CN87107264A - 花粉介异的植物的转化 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了用于花粉介异的转化的植物和植物系的遗传转化的方法和装置。通过在以物理方式加速进入植物花粉中的载体微粒上的涂复把外源基团引入花粉中。然后用手使经处理的植物花粉授粉，重获后代，其中部分后代将在它们的染色体组织中含有外源基因。该工艺可以用于建立遗传工程玉米植物和玉米植物系。

Description

本发明涉及植物遗传工程的一般领域，具体地说，涉及通过以物理方式将传遗物质引入到植物花粉之中使外源的遗传物质进入到一种植物系的种系的转化。

目前，人们正大力致力于植物种的基因转化方面研究。据认为，把外源基因转入植物种系的有效手段的发展将使重要的经济作物种的遗传材料的多样性得到扩大，并能把特别感兴趣的功能基因有选择地引入作物种。以往关于植物种的转化或者遗传工程方面的努力和研究已取得一些成果，这些成果极其明显地取决于植物的种。

以往业已用作把外源基因引入植物的主要机构是从作为原生质体或者在称之伤愈组织的未经分化的组织中的单一植物细胞的转化开始。有人通过electroporation和显微注射将在植物细胞中起作用的嵌合基因引入到单胞植物的原生质体。然而，以往最广泛采用的转化技术是利用植物病原体根癌病土壤杆菌（Agrobacterium    tumefaciens）的天然特征的优点，它具有天生的能力可把部分DNA从藏于其中的Ti（Tumor-inducing）质粒转入感染的植物细胞之中。通过把外源基因插入到带有来自Ti质粒的某些顺序的土壤杆菌中的一些质粒中，细菌的转化特征可以被用来把外源基因输入到经感染的植物细胞的染色体组。业已发现，土壤杆菌介导的植物细胞的转化作用可用在许多典型的作物种例如烟草、矮牵牛属植物及胡萝卜中得到应用，但是它有两个很大局限性。第一个局限性是，介导作用只能在细胞水平上例如用体细胞组织进行，然后必须用人工方法使它们再生为整株植物。这就限制了土壤杆菌介导的杆菌遗传转化在那些可容易地从易感染土壤杆菌各种类型组织再生的作物中的可应用性。第二个局限性是土壤杆菌的天然宿主范围仅包括双子叶植物和有限的几个Liliaceae科的单子叶植物种。因此，尚未证明，土壤杆菌介导的转化作用对有商业价值的单子叶植物种，如谷类作物种是有效的工具。采用土壤杆菌介导的转化的另一个困难在于体细胞无性系变异体的产生，体细胞变异体在组织培养中的植物组织是自发地出现，从而可使转化突变型（转移基因接受体）的鉴定复杂化。

业已证明，至少某些嵌合基因的结构对外源基因在多数植物细胞中的表达是有效的。采用如electroporation一类技术对培养中的玉米原生质体的转化已证明这些嵌合结构在单子叶植物及双子叶植物中的功能度。然而，目前尚没有建立起从这种原生质体再生整株玉米或者整株其它任何重要作用物的一套方法。公知的是非整株、完整的转化的玉米植物已生产出来。尽管如此，玉米和其它作物的遗传转化是一个人们所期望的目标，因为这种普通作物具有很大的农业价值，并且有潜力可提高它们的价值和产量。

以往，至少有一种建议，即通过玉米花粉的遗传转化可以在遗传上使玉米转化。Dewet的公开的PCT专利申请WO85/01856大致上描述了一种通过植物花粉的转化把外源基因转移到显花植物的方法。其他人证实这一技术以及重复该实验的试图均遭失败。参见Sanford等人，Theor.Appl.Genet.，69（5-6），571-74（1985）。业有人作出得到相似结果的报告。参见Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83∶715-719（1986）。

本发明概括为一种从遗传上使植物系转化的方法。所说的方法包括以下步骤：制备一种包含外源基因和调节顺序的DNA顺序;将DNA顺序涂盖在生物学上的隋性的微粒上，用物理学方法使带有DNA的微粒向植物的花粉加速，以致该微粒进入并固定在花粉中;用所说的花粉使雌性亲本授粉;从授粉的后代中选择转化植物。

本发明还对准具有在插入到它们的功能表达的外源基因的玉米系。

本发明的另一个目的在于通过花粉转化以及在不需要植物的组织培养或者再生的情况下，不仅对玉米而且对其它重要的作物，进行遗传转化。

本发明的优点在于所说的方法是快而有效，易于检证和重复。

本发明的所说方法和由此所生成物质的优点在于可以简便快速地把经鉴定或未经鉴定的外源遗传物质引入到用于作物育种、分子生物学或者其它相似的农学或科学的目的的玉米的任何要求的遗传背景之中。

本发明的方法的另一个优点在于要得到无数的即几千个转化突变型是可能的和行得通的，因为与难以实施或者要求一个细胞一个细胞地处理的已有的体细胞转化技术或者显微注射相比，实施本方法是容易的。

本发明的其它目的、优点以及特点通过以下结合附图的说明将会更加清楚。

图1为实施本发明方法的装置的分解透视图;

图2为制作质粒pCMC    1208的方法中的质粒操作的图解说明;

图3为制作质粒pCMC    1022的方法中的质粒操作的图解说明。

在根据本发明所进行的花粉介导的植物遗传转化的实践中，以物理的方式把DNA传递到植物花粉的细胞溶质中，把DNA带到生物学上隋性的物质的单个小微粒上，使所说的微粒向花粉加速，以致于所说的微粒进入单个花粉细胞，但是既没有破坏它们也没有使它们失去能力。业已发现，以这种方式供给的DNA将被结合在该花粉的后代的遗传物质中。以这种方式所得的转化花粉可供植物和植物系的遗传工程应用。

有几种因素影响花粉介导的的转化的成功。其中使微粒加速的方式要优先仔细地安排，以使各个带有DNA的微粒具有适合的动量和速度，并且微粒本身应处于较均匀的图式中，当接触花粉时，它们穿过大量花粉细胞，并没有在生物学上使它们失去能力。因此，微粒上的DNA应当是稳定的，而且能使植物细胞转化和表达植物细胞中的所要求的特征。此外，DNA本身可含有一种可供选择的标记物，该标记可在已推定转化了的植物种子或者植物苗中被测到，以便证明该特定植物已发生遗传转化。如果转化频率足够高，那么这种可选择的标记物就不需要采用。可以预见到加速生物学上隋性的小载体微粒的机械系统有多种类型。可能的装置可包括微粒的弹道式爆炸加速、微粒的离心加速、微粒的静电加速或者能够给小的隋性微粒提供动量和速度的任何其它类似的系统。图1以图解方式说明了申请人优先采用的一种新的方法。这里所说明的方法采用由高压放电产生的冲击波。在图1中和通常以10表示的是用所说的方法加速隋性微粒用的加速器。如图1所示，一般以22表示的是用于在其上带花粉靶子的靶子表面。

加速器10是由几部分组成。火花放电室12设有一对电极14，延伸到它的内部。火花放电室12的几何形状对本发明来说并非至关紧要，只要该室被配置到能产生和提供具有可用于推动载体微粒的合适的特性和合适的方向的冲击波。申请人发现，内径为13毫米的聚氯乙烯塑料管的一段对用作火花放电区12是满意的。电极14以相对的两侧延伸到管的内部，设置在低于火花室12顶大约5毫米处。电极14本身由螺纹螺栓构成，延伸到在火花室12壁本身的内侧壁表面中形成的合适的螺纹中。构成电极14的螺纹螺栓的端部均用高压继电器上断开的触点的耐电弧合金保护，其尺寸为大约2毫米×2毫米×3毫米，并且焊接在螺纹螺栓的端部。通过适当地把螺栓旋进或旋出火花室12可调整电极14之间的间隙。电极端部之间的放电电压大约为15千伏时的最佳间隙为1-1.5毫米。电极14本身的制作和安装的方法显然有多种方式，尽管优先采用的电极是相当耐用的，电极之间的放电间隙的距离要易于调整。

火花室12上面设有间隔圈16。间隔圈16可以由与火花室12相同的PVC管构成，最好切割成垂直长度为6毫米。在用于单一作物种转化的固定装置中，间隔圈16应当仅被构成火花放电室12的垂直延伸部分，虽然可移动的和可替换的间隔圈16可调节火花放电到承载板的可变更的距离，使得粒的加速力可以按条件或者种来加以改变。如果采用大的承载板18，则可以使间隔圈16在顶上开口，但也可以方便地通过适当的密封部分地限制顶部开口以形成一个大约9毫米×13毫米的长方形孔。在间隔圈16顶上放置的是承载板18。承载板18是一块具有合适尺寸的光亮平板，放置在间隙圈12的顶上。承载板18是由柔软的生物学上隋性的板材构成，能够在其上装载生物学上隋性的微粒。承载板18的作用是把由火花放电发生的冲击波的力传递到加速的载体微粒上。业已发现，承载板18是由1毫米或0.5毫米涂复浸铝的聚酯薄膜的塑料构成，最好采用0.5毫米板，因为在实践中这种板具有较好的透入花粉的性能。根据通常的实践，承载板18的实际表面积越小，载体微粒进入花粉的穿透性越好。关于穿透性的这种看法由需要具有的承载板的尺寸来权衡，所说的板要易于处理且在足够大的范围内提供能够使塞满每种单独注入的大量花粉细胞的冲击图式。业已发现，9×11毫米的承载板是一种较好的尺寸，它可能以要求的冲击图式使微粒穿过花粉靶。

承载板的作用还在于安排微粒的图式，当它们接触靶子表面时。为了保证靶子上的许多细胞尽可能地被冲击，对微粒的图式的均匀性要求相当高，以便使转化突变型的效率达到最大。未转化的细胞、花粉或者相反可以与转化突变型一起处于竞争的有利地位或者它们被载体微粒部分地变弱。故而，要求尽可能以接近100%注入靶子细胞中，而承载板18上微粒的均匀层和图式有助于这个目的。

至于载体微粒本身，任何生物学上隋性的高密度材料均可用作本发明范围内的DNA载体微粒。最好采用金属材料，例如钨和金，其比重为19。铱也可优先采用，其比重为22，但申请人尚未用过，因为通常它只易买到粉末，而最好采用球粒。与金相比，钨也很少被采用，因为它在具有极低湿度的空气中就会氧化。载体微粒上的这种氧化层会使微粒结合在一起，当微粒聚集在一起时会引起平均粒度显著增大。以不规则聚集成块的粒颗对实施本发明是不适宜的，因为这种聚集将使其质量和大小有很大的变化，因此难以获得有规律的重复的结果。业已发现，金是用作本发明的微粒的一种最佳材料，因为它具有高的比重，对生物物质和氧化均是比较隋性的，并且具有1-3微米直径的球状体也容易从市场上买到。可以把合适的DNA顺序施加到金微粒上，再把金微粒以将在下文详细讨论的方式施加到承载板上。

在承载板18上放置的是保持筛20。保持筛20是一种100目不锈钢筛，以物理方式设置在间隔圈16上大约5毫米的塑料支架中。保持筛20的作用是把载体板18限制得它不能对靶子动作。

靶子表面22是一块平板材，能够悬浮靶子细胞，也即其上的花粉或者其它植物细胞。实践中业已发现，易于采用的靶子是一种陪替氏培养皿，尺寸为60毫米×15毫米，倒置在固定保持筛的组合件的顶上。从保持筛20到靶子表面22上靶细胞的间距最好为大约15毫米。在下述的电压条件和气压下，间距大于15毫米会降低载体微粒进入花粉的穿透性，而间距小于10毫米，会导致压碎细胞，结果使保持筛20在冲击波的力作用下变形。

如果用花粉作靶细胞，则必须以这样的方式，即用能存活的花粉可使靶子转化，将花粉施加于靶子。因为一般来说花粉对湿度是敏感的，所以把花粉附着在靶子上所用的方法应当是尽可能无湿度。业已发现，矿物油可用作这种附着剂。如果把矿物油的薄层施加在用作靶表面22的陪替氏培养皿的底部，则将花粉撒入培养皿，然后把培养皿翻过来去除多作的花粉，业已发现，较均匀的单层花粉粒保持在靶子上，所说靶子是在进行注射颗粒时将保持在原位，并且将保持存活。如果在该装置中用细胞而不是花粉，采用其它支承培养基如琼胶可能是较为合适的。

微粒加速器10和靶表面22的整个组合件必须被部分地抽成真空，以防大气阻力使微粒和（或）承载板18减速。真空应当仅仅是部分真空，因为高真空会使靶花粉细胞干燥，从而使它们不能存活。业已发现，足够且有利的真空度为460-480mmHg。

以下最简单地说明图1装置的操作，使加速器10点火的方法以在电极14之间放置一滴蒸馏水或者软化水24开始。水量必须加以选择，不使在电极之间出现的电弧减弱，但还是要有足够的水量，以便在出现放电时在火花室12的内部形成冲击波。业已发现，优先采用的水量大约为2-4微升。水量可用移液管使其悬挂在电极的端部之间来施加。水滴24跨接在电极之间并保持在位置中。

然后，把间隔圈16放置在火花室12的顶上，再把承载板18放置在间隙圈16的顶上。保持筛20被设置在承载板18上面5毫米处，由倒置陪替氏培养皿组成的靶表面22放置在安装保持筛20的上面。然后，把组合件抽真空到480mmHg。

在图1所示装置的外面，将电源连接上以产生15000伏DC。然后使其与电源断开。通过接通合适的开关，再把电容器上的15000伏电荷施加在电极14之间。

当施加电压时，放电电弧在两根电极14之间跳跃。电弧立刻使在电极之间延伸的小水滴汽化。来自水滴的爆炸式汽化的冲击波在整个火花室12的内部传播。当冲击波到达承载板18时，承载板18被垂直升起脱离间隔圈16并被加速朝向保持筛20。当承载板18击中保持筛20时，承载板18被限制在原位上，在承载板18上所带的微粒离开承载板，自由地飞越一段距离到靶表面22上静置的细胞上。如果该装置结构和调整合适并工艺合理，则很大百分比载体微粒将以正确的速度达到靶子，穿透在靶表面22上所带的细胞，而不破坏大量的细胞。然后，把靶表面22上的细胞从靶表面22中取出，选择合适的方式把转化突变型同未转化体分开。正如本方法中所优先采用的那样，如果采用花粉，则从靶表面22中取出花粉，并手工将花粉传给可结实的雌花上，例如玉米穗丝，雌花然后将结籽或者结粒。将种子收获起、种植以及评价以在载体微粒上所带的DNA传入花粉所制约的形态或者生物化学的特征。另外从正在发育的种子组织切下未成熟的胚，使胚在合适的组织培养中长出小的植物幼苗或者完整的植物。然后，对这些植株、植物苗或者来自它们的组织进行试验，以基于转化到花粉细胞的DNA中所带的可选择的标记物作选择。合适的可选择的标记物应当包括外源的抗性特征，例如对除草剂或抗菌素抗性，或者可以观察它们表达的显性形态特征。

可以认为，虽然图1的装置是为本发明的以花粉介异的植物转化的方法而专门研制成的，但该装置本身也可用于其它组织类型、植物、动物或者细菌的加速微粒转化。该装置通过改变间距或者放电电压容易调整微粒的力。本装置操作相当简单、效率高而且稳定，以致可重复结果。

在本发明的优先采用的方法中，把DNA顺序施加到微粒的方法、把微粒敷在载体板中的方法以及制备植物转化用的DNA的方法都要求特别注意。这些细节将一一进行讨论。

DNA顺序包括以适合于植物转化的形式制备的外源基因，可简单地在裸露金或者钨丸上干燥。然而，这种形式的DNA分子就会具有相当短期的稳定性和由于与微粒本身的金属的或氧化物的基质发生化学反应而相当迅速地降解。相反，业已发现，如果载体微粒先用包复剂涂复，则DNA链大大地改善了稳定性，甚至在几个星期内都无明显降解。业已发现，合适的包复剂是聚赖氨酸（分子量200，000），可以把它施加到载体微粒后再用DNA分子。其它的包复剂，如聚合物或其他的物质也可用作类似的包复剂。通过在0.02%的聚赖氨酸溶液中冲洗金微粒把聚赖氨酸施加到微粒上，然后在空气干燥或加热干燥由此对微粒涂复。一旦用聚赖氨酸链涂复的金属微粒经适合地干燥，则可以把DNA链载在微粒上。DNA可以每毫克金小球含有3-30微克DNA涂载在微粒上。实践中，应当加100微克DNA和30毫克用聚赖氨酸预涂复的1-3微米金球，随后是5微升10mM Na₂HPO₄，然后是5微升10mM Ca Cl₂，以提供细的Ca HPO₄沉淀物。这种沉淀物是由干燥而形成的。该沉淀物把与它一起的DNA带到小球上。一旦小球和磷酸盐和氯化钙的溶液与DNA混合，则悬浮液在氮气流中不断搅拌下干燥。一旦干燥，沉淀物立刻再悬浮在100%乙醇中，作为把微粒放置在载体板上的方法。

在把微粒施加到载体板中，作为这种工艺的成功的操作，最好是在载体板上形成均匀且可再现的载体微粒层。为此，微粒不能简单地撒在载体板上，因为它们会聚集，从而以不可再现的方式不均匀地分布在板上。具体地说，板上水份或者水含量将破坏微粒应用到板上并导致不希望的聚集。所以，首先必需用亲水涂料预涂复聚酯薄膜板，以防在施加载体微粒时弄上水。业已发现，羟基乙基纤维素可为该目的很好地工作，虽然其它类似的处理，例如酸性经水解纤维素，也是可行的。抹去涂复浸铝聚酯薄膜塑料上的1%羟基乙基纤维素的溶液，然后用离子化水冲洗，在空气中干燥。用包含悬浮在100%乙醇中的DNA链的沉淀涂料把载体微粒施加到载体板上。业已发现，以合适的均匀和可再现的方式成功地用移液管把50或100微升经充分搅拌的乙醇与载体微粒悬浮液吸移在聚酯薄膜板上。然后，使这种悬浮液的吸移部分安置在封闭的陪替氏培养皿中至少30秒钟。陪替氏培养皿必须密闭，以防室内空气流和从快速汽化引起的涡流形成，这种涡流可能会引起微粒的偏移，故而使微粒在板上呈不均匀分布。在放置期之后，弯液面方被破坏，排除多余的乙醇。在局部打开的陪替氏培养皿中蒸发去除残存的乙醇。

这种方法旨在把用含有DNA链的沉淀涂复的载体微粒置于聚酯薄膜承载板上。本发明中成功地发现的正好中间的速度为大约0.1毫米带沉淀的载体微粒，DNA施加到9×11毫米面积的承载板。承载板上用这种密度的载体微粒可使得花粉很好地存活，还可使加速微粒具有高的花粉粒的穿透力。微粒的实际的加速和对花粉粒的穿透力将随花粉粒大小和直径二者而变化，按需要给靶细胞的每个横截面积多少微粒，载体微粒的数目也显然是不同的。

在本发明中所用的DNA必须被建造到一个合适表达玉米或者本发明中用的其它的植物的细胞中外源基因的载体之中。DNA顺序可以是嵌合的，但也可以采用来自其它植物种或相同种的系的完全完整的非嵌合基因。适合于植物中表达的载体，除所要求的外源基因的编码顺序之外，一般来说必须包括合适的侧翼调节顺序，例如能够促进在植物细胞内转录和表达的合适的启动子和能够使转录末端发信号或者能够以信使的合适翻译产生蛋白质合成的方式适当的处理DNA的翻译终止区。上面业已说明，在双子叶植物中能够引起编码顺转录和表达的植物基因启动子在细胞水平上在诸如玉米的单子叶植物中也是有效的，尽管在某些情况下效果较差。Fromm等人.，Proc、Natl.Acad.Sci.USA，82：5824-5828，1985年9月。这种启动子包括来自植物病原体，根癌病土壤杆菌的蓝曙红合酶启动子和由花椰菜花叶病病毒顺序衍生的Ca    Mv35s启动子。植物中起作用的合适的终止顺序是来自根癌病土壤杆菌蓝曙红合酶基因的聚腺苷酸顺序。

植物表达载体也可含有在植物细胞中起作用的用于选择转化突变型植物的可选择标记物。可选择的标记物可以决定可作生化上测定的特征或者可在后代植物中观察到的表型特征。显然，如果本发明采用来自相同或者别的植物且具有侧翼调节顺序的非嵌合整体基因，则嵌合启动子或者控制顺序并非必要而可用具有其天然顺序的基因。

显然关于花粉介异的玉米转化，本发明的方法已作了详细地叙述，但应当认为，这并非本方法只限用于玉米，本方法同样适用于其它谷类作物以及双子叶作物，例如大豆和棉花，还有多数其它植物的花粉转化。处理其它种的花粉的手续需要加以改变，对载体微粒速度起决定作用的本装置的部件的间隙可根据种作改变，但基本的装置和步骤可用于其它植物种。

此外，虽然本发明的方法旨在针对花粉介导的植物的转化，但本文所揭示的装置同样适用于其它植物组织的转化，例如胚胎发生的胼胝体或者体细胞胚，或培养中的任何其他植物或其它组织。

因为并非所有的花粉均有插入它们中的载体微粒，还因为并非所有的花粉细胞或者后代合子吸收DNA进入它们的染色体组中，故而必需在某些阶段筛选后代植物，以选择转化突变型。如果要求把给定的外源基因转入一种植物中，则可把该基因插入嵌合的表达载体中，然后，应把嵌合的表达载体与可选择的标记物质粒一起转入植物细胞中，例如下文所述的PCMC1022。两种载体（外源基因和可选择的标记物）给合在一起制成一个质粒，或者可以分别克隆两种载体，然后一起施加到相同的载体微粒上。在上述任何一种情况下，产生的后代均要按标记物筛选，以选择已转化的后代。虽然在某些情况下应用这种可选择的标记物是需要的，但如果有一种可用于合适的形态或生化试验，筛选已转化的后代，则可以省略。形态筛选试验应用于后代中一种显性表型特性。合适的生化筛选试验应是一种所谓“南方”斑点杂交探针，用于探测后代植物的染体组中转化DNA本身的存在。

实施例

1.载体的结构

A.抗生素抗性

图2和图3示意地说明合适的植物表达载体的结构。图2所示为一种植物表达载体PCMC1208的结构。质粒PCMC1208的结构开始于用核酸内切限制性酶Taq    Ⅰ消化质粒PBR325（Bolivar，F、Gene∶4∶121-136，1987）。质粒PBR325含有一种由Taq    Ⅰ消化质粒的残留物中存在的抗菌素抗性基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）的编码顺序。在PBR325消化之后，用电泳把片断溶解在琼脂糖凝胶中，含有CAT基因的片断切下来后，将CAT片断结合到预先业已由限制性酶ACC    Ⅰ消化的质粒Puc9上（Viera    &    Messing，Gene，19：259-268，1982）。由Taq    Ⅰ和ACC    Ⅰ所产生的片断末端在这种情况下是互补的，由此所得的链可直接结合。所得质粒在图2中称为PUC-CAT含有侧面与PUC9的多衔接物几部分相接的CAT编码顺序，由Pst    Ⅰ和BamH    Ⅰ消化这种质粒，并用凝胶电泳分离两种片断中的较小者。然后，将这种片断结合到中间植物表达载体PCMC66上，它预先由Pst    Ⅰ和BamH    Ⅰ消化，以形成CAT表达质粒PCMC1205。这种质粒PCMC66含有来自根癌病土壤杆菌的蓝曙红合酶启动子（NOSPr）和来自相同有机体的包围6个质粒独特的限制位的篮曙红合酶多聚腺苷酸顺序（Poiy    A）。质粒PCMC66还带有可表达抗细菌中抗菌素氨苄青霉素的β-内酰胺酶基因（bla）的译本，以致可把氨苄青霉素抗性用作随后在大肠杆菌中实施的重组中的选择标记物。

由Stu    Ⅰ消化质粒P    Ca    MV    10（Gardner等人.Nucl    Acids    Res    9：2871-2888，1981），并将含有花椰菜花叶病毒35启动子（Ca    Mv    35s）的片断连接到合成的Hind    Ⅲ寡核苷酸衔接物上。然后，由HPh    Ⅰ消化片断，用DNA多聚酯处理以产生饨圆的末端，再把它连接到合成的Hind    Ⅲ寡核苷酸衔接物上。用Xho    Ⅰ和Hind    Ⅲ两者消化这种片断生成了一种含有Ca    Mv    35s启动子的片断，在其末端上通过添加限制部位顺序改变转录起始部位。通过由Xho    Ⅰ和Hind    Ⅲ消化质粒从PCMC1205切下篮曙红合酶启动子。由此产生的两种片断中的较大者与Ca    Mv    35s启动子片断结合依次产生PCMC1208具有Ca    Mv    35s启动子的植物表达载体，CAT编码顺序以及篮曙红合酶聚腺苷酸顺序。Ca    Mv    35s启动子和Poly    A顺序可用作CAT编码顺序的侧翼调节顺序。

通过electroporation进入原生质体内试验质粒PCMC1205和PCMC1208两者在玉米中的活性，随后，试验CAT活性。两种结构证明在玉米细胞中是有活性的，但PCMC1208的活性水平相当高，因此可被选作植物转化实验。

把质粒PCMC1208用于在本发明的装置和方法中对玉米进行花粉介异遗传转化。然而，已发现，CAT活性试验表明玉米组织具有高的背景水平，故而CAT基因并不是玉米的最佳标记物。因此，如图3所示，对该质粒进行进一步操纵，把别的在玉米中有更多选择性的抗菌素抗性基因播入载体中，以代替CAT基因。

质粒PCMC1021含有篮曙红合酶启动子和篮曙红合酶聚腺苷酸顺序，后者与决定了氨基糖苷抗菌素（对诸如卡那霉素）的抗性的氨基糖苷-3-磷酸转移酶Ⅱ（APH3′Ⅱ）的一个编码区侧面相接。因为electroporation实验揭示了Ca    Mv    35s启动子在玉米比Nos    Pr有效得多，故而决定把Ca    Mv    35s启动子转换到PCMC1021。如图3所示，PCMC1208中的Ca    Mv    35s片断通过由Xho    Ⅰ和Hin    Ⅰ消化以及通过电泳分离。质粒PCMC1021还由Xhod    Ⅲ和Hind    Ⅲ消化，分离较大片断并与Ca    Mv    35s片断结合以生成PCMC1022。在质粒PCMC1022中，APH3′Ⅱ中的编码顺序是与调节的Ca    Mv    35s和Nos    PA顺序侧面相接。

质粒PCMC1208和PCMC1022经转化和蛋白质分析均被表明用作烟草、棉花、大豆和玉米的单个细胞中的转化和表达是有效的。业已征明，用APH3′Ⅱ转化培养中的植物细胞（对棉花、大豆和玉米细胞）已证明对卡那霉素是有抗性的。

B.胚乳染色标记物

已获得一种称之PMBZRI的质粒，它含有玉米基因组DNA的大约9.9千碱基（Kilobase）Eco    R    Ⅰ片断，它包括以为酶UDP葡萄糖-加味的葡糖基转移酶编码的整个基因，这种酶是合成玉米中花色素苷色素所需的酶。基因组片断含有延伸的5′和3′侧翼DNA，因此可以预期它包括可在玉米中有效地表达基因的合适的调节顺序。因为克隆的基因是一种正常的、玉米功能基因的整长度的拷贝，故而期望克隆的基因应当在玉米细胞是完全活性的和合适的功能。

酶UDP葡萄糖-加味的葡糖基转移酶本身可用作玉米的遗传转化中的可选择的标记物，因为玉米系是可得到的，它带有使内源基因失活的隐性突变。因为这种酶对植物生长和发育并非不可缺少的，所以突变体系的植物是正常的，除了缺少在野生型或者非突变型玉米植物的各种组织所产生的红的花色素苷色素。将野生型基因引入到纯合的突变体系，从而导致了酶的产生和由此最后产生花色素苷，以致使转化突变型表达载体植物由于它们的特征颜色而可易于识别。故而，质粒PMBZRI适合用作玉米中的典型载体，无需加以改变，当与别的所考虑的基因结合时，适合用作通常筛选转化作用标记物，这是一种有用的非嵌合基因的实例。

2.玉米用PCMC1022转化

大量用作载体微粒的1-3微米金小球通过在0.02%聚赖氨酸中冲洗预先涂上聚赖氨酸，再空干。把33毫克经涂复的小球加入到有100微克PCMC1022的水溶液中，然后依次加入5微升10m M Na₂HPO₄和10m M Ca Cl₂，当所说溶液在N₂气流中干燥时，则生成细的沉淀物，然后，使干燥的沉淀物涂复小球在100%乙醇中重新悬浮，并使其沉积在2.0毫米涂复浸铝的聚酯薄膜板的塑料上面积大约为1厘米×1厘米。经涂复的小球以0.1毫克/厘米²的最终密度施加到聚酯薄膜承载板上。

带有经涂复的小球的承载板设置在图1所示的装置中的间隔圈16顶上，用手从早熟的桑格鲁甜玉米（Early    Sun-Glo    Sweet    Corn）中收集花粉。将矿物油轻轻地涂到60毫米陪替氏培养皿的底部，并把花粉撒在上面，倒置培养皿去除多余的花粉，留下一层花粉。陪替氏培养皿在图1所示的装置中用作靶表面22。

对图1中经组合的装置抽真空，真空度为55-60mmHg。由1微法电容器供给的15KV放电电压经电极14放电，使经涂复的微粒迅速冲到靶表面22上的花粉。

制备小球和花粉以及图1装置的点火过程重复几次直到积聚了适当的经处理花粉的供应量。用刷子刷去陪替氏培养皿底部的经处理的花粉，用手把经处理的花粉授粉在Kaltenberg    390和CFS5504杂种的雌植物的穗丝上。以物理的方式使穗丝与其它的花粉分开。

以这种方式使谷穗授粉，生产出52颗谷粒。在授粉后14天，从谷穗切下未成熟的胚，并把它置于含有每一百万之五十卡那霉素的玉米胚组织培养基上培养。直接试验在培养基上成长的幼苗以了解APH3′Ⅱ活性，其中三颗幼苗试验为阳性，这就表明APH3′Ⅱ酶在幼苗的组织中得到表达，故而认为这些植物的转化是成功的。

把这些植物中的一株置于非选择的培养基上，然后将其移入温室继续生长。分析叶组织以了解连续APH3′Ⅱ的活性表明为阳性。

从这种植物分离的DNA中PCM1022顺序的存在和一株植物不呈阳性是通过南方杂交技术证明的。Southern，J.Mol.Bio，98：503-577（1975）。从对照和试验玉米叶试样分离DNA是用Taglor和Powell（Focus，4：4-6，1982）的十六烷基三甲基溴化铵方法略加改进的方法进行。用限制性酶Ava Ⅰ和Hind Ⅲ消化10微克每种DNA试样，通过在琼脂糖凝胶电泳分解，再转移到尼龙膜上，以及与相应于APHⅡ编码区的非编码链的³²P-标记的探针杂交。在洗涤过滤之后，由放射自显影术观察杂交的DNA片断。

在任何一组植物中均未发现所期望的1Kb片断。然后，每种植物均呈现大约4Kb片断，该片断用与APH3′Ⅱ探针杂交，且在玉米DNA的任何控制非转化的对照试样中均未发现。两种植物（一种为APHⅡ阳性）之一还呈现3.7Kb特殊杂交的片断。所观察到的片断并非是所期望的尺寸的这一事实没有使人感到很惊奇，因为通常观察到复杂的限制模式以了解进入植物和动物细胞的DNA式。Perucho等人，Cell，22：309-317（1980），Kiens等人;PlantMol，Biol.，5：223-224（1985）;Paszkowski等人，EMBOJ.;3：2717-2722（1984）;Riggs    and    Bates    Proc    Natl    Acad，Sci.USA，83：5602-5606（1986）。此外，真核细胞中的DNA可通过甲基化作用加以改变，以这些方法，可以改变它的所预期限制性消化模式。Chandler和Walbot，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：1767-1771（1986）。众所周知，在本实施例所用的核酸酶内切限制酶Ava    Ⅰ和Hind    Ⅲ两者在它们的识别顺序中由专门的甲基化作用所限制。Mc    Cle    11和Nelson，Nucleie    Acids    Res，13：r    201-r    207（1985）。4Kb片断长度相当于PCMC1022质粒的质粒单位长度，并表明这些植物含有该质粒的重复拷贝。然后，仅用其中一种酶消化将产生所观察到的质粒长度片断。3.7Kb片断看来似乎是由质粒的重排所引起的结果，也许在其与自然的玉米DNA的接合点上。

用在CFS5504植物的穗丝上的花粉，以上述相同的方法作两种附加再复制，以随机的方式从所生成的植物中选择由该方法所产生的两株植物，检验APH3′Ⅱ并用Southern斑点法进行分析。两株植物均未显示APH3′Ⅱ活性，但证明在它们的染色体组中有4.0Kb杂交片断。用A188的花粉以相同的方法进行另一复制，硬质母体再形成后代，从中可随机选择一株植物供分析应用。这种植物的叶子经试验为APH3′Ⅱ阳性，还证明用Southern斑点分析中有4.0Kb片断。

3.具有其它基因的PCMC1022的应用

为了把所研究的其它基因转入玉米或者其他植物中，质粒PCMC1022可以以几种方法中的任何一种方法被应用。通过由Hind    Ⅲ和BamH    Ⅰ消化PCMC1022，可以删除APH3′Ⅱ编码顺序，用合适的末端制备的别的所研究的基因可以适当地选择顺序可被结合在其位置上。如果所研究的基因可以适当地选择，该质粒可直接地用于转化。如果用合适的调节顺序分别地制备所研究的基因以及需要一种可选择的标记物，则可以把具有它的调节顺序的所研究的基因可以插入PCMC1022中的CAMV35s顺序的多衔接物上流中任何位置。利用PCMC1022可选择标记物的另一替代方法是制备在PCMC1022中或者任何其它植物表达载体中的所研究的基因以及把PCMC1022和基因表达载体一起涂复在如本文所揭示载体微粒上用于转入植物细胞。

质粒PCMC1022已于1986年11月14日保藏在ATCC：12301    Parklawn    Drive，Rockville    MD，USA;ATCC保藏号No_。

以上保藏处是按照ATCC和本发明的受让人中的合伙人Cetus公司之间订立的合同作出的。与ATCC订立的合同规定，在叙述和鉴别保藏物的美国专利颁发或出版或者对任何美国公众公开或对外国专利申请案公开时，而不管哪一种在先，均为公众提供永久可靠的细胞系后代，而且为根据35    US73    122节和专利局长的规定（包括37CFR1.14节具体参考886    O.G638）授权给美国专利和商标局长确定的人提供这些细胞系的后代的有效性。本申请人的受让人已同意，如果保藏中的细胞系在合适的条件下培养时死了，失活或被破坏，则将按通知立即用相同细胞系的存活培养物来更换。

本发明并不限于保藏微生物的范围，因为保藏的实施旨在对本发明的一个方面作简单的说明，功能上相当的任何微生物是属于本发明的范围。当然，除了本文所说明和叙述的之外，本发明的各种改进对本技术领域内的技术人员来说将是显而易见的，并包括在以下权利要求的范围内。

还应当指出，核苷酸所给出的全部碱基对的尺寸都是近似的，并供叙述用。

Claims (36)

1、一种培育经遗传转化的植物系的方法，其特征在于所说的方法包括以下步骤：

制备包含编码区和侧翼调节顺序有效地在植物细胞中表达编码区；的外源基因的拷贝；

将外源基因的拷贝连接在生物学上隋性的载体微粒上；

用物理方法以下列方式使带有嵌合基因拷贝的微粒向植物的花粉加速，以这种方式使某些微粒射入某些花粉的内部；

用经上述处理的花粉使植物的雌性器管授粉；以及

在这种授粉所产生的后代中筛选出已转化的后代。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的生物学上隋性的微粒是金属微粒。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的金属微粒是金小球。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的方法在将嵌合基因拷贝连接在金属微粒上之前还包括用包复剂涂复金属微粒的步骤。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所说的包复剂为聚赖氨酸（Polylysine）。

6、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所说的将外源基因拷贝连接到金属微粒上的步骤包括干燥微粒上基因拷贝的溶液。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所说的基因拷贝溶液包括与基因拷贝一起沉淀在金属微粒上的CaHPO₄。

8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于以物理方法加速微粒的步骤包括使微粒在平面承载板上成层，通过冲击波冲击承载板使其加速以及制止承载板，以致载体微粒的动量使其离开所说的板。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于产生冲击承载板的冲击波是由高压经水滴搭桥的火花间隙放电产生。

10、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的使微粒向植物花粉加速的步骤包括把单层花粉铺设在靶表面上和把靶表面设置在载体微粒的加速通道中。

11、根据权利要求10所述的方法，其特征在于把花粉铺设在靶表面上是由把一层矿物油施加在靶表面上，把花粉撒在其上以及由此去除多余的花粉来实现。

12、根据权利要求1所述的方法，其特征在于使植物雌性器官授粉的步骤是由用刷子从靶表面刷下微粒已被加速进入花粉之中的花粉和把那种花粉撒在经选择的母本植物的雌性器官上来实现。

13、根据权利要求1所述的方法，其特征在于在后代中的筛选是基于生化试验作出的。

14、根据权利要求13所述的方法，其特征在于所说的试验是抗菌素抗性试验。

15、根据权利要求1所述的方法，其特征在于在后代中的筛选是基于形态学的植物特征作出的。

16、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的植物是玉米。

17、用权利要求1的方法遗传转化的一些植物。

18、用权利要求1的方法遗传转化的玉米植物。

19、一种培育遗传转化的玉米植物的方法，其特征在于所说的方法包括以下步骤：

以物理的方式把包含编码区和合适的调节顺序注入父本植物的玉米花粉;

用手把花粉授于母本植物的成熟玉米穗丝和把穗丝同其它花粉源分开;

载种从经授粉的母体植物中产生的后代。

20、根据权利要求19所述的方法，其特征在于所说的物理注射步骤包括把外源基因的拷贝连接到载体微粒上和使微粒向玉米花粉加速。

21、根据权利要求20所述的方法，其特征在于所说的载体微粒是用包复剂涂复过的金小球。

22、根据权利要求21所述的方法，其特征在于所说的包复剂是聚赖氨酸（Polylysine）。

23、根据权利要求20所述的方法，其特征在于所说的使微粒向玉米花粉加速的步骤包括：

通过用矿物油涂复靶表面并把花粉撒在靶表面上，使花粉固定在靶表面上。

24、根据权利要求20所述的方法，其特征在于通过干燥把外源基因涂复在载体微粒上。

25、用权利要求19的方法培育玉米植物。

26、一种在其染色体组织中包含外源基因的玉米植物，其特征在于所说的外源基因通过物理方法注入到植物花粉亲本的花粉中引入到植物中。

27、根据权利要求26所述的玉米植物，其特征在于所说的物理注射是由把外源基因涂复在加速进入花粉的载体上来实现。

28、根据权利要求26所述的玉米植物，其特征在于所说的外源基因包括编码顺序和合适的侧翼调节顺序，使得编码顺序可在植物组织中表达。

29、一种具有根据权利要求26所述的亲本植物的玉米植物。

30、玉米花粉，其特征在于所说的花粉包括存在其中的外源嵌合基因和至少一粒以物理方式把基因带入花粉的载体微粒。

31、根据权利要求30所述的玉米花粉，其特征在于所说的外源基因包括编码顺序和合适的侧翼调节顺序，使得编码顺序可在花粉的后代中表达。

32、一种用于把带有DNA的载体微粒注入活细胞的装置，其特征在于所说的装置包括：

电火花放电室;

伸入所说的电火花放电室并由火花间隙隔开的两根电极，所说的电极适用于连接在高压放电的外电源上;

以可垂直移动的方式在火电放电室上间隔设置的承载板，所说的承载板其上接受载体微粒;

在承载板上应有位置上固定的保持筛，以及

在保持筛上间隔设置的靶表面，所说的靶表面带有细胞，以便在放电室中产生冲击波的电火花放电将使承载板加速进入保持筛，以致使载体微粒加速进入靶表面的细胞中。

33、根据权利要求32所述的装置，其特征在于所说的装置还包括在电极之间搭架间隔的水滴。

34、根据权利要求32所述的装置，其特征在于所说的装置还包括包围所说装置的真空室，以便使所说的装置在低真空中工作。

35、根据权利要求32所述的装置，其特征在于电极之间的电火花间隙为大约1毫米到大约1.5毫米。

36、根据权利要求32所述的装置，其特征在于所说的装置还包括设置在电火花放电室之上的间隔圈，但低于承载板且具有至少在其顶上局部开口。

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