CN112553238A - 一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 - Google Patents
一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112553238A CN112553238A CN202011456823.7A CN202011456823A CN112553238A CN 112553238 A CN112553238 A CN 112553238A CN 202011456823 A CN202011456823 A CN 202011456823A CN 112553238 A CN112553238 A CN 112553238A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vector
- crispr
- fragment
- pfc332
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 241000887182 Paraphaeosphaeria minitans Species 0.000 title claims abstract description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims abstract description 22
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 51
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 12
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 10
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 10
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 10
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 9
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 6
- 241000607473 Edwardsiella <enterobacteria> Species 0.000 claims description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 6
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 abstract description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 150000004141 diterpene derivatives Chemical class 0.000 abstract description 2
- 241000207929 Scutellaria Species 0.000 abstract 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract 1
- 241000315390 Paracamarosporium hawaiiense Species 0.000 description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- -1 diterpenoid compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 2
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000858029 Paraconiothyrium Species 0.000 description 2
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 2
- 101710135150 (+)-T-muurolol synthase ((2E,6E)-farnesyl diphosphate cyclizing) Proteins 0.000 description 1
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710119400 Geranylfarnesyl diphosphate synthase Proteins 0.000 description 1
- 101710107752 Geranylgeranyl diphosphate synthase Proteins 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000004270 Peptidyl-Dipeptidase A Human genes 0.000 description 1
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012543 microbiological analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。本发明首次利用启动子优化后的新型CRISPR/Cas9系统构建二萜类新骨架化合物生物合成基因被敲除的重组拟盾壳霉FS482菌株,建立了一种高效的适用于深海真菌拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除体系,从而为拟盾壳霉FS482新型活性次级代谢产物的生物合成机制的阐明以及获得更多具有显著生物学活性的新型次级代谢产物奠定分子生物学基础。
Description
技术领域
本发明属于生物化学和分子生物学技术领域,具体涉及一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。
背景技术
深海真菌Paraconiothyrium_hawaiiense FS482是一种来源于深海的拟盾壳霉,该真菌能产生具有抑制血管紧张素转化酶的新骨架二萜类化合物,因此具有发掘抗高血压类药物先导化合物的潜力。在此基础上,对P._hawaiiense FS482进行了基因组测序,预测了新骨架化合物的生物合成基因簇。预测该化合物由含有萜类环化酶、P450单加氧酶和甲基转移酶的cluster 66生物合成,P450单加氧酶对其骨架的形成及修饰都发挥重要功能。因此有必要对P450进行缺失以验证其在二萜类新骨架化合物生物合成过程中的功能。但是目前深海真菌P._hawaiiense FS482基因敲除体系尚未成功建立,限制了其活性次级代谢产物生物合成机制解析。因此,本发明将首次建立深海真菌P._hawaiiense FS482的基因敲除体系,从而为活性次级代谢产物生物合成机制的解析及通过合成生物学策略获得得更多新型衍生物奠定基础。
CRISPR/Cas9是一种由sgRNA介导Cas9核酸酶对靶向基因进行切割的基因编辑技术。通过对Cas9的突变及融合可使CRISPR/Cas9系统广泛应用于目的基因的转录激活、甲基化修饰和单碱基突变等。CRISPR/Cas9系统由于构建简单、基因敲除效率相对较高、可控性强、成本较低等优点已经在哺乳动物细胞、干细胞、酵母、细菌的基因组编辑方面有着十分广泛的应用,而由于深海真菌独特生境导致的相对复杂的遗传背景,且CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中敲除效率相对较低。
发明内容
本发明的目的在于克服目前深海真菌缺乏有效的遗传操作手段的现状,提供一种适用于拟盾壳霉FS482(Paraconiothyrium_hawaiiense FS482)的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。
本发明首次将优化后的CRISPR/Cas9系统应用于深海真菌拟盾壳霉目的基因的敲除。
本发明的第一个目的是提供一种适用于丝状真菌的CRISPR/Cas9基因敲除载体,其是通过以下步骤制备得到的:
a.采用限制性内切酶PacI对pFC332载体进行酶切,对酶切后的pFC332载体进行回收;
b.以pG-F:CATCTAGAGGGCCGCTTAATGAGGACCGCTCGTCCCCTAT和PG-R:CTAGTAATGCGTAGAGGTGCGTCTGCCATGGTGATGGGAC为引物,以埃德菌FS110基因组DNA为模板,扩增并回收得到pG启动子片段;
c.将pG启动子片段采用同源重组插入至酶切后的pFC332载体,菌液PCR和测序验证pG启动子的插入,构建得到pG-pFC332载体。
通过上述的构建方法,将pFC332载体中的原启动子替换为转录活性更强的pG启动子。
优选,所述的丝状真菌为拟盾壳霉FS482。
本发明还提供一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法,包括以下步骤:
a.在所述的pG-pFC332载体的基础上,设计P450基因的靶点序列5'-tcagttgatcgagaagatag-3',设计并扩增5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段,然后以5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段为模板,进行融合PCR得到5SrRNA-P450-sgRNA片段;
b.用限制性内切酶PacI和BglII双酶切pG-pFC332载体、5SrRNA-P450-sgRNA片段,然后用T4 DNA连接酶将5SrRNA-P450-sgRNA片段连接至pG-pFC332载体中,连接产物转化至DH5α感受态细胞,Amp抗性筛选,扩增5SrRNA-P450-sgRNA片段进行验证,由此获得适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
优选,所述的5SrRNA片段,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述的含靶点序列的sgRNA片段,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供按照所述的构建方法构建得到的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
本发明还提供一种CRISPR/Cas9载体应用于拟盾壳霉FS482中P450基因敲除的方法,将所述的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体通过原生质体转化法导入拟盾壳霉FS482原生质体中,对目标基因进行敲除。
优选,以拟盾壳霉FS482基因组为模板扩增P450基因的上下游同源臂LR和RR,然后以LR和RR为模板进行融合PCR,得到LRR片段;通过PEG介导法将所述的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体和LRR片段导入拟盾壳霉FS482原生质体,用潮霉素抗性PDA平板筛选阳性克隆,挑取克隆扩大培养提取基因组DNA验证重组载体的导入,并通过同源臂两端引物验证目标基因的敲除。
本发明构建了适用于深海真菌P._hawaiiense FS482的CRISPR/Cas9载体,并对新骨架抗肿瘤化合物的关键生物合成基因进行敲除,并通过代谢产物对比分析进一步验证目的基因的功能,为后期解析P._hawaiiense FS482中新骨架二萜类化合物生物机合成制奠定分子生物学基础。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
目前,真菌的基因敲除一般采取导入目的基因同源臂通过同源重组介导的方法进行基因敲除,但丝状真菌中存在非同源末端修复和同源重组两种修复方式,而同源重组发生的效率较低,因此导致丝状真菌的基因编辑进展缓慢,严重阻碍了丝状真菌的遗传操作改造和新型次级代谢产物的发掘。CRISPR/Cas9基因敲除系统具有载体构建简单,基因敲除效率相对较高等优势。本发明通过导入更高效的重组pG-pFC332载体和P450目的基因的同源臂,敲除效率达到100%。因此新型CRISPR/Cas9载体介导的同源重组具有高效敲除目的基因的优势,从而为解析P._hawaiiense FS482中活性次级代谢产物生物合成机制并促进其代谢工程改造。
本发明涉及的拟盾壳霉FS482(Paraconiothyrium_hawaiiense FS482)已于2019年12月11日公开于非专利文献(网页)中,其网址为:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN788 608.1/,该菌种申请人本人也持有,并保证自申请日起20年内向公众提供。
本发明涉及的埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110公开于专利申请号201711107680.7,发明名称为:一种埃德菌FS110谷胱甘肽硫转移酶基因GliG启动子及其应用。
附图说明
图1为pG-pFC332重组载体的构建;其中,泳道1-5为以重组菌为模板,扩增pG启动子菌液PCR结果;
图2为重组载体pG-pFC332-sgRNA的构建图:图A为融合片段5SrRNA-P450-sgRNA片段的获得;图B为融合片段5SrRNA-P450-sgRNA片段插入pG-pFC332-sgRNA载体的验证;
图3为P._hawaiiense FS482 P450基因左右同源臂融合片段的获得;
图4为潮霉素抗性平板筛选获得的P._hawaiiense FS482转化子;
图5为P._hawaiiense FS482野生菌和重组菌DNA为模板P450同源片段的扩增;
图6为P._hawaiiense FS482 P450基因同源片段测序验证图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:靶向新骨架二萜化合物生物合成基因敲除载体的构建
在原始pFC332质粒基础上,对pFC332进行PacI单酶切,在pFC332载体Cas9基因启动子两侧设计同源臂序列,结合埃德菌(Dichotomomyces cejpii)FS110启动子pG碱基序列(pG启动子经体外荧光素酶转录活性实验和潮霉素抗性基因筛选酵母实验证实具有比pgpdA启动子更强的转录活性),设计引物序列pG-F:CATCTAGAGGGCCGCTTAATgaggaccgctcgtcccctat和pG-R:ctagtaatgcgtagaggtgcgtctgccatggtgatgggac;以埃德菌(Dichotomomycescejpii)FS110基因组为模板,以上述的pG-F和pG-R为引物,扩增pG启动子序列。PCR程序:94℃预变性5min;94℃变性10s,55℃退火15s,72℃延伸10s,35个循环;最后72℃延伸10min。回收pG启动子,采用同源重组试剂盒(上海翌圣生物科技有限公司)将pG启动子插入pFC332载体;用Hieff Clone Plus One Step Cloning Kit试剂盒将pG启动子通过同源重组连接至已纯化的双酶切pFC332载体,所采用连接体系为:pG启动子2μL,pFC33 2 1μL,HieffClone预混液10μL,ddH2O 7μL,总体系20μL;将连接混合液用移液枪轻轻吹打混匀,50℃孵育30min。转化DH5α,用含Amp的LB平板筛选,挑取克隆扩大培养,用pG-F和pG-R为引物进行菌液PCR验证,结果如图1所示,泳道1#,2#,3#和5#均扩增得到目的片段,经测序验证,pG启动子成功插入pFC332载体,由此构建得到重组的pG-pFC332载体。
然后将含有靶标的sgRNA序列插入至pG-pFC332载体:5SrRNA启动子-靶向序列-sgRNA-sgRNA终止子(5SrRNA-P450-sgRNA片段)通过融合PCR获得。其中引物5SrRNA-sgRNA-F中包含了目标基因P450 ctg417(P450基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)中的靶标序列tcagttgatcgagaagatag。
构建载体所设计的引物如表1所示,并利用酶切连接方式构建pG-pFC332-sgRNA-P450载体。构建方法具体如下所示:
表1引物序列
以P._hawaiiense FS482基因组DNA为模板,以引物5SrRNA-promoter-F、5SrRNA-pro moter-R为前后引物,用Prime STAR MAX(TAKARA,日本)高保真预混液进行PCR扩增,得到含有一个BglII酶切位点的5SrRNA片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。人工合成sgRNA及其终止子序列,以引物5SrRNA-sgRNA-F(含P450靶点gRNA)、sgRNA-Ter minator-R为前后引物进行PCR扩增,得到含有一个PacI酶切位点、sgRNA及其终止子的含靶点序列的sgRNA片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。以上述制备得到的5SrRN A片段和含靶点序列的sgRNA片段为混合模板,用Prime STAR MAX(TAKARA,日本)高保真预混液进行融合PCR,从而得到5SrRNA-P450-sgRNA片段(图2A)。对pG-pFC332质粒进行PacI和BglII双酶切(Fermentas,USA),对得到的5SrRNA-P450-sgRNA片段进行PacI和BglII双酶切,将酶切后的片段用T4 DNA连接酶进行连接,连接产物转化至DH5α感受态细胞,Amp抗性LB平板37℃筛选,通过扩增融合片段进行菌液PCR,成功获得250bp左右的5SrRNA-P450-sgRNA片段(图2B)并测序验证,得到靶向P._hawaiiense FS 482中P450基因的CRISPR/Cas9载体,命名为pG-pFC332-sgRNA-P450。
基因P450 ctg417同源臂的扩增与融合:以P._hawaiiense FS482基因组为模板,以表1中的引物LR-F和LR-R扩增左同源臂LR,长度约为750bp;以P._hawaiiense FS482基因组为模板,以表1中的引物RR-F和RR-R扩增右同源臂RR,长度约为750bp(图3);然后以LR和RR为混合模板,用Prime STAR MAX(TAKARA,日本)高保真预混液进行融合PCR,PCR程序:94℃预变性5min,94℃变性10s,60℃退火15s,72℃延伸30s,35个循环,最后72℃延伸10min。获得1500bp左右的融合片段LRR(图3)。
实施例2
P._hawaiiense FS482中P450基因生物合成基因的敲除:
外源基因导入P._hawaiiense FS482原生质体方法如下:
(1)P._hawaiiense FS482原生质体制备方法如下:
挑取适量P._hawaiiense FS482的菌丝接种于200mL PDA液体培养基中,30℃、180r/min培养7天。用两层纱布将菌液过滤,挑选生长较好的菌球2g(湿重)于50mL离心管中,用PBS缓冲液洗涤两次,使残留的PDA培养基充分洗去。称取0.15g溶菌酶(sigma,USA)溶解于20mL KC缓冲液(0.6M KCl、0.05M CaCl2),并用0.22μm滤膜过滤,加入洗涤好的菌球中。28℃、68rpm裂解3小时左右。用200目的滤网过滤裂解液,过滤菌丝,再用8层无菌擦镜纸再次过滤,4℃、4000×g离心5min,弃上清。加入5mL KC缓冲液,用移液枪将沉淀轻轻吹打混匀,4℃、4000×g离心5min,弃上清。加入1mL KC缓冲液,重悬,即原生质体制备完成,镜检,观察P._hawaiiense FS482原生质体的形态和数量。
将制备好的P._hawaiiense FS482原生质体(1×108/mL)与5μg pG-pFC332-sgRNA-P450质粒以及3μg同源臂融合产物LRR混匀,置于冰上5min,然后再加入200μL体积分数30%PEG4000,30℃放置15min,再加入400μL PEG4000,30℃放置15min,然后加入1.2mLW5溶液终止反应,最后加入4mL的WI缓冲液放置于30℃摇床80rpm低速过夜培养;
(2)将融化的PDA固体培养基冷却至室温后,每次取20mL与步骤(1)中过夜培养的溶液轻轻混匀,此外再加入终浓度为100μg/mL的潮霉素,混匀后均匀涂板,30℃培养5d;
(3)长出较小的菌丝体后,再挑取真菌菌落转移至含终浓度为50μg/mL潮霉素的PDA培养基上,再进行筛选;
(4)在步骤(3)中潮霉素PDA平板上长出的阳性克隆(图4)菌丝先进行保存(即挑取部分菌丝转移至新的潮霉素PDA平板),然后将剩余真菌菌丝置于无菌EP管中,加入液氮充分研磨,然后立刻放在100℃的水浴锅中5min,然后再放在液氮中1min,重复该过程3次,最后加入50μL超纯水溶解,最大转速离心5min,取上清(即总基因组DNA)放置于-20℃保存。采用LR-F和RR-R扩增目的片段,并在右同源臂中间设计引物Ver-R,和LR-F(见表1)扩增同源臂验证目的基因是否成功缺失以及同源臂是否整合在基因组中;结果表明,以野生P._hawaiiense FS482基因组DNA为模板时可扩增获得2.8bp左右含有P450基因的同源片段,而以突变株为模板仅获得1.1bp左右的P450基因缺失的同源臂融合片段(图5),通过测序验证,P450目的基因(1.7kb)通过同源重组完全缺失(图6)。证实所导入同源臂片段成功整合至P._hawaiiense FS482基因组中,并成功敲除P450目的基因。结果表明,本发明所构建的优化后的pG-pFC332-sgRNA-P450新型CRIPSR/Cas9系统载体能成功敲除深海真菌P._hawaiiense FS482中的目的基因,而且该筛选平板上仅长出一个克隆,经验证目的基因被成功敲除。经过重复验证结果亦然,说明本发明中新型CRIPSR/Cas9系统介导的同源重组敲除目的基因效率达100%,本发明同样也适用于其他丝状真菌,从而为丝状真菌目的基因的缺失提供了一种可靠的方法。
序列表
<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
<120> 一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 128
<212> DNA
<213> 拟盾壳霉FS482(Paraconiothyrium hawaiiense FS482)
<400> 1
cgcagatctc acatacgacc acagggtgtg gaaaacaggg cttcccgtcc gctcagccgt 60
acttaagcca cacgccggga ggttagtagt tgggtgggtg accaccagcg aatcccttct 120
gttgtatg 128
<210> 2
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaatccctt ctgttgtatg tcagttgatc gagaagatag gttttagagc tagaaatagc 60
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtggtgct 120
ttttttgttt tttatgtctg aattctgcag atatccatca cactggcggc cgctcgagca 180
tgcatctaga gggccgctta attaagac 208
<210> 3
<211> 1721
<212> DNA
<213> 拟盾壳霉FS482(Paraconiothyrium hawaiiense FS482)
<400> 3
atgggtgggc actggcatct tgtcgtccaa gaagctcata aaagctacgg tacgtacact 60
catgctttat gatcgagctt atccctaatc tgacgacctg ggtaggcgac gtgctacgtg 120
tgagcccaaa cgaactgtct tttgccaacg ccagtgcttg gaaatccata tatggtgtcc 180
aaaaaggcgc accaatcacg aagtcggaat tctgggatat gataggtctg ggattcgacg 240
ctgcatccat tggctcagaa cgagattacc acgctgcttt acggaaacgc gaattgtttg 300
ctgaagcgtt ctctgacaga aatttggcca aacaagaacc tattatgcaa atcttcgtta 360
atcagttgat cgagaagata gggaagctag gtaacactga tgttggaata gacatggaca 420
agtggttcgt gtactttagc ttcgacttga cggggaaaat ggcgttcggg gagtccttcg 480
cctgtcttga aaaaggttgt tacaccgttg tattgtccta catgagagag actgaccatt 540
tgatacagag acgtcacatg aatggctcga tctcattctg cctctctttt tcattgtcaa 600
cgtagccgat aatttcagac gccttccatt cgtagtgacg ctggctagca tgattcccac 660
aaaatggacg aatggcatcc gtagtaagat tgttaaatat tccaaggacc agactgcaaa 720
gtacgtcgtg ttctttcagt gaattggacg aaagcttcaa ctaaatatct ggcaatagac 780
gccttcaggt gaccagtatg cagaatgact ttttcgataa tgtgtccgac aaagttcgga 840
aaggcgaagt ctctgaggaa gaaatggccg ctcatctatt caccttgagg tgagtccccc 900
tgtcaggtgc tgccttgagc tggatgacca aagtgcctaa tacgctagta gtgttgcagc 960
aggagagaca tccgcaacag caatgagcgg aatgctttat tacttgctca gcactcccat 1020
ggcgcatgaa aagctcaaaa gcgaagttcg cggggcgtac gagaatgctc aggacatcga 1080
tattgcttca acccttaggt taccatatct ccaagcggtg ttcaaagaag caatgcgaat 1140
atttcccgta gtgccacaag gcctaccgcg cctgtcgcct ggagctgtga tcgaaggaac 1200
ttatgttcca caaggagtga gatagtatca caatccggct cattgcatat atgcctaaca 1260
ttcggcagac tgagatatat gtgtctggat gggcagtcac ccatgatgag cgctactttc 1320
atgagccata cactttcaaa ccagagcgct ggattgatcc agaatgtcag gacgtgaagc 1380
aggcgagcca accgttcgcc cttggacctc gtgtttgtcc aggaaaacgg tgagagactt 1440
tggccctaac aatgaagttg tagctcacgc ctccagtttt gcattctccc aaatgtcact 1500
tcaattggcg aagatggtct atctgtatga catggaactc cttgacagca gccgcaattg 1560
gaggtcggat tgtagggtcc actacttttg gtggaaaccg gctctgaacg tgcgcttcaa 1620
accgcgcgga cttagctttg tcgtaacgca aggtggctga gtaaattgtc cttcagatgc 1680
acttcacccc tggagagact ctgcgcgtga cgtctctcta g 1721
Claims (7)
1.一种适用于丝状真菌的CRISPR/Cas9基因敲除载体,其特征在于,是通过以下步骤制备得到的:
a.采用限制性内切酶PacI对pFC332载体进行酶切,对酶切后的pFC332载体进行回收;
b.以pG-F:CATCTAGAGGGCCGCTTAATGAGGACCGCTCGTCCCCTAT和PG-R:CTAGTAATGCGTAGAGGTGCGTCTGCCATGGTGATGGGAC为引物,以埃德菌FS110基因组DNA为模板,扩增并回收得到pG启动子片段;
c.将pG启动子片段采用同源重组插入至酶切后的pFC332载体,菌液PCR和测序验证pG启动子的插入,构建得到pG-pFC332载体。
2.根据权利要求1所述的载体,其特征在于,所述的丝状真菌为拟盾壳霉FS482。
3.一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
a.在所述的pG-pFC332载体的基础上,设计P450基因的靶点序列5'-tcagttgatcgagaagatag-3',设计并扩增5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段,然后以5SrRNA片段和含靶点序列的sgRNA片段为模板,进行融合PCR得到5SrRNA-P450-sgRNA片段;
b.用限制性内切酶PacI和BglII双酶切pG-pFC332载体、5SrRNA-P450-sgRNA片段,然后用T4 DNA连接酶将5SrRNA-P450-sgRNA片段连接至pG-pFC332载体中,连接产物转化至DH5α感受态细胞,Amp抗性筛选,扩增5SrRNA-P450-sgRNA片段进行验证,由此获得适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
4.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述的5SrRNA片段,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述的含靶点序列的sgRNA片段,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.按照权利要求3所述的构建方法构建得到的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
6.一种CRISPR/Cas9载体应用于拟盾壳霉FS482中P450基因敲除的方法,其特征在于,将权利要求5所述的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体通过原生质体转化法导入拟盾壳霉FS482原生质体中,对目标基因进行敲除。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,以拟盾壳霉FS482基因组为模板扩增P450基因的上下游同源臂LR和RR,然后以LR和RR为模板进行融合PCR,得到LRR片段;通过PEG介导法将所述的适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体和LRR片段导入拟盾壳霉FS482原生质体,用潮霉素抗性PDA平板筛选阳性克隆,挑取克隆扩大培养提取基因组DNA验证重组载体的导入,并通过同源臂两端引物验证目标基因的敲除。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011456823.7A CN112553238B (zh) | 2020-12-10 | 2020-12-10 | 一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011456823.7A CN112553238B (zh) | 2020-12-10 | 2020-12-10 | 一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112553238A true CN112553238A (zh) | 2021-03-26 |
CN112553238B CN112553238B (zh) | 2022-06-07 |
Family
ID=75061803
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011456823.7A Active CN112553238B (zh) | 2020-12-10 | 2020-12-10 | 一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112553238B (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112538496A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-03-23 | 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 |
CN114774459A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-07-22 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 一种香蕉枯萎菌CRISPR/Cas9基因编辑载体、制备方法及应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103255068A (zh) * | 2013-06-13 | 2013-08-21 | 云南大学 | 一种拟盾壳霉菌 |
CN107164375A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-09-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种新型向导RNA表达盒及在CRISPR/Cas系统中的应用 |
WO2019219046A1 (zh) * | 2018-05-16 | 2019-11-21 | 华中农业大学 | 一种快速高效获得非转基因的定向基因突变植物的方法和应用 |
CN111057713A (zh) * | 2019-12-18 | 2020-04-24 | 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 |
CN111138446A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-05-12 | 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 二萜类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 |
-
2020
- 2020-12-10 CN CN202011456823.7A patent/CN112553238B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103255068A (zh) * | 2013-06-13 | 2013-08-21 | 云南大学 | 一种拟盾壳霉菌 |
CN107164375A (zh) * | 2017-05-25 | 2017-09-15 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种新型向导RNA表达盒及在CRISPR/Cas系统中的应用 |
WO2019219046A1 (zh) * | 2018-05-16 | 2019-11-21 | 华中农业大学 | 一种快速高效获得非转基因的定向基因突变植物的方法和应用 |
CN111138446A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-05-12 | 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 二萜类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 |
CN111057713A (zh) * | 2019-12-18 | 2020-04-24 | 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
DOUGLAS R. COHEN 等: "A dual role for a polyketide synthase in dynemicin enediyne and anthraquinone biosynthesis", 《NAT CHEM.》, vol. 10, no. 2, 20 November 2017 (2017-11-20), pages 231 - 236 * |
REN FENGXIA 等: "Hawaiienols A-D, Highly Oxygenated p-Terphenyls from an Insect-Associated Fungus, Paraconiothyrium hawaiiense", 《JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS》, vol. 81, no. 18, 19 June 2018 (2018-06-19), pages 1752 - 1759 * |
黄自磊 等: "深海真菌Dichotomomyces cejpii 胶霉毒素生物合成基因启动子的克隆和功能鉴定", 《生物技术通报》, vol. 34, no. 4, 13 December 2018 (2018-12-13), pages 144 - 150 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112538496A (zh) * | 2020-12-23 | 2021-03-23 | 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 |
CN114774459A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-07-22 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 一种香蕉枯萎菌CRISPR/Cas9基因编辑载体、制备方法及应用 |
CN114774459B (zh) * | 2022-05-31 | 2024-03-12 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 一种香蕉枯萎菌CRISPR/Cas9基因编辑载体、制备方法及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112553238B (zh) | 2022-06-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107937432B (zh) | 一种基于crispr系统的基因组编辑方法及其应用 | |
CN107988229B (zh) | 一种利用CRISPR-Cas修饰OsTAC1基因获得分蘖改变的水稻的方法 | |
CN111057713A (zh) | 一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 | |
CN110607320B (zh) | 一种植物基因组定向碱基编辑骨架载体及其应用 | |
CN112553238B (zh) | 一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 | |
CN108034671B (zh) | 一种质粒载体及利用其建立植物群体的方法 | |
US20210130838A1 (en) | SYSTEMS AND METHODS FOR PLANT GENOME EDITING USING CAS 12a ORTHOLOGS | |
CN111073902A (zh) | 提升胶霉毒素生物合成基因表达水平的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用 | |
CN111057654B (zh) | 一种适用于巴戟天内生真菌A761的Cas9基因敲除载体及其构建方法和应用 | |
CN108603160B (zh) | 突变丝状菌的制造方法 | |
CN113265406A (zh) | 大豆fdl12基因编辑位点及其应用 | |
CN112359043B (zh) | 一种适用于拟茎点霉FS508的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 | |
CN108893486A (zh) | 一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用 | |
CN112760338B (zh) | 一种适用于深海真菌FS140的CRISPR/Cpf1载体及其构建方法和应用 | |
Takahashi et al. | Production of transgenic Italian ryegrass (Lolium multiflorum Lam.) via microprojectile bombardment of embryogenic calli | |
CN112538496A (zh) | 一种适用于露湿漆斑菌A553的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 | |
CN115786385A (zh) | 一种适用于深海真菌FS441的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 | |
EP4148129A1 (en) | Directed evolution method based on primary and secondary replicon of gemini virus | |
CN108546708A (zh) | 一种丝状真菌基因敲除突变体的筛选方法 | |
CN103525854A (zh) | 高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法 | |
CN114606254B (zh) | 一种副溶血弧菌基因高效敲除质粒的构建方法 | |
CN112899172B (zh) | 一种同源重组高效的鞘茎点霉属的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
CN112852805B (zh) | 水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法 | |
CN112481259B (zh) | 两种甘薯U6基因启动子IbU6的克隆与应用 | |
CN116445463B (zh) | 新型植物碱基编辑器pAYBEs |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 510070 No.56 courtyard, No.100 Xianlie Middle Road, Yuexiu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee after: Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences Address before: 510070 No.56 courtyard, No.100 Xianlie Middle Road, Yuexiu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee before: GUANGDONG INSTITUTE OF MICROBIOLOGY (GUANGDONG DETECTION CENTER OF MICROBIOLOGY) |