CN110628767B - 一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒、制备方法及其用于基因编辑 - Google Patents

一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒、制备方法及其用于基因编辑 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒、制备方法及其用于基因编辑，涉及基因工程领域，该方法包括：将1份浓度为60mM的可溶性磷酸盐加入向15～18份缓冲溶液中混合均匀，向混合液中加入4～5份待矿化的蛋白/质粒DNA混合均匀后，加入4～5份浓度为100mM的可溶性钙盐混合均匀并静置至溶液为不透明且没有出现肉眼可见的沉淀时，加入分散剂震荡混合均匀并离心、纯化；该纳米颗粒的粒径为100～200nm；该纳米颗粒用于基因编辑时，使细胞与矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒接触。本发明用于基因编辑时，能够避免DNA残留和脱靶效应。

Description

一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒、制备方法及其 用于基因编辑
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒、制备方法及其用于基因编辑。
背景技术
CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR-associated9)系统是如今被广泛使用的基因工具，然而，目前大多数的CRISPR/Cas9依然使用传统的DNA作为递送手段，如针对植物时主要采用农杆菌介导或是基因枪，针对动物时主要使用病毒载体如慢病毒，腺病毒等。
然而DNA作为递送手段容易导致基因组整合，Cas9与sgRNA在宿主基因组中长时间残留并过度表达会导致脱靶切割，目前主要使用IVTs(体外转录产物)递送Cas9蛋白与sgRNA或将Cas9蛋白与sgRNA组装形成的RNPs(核酸蛋白复合物)可以有效避免基因组整合，降低脱靶。
但是RNA水平与蛋白质水平的递送难度较大，传统手段无法实现，同时，IVTs与RNPs容易受到外界或者体内环境的影响而失活，Cas9本身做为一个大分子量的蛋白，将其有效地递送进细胞也存在难度，因此有效将RNPs基因编辑系统递送进细胞核并维持其活性难度较大。
随着纳米技术的发展，目前的纳米材料可以实现多种水平的递送，不仅可以递送DNA，也可以递送RNA与蛋白质，纳米材料一般通过化学偶联或者吸附等手段搭载生物大分子，搭载生物大分子的纳米材料通过与细胞膜的相互作用，由内吞途径进入细胞后由于质子海绵效应逃逸出溶酶体，使生物大分子释放至细胞中免受溶酶体的降解，因此，以纳米材料作为载体可以在很大程度上保护生物大分子免受外部环境影响，进而避免生物大分子降解。
目前，使用纳米材料做为载体递送生物大分子在基因编辑领域被广泛使用：如M.Rotello等人使用精氨酸修饰纳米金颗粒，将Cas9 RNPs不经过溶酶体直接递送进细胞内实现基因编辑；Niveen M.Khashab等人使用MOF(有机金属框架)材料经内吞后溶酶体逃逸，将RNPs递送进细胞进行编；Xingyu Jiang等人使用细胞穿膜肽与脂质体将CRISPR的部件有效递送进细胞内进行编辑等。
但是，以纳米材料作为载体递送生物大分子后，容易出现DNA残留，且存在一定的脱靶效应。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒、制备方法及其用于基因编辑，能够避免DNA残留和脱靶效应。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒制备方法，包括以下步骤：
按体积份，将1份浓度为60mM的可溶性磷酸盐加入15～18份缓冲溶液中混合均匀，该缓冲溶液的pH值为7～8、渗透压为150～300mM，且不含P和/或Ca；向混合液中加入4～5份待矿化的蛋白/质粒DNA混合均匀后，加入4～5份浓度为100mM的可溶性钙盐混合均匀并静置至溶液为不透明且没有出现肉眼可见的沉淀时，加入分散剂震荡混合均匀并离心、纯化。
在上述技术方案的基础上，所述可溶性钙盐为氯化钙或硝酸钙，所述可溶性磷酸盐为正磷酸盐。
一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒，所述纳米颗粒的粒径为100～200nm，其中，当纳米颗粒负载的为蛋白时，蛋白的负载量为20～70ug；当纳米颗粒负载的为质粒DNA时，质粒DNA的负载量为5～10ug。
在上述技术方案的基础上，所述蛋白为Cas9蛋白，所述质粒DNA为任意质粒DNA。
一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒用于基因编辑，使细胞与矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒接触。
在上述技术方案的基础上，所述细胞为动物细胞、植物细胞或真菌细胞。
在上述技术方案的基础上，当所述细胞为植物细胞或真菌细胞时，选用其对应的原生质体与矿化纳米颗粒相接触。
在上述技术方案的基础上，所述纳米颗粒与细胞的质量比为1:105～109。
在上述技术方案的基础上，所述基因编辑能够导致基因敲除、基因矫正。
在上述技术方案的基础上，当所述蛋白/质粒DNA选用Cas9蛋白或其对应的质粒DNA时，所述细胞选用真菌细胞。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明的一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒的制备方法，反应步骤较简单，时间较短，能够在30min内完成，反应条件温和，能够避免生物大分子的失活。
(2)本发明的一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒，矿化形成的磷酸钙纳米颗粒为无定形磷酸钙，具有良好的体内释放性能；能够对大分子如蛋白质/DNA质粒分子进行高效搭载，当蛋白搭载量为20～70ug或质粒DNA搭载量为5～10ug时，搭载效率可接近100％，其搭载效率可以接近100％，该纳米颗粒能够传递大分子至细胞内部，且被矿化的大分子在生物体内不仅能够维持自身活性，还能够抵御外界酶降解，能够有效维持大分子在生物体内的活性，不仅能够用于动物细胞喝植物细胞，而且能够在转化难度较大的真菌细胞中能够进行有效传递。
(3)本发明中生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒用于基因编辑，由于矿化后的纳米颗粒无明显生物毒性，不仅可以避免传递过程中对细胞的影响，而且不影响原生质体的细胞壁再生；同时，矿化纳米颗粒与未矿化的CRISPR./Cas9 RNPs相比，基因编辑效率提高20～30％，且未出现脱靶或DNA残留。
附图说明
图1为本发明实施例中制备生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒及用于基因编辑的结构示意图；
图2为本发明实施例中CRISPR/Cas9RNPs矿化后透射电镜照片，粒径分布及其电子选取衍射照片；
图3为本发明实施例中CRISPR/Cas9RNPs矿化后的元素mapping照片；
图4为本发明实施例中矿化后纳米载体搭载效率分析的SDS-PAGE图片及其琼脂糖电泳图片；
图5为本发明实施例中矿化后对生物大分子的保护作用的琼脂糖电泳图片；
图6为本发明实施例中绿色荧光蛋白生物矿化后的表征图；
图7为本发明实施例中基因编辑效率及其测序图片；
图8为本发明实施例中基因编辑脱靶分析琼脂糖电泳图片。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
参见图1所示，本发明实施例提供一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
按体积份，将1份浓度为60mM的可溶性磷酸盐加入15～18份缓冲溶液中混合均匀，该缓冲溶液的pH值为7～8、渗透压为150～300mM，且不含P和/或Ca；向混合液中加入4～5份待矿化的蛋白/质粒DNA混合均匀后，加入4～5份浓度为100mM的可溶性钙盐混合均匀并静置至溶液为不透明且没有出现肉眼可见的沉淀，加入分散剂震荡混合均匀并离心，取上清液，得到搭载生物大分子的矿化纳米颗粒溶液初制品，将初制品纯化，得到纯化液，以下简称大分子溶液。
可溶性钙盐选用氯化钙，可溶性磷酸盐选用Na2HPO4。
本发明还提供一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒，其粒径为100～200nm，其中，当纳米颗粒负载的为蛋白时，蛋白的量为20～70ug；当纳米颗粒负载的为质粒DNA时，质粒DNA的量为5～10ug，本发明实施例中，蛋白选用Cas9蛋白，质粒DNA为任意质粒DNA。
参见图1所示，本发明还提供一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒(以下简称矿化纳米颗粒)用于基因编辑，其包括：使细胞与矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒接触。
该细胞可以为动物细胞、植物细胞或真菌细胞，当细胞为植物细胞时，选用其对应的原生质体与矿化纳米颗粒相接触。
参见图1所示，矿化纳米颗粒通过细胞内吞途径进入细胞后由于质子海绵效应逃逸出溶酶体，使蛋白/质粒DNA释放至细胞中免受溶酶体的降解。
基因编辑的具体步骤为：按质量比为1:105～109，将矿化的纳米颗粒与细胞混合后共培养，当细胞为真菌细胞时，培养后挑出突变单克隆(肉眼可见发生变异的菌丝)；当细胞为动物细胞或植物细胞时，提取混合基因组与RNA。
本实施例中的基因编辑能够导致基因敲除、基因矫正。
本发明实施例中，当蛋白/质粒DNA选用Cas9蛋白或其对应的质粒DNA时，细胞选用真菌细胞。
下面，通过6个实施例对本发明进行详细说明
实施例1 CRISPR/Cas9 RNPs的生物矿化
向183ul矿化缓冲液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH＝7.5)中加入11μl浓度为60mM Na2HPO4(可以为其他正磷酸盐，如NaH2PO4、KH2PO4等)并震荡混匀，加入50ul所需矿化的RNPs并混匀，然后加入25μl of 100mM CaCl2(可以为硝酸钙)并震荡混匀，在室温下静置2～10mins，待溶液变得不透明并没有出现肉眼可见的沉淀时，加入5ul 1M PAA(PolyacrylicAcid，聚丙烯酸)并震荡混匀后，在转速为12000rpm的条件下离心10min，去除上清液，加入100ulddH2O(重蒸水)洗涤两次除去未矿化的分子，将沉淀物即矿化后的纳米粒子超声分散于ddH2O中。
参见图2所示，其中，图2a为对矿化后的磷酸钙纳米颗粒进行TEM(透射电子显微镜)表征的示意图，由图可知矿化后的磷酸钙纳米颗粒呈均匀度的100～200nm的圆球形貌。
参见图2b可知，矿化后的磷酸钙纳米颗粒水合后在动态光散射下的粒径较为集中，主要于100nm～180nm左右分布，证明其具有良好的分散性。
参见图2c为对矿化后的磷酸钙矿化纳米颗粒在TEM的同时进行电子衍射的测试，图中显示无衍射环及衍射点出现，证明本实施例的磷酸钙矿化纳米颗粒中的磷酸钙为无定形磷酸钙。
参见图3所示，为对生物矿化自组装形成的磷酸钙矿化纳米颗粒进行TEM-mapping(元素分析)，由图可知，C、N元素为RNPs的特有元素，Ca、P为磷酸钙成分，这些元素共定位在同一矿化的纳米颗粒中，证明矿化后RNPs被成功搭载进磷酸钙纳米颗粒中。
实施例2、生物大分子的矿化搭载效率与酶活测定
S201、制备搭载生物大分子的矿化纳米颗粒
向183ul矿化缓冲液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH＝7.5)中加入11μl浓度为60mM Na2HPO4并震荡混匀，加入50ul所需矿化的Cas9蛋白或质粒DNA并混匀，然后加入25μlof 100mM CaCl2并震荡混匀，在室温下静置2～10mins，待溶液变得不透明并没有出现肉眼可见的沉淀时，加入5ul 1M PAA并震荡混匀后，在转速为10000rpm的条件下离心10min，取上清液，得到搭载生物大分子的矿化纳米颗粒溶液，以下简称大分子溶液。
S202、同时，除了使用矿化缓冲液替换CaCl2外，其它处理方式均与步骤S201相同，取上清液，得到对比溶液。
S203、分别对大分子溶液、对比溶液进行电泳，其中，含有Cas9蛋白的大分子溶液使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，含有质粒DNA的大分子溶液使用琼脂糖凝胶电泳，对比溶液使用的凝胶与相对应的大分子溶液相同，结果如图4a、b所示，经过生物矿化后，上清液中仅存几乎不残留游离的生物大分子，证明经矿化反应后，蛋白和核酸可以高效率地被搭载进矿化后的磷酸钙纳米颗粒中。
S204、将步骤S201离心后的纳米颗粒沉淀物使用储存缓冲液分散(储存缓冲液为50Mm Tris-HCl，300mM NaCl，0.1mM EDTA，20％glycerol(甘油)，1mM DTT(DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇)，0.5mM PMSF(Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟)，pH＝8.0)，使用0.1M稀盐酸调至PH＝5～6.5时溶解，吸取2ul溶解出的Cas9蛋白与1ul sgRNA在37℃的条件下共孵育形成RNPs，向RNPs溶液中加入5ul相应的靶标DNA片段、1.5ul酶切反应缓冲液和5.5ul无RNA酶的水混合后，在温度为37℃的条件下反应50min，然后在80℃的条件下放置5min后使用琼脂糖凝胶电泳检测切割效率，参见图4c所示可知，矿化后的Cas9蛋白仍然具有对靶标DNA 100％的精准切割活性，证明RNPs的生物矿化策略在保护其生物大分子的同时不会影响其中蛋白质的功能。
实施例3、矿化后对生物大分子的保护
S301、制备搭载生物大分子的矿化纳米颗粒，作为矿化保护组
在183ul矿化缓冲液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH＝7.5)中加入11μl浓度为60mM Na2HPO4并震荡混匀，加入50ul所需矿化的sgRNA或DNA并混匀，之后加入25μl of100mM CaCl2并震荡混匀。室温静置2～10mins,待溶液变得不透明且并没有出现肉眼可见的沉淀，加入5ul 1M PAA，并震荡混匀。
S302、制备无大分子的矿化纳米颗粒作为对照保护组
除使用同体积的ddH2O替代sgRNA或DNA外，其他反应条件均与S301相同。
S303、向矿化保护组、对照保护组中分别加入2ul RNaseA/2ul重组DNA酶，在37℃的条件下孵育。
加入sgRNA的矿化保护组、对照保护组分别于5min，10min，30min，60min取样加入上样缓冲液后置于冰上终止反应，将所有取样样品均使用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
加入DNA的矿化保护组、对照保护组分别于10min，20min，30min，12h取样加入上样缓冲液后置于冰上终止反应，将所有有取样样品均使用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
参见图5a、5b可知：未矿化的RNA与DNA在暴露在相应的核酸酶环境中很快被水解，而矿化后的核酸分子与核酸酶共孵育则无明显的降解出现，证明本实施例中通过生物矿化的递送策略可以有效保护生物大分子免受外界环境对其的破坏。
实施例4、绿色荧光蛋白的生物矿化与细胞内递送
将步骤S201中所需矿化的RNPs替换为绿色荧光蛋白，其余反应条件均与步骤S201相同，将矿化后的纳米粒子进行超声分散于真菌细胞的再生培养基中进行培养(再生培养基为：34.2％蔗糖，1％酪蛋白水解粉，1％酵母浸粉)。
矿化离心后的图片参见图6a所示，绿色蛋白集中于离心后的矿化的纳米颗粒中。参见图6b所示，矿化后的纳米颗粒水合粒径分布在100～200nm，具有良好的分散性。
将生物矿化后绿色荧光蛋白纳米颗粒加入真菌原生质体中共培养12h，使用共聚焦激光显微镜观察，其结果如图6c所示，绿色荧光富集于细胞中(图中白色部分为荧光)，证明矿化后的纳米颗粒能将绿色荧光蛋白递送并释放至细胞中。
实施例5、使用CRISPR/Cas9 RNPs矿化后形成的磷酸钙纳米颗粒实现基因编辑
S501、将步骤S201中所需矿化的RNPs替换为CRISPR/Cas9RNPs，其余反应条件均与步骤S201相同，将矿化后的纳米粒子超声分散于真菌细胞的再生培养基中。
S502、向矿化的纳米颗粒中加入107数量级的真菌原生质体，在温度为28℃的条件下共培养12h后涂布在完全培养基平板(当与动物细胞或植物细胞共培养后，提取混合基因组与RNA)(完全培养基为：0.6％的酵母浸粉，0.3％的酶解酪蛋白，0.3％的酪蛋白水解粉和1％的D-葡萄糖)。
涂布平板后48h从完全培养基平板上挑出突变单克隆，其结果如图7a所示，对突变单克隆提取基因组、PCR靶基因后测序确定，测序结果如图7c所示，实现了靶基因的移码突变，多数突变集中于碱基T的插入突变。
图7中，WT(wide type，野生型)，KO(对照组)，hybird(杂交型)。
将提取出的混合基因组使用PCR扩增出靶基因片段，使用T7核酸内切酶1测试其编辑效率，琼脂糖电泳结果如图7b可知：与单独使用CRISPR./Cas9 RNPs相比，进行矿化的CRISPR./Cas9 RNPs(Bm-RNA)编辑效率提高了20％。
向矿化的纳米颗粒中加入107数量级的动物细胞共培养，其编辑效率与未矿化的CRISPR./Cas9 RNPs相比，提高25％；向矿化的纳米颗粒中加入109数量级的植物原生质体共培养时，其编辑效率与未矿化的CRISPR./Cas9 RNPs相比，提高30％。(使用动物细胞、植物原生质体时，培养条件根据实际需要进行调整)
提取出的混合RNA使用反转录荧光定量PCR检测靶基因的转录水平，统计结果如图7d所示，由此可知，与单独使用CRISPR/Cas9相比，靶基因的总体转录水平下降越20％，表明基于矿化后的RNPs有效进入细胞核中进行基因编辑，与直接使用CRISPR./Cas9 RNPs相比，显著提高了基因编辑效率。
实施例6、CRISPR/Cas9 RNPs矿化后形成的磷酸钙纳米颗粒脱靶效应分析
S601、该步骤与S501相同。
S602、将最后矿化后的纳米粒子超声分散于真菌细胞的再生培养基中，向矿化的纳米颗粒中加入107数量级的真菌原生质体，在温度为28℃的条件下共培养12h后提取混合基因组。
使用局部序列比对工具筛选出基因组范围内潜在的七个可能靶点，分别设计引物后对其PCR扩增，分别使用T7核酸内切酶1检测其编辑结果，结果如图8所示，七个潜在靶点均无T7E1脱靶切割出现，证明该基于RNPs生物矿化的基因编辑能够在提高编辑效率的同时，有效降低了CRISPR/Cas9系统的脱靶效应。
实施例7制备搭载生物大分子的矿化纳米颗粒
向183ul矿化缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH＝7)中加入10.4μl浓度为60mM Na2HPO4并震荡混匀，加入50ul所需矿化的Cas9蛋白并混匀，然后加入30μl of 100mMCaCl2并震荡混匀，在室温下静置2～10mins，待溶液变得不透明并没有出现肉眼可见的沉淀时，加入5ul 1M氯化镁溶液并震荡混匀后，在转速为12000rpm的条件下离心10min，取上清液，得到搭载生物大分子的矿化纳米颗粒溶液。
本实施例制备的矿化纳米颗粒，同样呈均匀度的100～200nm的圆球形貌，具有良好的分散性，且矿化纳米颗粒中的磷酸钙为无定形磷酸钙，具有较好的活性。
实施例8
制备搭载生物大分子的矿化纳米颗粒
向183ul矿化缓冲液(20mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH＝8)中加入12μl浓度为60mMNa2HPO4并震荡混匀，加入50ul所需矿化的质粒DNA并混匀，然后加入28μl of100mM CaCl2并震荡混匀，在室温下静置2～10mins，待溶液变得不透明并没有出现肉眼可见的沉淀时，加入5ul 1M硝酸镁溶液并震荡混匀后，在转速为13000rpm的条件下离心10min，取上清液，得到搭载生物大分子的矿化纳米颗粒溶液。
本实施例制备的矿化纳米颗粒，呈均匀度的100～200nm的圆球形貌，具有良好的分散性，且矿化纳米颗粒中的磷酸钙为无定形磷酸钙，具有较好的活性。
本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (8)

1.一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
按体积份，将1份浓度为60mM的可溶性磷酸盐加入15～18份缓冲溶液中混合均匀，该缓冲溶液的pH值为7～8、渗透压为150～300mM，且不含P和/或Ca；向混合液中加入4～5份待矿化的CRISPR/Cas9 RNPs混合均匀后，加入2.27～2.88份浓度为100mM的可溶性钙盐混合均匀并静置至溶液为不透明且没有出现肉眼可见的沉淀时，加入分散剂震荡混合均匀并离心、纯化，所述RNPs为Cas9蛋白与sgRNA组装形成的RNPs。
2.如权利要求1所述的一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒制备方法，其特征在于：所述可溶性钙盐为氯化钙或硝酸钙，所述可溶性磷酸盐为正磷酸盐。
3.一种采用权利要求1或2所述的方法制备的生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒，其特征在于：所述纳米颗粒的粒径为100～200nm。
4.一种采用权利要求1或2中生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒用于基因编辑的方法，其特征在于：使细胞与矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒接触。
5.如权利要求4所述的一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒用于基因编辑的方法，其特征在于：所述细胞为动物细胞。
6.如权利要求4所述的一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒用于基因编辑的方法，其特征在于：当所述细胞为植物细胞或真菌细胞时，选用其对应的原生质体与矿化纳米颗粒相接触。
7.如权利要求4所述的一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒用于基因编辑的方法，其特征在于：所述纳米颗粒与细胞的质量比为1:10 5 ～10 9 。
8.如权利要求4所述的一种生物矿化的CRISPR/Cas9 RNPs纳米颗粒用于基因编辑的方法，其特征在于：所述基因编辑能够导致基因敲除、基因矫正。
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