CN112877368B - 一种用于成熟植物的基因编辑系统及基因编辑方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于成熟植物的基因编辑系统及基因编辑方法，属于生物技术领域。所述植物基因编辑系统包括碳纳米管(CNT)载体和负载在所述CNT载体上的核酸分子，所述核酸分子为Cas9mRNA、sgRNA或CRISPR/Cas9IVTs。本发明采用Cas9mRNA进行基因编辑，由于分子量大大缩小，更易于被CNT载体转运进植物细胞，而且mRNA表达的场所位于细胞质中，无需进入细胞核，使得递送过程中少了核孔屏障，有助于提高基因编辑效率。此外，以Cas9mRNA进行基因编辑，导入的mRNA和sgRNA在细胞内发挥作用后不会再生，有利于降低脱靶效应和对植物基因组自身基因表达的影响，有效避免基因组整合，实现无外源基因插入且无转基因过程的基因编辑。

Description

一种用于成熟植物的基因编辑系统及基因编辑方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于成熟植物的基因编辑系统及利用该基因编辑系统进行基因编辑的方法。

背景技术

植物基因工程可以在非生物和/或生物胁迫条件下创造出具有更多优良性状的作物，最大限度地减少作物生产对环境的不利影响。CRISPR/Cas9系统是如今广泛应用的基因编辑工具，由于其操作简单、高效和通用性，目前在植物基因工程中的地位已经取代了上一代的锌指核酸酶(ZFNs)基因编辑技术和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)基因编辑技术。

CRISPR/Cas9系统在植物中的递送方式主要依赖于两种方式：农杆菌转化法和基因枪技术。农杆菌转化法是通过构建含有编码Cas9蛋白与向导RNA(smallguideRNA，sgRNA)的质粒DNA，之后使用携带该质粒DNA的农杆菌去侵染植物细胞，在相关毒力蛋白的协助下，T-DNA区域的CRISPR/Cas9系统被整合进宿主的基因组中，进而获得表达，实现基因编辑。但是农杆菌的递送大概率会导致宿主基因组的未知整合，由于农杆菌介导的DNA插入在植物基因组中的位置是随机的，可能造成基因表达水平的不可控、不稳定、甚至影响植物基因组内其他基因的表达，且农杆菌侵染具有物种选择性，相当部分品系的作物植株对农杆菌的亲和力很弱，难以通过农杆菌转化的方式进行侵染。基因枪法则在真空下通过高压轰击的方式，将负载编码Cas9蛋白与sgRNA的质粒DNA、CRISPR/Cas9体外转录物(CRISPR/Cas9IVTs，Cas9mRNA和sgRNA的体外转录产物)或CRISPR/Cas9核蛋白复合物(CRISPR/Cas9RNPs，Cas9蛋白和sgRNA的核蛋白复合物)的金颗粒以极大的动能直接透过植物细胞壁细胞膜递送至细胞质或细胞核中。但是基因枪技术递送的质粒DNA依然会导致基因片段的随机整合，且高压轰击会造成基因组随机断裂，对植物产生不利影响。因此，上述递送方式均容易造成外源基因插入到植物基因组中，使CRISPR/Cas9系统长期过量表达，引起脱靶效应的累积，进而对整个基因组范围内的潜在靶点造成破坏；且外源基因的去除相当困难，往往需要通过回交、自交等手段去筛选没有外源基因插入的基因编辑植株，耗费大量的人力物力。此外，对于基因编辑作物而言，递送过程中导致的外源基因整合会触发转基因法规的监管，影响作物产品的推广和上市。这些局限性严重限制了CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程领域的进一步发展。

发明内容

针对以上现有技术中在基因编辑过程中存在外源基因整合的问题，本发明提供了一种用于成熟植物的基因编辑系统及利用该基因编辑系统进行基因编辑的方法。

为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种植物基因编辑系统，包括CNT载体和负载在所述CNT载体上的核酸分子，所述核酸分子为Cas9mRNA、sgRNA或CRISPR/Cas9IVTs。

进一步地，所述CNT载体为以羧基化CNT为骨架、表面键合聚乙烯亚胺的改性CNT载体。

进一步地，所述改性CNT载体的制备方法，包括以下步骤：

S11、将羧基化CNT加入到MESbuffer(2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液)中超声分散，离心去除聚集的管束，得到CNT分散液；

S12、向所述CNT分散液中加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，室温下搅拌反应得到活化的CNT分散液，之后加入为羧基化CNT15-20倍质量的精氨酸，室温搅拌反应，分离得到精氨酸修饰的CNT；

S13、将所述精氨酸修饰的CNT加入MESbuffer中超声分散，加入EDC和NHS，室温下搅拌反应得到活化的精氨酸修饰的CNT分散液，之后加入为羧基化CNT8-12倍质量的聚乙烯亚胺，室温搅拌反应，分离得到改性CNT载体。

进一步地，步骤S12和步骤S13中，所述羧基化CNT、所述EDC、所述NHS以质量比计为羧基化CNT：EDC：NHS＝2：1：1。

进一步地，所述改性CNT载体与所述核酸分子的质量比为1：1-7。

进一步地，所述改性CNT载体为改性单壁CNT载体或改性多壁CNT。

另外，本发明的提供了利用如上所述的植物基因编辑系统进行植物基因编辑的方法，包括以下步骤：将如上所述的植物基因编辑系统的CNT载体与核酸分子加入到MESdeliverybuffer中，混合均匀，静置，吸取底部100-200μL混合液注射进植物叶片中，之后置于温室培养。

进一步地，所述混合液中CNT载体的浓度为30-50ng/μL。

进一步地，所述混合液中CNT载体与核酸分子的质量比为1：1。

进一步地，所述植物叶片包括成熟的植株叶片或离体培养的植株叶片的悬浮细胞，所述植物为烟草、拟南芥、棉花或小麦中的一种。

本发明相比于现有技术具有以下有益效果：

1、本发明采用改性碳纳米管(CNT)作为Cas9mRNA和/或sgRNA的载体，比表面积大、穿膜能力强，能够通过静电吸附作用将核酸分子吸附在载体上并递送进植物细胞内，而采用Cas9mRNA进行基因编辑，由于分子量大大缩小，更易于被CNT载体转运进植物细胞，而且mRNA表达的场所位于细胞质中，无需进入细胞核，使得递送过程中少了核孔屏障，有助于提高基因编辑效率。此外，以Cas9mRNA进行基因编辑，导入的mRNA和sgRNA在细胞内利用完不会再生，有利于降低脱靶效应和对植物基因组自身基因表达的影响，有效避免基因组整合，实现无外源基因插入且无转基因过程的基因编辑。

2、本发明中的改性CNT载体搭载Cas9mRNA方式能够在植物中有效保护其免受核酸酶的降解，大大提高其在植物体内的稳定性。而且可以延缓mRNA的表达，提高在植物细胞内的表达周期。

3、本发明能够在不导入任何外源DNA的情况下对植物体实现瞬时、干净、安全的基因编辑，有利于使基因编辑作物规避一些转基因作物法规的监管。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明制备改性CNT载体搭载mRNA的植物基因编辑系统的流程图；

图2为本发明CNT载体搭载Cas9mRNA递送进植物细胞并表达的示意图；

图3为本发明实施例1的改性CNT载体搭载mRNA后静置上清液的电泳测试图；

图4为本发明实施例1的改性CNT载体搭载mRNA后的表面电势测试图；

图5为本发明实施例1的改性CNT载体搭载mRNA后的原子力显微镜分析图；

图6为本发明实施例1的改性CNT载体搭载mRNA后的元素分析图；

图7为本发明实施例2中改性单壁CNT载体在植物细胞内定位的TEM图；其中，图A为改性单壁CNT位于植物细胞中央大液泡的TEM图，图B为改性单壁CNT位于植物细胞中囊泡小液泡TEM图，图C为改性单壁CNT贯穿植物细胞细胞壁的TEM图，图D为改性单壁CNT位于植物细胞内和细胞间隙的TEM图；

图8为本发明实施例2的改性多壁CNT载体搭载mRNA后的元素分析图；

图9为本发明实施例2中改性多壁CNT载体在植物细胞内定位的TEM图；其中，图A为改性多壁CNT贯穿植物细胞壁的TEM图，图B为改性多壁CNT位于植物细胞中囊泡小液泡的TEM图；

图10为本发明实施例3的改性CNT载体搭载Cas9mRNA递送进植物组织后Cas9蛋白表达的免疫荧光图；

图11为本发明实施例3的改性CNT载体搭载Cas9mRNA递送进植物组织后Cas9蛋白表达的westernblot检测图；

图12为本发明实施例3的改性CNT载体搭载Cas9mRNA递送进植物组织后不同培养时间段叶片组织内Cas9mRNA残留量的荧光定量PCR检测统计图；

图13为本发明实施例4的改性CNT载体搭载GFPmRNA递送进植物组织后不同时间的GFP蛋白表达的激光共聚焦检测图；

图14为本发明实施例4的改性CNT载体搭载GFPmRNA递送进植物组织后不同时间的Cas9蛋白表达的wsternblot检测图；

图15为本发明实施例5的改性CNT载体搭载CRISPR/Cas9IVTs后静置上清液的电泳测试图；

图16为本发明实施例5的改性CNT载体搭载CRISPR/Cas9IVTs后的表面电势测试图；

图17为本发明实施例5的CRISPR/Cas9IVTs递送进植物细胞后的荧光标记共定位图；

图18为本发明实施例5的叶片组织基因组DNA电泳测试图；

图19为本发明实施例5的叶片组织基因组DNA高通量测序图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。另外，术语“包括”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、质量分数的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

相较于动物细胞中多种多样的基因递送方式，植物细胞的基因递送方式的相关研究进展缓慢，其主要原因是成熟植物细胞的细胞膜外有刚性、多层而又致密的结构-细胞壁，细胞壁具有保护原生质体、维持细胞形态的作用，其存在是生物大分子向植物细胞内递送的主要阻碍，细胞壁孔隙大小理论上只允许小于20nm的分子进入，这一限制使得绝大多数动物细胞中可行的基因递送方式都无法应用到植物细胞中。农杆菌转化法借助生物途径进行侵染以将外源基因转运至细胞核内，基因枪技术借助物理轰击的外力以直接打穿细胞壁将外源基因递送进细胞内，而除此之外的其它方法则很难有效导入外源基因至植物细胞中。但基因枪和农杆菌转化法目前均较难实现无外源基因插入而进行基因编辑。

随着纳米技术的发展，纳米载体在核酸物质转运中的应用研究迅速增多，可以通过纳米载体直接递送核酸物质进入细胞内。几种用于植物细胞的纳米载体被相继报道，这些纳米载体主要可分为两类，依赖外力协助的纳米载体和不依赖外力协助的纳米载体。依靠外力的纳米载体主要在基因枪或者磁力的协助下突破细胞壁，Martin-Ortigosa等人报道了一种在植物中基于基因枪轰击介孔硅微球(MSN)的外源DNA和外源蛋白共递送系统，Zhao等人报道了一种基于Fe₃O₄纳米颗粒(MNP)介导的外源DNA棉花花粉转化技术。不依赖外力协助的纳米载体目前主要集中于碳纳米材料，功能化修饰后的碳纳米材料可有效搭载质粒DNA并穿越细胞壁内化进植物细胞，实现外源基因的递送及表达。Kwak等人报道了一种使用壳聚糖功能化的单壁CNT为载体，通过细胞被动摄取的方式实现了外源基因向植物细胞叶绿体的靶向递送。Demirer等人报道了单壁CNT搭载GFP报告基因在烟草、小麦、芝麻叶、棉花多种成熟植物体中通过渗透的方式实现了有效递送与表达。但是，至今所报道的在成熟植物中基于纳米载体的基因递送方式还主要停留于小分子报告基因的递送，而对于CRISPR/Cas9系统尚未有人成功实现，其递送仍然依赖于传统的农杆菌转化法与基因枪技术。原因在于CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白本身是一个170kDa左右的大蛋白，其构建的质粒DNA分子量至少为12000bp起步，越大的生物大分子越难有效转运，这使得CRISPR/Cas9系统在植物细胞中递送较为困难，递送效率低，无法有效实现基因编辑。

本发明的实施例提供了一种植物基因编辑系统，包括CNT载体和负载在所述CNT载体上的核酸分子，所述核酸分子为Cas9mRNA、sgRNA或CRISPR/Cas9IVTs。所述CRISPR/Cas9IVTs为Cas9mRNA和sgRNA的体外转录产物的混合物，又称CRISPR/Cas9体外转录物，其中Cas9mRNA和sgRNA的摩尔比为1：1。

本发明既可以先将Cas9mRNA和sgRNA分别负载在CNT载体上，然后将负载有两种核酸分子的CNT载体混合得到植物基因编辑系统，也可以先将Cas9mRNA和sgRNA混合在一起形成CRISPR/Cas9IVTs，再将CRISPR/Cas9IVTs负载在CNT载体得到植物基因编辑系统。

碳纳米管(CNT)作为上述核酸分子的载体，比表面积大、穿膜能力强，能够与RNA结合以将RNA负载在载体上，之后以“纳米针”的形式穿过细胞壁和细胞膜，将Cas9mRNA和/或sgRNA递送进植物细胞质内，在细胞质中，细胞内环境(如酸度、离子浓度等)的变化使以非共价方式构建的CNT-RNA复合物中的RNA释放，Cas9mRNA翻译为Cas9蛋白，与sgRNA配合进行基因编辑(见图1-2)。

采用Cas9mRNA(分子量4500nt)，相较于其质粒DNA(分子量12000bp)，分子量大大缩小，更容易被CNT载体搭载和转运，而且mRNA表达的场所位于细胞质中，无需像质粒DNA必须进入细胞核才可进行表达，使得递送过程中少了细胞核的核孔屏障，有助于提高递送效率。更为重要的是，以编码Cas9蛋白的mRNA进行基因编辑，不存在其他DNA元件影响基因组，不会持续转录，导入的mRNA和sgRNA在细胞内发挥作用后不会再生，有利于降低脱靶效应和对植物基因组自身基因表达的影响；而且可以有效避免基因组整合，杜绝外源基因插入到植物基因组中，进而实现无外源基因插入且无转基因过程的基因编辑。

为了增强吸附RNA的能力，优选地，所述CNT载体为以羧基化CNT(CNT-COOH)为骨架、表面键合聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)的改性CNT载体。高等农作物植物细胞具有相对复杂的细胞壁、细胞膜的保护，纳米材料较难突破该保护层进入到细胞内。PEI为具有高密度正电荷的多聚阳离子聚合物，能够通过胺基与羧基反应生成离子键进而结合于羧基化CNT的外管壁上，在其表面引入较多的正电荷，由于RNA和细胞膜、细胞壁带负电荷，表面带有正电荷的CNT能够通过静电作用将带负电的RNA吸附在改性CNT表面，有利于提高结合RNA的效率，且吸附量与其表面修饰的基团类型和正电荷的密度相关，与此同时载体与细胞膜、细胞壁的吸附也受载体表面电荷的影响。

所述改性CNT载体的制备方法，包括以下步骤：

S11、将羧基化CNT加入到MESbuffer中，超声分散，离心去除聚集的管束，得到CNT分散液；

S12、向所述CNT分散液中加入EDC和NHS，室温下搅拌反应得到活化的CNT分散液，之后加入为羧基化CNT15-20倍质量的精氨酸，室温搅拌反应，分离得到精氨酸修饰的CNT；

S13、将所述精氨酸修饰的CNT加入MESbuffer中超声分散，加入EDC和NHS，室温下搅拌反应得到活化的精氨酸修饰的CNT分散液，之后加入为羧基化CNT8-12倍质量的聚乙烯亚胺，室温搅拌反应，分离得到改性CNT载体。

反应体系中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)用于活化CNT-COOH表面的羧基基团，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用于保持EDC的活性，首先加入精氨酸，精氨酸为碱性氨基酸，具有大量的氨基，利用精氨酸与CNT上的羧基反应生成酰胺键将精氨酸接枝到CNT表面，然后加入PEI，PEI与精氨酸游离的羧基进行缩合反应，接枝到精氨酸上，可以得到表面正电荷密度大大提高的改性CNT载体。而且，精氨酸为亲水性物质，接枝后载体表面具有较强的亲水性，可提高改性CNT载体在胞质中的分散性和稳定性；同时精氨酸含有多个氨基，可增加载体表面的正电荷，有助于提高mRNA负载量和载体的穿膜效率。

可选地，所述改性CNT载体与所述核酸分子的质量比为1：1-7。通过上述改性修饰，RNA分子负载量高。

步骤S11的操作具体为：将羧基化CNT加入到MESbuffer中并调节pH至4.5-5，超声分散15-30min，16000g离心1h去除聚集的管束，得到稳定分散的CNT分散液。

步骤S12的操作具体为：向所述CNT分散液中加入EDC和NHS，室温下搅拌反应0.5-2h，使用截留分子量为100kDa的超滤管离心去除游离的EDC和NHS，并将滤饼溶于PBS缓冲液(pH7)中，或者采用截留分子量为100kDa的透析膜透析去除游离的EDC和NHS，透析液采用PBS缓冲液(pH7)，得到活化的CNT分散液，之后加入为羧基化CNT15-20倍质量的精氨酸，室温搅拌反应4-6h，使用截留分子量为100kDa的超滤管离心得到精氨酸修饰的CNT。

步骤S13的操作具体为：将所述精氨酸修饰的CNT加入到MESbuffer中并调节pH至4.5-5，超声分散15-30min，然后加入EDC和NHS，室温下搅拌反应0.5-2h，使用截留分子量为100kDa的超滤管离心去除游离的EDC和NHS，并将滤饼溶于PBS缓冲液(pH7)中，或者采用使用截留分子量为100kDa的透析膜透析去除游离的EDC和NHS，得到活化的精氨酸修饰的CNT分散液，然后加入为羧基化CNT8-12倍质量的聚乙烯亚胺，室温搅拌反应，得到改性碳纳米管粗液，将改性碳纳米管粗液置换至无酶无菌水(RNase-free Water)的环境中，再超声分散15-30min，16000g离心1h去除聚集的管束，所得悬液即为改性CNT载体悬液，分离得到改性CNT载体。

可选地，步骤S12和步骤S13中，所述CNT-COOH、所述EDC、所述NHS以质量比计为CNT-COOH：EDC：NHS＝2：1：1。

可选地，所述改性CNT载体为改性单壁CNT载体或改性多壁CNT。本发明对此不做限定，无论单壁CNT还是多壁CNT，均可高效率地负载RNA。

本发明的另一实施例提供了如上所述的植物基因编辑系统的制备方法，参见图1，包括以下步骤：将CNT载体与核酸分子加入到MESdeliverybuffer(MES递送缓冲液)中，混合均匀，静置15-60min，即可将核酸分子负载在CNT载体上，分离纯化，得到植物基因编辑系统。所述植物基因编辑系统的制备方法与如上所述的植物基因编辑系统相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

具体地，所述MESdeliverybuffer含有25mMMES和15mMMgCl₂，pH为6.0。

本发明的再一实施例提供了利用如上所述的植物基因编辑系统进行植物基因编辑编辑的方法，参见图2，包括以下步骤：将核酸分子和CNT载体加入到MESdeliverybuffer中，混合均匀，静置15-60min，吸取底部100-200μL混合液注射进植物叶片中，之后置于温室培养。将混合液注射进植物叶片中的方式不限于注射器注射，也可以是浸泡或是真空渗透。

为了更利于植物基因编辑系统渗透进植物叶片细胞中，优选地，所述混合液中CNT载体的浓度为30-50ng/μL，所述混合液中CNT载体与核酸分子的质量比为1：1。

可选地，所述植物叶片包括但不限于成熟的植株叶片或离体培养的植株叶片的悬浮细胞，所述植物为烟草、拟南芥、棉花或小麦中的一种。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，除非特别说明，聚乙烯亚胺为支链聚乙烯亚胺，数均分子量为35K，植物选择烟草。

实施例1植物基因编辑系统的制备-CNT载体搭载Cas9mRNA

S10、CNT载体的制备：所述CNT载体为以羧基化CNT(CNT-COOH)为骨架、表面键合聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)的改性CNT载体，其制备方法包括以下步骤：

S11、将羧基化CNT加入到MESbuffer中并调节pH至4.5-5，超声分散30min，16000g离心1h去除聚集的管束，得到稳定分散的CNT分散液；

S12、向所述CNT分散液中加入EDC和NHS，按质量比计，CNT-COOH：EDC：NHS为2：1：1，室温下搅拌反应2h，使用截留分子量为100kDa的超滤管离心去除游离的EDC和NHS，并将滤饼溶于PBS缓冲液(pH7)中，得到活化的CNT分散液，之后加入为羧基化CNT20倍质量的精氨酸，室温搅拌反应5h，使用截留分子量为100kDa的超滤管离心，得到精氨酸修饰的CNT；

S13、将所述精氨酸修饰的CNT加入到MESbuffer中并调节pH至4.5-5，超声分散30min，然后加入EDC和NHS，室温下搅拌反应2h，使用截留分子量为100kDa的超滤管离心去除游离的EDC和NHS，并将滤饼溶于PBS缓冲液(pH＝7)中，得到活化的精氨酸修饰的CNT分散液，然后加入为羧基化CNT10倍质量的聚乙烯亚胺，室温搅拌反应10h，得到改性CNT粗液，将改性CNT粗液置换至RNase-freeWater的环境中，再超声分散30min，16000g离心1h去除聚集的管束，所得悬液即为改性CNT载体悬液。

S20、mRNA的获取：Cas9mRNA的获取使用体外加帽转录的方式，首先使用pLZT7-zCas9质粒(pLZT7-zCas9质粒序列参见文献“Z.Liangetal.,GenomeeditingofbreadwheatusingbiolisticdeliveryofCRISPR/Cas9invitro transcriptsorribonucleoproteins.NatProtoc13,413-430(2018).”的supporting部分)做为转录模板，在针对植物密码子优化后的zCas9序列基础上整合玉米泛素的5’端UTR、3’端UTR和ployA尾。以线性化pLZT7-zCas9质粒为模板，使用T7RNA聚合酶进行体外转录，在转录的过程中加入m7GPPPN帽子结构，RNA的纯化使用柱式纯化法，定量使用超微量紫外光谱仪。

S30、CNT载体搭载Cas9mRNA：将1份CNT载体与1-7份Cas9mRNA加入到MESdeliverybuffer(pH＝6.0)中，混合均匀，室温下静置30min，即可将核酸分子负载在CNT载体上，得到植物基因编辑系统。

通过调整改性CNT载体与Cas9mRNA的质量比，取静置后的上清液进行电泳测试，观察CNT载体对RNA的负载能力，mRNA被改性CNT载体搭载后的上清液电泳测试图如图3所示，图3中，M为DNAmarker，泳道1为没有加入CNT载体的空白对照，因此，能够电泳出明显的Cas9mRNA条带，泳道2-9分别为改性CNT载体与Cas9mRNA质量比为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7时的扩增结果。参见图3，当CNT载体的Cas9mRNA质量比高达1：7时，上清液中检测不到Cas9mRNA，说明Cas9mRNA已被改性CNT载体完全搭载，表明改性CNT载体具有很强的搭载能力，能够负载高含量的Cas9mRNA。

图4为改性CNT载体搭载mRNA后的表面电势(Zatapotential)测试图，示出了改性CNT载体搭载mRNA后载体表面电势的变化，在质量比为改性CNT载体：mRNA为1：1和1：10的搭载比例下，改性CNT载体的表面电荷有所下降，原因在于负电荷的mRNA以静电作用吸附在改性CNT载体表面，中和了改性CNT载体的表面电荷，使其电势降低，这也说明mRNA被有效搭载在改性CNT载体表面。

图5为改性CNT载体搭载mRNA后的原子力显微镜分析图，图中CNT carrier指代改性CNT载体，CNT-mRNA指代改性CNT载体搭载mRNA后的系统，图5示出了改性CNT载体搭载mRNA后载体高度的变化，在质量比为改性CNT载体：mRNA为1：1的搭载比例下，改性CNT-mRNA的高度由原来的7nm左右升高到30nm，说明了mRNA被有效搭载在改性CNT载体表面，mRNA的存在升高了CNT的高度。

图6为改性CNT载体搭载mRNA后的元素分析(TEM-mapping)图，在质量比为改性CNT载体：mRNA为1：1的搭载比例下，C、N、O元素为改性CNT载体的特有元素，P元素为mRNA成分，这些元素共定位在同一根CNT上，证明了mRNA被有效搭载在改性CNT载体表面。

以上结果证实了本实施例的改性CNT载体能够通过静电作用高效负载mRNA，且具有高负载量。

实施例2植物基因编辑系统通过细胞壁转运至植物细胞内

将改性CNT载体和mRNA按质量比为改性CNT载体：mRNA为1：1的搭载比例加入到MESdeliverybuffer中，CNT载体的终浓度为30-50ng/μL，混合均匀，室温下静置30min，使用1mL去除针尖的注射器吸取底部100-200μL混合液注射进烟草的叶背表面，以记号笔标注，之后将烟草置于温室培养。

培养24h后，切取叶片组织，使用戊二醛固定，之后脱水，树脂包埋，超薄切片，使用高分辨率生物透射电镜(TEM)进行亚细胞观察，结果见图7，图中CW指代细胞壁(CellWall)，CM指代细胞膜(CytoplasmicMembrane)，EC指代细胞外间隙(Extracellularspace)，IC指代细胞内中央大液泡(IntracellularCentralVacuole)，V指代细胞内囊泡小液泡(Vesicles)，CY指代细胞质(Cytoplasm)。

参见图7中的A图，箭头所指为植物细胞中央大液泡内的改性CNT载体，说明CNT可以有效穿透植物细胞壁进入植物细胞内。

参见图7中的B图，箭头所指为植物细胞中囊泡小液泡中的改性CNT载体，说明改性CNT载体可以进入植物细胞内并参与了囊泡的转运。

参见图7中的C图，箭头所指为植物细胞壁上正在贯穿的改性CNT载体，说明改性CNT载体是通过贯穿细胞壁的途径进入植物细胞内的。

参见图7中的D图，箭头所指为植物细胞壁外细胞间隙和植物细胞壁内侧的大量分布的改性CNT载体，证明改性CNT载体能够有效透过植物细胞壁，分布于植物细胞壁的两侧。

将步骤S10中的羧基化单壁CNT替换为羧基化多壁CNT，其余反应条件均与步骤S10相同，之后以本实施例的方式渗透进植物叶片，处理后进行元素分析和TEM表征，结果分别见图8和图9。

参见图8，元素分析结果显示C、N、O和P元素共定位在同一根改性多壁CNT载体上，说明改性多壁CNT载体同样可以有效搭载mRNA。

参见图9中的A图，虚线框内所指为正在贯穿植物细胞壁的改性多壁CNT载体，多壁纳米管由于比单壁纳米管稍粗，在TEM下有比较好的衬度，更清晰地说明CNT是通过贯穿植物细胞壁的途径进入植物细胞。

参见图9中的B图，虚线框内为植物细胞囊泡小液泡中的改性多壁CNT载体，更清楚地证明CNT进入植物细胞内并参与了囊泡的转运。

实施例3植物基因编辑系统在成熟植物体中的表达及稳定性

将改性CNT载体和mRNA按质量比为改性CNT载体：mRNA为1：1的搭载比例加入到MESdeliverybuffer中，CNT载体的终浓度为30-50ng/μL，混合均匀，室温下静置30min，使用1mL去除针尖的注射器吸取底部100-200μL混合液注射进烟草的叶背表面，以记号笔标注，之后将烟草置于温室培养。

培养24h后，切取叶片组织，使用FAA(Formalin-Aceto-Alcohol，福尔马林-乙酸-乙醇混合液)固定，之后脱水，石蜡包埋，切片，使用Cas9蛋白的抗体进行免疫荧光检测，同时切取叶片组织提取全蛋白，使用Cas9蛋白的抗体进行免疫印迹(westernblot)检测。此外，在培养的不同时间段切取叶片组织，使用荧光定量PCR检测Cas9mRNA的残留。上述检测结果分别见图10-12。图10-11中，Anti-Cas9-FITC为异硫氰酸荧光素标记的抗Cas9蛋白的抗体，DAPI为4',6-二脒基-2-苯基吲哚，CNT表示CNT未搭载mRNA的载体对照组，Cas9mRNA表示未吸附在CNT上的RNA对照组，CNT-pHSN401表示CNT搭载Cas9质粒pHSN401(质粒pHSN401大小为12000bp)的阳性对照组，CNT-Cas9mRNA表示改性CNT载体搭载Cas9mRNA(Cas9mRNA大小为5000nt)后的实验组，图12中，Cas9mRNAchange表示Cas9mRNA的残留量随时间的变化。

参见图10-11，单纯的载体、单纯的Cas9mRNA以及改性CNT载体搭载Cas9质粒DNA检测不到Cas9蛋白的表达，而改性CNT载体搭载Cas9mRNA能够检测到明显的蛋白表达，说明改性CNT载体搭载Cas9mRNA的方法能够有效实现Cas9mRNA在成熟植物体中的递送，并表达为用于基因编辑的Cas9蛋白。

参见图12，单纯的Cas9mRNA在渗透进植物体约1h已经被大部分降解，6h时基本检测不到Cas9mRNA残留，而改性CNT载体搭载的Cas9mRNA在注射进植物体内15h仍可被大量检测到，说明改性CNT载体能够有效保护mRNA免受植物体中核酸酶降解，提高了细胞内生物稳定性。

实施例4植物基因编辑系统在成熟植物体中的表达周期

按照实施例3的实验方法，于培养的不同时间切取叶片组织并提取全蛋白，使用Cas9蛋白的抗体进行免疫印迹(westernblot)检测。

将实施例1的步骤S20中pLZT7-zCas9质粒替换为pLZT7-zGFP质粒，然后按照与实施例1的相同步骤获得GFP(绿色荧光蛋白)mRNA；然后按照实施例3的实验步骤将搭载GFPmRNA的改性CNT注射进烟草的叶背表面作为对照组，以搭载等量的Cas9mRNA的改性CNT注射进烟草的叶背表面作为实验组，将实验组和对照组的烟草置于温室培养，于培养的不同时间切取叶片组织，使用激光共聚焦显微镜检测GFP蛋白表达，上述检测结果分别见图13-14。图13中，GFP为绿色荧光蛋白，BF为正常光模式。

参见图13，GFPmRNA在渗透进植物体内6h左右检测不到明显的表达，而在24h左右可以检测到GFP的表达。

参见图14，改性CNT载体搭载的Cas9mRNA在注射进植物体内6h左右能检测到少量的Cas9蛋白表达，随着时间延长，24-48h可以检测到明显的Cas9蛋白表达。

上述结果说明Cas9mRNA经由改性CNT载体递送进植物细胞中的表达明显滞后于现有技术中报道的细胞内递送mRNA表达的周期(现有技术中约6-24h达到表达峰值)，可见，改性CNT载体的搭载能够显著延缓Cas9mRNA在植物细胞内的表达，延长Cas9mRNA在植物细胞内的表达周期。

实施例5植物基因编辑系统在成熟植物体中实现基因编辑

将改性CNT载体和CRISPR/Cas9IVTs按质量比为改性CNT载体：CRISPR/Cas9IVTs(1份Cas9mRNA+1份sgRNA)为1：1的搭载比例加入到MESdeliverybuffer中，CNT载体的终浓度为30-50ng/μL，混合均匀，室温下静置30min，使用1mL去除针尖的注射器吸取底部100-200μL混合液注射进烟草的叶背表面，以记号笔标注，之后将烟草置于温室培养。

上述sgRNA序列为：5’-TTGGTAGTAGCGACTCCATGGGG-3’，sgRNA的目标基因为NbPSD基因。

调整改性CNT载体与CRISPR/Cas9IVTs的质量比为1：1和1：2，取静置后的上清液进行电泳测试，如图15所示，M为DNAmarker，泳道1为没有加入CNT载体的空白对照，因此，能够电泳出明显的Cas9mRNA和sgRNA条带，泳道2分别为改性CNT载体与CRISPR/Cas9IVTs质量比为1：2时的扩增结果，可以看出质量比为改性CNT载体：CRISPR/Cas9IVTs为1:2的搭载比例下，CRISPR/Cas9IVTs可被载体完全搭载，说明CNT对于CRISPR/Cas9IVTs同样具有很强的搭载能力。

图16为改性CNT载体搭载CRISPR/Cas9IVTs后的表面电势测试图，示出了改性CNT载体搭载CRISPR/Cas9IVTs后载体表面电势的变化，在质量比为改性CNT载体：CRISPR/Cas9IVTs为1：2的搭载比例下，改性CNT载体的表面电荷明显降低。同时，CRISPR/Cas9IVTs的电势相较于Cas9mRNA降幅不大，说明额外加入的sgRNA对改性CNT载体的搭载效率影响很小，表明sgRNA和Cas9mRNA均能被有效搭载在改性CNT载体表面。

将本实施例中CRISPR/Cas9IVTs替换为cy3分别标记的CRISPR/Cas9IVTs，即包括2组，其中一组为1份cy3标记的Cas9mRNA加1份sgRNA，另外一组为1份Cas9mRNA加1份cy3标记的sgRNA，将实验使用的烟草植株替换为基因组稳定整合高表达GFP的转基因烟草16C，其细胞质能自发绿色荧光。以单纯的cy3分别标记的CRISPR/Cas9IVTs作为对照组，其余条件不变。烟草叶片组织被渗透12h后，切取叶片组织，通过激光共聚焦显微镜进行观察。参见图17，单纯的CRISPR/Cas9IVTs渗透叶片组织，基本上观察不到Cas9mRNA和细胞质自发荧光的共定位，sgRNA因其分子量较小可部分内化进烟草叶片细胞，因而能观察到部分区域出现sgRNA和细胞质自发荧光的共定位。改性CNT载体搭载的CRISPR/Cas9IVTs渗透叶片组织，可以观察到明显的Cas9mRNA和细胞质自发荧光的共定位，sgRNA能观察到更强的和细胞质自发荧光的共定位。证实了改性CNT载体能够有效将负载其上的CRISPR/Cas9IVTs递送进植物细胞内，实现基因编辑。

以单纯的CRISPR/Cas9IVTs作为对照组，其余条件均与本实施例相同。CRISPR/Cas9IVTs渗透叶片组织72h后，提取基因组DNA，使用PCR扩增出靶基因片段，使用T7核酸内切酶I测试编辑效率，并使用高通量测序检测突变类型。琼脂糖凝胶电泳结果如图18所示，单纯的CRISPR/Cas9IVTs渗透的植株与野生型植株一样没有产生明显的突变，而CNT-IVTs(改性CNT搭载CRISPR/Cas9IVTs系统)渗透的植株则检测到了4％左右的突变，参见图19，高通量测序结果显示，共检测到三种Indels突变类型，有插入突变和缺失突变，以上结果证明CRISPR/Cas9IVTs经由改性CNT载体的搭载能够有效进入成熟植物体内并实现基因编辑。

虽然本发明公开披露如上，但本发明公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本发明公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (6)

1.一种用于成熟植物的基因编辑系统，其特征在于，包括CNT载体和负载在所述CNT载体上的核酸分子，所述核酸分子为CRISPR/Cas9 IVTs；

其中，所述CNT载体为以羧基化CNT为骨架、表面键合聚乙烯亚胺的改性CNT载体；

所述改性CNT载体的制备方法，包括以下步骤：

S11、将羧基化CNT加入到MES buffer中并调节pH至4.5-5，超声分散，离心去除聚集的管束，得到CNT分散液；

S12、向所述CNT分散液中加入EDC和NHS，室温下搅拌反应，离心去除游离的EDC和NHS，得到活化的CNT分散液，之后加入为羧基化CNT 15-20倍质量的精氨酸，室温搅拌反应，分离得到精氨酸修饰的CNT；

S13、将所述精氨酸修饰的CNT加入MES buffer中并调节pH至4.5-5，超声分散，加入EDC和NHS，室温下搅拌反应，离心去除游离的EDC和NHS，得到活化的精氨酸修饰的CNT分散液，之后加入为羧基化CNT 8-12倍质量的聚乙烯亚胺，室温搅拌反应，得到改性CNT粗液，将所述改性CNT粗液置换至RNase-free Water的环境中，再次超声分散，离心去除聚集的管束，分离得到改性CNT载体；

其中，步骤S12和步骤S13中，所述羧基化CNT、所述EDC、所述NHS以质量比计为羧基化CNT：EDC：NHS=2：1：1；

所述改性CNT载体与所述核酸分子的质量比为1：1或1：2；

所述MES buffer为2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲液，所述EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺。

2.根据权利要求1所述的用于成熟植物的基因编辑系统，其特征在于，所述改性CNT载体为改性单壁CNT载体或改性多壁CNT。

3. 一种基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1-2任一项所述的植物基因编辑系统的CNT载体与核酸分子加入到MES delivery buffer中，混合均匀，静置，吸取底部100-200μL混合液注射进烟草叶片中，之后置于温室培养。

4.根据权利要求3所述的基因编辑方法，其特征在于，所述混合液中CNT载体的浓度为30-50ng/μL。

5.根据权利要求3所述的基因编辑方法，其特征在于，所述混合液中CNT载体与核酸分子的质量比为1：1。

6.根据权利要求3所述的基因编辑方法，其特征在于，所述烟草叶片为成熟的叶片或离体培养的叶片的悬浮细胞。

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