CN117616125A - 无毒素芦荟及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
无毒素突变芦荟衰减了参与天然毒素，如芦荟素的生物合成的至少一种基因的表达。生产无毒素突变芦荟的方法包括获得来源于一种芦荟的植物细胞，并衰减所获得的植物细胞内至少一种聚酮合酶基因的表达水平以形成突变植物细胞。方法还包括在一组有利于突变植物细胞增殖的培养条件下培养突变植物细胞。方法还包括在生物反应器中生长突变植物细胞，和由此获得无毒素芦荟生物产物。衰减至少一种聚酮合酶基因的表达水平涉及用靶向核酸内切酶系统破坏该基因，并在筛选成功突变的细胞之后进行细胞培养和扩增。
Description
相关申请的交叉引用
本申请权利要求于2021年4月30日提交的美国临时专利申请号63/182,468、名称为“无毒素芦荟及其制备方法”的优先权，该申请通过引用整体并入本发明并用于所有目的。
技术领域
实施方式涉及芦荟突变体和相关的生产方法。具体实施方式提供了生产缺乏一种或多种天然产生的毒素(如芦荟素)的芦荟突变体的可扩展的高通量方法。本发明公开的无毒素芦荟突变体可以显著衰减毒素生物合成所需一个或多个基因的表达水平。
序列表
本申请包含一份序列表，已经以ASCII格式通过电子方式提交，并通过引用将其全部并入本发明。所述ASCII副本于2021年4月30日创建，名为P291962_US_01_SL.txt，大小为264033字节。
背景技术
各种各样的生物医学、制药和化妆品产品包含芦荟，它通常从真芦荟(Aloe vera)物种的多肉植物中获取。例如，使用芦荟产品作为治疗晒伤、愈合伤口和改善免疫功能的家庭疗法尤其常见。虽然广泛流行，但生产消费者安全的芦荟产品需要耗时且昂贵的加工步骤来去除芦荟植物自然产生的有害毒素。因此，人们进行了广泛的努力，如人工将内叶与外皮分离和木炭过滤，以从价值极高的内叶凝胶中消除有毒和苦味化合物。传统的农业实践，通常需要消耗大量的资源来培育在大片农田上生长缓慢的芦荟植物，进一步阻碍了满足日益增长的全球需求所需的可扩展芦荟生产的加速率。随着可用农田的减少、自然资源的稀缺以及化肥、除草剂和杀虫剂造成的负面环境影响的持续恶化，这些问题只会变得越来越难以解决。需要一种在工业规模上新的、可持续的方法更有效地生产无毒素芦荟。
发明内容
本公开提供了用于生产无毒素芦荟细胞、细胞培养物、种子和植物的新方法、系统和试剂。具体的实施方式涉及消除、抑制或以其他方式衰减编码一种或多种蛋白质的一种或多个基因的表达，所述蛋白质是生物合成上游的或以其他方式参与至少一种天然芦荟毒素(例如芦荟素)的表达。具体实例可涉及衰减芦荟聚酮合酶1和/或2基因(“pks1和/或pks2”)的表达。由此产生的无毒素芦荟，其不能由未经修饰的芦荟植物自然制成，可以在新的条件下培养，并使用工业规模的生物反应器进行扩增，从中获得无毒素芦荟细胞。这些细胞也可以转移到固体培养基中，以产生用于该领域的无毒素芦荟植物。
根据本发明所述的实施方式，突变体芦荟表现出编码芦荟素生物合成上游蛋白质的至少一种基因的衰减表达，通过一种或多种基因破坏技术，包括例如CRISPR编辑、大核酸酶活性、RNA干扰和/或核酶活性。例如，基因破坏可以通过CRISPR RNA引导的核酸内切酶切割、插入突变、基因全部或部分缺失、非同源端接和/或同源重组实现。对于CRISPR介导的DNA切割，核酸内切酶可以是Cas9或Cbfl。在各种实施方式中，通过一种或多种上述技术实现的在突变体芦荟中pks1和/或pks2基因连同PKS1和/或PKS2蛋白的衰减表达，如通过RNA转录和/或氨基酸翻译所测量，可以低于野生型芦荟中RNA转录量和/或氨基酸翻译量的50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％或1％。在一些实施例中，与野生型芦荟中由相应的pks1和/或pks2基因转录的的RNA和/或翻译的氨基酸相比，从衰减的pks1和/或pks2基因转录的RNA和/或翻译的氨基酸的量可能检测不到或在背景水平以上没有显著增加。
根据本公开的实施方式，生产突变芦荟的方法可以包括获得衍生自一种芦荟的植物细胞，衰减获得的植物细胞内由野生型芦荟产生的毒素生物合成所必需的至少一种蛋白质的表达水平以形成突变植物细胞，以及在一组培养条件下培养突变植物细胞。
在一些实施例中，该方法可以进一步包括在衰减至少一种毒素生物合成所需的蛋白质的表达水平之前将获得的植物细胞转化为植物干细胞。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括培养的突变植物细胞在生物反应器中生长。在一些实施例中，生物反应器的体积至少为50升。在一些实施例中，所述方法进一步包括从培养的突变植物细胞中获得芦荟生物产物。在一些实施例中，毒素包括芦荟素。在一些实施例中，所述方法进一步包括使用突变植物细胞再生芦荟植物。在一些实施例中，所述方法还包括在一组培养条件下培养突变植物细胞之前选择突变植物细胞。在一些实施例中，选择突变植物细胞涉及筛选突变植物细胞的荧光。在一些实施例中，选择突变植物细胞涉及选择无荧光的植物细胞。在一些实施例中，选择突变植物细胞涉及向突变植物细胞施用一种或多种抗生素。
在一些实例中，衰减毒素生物合成所需的至少一种蛋白质的表达水平涉及破坏至少一种蛋白的功能。在一些实施例中，所述功能包括酶活性。在一些实施例中，所述至少一种蛋白质包含聚酮合酶1(PKS1)和/或聚酮合酶2(PKS2)。在一些实施例中，所述PKS1蛋白具有与SEQ ID NO:1至少55％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述PKS2蛋白具有与SEQ ID NO:2至少55％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，衰减至少一种蛋白质的表达水平涉及破坏pks1和/或pks2基因的表达。在一些实施例中，破坏pks1和/或pks2基因的表达涉及用切割pks1和/或pks2的核酸内切酶转化细菌细胞和用转化的细菌细胞转染获得的植物细胞。在一些实施例中，细菌细胞被核糖核蛋白进一步转化。在一些实施例中，核酸内切酶被编码在CRISPR构建体中。在一些实施例中，包含在CRISPR构建体内的引导RNA序列与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9或SEQ ID NO:10具有至少55％同一性的序列。在一些实施例中，细菌细胞衍生自根癌农杆菌(Agrobacteria tumefaciens)、粘着剑菌(Ensifer adhaerens)、海沃德铬杆菌(Ochrobactrum haywardense)、埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、根瘤菌(Rhizobium sp.)菌株NGR234，或其组合。
在一些实施例中，破坏pks1和/或pks2基因的表达涉及通过粒子轰击将靶向pks1和/或pks2的核酸内切酶和/或核糖核蛋白递送到所获得的植物细胞。在一些实施方式中，破坏pks1和/或pks2基因的表达涉及使用碳纳米管、碳化硅晶须、直接注射或其组合将靶向pks1和/或pks2的核酸内切酶和/或核糖核蛋白递送到所获得的植物细胞。
根据本公开的一些实施方式，生产突变芦荟植物的方法包括获得衍生自一种芦荟的植物细胞，衰减所获得的植物细胞中的野生型芦荟产生的毒素的生物合成所需的至少一种蛋白质的表达水平以形成突变植物细胞，以及使用所述突变植物细胞再生突变芦荟植物，随后从中获得转基因种子。
在一些实施例中，毒素包括芦荟素。在一些实施例中，衰减毒素生物合成所需的至少一种蛋白质的表达水平涉及破坏至少一种蛋白的功能。在一些实施例中，所述至少一种蛋白质包括聚酮合酶1(PKS1)和/或聚酮合酶2(PKS2)。在一些实施例中，衰减至少一种蛋白质的表达水平涉及破坏pks1和/或pks2基因的表达。在一些实施例中，破坏pks1和/或pks2基因的表达涉及用切割pks1和/或pks2的核酸内切酶转化细菌细胞，并用转化的细菌细胞感染所获得的植物细胞。
在一些实施例中，所述方法还包括在一组培养条件下培养突变植物细胞。在一些实施例中，核酸内切酶被编码在CRISPR构建体中。
根据本公开的一些实施方式，突变芦荟具有至少一种聚酮合酶(pks)基因的衰减表达。在一些实施例中，所述至少一种pks基因包含pks1和/或pks2。在一些实施例中，由pks1和/或pks2转录的mRNA的量小于野生型芦荟中pks1和/或pks2转录的mRNA的量的10％。在一些实施例中，所述突变芦荟包括突变芦荟细胞。在一些实施例中，所述突变芦荟包括突变芦荟细胞培养物。在一些实施例中，所述突变芦荟包括突变真芦荟。在一些实施例中，所述突变芦荟包括再生芦荟植物。在一些实施例中，所述突变芦荟包含突变芦荟生物产品，其包含或包含基于芦荟的凝胶、乳霜、乳液、肥皂、防晒霜、喷雾、护发产品、胶冻、保湿霜、洁面乳、爽肤水、皮肤护理组合物、化妆品、漱口水、牙膏、可食用食品或液体中一种或多种。在一些实施例中，所述突变芦荟包含突变芦荟种子。在一些实施例中，所述突变芦荟表现出无野生型芦荟产生的一种或多种毒素。在一些实施例中，所述一种或多种毒素包括芦荟素。在一些实施例中，突变体芦荟中产生的芦荟素的量小于野生型芦荟产生的芦荟素量的10％。
附图说明
图1是根据本发明公开的原理执行的方法流程图。
图2是显示根据本发明公开的原理设计用于细菌转化和CRISPR编辑的外源质粒的核酸图谱。
图3是根据本发明公开的原理执行的另一方法的流程图。
具体实施方式
本发明公开了用于产生无毒素或基本上无毒素的芦荟突变体的系统、方法和试剂。如图1的方法100所示，所公开的方法通常包括获得芦荟植物细胞103，例如野生型芦荟植物细胞，将获得的细胞转化为干细胞104，以及通过对干细胞进行基因修饰以衰减至少一种天然产生的芦荟毒素的产生来产生突变植物细胞培养物106。然后在严格控制的生物反应器中将无毒素的细胞培养物扩增108并按比例改至工业体积110，最终可以从中收获无毒素的芦荟产品112。通过使用用于毒素抑制的特定程序化、转基因修饰的细胞培养物，所公开的方法可以通过选择性地仅生长生产可收获芦荟所需的细胞类型来加快芦荟的生产速率和最大限度地减少浪费。所公开的方法还可以在不需大片农田的情况下以工业规模生产无毒素芦荟，从而降低消费者和环境的成本，并提供不受地理、气候和季节影响的高效芦荟生产系统。
根据本发明所述方法抑制的至少一种毒素包括芦荟素，其是由多种芦荟植物产生的天然糖苷。芦荟素掺入医药和化妆品中时可能有害，尤其是当此类产品直接应用于皮肤或口服时。多种形式和类型的芦荟素可以由各种芦荟物种产生，包括芦荟素A、芦荟素B、芦荟苷、异芦荟苷和/或芦荟大黄素，其中至少一种可以根据本公开被衰减。为了便于说明，这些品种在本发明中统称为“芦荟素”，术语“无毒素”、“基本无毒素”和/或“突变体”可指缺乏或基本缺乏芦荟素的芦荟细胞、芦荟细胞培养物、芦荟样本、芦荟种子、芦荟生物质、芦荟植物或芦荟植物产品。术语“无毒素”、“基本上无毒素”或“突变体”还可指缺乏或基本上缺乏由本发明公开的技术抑制的一种或多种其它毒素的芦荟细胞、芦荟细胞培养物、芦荟标本、芦荟种子、芦荟生物质、芦荟植物或芦荟植物产品。其它靶向毒素的非限制性实例可包括羟基蒽衍生物，例如蒽醌、芦荟大黄素和/或芦荟宁。
植物特异性聚酮合成酶(“PKS”)是一种用于催化多种植物产物合成的酶，包括聚酮，所述聚酮是由辅酶A(“CoA”)前体形成的代谢产物。本发明公开的实施方式旨在衰减聚酮合成酶1(“PKS1”)和/或聚酮合成酶2(“PKS2”)的产生和/或功能所需的基因的表达，例如pks1和/或pks2。PKS1和PKS2的保守区都是III型聚酮合酶，它们几乎相同并且可以包括至少一个活性位点结构域、至少一个产物结合位点结构域、至少一个丙二酰辅酶A结合位点结构区和至少一个二聚体界面结构域。通过实施本发明公开的方法修饰编码这些结构域中的一个或多个的遗传序列可以干扰甚至阻止适当的PKS形成，例如翻译和/或蛋白质折叠，和/或功能，例如底物结合和/或酶活性。术语“保守结构域”是指给定蛋白质或DNA序列的保守部分，其可以独立于蛋白质或DNA序列的其余部分而进化和/或发挥功能。至于PKS结构域，每个野生型结构域可以形成紧凑的三维结构，并且通常可以独立稳定和折叠。
由于芦荟素合成酶基因的基因组位置和序列仍然未知，并且芦荟素生物合成途径尚未完全阐明，所以减少或消除功能性芦荟素的产生一直是难以实现的。公开的的方法通过衰减编码蛋白质(所述蛋白质已被本发明人认为是芦荟素生物合成和/或功能所必需的)的至少一种基因的表达解决该问题，。如上所述，本发明描述的非限制性实施例旨在衰减pks1和/或pks2，其可使用本发明公开的一种或多种基因工程技术实现。例如，来源于芦荟植物的植物细胞可以被细菌细胞感染，这些细菌细胞已经被至少一种聚集的规则间隔短回文重复序列(“CRISPR”)构建体转化，所述构建体被设计为特异性靶向和抑制psk1和/或pks2的表达，从而抑制PKS1和/或PKS2蛋白的翻译并干扰芦荟素的合成。通过成功的psk1/2衰减显示出产生减少的或不存在的芦荟素的培养的突变细胞在体外被筛选，快速扩增，然后在一个或多个生物反应器中按比例放大到工业上相关的体积。可扩展的、基于细胞培养的芦荟生产的好处可能是巨大的。例如，通过实施本发明所述的方法，促进无毒素芦荟细胞培养物的生长的一个50升的生物反应器可以产生否则需要大约一公顷农田才能生产的芦荟量。产量的增加比在受控条件下种植的植物快30-100倍，从而同时减少浪费并加快生产率。在另一个实施方式中，可以使用传统农业方法从pks1/2突变细胞系再生芦荟植物以生产无毒素芦荟产品。可以从突变芦荟植物中收集突变植物种子，并随后重新种植以再生植物。
术语“基因”在本发明中广泛用于指编码多肽或表达的RNA的核酸分子(通常为DNA，但任选为RNA)的任何片段。因此，基因包括编码表达的RNA的序列(其可以包括多肽编码序列或例如功能性RNA、微小RNA、短发夹RNA、核酶等)。基因还可以包括其表达所需或影响其表达的调节序列，以及与处于其自然状态的蛋白质或RNA编码序列相关的序列，例如，内含子序列、5′或3′非翻译序列等。在一些实施例中，基因可能仅涉及DNA或RNA分子的蛋白质编码部分，其可能包括或不包括内含子。基因的长度优选大于50个核苷酸，更优选大于100个核苷酸，长度在约50和约500000个核苷酸之间，约100个核苷酸、约1000个核苷酸、大约5000个核苷酸、10000个核苷酸，长度约25000个核苷酸、长度约50000个核苷酸、长度约75000个核苷酸，长度约100000个核苷酸、长度约150000个核苷酸、长度约200000个核苷酸、长度约250000个核苷酸、长度约300000个核苷酸、长度约350000个核苷酸、长度约400000个核苷酸、长度约450000个核苷酸、长度约500000个核苷酸，或更长的长度、或其间的任何长度。
术语“核酸”或“核酸分子”是指DNA或RNA(例如，mRNA)的片段，还包括具有修饰的骨架(例如，肽核酸)或修饰的或非天然存在的核酸碱基的核酸。核酸分子可以是双链或单链。包含基因或其一部分的单链核酸可以是编码(有义)链或非编码(反义)链。
核酸分子可以“衍生自”指定来源，包括从指定来源分离(全部或部分)核酸片段。核酸分子也可以衍生自指定来源，通过例如直接克隆、PCR扩增或从所指定的多核苷酸来源的人工合成，或基于与所指定的多核苷酸来源相关的序列或基于与指定的多核苷酸来源相关的序列。衍生自特定来源或物种的基因或核酸分子还包括对来源核酸分子具有序列修饰的基因或核酸分子。例如，衍生于来源(例如，特定参考基因)的基因或核酸分子可以包括源基因或核酸的一个或多个非故意的或故意引入的突变，并且如果一个或多个突变，包括取代、缺失或插入，是有意引入的，可以通过细胞或核酸的随机或靶向突变、通过扩增或其他分子生物学技术、或通过化学合成或其任何组合来引入序列改变。衍生自编码功能性RNA或多肽的参考基因或核酸分子的基因或核酸分子可编码与参考源功能性RNA或者多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的功能性RNA或多肽或其功能性片段。例如，衍生自编码功能性RNA或多肽的参考基因或核酸分子的基因或核酸分子可以编码与参考或源功能性RNA或者多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％序列同一性的功能性RNA或多肽，或其功能片段。
术语“天然存在”和“野生型”指的是在自然界中发现的一种形式。例如，天然存在或野生型核酸分子、核苷酸序列、多肽或蛋白质可以存在于天然来源中并从天然来源分离，并且不是通过人类有意操作修饰的。天然存在或野生型基因和/或蛋白质可能特异性地缺乏一种或多种突变，其由根据所公开的生产突变体和/或无毒素芦荟的方法实施的基因工程技术产生。
如本发明所用，“衰减”可以指在数量、程度、强度(intensity)、功能和/或强度(strength)上被抑制、减少、消除和/或改变。基因表达衰减可指所述基因(例如pks1/2)的转录量和/或速率显著衰减，或由该基因编码的蛋白质(例如PKS1/PKS2)的适当翻译、折叠、活性和/或组装的减少和/或破坏。作为非限制性实施例，基因可能由于基因中的非自然突变和/或非自然破坏(例如，通过双链切割、内源性错误修复、部分或全部缺失、截断、移码或插入突变的基因破坏)而衰减，或由于改变、替换、和/或消除一个或多个基因调控序列而表达衰减。具有衰减的基因表达(例如pks1和/或pks2)的突变芦荟细胞可以是重组芦荟细胞，其中所述衰减是基因工程的结果，即通过可能涉及将一种或多种非天然核酸分子(例如CRISPR质粒构建体)或多肽引入芦荟细胞的人类干预。此外，可以通过内源性DNA损伤修复机制，例如非同源末端连接、同源重组、碱基切除修复、核苷酸切除修复和/或错配修复引入外源构建体后，全部或部分完成衰减。另外或替代地，基因衰减可以通过其他形式的诱变来实现。
“外源核酸分子”或“外源基因”是指已被引入(例如“转化”和/或“感染”)细胞的核酸分子或基因。转化的细胞可以称为重组细胞，其中可以引入额外的外源基因。用核酸分子转化的细胞的后代如果继承了外源核酸分子，也被称为“转化”。外源基因可能来自一个或多个不同的物种(“异源”)或来自与被转化细胞相关的相同物种(“同源”)。“内源性”核酸分子、基因或蛋白质是发生在宿主细胞中或由宿主细胞自然产生的天然核酸分子、基因组或蛋白质。
如本发明所用，“表达”包括至少在RNA产生水平上的基因例如pks1或pks2的表达，并且“表达产物”包括所得产物，例如表达基因的mRNA、功能性RNA、多肽和/或蛋白质。术语“表达衰减”包括在mRNA加工(例如RNA剪接)之前或之后基因的mRNA产生减少。因此，“产生减少”是指基因表达导致的蛋白质丰度或活性蛋白质丰度的下降。蛋白质(例如PKS1或PKS2)的产生减少包括相对于多肽的天然产生、构型和/或酶活性，多肽表达量、适当折叠和/或二聚化、多肽的酶活性或其组合的减少。因此，衰减的pks1和/或pks2表达可以包括正常或基本正常的基因表达水平，但其最终导致非功能性和/或改变PKS1和/或PKS2蛋白的翻译。术语“下调的”或“下调”包括感兴趣的基因或核酸分子的表达和/或酶的活性的降低，例如，相对于未被下调的其他相同基因或酶的表达或活性，基因表达或酶活性的降低。
本公开的一些方面包括一或多种特定多核苷酸序列的表达的部分、基本上或完全缺失、沉寂、失活或下调。基因可以部分、基本上或完全缺失、沉寂、失活，或者它们的表达可以下调，以影响它们编码的多肽所产生的活性，例如其酶活性。通过插入破坏基因功能和/或表达的核酸序列，例如大核酸酶工程，基因可以部分、基本或完全缺失、沉寂、失活或下调。根据本发明描述的实施例，术语“消除”、“排除”和“敲除”可以与术语“删除”、“部分删除”、“基本上删除”或“完全删除”互换使用。
“重组”或“工程化”核酸分子是指通过人类操作(包括机器人干预)改变的核酸分子。作为非限制性实施例，重组核酸分子包括在体外部分或完全合成或修饰的任何核酸分子。实施例还包括核酸分子，所述核酸分子包括在自然界中不相连的相连核苷酸序列。实施例还可包括使用分子克隆技术改造的核酸分子，使得其相对于天然存在的序列缺乏一个或多个核苷酸。实例还可包括已使用分子克隆技术操作的核酸分子，使得其相对于天然存在的核酸序列具有一个或多个序列改变或重排。
本发明使用的术语“重组蛋白”是指通过基因工程产生的蛋白质。
如本发明所用，“突变体”可以指在至少一个基因(例如pks1和/或pks2)中具有突变的植物细胞、细胞培养物、样本、种子、生物质、植物、植物部分或生物体，该突变是某种形式的诱变的结果，例如核酸内切酶切割和双链断裂修复。在一些实施例中，核酸内切酶可以在CRISPR构建体内编码。根据这样的实施例，核酸内切酶可以包含Cas9。“突变体”也可以指重组细胞、细胞培养物、标本、种子、生物质、植物或植物部分，其由于针对至少一种参与生产一种或多种天然存在的芦荟毒素(如芦荟素)的基因的基因工程而改变了基因的结构、功能和/或表达。突变体也可以指重组细胞、细胞培养物、样本、种子、生物质、植物或植物部分，其具有产生至少一种毒素所需的至少一种基因的衰减表达。这种突变体可以通过基因破坏、靶向敲除和/或核酸酶活性产生，其可以先于核酸修复的一种或多种天然或非天然机制。
当应用于植物生物体时，术语重组、工程化或转基因修饰是指通过将异源或外源(例如，非同源)重组核酸序列引入生物体而被操纵的生物体，其非限制性实例包括基因敲除、靶向突变和基因置换、启动子置换、缺失、插入，或核酸分子转移，例如转基因、合成基因、启动子或其他序列插入或转移到生物体中。重组或基因工程生物体也可以是已经引入基因“敲低”构建体的生物体。这样的构建体包括但不限于一种或多种引导RNA、转移RNA、RNA干扰序列、微小RNA、短发夹RNA、小干扰RNA、反义RNA和核酶构建体。实例还包括具有通过一种或多种Cas核酸酶、大核酸酶或锌指核酸酶的活性而改变的基因组的生物体。如本发明所用，“重组芦荟”包括本公开的重组芦荟的子代或衍生物。由于突变或环境影响，在子代中可能会发生某些修饰，因此这些子代或衍生物实际上可能与亲本细胞不相同，但仍包含在术语“重组芦荟”的范围内。
如上所述，所公开的方法可涉及一个或多个步骤，包括但不限于：从一种或多种植物来源获得芦荟植物细胞，将获得的细胞转化为干细胞，对干细胞进行基因修饰以衰减合成至少一种天然产生的芦荟毒素所需的至少一种基因的表达，从中产生无毒素的细胞培养物，在生物反应器中将细胞培养物扩增到工业体积，以及从培养产物中收获无毒素或基本上无毒素的芦荟。实施方式还可涉及使用经修饰的细胞培养物生长无毒素或基本上无毒素的芦荟植物或植物部分，并从中收获无毒素芦荟和/或芦荟种子。实施方式可以涉及上述步骤中的每一个，或者可以具体地排除一个或多个步骤。例如，某些实施方式可能不涉及将源细胞转化为干细胞、在生物反应器中扩增细胞培养物和/或生长转基因芦荟植物或植物部分的一个或多个步骤。
以下描述的特定的非限制性实施方式涉及通过pks1和/或pks2衰减抑制芦荟素的产生，但仅用于说明目的描述这样的实施方式。另外的实施方式可以靶向一种或多种不同的芦荟毒素和/或可以通过衰减参与毒素生物合成的一种或多种不同或另外的基因和/或蛋白质的表达来减少或消除毒素的产生。除了pks1、pks2、PKS1和/或PKS2之外，这些基因和/或蛋白质可以被衰减。所产生的突变体统称为“无毒素”或“基本上无毒素”，无论通过本发明所述技术靶向的特定毒素如何。
获得芦荟源细胞
根据所公开的方法产生的突变芦荟细胞最初来源于各种芦荟物种的野生型源细胞，包括但不限于：真芦荟(Aloe vera)(或库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller))、木立芦荟(Aloe arborescens)、芒芦荟(Aloe ferox)、马达加斯加芦荟(Aloe vaombe)、德卡里芦荟(Aloe decaryi)、阿拉伯芦荟(Aloe rubroviolacea)、水玉锦芦荟(Aloemicrostigma、狮子锦芦荟(Aloe broomii)、皮刺芦荟(Aloe aculeata)、鬼切芦荟(Aloemarlothii)、卡梅伦芦荟(Aloe cameronii)、斑痕芦荟(Aloe maculata)、石生芦荟(Aloepetricola)、纤毛芦荟(Aloe ciliaris)、银芳锦芦荟(Aloe striata)、青刀锦芦荟(Aloehereroensis)、东非芦荟(Aloe perryi)、螺旋芦荟(Aloe polyphylla)、短叶芦荟(Aloebrevifolia)、珍珠芦荟(Aloe aristata)、折扇芦荟(Aloe plicatilis)、卡比塔塔多样芦荟(Aloe capitala var.quartziticola)等。根据所公开的方法产生的突变芦荟细胞可以最初来源于各种来源的各种芦荟物种的野生型来源细胞，其非限制性实例可以包括：温室、农场、植物苗圃、出售芦荟植物的商店、庭院、野外等。源细胞可以直接从植物组织中收获，或者在已建立的芦荟细胞系的形式获得。源细胞的特定组织来源可以包括叶、根、根毛、叶毛状体、茎、杆、花、雌蕊、雄蕊、花瓣、花粉、种子、胚胎、子叶、分生组织等。在一些实施例中，可以对细胞来源或芦荟植物本身进行杀菌以去除或部分去除细菌、真菌或其他污染生物。用于去除污染生物的过程可能包括使用0-100％浓度的漂白剂、过氧化氢、氯气、消毒溶液等。在一些实施例中，细胞来源可衍生自在体外、在植物组织培养物中、在液体中、在无菌环境中、在部分无菌环境中或从未无菌环境中生长的植物。
源细胞也可以被称为“对照细胞”或“对照芦荟”，每一个都是野生型芦荟细胞或直接或间接衍生出突变芦荟或突变芦荟细胞的芦荟。对照细胞或对照芦荟可以包括与已操纵的、重组的或突变的细胞基本相同的芦荟细胞或芦荟，除了对照细胞不具有突变芦荟或芦荟细胞的遗传操纵，即对照细胞无衰减的pks1和/或pks2的表达，或衰减的PKS1、PKS2和/或芦荟素的产生。
干细胞生成
在一些实施例中，所公开的方法可涉及将所述获得的芦荟细胞的至少一部分转化为干细胞。干细胞转化过程的实施方式涉及将源细胞去分化为能够被重新编程为专门植物细胞的专能、多能或全能干细胞，包括构成芦荟叶内部粘液组织的植物细胞。因此，根据所公开的实施方式的用于产生突变芦荟细胞培养物的基因工程可以直接实施在来源于芦荟植物的对照细胞上或已经、将要或正在经历细胞分化过程的干细胞上。
受控的细胞分化通过根据严格的方案对干细胞进行编程来进行，所述方案涉及在一组特定的环境条件下、特定的时间点应用特定的生长因子，例如植物激素。最终结果可以是特定的芦荟植物细胞，例如由一层或多层的芦荟叶构成的芦荟植物细胞，例如基本透明的叶子内部凝胶。将干细胞专门编程为特定的芦荟植物细胞类型可以导致仅选择性地生长所需的细胞，即，不是构成芦荟植物或植物部分的所有细胞。因此，这种方法可以用于显著减少浪费并提高生产率。成功的程序化细胞可以在细胞培养物中扩增和维持，所述细胞培养物可以以本发明公开的最终产生无毒素芦荟细胞所需的方式进行处理。
在一些实施例中，突变体芦荟(例如突变体芦荟植物)的再生可涉及施用生长调节剂，例如约0.1至约100μg/mL的一种或多种生长素，例如1-萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲唑-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-丙酸(IPA)、2-苯基乙酸(PAA)或4-氯吲哚-3-乙酸(4-CI-IAA)。一种或多种上述生长素可单独施用或与约0.1至约100μg/mL的一种或多种细胞分裂素组合施用，其非限制性实施例可包括6-苄氨基嘌呤(BA)、N6-苄氨基嘌呤核糖苷6-苄氨基嘌呤、6-苄基氨基嘌呤9-(a-D-葡糖苷)(N6-苄基腺嘌呤9-葡糖苷)，和/或苯脲型细胞分裂素，例如，二苯脲和噻二唑仑(thidiazuron,TDZ)。包括光照和暗度水平、光照周期和/或温度在内的环境因素也可以单独或与植物生长调节剂组合调节以刺激再生。
如上所述，替代实施方式可以不包括干细胞转化过程。这样的实施方式可以涉及用一种或多种被配置为衰减pks1和/或pks2表达的外源核酸构建体感染现有的芦荟植物细胞，筛选表现出pks1/2衰减和/或不存在一种或多种毒素(例如芦荟素)的细胞，并在培养基中扩增所述筛选的细胞。
基因衰减
具有编码PKS1和/或PKS2的一个或多个基因衰减表达的突变体芦荟细胞和/或突变体芦荟细胞培养物可以通过本发明公开的一种或多种基因工程方法产生。例如，实施方式可以涉及CRISPR介导的pks1、pks2编辑和/或至少一种额外的或不同的基因的编辑，所述基因被本发明人识别为涉及芦荟素生物合成。衰减pks1和/或pks2的其他方法，可能发生在除了CRISPR介导的编辑之外或代替CRISPR介导的编辑，可以涉及同源重组、非同源末端连接、RNA引导的核酸酶活性、RNAi构建体、核酶构建体、转录激活子样效应核酸酶活性(“TAENS”)、锌指核酸酶活性(“ZFNs”)，或其组合。
如本发明所用，“衰减pks1和/或pks2基因的表达”可指以改变或减少全功能PKS1和/或PKS2蛋白的产生的任何方式减少、改变或消除野生型基因的表达，所述全功能PKS1和/或PKS2蛋白可由与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别具有至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％，或99％同一性的氨基酸顺序组成。被工程化为具有衰减pks1、pks2或其两者表达的突变体芦荟可以具有pks1和/或pks2基因，所述基因包括至少一种减少或消除该基因表达的突变、缺失或插入，使得不产生全功能或野生型pks1和/或pks2或与野生型芦荟相比以显著更低的量产生。
在涉及CRISPR介导编辑的实施方式中，pks1和/或pks2基因可以被Cas蛋白(例如化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9)的DNA切割活性破坏，所述Cas蛋白是被配置为产生双链DNA断裂的DNA核酸内切酶。特定的核酸内切酶可以变化，并且编码CRISPR组件的给定载体可以包括Cas9、Cas12a、SaCas9、NmeCas9、StCas9、TdCas9、CjCas9、MAD7或Cpf1表达盒，所述表达盒除了衍生自化脓性链球菌、氨基酸球菌(Acidaminococcus)、新凶手弗朗西斯杆菌(Francisella novicida)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、齿状密螺旋体(Treponema denticola)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和/或直肠真杆菌(Eubacterium rectale)的核酸内切酶基因，可以包括编码N-末端FLAG标签和核定位信号的序列。
除了核酸内切酶多肽或复合物外，CRISPR系统还包括至少一种合成引导RNA(“gRNA”)，其被配置为通过与特定靶位点序列互补而与芦荟细胞中的基因组靶位点相互作用。与基因组靶位点的至少一部分互补的gRNA序列可称为“gRNA间隔区序列”，长度为约20至约23个核苷酸。由间隔区序列定位的靶序列可以位于pks1和/或pks2内或与其相邻，例如位于编码区或转录调控序列内。本发明公开的具体实施例包括gRNA间隔区序列，其经配置以靶向编码PSK1或PKS2蛋白的天然存在基因的至少一部分，例如pks1和/或pks2。在一些实施例中，单个CRISPR构建体可以包括多个gRNA，以实现多重序列靶向，可以提高遗传衰减的效率。
本发明公开的CRISPR RNA序列可以是在通过细胞内存在的内源性RNA聚合酶将质粒引入靶向芦荟细胞后转录成RNA的质粒表达的DNA序列。因此，被配置为靶向pks1基因至少一部分的gRNA间隔区序列最初可以具有与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6相同或基本相同的DNA序列。配置为靶向pks2基因至少一部分的gRNA间隔区序列最初可以具有与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10相同或基本相同的DNA序列。基本相同的序列可以包括与上述SEQ ID NO:3-10中的任何一个具有至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核苷酸序列。这些gRNA间隔区序列可以单独或一起插入质粒中。有效靶向pks1和/或pks2的引导RNA可以不限于SEQ ID NO:3-10，并且还可以包括计算鉴定的额外序列。另外，靶向pks1和pks2的gRNA序列(作为质粒表达的DNA序列提供)的非限制性实施例可以分别与SEQ ID NOS:24-567和SEQID NOS:568-1079相同或基本相同。所述公开的gRNA的设计部分由PKS1和PKS2中存在的保守蛋白结构域决定。靶向这些结构域的一个或多个潜在遗传密码的引导RNA可能在衰减PKS1和/或PKS2组装、活性、强度和/或功能方面最有效。
除了与靶序列互补的gRNA间隔区序列外，完整的gRNA盒还可以包括支架序列和/或转运RNA(“tRNA”)序列，其可以在5’端和3’端的侧接间隔序列。支架序列被配置为与核酸内切酶蛋白上的结合位点结合，例如Cas蛋白，从而确保在gRNA间隔区序列的引导下将蛋白递送到靶位点。以这种方式，功能性核酸内切酶可以通过产生靶向双链断裂来衰减包含或接近靶位点的基因，在一些实例中，所述断裂可以由容易出错的内源性修复酶修复。
可以包含tRNA序列以在单个核酸转录物中表达多个gRNA间隔区序列，这可实现多个独立基因座的同时靶向和衰减。转运RNA是一种RNA分子，利用基本的mRNA指令促进氨基酸的募集和组装。tRNA序列可以被内源性RNA加工酶切割，使得如果多个gRNA间隔序列的侧翼有单个tRNA，那么多功能性gRNA在细胞内释放用于靶标杂交和切割。
在tRNA和gRNA支架序列位于每个gRNA间隔区的侧翼的情况下，间隔区SEQ ID NO:3-10的完整gRNA盒序列可以分别包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO.14、SEQ ID N0:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18相同或基本相同的序列，其再次通过内源性RNA聚合酶作为靶细胞内表达的DNA序列提供。基本相同的序列可以包括与上述SEQ ID NO:11-18中的任何一个具有至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
单个启动子可用于表达所有gRNA间隔区序列、支架和tRNA。启动子可以是组成型的，例如U6，或者它可以在特定时间和/或特定位置表达。U6启动子可以与SEQ ID NO:19相同或基本相同。基本相同的序列可以包括与SEQ ID NO:19具有至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核苷酸序列。或者，外源表达载体中包含的每个gRNA盒(由间隔区、支架和/或tRNA序列组成)都可以由单个启动子转录。
芦荟突变体可以通过鉴定成功突变细胞的一个或多个特征来选择，例如荧光和/或抗生素抗性。突变体也可以通过一种或多种技术进行确认，包括PCR扩增、定量PCR和/或DNA测序。此外，可以使用微量滴定法或其他高通量表型分析，包括但不限于：光谱学、薄层色谱法和酶活性分析。
在DNA编辑机器能够靶向和衰减一个或多个靶位点之前，编码该机器的核酸构建体，例如下文中称为“衰减构建体”的环状DNA质粒，必须插入靶细胞中，所述靶细胞可以处于培养中或构成完全形成的植物组织。如上所述，靶细胞可以包括野生型芦荟细胞或维持在细胞培养物中的重编程干细胞。在一些实施方式中，衰减构建体和/或互补核糖核蛋白(RNP)可以通过粒子轰击(即，生物学、基因枪)、细菌转化(例如，农杆菌介导的转化或根瘤菌介导的转换)或原生质体转染或转化插入靶细胞中。根据所公开的实施方式已转化的其它细菌细胞的非限制性实例可以包括衍生自根癌农杆菌、粘着剑菌、海沃德铬杆菌、埃特里根瘤菌、苜蓿中华根瘤菌、百脉根中慢生根瘤菌、根瘤菌菌株NGR234或其组合的细胞。实施例还可涉及使用碳纳米管、碳化硅晶须、直接注射或其组合将衰减构建体递送到靶细胞。在一些实施方式中，将衰减构建体结合到培养的细胞中可以根据两步过程来实现。第一步可以涉及用衰减构建体转化细菌宿主细胞，然后通过细菌细胞的系统进行复制。第二步可以涉及将转化的细菌细胞感染到靶细胞中，在靶细胞中转录和翻译衰减构建体。
在一些实施方式中，转化可以通过电穿孔感受态细菌细胞来实现，例如根癌农杆菌细胞(以下简称“农杆菌”)，其是天然存在的土壤细菌，能够通过内源性转化DNA(“T-DNA”)将外源核酸引入植物细胞基因组。农杆菌细胞可以根据各种技术转化，这些技术可以包括热休克和/或电穿孔。
在一个实施例中，可以在一种或多种抗生素的存在下培养感受态农杆菌细胞过夜。当细菌细胞培养物达到对数生长，例如OD600读数在约0.6和1.0之间时，细胞可以被旋转以形成浓缩的沉淀。洗涤一次或多次后，可以将沉淀重悬于去离子水中，并且可以将一部分重新悬浮的细菌(例如，约80μL)转移到单独的微量离心管中，也可以向其中添加衰减构建体。添加到细菌悬浮液中的衰减构建体的量可以变化，在各种实施方式中约25至约250ng的范围内。
然后可以将接种DNA的细菌悬浮液转移到电极杯，例如2mm电极杯中，并在约2.5kv下进行电穿孔。电穿孔后，可以将约900μL具有分解代谢抑制功能的超优肉汤(“S.O.C.”)培养基添加到转化的细菌培养基中，然后可以在约28℃下孵育约3小时或更长时间。然后可以对得到的培养物进行离心并去除上清液。重悬浮后，转化的细菌可以铺展到选择性培养基上，例如，注入了在衰减构建体中编码的一种或多种抗生素的琼脂。例如编码的抗生素可以包括卡那霉素和/或壮观霉素。可以提取来自转化的农杆菌的DNA并对其进行测序以确认成功转化。
在用衰减构建体转化细菌细胞后，可以将构建体感染到目标植物细胞中。在一些实施例中，此过程可在补充有一种或多种抗生素的培养基(例如，注入壮观霉素和/或卡那霉素的琼脂)上在约28℃下使转化细胞生长约两天后开始。例如，然后可以选择单一的细菌培养物，并将其接种到补充有至少一种抗生素的液体培养基中，并在约28℃下在设定为约180rpm的摇床上搅拌过夜。一旦培养物的OD600读数达到至少约0.8，就可以将液体培养物沉淀，丢弃上清液，并将细菌重悬在pH约5.7的“感染培养基”中。所得到的重浮液可以用乙酰丁香酮补充，并将细胞密度调节至约0.6至约0.8。
根据靶细胞感染步骤，可以将芦荟植物细胞培养物接种到试管或小瓶中，例如50mL锥形管中。细胞培养物可以离心并用约5mL转化的农杆菌和感染培养基重悬。将混合物涡旋、沉淀并再悬浮在共培养基中。除去上清液并重悬剩余的农杆菌。此后，所得细胞培养物可以沉淀至少一次，并且在相对较长的时间段(例如，大约两到三周)之后，可以将细胞培养物重悬在新的培养基中，例如，含有潮霉素的培养基。培养物可以在显微镜下观察约六周到约八周的时间。培养物可以用细胞计数器进行筛选，并根据需要进行稀释。
在孵育细胞培养物样品直到出现抗生素抗性菌落之后，可以选择菌落进行DNA提取和通过PCR扩增以确认pks1和/或pks2的成功衰减，例如敲除。为了证实成功的pks1敲除，用于PCR的正向引物可以具有与SEQ ID NO:20相同或基本相同的序列，而反向引物可以具有与SEQ ID NO:21相同或基本上相同的序列。为了证实成功的pks2敲除，用于PCR的正向引物可以具有与SEQ ID NO:22相同或基本相同的序列，而反向引物可以具有与SEQ ID NO:23相同或基本上相同的序列。基本相同的序列可以包括与上述SEQ ID NO:20-23中的任何一个具有至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的核苷酸序列。附加地或替代地，敲除确认可以通过基于PCR扩增一个或多个包含至少一部分衰减构建体的序列来实现。还可以对靶向衰减位点的至少一部分进行DNA测序以确认成功编辑。
pks1和/或pks2表达的衰减可以定义为其表达水平与野生型表达水平相比减少至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％。在一些实施方式中，衰减的表达可以降低到不可检测的水平。如上所述，衰减还可以包括突变的pks1/pks2基因的野生型表达。根据这样的实施方式，所得PKS1/PKS2蛋白的结构、功能和/或生产水平可能被破坏。
图2描绘了约1800bp构建体的实施例，其用于通过CRISPR介导的编辑芦荟宿主细胞中的pks1和/或pks2基因敲低或以其他方式衰减PKS1和/或PKS2蛋白的产生。所示的质粒载体200包含骨架模板构建体，其经修饰以包含对本发明实施过程特异的序列。如所示，构建体可包含二元质粒200，其包含成功细菌转化、靶细胞感染和衰减构建体表达所需的许多序列。特别地，质粒200包括至少一植物特异性启动子202，其被配置为驱动受感染的植物细胞中CRISPR部件的表达。在所示的实例中，植物特异性启动子202包含源自花椰菜花叶病毒的序列，称为CaMV 35S。编码绿色荧光蛋白(“GFP”)的序列204也包含在启动子202的下游。GFP构建体204在靶向植物细胞中的表达使得能够荧光选择表达衰减构建体的细胞。
质粒200还包括gRNA盒，该gRNA盒由多个gRNA 206(作为用于随后转录的DNA提供)和Cas9编码区208组成。在该特定实施方式中，所述gRNA盒包括对应于六个gRNA的DNA序列，每个gRNA可以包括gRNA间隔区序列和Cas9支架，以及用于多重表达的tRNA序列。总之，所述gRNA可以靶向pks1和/或pks2内或重叠的序列，使得一个或两个基因通过靶向Cas9切割有效地衰减。所述gRNA盒以及一个或多个附加部件可以使用各种技术克隆到质粒200中，包括各种基于限制酶的方法和/或一种或多种市售克隆系统，例如克隆或金门组装。
为了确保包括gRNA盒和GFP序列的衰减构建体成功转移到靶植物细胞中，所述质粒200还包括左边界T-DNA重复序列(“LB T-DNA”)210和右边界T-DNA重复序列(“RB T-DNA”)212，每个可以包含约25个碱基对。通过用质粒200转化的细菌细胞将这些序列侧翼的区域转移到靶植物细胞。在植物细胞感染成功后，转移的gRNA盒可以合并在感染的植物细胞的基因组中，其中使用植物宿主体系转录和翻译所述盒。
还包括多种抗生素抗性基因，以促进用质粒200成功转化的细菌细胞和用质粒200成功感染的植物细胞的抗生素选择。所示的实例包括潮霉素抗性基因214和链霉素抗性基因216，这两个基因都由增强的CaMV 35S启动子218表达。
包含pVS1 StaA序列220，以促进转化细菌细胞中稳定的质粒分离，且包含pVS1RepA序列222，以促进细菌细胞内连续质粒复制。
细胞培养
可以使用多种技术筛选用于持续繁殖的突变芦荟植物细胞。这样的技术可以包括抗生素筛选和/或基于荧光的筛选。在一些实施例中，可以至少部分地通过利用由转化到细菌细胞中并在宿主植物细胞内感染的质粒200编码的一种或多种蛋白质产物的表达来实现筛选。例如，突变体芦荟细胞可以通过其对潮霉素和/或链霉素以及其他抗生素的抗性来筛选。突变细胞也可以通过包含在衰减构建体中的荧光构建体的表达来筛选，例如编码GFP或dsRed的构建体。产生芦荟素的细胞的天然荧光也可能促进突变体的筛选过程。高通量机器人可用于通过连续筛选表达一种或多种可选择特征的细胞来帮助任何上述过程。
在筛选成功表达出毒素抑制的芦荟植物细胞后，方法可以包括根据定制的培养程序培养突变的芦荟细胞。培养程序可以包括在设计用于促进细胞生长的受控环境条件下在合适的培养基中生长细胞，其可以通过细胞大小、细胞含量和/或细胞活性的增加来测量。可使用的悬浮生长容器包括试管、罐子、烧瓶(有挡板和无挡板)、生物反应器、发酵罐、桶、罐、鼓、管或袋。细胞可能需要也可能不需要保持在悬浮液中，在这种情况下，可以通过使用磁性搅拌棒、桨叶、泵、摇动或气体喷射中的一种或其组合来实现混合。在一些实施方式中，细胞也可以在粘附支撑系统上生长，例如辊瓶、多层细胞培养托盘、泡沫、珠粒、纤维或微载体。在一些实施方式中，可以为培养物提供气体交换，包括0.01-100％空气、0.1-100％纯氮、0.1-100％二氧化碳、0.1-100％纯氧或其任意组合。所用的气体可渗透材料，包括但不限于聚合物，如聚乙烯(PE)膜或纤维和泡沫或天然纤维塞，可以用作活性气体交换的替代方案，当主动引入气体交换时，提供给细胞的气体流速可以是1-100L/min。在主动添加气体的情况下，可以将其过滤至0.2μM或更低，以保持无菌。细胞生长也可以通过细胞繁殖来测量，细胞繁殖可以通过总细胞计数的增加来测量，例如通过显微镜或流式细胞术。为了便于说明，细胞生长和繁殖的组合在本发明中可以称为“增殖”。
在细胞培养基中包含的特定营养物质和缓冲液可能对细胞培养的健康和生长具有显著影响。因此，本发明所述用于生长无毒素细胞的细胞培养基可以包括一种或多种生长促进组分的新组合和量，例如糖、硝酸盐、磷酸盐、生长调节剂和/或碳源。细胞培养基也可以具有特定的pH或pH范围。
特定的细胞培养条件也可能是本发明所述用于增强细胞生长、发育和代谢产物产生的方法所特有的。因此，用于生长无毒素突变细胞的条件可以包括新的温度、湿度水平、二氧化碳水平、通气水平、扰动条件(例如摇动)和/或光照应用。
细胞培养条件可以根据光合自养植物进行调整。光合自养生长的芦荟细胞培养物可以在无机碳基本上是唯一碳源的培养基上生长。例如，无机碳基本上是唯一碳源的培养物中，可以在培养基中提供的任何有机碳分子或有机碳化合物不能被细胞吸收和/或代谢以获得能量，和/或不以足以为细胞培养增殖提供可持续能量的量存在。光合自养生长的细胞可以在恒定光照或昼夜循环下生长，例如，光照周期可以是例如至少4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、超过16小时或其间的任何时间长度的昼夜循环。
至少在最初，细胞培养物可以在培养皿、摇瓶、试管、生长板、小瓶和/或微量滴定皿中保持和/或扩增。这样的装置可以放置在生长室中，生长室被编程为维持如本发明公开的细胞培养条件。
通过实施本发明所述的细胞培养条件，培养物可以以小于约两天、约两天，约三天、约四天、约五天、约六天、超过六天或其间任何时间长度的加倍速率扩增。具体实施方式可以表现出大约两到三天的加倍速率。这样的增殖速率可以近似类似于在野生型芦荟细胞培养物中实现的增殖速率，或者相对于野生型和/或基因修饰的细胞培养物，增殖速率可以被加快。
所述培养的细胞可以在任何合适的容器中扩增，包括烧瓶或生物反应器，其中突变芦荟可以在不使用土壤的专用培养基的存在下暴露于人工或自然光下。包含突变芦荟的培养物可以在光/暗循环下培养，所述光/暗循环可以是自然的或程序化的光/暗循环。实施方式可涉及在一个或多个生物反应器中培养无毒素细胞，所述生物反应器配备有人工光源和/或具有配置允许足以促进细胞培养增殖的自然光通过的外壁。每个生物反应器可以向生长的细胞培养物提供无机碳源。无机碳的非限制性实例可包括二氧化碳、碳酸氢盐和/或碳酸盐，其可由空气、富含CO2的空气、烟道气或其组合提供。
如本发明所使用的，术语“生物反应器”是指一种被配置为通过维持有利于细胞活力和生长的内部环境来支持和扩增突变芦荟植物细胞群体的装置。该设备可以包括容器、罐或室，其被配置为搅拌、摇动或以其他使所含培养细胞混合的方式。具体实施方式还可以包括被配置为对培养的植物细胞群体进行气轮混合、气泡混合和/或轨道摇动的设备。实施例搅拌槽生物反应器可以配备有一个或多个支撑槽，该支撑槽包含用于混合的叶轮和用于培养通气的喷布器。在搅拌混合的设备中，培养细胞附着在其上的材料可以包括基本上刚性或柔性的材料，其中任何一种材料都可以包括一种或多种塑料。被配置为使培养细胞摇晃的装置可以包括大体上柔性的腔室，该腔室类似于支撑在托盘上的塑料枕头或袋子，该托盘被配置为来回移动以进行连续的混合动作和气体转移。
在一个或多个生物反应器内扩增一段时间后，可以收获突变的芦荟细胞以获得无毒素的芦荟生物产品。本发明中使用的术语“生物产品”是指包含或衍生自根据所公开的实施方式描述的突变细胞的产品，即缺乏或基本上缺乏一种或多种毒素(例如芦荟素)的细胞。这样的产品可以是干形式，例如粉末，湿形式，例如液体，和/或粘液形式，例如凝胶。所述产物可以包括各种不同量的分子或分子类别。此类产品的非限制性实例包括由至少一种多糖、葡甘聚糖、半乳甘露聚糖、核苷二磷酸糖、β-羟基酸、五环二萜、七酮(heptaketide)、芳香族聚酮、肉桂酸酯、色酮、蒽醌、二羟基蒽醌、蒽酮、八酮(octaketide)、苯并异色满醌、C-葡糖基蒽酮、辅酶、蒽、查尔酮化合物(chalconoid)、脂质、氨基酸、蛋白质、碳水化合物、戊醛糖、胆固醇、类固醇、矿物质、中链脂肪酸、果胶和/或甘油三酯构成的生物产品。所公开的生物产品的具体实施方式可能缺乏或基本上缺乏一种或多种天然产生的毒素，例如芦荟素，并且可能包括一种或多种多糖、矿物质、糖、蛋白质、脂质、脂肪酸、酯和/或酚类化合物。潮湿或粘稠的生物产品可以在水基悬浮液中产生任何或所有上述组分。在实施方式中，收获的生物产品可以包括或结合到各种最终产品中，例如消费者使用的产品，其非限制性实例可以包括芦荟基凝胶、乳霜、乳液、肥皂、防晒霜、喷雾剂、护发产品、胶冻、保湿霜、洁面乳、爽肤水、皮肤护理组合物、化妆品、漱口水、牙膏、可食用食品和/或液体，例如水或果汁。
无毒素的细胞培养物也可以全部或部分回收。在一些实施例中，可以从全细胞培养物中选择性地提取一种或多种多糖、蛋白质、脂质和/或生物质。可以通过离心和/或过滤来收获生物质，随后可以进行一个或多个处理步骤，例如干燥、浓缩和/或研磨，以生产纯化的无毒素芦荟粉末。例如，无毒素芦荟粉可以通过添加一种或多种液体或凝胶来复原。根据一些实施方式，每升生物反应器样品每天可以产生至少1克无毒素芦荟粉末。无毒素的芦荟生物产品也可以被过滤和/或消毒以去除任何杂质。无论是液体、粘液状还是干燥形式，无毒素芦荟生物产品都可能是纯的或基本上纯的，这意味着该产品缺乏或基本上缺乏所获芦荟中非天然存在的成分。另外地或替代地，可以用一种或多种添加剂或防腐剂补充生物产品，以增强或稳定所需的芦荟特性。最终产物也可以是具有衰减的pks1/2表达的再生的不含毒素的芦荟植物或植物产品，例如植物部分或种子。
所公开的细胞培养物可以扩展到工业规模的生产系统中，所述生产系统被配置为产生大量的无毒素植物产品。随着规模的扩大，一个25000升的反应器可以以相当于100公顷农场的速度生产出无毒素芦荟。培养物可以按比例放大到更大的反应器，例如体积为74升、100升、125升、150升、175升、200升、225升、250升、275升、300升、大于300升或其间任何体积的反应器。这可以扩大到大约75000升的生物反应器。
图3是描绘根据本发明描述的实施方式实施的另一方法300的流程图。如所示，在步骤302，方法300可包括“获得来源于一种芦荟的植物细胞”。在步骤304，方法300可以包括“在获得的植物细胞中衰减野生型芦荟产生的毒素生物合成所需的至少一种蛋白质(例如PKS1和/或PKS2)的表达水平以形成突变植物细胞”。在步骤306，方法300可以包括“在一组培养条件下培养突变植物细胞”。如上所述，方法还可以包括任选地在衰减毒素生物合成所需的至少一种蛋白质的表达水平之前将获得的植物细胞转化为植物干细胞。在步骤308，方法300还可以包括“使用突变植物细胞再生芦荟植物”。在步骤310，方法300可以进一步包括“从突变芦荟植物中获得突变芦荟种子”
如本发明所用，修饰，例如，用于描述本公开实施方式的组合物中的组分的量、浓度及其范围的术语“约”，是指可发生的数值变化，例如通过用于制备化合物、组合物、浓缩物或使用制剂的典型测量和处理程序；由于这些程序中的疏忽错误；通过用于实施所述方法的起始材料或组分的制造、来源或纯度的差异，以及类似的近似考虑因素。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的制剂的老化而不同的量，以及由于混合或处理具有特定初始浓度或混合物的配方而不同的量。在被术语“约”修改的情况下，本发明所附的权利要求包括这些量的等价物。
类似地，应当理解的是，在示例实施例的前述描述中，为了简化公开内容并有助于理解各个方面中的一个或多个的目的，各种不同的特征有时被组合在单个实施例中。然而，这些公开方法不应被解释为反映权利要求要求的特征多于每项权利要求中明确记载的特征的意图。相反，如所附权利要求所反映的，创造性方面并不局限于单个前述公开的实施例的所有特征，且本文描述的各实施方式可以包含一个以上的创造性特征。
尽管本公开提供了优选实施例的参考，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行改变。
序列表
<110> 芝一植物股份有限公司
<120> 无毒素芦荟及其制备方法
<130> P291962.US.01
<140>
<141>
<160> 1079
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 403
<212> PRT
<213> 芦荟(Aloe sp.)
<400> 1
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1 5 10 15
Ile Arg Lys Ala Gln Lys Ala Asp Gly Thr Ala Thr Val Met Ala Ile
20 25 30
Gly Thr Ala His Pro Pro His Ile Ile Ser Gln Asp Ser Tyr Ala Asp
35 40 45
Phe Tyr Phe Arg Val Thr Asn Ser Glu His Lys Val Glu Leu Lys Lys
50 55 60
Lys Phe Asp Arg Ile Cys Lys Lys Thr Met Ile Gly Lys Arg Tyr Phe
65 70 75 80
Asn Phe Asp Glu Glu Phe Leu Lys Lys Tyr Pro Asn Ile Thr Ser Phe
85 90 95
Asp Lys Pro Ser Leu Asn Asp Arg His Asp Ile Cys Ile Pro Gly Val
100 105 110
Pro Ala Leu Gly Ala Glu Ala Ala Val Lys Ala Ile Glu Glu Trp Gly
115 120 125
Arg Pro Lys Ser Glu Ile Thr His Leu Val Phe Cys Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Val Asp Met Pro Ser Ala Asp Phe Gln Cys Ala Lys Leu Leu Gly Leu
145 150 155 160
Arg Thr Asn Val Asn Lys Tyr Cys Ile Tyr Met Gln Gly Cys Tyr Ala
165 170 175
Gly Gly Thr Val Met Arg Tyr Ala Lys Asp Leu Ala Glu Asn Asn Arg
180 185 190
Gly Ala Arg Val Leu Met Val Cys Ala Glu Leu Thr Ile Ile Ala Leu
195 200 205
Arg Gly Pro Asn Asp Ser His Ile Asp Asn Ala Ile Gly Asn Ser Leu
210 215 220
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Gly Val Glu Lys Pro Met Phe Glu Ile Val Cys Ala Lys Gln Thr Val
245 250 255
Ile Pro Asn Ser Glu Asp Val Ile His Leu His Leu Arg Glu Ser Gly
260 265 270
Leu Met Phe Tyr Met Thr Lys Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser Asn Asn
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Met Arg Arg Lys Ser Ala Ala
355 360 365
Glu Gly Leu Glu Thr Tyr Gly Glu Gly Leu Glu Trp Gly Val Leu Leu
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<213> 芦荟(Aloe sp.)
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<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<210> 4
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寡核苷酸
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<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<211> 23
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<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<211> 23
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<211> 23
<212> DNA
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<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<223> 人工序列描述：合成
多聚核苷酸
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aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60
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aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 176
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<223> 人工序列描述：合成
多聚核苷酸
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<220>
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多聚核苷酸
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<210> 15
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
多聚核苷酸
<400> 15
aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60
gattcccggc tggtgcaatg cagggatgct acgctggcgg gttttagagc tagaaatagc 120
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 176
<210> 16
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
多聚核苷酸
<400> 16
aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60
gattcccggc tggtgcaagg catgtcgaca ccgcaggagg gttttagagc tagaaatagc 120
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 176
<210> 17
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
多聚核苷酸
<400> 17
aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60
gattcccggc tggtgcacca ggatatttgc gtccctgggg gttttagagc tagaaatagc 120
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 176
<210> 18
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
多聚核苷酸
<400> 18
aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60
gattcccggc tggtgcattc tggatccctc accccggcgg gttttagagc tagaaatagc 120
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 176
<210> 19
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
多聚核苷酸
<400> 19
aagaacgaac taagccggac aagaaaagga gcacatatac aaaccggttt tattcatgaa 60
tggtcacgat ggatgatggg gctcagactt gagctacgag gccgcaggcg agagaagcct 120
agtgtgctct ctgcttgttt gggccgtaac ggaggatacg gccgacgagc gtgtactacc 180
gcgcgggatg ccgctgggcg ctgcgggggc cgttggatgg ggatcggtgg gtcgcgggag 240
cgttgagggg agacaggttt agtaccacct cgcctaccga acaatgaaga acccacctta 300
taaccccgcg cgctgccgct tgtgttag 328
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 20
cactctccga ctctacgcct 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 21
taaacttctc ggggcgaagc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 22
ctcgccagtg atggaggatg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 23
ccgtaggttg ctagtccgtc 20
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 24
cgactctacg cctttgatga agg 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 25
gcctttgatg aaggatgtgc agg 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 26
cctttgatga aggatgtgca ggg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 27
ggatgtgcag ggcatccgaa agg 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 28
gggcatccga aaggcccaaa agg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 29
cgaaaggccc aaaaggccga cgg 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 30
cgacggaact gcgaccgtga tgg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 31
actgcgaccg tgatggccat tgg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 32
ccctcctcat atcatttcgc agg 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 33
catttcgcag gacagctacg cgg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 34
gctacgcgga tttctacttc cgg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 35
ctacgcggat ttctacttcc ggg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 36
ggtcaccaac agcgagcaca agg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 37
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<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 38
gcgttacttt aacttcgacg agg 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 39
acaagcccag cctcaacgac agg 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 40
aggcatgaca tttgcattcc tgg 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 41
ggcatgacat ttgcattcct ggg 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 42
gcatgacatt tgcattcctg ggg 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 43
catttgcatt cctggggtgc cgg 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 44
cattcctggg gtgccggcgc tgg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 45
attcctgggg tgccggcgct ggg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 46
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<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 47
tcctggggtg ccggcgctgg ggg 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 48
tggggtgccg gcgctggggg cgg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 49
gccggcgctg ggggcggaag cgg 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 50
agcggctgtt aaagccattg agg 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 51
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<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 52
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<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 53
gttaaagcca ttgaggagtg ggg 23
<210> 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 54
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<210> 55
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 55
ctcgtcttct gcaccagcgg cgg 23
<210> 56
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 56
ttccagtgcg ctaagctcct tgg 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 57
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<210> 58
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 58
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<210> 59
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 59
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<210> 60
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 60
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<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 61
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 62
caccgtcatg cggtatgcca agg 23
<210> 63
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 63
catgcggtat gccaaggatc tgg 23
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 64
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<210> 65
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 65
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<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 66
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<210> 67
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 67
tcccatatcg acaatgctat cgg 23
<210> 68
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 68
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<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 69
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<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 70
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<210> 71
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 71
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 72
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 73
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<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 74
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<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 75
ccatctccac ctgagggagt cgg 23
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 76
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<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 77
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<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 78
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<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 79
ccttgttgat gtgtttaagt cgg 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 80
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<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 81
gttgatgtgt ttaagtcggt ggg 23
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 82
ttgatgtgtt taagtcggtg ggg 23
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 83
gtcggtgggg atgactcctc cgg 23
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 84
ggtggggatg actcctccgg agg 23
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 85
ggatgactcc tccggaggat tgg 23
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 86
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<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 87
ctcttctgga tccctcatcc cgg 23
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 88
ttctggatcc ctcatcccgg tgg 23
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 89
ggatccctca tcccggtggc cgg 23
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 90
gatccctcat cccggtggcc ggg 23
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 91
ggctatcctc gaccaagttg agg 23
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 92
gtgcgactcg aacagttctc tgg 23
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 93
tgcgactcga acagttctct ggg 23
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 94
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<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 179
cgcagttccg tcggcctttt ggg 23
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 180
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<210> 181
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 181
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 200
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
<400> 241
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
<400> 247
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 249
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<220>
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<400> 250
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<211> 23
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<400> 251
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<210> 252
<211> 23
<212> DNA
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<220>
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寡核苷酸
<400> 252
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<210> 253
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 253
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<210> 254
<211> 23
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 254
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<210> 255
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 255
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<210> 256
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<210> 257
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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<400> 258
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<212> DNA
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<220>
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寡核苷酸
<400> 259
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 263
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<210> 264
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 264
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<210> 265
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 265
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 300
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 302
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 303
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 307
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 308
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 315
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<210> 318
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 318
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 323
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 324
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 325
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 326
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<210> 327
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 327
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<210> 328
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 328
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 329
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<210> 330
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 330
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 331
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<210> 332
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 332
ttatactgga tgaaatgaga aga 23
<210> 333
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 333
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<210> 334
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 334
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<210> 335
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 335
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<210> 336
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<400> 336
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<210> 337
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 337
ttagaaacct acggagaggg gtt 23
<210> 338
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 338
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<210> 339
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 339
ttgcttggtt ttggaccagg aat 23
<210> 340
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 340
cttggttttg gaccaggaat gac 23
<210> 341
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 341
ttggttttgg accaggaatg act 23
<210> 342
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 342
ttttggacca ggaatgacta ttg 23
<210> 343
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 343
tttggaccag gaatgactat tga 23
<210> 344
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 344
ttggaccagg aatgactatt gaa 23
<210> 345
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 345
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<210> 346
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 346
ttgaaactat ccttcttcat agc 23
<210> 347
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 347
ctatccttct tcatagcctg cct 23
<210> 348
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 348
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<210> 349
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 349
ttcttcatag cctgcctcct gtg 23
<210> 350
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 350
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<210> 351
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 351
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<210> 352
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
<400> 353
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 365
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<210> 366
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<400> 366
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 367
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 368
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<210> 373
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 399
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<210> 400
<211> 23
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 401
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 404
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 407
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<400> 413
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<211> 23
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 414
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<210> 415
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 415
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<400> 416
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<210> 417
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 417
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<400> 418
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<210> 419
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<400> 419
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<210> 420
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<400> 420
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<210> 421
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 421
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<210> 422
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 422
ttctcggcca gatccttggc ata 23
<210> 423
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 423
ctcggccaga tccttggcat acc 23
<210> 424
<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 424
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<210> 425
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 425
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 426
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<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 427
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<210> 428
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 428
ttgttgacat tggtgcggag gcc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 429
ttgacattgg tgcggaggcc aag 23
<210> 430
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 430
ttggtgcgga ggccaaggag ctt 23
<210> 431
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 431
cttagcgcac tggaaatcgg cac 23
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<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<210> 501
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 501
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<210> 502
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 502
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<210> 503
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 503
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<210> 504
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 504
gtgcatgtgt gctctttata ctggat 26
<210> 505
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 505
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<210> 506
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 506
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<210> 507
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 507
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 508
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 509
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<210> 510
<211> 26
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 510
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<210> 511
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 511
ccataatccc agagaactgt tcgagt 26
<210> 512
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 512
agcttggcct caacttggtc gaggat 26
<210> 513
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 513
gtcgaggata gcccggccac cgggat 26
<210> 514
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 514
atagcccggc caccgggatg agggat 26
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<211> 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 515
gggatgaggg atccagaaga gagagt 26
<210> 516
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 516
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<210> 517
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 517
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<210> 518
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 518
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<210> 519
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 550
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<223> 人工序列描述：合成
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 570
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 577
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 578
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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寡核苷酸
<400> 581
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
<400> 584
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 585
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<220>
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寡核苷酸
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<211> 23
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 587
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<211> 23
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 588
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 589
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 590
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 591
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 592
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<210> 593
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 593
tacatgcagg gatgctacgc tgg 23
<210> 594
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 594
atgcagggat gctacgctgg cgg 23
<210> 595
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 595
acgctggcgg cacagtcatg cgg 23
<210> 596
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 596
cacagtcatg cggtacgcca agg 23
<210> 597
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 597
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<210> 598
<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 598
ccgcggtgct cgtgttctag tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<210> 601
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
<400> 634
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 658
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 665
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 666
ctgcctctct catgtggaga tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 667
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 668
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 669
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<210> 670
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 670
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<210> 671
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 671
gcttctcgac gccaatgatg ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 672
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<210> 673
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 673
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 674
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<210> 675
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 675
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 676
gccgatggcg ttgtcgagat ggg 23
<210> 677
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 677
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<210> 678
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 678
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<210> 679
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 679
aagcccgatg atggtgagct cgg 23
<210> 680
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 680
ccactagaac acgagcaccg cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 681
acgagcaccg cggttgttct cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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寡核苷酸
<400> 682
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 683
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<210> 684
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 684
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 705
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<220>
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寡核苷酸
<400> 706
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<220>
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寡核苷酸
<400> 707
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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寡核苷酸
<400> 708
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<220>
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寡核苷酸
<400> 709
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 713
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<220>
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寡核苷酸
<400> 714
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 715
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 716
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
<400> 718
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 720
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 722
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 723
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 724
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 725
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 727
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 728
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 729
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 730
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 731
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 732
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<210> 733
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 733
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<210> 734
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 734
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<210> 735
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 735
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<210> 736
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 736
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<210> 737
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 737
tttggacgtc cccattcagc gatg 24
<210> 738
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 738
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<210> 739
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 739
tttttgcaga tacgatcgaa tttc 24
<210> 740
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 740
ttttgcagat acgatcgaat ttct 24
<210> 741
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 741
tttgcagata cgatcgaatt tctt 24
<210> 742
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 742
tttctttttg agctcgactt tgtg 24
<210> 743
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 743
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<210> 744
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 744
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<210> 745
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 745
tttgagctcg actttgtgct cgct 24
<210> 746
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 746
tttgtgctcg ctgttggtgg cgcg 24
<210> 747
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 747
tttttgggcc tttcggatgg cctg 24
<210> 748
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 748
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<210> 749
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 749
tttgggcctt tcggatggcc tgca 24
<210> 750
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 750
tttcggatgg cctgcacatc ctcc 24
<210> 751
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 751
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<210> 752
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 752
ctctctccaa ctactcgcca gtg 23
<210> 753
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 753
ctctccaact actcgccagt gat 23
<210> 754
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 754
ctactcgcca gtgatggagg atg 23
<210> 755
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 755
ctcgccagtg atggaggatg tgc 23
<210> 756
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 756
ctcaccctcc tcatatcttt cct 23
<210> 757
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 757
ctcctcatat ctttcctcag gac 23
<210> 758
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 758
ctcatatctt tcctcaggac acc 23
<210> 759
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 759
tttcctcagg acacctatgc gga 23
<210> 760
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 760
ttcctcagga cacctatgcg gac 23
<210> 761
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 761
ctcaggacac ctatgcggac ttc 23
<210> 762
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 762
ctatgcggac ttctacttcc gcg 23
<210> 763
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 763
cttctacttc cgcgccacca aca 23
<210> 764
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 764
ttctacttcc gcgccaccaa cag 23
<210> 765
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 765
ctacttccgc gccaccaaca gcg 23
<210> 766
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 766
cttccgcgcc accaacagcg agc 23
<210> 767
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 767
ttccgcgcca ccaacagcga gca 23
<210> 768
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 768
ctcaaaaaga aattcgatcg tat 23
<210> 769
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 769
ttcgatcgta tctgcaaaaa gac 23
<210> 770
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 770
ctgcaaaaag acaatgatag gca 23
<210> 771
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 771
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<210> 772
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 772
cttcaactac gatgaggaat tcc 23
<210> 773
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 773
ttcaactacg atgaggaatt cct 23
<210> 774
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 774
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<210> 775
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 775
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<210> 776
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 776
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<210> 777
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 777
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<210> 778
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 778
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<210> 779
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 779
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 780
cttcattcga cgagccgagc ctc 23
<210> 781
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 781
ttcattcgac gagccgagcc tca 23
<210> 782
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 782
ttcgacgagc cgagcctcaa cga 23
<210> 783
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 783
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<210> 784
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 784
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<210> 785
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 785
ttgcgtccct ggggtgccgg ccc 23
<210> 786
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 786
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<210> 787
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 787
ctgggagccg aagcagctgt caa 23
<210> 788
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 788
ctgaatgggg acgtccaaag tct 23
<210> 789
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 789
ctgagatcac tcatctcgtc ttc 23
<210> 790
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 790
ctcatctcgt cttctgcacc tcc 23
<210> 791
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 791
cttctgcacc tcctgcggtg tcg 23
<210> 792
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 792
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<210> 793
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 793
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<210> 794
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 794
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<210> 795
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 795
ctgcggtgtc gacatgccta gcg 23
<210> 796
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 796
ctagcgctga cttccagtgc gcc 23
<210> 797
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 797
ctgacttcca gtgcgccaag ctc 23
<210> 798
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 798
cttccagtgc gccaagctcc tcg 23
<210> 799
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 799
ctcctcggcc tccgcgccaa tgt 23
<210> 800
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 800
ctcggcctcc gcgccaatgt caa 23
<210> 801
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 801
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<210> 802
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 802
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<210> 803
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 803
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<210> 804
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 804
ctacgctggc ggcacagtca tgc 23
<210> 805
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 805
ctggcggcac agtcatgcgg tac 23
<210> 806
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 806
ctcgccgaga acaaccgcgg tgc 23
<210> 807
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 807
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<210> 808
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 808
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<210> 809
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 809
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<210> 810
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 810
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<210> 811
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 811
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<210> 812
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 812
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<210> 813
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 813
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 814
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<210> 815
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 815
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<210> 816
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 816
ttttggagac ggagctgctg cgc 23
<210> 817
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 817
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<210> 818
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 818
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<210> 819
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 819
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<210> 820
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 820
ctgcgctgat tgtcgggtca gac 23
<210> 821
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 821
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<210> 822
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 822
ttgtcgggtc agaccccatc att 23
<210> 823
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 823
ttggcgtcga gaagcctatg ttc 23
<210> 824
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 824
ctatgttcga gatcgtgtgc gca 23
<210> 825
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 825
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<210> 826
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 826
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<210> 827
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 827
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<210> 828
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 828
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<210> 829
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 829
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<210> 830
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 830
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<210> 831
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 831
ctgagaccat ctccaacaat gta 23
<210> 832
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 832
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<210> 833
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 833
cttgtcgatg tgttcaagtc ggt 23
<210> 834
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 834
ttgtcgatgt gttcaagtcg gtg 23
<210> 835
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 835
ttcaagtcgg tggggatgac tcc 23
<210> 836
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 836
ctcctcccga ggactggaac tct 23
<210> 837
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 837
ctcccgagga ctggaactct ctc 23
<210> 838
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 838
ctggaactct ctcttctgga tcc 23
<210> 839
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 839
ctctctcttc tggatccctc acc 23
<210> 840
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 840
ctctcttctg gatccctcac ccc 23
<210> 841
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 841
cttctggatc cctcaccccg gcg 23
<210> 842
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 842
ctggatccct caccccggcg gcc 23
<210> 843
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 843
ctcaccccgg cggccgagct atc 23
<210> 844
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 844
ctatcctcga ccaggttgag tcc 23
<210> 845
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 845
ctcgaccagg ttgagtccag gct 23
<210> 846
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 846
ttgagtccag gcttaagctt cgt 23
<210> 847
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 847
cttaagcttc gtcccgagaa gtt 23
<210> 848
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 848
ttaagcttcg tcccgagaag ttc 23
<210> 849
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 849
cttcgtcccg agaagttcgg cgc 23
<210> 850
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 850
ttcgtcccga gaagttcggc gcg 23
<210> 851
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 851
ttcggcgcga ctcgaactgt gct 23
<210> 852
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 852
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<210> 853
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 853
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<210> 854
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 854
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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<220>
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寡核苷酸
<400> 874
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
<400> 876
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 880
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 885
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 887
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 904
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 907
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 908
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 915
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 916
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<210> 917
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 917
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<210> 918
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 918
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<210> 919
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 919
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<210> 920
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 920
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<210> 921
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 921
cttcactgtt tgggatcacg gtc 23
<210> 922
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 922
ttcactgttt gggatcacgg tct 23
<210> 923
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 923
ctgtttggga tcacggtctg ctt 23
<210> 924
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 924
tttgggatca cggtctgctt tgc 23
<210> 925
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 925
ttgggatcac ggtctgcttt gcg 23
<210> 926
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 926
ctgctttgcg cacacgatct cga 23
<210> 927
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 927
ctttgcgcac acgatctcga aca 23
<210> 928
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 928
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<210> 929
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 929
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<210> 930
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 930
ctcgaacata ggcttctcga cgc 23
<210> 931
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 931
cttctcgacg ccaatgatgg ggt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 932
ttctcgacgc caatgatggg gtc 23
<210> 933
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 933
ctcgacgcca atgatggggt ctg 23
<210> 934
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 934
ctgacccgac aatcagcgca gca 23
<210> 935
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 935
ctccgtctcc aaaaagggag ttg 23
<210> 936
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 936
ctccaaaaag ggagttgccg atg 23
<210> 937
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 937
ttgccgatgg cgttgtcgag atg 23
<210> 938
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 938
ctcatttggt ccgcgaagcc cga 23
<210> 939
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<210> 940
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 940
ttggtccgcg aagcccgatg atg 23
<210> 941
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 942
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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ttgttctcgg cgagatcctt ggc 23
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 955
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 956
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<210> 957
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 957
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 967
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<220>
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寡核苷酸
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<210> 971
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<210> 973
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<210> 974
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 976
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 977
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 980
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<210> 981
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 981
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<210> 983
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<210> 984
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 984
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 986
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 987
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<220>
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寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1000
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1001
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1002
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1003
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1004
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1005
ctgttgcggt tccatctgct ttt 23
<210> 1006
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1006
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<210> 1007
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1007
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1008
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<210> 1009
<211> 23
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1009
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1010
ttttgggcct ttcggatggc ctg 23
<210> 1011
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1011
tttgggcctt tcggatggcc tgc 23
<210> 1012
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1012
ttgggccttt cggatggcct gca 23
<210> 1013
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1013
ctttcggatg gcctgcacat cct 23
<210> 1014
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1014
tttcggatgg cctgcacatc ctc 23
<210> 1015
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1016
ctgcacatcc tccatcactg gcg 23
<210> 1017
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1017
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1018
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<210> 1019
<211> 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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accctcctca tatctttcct caggacac 28
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寡核苷酸
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ctacttccgc gccaccaaca gcgagcac 28
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寡核苷酸
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ctgagatcac tcatctcgtc ttctgcac 28
<210> 1060
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寡核苷酸
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acatgcaggg atgctacgct ggcggcac 28
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<220>
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寡核苷酸
<400> 1061
ctacgctggc ggcacagtca tgcggtac 28
<210> 1062
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<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1062
atccctggtc cgaaaccaag caagacac 28
<210> 1063
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<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1063
ctcatctcat ccaatatgta gagaacac 28
<210> 1064
<211> 28
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寡核苷酸
<400> 1064
catctcatcc aatatgtaga gaacacac 28
<210> 1065
<211> 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1065
tcaccatgtt tccgcaatcc cagagcac 28
<210> 1066
<211> 28
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<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1066
gaggagtcat ccccaccgac ttgaacac 28
<210> 1067
<211> 28
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1067
gtttgggatc acggtctgct ttgcgcac 28
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<400> 1068
ttgggatcac ggtctgcttt gcgcacac 28
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寡核苷酸
<400> 1069
aagcccgatg atggtgagct cggcgcac 28
<210> 1070
<211> 28
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寡核苷酸
<400> 1070
gcccgatgat ggtgagctcg gcgcacac 28
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<400> 1071
gtgagctcgg cgcacaccac tagaacac 28
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寡核苷酸
<400> 1072
tcggcgcaca ccactagaac acgagcac 28
<210> 1073
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寡核苷酸
<400> 1073
gttgttctcg gcgagatcct tggcgtac 28
<210> 1074
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寡核苷酸
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gtagcatccc tgcatgtaga cgcaatac 28
<210> 1075
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1075
ggcgcggagg ccgaggagct tggcgcac 28
<210> 1076
<211> 28
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1076
tggaagtcag cgctaggcat gtcgacac 28
<210> 1077
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1077
cagctgcttc ggctcccagg gccggcac 28
<210> 1078
<211> 28
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1078
ttgcctatca ttgtcttttt gcagatac 28
<210> 1079
<211> 28
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列描述：合成
寡核苷酸
<400> 1079
ctttttgggc ctttcggatg gcctgcac 28
Claims (20)
1.一种生成突变芦荟的方法，所述方法包括：
从一种芦荟中获得植物细胞；
衰减所获得的植物细胞中野生型芦荟产生的毒素的生物合成所需的至少一种蛋白质的表达水平以形成突变体植物细胞，其中，所述至少一种蛋白质包括聚酮合酶1(PKS1)和/或聚酮合酶2(PKS2)；和
在一组培养条件下培养所述突变植物细胞。
2.如权利要求1所述的方法，在衰减毒素的生物合成所需的至少一种蛋白质的表达水平之前，所述方法还包括将所获得的植物细胞转化为植物干细胞。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括在生物反应器中培养所述培养的突变植物细胞，和从所述培养的突变植株细胞获得的芦荟生物产物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述毒素包括芦荟素。
5.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括使用突变植物细胞再生芦荟植物。
6.如权利要求1所述的方法，在一组培养条件下培养突变植物细胞之前，所述方法还包括通过筛选突变植物细胞的荧光和/或向突变植物细胞施用一种或多种抗生素来选择突变植物细胞。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，衰减毒素的生物合成所需的至少一种蛋白质的表达水平包括破坏所述至少一种蛋白的酶活性。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，衰减至少一种蛋白质的表达水平包括破坏pks1和/或pks2基因的表达。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，破坏所述pks1和/或pks2基因的表达包括：
用切割pks1和/或pks2的核酸内切酶转化细菌细胞；和
用转化的细菌细胞感染获得的植物细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸内切酶在CRISPR构建体中编码，所述CRISPR构建物包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10具有至少55％同一性的引导RNA序列。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述破坏pks1和/或pks2基因的表达包括通过粒子轰击、碳纳米管、碳化硅晶须或直接注射中的一种或多种将靶向pks1和/或pks2的核酸内切酶和/或核糖核蛋白递送至获得的植物细胞。
12.一种突变芦荟，其至少一种聚酮合酶(pks)基因的表达减弱。
13.如权利要求12所述的突变芦荟，其特征在于，所述至少一种pks基因包括pks1和/或pks2。
14.如权利要求13所述的突变芦荟，其特征在于，由pks1和/或pks2转录的mRNA量少于在野生型芦荟中pks1和/或pks2转录的mRNA量的10％。
15.如权利要求12所述的突变芦荟，其特征在于，所述突变芦荟包括突变芦荟细胞或细胞培养物。
16.如权利要求12所述的突变芦荟，其特征在于，所述突变芦荟包括突变真芦荟(Aloevera)。
17.如权利要求12所述的突变芦荟，其特征在于，所述突变芦荟包括突变芦荟生物产物，所述突变芦荟生物产物包括或包含芦荟凝胶、乳霜、乳液、肥皂、防晒霜、喷雾、护发产品、胶冻、保湿霜、洁面乳、爽肤水、皮肤护理组合物、化妆品、漱口水、牙膏、食用食品或液体的一种或多种。
18.如权利要求12所述的突变芦荟，其特征在于，所述突变芦荟表现出不存在由野生型芦荟产生的一种或多种毒素。
19.如权利要求18所述的突变芦荟，其特征在于，所述一种或多种毒素包括芦荟素。
20.如权利要求19所述的突变芦荟，其特征在于，所述突变芦荟产生芦荟素的量低于野生型芦荟产生芦荟素的量的10％。
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