JP2606856B2 - 生細胞中に遺伝物質担持担体粒子を注入するための装置 - Google Patents
生細胞中に遺伝物質担持担体粒子を注入するための装置Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般的に植物の遺伝子工学の分野に関し、特
に遺伝物質を植物の花粉中に物理的に注入することによ
る、外因性遺伝物質の該植物系の生殖系内での形質転換
に関するものである。
に遺伝物質を植物の花粉中に物理的に注入することによ
る、外因性遺伝物質の該植物系の生殖系内での形質転換
に関するものである。
本発明はさらに生細胞中に遺伝物質担持担体粒子を注
入するための装置を提供するものである。
入するための装置を提供するものである。
（従来の技術） 多くの努力並びに研究が植物種の遺伝的形質転換に向
けられている。外来遺伝子により植物生殖系を形質転換
するのに有効な手段を開発することによって、工業的に
重要な作物種の遺伝的系統の多様性が拡大され、しかも
特別に興味のある機能をもつ遺伝子を選択的に作物種内
に導入し得るものと考えられている。植物種の形質転
換、即ち遺伝子光学に関する今日までの努力および研究
は、植物の種に大きく依存して変化する結果をもたらし
た。
けられている。外来遺伝子により植物生殖系を形質転換
するのに有効な手段を開発することによって、工業的に
重要な作物種の遺伝的系統の多様性が拡大され、しかも
特別に興味のある機能をもつ遺伝子を選択的に作物種内
に導入し得るものと考えられている。植物種の形質転
換、即ち遺伝子光学に関する今日までの努力および研究
は、植物の種に大きく依存して変化する結果をもたらし
た。
外因性遺伝子を植物中に導入するのに従来利用されて
いた主な機構は、原形質体としての、あるいはカルスと
して知られている未分化組織塊中での単一の植物細胞の
形質転換から出発していた。植物細胞中でのキメラ遺伝
子の機能は、エレクトロポーレーションおよびマイクロ
インジェクションにより、単一の植物細胞原形質体中に
導入されている。しかしながら、これまでに利用されて
いる最も汎用性の形質転換技術は、植物病原体アグロバ
クテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumef
aciens）の天然の特性を利用することである。該病原体
はその中に含まれているTi（腫瘍誘起：Tumor-inducin
g）プラスミドからのDNAの一部を感染植物細胞中に移す
という固有の能力を有している。Tiプラスミドからのあ
る配列を担持するアグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）中のプラスミドに外来遺伝子を挿入することによ
り、感染植物細胞のゲノム内に該外来遺伝子を移すの
に、この細菌性の形質転換特性を利用できる。アグロバ
クテリウム（Agrobacterium）−媒介植物細胞形質転換
は、タバコ、ペチュニア、人参などの多くのモデル作物
種において極めて妥当に作用することがわかっている
が、２つの重大な制限をこうむる。第１の制限は、この
媒介は単に個々の細胞レベル、典型的には体組織に対し
てなし得るのみであり、従って全植物において人為的に
再生される必要があることである。このことは、アグロ
バクテリウム（Agrobacterium）感染に敏感な型の組織
から容易に再生できる作物種に対する、該アグロバクテ
リウム（Agrobacterium）−媒介遺伝的形質転換の応用
性を制限する。第２の制限は、アグロバクテリウム（Ag
robacterium）の天然宿主範囲が双子葉植物および限ら
れた数のユリ科の単子葉植物種のみを含むにすぎないこ
とである。従って、このアグロバクテリウム（Agrobact
erium）−媒介形質転換技術は、穀類作物種などの商業
的に興味ある端子葉植物種に対する有効な手段ではない
ことが立証された。アグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）−媒介形質転換技術に係るもう一つの難点はソモク
ローナル（somoclonal）変種の発生であり、これは組織
培養中の植物組織内で自然に起こり、形質転換体の識別
を複雑化する恐れがある。
いた主な機構は、原形質体としての、あるいはカルスと
して知られている未分化組織塊中での単一の植物細胞の
形質転換から出発していた。植物細胞中でのキメラ遺伝
子の機能は、エレクトロポーレーションおよびマイクロ
インジェクションにより、単一の植物細胞原形質体中に
導入されている。しかしながら、これまでに利用されて
いる最も汎用性の形質転換技術は、植物病原体アグロバ
クテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumef
aciens）の天然の特性を利用することである。該病原体
はその中に含まれているTi（腫瘍誘起：Tumor-inducin
g）プラスミドからのDNAの一部を感染植物細胞中に移す
という固有の能力を有している。Tiプラスミドからのあ
る配列を担持するアグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）中のプラスミドに外来遺伝子を挿入することによ
り、感染植物細胞のゲノム内に該外来遺伝子を移すの
に、この細菌性の形質転換特性を利用できる。アグロバ
クテリウム（Agrobacterium）−媒介植物細胞形質転換
は、タバコ、ペチュニア、人参などの多くのモデル作物
種において極めて妥当に作用することがわかっている
が、２つの重大な制限をこうむる。第１の制限は、この
媒介は単に個々の細胞レベル、典型的には体組織に対し
てなし得るのみであり、従って全植物において人為的に
再生される必要があることである。このことは、アグロ
バクテリウム（Agrobacterium）感染に敏感な型の組織
から容易に再生できる作物種に対する、該アグロバクテ
リウム（Agrobacterium）−媒介遺伝的形質転換の応用
性を制限する。第２の制限は、アグロバクテリウム（Ag
robacterium）の天然宿主範囲が双子葉植物および限ら
れた数のユリ科の単子葉植物種のみを含むにすぎないこ
とである。従って、このアグロバクテリウム（Agrobact
erium）−媒介形質転換技術は、穀類作物種などの商業
的に興味ある端子葉植物種に対する有効な手段ではない
ことが立証された。アグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）−媒介形質転換技術に係るもう一つの難点はソモク
ローナル（somoclonal）変種の発生であり、これは組織
培養中の植物組織内で自然に起こり、形質転換体の識別
を複雑化する恐れがある。
少なくともいくつかのキメラ遺伝子構造が、多くの植
物細胞中での外来遺伝子の表現に有効であることが立証
されている。単子葉類および双子葉類におけるこれらキ
メラ構造の機能は、エレクトロポレーションなどの技術
により、培養液中のトウモロコシ原形質体の形質転換に
より証明されている。しかしながら、従来知られている
方法の中には、このような原形質体から、全トウモロコ
シあるいは他のすべての重要な作物種の植物を再生でき
るものはない。例えば、再生された完全な形質転換トウ
モロコシは知られていない。それにも拘らず、一般の植
物作物の大きな農業的価値並びにこれらの価値および生
産性を改善する可能性の故に、トウモロコシおよび他の
作物種の系の遺伝的形質転換が望ましい対象となってい
る。
物細胞中での外来遺伝子の表現に有効であることが立証
されている。単子葉類および双子葉類におけるこれらキ
メラ構造の機能は、エレクトロポレーションなどの技術
により、培養液中のトウモロコシ原形質体の形質転換に
より証明されている。しかしながら、従来知られている
方法の中には、このような原形質体から、全トウモロコ
シあるいは他のすべての重要な作物種の植物を再生でき
るものはない。例えば、再生された完全な形質転換トウ
モロコシは知られていない。それにも拘らず、一般の植
物作物の大きな農業的価値並びにこれらの価値および生
産性を改善する可能性の故に、トウモロコシおよび他の
作物種の系の遺伝的形質転換が望ましい対象となってい
る。
以前に、トウモロコシは一般にその花粉の遺伝的形質
転換により形質転換し得るという、少なくとも一つの示
唆があった。公開PCT特許出願WO85/01856号は、顕花植
物の花粉を形質転換することで、外因性遺伝子を該顕花
植物に移す方法を開示している。この技術を立証するた
めになされた他の研究者の試み並びに該実験の再現は失
敗に帰している〔サンフォード（Sanford）等、セオリ
ー オブ アプライド ジェネティックス（Theor.App
l.Genet.）、1985、69（５−６）、571-74参照〕。同様
な結果の報告が、オータ（Ohta）、プロシーディングス
オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、1986、83、715-719にな
されている。
転換により形質転換し得るという、少なくとも一つの示
唆があった。公開PCT特許出願WO85/01856号は、顕花植
物の花粉を形質転換することで、外因性遺伝子を該顕花
植物に移す方法を開示している。この技術を立証するた
めになされた他の研究者の試み並びに該実験の再現は失
敗に帰している〔サンフォード（Sanford）等、セオリ
ー オブ アプライド ジェネティックス（Theor.App
l.Genet.）、1985、69（５−６）、571-74参照〕。同様
な結果の報告が、オータ（Ohta）、プロシーディングス
オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、1986、83、715-719にな
されている。
（発明が解決しようとする問題点および問題点解決のた
めの手段） 一般的に、本発明は植物系を遺伝的に形質転換する方
法に関し、該方法は以下の工程を含む。即ち、外来遺伝
子および調節配列を含むDNA配列を調製する工程；該DNA
配列を生物的に不活性な粒子上に塗布する工程；該植物
の花粉に対して該DNA担持粒子を物理的に加速して、該
粒子を該花粉内に打ち込む工程；該花粉で雌性親植物を
授粉する工程および該授粉した子孫から形質転換された
植物を選択する工程を含む。
めの手段） 一般的に、本発明は植物系を遺伝的に形質転換する方
法に関し、該方法は以下の工程を含む。即ち、外来遺伝
子および調節配列を含むDNA配列を調製する工程；該DNA
配列を生物的に不活性な粒子上に塗布する工程；該植物
の花粉に対して該DNA担持粒子を物理的に加速して、該
粒子を該花粉内に打ち込む工程；該花粉で雌性親植物を
授粉する工程および該授粉した子孫から形質転換された
植物を選択する工程を含む。
本発明は、また挿入された外来遺伝子の表現機能をも
つトウモロコシ系をも目的とするものである。
つトウモロコシ系をも目的とするものである。
本発明に更に、植物を組織培養または再生する必要な
しに、花粉の形質転換を通して、トウモロコシのみでな
く他の重要な植物作物を遺伝的に形質転換することをも
目的とする。
しに、花粉の形質転換を通して、トウモロコシのみでな
く他の重要な植物作物を遺伝的に形質転換することをも
目的とする。
本発明の利点の一つは、上記方法が比較的迅速かつ高
効率で容易に実証でき、しかも再現可能である点にあ
る。
効率で容易に実証でき、しかも再現可能である点にあ
る。
本発明の方法並びに該方法により作られる物質の利点
の一つは、特徴付けされたまたはされていない外来遺伝
子物質が、作物の品種改良、分子生物学的、または他の
同様な耕種学的または科学的目的で、トウモロコシの任
意の所定の遺伝子バックグラウンドに容易にかつ迅速に
導入できることである。
の一つは、特徴付けされたまたはされていない外来遺伝
子物質が、作物の品種改良、分子生物学的、または他の
同様な耕種学的または科学的目的で、トウモロコシの任
意の所定の遺伝子バックグラウンドに容易にかつ迅速に
導入できることである。
本発明の方法の付随的な利点は、従来の体細胞形質転
換技術またはマイクロインジェクション法と比較して、
該方法の実施が容易であることから、多数の、即ち数千
にも及ぶ形質転換が実施可能である点にある。上記従来
法は実施が困難である。即ち、細胞毎の処理が必要とさ
れる。
換技術またはマイクロインジェクション法と比較して、
該方法の実施が容易であることから、多数の、即ち数千
にも及ぶ形質転換が実施可能である点にある。上記従来
法は実施が困難である。即ち、細胞毎の処理が必要とさ
れる。
本発明は、生細胞中に遺伝物質担持担体粒子を流入す
るための装置を提供するものである。この装置は、 薄い平坦な担体シート； 該担体シートの表面に付着した、遺伝物質を塗布した
小さな生物学的に不活性な、複数の担体粒子； 生細胞を有するターゲット表面； 開口を有する放電室を形成するボデー、前記担体シー
トは該開口上に配置され、該開口を封鎖している； 前記担体粒子を有する担体シートを加速してターゲッ
ト表面に向けて走行させるのに充分な衝撃波を該放電室
中で発生させる手段；及び、 放電室とターゲット表面の間にある担体シートの走行
路に配置された支持スクリーンを有し、そこで担体粒子
は担体シートから離れてターゲット表面に向かって走行
するようになっていることを特徴とする。
るための装置を提供するものである。この装置は、 薄い平坦な担体シート； 該担体シートの表面に付着した、遺伝物質を塗布した
小さな生物学的に不活性な、複数の担体粒子； 生細胞を有するターゲット表面； 開口を有する放電室を形成するボデー、前記担体シー
トは該開口上に配置され、該開口を封鎖している； 前記担体粒子を有する担体シートを加速してターゲッ
ト表面に向けて走行させるのに充分な衝撃波を該放電室
中で発生させる手段；及び、 放電室とターゲット表面の間にある担体シートの走行
路に配置された支持スクリーンを有し、そこで担体粒子
は担体シートから離れてターゲット表面に向かって走行
するようになっていることを特徴とする。
本発明はまた、生細胞を含むターゲット中に遺伝物質
担持担体粒子を注入するための装置を提供するものであ
る。この装置は、 薄い平坦な担体シート； 該担体シートの表面に付着した、遺伝物質を塗布した
小さな生物学的に不活性な、複数の担体粒子； 開口を有する放電室を形成するボデー、前記担体シー
トは該開口上に配置され、該開口を封鎖している； 前記担体粒子を有する担体シートを加速してターゲッ
トに向けて走行させるのに充分な衝撃波を該放電室中で
発生させる手段；及び、 放電室とターゲットの間にある担体シートの走行路に
配置された支持スクリーンであって、担体シートが加速
された際に担体シートをターゲットで拘束するように配
置されかつ構成されている支持スクリーンを有し、そこ
で担体粒子は担体シートから離れてターゲットに向かっ
て走行するようになっていることを特徴とする。
担持担体粒子を注入するための装置を提供するものであ
る。この装置は、 薄い平坦な担体シート； 該担体シートの表面に付着した、遺伝物質を塗布した
小さな生物学的に不活性な、複数の担体粒子； 開口を有する放電室を形成するボデー、前記担体シー
トは該開口上に配置され、該開口を封鎖している； 前記担体粒子を有する担体シートを加速してターゲッ
トに向けて走行させるのに充分な衝撃波を該放電室中で
発生させる手段；及び、 放電室とターゲットの間にある担体シートの走行路に
配置された支持スクリーンであって、担体シートが加速
された際に担体シートをターゲットで拘束するように配
置されかつ構成されている支持スクリーンを有し、そこ
で担体粒子は担体シートから離れてターゲットに向かっ
て走行するようになっていることを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様では、上記装置は生細胞中
にDNA担持担体粒子を注入するための装置であり、 スパーク放電室； 該スパーク放電室内に伸び、かつスパークギャップに
より分離されている２つの電極、ここでこれら電極は外
部の高電圧放電源に接続されるようになっている； 上記スパーク放電室上方において垂直方向に移動し得
るように間隔をおいて支持された担体シート、このシー
トはその上に担体粒子を受け取る； 上記担体シート上方の所定位置に固定された支持スク
リーン；及び、 該支持スクリーン上方に間隔をおいて支持され、上記
生細胞を担持しているターゲット表面；ここで該ターゲ
ット表面は上記放電室で衝撃波を発生するスパーク放電
が上記担体シートを上記支持スクリーンに加速して、上
記担体粒子を上記ターゲット表面上の細胞内に加速注入
するように細胞を支持していることを特徴とする。
にDNA担持担体粒子を注入するための装置であり、 スパーク放電室； 該スパーク放電室内に伸び、かつスパークギャップに
より分離されている２つの電極、ここでこれら電極は外
部の高電圧放電源に接続されるようになっている； 上記スパーク放電室上方において垂直方向に移動し得
るように間隔をおいて支持された担体シート、このシー
トはその上に担体粒子を受け取る； 上記担体シート上方の所定位置に固定された支持スク
リーン；及び、 該支持スクリーン上方に間隔をおいて支持され、上記
生細胞を担持しているターゲット表面；ここで該ターゲ
ット表面は上記放電室で衝撃波を発生するスパーク放電
が上記担体シートを上記支持スクリーンに加速して、上
記担体粒子を上記ターゲット表面上の細胞内に加速注入
するように細胞を支持していることを特徴とする。
本発明の他の目的、利点並びに特徴は以下の添付図面
を参照しつつ記載される明細書の記述から明らかとなろ
う。
を参照しつつ記載される明細書の記述から明らかとなろ
う。
（発明の好ましい態様） 本発明に従って実施する花粉−媒介植物遺伝的形質転
換においては、DNAが植物花粉の細胞質ゾル中に物理的
に注入され、該DNAは生物的に不活性は物質の個々の小
さな粒子上に担持されており、該粒子は花粉に加速され
て、花粉細胞を破壊かつその能力を損うことなしに個々
の花粉細胞中に侵入する。このようにして注入されるDN
Aはこの花粉の子孫の遺伝物質内に組込まれることにな
る。かくして、このように花粉を形質転換することによ
り、植物並びに植物系の遺伝子工学が可能となる。
換においては、DNAが植物花粉の細胞質ゾル中に物理的
に注入され、該DNAは生物的に不活性は物質の個々の小
さな粒子上に担持されており、該粒子は花粉に加速され
て、花粉細胞を破壊かつその能力を損うことなしに個々
の花粉細胞中に侵入する。このようにして注入されるDN
Aはこの花粉の子孫の遺伝物質内に組込まれることにな
る。かくして、このように花粉を形質転換することによ
り、植物並びに植物系の遺伝子工学が可能となる。
花粉−媒介形質転換の首尾に影響を及ぼす因子がいく
つかある。上記粒子を加速する方法は、該花粉と接触さ
せて、花粉細胞を生物学的に無能とすることなしに実質
的な数の花粉細胞中に該粒子を侵入させる際、個々のDN
A−担持粒子が適度な運動量並びに速度を有し、しかも
該粒子自体が比較的均一なパターンとなるように注意し
て計画することが好ましい。更に、該粒子上のDNAは安
定でかつ植物細胞を形質転換し得るものであり、しかも
該植物細胞中の望ましい特性を表現し得るものでなけれ
ばならない。その上、このDNA自体は、形質転換された
と思われる植物種子または苗を検出し得る選択可能なマ
ーカーを含んでいて、遺伝的形質転換が起こっている特
定の植物を識別できるものである必要がある。形質転換
頻度が十分に高い場合には、かかる選択可能なマーカー
は不要となるかも知れない。
つかある。上記粒子を加速する方法は、該花粉と接触さ
せて、花粉細胞を生物学的に無能とすることなしに実質
的な数の花粉細胞中に該粒子を侵入させる際、個々のDN
A−担持粒子が適度な運動量並びに速度を有し、しかも
該粒子自体が比較的均一なパターンとなるように注意し
て計画することが好ましい。更に、該粒子上のDNAは安
定でかつ植物細胞を形質転換し得るものであり、しかも
該植物細胞中の望ましい特性を表現し得るものでなけれ
ばならない。その上、このDNA自体は、形質転換された
と思われる植物種子または苗を検出し得る選択可能なマ
ーカーを含んでいて、遺伝的形質転換が起こっている特
定の植物を識別できるものである必要がある。形質転換
頻度が十分に高い場合には、かかる選択可能なマーカー
は不要となるかも知れない。
生物的に不活性な小さい担体粒子を加速することを可
能とする多くの型の装置がある。可能な機構は粒子の弾
動爆発加速（ballistic explosive acceleration）、粒
子の遠心加速、粒子の静電加速または小さな不活性粒子
に運動量および速度を付与し得る任意の他の類似のシス
テムを含む。本出願人による一つの好ましい新規な方法
は添付第１図に模式的に示されている。ここで図示した
方法は高電圧放電により発生させた衝撃波を利用する。
この方法を用いる不活性粒子を加速するための加速器は
第１図において一般に参照番号10で示されている。第１
図においてターゲット表面は一般に参照番号22で示さ
れ、これはその上に花粉ターゲットを担持している。
能とする多くの型の装置がある。可能な機構は粒子の弾
動爆発加速（ballistic explosive acceleration）、粒
子の遠心加速、粒子の静電加速または小さな不活性粒子
に運動量および速度を付与し得る任意の他の類似のシス
テムを含む。本出願人による一つの好ましい新規な方法
は添付第１図に模式的に示されている。ここで図示した
方法は高電圧放電により発生させた衝撃波を利用する。
この方法を用いる不活性粒子を加速するための加速器は
第１図において一般に参照番号10で示されている。第１
図においてターゲット表面は一般に参照番号22で示さ
れ、これはその上に花粉ターゲットを担持している。
この加速器10は数個の部品からなっている。スパーク
放電室12が設けられ、その内部には一対の電極14が伸び
ている。このスパーク放電室12の幾何形状は本発明にお
いて特に制限はないが、この室が、上記担体粒子を推進
するのに利用できる適当な特性および方向をもつ衝撃波
を発生かつ存在せしめように設計されていることを条件
とする。本出願人は、内径13mmのポリ塩化ビニル樹脂パ
イプの一部がスパーク放電部12として使用するのに満足
なものであることを見出した。電極14は該室内で反対方
向に伸び、スパーク放電室12の上部から約5mm下方に取
付けられている。電極14自体はスパーク放電室12の壁の
内側面に形成された適当なねじ穴内に伸びたねじ山のあ
るボルトで形成されている。電極14をなすねじ山をもつ
ボルトの端部は、電弧耐性合金で保護され、該合金は寸
法約2mm×2mm×3mmに切断された高電圧リレー設定から
得られ、かつ該ねじ山のあるボルトの端部に溶接されて
いる。電極14間のギャップは、適宜該ボルトをスパーク
放電室12内にねじ込むか、あるいはそこからねじ出すこ
とにより調節できる。電極末端間に約15KVの放電々圧を
設定するのに好ましいギャップは１〜1.5mmである。電
極を作製し、取付ける方法には明らかに広範囲の変更が
可能である。しかし、電極は高い耐久性をもち、しかも
電極間のスパークギャップの距離は容易に調節できるも
のであることが好ましい。
放電室12が設けられ、その内部には一対の電極14が伸び
ている。このスパーク放電室12の幾何形状は本発明にお
いて特に制限はないが、この室が、上記担体粒子を推進
するのに利用できる適当な特性および方向をもつ衝撃波
を発生かつ存在せしめように設計されていることを条件
とする。本出願人は、内径13mmのポリ塩化ビニル樹脂パ
イプの一部がスパーク放電部12として使用するのに満足
なものであることを見出した。電極14は該室内で反対方
向に伸び、スパーク放電室12の上部から約5mm下方に取
付けられている。電極14自体はスパーク放電室12の壁の
内側面に形成された適当なねじ穴内に伸びたねじ山のあ
るボルトで形成されている。電極14をなすねじ山をもつ
ボルトの端部は、電弧耐性合金で保護され、該合金は寸
法約2mm×2mm×3mmに切断された高電圧リレー設定から
得られ、かつ該ねじ山のあるボルトの端部に溶接されて
いる。電極14間のギャップは、適宜該ボルトをスパーク
放電室12内にねじ込むか、あるいはそこからねじ出すこ
とにより調節できる。電極末端間に約15KVの放電々圧を
設定するのに好ましいギャップは１〜1.5mmである。電
極を作製し、取付ける方法には明らかに広範囲の変更が
可能である。しかし、電極は高い耐久性をもち、しかも
電極間のスパークギャップの距離は容易に調節できるも
のであることが好ましい。
スペーサリング16がスパーク放電室12の上方に設置さ
れている。このスペーサリング16はスパーク放電室12と
同じPVCパイプで形成でき、垂直方向の長さ6mmに切断さ
れていることが好ましい。単一の作物種の形質転換用に
設定された装置においては、スペーサリング16はスパー
ク放電室12を単に垂直方向に延長するだけで構成でき
る。但し、取りはずし可能かつ交換可能なスペーサリン
グ16の使用により、変更されるスパーク放電から担体シ
ートまでの距離を調節でき、その結果粒子を加速する力
を条件毎にあるいは植物種毎に変えることができる。大
きな担体シートを用いる場合には、スペーサリング16は
その上部を開放したままとすることができ、また適当な
クロージャーにより部分的にその上部開口部を制限し
て、約９×13mmの寸法の矩形開口を形成することも有利
である。スペーサ16の頂部には担体シート18が配置され
ている。この担体シート18はスペーサリング16の頂部に
配置されるように適当なサイズに形成された平坦で軽量
のシートである。担体シート18は、その上に生物的に不
活性な小粒子を担持し得る、可撓性の生物的に不活性の
シート材料から形成されている。この担体シート18は、
スパーク放電により発生する衝撃波の力を該担体粒子の
加速度に変える機能をもつ。担体シート18は有利には１
ミルまたは0.5ミルのプラスチック被覆アルミニウムメ
ッキマイラーから形成され、好ましくは0.5ミルのシー
トである。というのは、これらが実際に良好な花粉中へ
の侵入をもたらすからである。一般的な実施に際して
は、担体シート18の実際の表面積が小さい程、該担体粒
子の花粉中への良好な侵入が達成される。この侵入に関
する考察は担体シートがある寸法をもたねばならないと
いう要件により調和される。該寸法とは取扱いが容易で
あり、かつ各注入において多数の花粉細胞を衝撃するの
に十分に大きな領域に亘る衝撃パターンを与えるような
ものである。９×11mmという寸法の担体シートが、花粉
ターゲットに所定の粒子衝撃パターンで粒子の良好な侵
入を与える、良好な寸法をもたらすことがわかった。
れている。このスペーサリング16はスパーク放電室12と
同じPVCパイプで形成でき、垂直方向の長さ6mmに切断さ
れていることが好ましい。単一の作物種の形質転換用に
設定された装置においては、スペーサリング16はスパー
ク放電室12を単に垂直方向に延長するだけで構成でき
る。但し、取りはずし可能かつ交換可能なスペーサリン
グ16の使用により、変更されるスパーク放電から担体シ
ートまでの距離を調節でき、その結果粒子を加速する力
を条件毎にあるいは植物種毎に変えることができる。大
きな担体シートを用いる場合には、スペーサリング16は
その上部を開放したままとすることができ、また適当な
クロージャーにより部分的にその上部開口部を制限し
て、約９×13mmの寸法の矩形開口を形成することも有利
である。スペーサ16の頂部には担体シート18が配置され
ている。この担体シート18はスペーサリング16の頂部に
配置されるように適当なサイズに形成された平坦で軽量
のシートである。担体シート18は、その上に生物的に不
活性な小粒子を担持し得る、可撓性の生物的に不活性の
シート材料から形成されている。この担体シート18は、
スパーク放電により発生する衝撃波の力を該担体粒子の
加速度に変える機能をもつ。担体シート18は有利には１
ミルまたは0.5ミルのプラスチック被覆アルミニウムメ
ッキマイラーから形成され、好ましくは0.5ミルのシー
トである。というのは、これらが実際に良好な花粉中へ
の侵入をもたらすからである。一般的な実施に際して
は、担体シート18の実際の表面積が小さい程、該担体粒
子の花粉中への良好な侵入が達成される。この侵入に関
する考察は担体シートがある寸法をもたねばならないと
いう要件により調和される。該寸法とは取扱いが容易で
あり、かつ各注入において多数の花粉細胞を衝撃するの
に十分に大きな領域に亘る衝撃パターンを与えるような
ものである。９×11mmという寸法の担体シートが、花粉
ターゲットに所定の粒子衝撃パターンで粒子の良好な侵
入を与える、良好な寸法をもたらすことがわかった。
また、該担体シートは、粒子がターゲット表面と接触
した際に、該粒子のパターンを配列する機能をもつ。粒
子の均一なパターンが極めて望ましく、これによって出
きる限り多数のターゲット上の細胞が衝撃を受けて形質
転換体の収率を最大にすることが保証される。形質転換
されなかった細胞、花粉またはその他のものは形質転換
体と競合的優勢（competitive advantage）状態にある
か、あるいは担体粒子によって部分的に弱化されている
かも知れない。従って、できるだけターゲット細胞中に
100％注入することが望ましく、かつ担体シート18上の
粒子の均一層およびパターンはこの目的を援助する。
した際に、該粒子のパターンを配列する機能をもつ。粒
子の均一なパターンが極めて望ましく、これによって出
きる限り多数のターゲット上の細胞が衝撃を受けて形質
転換体の収率を最大にすることが保証される。形質転換
されなかった細胞、花粉またはその他のものは形質転換
体と競合的優勢（competitive advantage）状態にある
か、あるいは担体粒子によって部分的に弱化されている
かも知れない。従って、できるだけターゲット細胞中に
100％注入することが望ましく、かつ担体シート18上の
粒子の均一層およびパターンはこの目的を援助する。
担体粒子自体について、生物的に不活性な任意の高密
度材料が、本発明の範囲内のDNA担体粒子として使用す
るのに有利である。金属材料が好ましい。例えば、密度
19を有するタングステンおよび金などの金属材料が好ま
しい。密度22のイリジウムも好ましいが、本出願人はこ
れを使用しない。というのは、比較的粗い粉末としての
み入手が容易であるにすぎないからである。本発明では
球形粒子が好ましい。金と比較するとタングステンは余
り好ましいとはいえない。というのは、わずかに痕跡の
水分の存在下でさえ空気中で酸化され易いからである。
担体粒子上にこのような酸化層があると、粒子同志が互
に結合して凝集するのに伴って平均粒径が著しく大きく
なる傾向を示す。不規則な凝集により団塊化した粒子は
本発明の実施にとって望ましくない。なんとなれば、こ
のような凝集は該粒子の質量および寸法を大巾に変化さ
せ、その結果規則的かつ反復性のある結果を得ることを
困難にするからである。金が本発明の範囲内の粒子用の
最適の材料であることがわかった。というのは、金は高
密度で、比較的生物的物質に対して不活性でありかつ酸
化に対し安定であり、しかも１〜３μｍの径の球状のも
のが市販品として容易に入手できるからである。適当な
DNA配列を金粒子に適用でき、かつ金粒子は以下に詳細
に議論するような方法で担体粒子に適用できる。
度材料が、本発明の範囲内のDNA担体粒子として使用す
るのに有利である。金属材料が好ましい。例えば、密度
19を有するタングステンおよび金などの金属材料が好ま
しい。密度22のイリジウムも好ましいが、本出願人はこ
れを使用しない。というのは、比較的粗い粉末としての
み入手が容易であるにすぎないからである。本発明では
球形粒子が好ましい。金と比較するとタングステンは余
り好ましいとはいえない。というのは、わずかに痕跡の
水分の存在下でさえ空気中で酸化され易いからである。
担体粒子上にこのような酸化層があると、粒子同志が互
に結合して凝集するのに伴って平均粒径が著しく大きく
なる傾向を示す。不規則な凝集により団塊化した粒子は
本発明の実施にとって望ましくない。なんとなれば、こ
のような凝集は該粒子の質量および寸法を大巾に変化さ
せ、その結果規則的かつ反復性のある結果を得ることを
困難にするからである。金が本発明の範囲内の粒子用の
最適の材料であることがわかった。というのは、金は高
密度で、比較的生物的物質に対して不活性でありかつ酸
化に対し安定であり、しかも１〜３μｍの径の球状のも
のが市販品として容易に入手できるからである。適当な
DNA配列を金粒子に適用でき、かつ金粒子は以下に詳細
に議論するような方法で担体粒子に適用できる。
担体粒子18の上方には支持スクリーン20がある。この
支持スクリーン20は、スペーサリング16の頂部上方約5m
mの位置のプラスチックホルダ内に物理的に取付けられ
た100メッシュのステンレススチールスクリーンであ
る。この支持スクリーン20は、担体シート18がターゲッ
トの方向に進まないように該シート18を維持する機能を
もつ。
支持スクリーン20は、スペーサリング16の頂部上方約5m
mの位置のプラスチックホルダ内に物理的に取付けられ
た100メッシュのステンレススチールスクリーンであ
る。この支持スクリーン20は、担体シート18がターゲッ
トの方向に進まないように該シート18を維持する機能を
もつ。
ターゲット表面22は、その上にターゲット細胞、即ち
花粉または他の植物細胞を懸垂できる材料の平坦なシー
トである。実際に、容易に使用し得るターゲットは、支
持スクリーンを支持しているアセンブリの頂部上で逆向
きにされた60mm×15mmのペトリ皿であることがわかっ
た。従って、この支持スクリーン20からターゲット表面
22上のターゲット細胞までの距離は約15mmであることが
好ましい。以下に述べる電圧および大気圧条件下で、15
mmを越える距離は花粉中への担体粒子の低い侵入率を与
え、一方10mmに満たない距離は細胞の破壊を生じ、爆風
の作用の下で支持スクリーン20の変形をも生ずる。
花粉または他の植物細胞を懸垂できる材料の平坦なシー
トである。実際に、容易に使用し得るターゲットは、支
持スクリーンを支持しているアセンブリの頂部上で逆向
きにされた60mm×15mmのペトリ皿であることがわかっ
た。従って、この支持スクリーン20からターゲット表面
22上のターゲット細胞までの距離は約15mmであることが
好ましい。以下に述べる電圧および大気圧条件下で、15
mmを越える距離は花粉中への担体粒子の低い侵入率を与
え、一方10mmに満たない距離は細胞の破壊を生じ、爆風
の作用の下で支持スクリーン20の変形をも生ずる。
花粉をターゲット細胞として用いる場合、この花粉は
ターゲットが生きている花粉と逆転されるように該ター
ゲットに適用しなければならない。一般に、花粉は湿度
に敏感であるので、ターゲットに花粉を付着する方法は
できる限り湿度を含まないものでなければならない。こ
の接着には鉱油が有用であることがわかった。ターゲッ
ト表面22として使用されるペトリ皿の低部に鉱油の薄層
を適用した場合、花粉はこの皿内に振りまかれ、次いで
皿を反転させて過剰の花粉を除く。これにより、比較的
均一な花粉粒の単層がターゲット上に残され、該花粉粒
は粒子注入中しかるべき位置に保たれ、かつ生存してい
る。花粉以外の細胞をこの装置で用いる場合には、例え
ば寒天などの他の支持媒体がより好ましい。
ターゲットが生きている花粉と逆転されるように該ター
ゲットに適用しなければならない。一般に、花粉は湿度
に敏感であるので、ターゲットに花粉を付着する方法は
できる限り湿度を含まないものでなければならない。こ
の接着には鉱油が有用であることがわかった。ターゲッ
ト表面22として使用されるペトリ皿の低部に鉱油の薄層
を適用した場合、花粉はこの皿内に振りまかれ、次いで
皿を反転させて過剰の花粉を除く。これにより、比較的
均一な花粉粒の単層がターゲット上に残され、該花粉粒
は粒子注入中しかるべき位置に保たれ、かつ生存してい
る。花粉以外の細胞をこの装置で用いる場合には、例え
ば寒天などの他の支持媒体がより好ましい。
粒子加速器10およびターゲット表面22の完全なアセン
ブリは部分的に排気して、大気の抗力のために粒子およ
び／または担体シート18が減速されるのを防止する必要
がある。この真空はわずかな部分的真空であるべきであ
る。というのは高真空度はターゲット花粉細胞を乾燥し
てしまい、これらを死滅させるからである。460〜480mm
Hgの真空で十分かつ有利であることがわかった。
ブリは部分的に排気して、大気の抗力のために粒子およ
び／または担体シート18が減速されるのを防止する必要
がある。この真空はわずかな部分的真空であるべきであ
る。というのは高真空度はターゲット花粉細胞を乾燥し
てしまい、これらを死滅させるからである。460〜480mm
Hgの真空で十分かつ有利であることがわかった。
第１図の装置の動作の最も簡単な説明において加速器
10を始動する工程は、電極14間に蒸留水または脱イオン
水の液滴24を配置することで開始する。水の量は、電極
間に生ずる電弧を減衰せず、しかも放電が起こった際に
スパーク放電室12の内部に衝撃波を生ずるのに十分な体
積となるように選ばれなければならない。好ましい水の
体積は、約２〜４μｌであることがわかっている。この
量の水は電極14の端部間に懸垂されたピペットで適用す
ることができる。この水滴24は電極間のギャップを橋絡
し、かつ所定の位置に保つ。
10を始動する工程は、電極14間に蒸留水または脱イオン
水の液滴24を配置することで開始する。水の量は、電極
間に生ずる電弧を減衰せず、しかも放電が起こった際に
スパーク放電室12の内部に衝撃波を生ずるのに十分な体
積となるように選ばれなければならない。好ましい水の
体積は、約２〜４μｌであることがわかっている。この
量の水は電極14の端部間に懸垂されたピペットで適用す
ることができる。この水滴24は電極間のギャップを橋絡
し、かつ所定の位置に保つ。
次いで、スペーサリング16をスパーク放電室12の頂部
に配置し、担体シート18をスペーサリング16の頂部に設
置する。支持スクリーン20を担体シート18の上方5mmの
位置に取付け、逆さのペトリ皿からなるターゲット表面
22を支持スクリーン20の取付け位置上方に配置する。次
いで、このアセンブリを480mmHgに排気する。
に配置し、担体シート18をスペーサリング16の頂部に設
置する。支持スクリーン20を担体シート18の上方5mmの
位置に取付け、逆さのペトリ皿からなるターゲット表面
22を支持スクリーン20の取付け位置上方に配置する。次
いで、このアセンブリを480mmHgに排気する。
第１図に示した装置の外部には電圧源が接続されてい
て、これは15,000Vの直流電圧を発生する。この15,000V
の直流電圧は１μＦのキャパシタに印加され、該キャパ
シタは次いで電圧源から遮断される。適当なスイッチを
連絡させることにより、キャパシタに充電された15,000
Vの電圧は次いで電極14間に印加される。
て、これは15,000Vの直流電圧を発生する。この15,000V
の直流電圧は１μＦのキャパシタに印加され、該キャパ
シタは次いで電圧源から遮断される。適当なスイッチを
連絡させることにより、キャパシタに充電された15,000
Vの電圧は次いで電極14間に印加される。
この電圧が印加された場合、放電々弧が２つの電極14
間に生ずる。この電弧は電極間に広がっている小さな水
滴を瞬間的に蒸発させる。水滴の爆発的な蒸発に基き生
ずる衝撃波がスパーク放電室12の内部全体に伝播する。
この衝撃波が担体シート18に達すると、この担体シート
18はスペーサリング16により垂直方向に持ち上げられ、
支持スクリーン20に向けて加速され。担体シート18が支
持スクリーン20に衝突すると、担体シート18はその位置
で止められ、かつ担体シート18上にある粒子はこれを離
れて、ターゲット表面22上に静止している細胞に至るま
での距離を自由に飛翔する。この装置が適当に構成され
かつ調節されており、しかも適当な手順を行えば、実質
的な割合の担体粒子が正しい速度でターゲットに達し、
許容できない割合で該細胞を破壊することなしに、ター
ゲット表面22上の細胞中に侵入する。次いで、ターゲッ
ト表面22上の細胞をターゲット表面22から取出し、形質
転換体と非形質転換体とを分離すべく適当に選別を行う
ことが可能である。この工程で、花粉を使用（これが好
ましい）した場合、花粉は次にターゲット表面22から除
かれ、生殖能力のある雌性の花、例えばトウモロコシの
毛などに手で授粉する。これらは次いで種子または穀粒
となる。この種子を収穫し、播種し、かつ担体粒子に担
持され、花粉中に注入されたDNAで条件付けられた形態
学的または生化学的特徴につき評価を行うことが可能で
ある。また未成熟の胚を分化中の種子から切取って、該
胚を適当な組織培養液中で小さな苗または完全な植物に
まで育成することもできる。これら胚からの植物または
苗、あるいは組織は、花粉細胞中に形質転換されたDNA
中に含まれる選択可能なマーカーを基にして選別すべく
テストすることができる。適当な選択し得るマーカー
は、除草特性、抗生物質耐性または支配的形態学的特徴
などの表現が観測できる外因性抵抗特性を含む。
間に生ずる。この電弧は電極間に広がっている小さな水
滴を瞬間的に蒸発させる。水滴の爆発的な蒸発に基き生
ずる衝撃波がスパーク放電室12の内部全体に伝播する。
この衝撃波が担体シート18に達すると、この担体シート
18はスペーサリング16により垂直方向に持ち上げられ、
支持スクリーン20に向けて加速され。担体シート18が支
持スクリーン20に衝突すると、担体シート18はその位置
で止められ、かつ担体シート18上にある粒子はこれを離
れて、ターゲット表面22上に静止している細胞に至るま
での距離を自由に飛翔する。この装置が適当に構成され
かつ調節されており、しかも適当な手順を行えば、実質
的な割合の担体粒子が正しい速度でターゲットに達し、
許容できない割合で該細胞を破壊することなしに、ター
ゲット表面22上の細胞中に侵入する。次いで、ターゲッ
ト表面22上の細胞をターゲット表面22から取出し、形質
転換体と非形質転換体とを分離すべく適当に選別を行う
ことが可能である。この工程で、花粉を使用（これが好
ましい）した場合、花粉は次にターゲット表面22から除
かれ、生殖能力のある雌性の花、例えばトウモロコシの
毛などに手で授粉する。これらは次いで種子または穀粒
となる。この種子を収穫し、播種し、かつ担体粒子に担
持され、花粉中に注入されたDNAで条件付けられた形態
学的または生化学的特徴につき評価を行うことが可能で
ある。また未成熟の胚を分化中の種子から切取って、該
胚を適当な組織培養液中で小さな苗または完全な植物に
まで育成することもできる。これら胚からの植物または
苗、あるいは組織は、花粉細胞中に形質転換されたDNA
中に含まれる選択可能なマーカーを基にして選別すべく
テストすることができる。適当な選択し得るマーカー
は、除草特性、抗生物質耐性または支配的形態学的特徴
などの表現が観測できる外因性抵抗特性を含む。
第１図の装置は本発明による花粉媒介植物形質転換法
のために特別に開発されたものてあるが、この装置自体
は他の型の組織、植物、動物またはバクテリアの加速粒
子形質転換に対しても同様に有用であるものと理解すべ
きである。この装置では間隔または放電電位を変えるこ
とにより粒子の力を容易に調節することができる。これ
は結果が再現し得るように、高効率かつ安定に、かつ比
較的簡単に操作される。
のために特別に開発されたものてあるが、この装置自体
は他の型の組織、植物、動物またはバクテリアの加速粒
子形質転換に対しても同様に有用であるものと理解すべ
きである。この装置では間隔または放電電位を変えるこ
とにより粒子の力を容易に調節することができる。これ
は結果が再現し得るように、高効率かつ安定に、かつ比
較的簡単に操作される。
本発明の好ましい方法においては、粒子にDNA配列を
適用する工程、担体シート内に粒子の層を形成する工程
および植物の形質転換用のDNAの調製工程すべては特別
な注意を要する。これら各々の詳細は順次以下で議論さ
れるであろう。
適用する工程、担体シート内に粒子の層を形成する工程
および植物の形質転換用のDNAの調製工程すべては特別
な注意を要する。これら各々の詳細は順次以下で議論さ
れるであろう。
植物の形質転換に適した形状で調製された外来遺伝子
を含むDNA配列は無垢の金またはタングステンペレット
上で単に乾燥することができる。しかし、このような形
態のDNA分子は比較的短期間のみ安定であり、しかも粒
子自体の金属または酸化基質との化学的反応により比較
的急速に分解する傾向がある。これに対して、担体粒子
をまず封止剤で被覆した場合には、DNA鎖は大巾に改善
された安定性を有し、かつ数週間にも及ぶ長期間に亘り
殆ど分解されないことがわかった。適当な封止剤はポリ
リジン（分子量＝200,000）であり、これはDNA分子を塗
布する前に担体粒子に塗布し得ることがわかった。ポリ
マー型のあるいはその他のこれ以外の封止剤も同様な封
止剤として有用であると思われる。ポリリジンは、金粒
子を0.02％ポリリジン溶液で洗い、次いでかくして被覆
した粒子を風乾または加熱乾燥することにより塗布され
る。一旦、ポリリジンで被覆した金属粒子を乾燥すれ
ば、DNA鎖を該粒子上に担持させることができる。DNAF
は金ビーズ球1mg当りDNA3〜30μｇの範囲の割合で該粒
子上に担持させることができる。実際には、100μｇのD
NAおよび１〜３μの金粒子30mgに、５μｌの10mM Na2HP
O4および５μｌの10mM CaCl2を添加して、溶液が乾燥す
るに伴って微細なCaHPO4沈殿が生成されるようにする。
この沈殿は該ビーズ上でDNAを担持している。ビーズと
燐酸およびカルシウム塩溶液とをDNAと混合した後、懸
濁液を時々攪拌しつつ窒素気流下で乾燥する。沈殿を一
旦乾燥し、次いですぐに担体シート上に該粒子を配置す
るために100％エタノール中に再懸濁する。
を含むDNA配列は無垢の金またはタングステンペレット
上で単に乾燥することができる。しかし、このような形
態のDNA分子は比較的短期間のみ安定であり、しかも粒
子自体の金属または酸化基質との化学的反応により比較
的急速に分解する傾向がある。これに対して、担体粒子
をまず封止剤で被覆した場合には、DNA鎖は大巾に改善
された安定性を有し、かつ数週間にも及ぶ長期間に亘り
殆ど分解されないことがわかった。適当な封止剤はポリ
リジン（分子量＝200,000）であり、これはDNA分子を塗
布する前に担体粒子に塗布し得ることがわかった。ポリ
マー型のあるいはその他のこれ以外の封止剤も同様な封
止剤として有用であると思われる。ポリリジンは、金粒
子を0.02％ポリリジン溶液で洗い、次いでかくして被覆
した粒子を風乾または加熱乾燥することにより塗布され
る。一旦、ポリリジンで被覆した金属粒子を乾燥すれ
ば、DNA鎖を該粒子上に担持させることができる。DNAF
は金ビーズ球1mg当りDNA3〜30μｇの範囲の割合で該粒
子上に担持させることができる。実際には、100μｇのD
NAおよび１〜３μの金粒子30mgに、５μｌの10mM Na2HP
O4および５μｌの10mM CaCl2を添加して、溶液が乾燥す
るに伴って微細なCaHPO4沈殿が生成されるようにする。
この沈殿は該ビーズ上でDNAを担持している。ビーズと
燐酸およびカルシウム塩溶液とをDNAと混合した後、懸
濁液を時々攪拌しつつ窒素気流下で乾燥する。沈殿を一
旦乾燥し、次いですぐに担体シート上に該粒子を配置す
るために100％エタノール中に再懸濁する。
担体シートに該粒子を塗布する場合、該担体シート上
に担体粒子の均一かつ再生可能な層を形成することがこ
の手順の首尾より操作のために好ましい。このため、粒
子は担体上に単純に振りまくことはできない。なんとな
れば、これらは凝集する傾向をもち、従ってシート上に
再現し得ない様式で不均一に分布するからである。特
に、シート上の水分即ち水含量はシートへの粒子の適用
を妨害し、望ましからぬ凝集を起こす。従って、まずマ
イラーシートを、担体粒子を適用する際に水が点在する
のを防止するために親水性被覆で通め覆っておくことが
必要である。このためにはヒドロキシエチルセルロース
が役立つが、他の同様な処理、例えば酸化水分解セルロ
ースによる被覆も利用できることがわかった。１％のヒ
ドロキシエチルセルロース溶液をプラスチック被覆アル
ミメッキマイラー上に塗布し、次いで脱イオン水で洗浄
し、風乾する。次いで、100％エタノールに懸濁され
た、DNA鎖を含む沈殿被覆をもつ担体粒子を担体シート
に塗布する。50〜100μｌの十分に攪拌したエタノール
懸濁液を担体粒子と共に、適度に均一かつ再現性のある
様式で、マイラーシート上にピペットで首尾良く移する
ことができることを見出した。この懸濁液の移されたア
リコートを少なくとも30秒間密閉したペトリ皿内で静置
する。このペトリ皿は室内空気流による渦流の発生を防
止し、かつ高速度での蒸発を防止するために密閉しなけ
ればならない。該渦流は粒子の過度のドリフトを生ずる
可能性があり、その結果シート上での粒子の分布が不均
一となる可能性がある。静置時間の経過後、メニスカス
を破り、過剰のエタノールを排液する。部分的に開放し
たペトリ皿内で蒸発させることにより残留エタノールを
除去する。
に担体粒子の均一かつ再生可能な層を形成することがこ
の手順の首尾より操作のために好ましい。このため、粒
子は担体上に単純に振りまくことはできない。なんとな
れば、これらは凝集する傾向をもち、従ってシート上に
再現し得ない様式で不均一に分布するからである。特
に、シート上の水分即ち水含量はシートへの粒子の適用
を妨害し、望ましからぬ凝集を起こす。従って、まずマ
イラーシートを、担体粒子を適用する際に水が点在する
のを防止するために親水性被覆で通め覆っておくことが
必要である。このためにはヒドロキシエチルセルロース
が役立つが、他の同様な処理、例えば酸化水分解セルロ
ースによる被覆も利用できることがわかった。１％のヒ
ドロキシエチルセルロース溶液をプラスチック被覆アル
ミメッキマイラー上に塗布し、次いで脱イオン水で洗浄
し、風乾する。次いで、100％エタノールに懸濁され
た、DNA鎖を含む沈殿被覆をもつ担体粒子を担体シート
に塗布する。50〜100μｌの十分に攪拌したエタノール
懸濁液を担体粒子と共に、適度に均一かつ再現性のある
様式で、マイラーシート上にピペットで首尾良く移する
ことができることを見出した。この懸濁液の移されたア
リコートを少なくとも30秒間密閉したペトリ皿内で静置
する。このペトリ皿は室内空気流による渦流の発生を防
止し、かつ高速度での蒸発を防止するために密閉しなけ
ればならない。該渦流は粒子の過度のドリフトを生ずる
可能性があり、その結果シート上での粒子の分布が不均
一となる可能性がある。静置時間の経過後、メニスカス
を破り、過剰のエタノールを排液する。部分的に開放し
たペトリ皿内で蒸発させることにより残留エタノールを
除去する。
この工程はDNA鎖含有沈殿で被覆した担体粒子をマイ
ラー担体シート上に配置するためのものである。本発明
において有効であることがわかっている良好な中間的割
合（median rate）は、担体シートの９×11mmの面積に
塗布された沈殿およびDNAを含む担体粒子約0.1mgであ
る。このような担体粒子の担体シートへの塗布密度は花
粉の良好な生存率を与えまた加速粒子による花粉粒への
高い侵入率を与える。実際の加速率およびこの粒子によ
る花粉粒への侵入率は花粉の寸法および径の両者に応じ
て変化し、しかも担体粒子の数は必要に応じて、ターゲ
ット細胞の断面積当たりで、多くの粒子あるいはより少
ない粒子数となるように変えることができることは明ら
かである。
ラー担体シート上に配置するためのものである。本発明
において有効であることがわかっている良好な中間的割
合（median rate）は、担体シートの９×11mmの面積に
塗布された沈殿およびDNAを含む担体粒子約0.1mgであ
る。このような担体粒子の担体シートへの塗布密度は花
粉の良好な生存率を与えまた加速粒子による花粉粒への
高い侵入率を与える。実際の加速率およびこの粒子によ
る花粉粒への侵入率は花粉の寸法および径の両者に応じ
て変化し、しかも担体粒子の数は必要に応じて、ターゲ
ット細胞の断面積当たりで、多くの粒子あるいはより少
ない粒子数となるように変えることができることは明ら
かである。
本発明で使用するDNAは、トウモロコシの細胞中で外
因性遺伝子を表現するのに適したベクタ中に構成しなけ
ればならない。また他のあらゆる植物が本発明で利用で
きる。DNA配列はキメラであり得るが、他の植物種また
は同種の植物系からの十分に完全な非キメラ遺伝子も利
用できる。植物中での表現に適したベクターは、一般
に、所定の外因性遺伝子のコード配列以外に、適当な側
部に位置する調節配列、例えば植物細胞の生体中での転
写および表現を促進し得る適当なプロモータ、および転
写末端を認識し信号を発するかあるいはメッセンジャー
を適当に翻訳して蛋白合成を行うように、RNAを適当に
処理することのできる翻訳ターミネータを含むべきであ
る。以前に双子葉植物細胞中でコード配列の転写および
表現を可能とする植物遺伝子プロモータは細胞レベルで
の単子葉植物、例えばコーンなどでも有効であることが
証明されたが、後者のいくつかの場合において効果は低
い。これについてはフロム（Fromm）等、プロシーディ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,1
985−９月，82,5824-5828を参照のこと。このようなプ
ロモータは、植物病原体アグロバクテリアム ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefaiens）からのノパリン
シンターゼプロモータおよびカリフラワーモザイクウイ
ルス配列由来のCaMv35sを含む。植物で有効な適当な終
止配列はアグロバクテリウム ツメファシエンス（Agob
acterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ遺伝子
からのポリアデニル化配列である。植物表現ベクタも、
植物細胞中で機能可能な選択し得るマーカーを含んでい
て、形質転換植物の選別を可能とすることができる。こ
の選択可能なマーカーは、生化学的にアッセイし得る特
徴あるいは子孫の植物にみることのできる表現型の特徴
であり得る。同一のまたは他の植物からの、側部に配置
された（flanking）調節配列をもつ非キメラ型の完全な
遺伝子をこの工程で使用した場合、キメラプロモータま
たは制御配列は不要であり、この遺伝子はその元の配列
のまま使用できる。
因性遺伝子を表現するのに適したベクタ中に構成しなけ
ればならない。また他のあらゆる植物が本発明で利用で
きる。DNA配列はキメラであり得るが、他の植物種また
は同種の植物系からの十分に完全な非キメラ遺伝子も利
用できる。植物中での表現に適したベクターは、一般
に、所定の外因性遺伝子のコード配列以外に、適当な側
部に位置する調節配列、例えば植物細胞の生体中での転
写および表現を促進し得る適当なプロモータ、および転
写末端を認識し信号を発するかあるいはメッセンジャー
を適当に翻訳して蛋白合成を行うように、RNAを適当に
処理することのできる翻訳ターミネータを含むべきであ
る。以前に双子葉植物細胞中でコード配列の転写および
表現を可能とする植物遺伝子プロモータは細胞レベルで
の単子葉植物、例えばコーンなどでも有効であることが
証明されたが、後者のいくつかの場合において効果は低
い。これについてはフロム（Fromm）等、プロシーディ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,1
985−９月，82,5824-5828を参照のこと。このようなプ
ロモータは、植物病原体アグロバクテリアム ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefaiens）からのノパリン
シンターゼプロモータおよびカリフラワーモザイクウイ
ルス配列由来のCaMv35sを含む。植物で有効な適当な終
止配列はアグロバクテリウム ツメファシエンス（Agob
acterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ遺伝子
からのポリアデニル化配列である。植物表現ベクタも、
植物細胞中で機能可能な選択し得るマーカーを含んでい
て、形質転換植物の選別を可能とすることができる。こ
の選択可能なマーカーは、生化学的にアッセイし得る特
徴あるいは子孫の植物にみることのできる表現型の特徴
であり得る。同一のまたは他の植物からの、側部に配置
された（flanking）調節配列をもつ非キメラ型の完全な
遺伝子をこの工程で使用した場合、キメラプロモータま
たは制御配列は不要であり、この遺伝子はその元の配列
のまま使用できる。
本発明の方法はトウモロコシの花粉媒介形質転換法に
ついて特に詳細に記載してきたが、本発明の方法に固有
の事柄は何もなく、即ちトウモロコシに制限する必要性
はなく、かつ本発明の方法は同様に他の穀類作物並びに
大豆および綿などの双子葉植物および殆どの他の植物の
花粉形質転換にも適しているものと理解すべきである。
他の種の花粉を扱う手順は変える必要があるかもしれ
ず、また種に応じて、担体粒子速度に対して臨界的な装
置の部品の間隔を変える必要があろうが、基本的な装置
および手続きは他の植物種にも利用できる。
ついて特に詳細に記載してきたが、本発明の方法に固有
の事柄は何もなく、即ちトウモロコシに制限する必要性
はなく、かつ本発明の方法は同様に他の穀類作物並びに
大豆および綿などの双子葉植物および殆どの他の植物の
花粉形質転換にも適しているものと理解すべきである。
他の種の花粉を扱う手順は変える必要があるかもしれ
ず、また種に応じて、担体粒子速度に対して臨界的な装
置の部品の間隔を変える必要があろうが、基本的な装置
および手続きは他の植物種にも利用できる。
更に、本発明の方法は花粉媒介形質転換を指向するも
のであるが、ここに記載した装置は他の植物組織、例え
ば胚カルスまたは体性胚あるいは任意の他の植物または
他の培養組織の形質転換に利用するためにも適したもの
である。
のであるが、ここに記載した装置は他の植物組織、例え
ば胚カルスまたは体性胚あるいは任意の他の植物または
他の培養組織の形質転換に利用するためにも適したもの
である。
すべての花粉が内部に挿入された担体粒子をもつわけ
ではないので、しかもすべての花粉細胞または子孫接合
体がそのゲノム内にDNAを取込むわけではないので、あ
る段階で子孫植物をスクリーニングして形質転換体を選
別しなければならない。所定の外来遺伝子を植物中に形
質転換しようとする場合、該遺伝子をキメラ表現ベクタ
内に挿入できる。次いで、このキメラ表現ベクタを、以
下に記載するpCMC1022などの選択可能なマーカープラス
ミドと共に植物細胞内に形質転換することができる。こ
れら２つのベクタ（外来遺伝子および選択可能なマーカ
ー）は一緒につないで一つのプラスミドとすることがで
き、あるいはこれら２つのベクタを別々にクローニング
して、次いで同一の担体粒子に一緒に塗布することも可
能である。いずれにしても、得られる子孫を該マーカー
に対してスクリーニングし、形質転換された子孫を選別
する。このような選別可能なマーカーの使用はある情況
下では望ましいが、形質転換された子孫を選別するため
の適当な形態学的または生化学的テストが存在する場合
にはこれを省くこともできる。形態学的スクリーニング
テストは子孫における支配的表現型特徴に対するもので
あってよい。適当な生化学的スクリーニングテストは、
子孫植物のゲノムにおける形質転換DNA自体の存在に対
するいわゆるサザンブロットハイブリダイゼーションプ
ローブであってよい。
ではないので、しかもすべての花粉細胞または子孫接合
体がそのゲノム内にDNAを取込むわけではないので、あ
る段階で子孫植物をスクリーニングして形質転換体を選
別しなければならない。所定の外来遺伝子を植物中に形
質転換しようとする場合、該遺伝子をキメラ表現ベクタ
内に挿入できる。次いで、このキメラ表現ベクタを、以
下に記載するpCMC1022などの選択可能なマーカープラス
ミドと共に植物細胞内に形質転換することができる。こ
れら２つのベクタ（外来遺伝子および選択可能なマーカ
ー）は一緒につないで一つのプラスミドとすることがで
き、あるいはこれら２つのベクタを別々にクローニング
して、次いで同一の担体粒子に一緒に塗布することも可
能である。いずれにしても、得られる子孫を該マーカー
に対してスクリーニングし、形質転換された子孫を選別
する。このような選別可能なマーカーの使用はある情況
下では望ましいが、形質転換された子孫を選別するため
の適当な形態学的または生化学的テストが存在する場合
にはこれを省くこともできる。形態学的スクリーニング
テストは子孫における支配的表現型特徴に対するもので
あってよい。適当な生化学的スクリーニングテストは、
子孫植物のゲノムにおける形質転換DNA自体の存在に対
するいわゆるサザンブロットハイブリダイゼーションプ
ローブであってよい。
（実施例） 1.ベクターの構築 A.抗生物質耐性 適当な植物表現ベクタの組立ては模式的に第２図およ
び第３図に示されている。第２図には模式的に、植物表
現ベクタpCMC1208の構築法が示されている。プラスミド
pCMC1208の作製はプラスミドpBR325〔ボリバー エフ
（Boliver,F.），ジーヌ（Gene）,1978,4,121-136〕を
制限エンドヌクレアーゼTagIで消化することにより開始
する。このプラスミドpBR325は抗生物質耐性遺伝子、ク
ロラムファェコールアセチル トランスフェラーゼ（CA
T）に対するコード配列を含む。CATはこのプラスミドの
残部からTagIによる消化によって切取られる。pBR325の
消化の後、断片をアガロースゲル中を電気泳動させて分
割し、CAT遺伝子を含む断片を切り取った。次いで、こ
のCAT断片をプラスミドpUC9〔ビエラおよびメッシング
（Viera ＆ Messing）、ジーヌ（Gene）,1982,19,259-2
68〕に連結した。このpUC9は予め制限酵素AccIで消化し
ておいた。TagIおよびAccIにより生成された断片の端部
はこの場合相補的であり、従ってこれらの鎖は直接連結
できた。得られるプラスミド（第２図でpUC-CATと命名
したもの）は、pUC9からのポリリンカーの部分が側面に
位置するCATコード配列を含んでいた。このプラスミド
をPstIおよびBamHIで消化し、２つの断片の小さな方を
ゲル電気泳動法により単離した。次に、この断片を介在
植物表現ベクタpCMC66に連結し、CAT表現プラスミドpCM
C1205を形成した。ここでベクタpCMC66は予めPstIおよ
びBamHIで消化しておいた。このプラスミドpCMC66はア
グロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium
tumfaciens）由来のノパリンシンターゼ プロモータ
（NosPr）および６個のプラスミド固有の制限サイトを
包囲する、同じ生物起源のノパリンシンターゼ ポリア
デニル化配列（Poly A）を含む。また、このプラスミド
pCMC66はβ−ラクタマーゼ遺伝子（bla）の異形を有
し、これはバクテリア中で抗生物質アンピシリン耐性を
表現し、その結果後にイー．コリ（E.coli）中で行った
組換えにおける選別マーカーとして使用できる。
び第３図に示されている。第２図には模式的に、植物表
現ベクタpCMC1208の構築法が示されている。プラスミド
pCMC1208の作製はプラスミドpBR325〔ボリバー エフ
（Boliver,F.），ジーヌ（Gene）,1978,4,121-136〕を
制限エンドヌクレアーゼTagIで消化することにより開始
する。このプラスミドpBR325は抗生物質耐性遺伝子、ク
ロラムファェコールアセチル トランスフェラーゼ（CA
T）に対するコード配列を含む。CATはこのプラスミドの
残部からTagIによる消化によって切取られる。pBR325の
消化の後、断片をアガロースゲル中を電気泳動させて分
割し、CAT遺伝子を含む断片を切り取った。次いで、こ
のCAT断片をプラスミドpUC9〔ビエラおよびメッシング
（Viera ＆ Messing）、ジーヌ（Gene）,1982,19,259-2
68〕に連結した。このpUC9は予め制限酵素AccIで消化し
ておいた。TagIおよびAccIにより生成された断片の端部
はこの場合相補的であり、従ってこれらの鎖は直接連結
できた。得られるプラスミド（第２図でpUC-CATと命名
したもの）は、pUC9からのポリリンカーの部分が側面に
位置するCATコード配列を含んでいた。このプラスミド
をPstIおよびBamHIで消化し、２つの断片の小さな方を
ゲル電気泳動法により単離した。次に、この断片を介在
植物表現ベクタpCMC66に連結し、CAT表現プラスミドpCM
C1205を形成した。ここでベクタpCMC66は予めPstIおよ
びBamHIで消化しておいた。このプラスミドpCMC66はア
グロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium
tumfaciens）由来のノパリンシンターゼ プロモータ
（NosPr）および６個のプラスミド固有の制限サイトを
包囲する、同じ生物起源のノパリンシンターゼ ポリア
デニル化配列（Poly A）を含む。また、このプラスミド
pCMC66はβ−ラクタマーゼ遺伝子（bla）の異形を有
し、これはバクテリア中で抗生物質アンピシリン耐性を
表現し、その結果後にイー．コリ（E.coli）中で行った
組換えにおける選別マーカーとして使用できる。
プラスミドpCaMV10〔ガードナー（Gardner）等、ヌク
レイック アシッズ リサーチ（Nucl.Acids Res.）,19
81,9,2871-2888〕をStuIで消化し、カリフラワ モザイ
クウイルス35プロモータ（CaMv35s）を含む断片を合成X
hoIオリゴヌクレオチドリンカーに結合した。次いで、
この断片をHpHIで消化し、DNAポリメラーゼで処理して
平滑末端を得、次いで合成HindIIIオリゴヌクレオチド
リンカーに結合した。この断片のXhoIおよびHindIII両
者による消化はCaMv35sでプロモータおよび制限サイト
配列の添加により末端が変性された転写開始サイトを含
む断片を生成した。
レイック アシッズ リサーチ（Nucl.Acids Res.）,19
81,9,2871-2888〕をStuIで消化し、カリフラワ モザイ
クウイルス35プロモータ（CaMv35s）を含む断片を合成X
hoIオリゴヌクレオチドリンカーに結合した。次いで、
この断片をHpHIで消化し、DNAポリメラーゼで処理して
平滑末端を得、次いで合成HindIIIオリゴヌクレオチド
リンカーに結合した。この断片のXhoIおよびHindIII両
者による消化はCaMv35sでプロモータおよび制限サイト
配列の添加により末端が変性された転写開始サイトを含
む断片を生成した。
上記ノパリンシンターゼ プロモータを、プラスミド
pCMC1205をXhoIおよびHindIIIで消化することにより該
プラスミドから切取った。かくして得た２つの断片の大
きな方をCaMv35sプロモータ断片と結合してpCMC1208を
生成した。このpCMC1208はCaMv35sプロモータ、CATコー
ド配列およびノパリンシンターゼ ポリアデニル化配列
をこの順で有する植物表現ベクタである。このCaMv35s
プロモータおよびpolyA配列はCATコード配列に対する側
部に配置された調節配列として機能した。
pCMC1205をXhoIおよびHindIIIで消化することにより該
プラスミドから切取った。かくして得た２つの断片の大
きな方をCaMv35sプロモータ断片と結合してpCMC1208を
生成した。このpCMC1208はCaMv35sプロモータ、CATコー
ド配列およびノパリンシンターゼ ポリアデニル化配列
をこの順で有する植物表現ベクタである。このCaMv35s
プロモータおよびpolyA配列はCATコード配列に対する側
部に配置された調節配列として機能した。
プラスミドpCMC1205およびpCMC1208両者を、原形質体
中にエレクトロポレーションし、次いでCAT活性につき
アッセイすることにより、トウモロコシ中での活性につ
きテストした。両者ともトウモロコシ細胞中で活性であ
ることが立証されたが、pCMC1208はその活性の点で著し
く高いことがわかり、従って植物形質転換実験ではこれ
を用いた。
中にエレクトロポレーションし、次いでCAT活性につき
アッセイすることにより、トウモロコシ中での活性につ
きテストした。両者ともトウモロコシ細胞中で活性であ
ることが立証されたが、pCMC1208はその活性の点で著し
く高いことがわかり、従って植物形質転換実験ではこれ
を用いた。
プラスミドpCMC1208を、本発明の方法および装置で
の、トウモロコシの花粉媒介遺伝的形質転換のために使
用した。しかし、CAT活性のためのアッセイはトウモロ
コシ組織中で高いバックグラウンドを有しており、従っ
てCAT遺伝子はトウモロコシでは最適のマーカーではな
いものと考えた。そこで、このプラスミドを更に処理し
て、CAT遺伝子の代りにトウモロコシ中でより一側選択
性の高い、ベクタ中の他の抗生物質耐性遺伝子を、第３
図に示すように挿入した。
の、トウモロコシの花粉媒介遺伝的形質転換のために使
用した。しかし、CAT活性のためのアッセイはトウモロ
コシ組織中で高いバックグラウンドを有しており、従っ
てCAT遺伝子はトウモロコシでは最適のマーカーではな
いものと考えた。そこで、このプラスミドを更に処理し
て、CAT遺伝子の代りにトウモロコシ中でより一側選択
性の高い、ベクタ中の他の抗生物質耐性遺伝子を、第３
図に示すように挿入した。
プラスミドpCMC1021はノパリンシンターゼ プロモー
タおよび酵素アミノグリコシド−３−ホスホトランスフ
ェラーゼII（APH3′II）のコード領域を側面に有するノ
パリンシンターゼ ポリアデニル化配列を含む。APH3′
IIはカナマイシンなどのアミノグリコシド抗生物質に対
する耐性を決定する。エレクトロポレーション実験はCa
Mv35sプロモータがNos Prよりもトウモロコシについて
より一層有効であることを明らかにしたので、CaMv35s
プロモータをpCMC1021に移すことを決定した。第３図に
示すようにpCMC1208由来のCaMv35s断片はXhoIおよびHin
dIIIで消化し、電気泳動で単離した。また、プラスミド
pCMC1021をXhoIおよびHindIIIで消化し、そのうち大き
な断片を単離し、これをCaMv35s断片と結合してpCMC102
2を生成した。プラスミドpCMC1022において、APH3′II
由来のコード配列は調節性CaMv35sおよびNos pA配列と
側面を接している。
タおよび酵素アミノグリコシド−３−ホスホトランスフ
ェラーゼII（APH3′II）のコード領域を側面に有するノ
パリンシンターゼ ポリアデニル化配列を含む。APH3′
IIはカナマイシンなどのアミノグリコシド抗生物質に対
する耐性を決定する。エレクトロポレーション実験はCa
Mv35sプロモータがNos Prよりもトウモロコシについて
より一層有効であることを明らかにしたので、CaMv35s
プロモータをpCMC1021に移すことを決定した。第３図に
示すようにpCMC1208由来のCaMv35s断片はXhoIおよびHin
dIIIで消化し、電気泳動で単離した。また、プラスミド
pCMC1021をXhoIおよびHindIIIで消化し、そのうち大き
な断片を単離し、これをCaMv35s断片と結合してpCMC102
2を生成した。プラスミドpCMC1022において、APH3′II
由来のコード配列は調節性CaMv35sおよびNos pA配列と
側面を接している。
エレクトロポーレーション形質転換および蛋白アッセ
イにより、プラスミドpCMC1208およびpCMC1022は両者と
もに、タバコ、綿、大豆およびコーンの個々の細胞中で
の形質転換および表現につき活性であることが立証され
た。
イにより、プラスミドpCMC1208およびpCMC1022は両者と
もに、タバコ、綿、大豆およびコーンの個々の細胞中で
の形質転換および表現につき活性であることが立証され
た。
B.胚乳染色マーカー pMBzRIと称するプラスミドが得られ、これはトウモロ
コシゲノムDNAの約9.9kbのEco RI断片を含み、該ゲノム
DNAは、コーン中でアントシアニン顔料を合成するのに
必要とされる酵素、UDPグルコース−フレーバード グ
ルコシル トランスフェラーゼをコードする完全な遺伝
子を含んでいる。このゲノム断片は長い５′および３′
の側面に位置するDNA両者を含み、従って該遺伝子をト
ウモロコシ中で表現するのに有効な適当な調節配列を含
むものと期待される。このクローニングした遺伝子は正
常な機能性のトウモロコシ遺伝子の全長に亘るコピーで
あるので、このクローン化遺伝子は完全に活性で、しか
もトウモロコシ細胞中で適切に機能するであろう。
コシゲノムDNAの約9.9kbのEco RI断片を含み、該ゲノム
DNAは、コーン中でアントシアニン顔料を合成するのに
必要とされる酵素、UDPグルコース−フレーバード グ
ルコシル トランスフェラーゼをコードする完全な遺伝
子を含んでいる。このゲノム断片は長い５′および３′
の側面に位置するDNA両者を含み、従って該遺伝子をト
ウモロコシ中で表現するのに有効な適当な調節配列を含
むものと期待される。このクローニングした遺伝子は正
常な機能性のトウモロコシ遺伝子の全長に亘るコピーで
あるので、このクローン化遺伝子は完全に活性で、しか
もトウモロコシ細胞中で適切に機能するであろう。
酵素、UDPグルコース−フラボノール グルコシル
トランス フェラーゼ自体はトウモロコシの遺伝的形質
転換用の選別マーカーとして有用である。というのは、
外因性遺伝子を不活性する劣勢変異体を含むトウモロコ
シ系が得られるからである。この酵素は植物の生長並び
に分化に対して必須ではないので、変異系の植物が、野
性型または非−変異型トウモロコシの種々の組織中で生
成されるはずの赤色アントシアニン顔料に乏しいこと以
外は正常である。ホモ接合変異系に野性型の遺伝子を導
入すると、この酵素を生成し、かくして後にアントアニ
ンを産生し、従って形質転換植物はその特徴的な色によ
って容易に識別できる。かくして、プラスミドpMBzRI
は、何の変更もなしに、トウモロコシにおけるモデル的
表現ベクタとして適しており、また他の興味ある遺伝子
に結合した場合には便利なスクリーニング可能な形質転
換マーカーとして使用できる。これは有用な非キメラ遺
伝子の一例である。
トランス フェラーゼ自体はトウモロコシの遺伝的形質
転換用の選別マーカーとして有用である。というのは、
外因性遺伝子を不活性する劣勢変異体を含むトウモロコ
シ系が得られるからである。この酵素は植物の生長並び
に分化に対して必須ではないので、変異系の植物が、野
性型または非−変異型トウモロコシの種々の組織中で生
成されるはずの赤色アントシアニン顔料に乏しいこと以
外は正常である。ホモ接合変異系に野性型の遺伝子を導
入すると、この酵素を生成し、かくして後にアントアニ
ンを産生し、従って形質転換植物はその特徴的な色によ
って容易に識別できる。かくして、プラスミドpMBzRI
は、何の変更もなしに、トウモロコシにおけるモデル的
表現ベクタとして適しており、また他の興味ある遺伝子
に結合した場合には便利なスクリーニング可能な形質転
換マーカーとして使用できる。これは有用な非キメラ遺
伝子の一例である。
2.pCMC1022を用いるトウモロコシの形質転換 担体粒子として用いる径１〜３μｍの球状金ビーズ
を、0.02％ポリリジン中ですすぎ、風乾することによ
り、ポリリジンで予め被覆した。100μｇのpCMC1022DNA
を含む水性溶液を33mgの被覆ビーズに添加し、次いで５
μｌの10mM Na2HPO4および５μｌの10mM CaCl2を添加し
た。溶液がＮ2気流中で乾燥（蒸発）されるにつれて微
細な沈殿が生成した。
を、0.02％ポリリジン中ですすぎ、風乾することによ
り、ポリリジンで予め被覆した。100μｇのpCMC1022DNA
を含む水性溶液を33mgの被覆ビーズに添加し、次いで５
μｌの10mM Na2HPO4および５μｌの10mM CaCl2を添加し
た。溶液がＮ2気流中で乾燥（蒸発）されるにつれて微
細な沈殿が生成した。
乾燥した、沈殿で被覆されたビードを、次に100mlの
エタノールに再懸濁し、次いで約1cm×1cmの厚さ2.0ミ
ルのプラスチック被覆し、アルミメッキしたマイラーシ
ート上に析出させた。この被覆ビードは最終密度0.1mg/
cm2となるようにマイラー担体シート上に塗布した。
エタノールに再懸濁し、次いで約1cm×1cmの厚さ2.0ミ
ルのプラスチック被覆し、アルミメッキしたマイラーシ
ート上に析出させた。この被覆ビードは最終密度0.1mg/
cm2となるようにマイラー担体シート上に塗布した。
上部に被覆ビードをもつ担体シートを第１図に示した
装置のスペーサ16の頂部に取付けた。花粉を手でアーリ
ーサン−グロ甘味種トウモロコシ（Early Sun-Glo swee
t corn）から集めた。60mmのペトリ皿の底部を鉱油でわ
ずかに覆い、集めた花粉をその上に振りまいた。このペ
トリ皿を逆転させて過剰の花粉を除き、単層とした。こ
のペトリ皿を第１図の装置のターゲット表面22として用
いた。
装置のスペーサ16の頂部に取付けた。花粉を手でアーリ
ーサン−グロ甘味種トウモロコシ（Early Sun-Glo swee
t corn）から集めた。60mmのペトリ皿の底部を鉱油でわ
ずかに覆い、集めた花粉をその上に振りまいた。このペ
トリ皿を逆転させて過剰の花粉を除き、単層とした。こ
のペトリ皿を第１図の装置のターゲット表面22として用
いた。
55〜60mmHgの真空を第１図の組立てられた装置に印加
した。１μＦのキャパシタからの15KV放電を電極14を介
して発生させて、ターゲット表面22上の花粉に、該被覆
粒子を加速した。
した。１μＦのキャパシタからの15KV放電を電極14を介
して発生させて、ターゲット表面22上の花粉に、該被覆
粒子を加速した。
ビーズの調製および花粉の調製工程および第１図の装
置の始動工程を、十分な量の処理花粉が得られるまで数
回繰返した。処理した花粉をペトリ皿の底部からブラシ
で払い落とし、手作業でカルテンバーグ（Kaltenberg）
390とCFS5504とのハイブリッドの雌性植物の毛に授粉し
た。これらの毛を他の花粉から物理的に隔離した。
置の始動工程を、十分な量の処理花粉が得られるまで数
回繰返した。処理した花粉をペトリ皿の底部からブラシ
で払い落とし、手作業でカルテンバーグ（Kaltenberg）
390とCFS5504とのハイブリッドの雌性植物の毛に授粉し
た。これらの毛を他の花粉から物理的に隔離した。
このようにして授粉したトウモロコシの実から52個の
穀粒を得た。授粉後14日目の実から未成熟胚を切取り、
50ppmのカナマイシンを含むコーン胚組織培養培地上で
培養した。この配置で生育した苗木につき直接APH3′II
活性をアッセイしたところ、３つの苗木が正であった。
このことはAPH3′II酵素が該苗木の組織中で表現されて
いることを示しており、かくしてこれら植物の首尾良い
形質転換が起こったことを示している。
穀粒を得た。授粉後14日目の実から未成熟胚を切取り、
50ppmのカナマイシンを含むコーン胚組織培養培地上で
培養した。この配置で生育した苗木につき直接APH3′II
活性をアッセイしたところ、３つの苗木が正であった。
このことはAPH3′II酵素が該苗木の組織中で表現されて
いることを示しており、かくしてこれら植物の首尾良い
形質転換が起こったことを示している。
これら植物の一つを非選択培地に入れ、温室に移して
更に生長させた。葉の組織を連続APH3′II活性につき分
析したが、正であった。
更に生長させた。葉の組織を連続APH3′II活性につき分
析したが、正であった。
この植物および上記アッセイにおいて正ではなかった
１種の植物から単離したDNA中のpCMC1022配列の存在
を、サザンハイブリダイゼーション法で確認した〔サザ
ン（Sauthern），ジャーナル オブ モレキュラーバイ
オロジー（J.Mol.Bio.）,1975,98,503-577参照〕。コン
トロールおよびテストコーンの葉のサンプルから、テー
ラーおよびポーエル（Taylor ＆ Powell）のセチル−ト
リメチルアンモニウムブロミドのマイクロモディフィケ
ーション（micromodification）法〔フォーカス（Focu
s）,1982,4,4−６〕によってDNAを単離した。10μｇの
各DNAサンプルを制限酵素AvaIおよびHindIIIで消化し、
アガロースゲル中での電気泳動によって分割し、ナイロ
ン膜に移し、APHIIコード領域の非コード鎖に対応する
32Ｐ−標識したプローブとハイブリッド化した。フィル
タを洗浄した後、ハイブリッドDNA断片をオートラジオ
グラフィーで可視化した。
１種の植物から単離したDNA中のpCMC1022配列の存在
を、サザンハイブリダイゼーション法で確認した〔サザ
ン（Sauthern），ジャーナル オブ モレキュラーバイ
オロジー（J.Mol.Bio.）,1975,98,503-577参照〕。コン
トロールおよびテストコーンの葉のサンプルから、テー
ラーおよびポーエル（Taylor ＆ Powell）のセチル−ト
リメチルアンモニウムブロミドのマイクロモディフィケ
ーション（micromodification）法〔フォーカス（Focu
s）,1982,4,4−６〕によってDNAを単離した。10μｇの
各DNAサンプルを制限酵素AvaIおよびHindIIIで消化し、
アガロースゲル中での電気泳動によって分割し、ナイロ
ン膜に移し、APHIIコード領域の非コード鎖に対応する
32Ｐ−標識したプローブとハイブリッド化した。フィル
タを洗浄した後、ハイブリッドDNA断片をオートラジオ
グラフィーで可視化した。
予想された1kbの断片はいずれの植物にも見出されな
かった。しかし、各植物は、APH−３′IIプローブとハ
イブリッド化され、かつコントロールとしての形質転換
されていないトウモロコシDNAのサンプルのいずれにも
見出されなかった、約4kbの断片の存在を示した。２種
の植物の一方（APHIIにつき正のもの）も3.7kbの特異的
にハイブリッド化されている断片の存在を示した。観測
された断片が予想したサイズをもっていないという事実
はそれ程驚く程のことではない。というのは複雑な制限
パターンは、一般に植物および動物細胞中にトランスフ
ェクションされたDNAについて観察されるからである。
これについては、ペルチョ（Perucho）等の、セル（Cel
l）,1980,22,309-317;キエンズ（Kines）等、プラント
モレキュラー バイオロジー（Plant Mol.Biol.）,19
85,5,223-224;パツコースキー（Paszkowski）等，イー
エムビーオージャーナル（EMBO J.）,1984,3,2717-272
2;リッグス＆ベムツ（Riggs and Bates），プロシーデ
ィングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）,1986,83,5602-5606を参照のこと。更に、真核細胞
においてDNAは、例えばメチル化により、その予想され
る制限消化パターンを変えるように変性し得る〔チャン
ドラー＆ウオルボット（Chandlerand Walbot），プロシ
ーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA）,1986,83,1767-1771〕。本例で用いた制限エンドヌ
クレアーゼ、AvaIおよびHindIIIの両者はその認識配列
内で特異的メチル化により阻害されていることが知られ
ている〔マックレランド＆ネルソン（McClelland and N
elson），ヌクレイック アシッド リサーチ（Nucleic
Acids Res.）,1985,13,r201-r207〕。4kb断片の長さは
pCMC1022プラスミドのプラスミド単位長に等しく、これ
ら植物がタンデム状に複製された該プラスミドのコピー
を含むことを示唆している。これら酵素の一方のみによ
る消化は、従って観測されたプラスミド−長さの断片を
生成するであろう。3.7kbの断片は、たぶん本来のトウ
モロコシDNAとの接合部における、該プラスミドの再配
列の結果であると思われる。
かった。しかし、各植物は、APH−３′IIプローブとハ
イブリッド化され、かつコントロールとしての形質転換
されていないトウモロコシDNAのサンプルのいずれにも
見出されなかった、約4kbの断片の存在を示した。２種
の植物の一方（APHIIにつき正のもの）も3.7kbの特異的
にハイブリッド化されている断片の存在を示した。観測
された断片が予想したサイズをもっていないという事実
はそれ程驚く程のことではない。というのは複雑な制限
パターンは、一般に植物および動物細胞中にトランスフ
ェクションされたDNAについて観察されるからである。
これについては、ペルチョ（Perucho）等の、セル（Cel
l）,1980,22,309-317;キエンズ（Kines）等、プラント
モレキュラー バイオロジー（Plant Mol.Biol.）,19
85,5,223-224;パツコースキー（Paszkowski）等，イー
エムビーオージャーナル（EMBO J.）,1984,3,2717-272
2;リッグス＆ベムツ（Riggs and Bates），プロシーデ
ィングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）,1986,83,5602-5606を参照のこと。更に、真核細胞
においてDNAは、例えばメチル化により、その予想され
る制限消化パターンを変えるように変性し得る〔チャン
ドラー＆ウオルボット（Chandlerand Walbot），プロシ
ーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA）,1986,83,1767-1771〕。本例で用いた制限エンドヌ
クレアーゼ、AvaIおよびHindIIIの両者はその認識配列
内で特異的メチル化により阻害されていることが知られ
ている〔マックレランド＆ネルソン（McClelland and N
elson），ヌクレイック アシッド リサーチ（Nucleic
Acids Res.）,1985,13,r201-r207〕。4kb断片の長さは
pCMC1022プラスミドのプラスミド単位長に等しく、これ
ら植物がタンデム状に複製された該プラスミドのコピー
を含むことを示唆している。これら酵素の一方のみによ
る消化は、従って観測されたプラスミド−長さの断片を
生成するであろう。3.7kbの断片は、たぶん本来のトウ
モロコシDNAとの接合部における、該プラスミドの再配
列の結果であると思われる。
２度の付随的複製を、CFS5504植物の毛に授粉されるC
FS5504植物からの花粉を用いて、上記のような手順に従
って行った。この手順で得られた２つの植物を、生成し
た植物から無作為に選択し、APH3′IIにつきアッセイ
し、サザンブロット法で分析した。両植物ともAPH3′II
活性を示さなかったが、そのゲノム中には4.0kbのハイ
ブリッド断片が存在することが明らかとなった。
FS5504植物からの花粉を用いて、上記のような手順に従
って行った。この手順で得られた２つの植物を、生成し
た植物から無作為に選択し、APH3′IIにつきアッセイ
し、サザンブロット法で分析した。両植物ともAPH3′II
活性を示さなかったが、そのゲノム中には4.0kbのハイ
ブリッド断片が存在することが明らかとなった。
A188およびフリント（Flint）母系植物の花粉を用い
て同様に実施したもう一つの複製実験でも、その子孫か
ら無作為に一つの植物を選択して分析した。この植物の
葉はAPH3′II活性の点で正であり、かつサザンブロット
分析において4.0kbの断片が存在することが明らかとな
った。
て同様に実施したもう一つの複製実験でも、その子孫か
ら無作為に一つの植物を選択して分析した。この植物の
葉はAPH3′II活性の点で正であり、かつサザンブロット
分析において4.0kbの断片が存在することが明らかとな
った。
3.pCMC1022と他の遺伝子との併用 トウモロコシまたは他の植物中に興味ある他の遺伝子
を形質転換するために、プラスミドpCMC1022を数通りの
方法のいずれかで使用することができる。APH3′IIコー
ド配列は、pCMC1022をHindIIIおよびBamHIで消化するこ
とにより除去でき、かつ適当な末端をもつように調製さ
れた興味ある他の遺伝子配列をその位置に接合できる。
興味ある遺伝子を適切に選択できれば、上記プラスミド
を直接形質転換に使用できる。この対象とする遺伝子が
適当な調節配列とは別々に調製される場合、かつ選別可
能なマーカーが必要とされる場合には、調節配列をもつ
対象とする遺伝子を、pCMC1022中のCaMv35s配列の上流
側のポリリンカー内の任意のサイトに挿入できる。pCMC
1022の選別可能なマーカーを利用するもう一つの方法
は、対象とする遺伝子をpCMC1022または他の任意の植物
表現ベクタ中で調製し、pCMC1022および該遺伝子表現ベ
クタを一緒に、植物細胞中に形質転換するために上記し
たようにして、担体粒子上に被覆することである。
を形質転換するために、プラスミドpCMC1022を数通りの
方法のいずれかで使用することができる。APH3′IIコー
ド配列は、pCMC1022をHindIIIおよびBamHIで消化するこ
とにより除去でき、かつ適当な末端をもつように調製さ
れた興味ある他の遺伝子配列をその位置に接合できる。
興味ある遺伝子を適切に選択できれば、上記プラスミド
を直接形質転換に使用できる。この対象とする遺伝子が
適当な調節配列とは別々に調製される場合、かつ選別可
能なマーカーが必要とされる場合には、調節配列をもつ
対象とする遺伝子を、pCMC1022中のCaMv35s配列の上流
側のポリリンカー内の任意のサイトに挿入できる。pCMC
1022の選別可能なマーカーを利用するもう一つの方法
は、対象とする遺伝子をpCMC1022または他の任意の植物
表現ベクタ中で調製し、pCMC1022および該遺伝子表現ベ
クタを一緒に、植物細胞中に形質転換するために上記し
たようにして、担体粒子上に被覆することである。
プラスミドpCMC1022は、アメリカン タイプ カルチ
ャー コレクション（American Type Cultrue Collecti
on）（米国、メリーランド州、ロックビル、パークロー
ンドライブ 12301）に1986年11月14日付で、ATCC承認
番号第 として寄託されている。
ャー コレクション（American Type Cultrue Collecti
on）（米国、メリーランド州、ロックビル、パークロー
ンドライブ 12301）に1986年11月14日付で、ATCC承認
番号第 として寄託されている。
上記寄託はATCCと本発明の譲受人のパートナーである
セタス社（Cetus Corp.）との間の契約に従ってなされ
た。このATCCとの契約は、いずれが先にしろ、この寄託
を記載する並びにこれに関係する米国特許の発行もしく
はあらゆる米国もしくは外国特許出願の公開または公告
に際して、公に対してこれらセルラインの子孫の永久的
入手性を約定し、かつ35USC122章およびこれに関る委員
会規則（37CFR1.14章、特に886 O.G. 638を含む）に従
って権限の与えられた米国特許商標局長官により定めら
れた者に対するこれらのセルラインの子孫の入手性を規
定している。本出願の譲受人はこの寄託に関るセルライ
ンが、適当な条件の下で培養した際に死滅しもしくは失
われもしくは破壊された場合には、通知があり次第、即
座に同一のセルラインの生存培養体と交換することに同
意している。
セタス社（Cetus Corp.）との間の契約に従ってなされ
た。このATCCとの契約は、いずれが先にしろ、この寄託
を記載する並びにこれに関係する米国特許の発行もしく
はあらゆる米国もしくは外国特許出願の公開または公告
に際して、公に対してこれらセルラインの子孫の永久的
入手性を約定し、かつ35USC122章およびこれに関る委員
会規則（37CFR1.14章、特に886 O.G. 638を含む）に従
って権限の与えられた米国特許商標局長官により定めら
れた者に対するこれらのセルラインの子孫の入手性を規
定している。本出願の譲受人はこの寄託に関るセルライ
ンが、適当な条件の下で培養した際に死滅しもしくは失
われもしくは破壊された場合には、通知があり次第、即
座に同一のセルラインの生存培養体と交換することに同
意している。
本発明は寄託された微生物で規定される範囲に制限さ
れない。というのは、寄託した態様は本発明の局面の一
つを単に例示するものであり、機能的に同等なあらゆる
微生物が本発明の範囲に属するからである。事実、本明
細書に図示しかつ記載したものに加えて、本発明の種々
の変更が、上記記載から当業者には明らかであり、かつ
これらは上記特許請求の範囲にはいる。
れない。というのは、寄託した態様は本発明の局面の一
つを単に例示するものであり、機能的に同等なあらゆる
微生物が本発明の範囲に属するからである。事実、本明
細書に図示しかつ記載したものに加えて、本発明の種々
の変更が、上記記載から当業者には明らかであり、かつ
これらは上記特許請求の範囲にはいる。
また、ヌクレオチドに対して与えられたすべての塩基
対のサイズはおよその値であり、しかも記載の目的での
み使用されたものにすぎないことも理解すべきである。
対のサイズはおよその値であり、しかも記載の目的での
み使用されたものにすぎないことも理解すべきである。
第１図は、本発明の方法を実施するために組立てられた
装置の分解斜視図であり、 第２図は、プラスミドpCMC1208の製造工程中のプラスミ
ド処理操作を模式的に示す図であり、および 第３図は、プラスミドpCMC1022の製造工程におけるプラ
スミド処理操作を模式的に示す図である。 （主な参照番号） 10……加速器、12……スパーク放電室、14……電極、16
……スペーサリング、18……担体シート、20……支持ス
クリーン、22……ターゲット表面、24……液滴。
装置の分解斜視図であり、 第２図は、プラスミドpCMC1208の製造工程中のプラスミ
ド処理操作を模式的に示す図であり、および 第３図は、プラスミドpCMC1022の製造工程におけるプラ
スミド処理操作を模式的に示す図である。 （主な参照番号） 10……加速器、12……スパーク放電室、14……電極、16
……スペーサリング、18……担体シート、20……支持ス
クリーン、22……ターゲット表面、24……液滴。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブライアン ジェイ マーティネル アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53711 マディソン アイリッシュ レ ーン 4884
Claims (4)
- 【請求項１】生細胞中に遺伝物質担持担体粒子を注入す
るための装置であって、 薄い平坦な担体シート； 該担体シートの表面に付着した、遺伝物質を塗布した小
さな生物学的に不活性な、複数の担体粒子； 生細胞を有するターゲット表面； 開口を有する放電室を形成するボデー、前記担体シート
は該開口上に配置され、該開口を封鎖している； 前記担体粒子を有する担体シートを加速してターゲット
表面に向けて走行させるのに充分な衝撃波を該放電室中
で発生させる手段；及び、 放電室とターゲット表面の間にある担体シートの走行路
に配置された支持スクリーンを有し、そこで担体粒子は
担体シートから離れてターゲット表面に向かって走行す
るようになっていることを特徴とする装置。 - 【請求項２】生細胞中にDNA担持担体粒子を注入するた
めの装置であって、 スパーク放電室； 該スパーク放電室内に伸び、かつスパークギャップによ
り分離されている２つの電極、ここでこれら電極は外部
の高電圧放電源に接続されるようになっている； 上記スパーク放電室上方において垂直方向に移動し得る
ように間隔をおいて支持された担体シート、このシート
はその上に担体粒子を受けとる； 上記担体シート上方の所定位置に固定された支持スクリ
ーン；及び、 該支持スクリーン上方に間隔をおいて支持され、上記生
細胞を担持しているターゲット表面；ここで該ターゲッ
ト表面は上記放電室で衝撃波を発生するスパーク放電が
上記担体シートを上記支持スクリーンに加速して、上記
担体粒子を上記ターゲット表面上の細胞内に加速注入す
るように細胞を支持していることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の装置。 - 【請求項３】生細胞を含むターゲット中に遺伝物質担持
担体粒子を注入するための装置であって、 薄い平坦な担体シート； 該担体シートの表面に付着した、遺伝物質を塗布した小
さな生物学的に不活性な、複数の担体粒子； 開口を有する放電室を形成するボデー、前記担体シート
は該開口上に配置され、該開口を封鎖している； 前記担体粒子を有する担体シートを加速してターゲット
に向けて走行させるのに充分な衝撃波を該放電室中で発
生させる手段；及び、 放電室とターゲットの間にある担体シートの走行路に配
置された支持スクリーンであって、担体シートが加速さ
れた際に担体シートをターゲットで拘束するように配置
されかつ構成されている支持スクリーンを有し、そこで
担体粒子は担体シートから離れてターゲットに向かって
走行するようになっていることを特徴とする装置。 - 【請求項４】生細胞中にDNA担持担体粒子を注入するた
めの装置であって、 スパーク放電室； 該スパーク放電室内に伸び、かつスパークギャップによ
り分離されている２つの電極、ここでこれら電極は外部
の高電圧放電源に接続されるようになっている； 上記スパーク放電室上方において垂直方向に移動し得る
ように間隔をおいて支持された担体シート、このシート
はその上に担体粒子を受けとる； 上記担体シート上方の所定位置に固定された支持スクリ
ーン；及び、 該支持スクリーン上方に間隔をおいて支持され、上記生
細胞を担持しているターゲット表面；ここで該ターゲッ
ト表面は上記放電室で衝撃波を発生するスパーク放電が
上記担体シートを上記支持スクリーンに加速して、上記
担体粒子を上記ターゲット表面上の細胞内に加速注入す
るように細胞を支持していることを特徴とする特許請求
の範囲第３項記載の装置。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US93857086A | 1986-12-05 | 1986-12-05 | |
| US938570 | 1986-12-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63258525A JPS63258525A (ja) | 1988-10-26 |
| JP2606856B2 true JP2606856B2 (ja) | 1997-05-07 |
Family
ID=25471606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62307354A Expired - Lifetime JP2606856B2 (ja) | 1986-12-05 | 1987-12-04 | 生細胞中に遺伝物質担持担体粒子を注入するための装置 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0270356B1 (ja) |
| JP (1) | JP2606856B2 (ja) |
| CN (1) | CN1016574B (ja) |
| AT (1) | ATE106450T1 (ja) |
| AU (1) | AU610534B2 (ja) |
| BR (1) | BR8706531A (ja) |
| CA (1) | CA1339901C (ja) |
| DE (1) | DE3789941T2 (ja) |
| ES (1) | ES2056830T3 (ja) |
| IL (1) | IL84459A (ja) |
| IN (1) | IN169332B (ja) |
| NZ (1) | NZ222722A (ja) |
Cited By (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2007119796A1 (ja) | 2006-04-14 | 2007-10-25 | Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. | エフェクター機能を有するポリペプチド変異体 |
| WO2007132891A1 (ja) | 2006-05-16 | 2007-11-22 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | 物質の細胞内導入法 |
| WO2008038613A1 (fr) | 2006-09-25 | 2008-04-03 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Procédé de production de dipeptide |
| EP1908773A2 (en) | 2002-12-26 | 2008-04-09 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing dipeptides |
| EP1923464A1 (en) | 2002-08-30 | 2008-05-21 | Japan Science and Technology Agency | Ligase of a hyperthermostable bacterium and chip using the same |
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| WO2008090678A1 (ja) | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | 新規ペプチド |
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| WO2009041470A1 (ja) | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Shionogi & Co., Ltd. | チトクロームｐ４５０を用いたアダマンタン水酸化体の製造方法 |
| WO2009054435A1 (ja) | 2007-10-24 | 2009-04-30 | Otsuka Chemical Co., Ltd. | 増強されたエフェクター機能を有するポリペプチド |
| EP2107128A2 (en) | 1999-12-16 | 2009-10-07 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Novel polynucleotides |
| WO2010018847A1 (ja) | 2008-08-13 | 2010-02-18 | 協和発酵キリン株式会社 | 遺伝子組換えプロテインs組成物 |
| WO2010041715A1 (ja) | 2008-10-09 | 2010-04-15 | 協和メデックス株式会社 | 新規フルクトシルペプチドオキシダーゼ |
| EP2314686A1 (en) | 2000-10-06 | 2011-04-27 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions |
| WO2011108502A1 (ja) | 2010-03-02 | 2011-09-09 | 協和発酵キリン株式会社 | 改変抗体組成物 |
| WO2011118739A1 (ja) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | 協和発酵キリン株式会社 | 新規修飾部位導入抗体および抗体フラグメント |
| WO2012008298A1 (ja) | 2010-07-14 | 2012-01-19 | 住友ゴム工業株式会社 | イソプレンオリゴマー、ポリイソプレン、及びこれらの製造方法、ゴム組成物、並びに空気入りタイヤ |
| WO2014054804A1 (ja) | 2012-10-05 | 2014-04-10 | 協和発酵キリン株式会社 | ヘテロダイマータンパク質組成物 |
| WO2015005258A1 (ja) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 協和メデックス株式会社 | 糖化ヘキサペプチドオキシダーゼとその利用 |
| WO2015107920A1 (ja) | 2014-01-20 | 2015-07-23 | 住友ゴム工業株式会社 | シス型プレニルトランスフェラーゼ及びＮｏｇｏ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒを発現する形質転換体 |
| EP3059317A1 (en) | 2015-02-23 | 2016-08-24 | Sumitomo Rubber Industries, Ltd. | Vector comprising specific promoter and gene encoding specific protein, transgenic plant into which the vector has been introduced, and method for improving polyisoprenoid production by introducing the vector into plant |
| EP3059315A1 (en) | 2015-02-23 | 2016-08-24 | Sumitomo Rubber Industries, Ltd. | Vector comprising specific promoter and gene encoding specific protein, transgenic plant into which the vector has been introduced, and method for improving polyisoprenoid production by introducing the vector into plant |
| EP3059316A1 (en) | 2015-02-23 | 2016-08-24 | Sumitomo Rubber Industries, Ltd. | Vector comprising specific promoter and gene encoding specific protein, transgenic plant into which the vector has been introduced, and method for improving polyisoprenoid production by introducing the vector into plant |
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