de la forma inalterada de un compuesto después de la administración del compuesto a un mamífero. El AUC es una determinación del área bajo la curva que representa la concentración sérica o plasmática de un compuesto a lo largo de la ordenada (eje Y) frente al tiempo a lo largo de la abscisa (eje X). Generalmente, el AUC para un compuesto particular se puede calcular usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica y como se describe en G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc., 1996 .

El valor Cmax es la concentración máxima del compuesto alcanzada en el suero o plasma de un mamífero después de la administración del compuesto al mamífero. El valor Cmax de un compuesto particular se puede medir usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Las frases "aumentar la biodisponibilidad" o "mejorar la farmacocinética", como se usan en esta invención, significan que la disponibilidad sistémica de un primer polinucleótido, construcción primaria o ARNm, medido como AUC,Cmax, o Cmin en un mamífero es mayor, cuando se coadministra con un agente de administración como se describe en esta invención, que cuando dicha coadministración no tiene lugar. En algunos casos, la biodisponibilidad del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm puede aumentar en al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 100 %.

Ventana terapéutica

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm, cuando se formulan en una composición con un agente de administración como se describe en esta invención, pueden exhibir un aumento en la ventana terapéutica del polinucleótido, construcción primaria o composición de ARNmm administrados en comparación con la ventana terapéutica del polinucleótido, construcción primaria o composición de ARNmm administrados que carecen de un agente de administración como se describe en esta invención. Tal como se usa en esta invención, "ventana terapéutica" se refiere al intervalo de concentraciones plasmáticas, o al intervalo de niveles de sustancia terapéuticamente activa en el sitio de acción, con una alta probabilidad de provocar un efecto terapéutico. En algunos casos, la ventana terapéutica del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm cuando coadministrados con un agente de administración como se describe en esta invención puede aumentar en al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 100 %.

Volumen de distribución

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm, cuando se formulan en una composición con un agente de administración como se describe en esta invención, pueden exhibir un volumen de distribución mejorado (Vdist), por ejemplo, reducido o dirigido, en relación con una composición que carece de un agente de suministro como se describe en esta invención. El volumen de distribución (Vdist) relaciona la cantidad del fármaco en el cuerpo con la concentración del fármaco en la sangre o el plasma. Tal como se usa en esta invención, el término "volumen de distribución" se refiere al volumen de líquido que se requeriría para contener la cantidad total de fármaco en el cuerpo a la misma concentración que en la sangre o el plasma: Vdist es igual a la cantidad de fármaco en el cuerpo/concentración de fármaco en sangre o plasma.: Por ejemplo, para una dosis de 10 mg y una concentración plasmática de 10 mg/L, el volumen de distribución sería de 1 litro. El volumen de distribución refleja la medida en que el fármaco está presente en el tejido extravascular. Un gran volumen de distribución refleja la tendencia de un compuesto a unirse a los componentes tisulares en comparación con la unión a proteínas plasmáticas. En un entorno clínico, Vdist se puede utilizar para determinar una dosis de carga para lograr una concentración en estado estable. En algunos casos, el volumen de distribución del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm cuando coadministrados con un agente de administración como se describe en esta invención puede disminuir en al menos aproximadamente un 2 %, al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 15 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente el 70 %.

Efecto biológico

El efecto biológico del ARNm modificado administrado a los animales se puede clasificar analizando la expresión de proteínas en los animales. La expresión de la proteína reprogramada se puede determinar analizando una muestra biológica recogida de un mamífero al que se le ha administrado el ARNm modificado de la presente divulgación. Puede ser preferible la proteína de expresión codificada por el ARNm modificado administrado al mamífero de al menos 50 pg/ml. Por ejemplo, una expresión de proteína de 50-200 pg/ml para la proteína codificada por el ARNm modificado suministrado al mamífero puede verse como una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína en el mamífero. Cuantificación

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación pueden cuantificarse en exosomas derivados de uno o más fluidos corporales. Tal como se usa en esta invención, "fluidos corporales" incluye sangre periférica, suero, plasma, ascitis, orina, fluido cefalorraquídeo (LCR), esputo, saliva, médula ósea, fluido sinovial, humor acuoso, fluido amniótico, cerumen, leche materna, fluido de lavado bronqueoalveolar, semen, fluido prostático, fluido de Cowper o fluido preeyaculatorio, sudor, materia fecal, cabello, lágrimas, fluido quístico, fluido pleural y peritoneal, fluido pericárdico, linfa, quimo, quilo, bilis, fluido intersticial, menstruación, pus, sebo, vómitos, secreciones vaginales, secreciones mucosas, agua de heces, jugo pancreático, fluidos de lavado de las cavidades sinusales, aspirados broncopulmonares, fluido de la cavidad blastocilo y sangre del cordón umbilical. Alternativamente, los exosomas se pueden recuperar de un órgano seleccionado de entre el grupo que consiste en pulmón, corazón, páncreas, estómago, intestino, vejiga, riñón, ovario, testículos, piel, colon, mama, próstata, cerebro, esófago, hígado y placenta.

En el procedimiento de cuantificación, se obtiene una muestra de no más de 2 mL del sujeto y se aíslan los exosomas mediante cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugación en gradiente de densidad, centrifugación diferencial, ultrafiltración de nanomembranas, captura inmunoabsorbente, purificación por afinidad, separación de microfluidos o combinaciones de los mismos. En el análisis, el nivel o concentración de un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm puede ser un nivel de expresión, presencia, ausencia, truncamiento o alteración de la construcción administrada. Es ventajoso correlacionar el nivel con uno o más fenotipos clínicos o con un ensayo para un biomarcador de enfermedad humana. El ensayo se puede realizar usando sondas específicas de construcción, citometría, qRT-PCR, PCR en tiempo real, pCr , citometría de flujo, electroforesis, espectrometría de masas o combinaciones de los mismos, mientras que los exosomas pueden aislarse usando procedimientos inmunohistoquímicos como procedimientos de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ( ELISA). Los exosomas también pueden aislarse mediante cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugación en gradiente de densidad, centrifugación diferencial, ultrafiltración de nanomembranas, captura inmunoabsorbente, purificación por afinidad, separación de microfluidos o combinaciones de los mismos.

Estos procedimientos brindan al investigador la capacidad de monitorear, en tiempo real, el nivel de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm restantes o entregados. Esto es posible porque los polinucleótidos, las construcciones primarias o el ARNmm de la presente divulgación difieren de las formas endógenas debido a las modificaciones estructurales o químicas.

Detección de polinucleótidos modificados por espectrometría de masas

La espectrometría de masas (MS) es una técnica analítica que puede proporcionar información estructural y de masa molecular/concentración de moléculas después de su conversión en iones. Las moléculas se ionizan primero para adquirir cargas positivas o negativas y luego viajan a través del analizador de masas para llegar a diferentes áreas del detector de acuerdo con su relación masa/carga (m/z).

La espectrometría de masas se realiza utilizando un espectrómetro de masas que incluye una fuente de iones para ionizar la muestra fraccionada y crear moléculas cargadas para su posterior análisis. Por ejemplo, la ionización de la muestra puede realizarse mediante ionización por electropulverización (ESI), ionización química a presión atmosférica (APCI), fotoionización, ionización electrónica, bombardeo por átomos rápidos (FAB)/ionización secundaria líquida (LSIMS), desorción/ionización láser asistida por matriz ( MALDI), ionización de campo, desorción de campo, ionización por termopulverización/plasma e ionización por haz de partículas. El experto en la materia comprenderá que la elección del procedimiento de ionización se puede determinar en función del analito que se va a medir, el tipo de muestra, el tipo de detector, la elección del modo positivo frente al negativo, etc.

Una vez que la muestra ha sido ionizada, los iones cargados positivamente o cargados negativamente así creados pueden analizarse para determinar una relación de masa a carga (es decir, m/z). Los analizadores adecuados para determinar las relaciones de masa a carga incluyen analizadores de cuatro polos, analizadores de trampas de iones y analizadores de tiempo de vuelo. Los iones pueden detectarse utilizando varios modos de detección. Por ejemplo, se pueden detectar iones seleccionados (es decir, utilizando un modo de monitorización selectiva de iones (SIM)) o, alternativamente, los iones pueden detectarse utilizando un modo de exploración, por ejemplo, monitorización de reacciones múltiples (MRM) o monitorización de reacciones seleccionadas (SRM).

Se ha demostrado que la monitorización de reacciones múltiples de cromatografía líquida (LC-MS/MRM) junto con la dilución marcada con isótopos estables de estándares de péptidos es un procedimiento efectivo para la verificación de proteínas (p. ej., Keshishian y col., Mol Cell Proteomics 20098: 2339-2349; Kuhn y col., Clin Chem 200955:1108-1117; Lopez y col., Clin Chem 201056:281-290). A diferencia de la espectrometría de masas no dirigida que se usa con frecuencia en los estudios de descubrimiento de biomarcadores, los procedimientos de MS dirigida son modos de MS basados en secuencias de péptidos que enfocan la capacidad analítica completa del instrumento en decenas a cientos de péptidos seleccionados en una mezcla compleja. Al restringir la detección y la fragmentación a solo aquellos péptidos derivados de proteínas de interés, la sensibilidad y la reproducibilidad mejoran drásticamente en comparación con los procedimientos de MS en modo de descubrimiento. Este procedimiento de cuantificación de proteínas de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) basado en espectrometría de masas puede impactar dramáticamente el descubrimiento y la cuantificación de biomarcadores a través del perfil de expresión de proteínas multiplexado, rápido y dirigido de muestras clínicas.

Una muestra biológica que puede contener al menos una proteína codificada por al menos un ARNm modificado puede analizarse mediante el procedimiento de MRM-MS. La cuantificación de la muestra biológica puede incluir además, pero no se limita a, péptidos o proteínas marcados isotópicamente como patrones internos.

Según la presente divulgación, la muestra biológica, una vez obtenida del sujeto, puede someterse a digestión enzimática. Tal como se usa en esta invención, el término "digerir" significa romper en péptidos más cortos. Tal como se usa en esta invención, la frase "tratar una muestra para digerir proteínas" significa manipular una muestra de tal manera que se descompongan las proteínas en una muestra. Estas enzimas incluyen, pero no se limitan a, tripsina, endoproteinasa Glu-C y quimotripsina. Una muestra biológica que puede contener al menos una proteína codificada por al menos un ARNm modificado puede digerirse usando enzimas.

Una muestra biológica que puede contener proteína codificada por ARNm modificado puede analizarse en busca de proteína usando ionización por electropulverización. La espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI) (ESIMS) utiliza energía eléctrica para ayudar en la transferencia de iones de la solución a la fase gaseosa antes de analizarlos mediante espectrometría de masas. Las muestras se pueden analizar usando procedimientos conocidos en la técnica. (p.ej., Ho y col., Clin Biochem Rev. 200324(1 ):3-12). Las especies iónicas contenidas en la solución se pueden transferir a la fase gaseosa dispersando una fina pulverización de gotitas de carga, evaporando el disolvente y expulsando los iones de las gotitas cargadas para generar una niebla de gotitas muy cargadas. La neblina de gotitas muy cargadas puede analizarse usando al menos 1, al menos 2, al menos 3 o al menos 4 analizadores de masas tales como, pero sin limitarse a, un analizador de masas de cuatro polos. Además, el procedimiento de espectrometría de masas puede incluir una etapa de purificación. Como ejemplo no limitativo, el primer cuadripolo puede configurarse para seleccionar una sola relación m/z para que pueda filtrar otros iones moleculares que tengan una relación m/z diferente, lo que puede eliminar los complicados y laboriosos procedimientos de purificación de muestras previos al análisis MS.

Una muestra biológica que puede contener proteína codificada por ARNm modificado puede analizarse en busca de proteína en un sistema ESIMS en tándem (por ejemplo, MS/MS). Como ejemplos no limitantes, las gotitas pueden analizarse usando un escaneo de producto (o escaneo secundario), un escaneo de precursores (escaneo principal), una pérdida neutra o una monitorización de reacciones múltiples.

Una muestra biológica que puede contener proteína codificada por ARNm modificado puede analizarse usando espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) (MALDIMS). MALDI proporciona la vaporización e ionización no destructivas de moléculas grandes y pequeñas, como las proteínas. En el análisis MALDI, el analito se co-cristaliza primero con un gran exceso molar de un compuesto matriz, que también puede incluir, pero no se limita a, un ácido orgánico débil que absorbe ultravioleta. Ejemplos no limitantes de matrices utilizadas en MALDI son ácido a-ciano-4-hidroxicinámico, ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico y ácido 2,5­ dihidroxibenzoico. La radiación láser de la mezcla analito-matriz puede resultar en la vaporización de la matriz y el analito. La desorción inducida por láser proporciona altos rendimientos de iones del analito intacto y permite la medición de compuestos con alta precisión. Las muestras se pueden analizar usando procedimientos conocidos en la técnica.(p.ej., Lewis, Wei y Siuzdak, Encyclopedia of Analytical Chemistry 2000:5880-5894). Como ejemplos no limitantes, los analizadores de masas utilizados en el análisis MALDI pueden incluir un tiempo de vuelo lineal (TOF), un reflectrón TOF o un analizador de masas por transformada de Fourier.

La mezcla de analito-matriz se puede formar usando el procedimiento de gotitas secas. Una muestra biológica se mezcla con una matriz para crear una solución de matriz saturada donde la proporción de matriz a muestra es de aproximadamente 5000:1. A continuación, se deja secar una alícuota (aproximadamente 0,5-2,0 uL) de la solución de matriz saturada para formar la mezcla de analito y matriz..

La mezcla de analito-matriz se puede formar usando el procedimiento de capa fina. Primero se forma una película homogénea de matriz y luego se aplica la muestra y puede ser absorbida por la matriz para formar la mezcla analitomatriz.

La mezcla de analito-matriz se puede formar usando el procedimiento de capa gruesa. Se forma una película de matriz homogénea con un aditivo de matriz de nitrocelulosa. Una vez que se obtiene la capa uniforme de matriz de nitrocelulosa, la muestra se aplica y se absorbe en la matriz para formar la mezcla analito-matriz.

La mezcla de analito-matriz se puede formar usando el procedimiento de sándwich. Se prepara una capa fina de cristales de matriz como en el procedimiento de capa fina seguido de la adición de gotitas de ácido trifluoroacético acuoso, la muestra y la matriz. Luego, la muestra se absorbe en la matriz para formar la mezcla analito-matriz.. VI. Usos de polinucleótidos sintéticos y/o ARNsg sintéticos

Los polinucleótidos sintéticos y/o ARNsg sintéticos de la presente divulgación pueden usarse para alterar el fenotipo de las células. Los polinucleótidos, construcciones primarias y ARNmm de la divulgación pueden codificar péptidos, polipéptidos o proteínas múltiples para producir polipéptidos de interés. Los polipéptidos de interés pueden usarse en terapéutica y/o entornos clínicos y de investigación. Como ejemplo no limitativo, los polipéptidos de interés pueden incluir factores de reprogramación, factores de diferenciación y factores de desdiferenciación..

Agentes terapéuticos

Los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la presente divulgación, tales como ácidos nucleicos modificados y ARN modificados, y las proteínas traducidas de ellos descritas en esta invención, pueden usarse como agentes terapéuticos o profilácticos. Se proporcionan para su uso en medicina, terapia y tratamientos preventivos. Por ejemplo, un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm descritos en esta invención (p. ej., un ARNm modificado que codifica un polipéptido o proteína relacionado con CRISPR) se puede administrar a un sujeto, donde el polinucleótido, construcción primaria o ARNmm se traduce in vivo para producir una sustancia terapéutica. o polipéptido profiláctico en el sujeto. Asimismo, y opcionalmente en combinación con lo anterior, un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm descritos en esta invención (p. ej., un ARNg modificado o una pluralidad de los mismos) se puede administrar a un sujeto, donde el polinucleótido, construcción primaria o ARNmm guía la edición de genes mediante un polipéptido o proteína relacionado con CRISPR). Se proporcionan composiciones, procedimientos, kits y reactivos para el diagnóstico, tratamiento o prevención de una enfermedad o afección en humanos y otros mamíferos. Los agentes terapéuticos activos de la divulgación incluyen polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm, células que contienen los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm o polipéptidos traducidos a partir de polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm.

En esta invención se describen agentes terapéuticos de combinación que contienen uno o más polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm que contienen regiones traducibles que codifican una proteína o proteínas. En ciertos casos, en esta invención se proporcionan terapias de combinación que contienen uno o más polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm que contienen regiones no traducibles, por ejemplo, regiones complementarias a secuencias de genes diana, por ejemplo, ARNsg.

En esta invención se proporcionan procedimientos para inducir la traducción de un polipéptido recombinante en una población celular utilizando el polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm descritos en esta invención. Esta traducción puede ser in vivo, ex vivo, en cultivo, o in vitro. La población celular se pone en contacto con una cantidad efectiva de una composición que contiene un ácido nucleico que tiene al menos una modificación de nucleósido y una región traducible que codifica el polipéptido recombinante. La población celular también se pone en contacto opcionalmente con una cantidad efectiva de una composición que contiene un ácido nucleico que tiene al menos una modificación de nucleósido y tiene complementariedad con una secuencia de gen diana, por ejemplo, un ARNsg. La población se pone en contacto en condiciones tales que el ácido nucleico se localiza en una o más células de la población celular y el polipéptido recombinante se traduce en la célula a partir del ácido nucleico y/o el ARNsg (o la pluralidad del mismo) también se localiza en una o más células de la población celular.

Se proporciona una "cantidad efectiva" de la composición basada, al menos en parte, en el tejido diana, el tipo celular diana, los medios de administración, las características físicas del ácido nucleico (por ejemplo, el tamaño y la extensión de los nucleósidos modificados) y otros determinantes. En general, una cantidad efectiva de la composición proporciona una producción efectiva de proteínas en la célula, preferiblemente más efectiva que una composición que contiene el correspondiente ácido nucleico no modificado. El aumento de la eficiencia puede demostrarse mediante un aumento de la transfección celular (es decir, el porcentaje de células transfectadas con el ácido nucleico), un aumento de la traducción de la proteína del ácido nucleico, una disminución de la degradación del ácido nucleico (como se demuestra, por ejemplo, por un aumento de la duración de la traducción de la proteína de un ácido nucleico modificado), o respuesta inmune innata reducida de la célula huésped.

Los aspectos de la divulgación están dirigidos a procedimientos para inducir la traducción in vivo de un polipéptido recombinante en un sujeto mamífero que lo necesite, por ejemplo, una proteína recombinante relacionada con CRISPR. Otros aspectos de la divulgación están dirigidos a procedimientos para inducir la edición del gen in vivo en un sujeto mamífero que lo necesite. Allí, una cantidad efectiva de una composición que contiene un ácido nucleico que tiene al menos una modificación estructural o química y una región traducible que codifica el polipéptido recombinante, opcionalmente en combinación con una cantidad efectiva de una composición que contiene uno o más ácidos nucleicos que tienen al menos una modificación estructural o química y/o que tiene complementariedad de secuencia con un gen diana, por ejemplo, uno o más ARNsg, se administra al sujeto usando los procedimientos de administración descritos en esta invención. El ácido nucleico se proporciona en una cantidad y en otras condiciones tales que el ácido nucleico se localiza en una célula del sujeto y (1) el polipéptido recombinante se traduce en la célula a partir del ácido nucleico y/o (2) el o los ARNsg se unen a secuencias complementarias dentro de los genes diana. La célula en la que se localiza un ácido nucleico de la divulgación, o el tejido en el que está presente la célula, puede ser alcanzada con una o más rondas de administración de ácido nucleico.

Un polinucleótido, una construcción primaria o un ARNmm administrados pueden dirigir la producción de uno o más polipéptidos recombinantes y/o ARN regulador, por ejemplo, ARNsg, que proporciona una actividad funcional que está sustancialmente ausente en la célula, tejido u organismo en el que el polipéptido recombinante es traducido, por ejemplo, una actividad de edición de genes. Un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm administrados puede dirigir la producción de uno o más polipéptidos recombinantes y/o ARN regulador, por ejemplo, ARNsg, implicado en la edición de genes, y se administra en combinación con un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm que dirige la producción de uno o más polipéptidos recombinantes adicionales que tienen utilidad terapéutica, por ejemplo, proporcionando una actividad funcional que está sustancialmente ausente en la célula, tejido u organismo en el que se traduce el polipéptido recombinante. Por ejemplo, la actividad funcional faltante puede ser de naturaleza enzimática, estructural o reguladora de genes. El polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm administrados pueden dirigir la producción de uno o más polipéptidos recombinantes que aumentan (por ejemplo, sinérgicamente) una actividad funcional que está presente, pero sustancialmente deficiente en la célula en la que se traduce el polipéptido recombinante.

El polinucleótido, la construcción primaria o el ARNmm administrados pueden dirigir la producción de uno o más polipéptidos recombinantes que reemplazan un polipéptido (o múltiples polipéptidos) que está sustancialmente ausente en la célula en la que se traduce el polipéptido recombinante. Tal ausencia puede deberse a una mutación genética del gen codificante o vía reguladora del mismo. El polipéptido recombinante puede aumentar el nivel de una proteína endógena en la célula hasta un nivel deseable; tal aumento puede llevar el nivel de la proteína endógena de un nivel subnormal a un nivel normal o de un nivel normal a un nivel supernormal.

Alternativamente, el polipéptido recombinante funciona para antagonizar la actividad de una proteína endógena presente en, sobre la superficie o secretada de la célula. Normalmente, la actividad de la proteína endógena es perjudicial para el sujeto; por ejemplo, debido a la mutación de la proteína endógena que da como resultado una actividad o localización alterada. Además, el polipéptido recombinante antagoniza, directa o indirectamente, la actividad de un resto biológico presente en, sobre la superficie o secretado de la célula. Ejemplos de restos biológicos antagonizados incluyen lípidos (p. ej., colesterol), una lipoproteína (p. ej., lipoproteína de baja densidad), un ácido nucleico, un carbohidrato, un metabolito (p. ej., bilirrubina), una toxina proteica como las toxinas shiga y tétanos, o una pequeña toxina molecular como las toxinas botulínica, cólera y diftérica. Además, la molécula biológica antagonizada puede ser una proteína endógena que exhibe una actividad indeseable, tal como una actividad citotóxica o citostática. Sin estar ligado en teoría, se propone que el procedimiento de edición de genes CRISPR puede revertir los síntomas de la enfermedad in vivo.Como tal, esta metodología tiene potencial para tratar muchos trastornos genéticos.

En ciertos casos, un ARNmm que codifica un polipéptido o proteína relacionado con CRISPR se administra en combinación con uno o más ARNsg, opcionalmente en combinación con una plantilla de ADN corregido. La plantilla de ADN incluye una secuencia correcta correspondiente a un gen mutado asociado con una enfermedad. Las plantillas de ADN ejemplares corresponden a genes causantes de enfermedades de mutación única. Una célula en la que se introducen los componentes necesarios repara el gen dañado utilizando la proteína relacionada con CRISPEr . Al hacerlo, copia de la plantilla, introduciendo nuevo material genético en el genoma.

Los datos presentados en esta invención demuestran la administración hepática efectiva de los componentes de la divulgación. Como tal, la metodología descrita en esta invención es particularmente adecuada para el tratamiento de enfermedades metabólicas, por ejemplo, enfermedad metabólica causada por errores genéticos innatos, .p.ej., enfermedades relacionadas con la deficiencia de ornitina transcarbamilasa Los procedimientos de la divulgación también pueden servir para atenuar la progresión de la enfermedad. También se propone que la administración intramuscular, por ejemplo, a través de una inyección muscular múltiple, puede servir para tratar enfermedades musculares, por ejemplo, la distrofia muscular, mediante la inclusión de plantillas de ADN corregido apropiadas. En otros casos más, se prevén estrategias ex vivo que implican, por ejemplo, la administración de agentes a células hematopoyéticas ex vivo (p,ej,, mediante electroporación), seguida opcionalmente de la selección de células que expresan los componentes adecuados, seguida de la administración de células tratadas, donde posteriormente puede producirse la recolonización.

Las proteínas recombinantes, los ARNmm que codifican las mismas y/o los ARNsg, descritos en esta invención, pueden diseñarse para la localización dentro de la célula, potencialmente dentro de un compartimento específico como el núcleo, o para la secreción de la célula o la translocación a la membrana plasmática de la célula. En aspectos ejemplares, las proteínas recombinantes, los ARNmm que codifican las mismas y/o los ARNsg, se diseñan para la localización nuclear.

Otros aspectos de la presente divulgación se refieren al trasplante de células que contienen polinucleótido, construcción primaria o ARNmm a un sujeto mamífero. La administración de células a mamíferos es conocida por los expertos en la técnica e incluye, pero no se limita a, implantación local (por ejemplo, administración tópica o subcutánea), administración de órganos o inyección sistémica (por ejemplo, inyección intravenosa o inhalación) y la formulación de células en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones que contienen polinucleótido, construcción primaria o ARNmm pueden formularse para la administración intramuscular, transarterial, intraperitoneal, intravenosa, intranasal, subcutánea, endoscópica, transdérmica o intratecal. La composición se puede formular para una liberación prolongada.

El sujeto al que se le puede administrar el agente terapéutico padece o puede tener riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección deletérea. Se proporcionan procedimientos para identificar, diagnosticar y clasificar sujetos sobre estas bases, que pueden incluir diagnóstico clínico, niveles de biomarcadores, estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) y otros procedimientos conocidos en la técnica.

VII. Kits y dispositivos

La divulgación proporciona una variedad de kits para llevar a cabo de manera conveniente y/o efectiva los procedimientos de la presente divulgación. Normalmente, los kits comprenderán cantidades y/o números suficientes de componentes para permitir que un usuario realice múltiples tratamientos de un o varios sujetos y/o realice múltiples experimentos, y contacte células y/o una población de células al menos una vez.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona kits que comprenden las moléculas (polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm) de la divulgación. En un aspecto, el kit comprende uno o más anticuerpos funcionales o fragmentos funcionales de los mismos.

Los kits y dispositivos útiles en combinación con los polinucleótidos, construcciones primarias o ARNmm de la divulgación incluyen los descritos en la solicitud de patente provisional de EE. UU. pendiente de tramitación n.° 61/737.130 depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151666 reivindica prioridad. VIII. Definiciones

En varios lugares de la presente memoria descriptiva, los sustituyentes de los compuestos de la presente divulgación se describen en grupos o en intervalos. Se pretende específicamente que la presente divulgación incluya todas y cada una de las subcombinaciones individuales de los miembros de dichos grupos e intervalos. Por ejemplo, el término "alquilo C^1-6 " está destinado específicamente a describir individualmente metilo, etilo, alquilo C³ , alquilo C⁴ , alquilo C⁵ , y alquilo C6.

Alrededor de: Tal como se emplea en esta invención, el término “alrededor de” significa ± 10 % del valor mencionado. Administrado en combinación: Tal como se usa en esta invención, el término "administrado en combinación" o "administración combinada" significa que dos o más agentes se administran a un sujeto al mismo tiempo o dentro de un intervalo tal que puede haber una superposición de un efecto de cada agente en el paciente. En algunos casos, se administran con aproximadamente 60, 30, 15, 10, 5 o 1 minuto entre sí. En algunos casos, las administraciones de los agentes se espacian lo suficientemente cerca unas de otras para que se logre un efecto combinatorio (por ejemplo, sinérgico).

Animal: Tal como se usa en esta invención, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunos casos, "animal" se refiere a seres humanos en cualquier etapa de desarrollo. En algunos casos, "animal" se refiere a animales no-humanos en cualquier etapa de desarrollo. En ciertos casos, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, un ganado vacuno, un primate o un cerdo). En algunos casos, los animales incluyen, entre otros, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y gusanos. En algunos casos, el animal es un animal transgénico, un animal modificado genéticamente o un clon.

Aproximadamente: Tal como se usa en esta invención, la expresión “aproximadamente” o “alrededor de”, según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En determinados casos, la expresión “aproximadamente” o “alrededor de” se refiere a un intervalo de valores que se encuentra dentro del 25, el 20, el 19, el 18, el 17, el 16, el 15, el 14, el 13, el 12, el 11, el 10, el 9, el 8, el 7, el 6, el 5, el 4, el 3, el 2, el 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado, a menos que se indique lo contrario, o resulte evidente lo contrario a partir del contexto (salvo que dicho número supere el 100 % de un valor posible).

Asociado con: Tal como se usa en esta invención, los términos "asociado con", "conjugado", "enlazado", "unido" y "anclado", cuando se usan con respecto a dos o más restos, significa que los restos están físicamente asociados o conectados entre sí, ya sea directamente o mediante uno o más restos adicionales que sirven como agente de enlace, para formar una estructura que sea suficientemente estable de modo que los restos permanezcan físicamente asociados en las condiciones en las que se usa la estructura, por ejemplo, condiciones fisiológicas. Una "asociación" no tiene por qué ser estrictamente mediante un enlace químico covalente directo. También puede sugerir enlaces iónicos o de hidrógeno o una conectividad basada en hibridación suficientemente estable de modo que las entidades "asociadas" permanezcan físicamente asociadas.

Bifuncional: Tal como se usa en esta invención, el término "bifuncional" se refiere a cualquier sustancia, molécula o resto que sea capaz de o mantenga al menos dos funciones. Las funciones pueden afectar el mismo resultado o un resultado diferente. La estructura que produce la función puede ser la misma o diferente. Por ejemplo, los ARN modificados bifuncionales de la presente divulgación pueden codificar un péptido citotóxico (una primera función) mientras que los nucleósidos que comprenden el ARN codificante son, en y por sí mismos, citotóxicos (segunda función). En este ejemplo, la entrega del ARN modificado bifuncional a una célula cancerosa produciría no solo un péptido o molécula de proteína que podría mejorar o tratar el cáncer, sino que también entregaría una carga citotóxica de nucleósidos a la célula en caso de degradación, en lugar de traducción del ARN modificado.

Biocompatible: Tal como se usa en esta invención, el término "biocompatible" significa compatible con células, tejidos, órganos o sistemas vivos que presentan poco o ningún riesgo de lesión, toxicidad o rechazo por parte del sistema inmunológico.

Biodegradable: Tal como se usa en esta invención, el término "biodegradable" significa que puede descomponerse en productos inocuos por la acción de seres vivos.

Biológicamente activo: Tal como se usa en esta invención, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier sustancia que tenga actividad en un sistema y/u organismo biológico. Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera biológicamente activa. En casos particulares, un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm de la presente divulgación puede considerarse biológicamente activo si incluso una porción del polinucleótido, construcción primaria o ARNmm es biológicamente activo o imita una actividad considerada biológicamente relevante.

Células madre cancerosas: Tal como se usa en esta invención, las "células madre cancerosas" son células que pueden experimentar autorrenovación y/o proliferación y diferenciación anormales para formar un tumor.

Términos químicos: los términos químicos que no se definen de otra manera en esta invención, se ajustarán a las definiciones de términos químicos proporcionados en la solicitud de patente provisional de EE. UU. pendiente de tramitación n.° 61/ /3 /, 130 depositada el 14 de diciembre de 2012, de la cual la solicitud publicada WO/2013/151666 reivindica prioridad.

El término "diastereoisómero", como se usa en esta invención, significa estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí y no se pueden superponer entre sí.

El término "cantidad efectiva" de un agente, como se usa en esta invención, es la cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, por ejemplo, resultados clínicos y, como tal, una "cantidad efectiva" depende del contexto en el que se está aplicando. Por ejemplo, en el contexto de la administración de un agente que trata el cáncer, una cantidad efectiva de un agente es, por ejemplo, una cantidad suficiente para lograr el tratamiento, como se define en esta invención, del cáncer, en comparación con la respuesta obtenida sin la administración del agente.

El término "enantiómero", como se usa en esta invención, significa cada forma ópticamente activa individual de un compuesto de la divulgación, que tiene una pureza óptica o exceso enantiomérico (según se determina mediante procedimientos estándar en la técnica) de al menos 80 % (es decir, al menos 90 % de un enantiómero y como máximo 10 % del otro enantiómero), preferiblemente al menos 90 % y más preferiblemente al menos 98 %.

El término "isómero", como se usa en esta invención, significa cualquier tautómero, estereoisómero, enantiómero o diastereómero de cualquier compuesto de la divulgación. Se reconoce que los compuestos de la divulgación pueden tener uno o más centros quirales y/o dobles enlaces y, por lo tanto, existen como estereoisómeros, tales como isómeros de doble enlace (es decir, isómeros geométricos E/Z) o diastereómeros (p. ej., enantiómeros (es decir, (+) o (-)) o isómeros cis/trans). Según la divulgación, las estructuras químicas representadas en esta invención, y por lo tanto los compuestos de la divulgación, abarcan todos los estereoisómeros correspondientes, es decir, tanto la forma estereoméricamente pura (por ejemplo, geométricamente pura, enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) como enantiomérica y mezclas estereoisoméricas, por ejemplo, racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas de compuestos de la divulgación pueden resolverse típicamente en sus componentes enantiómeros o estereoisómeros mediante procedimienrtos bien conocidos, tales como cromatografía de gases en fase quiral, cromatografía líquida de alta resolución en fase quiral, cristalización del compuesto como un complejo de sal quiral, o cristalizar el compuesto en un disolvente quiral. Los enantiómeros y estereoisómeros también se pueden obtener a partir de intermedios, reactivos y catalizadores estereomérica o enantioméricamente puros mediante procedimientos sintéticos asimétricos bien conocidos.

El término "estereoisómero", como se usa en esta invención, se refiere a todas las posibles formas isoméricas y conformacionales diferentes que puede poseer un compuesto (por ejemplo, un compuesto de cualquier fórmula descrita en esta invención), en particular todas las formas estereoquímicas y conformacionalmente isoméricas posibles, todos los diastereómeros, enantiómeros y/o confórmeros de estructura molecular básica. Algunos compuestos de la presente divulgación pueden existir en diferentes formas tautoméricas, todas las últimas incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Compuesto: Tal como se usa en esta invención, el término "compuesto" pretende incluir todos los estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros e isótopos de las estructuras representadas.

Los compuestos descritos en esta invención pueden ser asimétricos (por ejemplo, tener uno o más estereocentros). Todos los estereoisómeros, tales como enantiómeros y diastereómeros, están destinados a menos que se indique lo contrario. Los compuestos de la presente divulgación que contienen átomos de carbono sustituidos asimétricamente pueden aislarse en formas ópticamente activas o racémicas. Se conocen en la técnica procedimientos sobre cómo preparar formas ópticamente activas a partir de materiales de partida ópticamente activos, tales como por resolución de mezclas racémicas o por síntesis estereoselectiva. Muchos isómeros geométricos de olefinas, dobles enlaces C=N y similares también pueden estar presentes en los compuestos descritos en esta invención, y todos estos isómeros estables se contemplan en la presente descripción. Los isómeros geométricos cis y trans de los compuestos de la presente divulgación se describen y pueden aislarse como una mezcla de isómeros o como formas isoméricas separadas.

Los compuestos de la presente divulgación también incluyen formas tautoméricas. Las formas tautoméricas resultan del intercambio de un enlace simple con un enlace doble adyacente y la migración concomitante de un protón. Las formas tautoméricas incluyen tautómeros prototrópicos que son estados de protonación isoméricos que tienen la misma fórmula empírica y carga total. Ejemplos de tautómeros prototrópicos incluyen pares cetona-enol, pares amidaácido imídico, pares lactama-lactima, pares amida-ácido imídico, pares enamina-imina y formas anulares donde un protón puede ocupar dos o más posiciones de un sistema heterocíclico, como, 1H- y 3H-imidazol, 1H-, 2H- y 4H- 1,2,4-triazol, 1H- y 2H- isoindol y 1H- y 2H-pirazol. Las formas tautoméricas pueden estar en equilibrio o bloqueadas estéricamente en una forma mediante una sustitución apropiada.

Los compuestos de la presente divulgación también incluyen todos los isótopos de los átomos que se encuentran en los compuestos intermedios o finales. "Isótopos" se refiere a átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa resultantes de un número diferente de neutrones en los núcleos. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio.

Los compuestos y sales de la presente divulgación se pueden preparar en combinación con moléculas de agua o disolvente para formar solvatos e hidratos mediante procedimientos rutinarios.

Comprometido: Tal como se usa en esta invención, el término "comprometido" significa, cuando se hace referencia a una célula, cuando la célula está lo suficientemente lejos en la ruta de diferenciación donde, en circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipo de célula. en lugar de en un tipo de célula diferente o revertir a un tipo de célula menos diferenciado.

Conservado: Tal como se usa en esta invención, el término "conservado" se refiere a nucleótidos o residuos de aminoácidos de una secuencia de polinucleótidos o secuencia de polipéptidos, respectivamente, que son los que se producen inalterados en la misma posición de dos o más secuencias que se comparan. Los nucleótidos o aminoácidos que están relativamente conservados son aquellos que se conservan entre más secuencias relacionadas que los nucleótidos o aminoácidos que aparecen en otras partes de las secuencias.

En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "completamente conservadas" si son 100 % idénticas entre sí. En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son al menos un 70 % idénticas, al menos un 80 % idénticas, al menos un 90 % idénticas o al menos un 95 % idénticas entre sí. En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son aproximadamente un 70 % idénticas, aproximadamente un 80 % idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % idénticas entre sí. . En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son al menos un 30 % idénticas, al menos un 40 % idénticas, al menos un 50 % idénticas, al menos un 60 % idénticas, al menos un 70 % idénticas, al menos 80 % idénticas, al menos 90 % idénticas o al menos 95 % idénticas entre sí. En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son aproximadamente un 30 % idénticas, aproximadamente un 40 % idénticas, aproximadamente un 50 % idénticas, aproximadamente un 60 % idénticas, aproximadamente un 70 % idénticas, aproximadamente un 80 % idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95 % idénticas, aproximadamente un 98 % idénticas o aproximadamente un 99 % idénticas entre sí. La conservación de la secuencia puede aplicarse a la longitud completa de un oligonucleótido o polipéptido o puede aplicarse a una porción, región o característica del mismo.

Liberación controlada: Tal como se usa en esta invención, “liberación controlada” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se conforma a un patrón particular de liberación para efectuar un resultado terapéutico.

Cíclico o ciclado: Tal como se usa en esta invención, el término "cíclico" se refiere a la presencia de un bucle continuo. Las moléculas cíclicas no necesitan ser circulares, solo unidas para formar una cadena ininterrumpida de subconjuntos. Las moléculas cíclicas tales como el ARN o ARNm modificado por ingeniería genética de la presente divulgación pueden ser conjuntos únicos o multímeros o comprender uno o más componentes de una estructura compleja o de orden superior.

Citostático: Tal como se usa en esta invención, "citostático" se refiere a inhibir, reducir, suprimir el crecimiento, la división o la multiplicación de una célula (p.ej., una célula de mamífero (p.ej., una célula humana)), bacteria, virus, hongo, protozoo, parásito, prión, o una combinación de los mismos.

Citotóxico: Tal como se usa en esta invención, "citotóxico" se refiere a matar o causar un efecto nocivo, tóxico o mortal en una célula (p.ej., una célula de mamífero (p.ej., una célula humana)), bacteria, virus, hongo, protozoo, parásito, prión, o una combinación de los mismos.

Entrega: Tal como se usa en esta invención, "entrega" se refiere al acto o la manera de entregar un compuesto, sustancia, entidad, fracción, carga o carga útil.

Agente de entrega: Tal como se usa en esta invención, "agente de entrega" se refiere a cualquier sustancia que facilite, al menos en parte, la administración in vivo de un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm a células diana. Desestabilizado: Tal como se usa en esta invención, el término "inestable", "desestabilizar" o "región desestabilizadora" significa una región o molécula que es menos estable que una forma inicial, de tipo silvestre o nativa de la misma región o molécula.

Etiqueta detectable: Tal como se usa en esta invención, "etiqueta detectable" se refiere a uno o más marcadores, señales o restos que están unidos, incorporados o asociados con otra entidad que se detecta fácilmente mediante procedimientos conocidos en la técnica que incluyen radiografía, fluorescencia, quimioluminiscencia, actividad enzimática, absorbancia y similares. Etiquetas detectables incluyen radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, enzimas, colorantes, iones metálicos, ligandos tales como biotina, avidina, estreptavidina y haptenos, puntos cuánticos y similares. Etiquetas detectables se pueden ubicar en cualquier posición en los péptidos o proteínas descritos en esta invención. Pueden estar dentro de los aminoácidos, péptidos o proteínas, o localizados en los extremos N- o C-. Potencial de desarrollo: Tal como se usa en esta invención, "potencial de desarrollo" o "potencia de desarrollo" se refiere al total de todos los destinos o tipos de células de desarrollo que puede lograr una célula tras la diferenciación. Factor de alteración del potencial de desarrollo: Tal como se usa en esta invención, "factor de alteración del potencial de desarrollo" se refiere a una proteína o ARN que puede alterar el potencial de desarrollo de una célula.

Digerir: Tal como se usa en esta invención, el término "digerir" significa romper en piezas o componentes más pequeños. Cuando se hace referencia a polipéptidos o proteínas, la digestión da como resultado la producción de péptidos.

Célula diferenciada: Tal como se usa en esta invención, el término "célula diferenciada" se refiere a cualquier célula somática que no es, en su forma nativa, pluripotente. La célula diferenciada también incluye células que están parcialmente diferenciadas.

Diferenciación: Tal como se usa en esta invención, el término "factor de diferenciación" se refiere a un factor de alteración del potencial de desarrollo tal como una proteína, ARN o molécula pequeña que puede inducir a una célula a diferenciarse a un tipo celular deseado.

Diferenciar: Tal como se usa en esta invención, "diferenciar" se refiere al procedimiento en el que una célula no comprometida o menos comprometida adquiere las características de una célula comprometida.

Enfermedad: Tal como se usa en esta invención, el término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta al cuerpo de un organismo que a menudo muestra síntomas corporales específicos.

Trastorno: Tal como se usa en esta invención, el término "trastorno" se refiere a una interrupción o una interferencia con las funciones normales o los sistemas establecidos del cuerpo.

Distal: Tal como se usa en esta invención, el término "distal" significa situado lejos del centro o lejos de un punto o región de interés.

Factor de división de dosis (DSF - Dose splitting factor) - relación de la PUD del tratamiento de división de dosis dividida por la PUD de la dosis diaria total o la dosis unitaria única. El valor se deriva de la comparación de los grupos de regímenes de dosificación.

Célula madre embrionaria: Tal como se usa en esta invención, el término "célula madre embrionaria" se refiere a células madre pluripotentes de origen natural de la masa celular interna del blastocisto embrionario.:

Encapsular: Tal como se usa en esta invención, el término "encapsular" significa envolver, encerrar o rodear.

Señal de escisión de proteína codificada: Tal como se usa en esta invención, "señal de escisión de proteína codificada" se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica una señal de escisión de proteína.

Ingeniería: Tal como se usa en esta invención, los polinucleótidos se "someten a ingeniería" cuando son diseñados para tener una característica o propiedad, ya sea estructural o química, que varía desde un punto de partida, una molécula silvestre o una molécula nativa.

Exosoma: Tal como se usa en esta invención, "exosoma" es una vesícula secretada por células de mamífero o un complejo involucrado en la degradación del ARN.

Expresión: Tal como se usa en esta invención, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los eventos siguientes: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (p.ej., mediante transcripción); (2) procesamiento de una transcripción de ARN (p.ej., mediante corte, edición, formación de extremo 5' y/o procesamiento de extremo 3'); (3) traducción de un ARN a un polipéptido o proteína; y (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.

Rasgo: Tal como se usa en esta invención, una "rasgo" se refiere a una característica, una propiedad o un elemento distintivo.

Formulación: Tal como se usa en esta invención, una "formulación" incluye al menos un polinucleótido, construcción primaria o ARNmm y un agente de administración.

Fragmento: Un "fragmento", como se usa en esta invención, se refiere a una porción. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos al digerir proteínas de longitud completa aisladas de células cultivadas.

Funcional: Tal como se usa en esta invención, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma en la que exhibe una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.

Homología: Tal como se usa en esta invención, el término "homología" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, p.ej. entre moléculas de ácido nucleico (p.ej. Moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. En algunos casos, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si sus secuencias son al menos 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % idénticos o similares. El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos). De acuerdo con la divulgación, dos secuencias de polinucleótidos se consideran homólogas si los polipéptidos que codifican son al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso 99 % durante al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos. En algunos casos, las secuencias de polinucleótidos homólogas se caracterizan por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. Para secuencias de polinucleótidos de menos de 60 nucleótidos de longitud, la homología se determina por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. De acuerdo con la divulgación, dos secuencias de proteínas se consideran homólogas si las proteínas son al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % idénticas durante al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos.

Identidad: Tal como se usa en esta invención, el término "identidad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, p.ej., entre moléculas de oligonucleótidos (p.ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido de polinucleótidos se puede efectuar, por ejemplo, alineando las dos secuencias para una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico para una alineación óptima, y se pueden ignorar las secuencias no idénticas a los efectos de la comparación). En ciertos casos, la extensión de una secuencia alineada a efectos comparativos es de al menos el 30, al menos el 40, al menos el 50, al menos el 60, al menos el 70, al menos el 80, al menos el 90, al menos el 95 o el 100 % de la extensión de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, a continuación, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta la cantidad de espacios y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede obtener usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando procedimientos tales como los que se describen en el documento Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., Ed., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., Ed., M Stockton Press, Nueva York, 1991. Por ejemplo, es posible determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) mediante el uso de una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse, de manera alternativa, usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP. Los procedimientos comúnmente empleados para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias incluyen, entre otros, aquellos descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Las técnicas para determinar la identidad se codifican en programas informáticos disponibles al público. Software informático ejemplar para determinar la homología entre dos secuencias incluyen, entre otros, el paquete de programa GCG, Devereux y col, Nucleic Acids Research, 12(1), 387( 1984, BLASTP, BLASTN, y FASTA, Altschul, S. F. y col., J. Molec. Biol, 215, 403 (1990)).

Inhibir la expresión de un gen: Tal como se usa en esta invención, la frase "inhibir la expresión de un gen" significa provocar una reducción en la cantidad de un producto de expresión del gen. El producto de expresión puede ser un ARN transcrito del gen (por ejemplo, un ARNm) o un polipéptido traducido de un ARNm transcrito del gen. Normalmente, una reducción en el nivel de un ARNm da como resultado una reducción en el nivel de un polipéptido traducido del mismo. El nivel de expresión se puede determinar usando técnicas estándar para medir ARNm o proteína. In vitro: Tal como se usa en esta invención, el término "in vitro" se refiere a eventos que se producen en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en un cultivo celular, en una placa de Petri, etc., en lugar de dentro de un organismo (p.ej., animal, planta, o microbio).

In vivo: Tal como se usa en esta invención, el término "in vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta o microbio o célula o tejido del mismo).

Aislado: Tal como se usa en esta invención, el término "aislado" hace referencia a una sustancia o entidad que ha sido separada de al menos algunos de los componentes con los cuales estuvo asociada (ya sea naturalmente o en condiciones experimentales). Las sustancias aisladas pueden tener niveles variables de pureza en referencia a las sustancias desde las cuales han sido asociadas. Sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de al menos alrededor del 10, alrededor del 20, alrededor del 30, alrededor del 40, alrededor del 50, alrededor del 60, alrededor del 70, alrededor del 80, alrededor del 90 % o más de otros componentes a los cuales estuvieron inicialmente asociadas. En algunas realizaciones, los agentes aislados son más de alrededor del 80, alrededor del 85, alrededor del 90, alrededor del 91, alrededor del 92, alrededor del 93, alrededor del 94, alrededor del 95, alrededor del 96, alrededor del 97, alrededor del 98, alrededor del 99 % o más de alrededor del 99 % puros. Tal como se usa en esta invención, una sustancia es "pura” si se encuentra sustancialmente libre de otros componentes.

Sustancialmente aislado: por "sustancialmente aislado" se entiende que el compuesto está sustancialmente separado del entorno en el que se formó o detectó. La separación parcial puede incluir, por ejemplo, una composición enriquecida en el compuesto de la presente divulgación. La separación sustancial puede incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 % o al menos aproximadamente el 99 % en peso del compuesto de la presente divulgación, o una sal del mismo. Los procedimientos para aislar compuestos y sus sales son habituales en la técnica.

Enlazador: Tal como se usa en esta invención, un enlazador se refiere a un grupo de átomos, por ejemplo, 10-1.000 átomos, y puede estar comprendido por átomos o grupos tales como, pero no limitado a, carbono, amino, alquilamino, oxígeno, azufre, sulfóxido, sulfonilo, carbonilo e imina. El enlazador se puede unir a un nucleósido o nucleótido modificado en la nucleobase o resto de azúcar en un primer extremo, y a una carga útil, por ejemplo, un agente detectable o terapéutico, en un segundo extremo. El enlazador puede tener una longitud suficiente para no interferir con la incorporación en una secuencia de ácido nucleico. El enlazador puede usarse para cualquier propósito útil, como para formar multímeros de ARNmm (por ejemplo, mediante la unión de dos o más polinucleótidos, construcciones primarias o moléculas de ARNmm) o conjugados de ARNmm, así como para administrar una carga útil, como se describe en esta invención . Los ejemplos de grupos químicos que se pueden incorporar en el enlazador incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, amido, amino, éter, tioéter, éster, alquileno, heteroalquileno, arilo o heterociclilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido, como se describe en esta invención. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero no se limitan a, alcanos insaturados, polietilenglicoles (por ejemplo, conjuntos monoméricos de etileno o propilenglicol, por ejemplo, dietilenglicol, dipropilenglicol, trietilenglicol, tripropilenglicol, tetraetilenglicol o tetraetilenglicol) y polímeros de dextrano. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, restos escindibles dentro del enlazador, tales como, por ejemplo, un enlace disulfuro (-S-S-) o un enlace azo (-N= N-), que se puede escindir usando un agente reductor o fotólisis. Los ejemplos no limitantes de un enlace selectivamente escindible incluyen un enlace amido que se puede escindir, por ejemplo, mediante el uso de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) u otros agentes reductores, y/o fotólisis, así como un enlace éster puede ser escindido, por ejemplo, mediante hidrólisis ácida o básica.

Sitio de unión de microARN: Tal como se usa en esta invención, un sitio de unión de microARN (miARN) representa una ubicación o región de nucleótidos de una transcripción de ácido nucleico a la que se une al menos la región "semilla" de un miARN.

Modificado: Tal como se usa en esta invención, "modificado" se refiere a un estado o estructura cambiada de una molécula de la invención. Las moléculas pueden modificarse de muchas maneras, incluso química, estructural y funcionalmente. Las moléculas de ARNm de la presente divulgación pueden modificarse mediante la introducción de nucleósidos y/o nucleótidos no naturales, por ejemplo, en lo que se refiere a los ribonucleótidos naturales A, U, G y C. Los nucleótidos no canónicos tales como las estructuras de capa no son considerados "modificados" aunque difieren de la estructura química de los ribonucleótidos A, C, G, U.

Moco: Tal como se usa en esta invención, "moco" se refiere a la sustancia natural que es viscosa y comprende glicoproteínas de mucina.

Multipotente: Tal como se usa en esta invención, "célula multipotente" o "célula parcialmente diferenciada" cuando se hace referencia a una célula se refiere a una célula que tiene un potencial de desarrollo para diferenciarse en células de una o más capas germinales, pero no todas las tres capas germinales.

De origen natural: Tal como se usa en esta invención, "de origen natural" significa que existe en la naturaleza sin ayuda artificial..

Vertebrado no humano: Tal como se usa en esta invención, un "vertebrado no humano" incluye todos los vertebrados excepto el Homo sapiens, incluidas las especies silvestres y domesticadas. Ejemplos de vertebrados no humanos incluyen, entre otros, mamíferos, como alpaca, banteng, bisonte, camello, gato, ganado, venado, perro, burro, gayal, cabra, cobaya, caballo, llama, mula, cerdo, conejo, reno, búfalo de agua, oveja y yak.

Fuera de diana: Tal como se usa en esta invención, "fuera del diana" se refiere a cualquier efecto no intencionado sobre una o más dianas, genes o transcripciones celulares.

Oligopotente: Tal como se usa en esta invención, "oligopotente" cuando se hace referencia a una célula significa dar lugar a un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes.

Marco de lectura abierto: Tal como se usa en esta invención, "marco de lectura abierto" u "ORF (Open reading frame)" se refiere a una secuencia que no contiene un codón de parada en un marco de lectura dado.

Unido operativamente: Tal como se usa en esta invención, la frase "unido operativamente" se refiere a una conexión funcional entre dos o más moléculas, construcciones, transcripciones, entidades, restos o similares.

Opcionalmente sustituido: En esta invención, una frase de la forma "X opcionalmente sustituido" (por ejemplo, alquilo opcionalmente sustituido) pretende ser equivalente a "X, donde X está opcionalmente sustituido" (por ejemplo, "alquilo, donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido"). No se pretende que signifique que la característica "X" (p.ej. alquilo) per se sea opcional.

Péptido: Tal como se usa en esta invención, "péptido" tiene una longitud menor o igual a 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud.

Paratopo: Tal como se usa en esta invención, un "paratopo" se refiere al sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Paciente: Tal como se usa en esta invención, "paciente" se refiere a un sujeto que puede buscar o necesitar tratamiento, que requiere tratamiento, está recibiendo tratamiento, recibirá tratamiento o un sujeto que está bajo el cuidado de un profesional capacitado para una enfermedad o afección particular.

Farmacéuticamente aceptable: La frase “farmacéuticamente aceptable” se emplea en esta invención para referirse a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance de un criterio médico sensato, son adecuados para su uso en contacto con tejidos humanos y animales sin provocar una toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, con una relación beneficio/riesgo correspondiente razonable.

Excipiente farmacéuticamente aceptable: La frase "excipiente farmacéuticamente aceptable", como se usa en esta invención, se refiere a cualquier ingrediente distinto de los compuestos descritos en esta invención (por ejemplo, un vehículo capaz de suspender o disolver el compuesto activo) y que tiene las propiedades de ser sustancialmente no tóxico y no inflamatorio en un paciente. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, auxiliares de compresión, desintegrantes, colorantes (colores), emolientes, emulsionantes, rellenos (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, saborizantes, fragancias, deslizantes (potenciadores de flujo), lubricantes, conservantes, impresión. tintas, sorbentes, agentes de suspensión o dispersantes, edulcorantes y aguas de hidratación. Excipientes ejemplares incluyen, entre otros: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), estearato de calcio, croscarmelosa, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metilparabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, goma laca, dióxido de silicio, carboximetilcelulosa sódica, citrato de sodio, glicolato de almidón de sodio, sorbitol, almidón (de maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.

Sales farmacéuticamente aceptables: La presente divulgación también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en esta invención. Tal como se usa en esta invención, "sales farmacéuticamente aceptables" hace referencia a derivados de los compuestos descritos donde se modifica el compuesto principal al convertir un resto básico o ácido existente en su forma de sal (por ejemplo, haciendo reaccionar el grupo de base libre con un ácido orgánico adecuado). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales de adición ácida representativas incluyen sales de acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroxibromuro, hidroxicloruro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, sulfato de laurilo, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2­ naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalinotérreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como también cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos, incluyendo, entre otros, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente descripción incluyen las sales no tóxicas convencionales del compuesto precursor formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente descripción se pueden sintetizar a partir del compuesto principal que contiene un resto ácido o básico mediante procedimientos químicos convencionales. Generalmente, dichas sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con la base o ácido adecuados en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se prefieren los medios no acuosos, tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, pág. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl y C.G. Wermuth (ed.), Wiley-VCH, 2008, y Berge y col., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977).

Farmacocinética: Tal como se usa en esta invención, "farmacocinética" se refiere a una o más propiedades de una molécula o compuesto en lo que se refiere a la determinación del destino de las sustancias administradas a un organismo vivo. La farmacocinética se divide en varias áreas que incluyen el grado y la velocidad de absorción, distribución, metabolismo y excreción. Esto se conoce comúnmente como ADME donde: (A) Absorción es el procedimiento de una sustancia que ingresa a la circulación sanguínea; (D) Distribución es la dispersión o diseminación de sustancias por los fluidos y tejidos del cuerpo; (M) Metabolismo (o biotransformación) es la transformación irreversible de compuestos parentales en metabolitos hijos; y (E) Excreción (o eliminación) se refiere a la eliminación de las sustancias del cuerpo. En casos raros, algunos fármacos se acumulan irreversiblemente en el tejido corporal.

Solvato farmacéuticamente aceptable: El término "solvato farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en esta invención, significa un compuesto de la divulgación donde se incorporan moléculas de un disolvente adecuado en la red cristalina.: Un disolvente adecuado es fisiológicamente tolerable a la dosis administrada. Por ejemplo, los solvatos se pueden preparar mediante cristalización, recristalización o precipitación a partir de una solución que incluye disolventes orgánicos, agua o una mezcla de los mismos. Ejemplos de disolventes adecuados son etanol, agua (por ejemplo, mono, di y trihidratos), /V-metilpirrolidinona (NMP), dimetil sulfóxido (DMSO), W,W-dimetilformamida (DMF), W,W-dimetilacetamida (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1 h )-pirimidinona (DMPU), acetonitrilo (ACN), propilenglicol, acetato de etilo, alcohol bencílico, 2-pirrolidona, benzoato de bencilo, y similares. Cuando el agua es el disolvente, el solvato se denomina "hidrato".

Fisicoquímica: Tal como se usa en esta invención, "fisicoquímica" significa o se relaciona con una propiedad física y/o química.:

Pluripotente: Como se usa en esta invención, "pluripotente" se refiere a una célula con el potencial de desarrollo, en diferentes condiciones, para diferenciarse en tipos celulares característicos de las tres capas germinales.

Pluripotencia: Como se usa en esta invención, "pluripotencia" o "estado pluripotente" se refiere al potencial de desarrollo de una célula donde la célula tiene la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinales embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo).

Prevenir: Como se usa en esta invención, el término "prevenir" se refiere a retrasar parcial o completamente la aparición de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones clínicas de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la progresión de una infección, una enfermedad, trastorno y/o afección particular; y/o disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la infección, la enfermedad, trastorno y/o afección.

Profármaco: La presente divulgación también incluye profármacos de los compuestos descritos en esta invención. Como se usa en esta invención, "profármacos" se refiere a cualquier sustancia, molécula o entidad que se encuentra en una forma predicada para que esa sustancia, molécula o entidad actúe como terapéutica tras una alteración química o física. Los profármacos pueden unirse covalentemente o secuestrarse de alguna manera y liberan o se convierten en el resto de fármaco activo antes, durante o después de su administración a un sujeto mamífero. Los profármacos se pueden preparar modificando grupos funcionales presentin vivo, a los compuestos parentales. es en los compuestos de tal manera que las modificaciones se escinden, ya sea en la manipulación rutinaria o in vivo, a los compuestos parentales. Los profármacos incluyen compuestos en los que los grupos hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxilo, amino, sulfhidrilo o carboxilo libre, respectivamente. La preparación y uso de profármacos se discute en T. Higuchi y V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 de A.C.S. Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Proliferar: Como se usa en esta invención, el término "proliferar" significa crecer, expandirse o aumentar o hacer crecer, expandirse o aumentar rápidamente. "Proliferativo" significa tener la capacidad de proliferar. "Antiproliferativo" significa que tiene propiedades contrarias o inapropiadas a las propiedades proliferativas.

Célula progenitora: como se usa en esta invención, el término "célula progenitora" se refiere a células que tienen un mayor potencial de desarrollo en relación con una célula a la que puede dar lugar por diferenciación.

Sitio de escisión de proteínas: Tal como se usa en esta invención, "sitio de escisión de proteínas" se refiere a un sitio donde se puede lograr la escisión controlada de la cadena de aminoácidos por medios químicos, enzimáticos o fotoquímicos.

Señal de escisión de proteínas: Tal como se usa en esta invención, "señal de escisión de proteínas" se refiere a al menos un aminoácido que marca o señala un polipéptido para la escisión.

Proteína de interés: Como se usa en esta invención, los términos "proteínas de interés" o "proteínas deseadas" incluyen los proporcionados en esta invención y fragmentos, mutantes, variantes y alteraciones de los mismos. Proximal: Tal como se usa en esta invención, el término "proximal" significa situado más cerca del centro o a un punto o región de interés.

Purificado: Como se usa en esta invención, "purificar", "purificado", "purificación" significa hacer sustancialmente puro o claro a partir de componentes no deseados, contaminación del material, mezcla o imperfección.

Transfección repetida: Como se usa en esta invención, el término "transfección repetida" se refiere a la transfección del mismo cultivo celular con un polinucleótido, construcción primaria o ARNm una pluralidad de veces. El cultivo celular se puede transfectar al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 11 veces, al menos 12 veces, al menos 13 veces, al menos 14 veces, al menos 15 veces, al menos 16 veces, al menos 17 veces al menos 18 veces, al menos 19 veces, al menos 20 veces, al menos al menos 25 veces, al menos 30 veces, al menos 35 veces, al menos 40 veces, al menos 45 veces, al menos 50 veces o más.

Reprogramación: Como se usa en esta invención, "reprogramación" se refiere a un procedimiento que invierte el potencial de desarrollo de una célula o población de células.

Factor de reprogramación: Como se usa en esta invención, el término "factor de reprogramación" se refiere a un factor de alteración del potencial de desarrollo tal como una proteína, ARN o molécula pequeña, cuya expresión contribuye a la reprogramación de una célula a un estado menos diferenciado o indiferenciado.

Muestra: Como se usa en esta invención, el término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, fluidos corporales, que incluyen, entre otros, sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen). Una muestra puede incluir además un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos, tumores, órganos. Una muestra se refiere además a un medio, como un caldo o gel nutritivo, que puede contener componentes celulares, como proteínas o molécula de ácido nucleico.

Secuencias señal: Como se usa en esta invención, la frase "secuencias señal" se refiere a una secuencia que puede dirigir el transporte o la localización de una proteína.

Dosis unitaria única: Tal como se usa en esta invención, una "dosis unitaria única" es una dosis de cualquier terapéutico administrado en una dosis/en un momento/vía única/punto único de contacto, es decir, evento de administración única.

Similaridad: Tal como se usa en esta invención, el término "similaridad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, p.ej. entre moléculas de polinucleótidos (p.ej. moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí se puede realizar de la misma manera que el cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta las sustituciones conservadoras como se entiende en la técnica.

Célula somática: Tal como se usa en esta invención, "células somáticas" se refiere a cualquier célula que no sea una célula germinal, una célula presente en un embrión preimplantado u obtenida de él, o una célula resultante de la proliferación de dicha célula in vitro.

Célula madre somática: Tal como se usa en esta invención, una "célula madre somática" se refiere a cualquier célula madre pluripotente o multipotente derivada de tejido no embrionario que incluye tejido fetal, juvenil y adulto.

Célula somática pluripotente: Tal como se usa en esta invención, una "célula somática pluripotente" se refiere a una célula somática que ha tenido su potencial de desarrollo alterado al de un estado pluripotente.

Dosis dividida: Tal como se usa en esta invención, una "dosis dividida" es la división de la dosis unitaria única o la dosis diaria total en dos o más dosis.

Estable: Como se usa en esta invención, "estable" se refiere a un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza de una mezcla de reacción, y preferiblemente capaz de formularse en un agente terapéutico eficaz.

Estabilizado: Tal como se usa en esta invención, el término "estabilizar", "estabilizado", "región estabilizada" significa hacer o volverse estable.

Célula madre: Tal como se usa en esta invención, el término "célula madre" se refiere a una célula en un estado indiferenciado o parcialmente diferenciado que tiene la propiedad de autorrenovación y tiene el potencial de desarrollo para diferenciarse en múltiples tipos de células, sin un potencial de desarrollo específico. Una célula madre puede ser capaz de proliferar y dar lugar a más células madre mientras mantiene su potencial de desarrollo.

Sujeto: Tal como se usa en esta invención, el término “sujeto” o "paciente" hace referencia a cualquier organismo al que se pueda administrar una composición según la invención, por ejemplo, con fines experimentales, diagnósticos, profilácticos, y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y humanos) y/o plantas.

Sustancialmente: Tal como se usa en esta invención, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una medida o grado total, o casi total, de una característica o propiedad de interés. Un experto en la materia biológica comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos en raras ocasiones, si es que ocurre, se completan y/o llegan a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. El término "sustancialmente" se usa en esta invención, por lo tanto, para capturar la posible falta de compleción inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos. Sustancialmente igual: Tal como se usa en esta invención en relación con las diferencias de tiempo entre dosis, el término significa más/menos 2 %.

Sustancialmente simultáneamente: Tal como se usa en esta invención y en lo que se refiere a una pluralidad de dosis, el término significa dentro de 2 segundos.

Que padece: Un individuo "que padece" una enfermedad, trastorno y/o afección ha sido diagnosticado y/o presenta uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno y/o afección.

Susceptible a: Una persona que es "susceptible a" una enfermedad, trastorno o afección no ha sido diagnosticada o puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno o afección, pero tiene una propensión a desarrollar una enfermedad o sus síntomas. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, cáncer) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (3) expresión y/o actividad aumentada y/o disminuida de una proteína y/o ácido nucleico asociado con la enfermedad, trastorno y/o afección; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (5) antecedentes familiares de la enfermedad, trastorno y/o afección; y (6) exposición y/o infección con un microbio asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunos casos, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunos casos, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.

Liberación sistenida: Tal como se usa en esta invención, “liberación sostenida” se refiere a un perfil de liberación de un compuesto o composición farmacéutica que se conforma a una velocidad de liberación durante un período específico de tiempo.

Sintético: El término "sintético" significa producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. La síntesis de polinucleótidos o polipéptidos u otras moléculas de la presente divulgación puede ser química o enzimática.

Células diana: Tal como se usa en esta invención, "células diana" se refiere a una o más células de interés. Las células se pueden encontrar in vitro, in vivo, in situ o en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano y lo más preferiblemente un paciente.

Agente terapéutico: El término "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, tras ser administrado a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, diagnóstico y/o profiláctico, y/o produce un efecto farmacológico y/o biológico deseado. Cantidad terapéuticamente eficaz: Tal como se usa en esta invención, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente a administrar (por ejemplo, ácido nucleico, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuando se administra. a un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.

Resultado terapéuticamente eficaz: Tal como se usa en esta invención, el término "resultado terapéuticamente eficaz" significa un resultado que es suficiente en un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.

Dosis diaria total: Tal como se usa en esta invención, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un período de 24 horas. Puede administrarse como una dosis unitaria única.

Totipotencia: Tal como se usa en esta invención, "totipotencia" se refiere a una célula con un potencial de desarrollo para producir todas las células que se encuentran en el cuerpo adulto así como los tejidos extraembrionarios, incluida la placenta.

Factor de transcripción: Como se usa en esta invención, el término "factor de transcripción" se refiere a una proteína de unión al ADN que regula la transcripción del ADN en ARN, por ejemplo, mediante la activación o represión de la transcripción. Algunos factores de transcripción efectúan la regulación de la transcripción por sí solos, mientras que otros actúan en conjunto con otras proteínas. Algún factor de transcripción puede activar y reprimir la transcripción bajo ciertas condiciones. En general, los factores de transcripción se unen a una secuencia o secuencias diana específicas muy similares a una secuencia consenso específica en una región reguladora de un gen diana. Los factores de transcripción pueden regular la transcripción de un gen diana solo o en un complejo con otras moléculas. Transcripción: Tal como se usa en esta invención, el término "transcripción" se refiere a procedimientos para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula. Los procedimientos de transfección incluyen, pero no se limitan a, procedimientos químicos, tratamientos plísicos y lípidos catiónicos o mezclas.

Transdiferenciación: Como se usa en esta invención, "transdiferenciación" se refiere a la capacidad de las células diferenciadas de un tipo para perder características de identificación y cambiar su fenotipo por el de otras células completamente diferenciadas.

Tratar: Tal como se usa en esta invención, el término "tratar' se refiere a aliviar, mejorar, inhibir, prevenir, retrasar el inicio de, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular. Por ejemplo, "tratar" el cáncer puede referirse a inhibir la supervivencia, el crecimiento, y/o diseminación de un tumor. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, trastorno y/o afección, y/o a un sujeto que muestra únicamente síntomas iniciales de la enfermedad, trastorno y/o afección, con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar patologías asociadas con la enfermedad, trastorno y/o afección.

Sin modificar: Tal como se usa en esta invención, "sin modificar" se refiere a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de ser cambiado de alguna manera. Sin modificar puede, pero no siempre, referirse al tipo salvaje o la forma nativa de una biomolécula. Las moléculas pueden sufrir una serie de modificaciones mediante las cuales cada molécula modificada puede servir como la molécula de partida "no modificada" para una modificación posterior. Equivalentes y alcance

Los expertos en la materia reconocerán o serán capaces de determinar, usando nada más que los experimentos de rutina, muchos equivalentes de realizaciones específicas según la descripción proporcionada en esta invención. No se pretende limitar el alcance de la presente invención a la descripción anterior, sino que el mismo se establece en las reivindicaciones adjuntas.

En las reivindicaciones, los artículos tales como "un", "uno(a)" y "el(la)" pueden significar uno o más a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran cumplidas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean, o de otro modo son relevantes para un producto o procedimiento dado, a menos que se indique lo contrario o que sea evidente de otra modo a partir del contexto. La invención incluye realizaciones donde exactamente un miembro del grupo está presente, se emplea o de otro modo es relevante para un producto o procedimiento dado. La invención incluye realizaciones donde más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean o son de otro modo relevantes para un producto o procedimiento dado.

Cabe señalar también que la expresión "que comprende" pretende ser abarcativa y permite, aunque no exige, la inclusión de elementos o etapas adicionales. En esta invención, cuando se usa la expresión "que comprende", por consiguiente, se abarca y se describe también la expresión "que consiste en".

Cuando se proporcionan intervalos, se incluyen criterios de valoración. Además, se debe entender que, a menos que se indique lo contrario, o sea evidente de otro modo mediante el contexto y el entendimiento de un experto en la materia, los valores que se expresan como intervalos pueden adoptar cualquier valor o subintervalo específico dentro de los intervalos establecidos en las diferentes realizaciones de la invención, hasta una décima parte de la unidad del extremo inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Construcciones de ADN para la producción de polinucleótidos sintéticos y ARNsg

Los polinucleótidos sintéticos y el ARNsg de la divulgación se producen mediante la creación de una construcción de ADN; amplificación por PCR de una plantilla de ADNc; transcripción in vitro de la plantilla de ADNc (usando, en algunos casos, nucleótidos modificados); si necesario, descolado de poli-A enzimática postranscripción in vitro y/o protección 5'; y purificación y análisis.

La construcción de ADN para el polinucleótido sintético incluye un marco de lectura abierto. El marco de lectura abierto (ORF) que codifica la proteína relacionada con CRISPR, por ejemplo, la proteína de fusión dCAS9 o dCAS9-activador, puede estar flanqueada por una región 5' no traducida (UTR) que puede contener una fuerte señal de iniciación de la traducción de Kozak y/o una alfa -globina 3' UTR que puede incluir una secuencia de oligo(dT) para la adición de plantilla de una cola poli-A.

El ORF también puede incluir varias adiciones ascendentes o descendentes (como, entre otras, p-globina, etiquetas, etc.) que se pueden solicitar a un servicio de optimización como, entre otras, DNA2.0 (Menlo Park, CA ) y puede contener múltiples sitios de clonación que pueden tener reconocimiento de XbaI.

La construcción de ADN para el ARNsg de la divulgación se elabora usando procedimientos similares. La construcción de plásmido incluye un inserto con una secuencia de ARNsg que incluye la secuencia de guías N (20-25) y la secuencia de andamio de guía flanqueada en el extremo 5' con una 5' UTR específica de ARN polimerasa, por ejemplo, una UTR 5' de polimerasa T7.

La construcción de ADN para el polinucleótido sintético y/o el ARNsg se transforma en E. coli. Para la presente divulgación, se utiliza E. coli competente NEB DH5-alfa. Las transformaciones se realizan de acuerdo con las instrucciones de NEB usando 100 ng de plásmido. El protocolo es el siguiente:

1. Descongelar un tubo de células de E. coli competentes NEB 5-alfa en hielo durante 10 minutos.

2. Añadir 1-5 pl que contengan 1 pg-100 ng de ADN plasmídico a la mezcla de células. Mover con cuidado el tubo de 4 a 5 veces para mezclar las células y el ADN. No agitar.

3. Colocar la mezcla en hielo durante 30 minutos. No mezclar.

4. Choque de calor a 42 °C durante exactamente 30 segundos. No mezclar.

5. Colocar en hielo durante 5 minutos. No mezclar.

6. Pipetear 950 pl de SOC a temperatura ambiente en la mezcla.

7. Colocar a 37 °C durante 60 minutos. Agitar vigorosamente (250 rpm) o girar.

8. Calentar las placas de selección a 37 ° C.

9. Mezclar bien las células moviendo el tubo e invirtiéndolo.

Alternativamente, incubar a 30 °C durante 24-36 horas o 25 °C durante 48 horas.

A continuación se usa una sola colonia para inocular 5 ml de medio de crecimiento LB usando el antibiótico apropiado y luego se deja crecer (250 RPM, 37 °C) durante 5 horas. A continuación, se utiliza para inocular un medio de cultivo de 200 ml y se deja crecer durante la noche en las mismas condiciones.

Para aislar el plásmido (hasta 850 pg), se realiza una preparación máxima utilizando el kit Invitrogen PURELINK™ HiPure Maxiprep (Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para generar ADNc para la transcripción In Vitro (IVT), el plásmido se linealiza primero usando una enzima de restricción como Xbal. Una digestión de restricción típica con Xbal comprenderá lo siguiente: Plásmido 1,0 pg; Tampón 10x 1,0 pl; Xbal 1,5 pl; dH20 hasta 10 pl; incubados a 37 °C durante 1 hora. Si se realiza a escala de laboratorio (<5 pg), la reacción se limpia con el Micro Kit PURELINK™ PCR de Invitrogen (Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Es posible que sea necesario realizar una purificación a gran escala con un producto que tenga una mayor capacidad de carga, como el kit de PCR estándar PURELINK™ de Invitrogen (Carlsbad, CA). Después de la limpieza, el vector linealizado se cuantifica usando el NanoDrop y se analiza para confirmar la linealización usando electroforesis en gel de agarosa.

Ejemplo 2. PCR para la producción de ADNc

El plásmido linealizado (que codifica el polinucleótido sintético que codifica la proteína relacionada con CRISPR o que codifica el ARNsg) se amplifica usando PCR para la preparación de DNAc, por ejemplo, una plantilla de transcripción. Los procedimientos de pCr para la preparación de Ad Nc se realizan usando 2x KAPA HIFI™ HotStart ReadyMix de Kapa Biosystems (Woburn, Ma ). Este sistema incluye 2x KAPA ReadyMix12,5 pl; Cebador directo (10 uM); 0,75 pl; Cebador inverso (10 uM) 0,75 pl; ADNc Plantilla; 100 ng; y dH20 diluido a 25,0 pl. Las condiciones de reacción son a 95 °C durante 5 min. y 25 ciclos de 98 °C durante 20 segundos, luego 58 °C durante 15 segundos, luego 72 °C durante 45 segundos, luego 72 °C durante 5 min. luego 4 °C hasta la terminación.

En algunas realizaciones, el cebador inverso de la presente invención incorpora un poli-T¹²⁰ para un poli-A¹²⁰ en el ARNm. Se pueden usar otros cebadores inversos con tractos poli(T) más largos o más cortos para ajustar la longitud de la cola poli(A) en el ARNm.

La reacción se limpia con el micro kit PURELINK™ PCR de Invitrogen (Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante (hasta 5 pg). Las reacciones más grandes requerirán una limpieza con un producto de mayor capacidad. Después de la limpieza, el ADNc se cuantifica usando el NanoDrop y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ADNc tiene el tamaño esperado. A continuación, el ADNc se envía para análisis de secuenciación antes de proceder a la reacción de transcripción in vitro.

Ejemplo 3. Transcripción In vitro (IVT)

El ADNc del producto amplificado se utiliza como plantilla para la transcripción in vitro para generar polinucleótidos sintéticos y/o ARNsg sintéticos. La mezcla de trifosfato de nucleótidos de entrada (NTP) se fabrica internamente utilizando NTP naturales y no naturales. La reacción de transcripción in vitro genera polinucleótidos sintéticos modificados y/o ARNsg.

Una reacción de transcripción in vitro in vitro típica incluye lo siguiente:

Incubación a 37 °C durante 3 h-5 h.

El polinucleótido sintético y/o el ARNsg sintético pueden modificarse para reducir la respuesta inmune innata celular. Las modificaciones para reducir la respuesta celular pueden incluir las descritas en esta invención, por ejemplo, pseudouridina (y ) y 5-metil-citidina. (5meC, 5mc o m5C). (Ver, Kariko K y col. Immunity 23:165-75 (2005), Kariko K y col. Mol Ther 16:1833-40 (2008), Anderson BR y col. NAR (2010).

La mezcla IVT bruta se puede almacenar a 4 °C durante la noche para su limpieza al día siguiente. A continuación, se utiliza 1 U de DNasa libre de RNasa para digerir la plantilla original. Después de 15 minutos de incubación a 37 °C, el ARNm se purifica usando el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit puede purificar hasta 500 pg de ARN. Después de la limpieza, el ARN se cuantifica utilizando el NanoDrop y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tiene el tamaño adecuado y que no se ha producido degradación del ARN.

Ejemplo 4. Reacción de descapado de poliA

En algunas realizaciones, el polinucleótido sintético se sintetiza sin una cola poli-A, es decir, la construcción de ADNc se amplifica sin una poli-T. Sin una poli-T en el ADNc, se debe realizar una reacción de descolado de poli-A antes de limpiar el producto final. Esto se hace mezclando ARN de IVT protegido (100 pl); Inhibidor de ARNasa (20 U); Tampón de descolado 10x (Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), NaCl 2,5 M, MgChIOO mM)(12,0 pl); 20 mM ATP (6,0 pl); Poli-A Polimerasa (20 U); dH20 hasta 123,5 pl e incubación a 37 °C durante 30 min. Si la cola de poli-A ya está en la transcripción, entonces la reacción de descolado puede omitirse y proceder directamente a la limpieza con el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) (hasta 500 pg). La polimerasa poli-A es preferiblemente una enzima recombinante expresada en levadura.

Para los estudios realizados y descritos en esta invención, la cola poli-A está codificada en la plantilla IVT para comprender 160 nucleótidos de longitud. Sin embargo, debe entenderse que la procesividad o la integridad de la reacción de descolado de poli-A no siempre pueden dar como resultado exactamente 160 nucleótidos. Por tanto, colas poliA de aproximadamente 160 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 o 165, están dentro del alcance de la invención.

Ejemplo 5. Protección 5' del polinucleótido sintético

La protección 5' del polinucleótido sintético (ARN modificado) puede completarse de forma concomitante durante la reacción de transcripción in vitroo, alternativamente, postranscripción protegida enzimáticamente.

La protección en 5' del polinucleótido sintético (ARN modificado) se puede completar de forma concomitante durante la reacción de transcripción in vitroutilizando los siguientes análogos químicos de la capa de ARN para generar la estructura de la capa de 5'-guanosina de acuerdo con los protocolos del fabricante: 3'-O-Me -m7G (5') ppp (5') G [la capa ARCA], G (5') ppp (5') A; G (5') ppp (5') G; m7G (5') ppp (5') A; m7G (5') ppp (5') G (New England BioLabs, Ipswich, MA).

La protección 5' del ARN modificado puede completarse postranscripcionalmente usando una enzima de protección del virus Vaccinia para generar la estructura "Capa 0": m7G (5') ppp (5') G (New England BioLabs, Ipswich, MA). La estructura Capa 1 puede generarse usando tanto la Enzima de Protección del Virus Vaccinia como una 2'-O metiltransferasa para generar: m7G (5 ') ppp (5') G-2'-O-metilo. La estructura Capa 2 puede generarse a partir de la estructura Capa 1 seguida de la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-antepenúltimo usando una 2'-O metiltransferasa. La estructura Capa 3 puede generarse a partir de la estructura Capa 2 seguida de la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-antepenúltimo usando una 2'-O metiltransferasa. Las enzimas se derivan preferiblemente de una fuente recombinante. La protección postranscripción del polinucleótido sintético se realiza como sigue. La mezcla de reacción incluye: IVT ARN 60 pg-180 pg y dH20 hasta 72 pl. La mezcla se incuba a 65 °C durante 5 minutos para desnaturalizar el ARN y luego se transfiere inmediatamente a hielo.

A continuación, el protocolo implica la mezcla de tampón de protección 10x (Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), KCl 60 mM, MgCh12,5 mM (10,0 pl); GTP 20 mM (5,0 pl); S-adenosil metionina 20 mM (2,5 pl); Inhibidor de ARNasa (100 U); 2'-O-metiltransferasa (400 U); Enzima de protección contra Vaccinia (Guanilil transferasa) (40 U); dH20 (hasta 28 pl); e incubación a 37 °C durante 30 minutos para 60 pg de ARN o hasta 2 horas para 180 pg de ARN.

A continuación, el polinucleótido sintético protegido se purifica usando el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la limpieza, el polinucleótido sintético protegido se cuantifica usando NANODROP™ (ThermoFisher, Waltham, MA) y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tiene el tamaño adecuado y que no se ha producido degradación del ARN. El producto de ARN también se puede secuenciar ejecutando una PCR de transcripción inversa para generar el ADNc para la secuenciación.

La eficacia de protección del polinucleótido sintético se ensaya usando varias técnicas experimentales. El polinucleótido sintético protegido se transfecta en células y la cantidad de proteína relacionada con c RiSPR se analiza usando, por ejemplo, ELISA. Los niveles más altos de expresión de proteínas se correlacionan con una mayor eficiencia de protección. El polinucleótido sintético protegido se procesa en una electroforesis en gel de agarosa-urea; un polinucleótido sintético con una sola banda consolidada por electroforesis corresponde a un producto de mayor pureza en comparación con un polinucleótido sintético con múltiples bandas o bandas a rayas. El polinucleótido sintético protegido se procesa en una columna de HPLC; el polinucleótido sintético con un solo pico de HPLC corresponde a un producto de mayor pureza. El polinucleótido sintético protegido se transfecta en queratinocitos primarios humanos a múltiples concentraciones. A las 6, 12, 24 y 36 horas después de la transfección, se ensaya mediante ELISA la cantidad de citocinas proinflamatorias, tales como TNF-alfa e IFN-beta, secretadas en el medio de cultivo. Los ARNm sintéticos que secretan niveles más altos de citocinas proinflamatorias en el medio corresponden a un ARNm sintético que contiene una estructura de capa inmuno-activante. El polinucleótido sintético protegido se analiza para determinar la eficacia de la reacción de protección mediante LC-MS después del tratamiento con nucleasa de ARNm protegido. El tratamiento con nucleasa de ARNm protegidos produce una mezcla de nucleótidos libres y la estructura de la capa de 5'-5-trifosfato protegida detectable por LC-MS. La cantidad de producto protegido en los espectros de LC-MS se expresa como un porcentaje del ARNm total de la reacción y correspondería a la eficacia de la reacción de protección. La estructura de capa con mayor eficiencia de reacción de protección tendría una mayor cantidad de producto protegido por LC-MS.

Ejemplo 6. Procedimientos de análisis de polinucleótidos sintéticos y ARNsg sintético

Electroforesis en gel de agarosa de ARN modificado o productos de RT PCR: Se cargan ARN modificados individuales (200-400 ng en un volumen de 20 pl) o productos de PCR con transcripción inversa (200-400 ng) en un pocillo de agarosa E-Gel al 1,2 % no desnaturalizante. (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se corre durante 12-15 minutos de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Cuantificación de ARN modificado con Nanodrop y datos espectrales UV: Los ARN modificados en tampón TE (1 pl) se utilizan para las lecturas de absorbancia UV de Nanodrop para cuantificar el rendimiento de cada ARN modificado a partir de una reacción de transcripción in vitro .

Ejemplo 7. Procedimiento de detección de la expresión de proteínas

Después de la transfección de células con polinucleótido sintético que codifica una proteína relacionada con CRISPR, se analiza la expresión de la proteína.

A. Ionización por electropulverización

Una muestra biológica que puede contener proteínas codificadas por polinucleótidos sintéticos administrados a las células o al sujeto se prepara y analiza de acuerdo con el protocolo del fabricante para ionización por electropulverización (ESI) usando 1,2, 3 o 4 analizadores de masa. También se puede analizar una muestra biológica utilizando un sistema de espectrometría de masas ESI en tándem.

Los patrones de fragmentos de proteína, o proteínas completas, se comparan con controles conocidos para una proteína dada y la identidad se determina por comparación.

B. Desorción/ionización láser asistida por matriz

Una muestra biológica que puede contener proteínas codificadas por polinucleótidos sintéticos administrados a las células o al sujeto se prepara y analiza de acuerdo con el protocolo del fabricante para la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).

Los patrones de fragmentos de proteína, o proteínas completas, se comparan con controles conocidos para una proteína dada y la identidad se determina por comparación.

C. Cromatografía líquida-Espectrometría de masas-Espectrometría de masas

Una muestra biológica, que puede contener proteínas codificadas por polinucleótidos sintéticos, puede tratarse con una enzima tripsina para digerir las proteínas que contiene. Los péptidos resultantes se analizan mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas-espectrometría de masas (LC/MS/MS). Los péptidos se fragmentan en el espectrómetro de masas para producir patrones de diagnóstico que pueden compararse con las bases de datos de secuencias de proteínas mediante algoritmos informáticos. La muestra digerida se puede diluir para lograr 1 ng o menos de material de partida para una proteína dada. Las muestras biológicas que contienen un fondo tampón simple (por ejemplo, agua o sales volátiles) son susceptibles de digestión directa en solución; fondos más complejos (por ejemplo, detergente, sales no volátiles, glicerol) requieren un paso de limpieza adicional para facilitar el análisis de la muestra.

Los patrones de fragmentos de proteína, o proteínas completas, se comparan con controles conocidos para una proteína dada y la identidad se determina por comparación.

Ejemplo 8. Sistemas microfisiológicos

Los polinucleótidos sintéticos que codifican proteínas relacionadas con CRISPR se formulan utilizando uno de los procedimientos descritos en esta invención, como en tampón, nanopartículas lipídicas y PLGA. A continuación, estas formulaciones se administran o se ponen en contacto con sistemas microfisiológicos creados a partir de chips de órganos como se describe en las publicaciones internacionales n.° WO2013086502, WO2013086486 y WO2013086505.

Ejemplo 9: Diseño de plantillas de ADN para polinucleótidos sintéticos que codifican proteínas de fusión de dominio efector Cas9 y dCas9

Los plásmidos se diseñaron para su uso como plantillas de transcripción in vitro para fabricar polinucleótidos químicamente sintéticos como se describe en esta invención. Se diseñaron dos plásmidos para contener Cas9 con codón optimizado como lo describen Cong y Mali, respectivamente (Science (2013) 339:819-23 y Science (2013) 339:823-6.) El primer plásmido codificaba Cas9 etiquetado con FLa G y el segundo el plásmido codificó Cas9 sin etiquetar. Se diseñaron dos plásmidos para contener el codón optimizado dcas9 que se fusiona con diferentes dominios efectores (ver Cell (2013) 154:442-51 y Nature Methods (2013) 10:977-979). Las secuencias codificantes se situaron bajo el control del promotor de polimerasa T7 para la transcripción in vitro de ARNm modificado.

Las secuencias del gen Cas9, dCAS9 y los dominios efectores se encuentran en las Tablas siguientes.

Se utilizaron las siguientes secuencias 5'UTR y 3'UTR:

5f TJTR

TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAAATAAGAGAGAAA

AGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC (SEQ ID NO:71)

3' UTR

TGATAATAGgctg gagcctcggtggccatgctt cttgcccctt gggcctcccc ccagcccctc ctccccttcc tgcacccgtacccccgtggt ctttgaataa

agtctgagtg ggcggc TCTAGA (SEQ ID NO:81)

Se crearon las siguientes construcciones: (3) dCas9- HA tag-2xSV40NLS-KRAB y (4) dCas9-NLS-FLAG-VP64. En otras realizaciones, el gen dCas9 de Streptococcus pyogenes optimizado con codones de secuencia se puede fusionar con una etiqueta HA, uno o más NLS (por ejemplo, SV40 NLS, por ejemplo, uno o dos NLS, opcionalmente en el extremo N- y/o C-) y/o una etiqueta de detección (por ejemplo, etiqueta HA, etiqueta FLAG, etiqueta BFP o similar). Cualquiera de los anteriores puede presentarse solo o en combinación con un dominio efector (dominios KRAB, CSD, WRPW, VP64 o p65AD) en las construcciones Cas9 de la invención, por ejemplo, para facilitar la regulación hacia arriba o hacia abajo). Las secuencias de varios genes Cas9, dCAS9 y dominios efectores se encuentran en las Tablas siguientes.

La expresión de Cas9 o dCas9 se puede regular adicionalmente mediante ingeniería de secuencias reguladoras de miR en UTR de las diversas construcciones. Se preparan dos construcciones que contienen la secuencia reguladora de miR-122 reemplazando la UTR 3‘ estándar por una UTR 3' que contiene un sitio regulador de miR-122. miR-122 se expresa en gran medida en los hepatocitos y no en otros tejidos; por lo tanto, la traducción de ARNm que contiene sitios reguladores (de unión) de miR-122 en su UTR 3‘ está selectivamente regulada hacia abajo en los hepatocitos pero no en otras células.

Se diseñaron las siguientes construcciones: (5) dCas9-KRAB-miR-122 y (6) dCas9-NLS-FLAG-VP64-miR-122). Las construcciones 1-4 (casetes de ADN) se sintetizaron y se insertaron en un vector (pJ364 de DNA 2.0, Inc., Menlo Park, CA). El plásmido se transfectó en E. coli como se describió anteriormente, el ADN del plásmido se purificó y linealizó usando una enzima de restricción (Xbal). El plásmido linealizado se amplificó por PCR y se usó como plantilla para la transcripción in vitro para producir los polinucleótidos sintéticos de la invención.

Ejemplo 10: Diseño de plantillas de ADN para ARNsg sintéticos dirigidos a VEGF.

Se crearon cuatro construcciones, cada una de las cuales codificaba un ARNsg dirigido a un gen de interés, es decir, un gen VEGF, para su uso como plantillas para la transcripción in vitro.

Cada una de las construcciones incluía una 5'UTR (T7), un GGG, una secuencia de 20-25 nucleótidos complementaria a una secuencia corriente arriba del inicio transcripcional del gen VEGF y una secuencia de andamio de ARN guía. Las secuencias de ARNg de VEGF se basaron en Maeder y col.

La siguiente secuencia se utilizó como secuencia 5'UTR:

TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID

NO:72)

Se crearon las siguientes cuatro construcciones de ARNsg; las secuencias en cursiva negrita son las complementarias del gen VEGF.

Secuencia de construcción de ARNsg de VEGF V1

TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGrGrGCAGACGGCAG

rCACrAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGA

AAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ IN NO:101)

Secuencia de construcción de ARNsg de VEGF V2

TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGAGCAGCGrCTTCGA

GAGTGAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGA

AAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO:102)

Secuencia de construcción de ARNsg de VEGF V3

TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGrGAGrGAGrGTGrG

CGrGrGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAA

AAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO:103)

Secuencia de construcción de ARNsg de VEGF V4

TCAAGCTTTTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACGACTCACTATAGGGrrGGAGCGGGGAGA

AGGCCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGA

AAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO:104)

Las cuatro construcciones (casetes de ADN) se sintetizaron y se insertaron en un vector (pJ224 de DNA 2.0, Inc., Menlo Park, CA). El plásmido se transfectó en E. coli como se describió anteriormente, el ADN del plásmido se purificó y linealizó usando una enzima de restricción (Xbal). El plásmido linealizado se amplificó por PCR como se describe en esta invención y se usó como plantilla para la transcripción in vitro para producir el ARNsg sintético.

Ejemplo 11: Producción de polinucleótidos sintéticos y ARNsg mediante transcripción in vitro.

Utilizando los procedimientos descritos en esta invención, se sintetizaron los dos polinucleótidos sintéticos que codifican Cas9, los dos polinucleótidos sintéticos que codifican las proteínas de fusión del gen efector dCAS9 y los cuatro ARNsg sintéticos que se dirigen a VEGF utilizando la transcripción in vitro de las construcciones descritas anteriormente. Se sintetizaron polinucleótidos sintéticos y ARNsg sintéticos con las siguientes secuencias.

Secuencia de ARNm de dCas9- HA tag-2xSV40NLS- KRAB

GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGACAAGAAAUAC

UCAAUCGGACUUGCUAUCGGAACUAACAGCGUGGGAUGGGCCGUCAUUACUGACGAAUACAA

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GAAAAGUACCCUACCAUCUACCAUCUCAGAAAGAAACUCGUCGAUUCAACUGAUAAGGCCGA

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GAGAUUCGCCUGGAUGACGCGGAAGUCCGAAGAAACCAUCACGCCGUGGAAUUUCGAAGAAG

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CGAACUGGAGAACGGAAGGAAACGGAUGCUGGCUUCCGCCGGCGAACUGCAAAAGGGCAAUG

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GCAGAUCGUGUACCGGAAUGUGAUGCUGGAGAACUACAAAAACUUGGUGUCCCUGGGGUAUC

AACUCACUAAGCCAGAUGUCAUUCUUAGACUGGAAAAGGGAGAAGAACCGUGAUAAUAGGCU

GGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCU

GCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC+A(14 Ont) cola (SEQ ID NO:51)

Secuencia de ARNm de dCas9-NLS-FLAG-VP64

GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGACAAGAAAUAC

UCAAUCGGACUUGCUAUCGGAACUAACAGCGUGGGAUGGGCCGUCAUUACUGACGAAUACAA

GGUGCCCUCAAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAAUACCGAUAGACACUCCAUCAAAAAGAACC

UGAUCGGGGCACUGUUGUUCGACUCGGGAGAGACUGCAGAAGCAACCAGGCUCAAGCGCACU

GCGAGGCGCCGGUACACCCGGAGGAAGAACCGCAUCUGCUACCUCCAAGAGAUUUUCAGCAA CGAGAUGGCAAAGGUCGAUGAUUCGUUCUUUCACCGCCUUGAGGAGUCGUUCCUUGUCGAGG AGGACAAAAAGCAUGAAAGACAUCCGAUCUUCGGAAACAUCGUGGACGAAGUCGCAUACCAU GAAAAGUACCCUACCAUCUACCAUCUCAGAAAGAAACUCGUCGAUUCAACUGAUAAGGCCGA CUUGCGGCUGAUCUACCUGGCUCUGGCGCACAUGAUCAAGUUUCGGGGUCACUUUCUCAUCG AGGGUGAUCUCAACCCGGACAAUUCCGACGUUGACAAACUCUUCAUCCAACUGGUCCAGACG UACAACCAGCUGUUCGAAGAAAAUCCGAUCAACGCAAGCGGAGUGGACGCCAAAGCCAUUCU GUCGGCCCGCCUCUCGAAGUCGCGUCGCCUGGAAAAUCUGAUUGCUCAGCUCCCGGGCGAAA AGAAGAAUGGCCUGUUUGGAAACCUCAUCGCACUGUCCCUCGGGCUGACUCCCAACUUCAAA UCGAACUUUGACUUGGCUGAGGAUGCAAAGCUGCAACUCUCCAAAGACACUUACGAUGAUGA CCUGGACAAUCUCCUGGCGCAGAUCGGGGAUCAGUAUGCUGACCUGUUCCUGGCGGCCAAGA ACCUGUCUGAUGCCAUCCUGCUCUCCGAUAUCCUGAGAGUGAACACUGAGAUCACCAAGGCG CCUCUGAGCGCCUCGAUGAUCAAACGCUACGAUGAACACCAUCAGGACCUCACUCUUCUGAA GGCUUUGGUGCGGCAGCAGCUUCCGGAAAAGUACAAAGAGAUCUUCUUCGACCAGUCGAAAA ACGGCUACGCCGGAUACAUUGAUGGCGGCGCAAGCCAGGAGGAAUUCUAUAAGUUUAUCAAA CCGAUCCUGGAGAAGAUGGACGGCACUGAAGAACUUCUGGUCAAGCUGAAUCGAGAGGAUCU GCUCCGGAAGCAGCGGACCUUCGACAAUGGGUCUAUCCCUCACCAAAUCCAUCUCGGCGAGC UGCAUGCGAUUCUGAGGCGCCAGGAGGACUUCUACCCAUUCCUGAAAGACAAUCGGGAGAAA AUCGAAAAGAUUCUGACGUUCCGCAUUCCAUACUACGUCGGGCCACUUGCGCGGGGUAAUUC GAGAUUCGCCUGGAUGACGCGGAAGUCCGAAGAAACCAUCACGCCGUGGAAUUUCGAAGAAG UGGUCGACAAGGGAGCCAGCGCACAGUCCUUCAUUGAGCGCAUGACCAAUUUCGACAAAAAU CUGCCGAACGAGAAGGUCCUGCCGAAGCAUUCACUGCUGUACGAAUACUUUACCGUGUACAA CGAACUGACCAAGGUGAAGUACGUCACCGAGGGAAUGAGAAAGCCUGCUUUCCUGAGCGGAG AACAGAAGAAGGCCAUUGUUGACCUCCUCUUCAAGACUAAUCGCAAAGUGACCGUGAAGCAG CUUAAAGAGGAUUACUUCAAAAAGAUCGAAUGUUUCGACUCCGUGGAAAUCAGCGGCGUGGA GGAUAGAUUCAACGCGUCCCUUGGGACUUACCACGACCUCCUUAAGAUCAUCAAGGAUAAGG AUUUCCUCGACAAUGAGGAAAACGAAGAUAUCCUGGAGGACAUCGUUCUGACUCUGACCCUC UUUGAGGACCGGGAGAUGAUCGAGGAGAGACUCAAGACCUACGCGCACCUGUUUGACGACAA AGUGAUGAAGCAACUUAAACGCAGGCGCUACACCGGCUGGGGCAGACUGUCACGCAAGUUGA UCAACGGAAUUAGAGAUAAACAGUCCGGAAAGACCAUCCUGGACUUCCUGAAGUCCGAUGGA UUCGCCAACCGGAAUUUCAUGCAGCUCAUCCAUGACGACUCAUUGACUUUCAAGGAGGAUAU CCAAAAGGCCCAAGUGAGCGGCCAAGGGGACUCCCUUCACGAACACAUCGCAAAUUUGGCCG GAUCACCAGCGAUUAAGAAGGGAAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGACGAGCUGGUGAAA GUGAUGGGACGGCACAAGCCGGAAAACAUCGUGAUCGAGAUGGCCAGAGAGAACCAGACGAC UCAAAAGGGCCAGAAGAACUCGCGCGAACGCAUGAAGAGAAUAGAAGAGGGAAUUAAGGAAC UGGGAUCGCAGAUCUUGAAGGAGCACCCUGUCGAAAAUACUCAACUCCAGAACGAGAAGCUG UACCUGUACUAUCUUCAAAACGGCAGGGACAUGUAUGUCGACCAAGAGCUCGACAUUAACCG CCUGUCCGAUUAUGACGUGGACGCCAUCGUGCCGCAGAGCUUUCUCAAGGACGAUUCCAUCG ACAACAAAGUGCUCACCCGCAGCGACAAGAAUAGAGGGAAGUCGGAUAACGUCCCUUCGGAA GAGGUGGUGAAAAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCAAAGCUCAUCACCCA ACGGAAGUUUGACAACCUCACCAAGGCAGAAAGAGGAGGACUGUCGGAAUUGGAUAAGGCCG GUUUCAUCAAGCGACAAUUGGUGGAAACUCGGCAAAUUACCAAGCAUGUGGCACAGAUUCUG GACUCCCGUAUGAACACCAAGUACGACGAGAACGAUAAGCUGAUCCGCGAGGUCAAGGUGAU CACCCUCAAAAGCAAACUUGUGUCAGACUUCCGGAAGGACUUCCAAUUCUACAAGGUCCGCG AAAUCAACAACUACCACCACGCUCAUGACGCAUACCUGAACGCUGUGGUCGGGACUGCCCUC AUCAAGAAGUACCCUAAACUCGAAAGCGAAUUUGUGUACGGCGACUACAAAGUGUACGAUGU CCGGAAGAUGAUCGCGAAAUCCGAGCAGGAGAUCGGAAAGGCGACUGCUAAGUACUUUUUCU ACUCGAACAUCAUGAACUUCUUCAAAACCGAAAUCACCCUGGCUAAUGGCGAGAUCAGAAAG CGCCCGCUGAUCGAAACCAACGGCGAAACCGGUGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCCGCGAUUU CGCUACUGUGAGAAAGGUCCUUUCCAUGCCGCAAGUGAAUAUCGUCAAAAAGACUGAGGUGC AGACUGGCGGAUUUUCCAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGGAACUCAGAUAAGCUCAUCGCG CGGAAAAAGGAUUGGGACCCUAAGAAGUACGGAGGAUUUGAUAGCCCAACUGUGGCCUACUC

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UUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUU

UGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC+A(140nt) cola (SEQ ID NO:52)

Secuencia de ARNm de dCas9- KRAB-miR122

GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGACAAGAAGUAC

UCAAUCGGACUCGCAAUCGGAACCAAUUCAGUCGGCUGGGCAGUCAUUACCGAUGAAUACAA

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GUGAUGGGAAGGCAUAAGCCGGAGAAUAUCGUGAUCGAGAUGGCGAGGGAAAACCAGACGAC

CCAGAAAGGACAGAAAAACAGCCGGGAACGCAUGAAGCGCAUCGAAGAGGGAAUCAAAGAGC

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UACCACGAUCGACCGGAAGAGAUACACCAGCACCAAAGAGGUGUUGGACGCGACCCUCAUCC

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UACCCUUACGAUGUCCCGGACUACGCCUCGCUGGGAUCCGGAUCUCCGAAGAAGAAGCGGAA

GGUCGAGGACCCAAAGAAAAAGCGCAAAGUGGAUGGGAUCGGUAGCGGUUCCAACGGUUCCU

CGGGUGGCGGCGGAGGCGGCAUGGAUGCUAAGUCACUUACCGCCUGGUCGCGGACGCUGGUG

ACUUUCAAAGAUGUGUUCGUGGAUUUCACUCGUGAGGAAUGGAAAUUGCUGGACACUGCCCA

ACAGAUCGUCUACCGCAACGUCAUGCUUGAAAACUACAAAAACCUCGUGUCGCUGGGAUAUC

AGCUGACCAAGCCCGACGUGAUUCUGAGACUGGAGAAGGGCGAAGAACCUUGAUAAUAGGCU

GGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCU

GCACCCGUACCCCCCAAACACCAUUGUCACACUCCAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGG

GCGGC+A(140nt) cola (SEQ ID NO:53)

Secuencia de ARNm de dCas9-VP64-miR122

GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGACAAGAAGUAC UCAAUCGGACUCGCAAUCGGAACCAAUUCAGUCGGCUGGGCAGUCAUUACCGAUGAAUACAA GGUGCCGUCGAAGAAGUUCAAAGUCCUGGGUAACACUGACAGACAUUCGAUCAAAAAGAACC UGAUCGGAGCCUUGCUGUUUGAUUCAGGCGAAACCGCCGAAGCUACCCGGUUGAAACGAACU GCUAGACGCCGCUACACGCGCCGCAAGAACCGGAUCUGCUACCUCCAAGAAAUCUUCUCGAA CGAAAUGGCUAAGGUGGACGACUCGUUCUUUCACCGGCUCGAGGAGUCAUUCCUUGUGGAGG AAGAUAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGCAACAUCGUGGACGAAGUCGCGUACCAC GAAAAGUACCCGACUAUCUACCAUCUCCGGAAGAAGCUCGUGGAUAGCACCGAUAAGGCCGA UCUGCGACUGAUCUACCUCGCGCUGGCCCAUAUGAUUAAGUUCCGCGGGCACUUCCUCAUCG AAGGGGACCUGAAUCCAGACAACUCGGACGUGGAUAAGCUGUUUAUCCAGCUGGUGCAGACU UACAAUCAAUUGUUUGAAGAAAACCCUAUCAACGCGUCUGGGGUGGACGCAAAGGCCAUCCU GAGCGCGCGGCUGUCAAAAUCCAGACGGCUGGAAAAUCUGAUAGCCCAACUGCCGGGCGAGA AGAAAAACGGCCUGUUUGGAAAUCUUAUCGCCCUGUCCCUGGGACUGACCCCCAACUUCAAG UCGAACUUCGACUUGGCCGAGGAUGCGAAGCUCCAGCUCAGCAAAGACACCUACGACGAUGA CCUCGAUAACCUGUUGGCCCAGAUCGGUGACCAGUAUGCUGAUCUCUUCUUGGCGGCCAAGA ACCUGUCAGACGCAAUUCUGCUCUCCGACAUCCUGCGGGUGAAUACUGAGAUCACUAAAGCC CCAUUGAGCGCGUCGAUGAUCAAAAGAUACGACGAGCACCACCAGGAUCUGACUCUCCUCAA GGCACUGGUCCGCCAACAGCUCCCGGAAAAGUACAAAGAGAUCUUCUUUGACCAAUCCAAAA ACGGAUACGCUGGUUACAUAGACGGCGGAGCGUCACAAGAAGAGUUCUACAAGUUCAUCAAG CCUAUCCUGGAAAAGAUGGACGGGACCGAGGAACUCCUGGUUAAGCUCAAUAGGGAGGAUCU GCUGCGCAAGCAACGCACGUUCGACAAUGGAAGCAUCCCCCAUCAGAUCCACCUGGGGGAGC UCCACGCGAUCCUGAGGCGCCAGGAAGAUUUCUACCCAUUUCUGAAGGACAAUAGAGAGAAA AUCGAAAAGAUCCUGACUUUCCGAAUCCCGUACUACGUGGGCCCGCUCGCACGGGGAAACUC ACGGUUUGCCUGGAUGACUCGCAAAUCCGAAGAAACCAUUACCCCCUGGAAUUUCGAGGAGG UGGUCGAUAAAGGCGCCUCAGCCCAGUCGUUCAUCGAAAGAAUGACCAACUUUGACAAGAAC CUCCCAAAUGAGAAGGUGCUGCCAAAACAUAGCCUGCUGUACGAGUACUUUACUGUGUAUAA CGAACUCACCAAGGUGAAAUACGUGACCGAGGGAAUGCGCAAGCCGGCAUUUCUGUCGGGCG AACAGAAGAAGGCAAUUGUGGACUUGCUGUUCAAAACCAACCGGAAGGUGACCGUGAAACAG CUCAAGGAAGAUUACUUUAAGAAGAUCGAGUGUUUCGAUAGCGUCGAAAUUUCGGGGGUGGA AGAUCGCUUCAAUGCAAGCCUUGGGACGUACCACGAUCUGCUUAAGAUCAUUAAGGACAAGG AUUUCCUUGACAACGAAGAGAACGAGGAUAUUCUCGAGGAUAUCGUCCUGACCCUGACUCUG UUUGAGGAUAGAGAAAU GAUCGAGGAGAGAUU GAAAACUUAC GCACAC CUCUUCGACGAUAA GGUGAUGAAACAGCUGAAAAGGCGUAGAUACACUGGUUGGGGAAGGCUGUCGAGAAAGCUGA UCAACGGAAUUAGGGACAAGCAGUCCGGAAAAACCAUCCUGGAUUUCCUCAAGUCCGACGGU UUCGCCAACCGCAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGAUGAUUCCCUGACGUUCAAAGAGGAUAU CCAGAAGGCACAAGUGUCCGGACAAGGAGACUCACUCCACGAGCAUAUCGCUAAUCUCGCCG GAUCGCCAGCUAUCAAGAAGGGAAUCUUGCAGACUGUCAAGGUGGUGGACGAACUGGUGAAA GUGAUGGGAAGGCAUAAGCCGGAGAAUAUCGUGAUCGAGAUGGCGAGGGAAAACCAGACGAC CCAGAAAGGACAGAAAAACAGCCGGGAACGCAUGAAGCGCAUCGAAGAGGGAAUCAAAGAGC UUGGGAGCCAAAUCCUCAAAGAACACCCUGUGGAAAAUACCCAACUGCAGAAUGAGAAGCUU UACCUGUAUUACCUCCAAAACGGGCGCGACAUGUACGUUGACCAGGAAUUGGACAUUAACCG GCUUUCCGACUACGAUGUGGACGCUAUCGUCCCGCAGUCCUUCCUGAAAGACGAUUCGAUCG ACAAUAAGGUCCUGACUAGAUCAGACAAGAAUCGGGGAAAGUCAGACAACGUGCCUAGCGAA GAGGUCGUUAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGCCAGCUGCUGAACGCGAAGCUUAUCACUCA GCGCAAGUUCGACAACCUCACCAAGGCAGAAAGAGGCGGAUUGUCGGAGCUCGACAAAGCUG GCUUCAUCAAGCGCCAGCUCGUCGAAACUCGCCAGAUUACUAAGCAUGUGGCGCAGAUCCUG GACAGCCGCAUGAAUACUAAGUAUGAUGAGAAUGACAAGCUCAUCCGGGAGGUGAAGGUCAU CACCCUGAAGUCCAAGCUGGUGUCCGACUUCCGGAAGGACUUCCAAUUCUACAAAGUCAGAG AAAUCAACAAUUACCAUCACGCGCAUGACGCCUACUUGAAUGCAGUGGUGGGUACUGCCCUC AUCAAGAAAUACCCAAAGCUUGAAAGCGAGUUUGUCUACGGAGACUACAAGGUGUACGACGU CCGGAAGAUGAUCGCCAAAUCGGAACAGGAAAUUGGGAAGGCGACCGCUAAGUACUUCUUCU

ACUCGAAUAUCAUGAAUUUCUUCAAGACCGAGAUCACGCUUGCAAAUGGCGAAAUCCGGAAG

CGGCCCCUCAUCGAAACCAACGGAGAAACCGGAGAAAUCGUGUGGGACAAGGGUCGCGAUUU

UGCGACCGUCCGAAAGGUUCUUAGCAUGCCUCAAGUGAACAUCGUCAAGAAAACGGAAGUGC

AGACUGGAGGCUUCAGCAAGGAGUCCAUUCUCCCGAAACGCAACUCCGACAAACUGAUCGCA

CGCAAGAAAGACUGGGACCCGAAGAAAUACGGAGGCUUCGAUUCGCCGACUGUGGCUUACUC

GGUCCUGGUUGUGGCCAAGGUGGAAAAGGGAAAGUCCAAGAAGCUGAAGUCCGUCAAGGAGC

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GCAAAGGGGUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUCUGAUCAUCAAACUGCCGAAGUACAGCCUCUU

UGAGCUCGAAAACGGACGCAAAAGGAUGCUGGCCUCCGCCGGAGAGCUGCAAAAGGGAAACG

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AAGGGAUCGCCGGAGGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUUGUGGAACAACACAAGCAUUAUCU

GGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCAGCGAAUUCUCAAAAAGGGUGAUCUUGGCCGACGCCAACC

UGGAUAAAGUGCUUUCCGCCUACAACAAACAUCGCGACAAGCCGAUCCGGGAGCAGGCCGAA

AACAUCAUUCACCUGUUUACCCUGACUAAUCUGGGUGCGCCCGCGGCUUUCAAAUACUUCGA

UACCACGAUCGACCGGAAGAGAUACACCAGCACCAAAGAGGUGUUGGACGCGACCCUCAUCC

ACCAAUCUAUUACCGGCCUCUAUGAAACUAGGAUCGACCUCAGCCAGCUGGGAGGCGAUGGA

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UCAUGAUAUUGAUUACAAGGACGACGACGACAAGGCCGCUGGAGGAGGAGGUUCCGGCCGCG

CCGAUGCUCUCGACGACUUCGACCUCGACAUGCUGGGAUCCGACGCCCUGGACGACUUUGAU

CUGGAUAUGCUGGGCUCGGACGCCCUUGAUGACUUCGAUCUGGACAUGCUGGGGUCGGAUGC

ACUGGACGACUUCGACCUUGAUAUGCUGUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUC

UUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCAAACACC

AUUGUCACACUCCAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC+A(14 Ont) cola (SEQ ID NO:54)

Secuencia de ARNm de Cas9(Mali)

GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGACAAGAAAUAC

AGCAUCGGCCUGGAUAUUGGAACUAACAGCGUUGGAUGGGCAGUGAUCACCGACGAGUACAA

GGUGCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUGCUGGGGAACACUGACCGCCAUUCAAUUAAGAAAAACC

UCAUUGGAGCACUGCUUUUUGACUCGGGUGAGACUGCCGAAGCUACCAGGCUCAAACGCACC

GCACGCAGACGGUACACCCGCCGCAAGAAUCGCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCCAA

CGAGAUGGCGAAGGUUGACGACAGCUUUUUCCACCGGCUGGAAGAGAGCUUCCUCGUGGAAG

AGGACAAAAAGCACGAAAGGCAUCCAAUCUUCGGUAACAUCGUGGACGAAGUGGCGUAUCAC

GAAAAGUACCCUACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGCUGGUCGAUUCCACGGAUAAGGCAGA

CCUGAGACUGAUCUACCUGGCUUUGGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGCCAUUUCCUGAUCG

AGGGGGACCUUAACCCGGAUAACUCGGAUGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAAACG

UAUAACCAACUGUUUGAGGAAAAUCCCAUCAACGCUUCGGGGGUGGACGCCAAAGCAAUCCU

CUCCGCGCGCCUGAGCAAGUCACGGCGGCUCGAAAACCUGAUCGCGCAGCUGCCGGGAGAAA

AGAAAAAUGGACUGUUUGGGAAUCUGAUCGCGCUGUCGCUCGGCCUGACUCCAAACUUUAAG

UCAAAUUUCGAUUUGGCCGAAGAUGCCAAGCUGCAGCUGUCAAAGGACACUUACGACGACGA

CCUGGACAAUCUGCUGGCCCAGAUUGGGGACCAAUACGCAGACCUGUUCUUGGCCGCGAAGA

ACCUGAGCGACGCCAUUCUUCUGUCCGAUAUUCUGAGAGUCAAUACCGAAAUCACUAAGGCU

CCGCUGUCCGCUUCAAUGAUCAAGCGCUACGAUGAACACCACCAGGAUCUCACUCUGCUCAA

AGCCCUCGUGAGACAACAAUUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGAGCAAAA

ACGGCUACGCAGGCUACAUCGAUGGAGGAGCGUCACAAGAAGAGUUCUACAAGUUCAUCAAG

CCAAUCUUGGAGAAGAUGGACGGUACUGAAGAACUCCUUGUGAAGCUGAAUAGGGAGGAUUU

GCUCAGAAAGCAGCGGACUUUUGACAACGGCUCGAUCCCUCAUCAGAUUCACCUCGGUGAGC

UGCAUGCCAUCCUUCGGCGCCAAGAGGAUUUUUACCCCUUCCUGAAGGAUAAUCGCGAGAAA

AUCGAAAAGAUCCUGACGUUCAGAAUUCCCUACUACGUGGGACCGCUGGCGCGCGGUAACUC

GCGGUUUGCAUGGAUGACUCGCAAGUCAGAGGAAACUAUCACUCCUUGGAAUUUUGAGGAGG

UCGUCGAUAAGGGAGCCUCCGCCCAGUCAUUCAUCGAACGCAUGACCAACUUCGACAAGAAU

CUUCCGAACGAGAAGGUCCUUCCAAAGCACUCCCUGUUGUACGAAUACUUCACCGUGUACAA

UGAGCUGACCAAAGUUAAGUAUGUCACCGAGGGCAUGAGAAAGCCGGCCUUCCUCAGCGGCG

AACAAAAGAAGGCCAUCGUCGACCUCCUCUUCAAGACCAACCGGAAGGUGACCGUCAAGCAA

CUCAAGGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUUGACUCGGUCGAAAUCAGCGGAGUGGA

GGACCGGUUUAACGCGUCACUGGGUACCUACCAUGAUCUCCUGAAAAUCAUCAAAGACAAGG

ACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAGGACAUCCUGGAAGAUAUUGUGUUGACCCUGACGCUG

UUCGAGGACCGGGAAAUGAUCGAGGAAAGGCUUAAGACCUACGCACACCUCUUCGAUGACAA

AGUGAUGAAGCAACUGAAGCGGCGGAGAUAUACUGGCUGGGGGAGGCUCUCCCGGAAGCUCA

UUAAUGGAAUCAGAGACAAACAGUCGGGUAAAACUAUCCUCGACUUCCUCAAGUCGGAUGGG

UUCGCCAACCGGAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGAUGAUUCCUUGACCUUCAAGGAAGAUAU

CCAGAAGGCGCAAGUGAGCGGACAGGGAGAUUCGUUGCACGAACAUAUCGCUAAUCUCGCCG

GAUCCCCAGCCAUCAAGAAAGGAAUCCUGCAGACCGUGAAGGUGGUGGAUGAACUGGUGAAA

GUGAUGGGGCGCCACAAACCAGAGAACAUCGUCAUUGAGAUGGCCCGCGAGAAUCAGACCAC

UCAGAAGGGACAAAAGAACUCCAGAGAGCGGAUGAAACGCAUCGAGGAAGGCAUCAAAGAGC

UUGGUAGCCAAAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAGAACACCCAGCUCCAGAACGAAAAGCUU

UACCUGUACUACCUCCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUCGACCAGGAAUUGGACAUCAACAG

ACUCAGCGACUACGAUGUGGACCAUAUUGUGCCACAGUCCUUUCUUAAGGACGACAGCAUCG

AUAACAAAGUGCUCACUAGAUCAGACAAAAAUCGCGGGAAAUCAGACAAUGUGCCAUCGGAA

GAGGUUGUCAAGAAGAUGAAAAACUACUGGAGACAGCUGCUCAAUGCCAAACUUAUCACCCA

GCGGAAGUUCGACAACCUUACCAAGGCCGAGCGCGGAGGAUUGUCCGAACUCGACAAGGCCG

GCUUCAUCAAAAGGCAGCUGGUGGAAACCCGGCAGAUCACUAAACACGUGGCCCAGAUCCUC

GAUUCGCGCAUGAACACUAAAUACGAUGAGAAUGACAAGCUGAUUAGGGAAGUCAAGGUCAU

CACUCUGAAGUCGAAACUGGUGUCGGACUUUAGAAAGGAUUUCCAGUUCUACAAAGUCCGCG

AGAUUAACAACUACCACCACGCUCAUGACGCCUACCUGAAUGCAGUUGUGGGCACCGCGCUG

AUCAAGAAGUAUCCGAAGCUGGAAUCCGAGUUCGUGUACGGAGAUUACAAAGUGUACGACGU

GCGCAAGAUGAUCGCCAAGUCGGAACAGGAAAUCGGAAAGGCUACUGCAAAGUACUUCUUCU

ACUCAAACAUCAUGAACUUCUUCAAAACGGAGAUCACGCUCGCGAACGGCGAAAUCCGGAAA

AGGCCGCUCAUUGAAACCAACGGAGAAACCGGGGAGAUCGUGUGGGACAAGGGAAGGGAUUU

UGCGACUGUGAGGAAGGUGUUGUCCAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAAAAGACGGAAGUGC

AAACCGGAGGAUUCAGCAAAGAAUCCAUCCUCCCAAAGCGCAACUCGGACAAACUCAUCGCG

CGCAAGAAGGAUUGGGACCCCAAGAAAUACGGUGGCUUUGACAGCCCUACUGUGGCUUACUC

CGUCCUCGUCGUGGCUAAAGUGGAAAAGGGUAAAUCCAAAAAGCUCAAAUCGGUGAAGGAGC

UCCUGGGAAUCACGAUCAUGGAGCGGUCGAGCUUCGAAAAGAAUCCUAUUGAUUUCCUGGAG

GCGAAGGGCUACAAGGAAGUCAAGAAAGACCUGAUCAUCAAGCUCCCGAAGUACAGCCUCUU

CGAGCUCGAAAACGGCAGAAAGAGGAUGCUGGCAUCAGCGGGAGAAUUGCAGAAGGGAAACG

AACUGGCACUGCCGUCCAAGUACGUGAAUUUUCUCUAUCUGGCUAGCCACUACGAAAAGCUG

AAGGGAUCGCCCGAGGACAACGAGCAAAAACAACUGUUCGUGGAGCAGCACAAGCACUACCU

GGAUGAGAUCAUCGAGCAGAUCUCCGAAUUCUCGAAACGCGUGAUCCUUGCCGAUGCCAAUC

UGGAUAAAGUGUUGUCGGCUUACAACAAGCAUCGGGAUAAACCGAUCCGCGAACAGGCAGAA

AACAUCAUUCAUCUGUUCACUUUGACCAAUCUGGGAGCGCCUGCCGCGUUUAAGUACUUCGA

CACCACUAUUGAUAGAAAGCGCUACACCUCGACCAAGGAAGUGCUGGACGCUACCCUGAUCC

ACCAGUCCAUCACCGGACUCUACGAAACUCGCAUUGACCUGUCCCAGCUUGGAGGAGAUUCA

CGGGCCGAUCCAAAGAAAAAGCGCAAGGUCUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCU

UCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUC

UUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC+A(140nt) cola (SEQ ID NO:55)

Secuencia de ARNm de Cas9(Cong)

GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGACUACAAGGAC

CACGACGGAGACUACAAAGACCAUGACAUCGAUUACAAGGAUGACGAUGACAAAAUGGCACC GAAGAAGAAGAGAAAGGUCGGAAUUCACGGGGUGCCGGCCGCGGACAAGAAGUACUCAAUCG GACUGGAUAUCGGCACGAACAGCGUGGGUUGGGCAGUGAUCACCGACGAAUACAAGGUGCCG AGCAAGAAGUUCAAAGUGCUGGGAAAUACCGAUCGCCAUUCGAUCAAGAAAAAUCUGAUUGG CGCGCUCCUGUUCGACUCGGGAGAGACUGCCGAGGCCACUAGACUGAAGAGGACCGCUAGGC GCCGCUACACGAGGCGCAAAAACCGCAUCUGCUAUCUUCAAGAAAUCUUCUCAAACGAGAUG GCCAAGGUGGACGACUCCUUUUUCCAUCGGCUGGAAGAAUCAUUUCUGGUGGAGGAGGACAA GAAGCACGAACGCCAUCCCAUUUUCGGCAACAUUGUCGACGAAGUGGCCUAUCAUGAGAAGU AUCCGACUAUCUACCACUUGAGAAAGAAGCUGGUGGACUCCACUGACAAGGCAGAUCUGCGG UUGAUCUACCUCGCACUGGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGGGGACACUUCCUCAUCGAGGGCGA CCUUAAUCCCGACAAUUCCGAUGUGGAUAAGCUUUUCAUCCAGCUGGUCCAGACCUACAACC AACUGUUUGAAGAAAAUCCAAUCAAUGCGAGCGGUGUCGAUGCAAAGGCCAUCCUGAGCGCC CGCCUCUCGAAAAGCAGAAGGCUCGAAAACCUGAUCGCACAGUUGCCUGGAGAGAAGAAGAA CGGCCUCUUCGGCAAUCUCAUCGCAUUGUCCCUGGGACUGACUCCAAACUUCAAAUCCAACU UCGACUUGGCCGAGGACGCCAAACUGCAACUGAGCAAAGAUACCUACGAUGAUGACUUGGAC AAUCUUCUGGCUCAGAUCGGCGACCAGUACGCCGACCUGUUCCUUGCGGCUAAGAACCUGUC GGACGCCAUCCUGCUGUCCGACAUCCUGCGCGUCAAUACCGAAAUUACUAAAGCACCACUCU CGGCAUCCAUGAUCAAGAGAUACGAUGAACACCACCAGGAUCUCACCCUCCUGAAAGCACUG GUGCGGCAGCAGCUCCCUGAGAAAUACAAGGAAAUCUUCUUUGAUCAGUCCAAGAACGGAUA CGCCGGAUACAUCGACGGCGGCGCGAGCCAAGAGGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCC UGGAAAAGAUGGAUGGCACGGAAGAACUCCUGGUCAAACUGAAUAGAGAGGAUCUGCUCCGC AAACAACGGACCUUCGAUAACGGAUCGAUCCCGCACCAGAUCCACCUCGGCGAACUGCAUGC CAUCCUGCGGCGGCAGGAGGACUUUUACCCGUUCCUCAAAGACAACAGAGAAAAGAUCGAGA AGAUCUUGACCUUUCGCAUCCCGUACUACGUGGGCCCGCUCGCGAGAGGUAACUCCCGCUUU GCUUGGAUGACUAGAAAGUCAGAGGAAACGAUCACCCCAUGGAACUUCGAAGAGGUGGUUGA CAAAGGAGCGAGCGCCCAAUCGUUCAUCGAACGGAUGACUAACUUCGAUAAGAAUCUGCCGA AUGAGAAGGUCCUGCCUAAGCACUCACUUCUGUAUGAAUACUUUACUGUGUAUAACGAACUC ACCAAAGUCAAAUACGUGACUGAGGGAAUGCGCAAGCCUGCGUUUUUGUCCGGCGAGCAGAA AAAGGCCAUCGUGGACUUGCUGUUCAAAACCAACCGCAAGGUGACUGUUAAGCAACUCAAAG AGGACUACUUUAAGAAGAUCGAAUGCUUUGACUCGGUCGAGAUUUCCGGGGUUGAAGAUAGA UUCAACGCGUCGCUGGGAACCUACCAUGAUCUCCUCAAGAUUAUCAAGGACAAAGACUUCCU GGAUAACGAGGAGAAUGAGGACAUCCUCGAAGAUAUUGUGCUUACCCUGACCCUUUUCGAAG AUCGCGAAAUGAUCGAAGAACGCCUGAAAACCUACGCUCACCUGUUCGACGAUAAGGUGAUG AAACAGUUGAAACGCCGGCGGUACACGGGUUGGGGGCGGCUGUCGCGCAAGCUGAUCAACGG AAUUCGGGACAAACAGAGCGGAAAGACCAUCCUCGAUUUUCUGAAGUCCGAUGGUUUUGCCA ACCGCAACUUCAUGCAGCUCAUCCAUGACGAUUCGCUUACCUUUAAGGAGGAUAUCCAGAAG GCACAAGUGUCGGGACAAGGGGAUUCGCUCCACGAACACAUCGCCAAUCUGGCGGGGUCGCC GGCAAUUAAGAAGGGAAUCCUCCAGACUGUUAAGGUGGUCGACGAGCUGGUGAAGGUGAUGG GGAGACAUAAGCCUGAAAACAUUGUGAUCGAGAUGGCGAGAGAAAAUCAAACUACUCAGAAG GGACAGAAGAAUUCCCGGGAGCGGAUGAAGCGCAUCGAGGAGGGAAUCAAGGAACUGGGCUC CCAAAUCCUGAAAGAGCAUCCCGUGGAAAAUACUCAGCUGCAGAACGAGAAGCUUUACCUGU ACUAUCUUCAAAAUGGCAGGGACAUGUACGUCGACCAAGAACUGGAUAUCAAUCGGCUCUCC GAUUACGACGUCGAUCACAUCGUCCCCCAAUCAUUCCUGAAGGAUGAUAGCAUCGAUAACAA GGUGCUCACUAGAUCAGACAAAAACCGGGGAAAGUCAGAUAACGUCCCCAGCGAAGAAGUCG UGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGAGGCAACUUCUGAACGCCAAACUCAUCACUCAGCGCAAG UUCGACAACCUGACCAAAGCAGAAAGGGGAGGACUCAGCGAGCUGGACAAGGCUGGUUUCAU CAAACGGCAGCUGGUGGAGACUCGCCAAAUCACGAAGCAUGUGGCCCAGAUUCUCGACUCGC GCAUGAAUACUAAGUACGACGAAAACGAUAAGCUGAUCCGGGAGGUGAAGGUGAUCACCCUC AAGAGCAAGCUCGUGUCCGAUUUCCGGAAAGACUUCCAGUUCUACAAGGUGCGGGAGAUUAA CAACUACCAUCACGCUCACGACGCUUACCUCAAUGCUGUGGUGGGGACGGCGUUGAUUAAGA AGUACCCAAAACUGGAGUCCGAAUUCGUCUACGGAGAUUACAAGGUCUACGACGUGCGCAAG AUGAUUGCCAAGUCGGAGCAGGAAAUUGGGAAAGCGACUGCUAAGUACUUCUUCUACUCGAA

UAUCAUGAACUUCUUCAAGACCGAAAUCACCCUGGCUAACGGCGAGAUCAGGAAACGGCCGC

UGAUCGAAACUAAUGGUGAGACUGGUGAAAUCGUGUGGGAUAAGGGACGGGACUUCGCCACG

GUCCGCAAGGUCCUCAGCAUGCCGCAAGUGAAUAUUGUUAAGAAAACCGAAGUGCAGACCGG

UGGGUUCUCGAAGGAAUCCAUCCUGCCAAAGCGCAACUCGGAUAAGCUUAUUGCCCGCAAGA

AGGAUUGGGACCCGAAAAAGUACGGUGGGUUCGACUCCCCUACCGUGGCGUACUCGGUGUUG

GUGGUGGCCAAAGUGGAAAAGGGCAAAUCAAAGAAGCUCAAGAGCGUCAAGGAGCUGCUGGG

AAUCACCAUCAUGGAGAGGUCCAGCUUUGAGAAAAACCCGAUCGACUUCUUGGAAGCCAAGG

GAUACAAAGAGGUGAAGAAAGACCUGAUCAUCAAACUUCCAAAGUACUCCCUGUUCGAACUC

GAAAACGGGAGGAAGCGCAUGCUCGCCUCAGCCGGGGAACUGCAAAAGGGCAACGAACUGGC

CCUCCCGUCAAAAUACGUCAACUUCCUGUACUUGGCGUCACACUACGAAAAGCUGAAAGGAU

CCCCAGAGGACAACGAACAGAAACAGCUGUUCGUCGAGCAGCACAAGCACUACCUGGACGAG

AUCAUCGAACAGAUCUCGGAAUUCAGCAAGAGAGUGAUCUUGGCAGACGCUAACCUUGACAA

AGUCCUCUCGGCAUACAAUAAGCAUCGCGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCGGAGAACAUCA

UCCACCUGUUCACUCUCACCAACCUGGGCGCGCCAGCGGCUUUUAAGUACUUUGAUACCACC

AUUGACCGCAAGAGAUACACCUCAACUAAAGAAGUGCUGGACGCAACCCUGAUCCAUCAAAG

CAUCACCGGACUUUAUGAAACUCGGAUCGAUCUCUCACAGCUCGGAGGAGACAAAAGACCGG

CUGCCACCAAGAAGGCCGGACAGGCAAAGAAGAAGAAAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUG

GCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCC

CCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC+A(14Ont) cola (SEQ ID NO:56)

ARNsg de VEGF V1

GGGTGTGCAGACGGCAGTCACTAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTA

GTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO:91)

ARNsg de VEGF V2

GGGTGAGTGAGTGTGTGCGTGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAG

TCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO:92)

ARNsg de VEGF V3

GGGTGAGTGAGTGTGTGCGTGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAG

TCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO:93)

ARNsg de VEGF V4

GGGTTGGAGCGGGGAGAAGGCCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTA

GTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC (SEQ ID NO:94)

Expresión in vitro de proteínas relacionadas con CRISPR a partir de construcciones de ARNm

Se transfectaron células HeLa con varios ARNm de dCas9 marcados y los extractos celulares se sometieron a análisis Western, Inmunoprecipitación y LC/MS para detectar la expresión de la proteína expresada por dichos ARN.

Una construcción de ARNm de Cas9 etiquetada con FLAG que contiene Cong Cas9 (SEQ ID NO: 55), una construcción de ARNm de Cas9 sin etiquetar que contiene Mali Cas9 (SEQ ID NO: 56), una construcción dCas9 etiquetada con HA que contiene Gilbert dCas9 (SEQ ID NO: 55), una construcción dCas9 etiquetada con FLAG que contenía Maeder dCas9 (SEQ ID NO: 52) y una construcción Trilink Cas9 etiquetada con HA (Trilink) se transfectaron en células HeLa de acuerdo con el siguiente protocolo:

3 x ^{1 0 6} células HeLa se sembraron en placas de 10 cm el día anterior a la transfección. Se diluyeron 30 ^l de Lipofectamina 2000 en un tubo que contenía 200 ^l de Opti-MEM para cada muestra a transfectar y se mantuvo a temperatura ambiente durante 2-5 minutos. Se diluyeron 7,5 ^g de ARNm de Cas9 en otro tubo que contenía 200 ^l de Opti-MEM. A continuación, las dos diluciones se combinaron para cada muestra y se mezclaron. Se dejó reposar la solución final a temperatura ambiente durante 20-25 minutos antes de que la solución de transfección se superpusiera sobre las células HeLa sembradas.

Después de siete horas postransfección, las células se lisaron con tampón de lisis en presencia de inhibidores de proteasa 1x HALT (Pierce). La proteína de los lisados celulares se aisló y se reservó para ensayos Western, inmunoprecipitación o LC-MS.

Para la inmunoprecipitación, se añadieron lisados normalizados para la concentración de proteína a perlas de agarosa Sigma M2 y se lavaron. La inmunoprecipitación se realizó a 4 °C durante la noche. A continuación, las perlas se lavaron y se resuspendieron en tampón de muestra de proteína IX LDS. A continuación, las muestras se procesaron en un gel Bis-Tris al 4-12 % con biffer MES (Life Technologies) usando patrones de proteínas preteñidas See BluePlus 2™ (Life Technologies). La nitrocelulosa se bloqueó con leche al 5 % en PBS durante una hora, a continuación se secó con anti-FLAG (Cell Signaling Technologies) 1:2000 (Figura 2) o anti-HA 1:1000 (Covance HA. 11 ascitis) (Figura 3) en PBS Tween al 0,05 % durante 4 horas durante la noche a 4 °C. A continuación, las membranas se lavaron e incubaron con anti-conejo (Sigma) o anti-ratón (Sigma) conjugado con HRP durante 45 minutos a temperatura ambiente y se detectaron con Pierce Super Signal West Femto (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se detectó proteína Cong Cas9-FLAG en células HeLa transfectadas con ARNm de Cong Cas9-FLAG (SEQ ID NO: 55) vía anti-FLAG western directo e inmunoprecipitación anti-FLAG western (Figura 2). La proteína Maeder Cas9-FLAG se detectó en células HeLA transfectadas con ARNm de Maeder Cas9-FLAG (SeQ ID NO: 52) mediante inmunoprecipitación anti-FLAG western (Figura 2). Tanto Mali Cas9 como Gilbert Cas9-HA no tenían un dominio FLAG y, por lo tanto, no aparecieron en la inmunoprecipitación o en el western anti-FLAG (Figura 2).

Se detectó la proteína Gilbert dCas9-HA en células HeLA transfectadas con ARNm de Gilbert dCas9-HA (SEQ ID NO: 51) via western anti-HA directo (Figura 3). Se utilizó Trilink Cas9-HA como control positivo para la expresión de dCas9. Los extractos de proteínas de células HeLa transfectadas con ARNm de Gilbert dCas9-HA (SEQ ID NO: 51) y Maeder dCas9-FLAG (SEQ ID NO: 52) se analizaron para determinar la expresión de proteínas de las construcciones Cas9 mediante la cuantificación del péptido LC-PRM y se compararon con extractos de proteína de células HeLa de control sin tratar.

Todos los disolventes eran de grado HPLC de Sigma-Aldrich y todos los productos químicos, cuando no se indica lo contrario, se obtuvieron de Sigma-Aldrich.

Las muestras se prepararon en tampón de lisis celular que contenía urea 8 M y bicarbonato amónico 0,1 M. Se llevaron a cabo ensayos de BCA para determinar el contenido de proteína total. Las muestras con 30 pg de proteína se redujeron y se digirieron durante la noche con tripsina. La limpieza de C18 para espectrometría de masas se llevó a cabo utilizando columnas MICROSpin™ (The Nest Group) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los péptidos se secaron y se volvieron a disolver en 30 pl hasta la concentración final de 1 pg/pl en disolvente LC A (acetonitrilo al 1 % en agua con ácido fórmico (FA) al 0,1 %) que contenía una mezcla de péptidos de control para la calibración del tiempo de retención.

Los péptidos (1 pg por muestra) se analizaron en columnas de cromatografía C18 en un sistema de cromatografía nano-líquida Thermo Scientific Easy nLC para todos los análisis espectrométricos de masas. Los disolventes de LC fueron A: acetonitrilo al 1 % en agua con FA al 0,1 %; B: 3 % de agua en acetonitrilo con 0,1 % de FA (elución en gradiente).

Las pruebas de LC-MS/MS para el descubrimiento de péptidos se llevaron a cabo en un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q Exactive™ equipado con una fuente de nanoelectropulverización estándar.

La LC-PRM se llevó a cabo usando una lista de inclusión predeterminada que contenía masas de precursores de péptidos diana en un espectrómetro de masas Thermo Scientific Q Exactive™ equipado con una fuente de nanoelectropulverización estándar como se describió anteriormente (elución en gradiente).

El gradiente de LC para LC-PRM fue 5-35 % de disolvente B en 50 minutos seguido de 35-100 % de B en 2 minutos y 100 % de B durante 8 minutos (la duración total del gradiente fue de 60 minutos).

Los conjuntos de datos de LC-MS/MS se analizaron utilizando el paquete de software MaxQuant y se realizaron búsquedas en la base de datos UniProt HUMAN y otras bases de datos. Para todos los péptidos de proteínas diana que se detectaron con éxito en LC-MS/MS, se generaron ensayos de LC-PRM utilizando los iones de fragmentos más intensos del análisis de LC-MS/MS. Se seleccionaron los 10 ensayos más intensos.

Los datos se procesaron utilizando el software SpectroDive™ (Biognosys) para el análisis de datos de LC-MRM y LC-PRM basados en mProphet (Reiter, Rinner y col., Nature Methods 8 (2011), 430-435). Se cuantificaron 10 péptidos que representan proteínas de mantenimiento en cada muestra para evaluar la carga de la muestra en la columna. La cuantificación relativa de los segmentos peptídicos de Cas9 se llevó a cabo para cada uno de los extractos de proteínas mediante LC-PRM. La cuantificación de los segmentos de péptidos Cas9: "GNELALPSK" (SEQ ID NO: 120), "YFDTTIDR" (SEQ ID NO: 121) e "IPYYVGPLAR" (SEQ ID NO: 122) se muestra en las Figuras 4A, 4B y 4C, respectivamente. La Tabla 2 muestra la cuantificación relativa para cada uno:

Tabla 2- Cuantificación de péptidos LC-PRM Cas9 en muestras de lisado celular

In vivo

A los ratones (n = 1) (hembra BalbC de 8 semanas de edad) se les administraron 350 ul por vía intravenosa de 0,04 mg/ml (14 pg) de ARNm de FLAG-Cas9 Cong como se describe en la SEQ ID NO: 55_ (cola de poliA de aproximadamente 140 nucleótidos no mostrado en secuencia; 5'capa, Capal; totalmente modificado con 1-metilpseudouridina) formulado en una nanopartícula lipídica que comprende el lípido DLin-MC3-DMA descrito en la Tabla 3 o un control de PBS (simulacro).

Tabla 3. Formulación de nano artículas li ídicas

6 horas después de la administración, los ratones se sacrificaron humanitariamente. Se recogieron los hígados de los ratones y se determinó la expresión de Cas9 mediante inmunoprecipitación como se describe en detalle a continuación. Se lisó tejido hepático en una formulación de lisador de tejidos en presencia de inhibidores de proteasa. La proteína se extrajo y se cuantificó usando un ensayo de proteína BCA (Pierce). Las muestras se normalizaron mediante cuantificación de proteína total. Se añadieron aproximadamente 88 mg de extracto de proteína a perlas de agarosa M2 (Sigma) para la inmunoprecipitación. Después de mezclar suavemente durante 3-4 horas a 4 °C, las perlas se apiraron y se lavaron con tampón RIPA para eliminar el sobrenadante. Se añadió tampón RIPA suplementado con 200pg/ml de péptido 3X FLAG (Sigma) a las perlas y se incubó a 4 °C durante 30 minutos con agitación a 1100 rpm en un termomezclador. A continuación, se realizó la elución del péptido centrifugando las perlas y eliminando el sobrenadante. Las muestras se incubaron a 72 °C durante 12 minutos en gel Bis Tris al 4-12 % usando tampón de corrida MES (LifeTech) junto con patrones de proteína preteñidos (LifeTech). El gel se transfirió a nitrocelulosa usando un aparato iBIot™ durante 6 minutos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se eliminó la membrana y se colocó en un recipiente adecuado para secar y se lavó 2x con ddhhO. A continuación, se bloqueó la nitrocelulosa durante 45 minutos con leche en polvo descremada al 5 % en PBS. A continuación, se transfirió nitrocelulosa con anti-M2 HRP a 1:15.000 en leche al 1 %, PBS, Tween al 0,05 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se eliminó la solución de anticuerpo primario y se lavó la nitrocelulosa con PBS Tween al 00,05 %. Los péptidos FLAG-Cas9 se detectaron con Pierce Super Signal Femto™. A continuación, se expuso la membrana de nitrocelulosa para la formación de imágenes.

Los resultados de la inmunoprecipitación se muestran en la Figura 5. Como se muestra en la Figura 5, una banda está presente a 150 kD sólo en la muestra de LNP Cas9 y no en la muestra tratada con control de PBS. Estos datos proporcionan evidencia de la expresión de la proteína Cas9 a partir de ARNm sintético formulado con LNP in vivo in vivo en ratones a los que se les administró Cas9-LNP.

Ejemplo 12: Modulación in vitro de la transcripción con polinucleótidos sintéticos que codifican proteínas de fusión dCas9-efectoras y ARNsg sintético

VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), uno de los factores angiogénicos más potentes, se ha identificado recientemente como un inductor de neoangiogénesis en muchos tumores, incluidos los gliomas. U-87 MG y A-172 son dos líneas celulares de glioblastoma establecidas. La expresión basal de VEGF fue un orden de magnitud mayor en U-87 MG en comparación con A-172. (Int J Dev Neurosci. 1999 Ago-Oct;17(5-6):565-77). Esto proporciona un sistema para probar la regulación génica por dCas9-KRAB y dCas9-VP64 con ARNsg dirigido a la secuencia genómica flanqueante 5' de VEGF.

Inhibición de la transcripción con dCas9-KRAB

Gilbert 2013 describió la regulación hacia abajo de genes utilizando la proteína de fusión dCas9-kRAB. KRAB es una categoría de dominios de represión transcripcional presentes en aproximadamente 400 factores de transcripción basados en proteínas con dedos de zinc humanos (proteínas con dedos de zinc KRAB) (Huntley 2006). Se ha demostrado que los dominios KRAB son represores efectivos de la transcripción.

La línea celular U-87MG produce VEGF endógeno. El polinucleótido sintético dCas9-kRAB junto con los 4 ARNsg sintéticos dirigidos a VEGF descritos anteriormente se utilizan para inhibir la transcripción de un gen VEGF en células U-87MG. Se utiliza el siguiente protocolo experimental.

1. Los U-87MG se mantienen en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) en FBS al 10 %, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de estreptomicina y 100 mg/ml de penicilina.

2. Todas las transfecciones se realizan por triplicado usando Lipofectamine y usando el protocolo de transfección descrito en la publicación de patente de EE.UU. US 2013/0259924 (Solicitud de patente EE. UU. n.° 13/791,922, depositada el 9 de marzo de 2013).

3. Se siembran 160.000 células en placas de 24 pocillos el día antes de la transfección.

4. Transfectar células U-87MG con 100 ng de ARNm dCas9-KRAB y 100 ng de ARNsg de VEGF VI-V4. Para experimentos de sinergia, transfectar 100 ng de ARNm dCas9-KRAB con 25 ng de cada uno de los ARNsg de VEGF V1-V4 (un total de 100 ng de cuatro ARNsg de VEGF diferentes)

5. Incubar las células durante 8 horas y lavar las células para eliminar el agente de transfección.

6. Continuar incubando células en DMEM

7. El medio de cultivo de U-87MG transfectado con ARNm que codifica ARNg dirigido a VEGFA y dCas9-KRAB se recogió 0 h, 12 h, 24 h, 48 h después de la transfección.

8. La expresión de la proteína VEGFA se mide mediante ELISA.

La introducción de polinucleótidos sintéticos que codifican dCas9-KRAB con ARNsg dirigido a la secuencia genómica de VEGF inhibe la transcripción de VEGF en comparación con las células no tratadas.

Activación de la transcripción con dCas9-VP64

Maeder 2013 y Perez-Pinera 2013 describen un activador transcripcional guiado por ARN, creado al fusionar dCas9 (D10A, H840A) con el dominio de transactivación de VP64. DCas9-VP64 reconoce sitios diana genómicos a través de la hibridación de un ARNsg con una secuencia diana.

La línea celular HEK293 produce VEGF endógeno. El polinucleótido sintético dCas9-VP-64 junto con los 4 ARNsg sintéticos dirigidos a VEGF descritos anteriormente se utilizan para activar la transcripción de un gen VEGF en células HEK293. Se utiliza el siguiente protocolo experimental.

1. Las células HEK293 se mantienen en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) en FBS al 10 %, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de estreptomicina y 100 mg/ml de penicilina.

2. Todas las transfecciones se realizan por triplicado usando Lipofectamina y usando el protocolo de transfección descrito en la publicación de patente de EE.UU. US 2013/0259924 (Solicitud de patente EE. UU. n.° 13/791.922, depositada el 9 de marzo de 2013).

3. Se siembran 160.000 células en placas de 24 pocillos el día antes de la transfección.

4. Las células HEK293 se transfectan con 100 ng de ARNm de dCas9-VP64 y 100 ng de ARNsg de VEGF V1-V4. Para experimentos de sinergia, transfectar 100 ng de ARNm de dCas9- VP64 con 25 ng de cada uno de los ARNsg de VEGF V1-V4 (un total de 100 ng de cuatro ARNsg de VEGF diferentes)

5. Incubar las células durante 8 horas y lavar las células para eliminar el agente de transfección.

6. Continuar incubando células en DMEM.

7. El medio de cultivo de HEK293 transfectado con ARNm que codifica ARNsg dirigido a VEGFA y dCas9- VP64 se recogió 0 h, 12 h, 24 h, 48 h después de la transfección.

8. La expresión de la proteína VEGFA se mide mediante ELISA.

9. El ARNm de VEGFA se mide mediante RT-PCR o Taqman o Q-PCR

La introducción de polinucleótidos sintéticos que codifican dCas9- VP64 con ARNsg dirigido a la secuencia genómica de VEGF activa la transcripción de VEGF en células HEK293 en comparación con las células no tratadas.

Ejemplo 13: Modulación específica de tejido de la expresión de proteínas in vitro

miR-122 está presente en hepatocitos humanos primarios y no está presente en líneas celulares de carcinoma hepatocelular como las células HepG2, Hep3B y SK-Hep-1. Se ha demostrado que miR-122 puede regular hacia abajo la producción de proteína codificada por un ARNm que contiene sitios de unión de miR-122 en la 3 'UTR en hepatocitos primarios, pero no en HepG2 y Hep3B.

Los hepatocitos primarios y las células HepG2 se transfectan con polinucleótidos sintéticos dCas9-KRAB, dCas9-KRAB-miR122, dCas9-VP64, dCas9-VP64-miR122 junto con una combinación de los cuatro ARNsg sintéticos dirigidos a VEGF.

La transfección de hepatocitos primarios se realiza como se describe en esta invención. Las tablas 4 y 5 proporcionan los resultados.

Tabla 4: Resultados de la transfección rimaria de he atocitos.

La transfección de células HEpG2 se realiza como se describe en esta invención. La siguiente tabla proporciona los resultados.

Tabla 5: Resultados de la transfección de HE G2.

Ejemplo 14: Modulación de la expresión de proteínas in vivo con dCas9

L a a d m in is tra c ió n d e p o lin u c le ó t id o s s in té t ic o s q u e c o d if ic a n p ro te ín a s d e fu s ió n e fe c to ra s d C A S 9 y A R N s g s in té tic a s q u e se d ir ig e n a un g e n d e in te ré s p a ra e l h íg a d o u s a n d o u n a fo rm u la c ió n d e p a r t íc u la s d e líp id o -á c id o n u c le ic o se re a liz a s ig u ie n d o lo s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s e n la p u b lic a c ió n d e p a te n te d e E E .U U . n .° U S 2013 /0259924 (s o lic itu d d e p a te n te E E . U U . n .° 13 /791.922 , d e p o s ita d a e l 9 d e m a rz o d e 2013 ). L a a d m in is tra c ió n d e p o lin u c le ó t id o s s in té tic o s q u e c o d if ic a n p ro te ín a s d e fu s ió n e fe c to ra s d C A S 9 y A R N s g s in té t ic a s q u e s e d ir ig e n a un g e n d e in te ré s p a ra c é lu la s m u s c u la re s v ia in y e c c ió n in t ra m u s c u la r s e re a liz a s ig u ie n d o lo s p ro c e d im ie n to s d e s c r ito s e n la p u b lic a c ió n d e p a te n te d e E E .U U . n .° U S 2013 /0259924 (s o lic itu d d e p a te n te E E . U U . n .° 13 /791.922 , d e p o s ita d a e l 9 d e m a rz o d e 2013 ).

a.Inhibición in vivo de la transcripción del gen TPO con dCas9-KRAB

L a tro m b o p o y e t in a (T P O ) e s p ro d u c id a p r in c ip a lm e n te p o r e l h íg a d o . L o s p o lin u c le ó t id o s s in té t ic o s q u e c o d if ic a n d C a s 9 -K R A B o d C a s 9 -K R A B -m iR 122 ju n to c o n A R N s g q u e s e d ir ig e n a la s e c u e n c ia f la n q u e a n te 5 ' d e t ro m b o p o y e t in a s e fo rm u la n en u n a fo rm u la c ió n d e l N p . S e a d m in is tra n d e 0 ,005 m g /k g a 0 ,5 m g /k g d e L N P fo rm u la d o c o n d C a s 9 -K R A B y A R N s g d e T P O p o r v ía in tra v e n o s a a ra to n e s . S e re c o g e n m u e s tra s d e s a n g re e h íg a d o a la s 8 h, 24 h, 48 h, 72 h d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n . E l n iv e l d e p ro te ín a T P O s e m id e m e d ia n te E L IS A y e l A R N m d e T P O s e m id e m e d ia n te R T -P C R o q -P C R .

C o n la s u p re s ió n m e d ia d a p o r d C a s 9 -K R A B c o n A R N g d e T P O , la e x p re s ió n d e A R N m y d e p ro te ín a d e T P O d is m in u irá . S in e m b a rg o , d e b id o a la p re s e n c ia d e m iR -122 , lo s g ru p o s tra ta d o s c o n A R N s g d C a s 9 -K R A B -m iR 122 T P O n o m o s tra rá n u n a re g u la c ió n h a c ia a b a jo v a d e la p ro d u c c ió n d e p ro te ín a T P O y e x p re s ió n d e A R N m .

b. Inhibición in vivo de la transcripción del gen indicador con dCas9-KRAB

S e c o a d m in is tra un p lá s m id o d e A D N e x ó g e n o q u e c o m p re n d e u n a m o lé c u la in d ic a d o ra , c o m o lu c ife ra s a , G F P o V E G F h u m a n o , y u n a s e c u e n c ia f la n q u e a n te 5 ' e s p e c íf ic a q u e c o n t ie n e s e c u e n c ia s d e A R N g d e V E G F V 1 -V 4 y un p ro m o to r c o n s t itu t iv a m e n te a c tiv o p a ra im p u ls a r la e x p re s ió n d e p ro te ín a s c o n el p o lin u c le ó t id o s is té t ic o q u e c o d if ic a d C a s 9 -K R A B /d C a s 9 -K R A B -m iR 122 y c o n lo s 4 A R N s g s in té t ic o s d ir ig id o s a V E G F . L o s p o lin u c le ó t id o s s e fo rm u la n y a d m in is tra n c o m o L N P c o m o s e d e s c r ib e en e s ta in v e n c ió n .

H a y u n a d is m in u c ió n en la e x p re s ió n d e la m o lé c u la in d ic a d o ra e n lo s g ru p o s tra ta d o s c o n A R N s g d C a s 9 -K R A B /V E G F . N o h a y u n a d is m in u c ió n s ig n if ic a t iv a e n la e x p re s ió n d e la m o lé c u la in d ic a d o ra en lo s g ru p o s tra ta d o s c o n A R N s g d C a s 9 -K R A B - m ir122 /V E G F .

c.Activación in vivo de la transcripción del gen LDHC con dCas9- VP64

P a ra d e m o s tra r la a c t iv a c ió n d e la tra n s c r ip c ió n y la e x p re s ió n d e p ro te ín a s u t i l iz a n d o p o lin u c le ó t id o s s in té t ic o s q u e c o d if ic a n d C a s 9 -V P 64 , s e d ir ig e n p ro te ín a s q u e no s e e x p re s a n t íp ic a m e n te e n e l h íg a d o . L a la c ta to d e s h id ro g e n a s a C (L D H C ) e s u n a e n z im a e s p e c íf ic a d e lo s te s t íc u lo s . L a a d m in is tra c ió n d e p o lin u c le ó t id o s in té t ic o fo rm u la d o c o n L N P q u e c o d if ic a d C a s 9 -V P 64 ju n to c o n A R N s g s in té tic o d ir ig id o a la s e c u e n c ia g e n ó m ic a 5 ' d e L D H C d e ra tó n in d u c e la e x p re s ió n d e L D H C e n e l h íg a d o . E l t ra n s c r ito d e A R N m d e L D H C s e m id e m e d ia n te R T -P C R o q P C R y la e x p re s ió n d e la p ro te ín a se m id e m e d ia n te E L IS A o W e s te rn b lo t. L a a d m in is tra c ió n d e p o lin u c le ó t id o s in té tic o fo rm u la d o co n L N P q u e c o d if ic a d C a s 9 -V P 64 -m iR 122 y A R N s g d ir ig id o a la s e c u e n c ia g e n ó m ic a 5 ' d e l L D H C d e ra tó n n o a c tiv a la e x p re s ió n d e L D H C d e b id o a la p re s e n c ia d e m iR -122 e n la s c é lu la s h e p á tic a s .

d. Activación in vivo de la transcripción del gen indicador con dCas9- VP64

S e c o a d m in is tra un p lá s m id o d e A D N e x ó g e n o q u e c o m p re n d e u n a m o lé c u la in d ic a d o ra , c o m o lu c ife ra s a , G F P o V E G F h u m a n o , y u n a s e c u e n c ia f la n q u e a n te 5 ' e s p e c íf ic a q u e c o n t ie n e s e c u e n c ia s d e A R N s g d e V E G F V 1 -V 4 y un p ro m o to r c o n s t itu t iv a m e n te in a c tiv o c o n e l p o lin u c le ó t id o s in té t ic o q u e c o d if ic a d C a s 9 -V P 64 /d C a s 9 -V P 64 -m iR 122 c o n e l A R N s g s in té tic o d ir ig id o a V E G F . H a y un a u m e n to e n la e x p re s ió n d e la m o lé c u la in d ic a d o ra en lo s g ru p o s t ra ta d o s c o n A R N s g d C a s 9 -V P 64 /V E G F . N o h a y un a u m e n to s ig n if ic a t iv o e n la e x p re s ió n d e la m o lé c u la in d ic a d o ra en g ru p o s tra ta d o s c o n A R N s g d C a s 9 -V P 64 -m ir122 /V E G F .

e. Modulación in vivo específica de tejido de la transcripción del gen LDHC

C o m o s e d e s c r ib e en e s ta in v e n c ió n , e l m ic ro A R N p u e d e p ro p o rc io n a r e s p e c if ic id a d d e te jid o . P a ra d e m o s tra r la s e le c t iv id a d t is u la r d e l s is te m a d C a s 9 u s a n d o m ic ro A R N 122 , un g ru p o d e ra to n e s s e d o s if ic a p o r v ía in tra v e n o s a y o tro g ru p o s e d o s if ic a p o r v ía in t ra m u s c u la r c o n p o lin u c le ó t id o s in té t ic o fo rm u la d o c o n L N P q u e c o d if ic a d C a s 9 -V P 64 -m ir122 y A R N s g s in té tic o d ir ig id o a L D H C . D e b id o a la p re s e n c ia d e m iR -122 e n la s c é lu la s h e p á tic a s , el p o lin u c le ó t id o s in té t ic o q u e c o d if ic a d C a s 9 -V P 64 n o s e e x p re s a rá ; p o r ta n to , n o h a b rá n in g u n a a c t iv a c ió n d e la e x p re s ió n d e L D H C m e d ia d a p o r d C a s 9 -V P 64. D a d o q u e la s c é lu la s m u s c u la re s n o c o n t ie n e n m iR -122 , e l g ru p o q u e re c ib e la in y e c c ió n in t ra m u s c u la r d e d C a s 9 -V P 64 -m iR 122 y A R N s g d e L D H C m o s tra rá la e x p re s ió n d e u n a p ro te ín a te s t ic u la r e s p e c íf ic a .

f. Modulación in vivo específica de tejido de la transcripción del gen indicador

O tro e je m p lo e s la c o a d m in is tra c ió n d e un p lá s m id o d e A D N d e s c r ito e n G ilb e r t y co l c o m o u n a d ia n a p a ra la s u p re s ió n g é n ic a d e d C a s 9 -K R A B . S e a d m in is tra un L N P fo rm u la d o q u e lle v a 1) p lá s m id o d e A D N S V 40 -G F P (d e s c r ito e n G ilb e r t y c o l), 2 ) A R N s g s g G F P -N T 1 (d e s c r ito e n G ilb e r t y c o l) y 3 ) A R N m q u e c o d if ic a d C a s 9 -K R A B o d C a s 9 -K R A B -m iR 122 v ía in tra v e n o s a a l h íg a d o , q u e c o n t ie n e m iR -122. E l g ru p o q u e re c ib e d C a s 9 -K R A B m o s tra rá u n a e x p re s ió n d e G F P re d u c id a e n c o m p a ra c ió n c o n e l g ru p o d e c o n tro l q u e n o re c ib ió A R N m d e d C a s 9 -K R A B c o m o m e d id a p o r c ito m e tr ía d e f lu jo o in m u n o h is to q u ím ic a p o rq u e la tra d u c c ió n d e d C a s 9 -K R A B n o s e re d u c irá p o r m iR 122. E l g ru p o q u e re c ib e d C a s 9 -K R A B -m iR 122 m o s tra rá u n a e x p re s ió n d e G F P s im ila r a la d e l g ru p o d e c o n tro l q u e n o re c ib e A R N m d e d C a s 9 -K R A B -m iR 122 d e b id o a la p re s e n c ia d e m iR -122 e n lo s h e p a to c ito s q u e in h ib e la tra d u c c ió n d e l A R N m d e d C a s 9 -K R A B -m iR 122. C o m p a ra r la a d m in is tra c ió n IM a la s c é lu la s m u s c u la re s q u e n o c o n t ie n e n m iR -122 , un L N P fo rm u la d o q u e lle v a 1) p lá s m id o d e A D N S V 40 -G F P (d e s c r ito e n G ilb e r t y c o l), 2 ) A R N s g s g G F P -N T 1 (d e s c r ito e n G ilb e r t y co l), y 3 ) E l A R N m q u e c o d if ic a d C a s 9 -K R A B o d C a s 9 -K R A B -m iR 122 s e a d m in is tra m e d ia n te in y e c c ió n IM . E s p e ra m o s v e r q u e lo s g ru p o s d C a s 9 -K R A B y d C a s 9 -K R A B -m iR 122 m u e s tre n la e x p re s ió n d e G P F e n la s c é lu la s m u s c u la re s c o m o m e d id a p o r c ito m e tr ía d e f lu jo o in m u n o h is to q u ím ic a .

O tro e je m p lo e s la c o a d m in is tra c ió n d e un p lá s m id o d e A D N d e s c r ito e n G ilb e r t y co l c o m o u n a d ia n a p a ra la a c t iv a c ió n g é n ic a d e d C a s 9 -V P 64. U n L N P fo rm u la d o q u e lle v a 1) p lá s m id o d e A D N G A L 4 U A S G F P (d e s c r ito e n G ilb e r t y co l), 2 ) A R N s g s g G A L 4 -1 (d e s c r ito e n G ilb e r t y c o l) y 3 ) A R N m q u e c o d if ic a d C a s 9 -V P 64 o d C a s 9 -V P 64 -m iR 122 se a d m in is tra v ía IV al h íg a d o . El g ru p o q u e re c ib e A R N m d e d C a s 9 -V P 64 m o s tra rá la e x p re s ió n d e G F P c o m o m e d id a p o r c ito m e tr ía d e f lu jo o in m u n o h is to q u ím ic a , m ie n tra s q u e e l g ru p o q u e re c ib e d C a s 9 -V P 64 -m iR 122 n o m o s tra rá e x p re s ió n d e G F P d e b id o a la p re s e n c ia d e m iR -122 e n lo s h e p a to c ito s q u e s u p r im e n la tra d u c c ió n d e d C a s 9 -V P 64 -A R N m d e m iR 122. P a ra c o m p a ra r la a d m in is tra c ió n IM a la s c é lu la s m u s c u la re s q u e n o c o n t ie n e n m iR -122 , un L N P fo rm u la d o q u e lle v a 1) p lá s m id o d e A D N G A L 4 U A S G F P (d e s c r ito e n G ilb e r t y co l), 2 ) A R N s g s g G A L 4 -1 (d e s c r ito en G ilb e r t y co l), y 3 ) E l A R N m q u e c o d if ic a d C a s 9 -V P 64 o d C a s 9 -V P 64 -m iR 12 s e a d m in is tra m e d ia n te in y e c c ió n IM . E s p e ra m o s v e r q u e lo s g ru p o s d C a s 9 -V P 64 y d C a s 9 -V P 64 -m iR 122 a c tiv e n la e x p re s ió n d e G P F e n la s c é lu la s m u s c u la re s c o m o m e d id a p o r c ito m e tr ía d e f lu jo o in m u n o h is to q u ím ic a .

Ejemplo 15: Uso de 3 sistemas de administración diferentes

S e u tiliz a u n a c o m b in a c ió n d e m e c a n is m o d e d ire c c ió n p a ra p e rm it ir u n a v e n ta n a d e s e g u r id a d s ig n if ic a t iv a c u a n d o s e a d m in is tra n p o lin u c le ó t id o s s in té t ic o s q u e c o d if ic a n u n a p ro te ín a re la c io n a d a c o n C R IS P R y A R N s g .

E n p r im e r lu g a r, s e d is e ñ a un p o lin u c le ó t id o s in té t ic o q u e c o d if ic a u n a p ro te ín a d e fu s ió n d e d o m in io d C A S 9 -e fe c to r u s a n d o u n a 3 'U T R d ir ig id a a m iR -142.3 p p a ra im p e d ir la e x p re s ió n e n A P C .

E n s e g u n d o lu g a r, e l p o lin u c le ó t id o s in té t ic o s e fo rm u la e n un L N P io n iz a b le q u e s e d ir ig e a la c a p ta c ió n m e d ia d a p o r L D L -R e n lo s h e p a to c ito s . E s to c o n d u c e a la e x p re s ió n d e la p ro te ín a d e fu s ió n d C A S 9 -d o m in io e fe c to r e n e l h íg a d o .

E n te rc e r lu g a r, e l A R N s g s in té tic o q u e s e d ir ig e al g e n h e p á t ic o d e in te ré s s e c o n ju g a , p o r e je m p lo , c o n un c o n ju g a d o d e G a lN a c o un re s to d e d ire c c io n a m ie n to s im ila r q u e e s a b s o rb id o p re fe re n te m e n te p o r lo s h e p a to c ito s . E l A R N s g s in té t ic o s e p u e d e a d m in is t ra r p o r s e p a ra d o y d e s p u é s d e un re tra s o d e 2 -3 h o ra s .

La combinación de mecanismos de dirección (en este caso 3: mir-3'UTR, LNP, GalNac) y la ausencia de ADN permitiría una ventana de seguridad significativa.

El resultado podría ser la activación transcripcional o la inhibición de cualquier proteína diana (nuestros primeros experimentos in vivo se centrarán en IHC para confirmar la localización de la fusión dCas9 en el hígado y lecturas funcionales utilizando indicadores como luciferasa y/o GFP.

OTRAS REALIZACIONES

Debe entenderse que las palabras que se han utilizado son palabras de descripción más que de limitación.

Si bien la presente invención se ha descrito con cierta extensión y con alguna particularidad con respecto a las diversas realizaciones descritas, no se pretende que deba limitarse a tales detalles o realizaciones o cualquier realización particular, sino que debe interpretarse con referencias a las reivindicaciones adjuntas para proporcionar la interpretación más amplia posible de tales reivindicaciones en vista de la técnica anterior y, por lo tanto, para abarcar efectivamente el alcance pretendido de la invención.

En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los títulos de las secciones, los materiales, los procedimientos y los ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Tablas de secuencia

Tabla 5: Proteínas relacionadas con CRISPR

^{H h U h » t) 4 t) < H t) < ti [5 <t t) O n < ti n H it !¡ <t «í B 4 < H q} O0O0OHU>HO<I<Í0[)r * r *HHCH< ^HHe' <0* tc« ^{<( 11 h H h ri}3 l i ) *<UU«ÍUC'HU»-< l5O •? CK5U O ( j t í h t - y U Ü H D U f l t P C l i í l i U l - r t u á l í l í H r t O U l i U O U O H t J U h i O o y rt < h IJ ^{U O U < U < 0 t i U U U í} H H m 3 ü < ( 5 ÜÜ U ^{i U 05 B t ' ¡ í l - 0 H I - O i í l < O t < Í } ‘! ¡ 3 h H O 3 ü O o o o l? (->} E - J ü < < 4 U Ü < 15 < O Ü < Ü Ü < Ü O < H U I < < < Ü «< o <U h es u 8_E-S_<Ea-S_<tB_-US_riü_;/Cy_Og_te_5Ha_U5_Uy_H§_'Í3_U<a_Uí_e j8_Oi_C2_JO!S_»<á_l-ü_»8_j;OS_t8_9US_ES_-O8_C5_>*E_TÍ_;y5_E8_-'3_*ti_U2_Cá_:eS_»e -s_*rB_t¡el_>¿_UH_UB_«¡ 8á t fg88g&888 ^ 88388 ! ; 5B £83838388888383 3S83SS ^{8' t ;S u5 o uS o3 e5 > <8 ua -s <S f í iS < j3 <3 u H5 e8 :8 H8 e >S <8 t CS 9K f i5 ¡ o3 o5 uS u o3 uS H8 uS t - rS ?8 e jS 5 <8 -S t ;8 H3 ^8 uS e8 <8 t -8 uÍ} P ^< uiü§ ^-t §hclm¡;s ^ü p ^«; hi ^u i§ ^{J í} § ^{o u} g ^H | ^{u m} § ^u 8 ^{ü i} l ^{í i} § ^{- o} 5 ^{u o} y ^< i ^u g ^S p ^{< <} ^ ^{H j ¡ u o} l^ ^¡ i ⁵ p ^< l ^í i ^< p ^o § ^o ¡ ^u ^ ^{c • t <} 33888688861 8 Í 2¡5áS888&88ád83á85 8868 8388 833 8 838S8883a33l6áG88S3S8! ;88S36£;SG3GÍ38853SSSS ^{H < u ü B < H < < u < y i S u i U ' í < u < U H < < í u » í ü u < < t - y e I a u < u} -• ^{e> h} <h ^{u o} n< ^{3 <}o ^hn ^es

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Tabla 10: Polinucleótidos sintéticos ue codifican una roteína relacionada con CRISPR ARNs sintético

Tabla 12: Secuencias adicionales depositadas en la base de datos Addgene (repositorio de plásmidos, Cambridge, MA

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido sintético donde la uridina se reemplaza al 100 % por 1-metil-pseudouridina, el polinucleótido sintético que comprende una primera región de nucleósidos enlazados, codificando dicha primera región una proteína relacionada con CRISPR seleccionada de entre el grupo que consiste en proteínas relacionadas con CRISPR que tienen cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO 61,7, 8, 9, 62, 63, 64 o 65 o codificadas por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO 1-6, o 110-112.

2. El polinucleótido sintético de la reivindicación 1, donde el polinucleótido sintético comprende al menos dos modificaciones, preferiblemente donde

(a) las al menos dos modificaciones están ubicadas en uno o más de un nucleósido y/o un enlace de la cadena principal entre nucleósidos; o

(b) las al menos dos modificaciones están ubicadas tanto en un enlace de nucleósido como en un enlace de la cadena principal; o

(c) al menos una modificación está ubicada en un enlace de la cadena principal; o

(d) uno o más enlaces de la cadena principal se modifican mediante la sustitución de uno o más átomos de oxígeno; o

(e) al menos una modificación comprende reemplazar al menos un enlace de la cadena principal con un enlace fosforotioato; o

(f) al menos una modificación se localiza en uno o más nucleósidos; o

(g) hay una o más modificaciones se encuentran en un azúcar de uno o más nucleósidos; o

(h) al menos una modificación está localizada en una o más nucleobases seleccionadas de entre el grupo que consiste en citosina, guanina, adenina, timina y uracilo.

3. Una composición que comprende el polinucleótido sintético de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, preferiblemente

(a) que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable, más preferiblemente que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable seleccionado de entre el grupo que consiste en un disolvente, disolvente acuoso, disolvente no acuoso, medio de dispersión, diluyente, adyuvante de dispersión, adyuvante de suspensión, agente tensioactivo, agente isotónico, agente espesante o emulsionante, conservante, lípido, liposoma lipidoide, nanopartícula lipídica, nanopartículas núcleo-capa, polímero, lipoplex, péptido, proteína, célula, hialuronidasa y mezclas de los mismos;

(b) que comprende además un lípido seleccionado de entre DLin-DMA, DLin-K-DMA, DLin-KC2-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, reLNP, PLGA, PEG, PEG-DMA y lípidos PEGilados y mezclas de los mismos; o

(c) que comprende además una nanopartícula lipídica.

4. Un procedimiento in vitro para producir una proteína relacionada con CRISPR que comprende poner en contacto una célula o tejido con el polinucleótido sintético de la reivindicación 1 o la composición de la reivindicación 3.

5. El polinucleótido sintético de la reivindicación 1 o la composición de la reivindicación 3 para su uso en un procedimiento terapéutico en el que se produce una proteína relacionada con CRISPR, comprendiendo dicho procedimiento administrar a un organismo el polinucleótido sintético o la composición, preferiblemente donde el polinucleótido sintético es

(a) administrado a una dosis diaria total de entre 1 pg y 1 mg;

(b) administrado en una dosis única.

(c) administrado en más de una dosis única

(d) administrado por administración prenatal, administración neonatal y administración posnatal;

(e) administrado por vía oral, por inyección, por administración oftálmica o por administración intranasal; o (f) administrado por inyección y dicha inyección se selecciona de entre el grupo que consiste en inyección intravenosa, intraarterial, intraperotoneal, intradérmica, subcutánea e intramuscular.

6. Un polinucleótido sintético como se define en la reivindicación 1, para su uso en un procedimiento terapéutico para modular la transcripción de un gen de interés en una célula que comprende poner en contacto la célula con el polinucleótido sintético de la reivindicación 1 y un ARNsg sintético en condiciones suficientes para modular la transcripción del gen de interés, la primera región del polinucleótido sintético comprende además una secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio efector y la secuencia de la primera región del ARNsg complementaria al gen de interés;

donde el ARNsg sintético es un ARNsg sintético para dirigirse a un gen de interés, donde en dicho ARNsg sintético la uridina se reemplaza al 100 % por 1-metil-pseudouridina, el ARNsg comprende:

(a) una primera región de 20-25 nucleósidos enlazados complementaria a cualquier cadena de una UTR 5' del gen de interés, preferiblemente donde la primera región comprende una secuencia diana como se describe en SEQ ID NO: 91, 92, 93 o 94; y

(b) una segunda región flanqueante ubicada en el extremo 3' de dicha primera región que comprende una secuencia de andamio de ARN guía como se encuentra en SEQ ID NO: 90,

preferiblemente donde:

(i) el polinucleótido sintético y el ARNsg sintético no son un solo polinucleótido;

(ii) el polinucleótido sintético son los polinucleótidos sintéticos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2;

(iii) el gen de interés seleccionado de entre el grupo que consiste en VEGF, TPO y LDHC;

(iv) el polinucleótido sintético de la reivindicación 1 comprende una secuencia miR específica para la célula; o (v) el gen de interés es VEGF y la célula es una célula U-97MG, una célula HEK293, un hepatocito humano primario o una célula HepG2, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la célula con uno de los polinucleótidos sintéticos de la reivindicación 1 o 2 y uno de los ARNsg en condiciones suficientes para modular la transcripción del gen VEGF.

7. Un polinucleótido sintético como se define en la reivindicación 1, para su uso en un procedimiento terapéutico para modular la transcripción de un gen de interés en un sujeto que comprende administrar al sujeto una primera dosis del polinucleótido sintético de la reivindicación 1 y una segunda dosis de un ARNsg sintético en condiciones suficientes para modular la transcripción del gen de interés, la primera región del polinucleótido sintético comprende además una secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio efector y la secuencia de la primera región del ARNsg complementaria al gen de interés;

donde el ARNsg sintético es un ARNsg sintético para dirigirse a un gen de interés, donde en dicho ARNsg sintético la uridina se reemplaza al 100 % por 1-metil-pseudouridina, el ARNsg comprende:

(a) una primera región de 20-25 nucleósidos enlazados complementaria a cualquier cadena de una UTR 5' del gen de interés, preferiblemente donde la primera región comprende una secuencia diana como se describe en SEQ ID NO: 91, 92, 93 o 94; y

(b) una segunda región flanqueante ubicada en el extremo 3' de dicha primera región que comprende una secuencia de andamio de ARN guía como se encuentra en SEQ ID NO: 90,

preferiblemente donde:

(i) el polinucleótido sintético es los polinucleótidos sintéticos de la reivindicación 2;

(ii) el sujeto es un ser humano;

(iii) el polinucleótido sintético y/o el ARNsg sintético se formulan en una formulación de nanopartículas lipídicas; (iv) el polinucleótido sintético se formula en una formulación de nanopartículas lipídicas y el ARNsg no se formula en una formulación de nanopartículas lipídicas;

(v) el gen de interés seleccionado de entre el grupo que consiste en VEGF, TPO y LDHC;

(iv) el polinucleótido sintético de la reivindicación 1 comprende una secuencia miR específica para la célula; o (vii) el gen de interés es TPO y el sujeto es un ratón, el procedimiento comprende administrar al ratón 0,0005/mg/kg0,5 mg/kg de polinucleótido sintético que comprende SEQ ID NO: 51 y 0,0005/mg/kg-0,5 mg/kg de ARNsg que comprende una primera región que comprende una secuencia complementaria a una cadena de la UTR 5' del gen TPO.

8. El polinucleótido sintético para su uso de la reivindicación 7, donde

(a) la primera dosis es de 0,0005/mg/kg a 0,5 mg/kg de polinucleótido sintético; y/o

(b) la segunda dosis está entre 0,0005/mg/kg-0,5 mg/kg de ARNsg; y/o

(c) el polinucleótido sintético y el ARNsg se administran juntos o se administran por separado; y/o

(d) el polinucleótido sintético y/o ARNsg se administran en una dosis única o en múltiples dosis; y/o

(e) el polinucleótido sintético y/o ARNsg se administran una vez al día o más de una vez al día; y/o

(f) el polinucleótido sintético y/o ARNsg se administran prenatalmente, neonatalmente, postnatalmente, oralmente, oftálmicamente, por vía intranasal y/o por inyección intravenosa, intraarterial, intraperotoneal, intradérmica, subcutánea o intramuscular.

9. Un polinucleótido sintético como se define en la reivindicación 1, para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad en un sujeto que comprende administrar al sujeto una primera dosis del polinucleótido sintético de la reivindicación 1 y una segunda dosis de un ARNsg sintético en condiciones suficientes para modular la transcripción del gen de interés, la primera región del polinucleótido sintético comprende además una secuencia de polinucleótidos que codifica un dominio efector y la secuencia de la primera región del ARNsg complementaria a una cadena del gen de interés UTR 5', donde la expresión del gen está ligada a la enfermedad,

donde el ARNsg sintético es un ARNsg sintético para dirigirse a un gen de interés, donde en dicho ARNsg sintético la uridina se reemplaza al 100 % por 1-metil-pseudouridina, el ARNsg comprende:

(a) una primera región de 20-25 nucleósidos enlazados complementaria a cualquier cadena de una UTR 5' del gen de interés, preferiblemente donde la primera región comprende una secuencia diana como se describe en SEQ ID NO: 91, 92, 93 o 94; y

(b) una segunda región flanqueante ubicada en el extremo 3' de dicha primera región que comprende una secuencia de andamio de ARN guía como se encuentra en SEQ ID NO: 90,

preferiblemente donde:

(i) la enfermedad es cáncer y el gen es un gen de apoptosis o senescencia;

(ii) el polinucleótido sintético es los polinucleótidos sintéticos de la reivindicación 2;

(iii) el sujeto es un ser humano;

(iv) el polinucleótido sintético y/o el ARNsg sintético se formulan en una formulación de nanopartículas lipídicas; (v) el polinucleótido sintético se formula en una formulación de nanopartículas lipídicas y el ARNsg no se formula en una formulación de nanopartículas lipídicas;

(vi) el gen de interés seleccionado de entre el grupo que consiste en VEGF, TPO y LDHC; ó

(vii) el polinucleótido sintético de la reivindicación 1 comprende una secuencia miR.

10. El polinucleótido sintético para su uso o el ARNsg sintético de la reivindicación 9, donde

(a) la primera dosis es de 0,0005/mg/kg a 0,5 mg/kg de polinucleótido sintético; y/o

(b) la segunda dosis está entre 0,0005/mg/kg-0,5 mg/kg de ARNsg; y/o

(c) el polinucleótido sintético y el ARNsg se administran juntos o se administran por separado; y/o

(d) el polinucleótido sintético y/o ARNsg se administran en una dosis única o en múltiples dosis; y/o

(e) el polinucleótido sintético y/o ARNsg se administran una vez al día o más de una vez al día; y/o

(f) el polinucleótido sintético y/o ARNsg se administran prenatalmente, neonatalmente, postnatalmente, oralmente, oftálmicamente, por vía intranasal y/o por inyección intravenosa, intraarterial, intraperotoneal, intradérmica, subcutánea o intramuscular.

11. El polinucleótido sintético de la reivindicación 1, donde la primera región:

(i) codifica la SEQ ID NO: 61;

(ii) codifica además un dominio efector;

(iii) codifica además un dominio efector seleccionado de entre el grupo que consiste en KRAB, VP64, p65AD y Mxi; (iv) codifica además KRAB o VP64 como se describe en la Tabla 6; o

(v) codifica además un dominio efector y comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que consiste en los dominios efectores descritos en la Tabla 6.

12. El polinucleótido sintético de la reivindicación 1, donde el polinucleótido sintético comprende una primera región flanqueante ubicada en el extremo 5' de dicha primera región que comprende una secuencia de nucleósidos enlazados seleccionados de entre el grupo que consiste en las secuencias de la región no traducida 5' (UTR). 71, 72 y 15-18; donde, opcionalmente, la primera región flanqueante comprende la SEQ ID NO: 71.

13. El polinucleótido sintético de la reivindicación 1, donde el polinucleótido sintético comprende una segunda región flanqueante ubicada en el extremo 3' de dicha primera región que comprende una secuencia de nucleósidos enlazados seleccionados de entre el grupo que consiste en las secuencias de la región no traducida 3' (UTR). 81, 82 y 19-35; donde, opcionalmente, la segunda región flanqueante:

(i) comprende la SEQ ID NO: 81;

(ii) comprende la SEQ ID NO: 82;

(iii) comprende además una secuencia de descolado 3' de nucleósidos enlazados;

(iv) comprende además una cola poli-A;

(v) comprende además una cola poli-A de 80 a 140 nucleótidos de longitud; o

(vi) comprende además una cola poli-A de 100 nucleótidos.

14. El polinucleótido sintético de la reivindicación 1, donde el polinucleótido sintético:

(i) es un polinucleótido de ARN modificado;

(ii) de una secuencia seleccionada de entre SEQ ID NOS: 51-56;

(iii) comprende además al menos una estructura de capa 5';

(iv) comprende al menos una 5'-metil citidina;

(v) está sustancialmente purificado; o

(vi) se produce utilizando un procedimiento de transcripción in vitro o utilizando un procedimiento de síntesis química.