JPS63258525A - 生細胞中に遺伝物質担持担体粒子を注入するための装置 - Google Patents
生細胞中に遺伝物質担持担体粒子を注入するための装置Info
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- JPS63258525A JPS63258525A JP62307354A JP30735487A JPS63258525A JP S63258525 A JPS63258525 A JP S63258525A JP 62307354 A JP62307354 A JP 62307354A JP 30735487 A JP30735487 A JP 30735487A JP S63258525 A JPS63258525 A JP S63258525A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
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- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
- C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は一般的に植物の遺伝子工学の分野に関し、特に
遺伝物質を植物の花粉中に物理的に注入することによる
、外因性遺伝物質の該植物系の生殖系内での形質転換に
関するものである。
遺伝物質を植物の花粉中に物理的に注入することによる
、外因性遺伝物質の該植物系の生殖系内での形質転換に
関するものである。
（従来の技術）
多くの努力並びに研究が植物種の遺伝的形質転換に向け
られている。外来遺伝子により植物生殖系を形質転換す
るのに有効な手段を開発することによって、工業的に重
要な作物種の遺伝的系統の多様性が拡大され、しかも特
別に興味のある機能をもつ遺伝子を選択的に作物種内に
導入し得るものと考えられている。植物種の形質転換、
即ち遺伝子工学に関する今日までの努力および研究は、
植物の種に大きく依存して変化する結果をもたらした。
られている。外来遺伝子により植物生殖系を形質転換す
るのに有効な手段を開発することによって、工業的に重
要な作物種の遺伝的系統の多様性が拡大され、しかも特
別に興味のある機能をもつ遺伝子を選択的に作物種内に
導入し得るものと考えられている。植物種の形質転換、
即ち遺伝子工学に関する今日までの努力および研究は、
植物の種に大きく依存して変化する結果をもたらした。
外因性遺伝子を植物中に導入するのに従来利用されてい
た主な機構は、原形質体としての、あるいはカルスとし
て知られている未分化組織塊中での単一の植物細胞の形
質転換から出発していた。
た主な機構は、原形質体としての、あるいはカルスとし
て知られている未分化組織塊中での単一の植物細胞の形
質転換から出発していた。
植物細胞中でのキメラ遺伝子の機能は、エレクトロボー
レーションおよびマイクロインジェクションにより、単
一の植物細胞原形質体中に導入されている。しかしなが
ら、これまでに利用されている最も汎用性の形質転換技
術は、植物病原体アグロバクテリウム ツメファシェン
ス（ハ弾小旦工しｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
）の天然の特性を利用することである。該病原体はその
中に含まれているＴｉ （腫瘍誘起：工ｕｍｏｒ−±ｎ
ｄｕｃｉｎｇ）プラスミドからのＤＮＡの一部を感染植
物細胞中に移すという固有の能力を有している。Ｔｉプ
ラスミドからのある配列を担持するアグロバクテリウム
（担「舅狙劇但匝１り一部のプラスミドに外来遺伝子を
挿入することにより、感染植物細胞のゲノム内に該外来
遺伝子を移すのに、この細菌性の形質転換特性を利用で
きる。アゲロバクチ冨ウム（紅匹ｂ −ａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）−媒介植物細胞形質転換は、タバコ、ペチュニア、
人参などの多くのモデル作物種において極めて妥当に作
用することがわかっているが、２つの重大な制限をこう
むる。第１の制限は、この媒介は単に個々の細胞レベル
、典型的には体組織に対してなし得るのみであり、従っ
て全植物において人為的に再生される必要があることで
ある。
レーションおよびマイクロインジェクションにより、単
一の植物細胞原形質体中に導入されている。しかしなが
ら、これまでに利用されている最も汎用性の形質転換技
術は、植物病原体アグロバクテリウム ツメファシェン
ス（ハ弾小旦工しｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
）の天然の特性を利用することである。該病原体はその
中に含まれているＴｉ （腫瘍誘起：工ｕｍｏｒ−±ｎ
ｄｕｃｉｎｇ）プラスミドからのＤＮＡの一部を感染植
物細胞中に移すという固有の能力を有している。Ｔｉプ
ラスミドからのある配列を担持するアグロバクテリウム
（担「舅狙劇但匝１り一部のプラスミドに外来遺伝子を
挿入することにより、感染植物細胞のゲノム内に該外来
遺伝子を移すのに、この細菌性の形質転換特性を利用で
きる。アゲロバクチ冨ウム（紅匹ｂ −ａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）−媒介植物細胞形質転換は、タバコ、ペチュニア、
人参などの多くのモデル作物種において極めて妥当に作
用することがわかっているが、２つの重大な制限をこう
むる。第１の制限は、この媒介は単に個々の細胞レベル
、典型的には体組織に対してなし得るのみであり、従っ
て全植物において人為的に再生される必要があることで
ある。
このことは、アグロバクテリウム ７一旦憇）感染に敏
感な型の組織から容易に再生できる作物種に対する、該
アグロバクテリウム（八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）
−媒介遺伝的形質転換の応用性を制限する。第２の制限
は、アグロバクテリウム（九ユ血虱肛籾Ｌ）の天然宿主
範囲が双子葉植物および限られた数のユリ科の単子葉植
物種のみを含むにすぎないことである。従って、この７
グロバクテリウム（ハ皿匝且肛ｉｕｍ ）−媒介形質転
換技術は、穀類作物種などの商業的に興味ある単子葉植
物種に対する有効な手段ではないことが立証された。ア
グロバクテリウム（知り匹圏粁堕）−媒介形質転換技術
に係るもう一つの難点はソモクローナル（ｓｏｍｏｃｌ
ｏｎａｌ）変種の発生であり、これは組織培養中の植物
組織内で自然に起こり、形質転換体の識別を複雑化する
恐れがある。
感な型の組織から容易に再生できる作物種に対する、該
アグロバクテリウム（八ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）
−媒介遺伝的形質転換の応用性を制限する。第２の制限
は、アグロバクテリウム（九ユ血虱肛籾Ｌ）の天然宿主
範囲が双子葉植物および限られた数のユリ科の単子葉植
物種のみを含むにすぎないことである。従って、この７
グロバクテリウム（ハ皿匝且肛ｉｕｍ ）−媒介形質転
換技術は、穀類作物種などの商業的に興味ある単子葉植
物種に対する有効な手段ではないことが立証された。ア
グロバクテリウム（知り匹圏粁堕）−媒介形質転換技術
に係るもう一つの難点はソモクローナル（ｓｏｍｏｃｌ
ｏｎａｌ）変種の発生であり、これは組織培養中の植物
組織内で自然に起こり、形質転換体の識別を複雑化する
恐れがある。
少なくともいくつかのキメラ遺伝子構造が、多くの植物
細胞中での外来遺伝子の表現に有効であることが立証さ
れている。単子葉類および双子葉類におけるこれらキメ
ラ構造の機能は、エレクトロボーレーションなどの技術
により、培養液中でのトウモロコシ原形質体の形質転換
により証明されている。しかしながら、従来知られてい
る方法の中には、このような原形質体から、全トウモロ
コシあるいは他のすべての重要な作物種の植物を再生で
きるものはない。例えば、再生された完全な形質転換ト
ウモロコシは知られていない。それにも拘らず、・一般
の植物作物の大きな農業的価値並びにこれらの価値およ
び生産性を改善する可能性の故に、トウモロコシおよび
他の作物種の系の遺伝的形質転換が望ましい対象となっ
ている。
細胞中での外来遺伝子の表現に有効であることが立証さ
れている。単子葉類および双子葉類におけるこれらキメ
ラ構造の機能は、エレクトロボーレーションなどの技術
により、培養液中でのトウモロコシ原形質体の形質転換
により証明されている。しかしながら、従来知られてい
る方法の中には、このような原形質体から、全トウモロ
コシあるいは他のすべての重要な作物種の植物を再生で
きるものはない。例えば、再生された完全な形質転換ト
ウモロコシは知られていない。それにも拘らず、・一般
の植物作物の大きな農業的価値並びにこれらの価値およ
び生産性を改善する可能性の故に、トウモロコシおよび
他の作物種の系の遺伝的形質転換が望ましい対象となっ
ている。
以前に、トウモロコシは一般にその花粉の遺伝的形質転
換により形質転換し得るという、少なくとも一つの示唆
があった。公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ３５１（１０）８５
６号は、顕花植物の花粉を形質転換することで、外因性
遺伝子を該顕花植物に移す方法を開示している。この技
術を立証するためになされた他の研究者の試み並びに該
実験の再現は失敗に帰している〔サンフォード（Ｓａｎ
ｆｏｒｄ）等、セオリー オブ アプライド ジエネテ
ィソクス（Ｔｈｅｏｒ、 Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、）
、１９８５．６９（５−６） 、５７１−７４参照〕。
換により形質転換し得るという、少なくとも一つの示唆
があった。公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ３５１（１０）８５
６号は、顕花植物の花粉を形質転換することで、外因性
遺伝子を該顕花植物に移す方法を開示している。この技
術を立証するためになされた他の研究者の試み並びに該
実験の再現は失敗に帰している〔サンフォード（Ｓａｎ
ｆｏｒｄ）等、セオリー オブ アプライド ジエネテ
ィソクス（Ｔｈｅｏｒ、 Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、）
、１９８５．６９（５−６） 、５７１−７４参照〕。
同様な結果の報告が、オーク（０ｈｔａ ） 、ブロシ
ーデインダスオブ ナショナル アカデミ−オブ サイ
エンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ） ＵＳＡ％１９８６．８３．７１５−７１
９になされている。
ーデインダスオブ ナショナル アカデミ−オブ サイ
エンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 ） ＵＳＡ％１９８６．８３．７１５−７１
９になされている。
（発明が解決しようとする問題点および問題点解決のた
めの手段） 一般的に、本発明は植物系を遺伝的に形質転換する方法
に関し、該方法は以下の工程を含む。即ち、外来遺伝子
および調節配列を含むＤＮＡ配列を調製する工程；該Ｄ
ＮＡ配列を生物的に不活性な粒子上に塗布する工程；該
植物の花粉に対して該ＤＮＡ担持粒子を物理的に加速し
て、該粒子を該花粉内に打ち込む工程；該花粉で雌性親
植物を授粉する工程および該授粉した子孫から形質転換
された植物を選択する工程を含む。
めの手段） 一般的に、本発明は植物系を遺伝的に形質転換する方法
に関し、該方法は以下の工程を含む。即ち、外来遺伝子
および調節配列を含むＤＮＡ配列を調製する工程；該Ｄ
ＮＡ配列を生物的に不活性な粒子上に塗布する工程；該
植物の花粉に対して該ＤＮＡ担持粒子を物理的に加速し
て、該粒子を該花粉内に打ち込む工程；該花粉で雌性親
植物を授粉する工程および該授粉した子孫から形質転換
された植物を選択する工程を含む。
本発明は、また挿入された外来遺伝子の表現機能をもつ
トウモロコシ系をも目的とするものである。
トウモロコシ系をも目的とするものである。
本発明は更に、植物を組織培養または再生する必要なし
に、花粉の形質転換を通して、トウモロコシのみでなく
他の重要な植物作物を遺伝的に形質転換することをも目
的とする。
に、花粉の形質転換を通して、トウモロコシのみでなく
他の重要な植物作物を遺伝的に形質転換することをも目
的とする。
本発明の利点の一つは、上記方法が比較的迅速かつ高効
率で容易に実証でき、しかも再現可能である点にある。
率で容易に実証でき、しかも再現可能である点にある。
本発明の方法並びに該方法により作られる物質の利点の
一つは、特徴付けされたまたはされていない外来遺伝子
物質が、作物の品種改良、分子生物学的、または他の同
様な耕種学的または科学的目的で、トウモロコシの任意
の所定の遺伝子バックグラウンドに容易にかつ迅速に導
入できることである。
一つは、特徴付けされたまたはされていない外来遺伝子
物質が、作物の品種改良、分子生物学的、または他の同
様な耕種学的または科学的目的で、トウモロコシの任意
の所定の遺伝子バックグラウンドに容易にかつ迅速に導
入できることである。
本発明の方法の付随的な利点は、従来の体細胞形質転換
技術またはマイクロインジェクション法と比較して、該
方法の実施が容易であることから、多数の、即ち数千に
も及ぶ形質転換が実施可能である点にある。上記従来法
は実施が困難である。
技術またはマイクロインジェクション法と比較して、該
方法の実施が容易であることから、多数の、即ち数千に
も及ぶ形質転換が実施可能である点にある。上記従来法
は実施が困難である。
即ち、細胞毎の処理が必要とされる。
本発明の他の目的、利点並びに特徴は以下の添付図面を
参照しつつ記載される明細書の記述から明らかとなろう
。
参照しつつ記載される明細書の記述から明らかとなろう
。
（発明の好ましい態様）
本発明に従って実施する花粉−媒介植物遺伝的形質転換
においては、ＤＮＡが植物花粉の細胞質ゾル中に物理的
に注入され、該ＤＮＡは生物的に不活性な物質の個々の
小さな粒子上に担持されており、該粒子は花粉に加速さ
れて、花粉細胞を破壊かつその能力を損うことなしに個
々の花粉細胞中に侵入する。このようにして注入される
ＤＮＡはこの花粉の子孫の遺伝物質内に組込まれること
になる。かくして、このように花粉を形質転換すること
により、植物並びに植物系の遺伝子工学が可能となる。
においては、ＤＮＡが植物花粉の細胞質ゾル中に物理的
に注入され、該ＤＮＡは生物的に不活性な物質の個々の
小さな粒子上に担持されており、該粒子は花粉に加速さ
れて、花粉細胞を破壊かつその能力を損うことなしに個
々の花粉細胞中に侵入する。このようにして注入される
ＤＮＡはこの花粉の子孫の遺伝物質内に組込まれること
になる。かくして、このように花粉を形質転換すること
により、植物並びに植物系の遺伝子工学が可能となる。
花粉−媒介形質転換の首尾に影響を及ぼす因子がいくつ
かある。上記粒子を加速する方法は、該花粉と接触させ
て、花粉細胞を生物学的に無能とすることなしに実質的
な数の花粉細胞中に該粒子を侵入させる際、個々のＤＮ
Ａ−担持粒子が適度な運動量並びに速度を有し、しかも
該粒子自体が比較的均一なパターンとなるように注意し
て計画することが好ましい。更に、該粒子上のＤＮＡは
安定でかつ植物細胞を形質転換し得るものであり、しか
も該植物細胞中の望ましい特性を表現し得るものでなけ
ればならない。その上、このＤＮＡ自体は、形質転換さ
れたと思われる植物種子または苗を検出し得る選択可能
なマーカーを含んでいて、遺伝的形質転換が起こってい
る特定の植物を識別できるものである必要がある。形質
転換頻度が十分に高い場合には、かかる選択可能なマー
カーは不要となるかも知れない。
かある。上記粒子を加速する方法は、該花粉と接触させ
て、花粉細胞を生物学的に無能とすることなしに実質的
な数の花粉細胞中に該粒子を侵入させる際、個々のＤＮ
Ａ−担持粒子が適度な運動量並びに速度を有し、しかも
該粒子自体が比較的均一なパターンとなるように注意し
て計画することが好ましい。更に、該粒子上のＤＮＡは
安定でかつ植物細胞を形質転換し得るものであり、しか
も該植物細胞中の望ましい特性を表現し得るものでなけ
ればならない。その上、このＤＮＡ自体は、形質転換さ
れたと思われる植物種子または苗を検出し得る選択可能
なマーカーを含んでいて、遺伝的形質転換が起こってい
る特定の植物を識別できるものである必要がある。形質
転換頻度が十分に高い場合には、かかる選択可能なマー
カーは不要となるかも知れない。
生物的に不活性な小さい担体粒子を加速することを可能
とする多くの型の装置がある。可能な機構は粒子の弾劾
爆発加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｅｘｐｌｏｓｉｖｅａ
ｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ）、粒子の遠心加速、粒子の
静電加速または小さな不活性粒子に運動量および速度を
付与し得る任意の他の類似のシステムを含む。本出願人
による一つの好ましい新規な方法は添付第１図に模式的
に示されている。ここで図示した方法は高電圧放電によ
り発生させた衝撃波を利用する。この方法を用いる不活
性粒子を加速するための加速器は第１図において一般に
参照番号ｌＯで示されている。第１図においてターゲッ
ト表面は一般に参照番号２２で示され、これはその上に
花粉ターゲットを担持している。
とする多くの型の装置がある。可能な機構は粒子の弾劾
爆発加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｅｘｐｌｏｓｉｖｅａ
ｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ）、粒子の遠心加速、粒子の
静電加速または小さな不活性粒子に運動量および速度を
付与し得る任意の他の類似のシステムを含む。本出願人
による一つの好ましい新規な方法は添付第１図に模式的
に示されている。ここで図示した方法は高電圧放電によ
り発生させた衝撃波を利用する。この方法を用いる不活
性粒子を加速するための加速器は第１図において一般に
参照番号ｌＯで示されている。第１図においてターゲッ
ト表面は一般に参照番号２２で示され、これはその上に
花粉ターゲットを担持している。
この加速器ｌＯは数個の部品からなっている。
スパーク放電室１２が設けられ、その内部には一対の電
極１４が伸びている。このスパーク放電室１２の幾何形
状は本発明において特に制限はないが、この室が、上記
担体粒子を推進するのに利用できる適当な特性および方
向をもつ衝撃波を発生かつ存在せしめるように設計され
ていることを条件とする。本出願人は、内径１３ｍｍの
ポリ塩化ビニル樹脂パイプの一部がスパーク放電部１２
として使用するのに満足なものであることを見出した。
極１４が伸びている。このスパーク放電室１２の幾何形
状は本発明において特に制限はないが、この室が、上記
担体粒子を推進するのに利用できる適当な特性および方
向をもつ衝撃波を発生かつ存在せしめるように設計され
ていることを条件とする。本出願人は、内径１３ｍｍの
ポリ塩化ビニル樹脂パイプの一部がスパーク放電部１２
として使用するのに満足なものであることを見出した。
電極１４は該室内で反対方向に伸び、スパーク放電室１
２の上部から約５ｍｍ下方に取付けられている。電極１
４自体はスパーク放電室１２の壁の内側面に形成された
適当なねじ穴内に伸びたねし山のあるボルトで形成され
ている。電極１４をなすねし山をもつボルトの端部は、
電弧耐性合金で保護され、該合金は寸法約２ｍｍ Ｘ
２ｍｍ Ｘ ３ ｔａに切断された高電圧リレー接点か
ら得られ、かつ咳ねし山のあるボルトの端部に溶接され
ている。電極１４間のギャップは、適宜該ボルトをスパ
ーク放電室１２内にねじ込むか、あるいはそこからねし
出すことにより調節できる。電極末端間に約１５ＫＶの
放電々圧を設定するのに好ましいギャップは１〜１．５
鶴である。電極を作製し、取付ける方法には明らかに広
範囲の変更が可能である。しかし、電極は高い耐久性を
もち、しかも電極間のスパークギャップの距離は容易に
調節できるものであることが好ましい。
２の上部から約５ｍｍ下方に取付けられている。電極１
４自体はスパーク放電室１２の壁の内側面に形成された
適当なねじ穴内に伸びたねし山のあるボルトで形成され
ている。電極１４をなすねし山をもつボルトの端部は、
電弧耐性合金で保護され、該合金は寸法約２ｍｍ Ｘ
２ｍｍ Ｘ ３ ｔａに切断された高電圧リレー接点か
ら得られ、かつ咳ねし山のあるボルトの端部に溶接され
ている。電極１４間のギャップは、適宜該ボルトをスパ
ーク放電室１２内にねじ込むか、あるいはそこからねし
出すことにより調節できる。電極末端間に約１５ＫＶの
放電々圧を設定するのに好ましいギャップは１〜１．５
鶴である。電極を作製し、取付ける方法には明らかに広
範囲の変更が可能である。しかし、電極は高い耐久性を
もち、しかも電極間のスパークギャップの距離は容易に
調節できるものであることが好ましい。
スペーサリング１６がスパーク放電室１２の上方に設置
されている。このスペーサリング１６はスパーク放電室
１２と同じＰｖＣバイブで形成でき、垂直方向の長さ６
龍に切断されていることが好ましい。単一の作物種の形
質転換用に設定された装置においては、スペーサリング
１６はスパーク放電室１２を単に垂直方向に延長するだ
けで構成できる。但し、取りはずし可能かつ交換可能な
スペーサリング１６の使用により、変更されるスパーク
放電から担体シートまでの距離を調節でき、その結果粒
子を加速する力を条件毎にあるいは植物種毎に変えるこ
とができる。大きな担体シートを用いる場合には、スペ
ーサリング１６はその上部を開放したままとすることが
でき、また適当なり、ロージャーにより部分的にその上
部開口部を制限して、約９Ｘ１３ｎの寸法の矩形開口を
形成することも有利である。スペーサ１６の頂部には担
体シート１８が配置されている。この担体シート１８は
スペーサリング１６の頂部に配置されるように適当なサ
イズに形成された平坦で軽量のシートである。担体シー
ト１８は、その上に生物的に不活性な小粒子を担持し得
る、可撓性の生物的に不活性のシート材料から形成され
ている。この担体シート１８は、スパーク放電により発
生する衝撃波の力を該担体粒子の加速度に変える機能を
もつ。担体シート１８は有利には１ミルまたは０．５ミ
ルのプラスチック被覆アルミニウムメッキマイラーから
形成され、好ましくは０．５ミルのシートである。とい
うのは、これらが実際に良好な花粉中への侵入をもたら
すからである。一般的な実施に際しては、担体シート１
８の実際の表面積が小さい程、該担体粒子の花粉中への
良好な侵入が達成される。この侵入に関する考察は担体
シートがある寸法をもたねばならないという要件により
調和される。該寸法とは取扱いが容易であり、かつ各注
入において多数の花粉細胞を衝撃するのに十分に大きな
領域に亘る衝撃パターンを与えるようなものである。９
Ｘ１１ｕという寸法の担体シートが、花粉ターゲットに
所定の粒子衝撃パターンで粒子の良好な侵入を与える、
良好な寸法をもたらすことがわかった。
されている。このスペーサリング１６はスパーク放電室
１２と同じＰｖＣバイブで形成でき、垂直方向の長さ６
龍に切断されていることが好ましい。単一の作物種の形
質転換用に設定された装置においては、スペーサリング
１６はスパーク放電室１２を単に垂直方向に延長するだ
けで構成できる。但し、取りはずし可能かつ交換可能な
スペーサリング１６の使用により、変更されるスパーク
放電から担体シートまでの距離を調節でき、その結果粒
子を加速する力を条件毎にあるいは植物種毎に変えるこ
とができる。大きな担体シートを用いる場合には、スペ
ーサリング１６はその上部を開放したままとすることが
でき、また適当なり、ロージャーにより部分的にその上
部開口部を制限して、約９Ｘ１３ｎの寸法の矩形開口を
形成することも有利である。スペーサ１６の頂部には担
体シート１８が配置されている。この担体シート１８は
スペーサリング１６の頂部に配置されるように適当なサ
イズに形成された平坦で軽量のシートである。担体シー
ト１８は、その上に生物的に不活性な小粒子を担持し得
る、可撓性の生物的に不活性のシート材料から形成され
ている。この担体シート１８は、スパーク放電により発
生する衝撃波の力を該担体粒子の加速度に変える機能を
もつ。担体シート１８は有利には１ミルまたは０．５ミ
ルのプラスチック被覆アルミニウムメッキマイラーから
形成され、好ましくは０．５ミルのシートである。とい
うのは、これらが実際に良好な花粉中への侵入をもたら
すからである。一般的な実施に際しては、担体シート１
８の実際の表面積が小さい程、該担体粒子の花粉中への
良好な侵入が達成される。この侵入に関する考察は担体
シートがある寸法をもたねばならないという要件により
調和される。該寸法とは取扱いが容易であり、かつ各注
入において多数の花粉細胞を衝撃するのに十分に大きな
領域に亘る衝撃パターンを与えるようなものである。９
Ｘ１１ｕという寸法の担体シートが、花粉ターゲットに
所定の粒子衝撃パターンで粒子の良好な侵入を与える、
良好な寸法をもたらすことがわかった。
また、該担体シートは、粒子がターゲット表面と接触し
た際に、該粒子のパターンを配列する機能をもつ。粒子
の均一なパターンが極めて望ましく、これによって出き
る限り多数のターゲット上の細胞が衝撃を受けて形質転
換体の収率を最大にすることが保証される。形質転換さ
れなかった細胞、花粉またはその他のものは形質転換体
と競合的優勢（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｄｖａｎｔ
ａｇｅ ）状態にあるか、あるいは担体粒子によって部
分的に弱化されているかも知れない。従って、できるだ
けターゲット細胞中に１（１１）％注入することが望ま
しく、かつ担体シート１８上の粒子の均一層およびパタ
ーンはこの目的を援助する。
た際に、該粒子のパターンを配列する機能をもつ。粒子
の均一なパターンが極めて望ましく、これによって出き
る限り多数のターゲット上の細胞が衝撃を受けて形質転
換体の収率を最大にすることが保証される。形質転換さ
れなかった細胞、花粉またはその他のものは形質転換体
と競合的優勢（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｄｖａｎｔ
ａｇｅ ）状態にあるか、あるいは担体粒子によって部
分的に弱化されているかも知れない。従って、できるだ
けターゲット細胞中に１（１１）％注入することが望ま
しく、かつ担体シート１８上の粒子の均一層およびパタ
ーンはこの目的を援助する。
担体粒子自体について、生物的に不活性な任意の高密度
材料が、本発明の範囲内のＤＮＡ担体粒子として使用す
るのに有利である。金属材料が好ましい。例えば、密度
１９を有するタングステンおよび金などの金属材料が好
ましい。密度２２のイリジウムも好ましいが、本出願人
はこれを使用しない。というのは、比較的粗い粉末とし
てのみ入手が容易であるにすぎないからである。本発明
では球形粒子が好ましい。金と比較するとタングステン
は余り好ましいとはいえない。というのは、わずかに痕
跡の水分の存在下でさえ空気中で酸化され易いからであ
る。担体粒子上にこのような酸化層があると、粒子同志
が互に結合して凝集するのに伴って平均粒径が著しく大
きくなる傾向を示す。不規則な凝集により団塊化した粒
子は本発明の実施にとって望ましくない。なんとなれば
、このような凝集は該粒子の質量および寸法を大巾に変
化させ、その結果規則的かつ反復性のある結果を得るこ
とを困難にするからである。金が本発明の範囲内の粒子
用の最適の材料であることがわかった。というのは、金
は高密度で、比較的生物的物質に対して不活性でありか
つ酸化に対し安定であり、しかも１〜３μｍの径の球状
のものが市販品として容易に入手できるからである。適
当なりＮＡ配列を金粒子に適用でき、かつ金粒子は以下
に詳細に議論するような方法で担体粒子に適用できる。
材料が、本発明の範囲内のＤＮＡ担体粒子として使用す
るのに有利である。金属材料が好ましい。例えば、密度
１９を有するタングステンおよび金などの金属材料が好
ましい。密度２２のイリジウムも好ましいが、本出願人
はこれを使用しない。というのは、比較的粗い粉末とし
てのみ入手が容易であるにすぎないからである。本発明
では球形粒子が好ましい。金と比較するとタングステン
は余り好ましいとはいえない。というのは、わずかに痕
跡の水分の存在下でさえ空気中で酸化され易いからであ
る。担体粒子上にこのような酸化層があると、粒子同志
が互に結合して凝集するのに伴って平均粒径が著しく大
きくなる傾向を示す。不規則な凝集により団塊化した粒
子は本発明の実施にとって望ましくない。なんとなれば
、このような凝集は該粒子の質量および寸法を大巾に変
化させ、その結果規則的かつ反復性のある結果を得るこ
とを困難にするからである。金が本発明の範囲内の粒子
用の最適の材料であることがわかった。というのは、金
は高密度で、比較的生物的物質に対して不活性でありか
つ酸化に対し安定であり、しかも１〜３μｍの径の球状
のものが市販品として容易に入手できるからである。適
当なりＮＡ配列を金粒子に適用でき、かつ金粒子は以下
に詳細に議論するような方法で担体粒子に適用できる。
担体粒子１８の上方には支持スクリーン２０がある。こ
の支持スクリーン２０は、スペーサリング１６の頂部上
方約５１鳳の位置のプラスチックホルダ内に物理的に取
付けられた１（１１）メツシユのステンレススチールス
クリーンである。この支持スクリーン２０は、担体シー
）１８がターゲットの方向に進まないように該シート１
８を維持する機能をもつ。
の支持スクリーン２０は、スペーサリング１６の頂部上
方約５１鳳の位置のプラスチックホルダ内に物理的に取
付けられた１（１１）メツシユのステンレススチールス
クリーンである。この支持スクリーン２０は、担体シー
）１８がターゲットの方向に進まないように該シート１
８を維持する機能をもつ。
ターゲット表面２２は、その上にターゲット細胞、即ち
花粉または他の植物細胞を懸垂できる材料の平坦なシー
トである。実際に、容易に使用し得るターゲットは、支
持スクリーンを支持しているアセンブリの頂部上で逆向
きにされた６０龍×１５璽皇のペトリ皿であることがわ
かった。従って、この支持スクリーン２０からターゲッ
ト表面２２上のターゲット細胞までの距離は約１５ｍで
あることが好ましい。以下に述べる電圧および大気圧条
件下で、１５ｍ１を越える距離は花粉中への担体粒子の
低い侵入率を与え、一方１０ｍに満たない距離は細胞の
破壊を生じ、爆風の作用の下で支持スクリーン２０の変
形をも生ずる。
花粉または他の植物細胞を懸垂できる材料の平坦なシー
トである。実際に、容易に使用し得るターゲットは、支
持スクリーンを支持しているアセンブリの頂部上で逆向
きにされた６０龍×１５璽皇のペトリ皿であることがわ
かった。従って、この支持スクリーン２０からターゲッ
ト表面２２上のターゲット細胞までの距離は約１５ｍで
あることが好ましい。以下に述べる電圧および大気圧条
件下で、１５ｍ１を越える距離は花粉中への担体粒子の
低い侵入率を与え、一方１０ｍに満たない距離は細胞の
破壊を生じ、爆風の作用の下で支持スクリーン２０の変
形をも生ずる。
花粉をターゲット細胞として用いる場合、この花粉はタ
ーゲットが生きている花粉と逆転されるように該ターゲ
ットに適用しなければならない。
ーゲットが生きている花粉と逆転されるように該ターゲ
ットに適用しなければならない。
一般に、花粉は湿度に敏感であるので、ターゲットに花
粉を付着する方法はできる限り湿度を含まないものでな
ければならない。この接着には鉱油が有用であることが
わかった。ターゲット表面２２として使用されるベトリ
皿の低部に鉱油の薄層を適用した場合、花粉はこの皿内
に振りまかれ、次いで皿を反転させて過剰の花粉を除く
。これにより、比較的均一な花粉粒の単層がターゲット
上に残され、該花粉粒は粒子注入中しかるべき位置に保
たれ、かつ生存している。花粉以外の細胞をこの装置で
用いる場合には、例えば寒天などの他の支持媒体がより
好ましい。
粉を付着する方法はできる限り湿度を含まないものでな
ければならない。この接着には鉱油が有用であることが
わかった。ターゲット表面２２として使用されるベトリ
皿の低部に鉱油の薄層を適用した場合、花粉はこの皿内
に振りまかれ、次いで皿を反転させて過剰の花粉を除く
。これにより、比較的均一な花粉粒の単層がターゲット
上に残され、該花粉粒は粒子注入中しかるべき位置に保
たれ、かつ生存している。花粉以外の細胞をこの装置で
用いる場合には、例えば寒天などの他の支持媒体がより
好ましい。
粒子加速器１０およびターゲット表面２２の完全なアセ
ンブリは部分的に排気して、大気の抗力のために粒子お
よび／または担体シート１８が減速されるのを防止する
必要がある。この真空はわずかな部分的真空であるべき
である。というのは高真空度はターゲット花粉細胞を乾
燥してしまい、これらを死滅させるからである。４６０
〜４８０ｍＨｇの真空で十分かつ有利であることがわか
った。
ンブリは部分的に排気して、大気の抗力のために粒子お
よび／または担体シート１８が減速されるのを防止する
必要がある。この真空はわずかな部分的真空であるべき
である。というのは高真空度はターゲット花粉細胞を乾
燥してしまい、これらを死滅させるからである。４６０
〜４８０ｍＨｇの真空で十分かつ有利であることがわか
った。
第１図の装置の動作の最も簡単な説明において加速器１
０を始動する工程は、電極１４間に蒸留水または脱イオ
ン水の液滴２４を配置することで開始する。水の量は、
電極間に生ずる電弧を減衰せず、しかも放電が起こった
際にスパーク放電室１２の内部に衝撃波を生ずるのに十
分な体積となるように選ばれなければならない。好まし
い水の体積は、約２〜４ｍｌであることがわかっている
。
０を始動する工程は、電極１４間に蒸留水または脱イオ
ン水の液滴２４を配置することで開始する。水の量は、
電極間に生ずる電弧を減衰せず、しかも放電が起こった
際にスパーク放電室１２の内部に衝撃波を生ずるのに十
分な体積となるように選ばれなければならない。好まし
い水の体積は、約２〜４ｍｌであることがわかっている
。
この量の水は電極１４の端部間に懸垂されたピペットで
適用することができる。この水滴２４は電極間のギャッ
プを橋絡し、かつ所定の位置を保つ。
適用することができる。この水滴２４は電極間のギャッ
プを橋絡し、かつ所定の位置を保つ。
次いで、スペーサリング１６をスパーク放電室１２の頂
部に配置し、担体シート１８をスペーサリング１６の頂
部に設置する。支持スクリーン２０を担体シート１８の
上方５龍の位置に取付け、逆さのペトリ皿からなるター
ゲット表面２２を支持スクリーン２０の取付は位置上方
に配置する。
部に配置し、担体シート１８をスペーサリング１６の頂
部に設置する。支持スクリーン２０を担体シート１８の
上方５龍の位置に取付け、逆さのペトリ皿からなるター
ゲット表面２２を支持スクリーン２０の取付は位置上方
に配置する。
次いで、このアセンブリを４８０ ｍｍ１１ｇに排気す
る。
る。
第１図に示した装置の外部には電圧源が接続されていて
、これは１５．（１１）０ Ｖの直流電圧を発生する。
、これは１５．（１１）０ Ｖの直流電圧を発生する。
この１５．（１１）０ Ｖの直流電圧は１μＦのキャパ
シタに印加され、該キャパシタは次いで電圧源から遮断
される。適当なスイッチを連絡させることにより、キャ
パシタに充電された１５．（１１）０ Ｖの電圧は次い
で電極１４間に印加される。
シタに印加され、該キャパシタは次いで電圧源から遮断
される。適当なスイッチを連絡させることにより、キャ
パシタに充電された１５．（１１）０ Ｖの電圧は次い
で電極１４間に印加される。
この電圧が印加された場合、放電々弧が２つの電極１４
間に生ずる。この電弧は電極間に広がっている小さな水
滴を瞬間的に蒸発させる。水滴の爆発的な蒸発に基き生
ずる衝撃波がスパーク放電室１２の内部全体に伝播する
。この衝撃波が担体シート１８に達すると、この担体シ
ート１８はスペーサリング１６により垂直方向に持ち上
げられ、支持スクリーン２０に向けて加速される。担体
シート１８が支持スクリーン２０に衝突すると、担体シ
ート１８はその位置で止められ、かつ担体シート１８上
にある粒子はこれを離れて、ターゲット表面２２上に静
止している細胞に至るまでの距離を自由に飛翔する。こ
の装置が適当に構成されかつ調節されており、しかも適
当な手順を行えば、実質的な割合の担体粒子が正しい速
度でターゲットに達し、許容できない割合で該細胞を破
壊することなしに、ターゲット表面２２上の細胞中に侵
入する。次いで、ターゲット表面２２上の細胞をターゲ
ット表面２２から取出し、形質転換体と非形質転換体と
を分離すべく適当に選別を行うことが可能である。この
工程で、花粉を使用（これが好ましい）した場合、花粉
は次にターゲット表面２２から除かれ、生殖能力のある
雌性の花、例えばトウモロコシの毛などに手で授粉する
。これらは次いで種子または穀粒となる。この種子を収
押し、播種し、かつ担体粒子に担持され、花粉中に注入
されたＤＮＡで条件付けられた形態学的または生化学的
特徴につき評価を行・うことが可能である。また未成熟
の胚を分化中の種子から切取って、該胚を適当な組織培
養液中で小さな苗または完全な植物にまで育成すること
もできる。これら胚がらの植物または苗、あるいは組織
は、花粉細胞中に形質転換されたＤＮＡ中に含まれる選
択可能なマーカーを基にして選別すべくテストすること
ができる。適当な選択し得るマーカーは、除草特性、抗
生物質耐性または支配的形態学的特徴などの、表現が観
測できる外因性抵抗特性を含む。
間に生ずる。この電弧は電極間に広がっている小さな水
滴を瞬間的に蒸発させる。水滴の爆発的な蒸発に基き生
ずる衝撃波がスパーク放電室１２の内部全体に伝播する
。この衝撃波が担体シート１８に達すると、この担体シ
ート１８はスペーサリング１６により垂直方向に持ち上
げられ、支持スクリーン２０に向けて加速される。担体
シート１８が支持スクリーン２０に衝突すると、担体シ
ート１８はその位置で止められ、かつ担体シート１８上
にある粒子はこれを離れて、ターゲット表面２２上に静
止している細胞に至るまでの距離を自由に飛翔する。こ
の装置が適当に構成されかつ調節されており、しかも適
当な手順を行えば、実質的な割合の担体粒子が正しい速
度でターゲットに達し、許容できない割合で該細胞を破
壊することなしに、ターゲット表面２２上の細胞中に侵
入する。次いで、ターゲット表面２２上の細胞をターゲ
ット表面２２から取出し、形質転換体と非形質転換体と
を分離すべく適当に選別を行うことが可能である。この
工程で、花粉を使用（これが好ましい）した場合、花粉
は次にターゲット表面２２から除かれ、生殖能力のある
雌性の花、例えばトウモロコシの毛などに手で授粉する
。これらは次いで種子または穀粒となる。この種子を収
押し、播種し、かつ担体粒子に担持され、花粉中に注入
されたＤＮＡで条件付けられた形態学的または生化学的
特徴につき評価を行・うことが可能である。また未成熟
の胚を分化中の種子から切取って、該胚を適当な組織培
養液中で小さな苗または完全な植物にまで育成すること
もできる。これら胚がらの植物または苗、あるいは組織
は、花粉細胞中に形質転換されたＤＮＡ中に含まれる選
択可能なマーカーを基にして選別すべくテストすること
ができる。適当な選択し得るマーカーは、除草特性、抗
生物質耐性または支配的形態学的特徴などの、表現が観
測できる外因性抵抗特性を含む。
第１図の装置は本発明による花粉媒介植物形質転換法の
ために特別に開発されたものであるが、この装置自体は
他の型のｍ織、植物、動物またはバクテリアの加速粒子
形質転換に対しても同様に有用であるものと理解すべき
である。この装置では間隔または放電電位を変えること
により粒子の力を容易に調節することができる。これは
結果が再現し得るように、高効率かつ安定に、かつ比較
的簡単に操作される。
ために特別に開発されたものであるが、この装置自体は
他の型のｍ織、植物、動物またはバクテリアの加速粒子
形質転換に対しても同様に有用であるものと理解すべき
である。この装置では間隔または放電電位を変えること
により粒子の力を容易に調節することができる。これは
結果が再現し得るように、高効率かつ安定に、かつ比較
的簡単に操作される。
本発明の好ましい方法においては、粒子にＤＮＡ配列を
適用する工程、担体シート内に粒子の層を形成する工程
および植物の形質転換用のＤＮＡの調製工程すべては特
別な注意を要する。これら各々の詳細は順次以下で議論
されるであろう。
適用する工程、担体シート内に粒子の層を形成する工程
および植物の形質転換用のＤＮＡの調製工程すべては特
別な注意を要する。これら各々の詳細は順次以下で議論
されるであろう。
植物の形質転換に適した形状で調製された外来遺伝子を
含むＤＮＡ配列は無垢の金またはタングステンベレット
上で単に乾燥することができる。
含むＤＮＡ配列は無垢の金またはタングステンベレット
上で単に乾燥することができる。
しかし、このような形態のＤＮＡ分子は比較的短期間の
み安定であり、しかも粒子自体の金属または酸化基質と
の化学的反応により比較的急速に分解する傾向がある。
み安定であり、しかも粒子自体の金属または酸化基質と
の化学的反応により比較的急速に分解する傾向がある。
これに対して、担体粒子をまず封止剤で被覆した場合に
は、ＤＮＡ鎖は大巾に改善された安定性を有し、かつ数
週間にも及ぶ長期間に亘り殆ど分解されないことがわか
った。適当な封止剤はポリリジン（分子１１＝２（１１
）．（１１）０ ）であり、これはＤＮＡ分子を塗布す
る前に担体粒子に塗布し得ることがわかった。ポリマー
型のあるいはその他のこれ以外の封止剤も同様な封止剤
として有用であると思われる。ポリリジンは、金粒子を
０．０２％ポリリジン溶液で洗い、次いでかくして被覆
した粒子を風乾または加熱乾燥することにより塗布され
る。一旦、ポリリジンで被覆した金属粒子を乾燥すれば
、ＤＮＡ鎖を該粒子上に担持させることができる。ＤＮ
Ａは金ビーズ球１ｍｇ当たりＤＮＡ３〜３０μｇの範囲
の割合で該粒子上に担持させることができる。実際には
、１（１１）μｇのＤＮＡおよび１〜３μの金粒子３０
ｍｇに、５ｐｌのｌ Ｑ ｍＭＮａｇ ＨＰ Ｏｓおよ
び５μＪの１０ｍＭ ＣａＣ１ｚを添加して、溶液が乾
燥するに伴って微細なＣａＨＰＯａ沈殿が生成されるよ
うにする。この沈殿は該ビーズ上でＤＮＡを担持してい
る。ビーズと燐酸およびカルシウム塩溶液とをＤＮＡと
混合した後、懸濁液を時々攪拌しつつ窒素気流下で乾燥
する。沈殿を一旦乾燥し、次いですぐに担体シート上に
該粒子を配置するために１（１１）％エタノール中に再
懸濁する。
は、ＤＮＡ鎖は大巾に改善された安定性を有し、かつ数
週間にも及ぶ長期間に亘り殆ど分解されないことがわか
った。適当な封止剤はポリリジン（分子１１＝２（１１
）．（１１）０ ）であり、これはＤＮＡ分子を塗布す
る前に担体粒子に塗布し得ることがわかった。ポリマー
型のあるいはその他のこれ以外の封止剤も同様な封止剤
として有用であると思われる。ポリリジンは、金粒子を
０．０２％ポリリジン溶液で洗い、次いでかくして被覆
した粒子を風乾または加熱乾燥することにより塗布され
る。一旦、ポリリジンで被覆した金属粒子を乾燥すれば
、ＤＮＡ鎖を該粒子上に担持させることができる。ＤＮ
Ａは金ビーズ球１ｍｇ当たりＤＮＡ３〜３０μｇの範囲
の割合で該粒子上に担持させることができる。実際には
、１（１１）μｇのＤＮＡおよび１〜３μの金粒子３０
ｍｇに、５ｐｌのｌ Ｑ ｍＭＮａｇ ＨＰ Ｏｓおよ
び５μＪの１０ｍＭ ＣａＣ１ｚを添加して、溶液が乾
燥するに伴って微細なＣａＨＰＯａ沈殿が生成されるよ
うにする。この沈殿は該ビーズ上でＤＮＡを担持してい
る。ビーズと燐酸およびカルシウム塩溶液とをＤＮＡと
混合した後、懸濁液を時々攪拌しつつ窒素気流下で乾燥
する。沈殿を一旦乾燥し、次いですぐに担体シート上に
該粒子を配置するために１（１１）％エタノール中に再
懸濁する。
担体シートに該粒子を塗布する場合、該担体シート上に
担体粒子の均一かつ再生可能な層を形成することがこの
手順の首尾よい操作のために好ましい。このため、粒子
は担体上に単純に振りまくことはできない。なんとなれ
ば、これらは凝集する傾向をもち、従ってシート上で再
現し得ない様式で不均一に分布するからである。特に、
シート上の水分即ち水含量はシートへの粒子の適用を妨
害し、望ましからぬ凝集を起こす。従って、まずマイラ
ーシートを、担体粒子を適用する際に水が点在するのを
防止するために親水性被覆で通め覆っておくことが必要
である。このためにはヒドロキシエチルセルロースが役
立つが、他の同様な処理、例えば酸化水分解セルロース
による被覆も利用できることがわかった。１％のヒドロ
キシエチルセルロース溶液をプラスチック被覆アルミメ
ッキマイラー上に塗布し、次いで脱イオン水で洗浄し、
風乾する。次いで、１（１１）％エタノールに懸濁され
た、Ｄ Ｎ Ａ ｔＭを含む沈殿被覆をもつ担体粒子を
担体シートに塗布する。５０〜１（１１）μｌの十分に
攪拌したエタノール懸濁液を担体粒子と共に、適度に均
一かつ再現性のある様式で、マイラーシート上にピペッ
トで首尾良く移すことができることを見出した。この懸
濁液の移されたアリコートを少なくとも３０秒間密閉し
たベトリ皿内で静置する。このペトリ皿は室内空気流に
よる渦流の発生を防止し、かつ高速度での蒸発を防止す
るために密閉しなければならない。該渦流は粒子の過度
のドリフトを生ずる可能性があり、その結果シート上で
の粒子の分布が不均一となる可能性がある。静置時間の
経過後、゛メニスカスを破り、過剰のエタノールを排液
する。部分的に開放したベトリ皿内で蒸発させることに
より残留エタノールを除去する。
担体粒子の均一かつ再生可能な層を形成することがこの
手順の首尾よい操作のために好ましい。このため、粒子
は担体上に単純に振りまくことはできない。なんとなれ
ば、これらは凝集する傾向をもち、従ってシート上で再
現し得ない様式で不均一に分布するからである。特に、
シート上の水分即ち水含量はシートへの粒子の適用を妨
害し、望ましからぬ凝集を起こす。従って、まずマイラ
ーシートを、担体粒子を適用する際に水が点在するのを
防止するために親水性被覆で通め覆っておくことが必要
である。このためにはヒドロキシエチルセルロースが役
立つが、他の同様な処理、例えば酸化水分解セルロース
による被覆も利用できることがわかった。１％のヒドロ
キシエチルセルロース溶液をプラスチック被覆アルミメ
ッキマイラー上に塗布し、次いで脱イオン水で洗浄し、
風乾する。次いで、１（１１）％エタノールに懸濁され
た、Ｄ Ｎ Ａ ｔＭを含む沈殿被覆をもつ担体粒子を
担体シートに塗布する。５０〜１（１１）μｌの十分に
攪拌したエタノール懸濁液を担体粒子と共に、適度に均
一かつ再現性のある様式で、マイラーシート上にピペッ
トで首尾良く移すことができることを見出した。この懸
濁液の移されたアリコートを少なくとも３０秒間密閉し
たベトリ皿内で静置する。このペトリ皿は室内空気流に
よる渦流の発生を防止し、かつ高速度での蒸発を防止す
るために密閉しなければならない。該渦流は粒子の過度
のドリフトを生ずる可能性があり、その結果シート上で
の粒子の分布が不均一となる可能性がある。静置時間の
経過後、゛メニスカスを破り、過剰のエタノールを排液
する。部分的に開放したベトリ皿内で蒸発させることに
より残留エタノールを除去する。
この工程はＤ Ｎ Ａ ｉｆｉ含有沈殿で被場した担体
粒子をマイラー担体シート上に配置するためのものであ
る。本発明において有効であることがわかっている良好
な中間的割合（ｍｅｄｉａｎ ｒａｔｅ ）は、担体シ
ートの９Ｘ１１ｍｍの面積に塗布された沈殿およびＤＮ
Ａを含む担体粒子約０．１ｍｇである。このような担体
粒子の担体シートへの塗布密度は花粉の良好な生存率を
与えまた加速粒子による花粉粒への高い侵入率を与える
。実際の加速率およびこの粒子による花粉粒への侵入率
は花粉の寸法および径の両者に応じて変化し、しかも担
体粒子の数は必要に応じて、ターゲｚト細胞の断面積当
たりで、多くの粒子あるいはより少ない粒子数となるよ
うに変えることができることは明らかである。
粒子をマイラー担体シート上に配置するためのものであ
る。本発明において有効であることがわかっている良好
な中間的割合（ｍｅｄｉａｎ ｒａｔｅ ）は、担体シ
ートの９Ｘ１１ｍｍの面積に塗布された沈殿およびＤＮ
Ａを含む担体粒子約０．１ｍｇである。このような担体
粒子の担体シートへの塗布密度は花粉の良好な生存率を
与えまた加速粒子による花粉粒への高い侵入率を与える
。実際の加速率およびこの粒子による花粉粒への侵入率
は花粉の寸法および径の両者に応じて変化し、しかも担
体粒子の数は必要に応じて、ターゲｚト細胞の断面積当
たりで、多くの粒子あるいはより少ない粒子数となるよ
うに変えることができることは明らかである。
本発明で使用するＤＮＡは、トウモロコシの細胞中で外
因性遺伝子を表現するのに適したベクタ中に構成しなけ
ればならない。また他のあらゆる植物が本発明で利用で
きる。ＤＮＡ配列はキメラであり得るが、他の植物種ま
たは同種の植物系からの十分に完全な非キメラ遺伝子も
利用できる。
因性遺伝子を表現するのに適したベクタ中に構成しなけ
ればならない。また他のあらゆる植物が本発明で利用で
きる。ＤＮＡ配列はキメラであり得るが、他の植物種ま
たは同種の植物系からの十分に完全な非キメラ遺伝子も
利用できる。
植物中での表現に適したベクターは、一般に、所定の外
因性遺伝子のコード配列以外に、適当な側部に位置する
調節配列、例えば植物細胞の生体中での転写および表現
を促進し得る適当なプロモータ、および転写末端を認識
し信号を発するかあるいはメツセンジャーを適当に翻訳
して蛋白合成を行うように、ＲＮＡを適当に処理するこ
とのできる翻訳ターミネータを含むべきである。以前に
双子葉植物細胞中でコード配列の転写および表現を可能
とする植物遺伝子プロモータは細胞レベルでの単子葉植
物、例えばコーンなどでも有効であることが証明された
が、後者のいくつかの場合において効果は低い。これに
ついてはフロム（Ｆｒｏｍｍ）等、プロシーディンゲス
オプ ザ ナショナルアカデミ−オブ サイエンス
ユーエスエー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ） ＋ １９８５−９月、■
、５８２４−５８２８を参照のこと。
因性遺伝子のコード配列以外に、適当な側部に位置する
調節配列、例えば植物細胞の生体中での転写および表現
を促進し得る適当なプロモータ、および転写末端を認識
し信号を発するかあるいはメツセンジャーを適当に翻訳
して蛋白合成を行うように、ＲＮＡを適当に処理するこ
とのできる翻訳ターミネータを含むべきである。以前に
双子葉植物細胞中でコード配列の転写および表現を可能
とする植物遺伝子プロモータは細胞レベルでの単子葉植
物、例えばコーンなどでも有効であることが証明された
が、後者のいくつかの場合において効果は低い。これに
ついてはフロム（Ｆｒｏｍｍ）等、プロシーディンゲス
オプ ザ ナショナルアカデミ−オブ サイエンス
ユーエスエー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ） ＋ １９８５−９月、■
、５８２４−５８２８を参照のこと。
このようなプロモータは、植物病原体アグロバクテリウ
ム ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔ
ｕｍｅｆａｉｅｎｓ）からのツバリンシンターゼプロモ
ータおよびカリフラワーモザイクウィルス配列由来のＣ
ａＭｖ３５ｓを含む。植物で有効な適当な終止配列はア
グロバクテリウム ツメファシェンス（Ａ ｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のツバリンシ
ンターゼ遺伝子からのポリアデニル化配列である。植物
表現ベクタも、植物細胞中で機能可能な選択し得るマー
カーを含んでいて、形質転換植物の選別を可能とするこ
とができる。この選択可能なマーカーは、生化学的にア
ッセイし得る特徴あるいは子孫の植物にみることのでき
る表現型の特徴であり得る。同一のまたは他の植物から
の、側部に配置された（ｆｌａｎｋｉｎｇ） ｉｌ１節
配列をもつ非キメラ型の完全な遺伝子をこの工程で使用
した場合、キメラプロモータまたは制御配列は不要であ
り、この遺伝子はその元の配列のまま使用できる。
ム ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔ
ｕｍｅｆａｉｅｎｓ）からのツバリンシンターゼプロモ
ータおよびカリフラワーモザイクウィルス配列由来のＣ
ａＭｖ３５ｓを含む。植物で有効な適当な終止配列はア
グロバクテリウム ツメファシェンス（Ａ ｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のツバリンシ
ンターゼ遺伝子からのポリアデニル化配列である。植物
表現ベクタも、植物細胞中で機能可能な選択し得るマー
カーを含んでいて、形質転換植物の選別を可能とするこ
とができる。この選択可能なマーカーは、生化学的にア
ッセイし得る特徴あるいは子孫の植物にみることのでき
る表現型の特徴であり得る。同一のまたは他の植物から
の、側部に配置された（ｆｌａｎｋｉｎｇ） ｉｌ１節
配列をもつ非キメラ型の完全な遺伝子をこの工程で使用
した場合、キメラプロモータまたは制御配列は不要であ
り、この遺伝子はその元の配列のまま使用できる。
本発明の方法はトウモロコシの花粉媒介形質転換法につ
いて特に詳細に記載してきたが、本発明の方法に固存の
事柄は何もなく、即ちトウモロコシに制限する必要性は
なく、かつ本発明の方法は同様に他の穀類作物並びに大
豆および綿などの双子葉植物および殆どの他の植物の花
粉形質転換にも適しているものと理解すべきである。他
の種の花粉を扱う手順は変える必要があるかもしれず、
また種に応じて、担体粒子速度に対して臨界的な装置の
部品の間隔は変える必要があろうが、基本的な装置およ
び手続きは他の植物種にも利用できる。
いて特に詳細に記載してきたが、本発明の方法に固存の
事柄は何もなく、即ちトウモロコシに制限する必要性は
なく、かつ本発明の方法は同様に他の穀類作物並びに大
豆および綿などの双子葉植物および殆どの他の植物の花
粉形質転換にも適しているものと理解すべきである。他
の種の花粉を扱う手順は変える必要があるかもしれず、
また種に応じて、担体粒子速度に対して臨界的な装置の
部品の間隔は変える必要があろうが、基本的な装置およ
び手続きは他の植物種にも利用できる。
更に、本発明の方法は花粉媒介形質転換を指向するもの
であるが、ここに記載した装置は他の植物組織、例えば
胚カルスまたは体性胚あるいは任意の他の植物または他
の培養組織の形質転換に利用するためにも適したもので
ある。
であるが、ここに記載した装置は他の植物組織、例えば
胚カルスまたは体性胚あるいは任意の他の植物または他
の培養組織の形質転換に利用するためにも適したもので
ある。
すべての花粉が内部に挿入された担体粒子をもつわけで
はないので、しかもすべての花粉細胞または子孫接合体
がそのゲノム内にＤＮＡを取込むわけではないので、あ
る段階で子孫植物をスクリーニングして形質転換体を選
別しなければならない。所定の外来遺伝子を植物中に形
質転換しようとする場合、該遺伝子をキメラ表現ベクタ
内に挿入できる。次いで、このキメラ表現ベクタを、以
下に記載するｐｃＭ（１０）０２２などの選択可能なマ
ーカープラスミドと共に植物細胞内に形質転換すること
ができる。これら２つのベクタ（外来遺伝子および選択
可能なマーカー）は−緒につないで一つのプラスミドと
することができ、あるいはこれら２つのベクタを別々に
クローニングして、次いで同一の担体粒子に一緒に塗布
することも可能である。いずれにしても、得られる子孫
を該マーカーに対してスクリーニングし、形質転換され
た子孫を選別する。このような選別可能なマーカーの使
用はある情況下では望ましいが、形質転換された子孫を
選別するための適当な形態学的または生化学的テストが
存在する場合にはこれを省くこともできる。形態学的ス
クリーニングテストは子孫における支配的表現型特徴に
対するものであってよい。適当な生化学的スクリーニン
グテストは、子孫植物のゲノムにおける形質転換ＤＮＡ
自体の存在に対するいわゆるサザンブロソトハイブリダ
イゼーションプローブであってよい。
はないので、しかもすべての花粉細胞または子孫接合体
がそのゲノム内にＤＮＡを取込むわけではないので、あ
る段階で子孫植物をスクリーニングして形質転換体を選
別しなければならない。所定の外来遺伝子を植物中に形
質転換しようとする場合、該遺伝子をキメラ表現ベクタ
内に挿入できる。次いで、このキメラ表現ベクタを、以
下に記載するｐｃＭ（１０）０２２などの選択可能なマ
ーカープラスミドと共に植物細胞内に形質転換すること
ができる。これら２つのベクタ（外来遺伝子および選択
可能なマーカー）は−緒につないで一つのプラスミドと
することができ、あるいはこれら２つのベクタを別々に
クローニングして、次いで同一の担体粒子に一緒に塗布
することも可能である。いずれにしても、得られる子孫
を該マーカーに対してスクリーニングし、形質転換され
た子孫を選別する。このような選別可能なマーカーの使
用はある情況下では望ましいが、形質転換された子孫を
選別するための適当な形態学的または生化学的テストが
存在する場合にはこれを省くこともできる。形態学的ス
クリーニングテストは子孫における支配的表現型特徴に
対するものであってよい。適当な生化学的スクリーニン
グテストは、子孫植物のゲノムにおける形質転換ＤＮＡ
自体の存在に対するいわゆるサザンブロソトハイブリダ
イゼーションプローブであってよい。
（実施例）
１、 ベクターの構築
Ａ、抗生物質耐性
適当な植物表現ベクタの組立ては模式的に第２図および
第３図に示されている。第２図には模式的に、植物表現
ベクタｐｃＭｃ１２（１０）３の構築法が示されている
。プラスミドｐＣＭＣ１２０８の作製はプラスミドｐＢ
Ｒ３２５〔ポリバー エフ（Ｂｏｌｉｖｅｒ、 Ｆ、）
、 ジータ（Ｇｅｎｅ） ＋ １ ９ ７ ８
＋ 土、 １２１−１３６） を制限エン
ドヌクレアーゼＴａｇ Ｉで消化することにより開始
する。このプラスミドｐＢＲ３２５は抗性物質耐性遺伝
子、クロラムファエコールアセチル トランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ）に対するコード配列を含む。ＣＡＴはこの
プラスミドの残部からＴａｇ ｒによる消化によって
切取られる。ｐＢＲ３２５の消化の後、断片をアガロー
スゲル中を電気泳動させて分割し、ＣＡＴ遺伝子を含む
断片を切り取った。次いで、このＣＡＴ断片をプラスミ
ドｐＵＣ９（ビエラおよびメッシング（Ｖｉｅｒａ ＆
Ｍａｓｓｉｎｇ ）、ジータ（Ｇｅｎｅ）、１９８２
．１９，２５９−２６８３に連結した。このｐＵｃ９は
予め制限酵素／１ｃｃｌで消化しておいた。Ｔａｇ
Ｉおよび＾ｃｃ Ｉにより生成された断片の端部はこ
の場合相補的であり、従ってこれらの鎖は直接連結でき
た。得られるプラスミド（第２図でｐＵＣ−ＣＡＴと命
名したもの）は、ｐＵＣ９からのポリリンカーの部分が
側面に位置するＣＡＴコード配列を含んでいた。このプ
ラスミドをＰｓｔ １およびＢａｎ Ｈ１で消化し、２
つの断片の小さな方をゲル電気泳動法により単離した。
第３図に示されている。第２図には模式的に、植物表現
ベクタｐｃＭｃ１２（１０）３の構築法が示されている
。プラスミドｐＣＭＣ１２０８の作製はプラスミドｐＢ
Ｒ３２５〔ポリバー エフ（Ｂｏｌｉｖｅｒ、 Ｆ、）
、 ジータ（Ｇｅｎｅ） ＋ １ ９ ７ ８
＋ 土、 １２１−１３６） を制限エン
ドヌクレアーゼＴａｇ Ｉで消化することにより開始
する。このプラスミドｐＢＲ３２５は抗性物質耐性遺伝
子、クロラムファエコールアセチル トランスフェラー
ゼ（ＣＡＴ）に対するコード配列を含む。ＣＡＴはこの
プラスミドの残部からＴａｇ ｒによる消化によって
切取られる。ｐＢＲ３２５の消化の後、断片をアガロー
スゲル中を電気泳動させて分割し、ＣＡＴ遺伝子を含む
断片を切り取った。次いで、このＣＡＴ断片をプラスミ
ドｐＵＣ９（ビエラおよびメッシング（Ｖｉｅｒａ ＆
Ｍａｓｓｉｎｇ ）、ジータ（Ｇｅｎｅ）、１９８２
．１９，２５９−２６８３に連結した。このｐＵｃ９は
予め制限酵素／１ｃｃｌで消化しておいた。Ｔａｇ
Ｉおよび＾ｃｃ Ｉにより生成された断片の端部はこ
の場合相補的であり、従ってこれらの鎖は直接連結でき
た。得られるプラスミド（第２図でｐＵＣ−ＣＡＴと命
名したもの）は、ｐＵＣ９からのポリリンカーの部分が
側面に位置するＣＡＴコード配列を含んでいた。このプ
ラスミドをＰｓｔ １およびＢａｎ Ｈ１で消化し、２
つの断片の小さな方をゲル電気泳動法により単離した。
次に、この断片を介在植物表現ベクタｐＣＭＣ６６に連
結し、ＣＡＴ表現プラスミドＰＣＭＣ１２０５を形成し
た。ここでベクタｐ ＣＭＣ６６は予めＰｓｔ Ｉおよ
びＲａｍ ＨＩで消化しておいた。このプラスミドｐＣ
ＭＣ６６はアグロバクテリウム ツメファシェンス −
７す、ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）由来
のツバリンシンターゼ プロモータ（Ｎｏｓ Ｐｒ）お
よび６個のプラスミド固有の制限サイトを包囲する、同
じ生物起源のツバリンシンターゼポリアデニル化配列Ｃ
Ｐｏ１ｙ Ａ）を含む。また、このプラスミドｐ ＣＭ
Ｃ６６はβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）の異形を有
し、これはバクテリア中で抗生物質アンピシリン耐性を
表現し、その結果後にイー、コリ （Ｅ、 ｃｏｌｉ
）中で行った組換えにおける選別マーカーとして使用で
きる。
結し、ＣＡＴ表現プラスミドＰＣＭＣ１２０５を形成し
た。ここでベクタｐ ＣＭＣ６６は予めＰｓｔ Ｉおよ
びＲａｍ ＨＩで消化しておいた。このプラスミドｐＣ
ＭＣ６６はアグロバクテリウム ツメファシェンス −
７す、ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）由来
のツバリンシンターゼ プロモータ（Ｎｏｓ Ｐｒ）お
よび６個のプラスミド固有の制限サイトを包囲する、同
じ生物起源のツバリンシンターゼポリアデニル化配列Ｃ
Ｐｏ１ｙ Ａ）を含む。また、このプラスミドｐ ＣＭ
Ｃ６６はβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）の異形を有
し、これはバクテリア中で抗生物質アンピシリン耐性を
表現し、その結果後にイー、コリ （Ｅ、 ｃｏｌｉ
）中で行った組換えにおける選別マーカーとして使用で
きる。
プラスミドｐｃａＭＶ’ｌ Ｏ（ガードナー（Ｇａｒｄ
ｎｅｒ）等、ヌクレイツク アシソズ リサーチ（Ｎｕ
ｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）＋ １９８１ 、
９ 、２８７１−２８８８）をＳｔｕ Ｉで消化し、カ
リフラワ モザイクウィルス３５プロモータ（ＣａＭｖ
３５ ｓ ）を含む断片を合成Ｘｈｏ Ｉオリゴヌク
レオチドリンカーに結合した。次いで、この断片をＨｐ
Ｈ１で消化し、ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末
端を得、次いで合成Ｈ３ｎｄｌｌｌオリゴヌクレオチド
リンカーに結合した。この断片のにｈｏｒおよび１ｌｉ
ｎｄｌ［［両者による消化はＣａＭｖ３５ ｓプロモー
タおよび制限サイト配列の添加により末端が変性された
転写開始サイトを含む断片を生成した。
ｎｅｒ）等、ヌクレイツク アシソズ リサーチ（Ｎｕ
ｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）＋ １９８１ 、
９ 、２８７１−２８８８）をＳｔｕ Ｉで消化し、カ
リフラワ モザイクウィルス３５プロモータ（ＣａＭｖ
３５ ｓ ）を含む断片を合成Ｘｈｏ Ｉオリゴヌク
レオチドリンカーに結合した。次いで、この断片をＨｐ
Ｈ１で消化し、ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末
端を得、次いで合成Ｈ３ｎｄｌｌｌオリゴヌクレオチド
リンカーに結合した。この断片のにｈｏｒおよび１ｌｉ
ｎｄｌ［［両者による消化はＣａＭｖ３５ ｓプロモー
タおよび制限サイト配列の添加により末端が変性された
転写開始サイトを含む断片を生成した。
上記ツバリンシンターゼ プロモータを、プラスミドｐ
ｃＭｃ１２０５をＸｈｏ Ｉおよび旧ｎｄ■で消化する
ことにより該プラスミドから切取った。かくして得た２
つの断片の大きな方をＣａＭｖ３５ ｇプロモータ断片
と結合して９０ＭＣ１２０８を生成した。このｐｃＭｃ
１２０８はＣａＭｖ３５ ｓプロモータ、ＣＡＴコード
配列およびツバリンシンターゼ ポリアデニル化配列を
この順で有する植物表現ベクタである。このＣａＭｖ
３５ ｓプロモータおよびｐｏｌｙＡ配列はＣＡＴコー
ド配列に対する側部に配置された調節配列として機能し
た。
ｃＭｃ１２０５をＸｈｏ Ｉおよび旧ｎｄ■で消化する
ことにより該プラスミドから切取った。かくして得た２
つの断片の大きな方をＣａＭｖ３５ ｇプロモータ断片
と結合して９０ＭＣ１２０８を生成した。このｐｃＭｃ
１２０８はＣａＭｖ３５ ｓプロモータ、ＣＡＴコード
配列およびツバリンシンターゼ ポリアデニル化配列を
この順で有する植物表現ベクタである。このＣａＭｖ
３５ ｓプロモータおよびｐｏｌｙＡ配列はＣＡＴコー
ド配列に対する側部に配置された調節配列として機能し
た。
プラスミドｐｃＭｃ１２０５およびｐ ＣＭＣ１２０８
両者を、原形質体中にエレクトロポレーションし、次い
でＣＡＴ活性につきアッセイすることにより、トウモロ
コシ中での活性につきテストした。両者ともトウモロコ
シ細胞中で活性であることが立証されたが、ｐ ＣＭ
Ｃ１２０８はその活性の点で著しく高いことがわかり、
従って植物形質転換実験ではこれを用いた。
両者を、原形質体中にエレクトロポレーションし、次い
でＣＡＴ活性につきアッセイすることにより、トウモロ
コシ中での活性につきテストした。両者ともトウモロコ
シ細胞中で活性であることが立証されたが、ｐ ＣＭ
Ｃ１２０８はその活性の点で著しく高いことがわかり、
従って植物形質転換実験ではこれを用いた。
プラスミドｐｃＭｃ１２０８を、本発明の方法および装
置での、トウモロコシの花粉媒介遺伝的形質転換のため
に使用した。しかし、ＣＡＴ活性のためのアッセイはト
ウモロコシ組織中で高いバックグラウンドを有しており
、従ってＣＡＴ遺伝子はトウモロコシでは最適のマーカ
ーではないものと考えた。そこで、このプラスミドを更
に処理して、ＣＡＴ遺伝子の代りにトウモロコシ中でよ
り一層選択性の高い、ベクタ中の他の抗生物質耐性遺伝
子を、第３図に示すように挿入した。
置での、トウモロコシの花粉媒介遺伝的形質転換のため
に使用した。しかし、ＣＡＴ活性のためのアッセイはト
ウモロコシ組織中で高いバックグラウンドを有しており
、従ってＣＡＴ遺伝子はトウモロコシでは最適のマーカ
ーではないものと考えた。そこで、このプラスミドを更
に処理して、ＣＡＴ遺伝子の代りにトウモロコシ中でよ
り一層選択性の高い、ベクタ中の他の抗生物質耐性遺伝
子を、第３図に示すように挿入した。
プラスミドｐｃＭｃ１０２１はツバリンシンターゼ プ
ロモータおよび酵素アミノグリコシド−３−ホスホトラ
ンスフェラーゼｎ（ＡＰＩ３′■）のコード領域を側面
に有するツバリンシンターゼ ポリアデニル化配列を含
む。ＡＰＩ３’ｌｌはカナマイシンなどのアミノグリコ
シド抗生物質に対する耐性を決定する。エレクトロポレ
ーション実験はＣａＭｖ３５ ｓプロモータがＮｏｓ
Ｐｒよりもトウモロコシについてより一層有効であるこ
とを明らかにしたので、ＣａＭν３５ｓプロモータをｐ
ｃＭｃ１０２１に１多すことを決定した。第３図に示す
ようにｐｃＭｃ１２０８由来のＣａＭｖ３５ ｓ断片は
Ｘｈｏ Ｉおよび１ｌｉｎｄｎ［で消化し、電気泳動で
単離した。また、プラスミドｐｃＭｃ１０２１をＸｈｏ
Ｉおよび旧ｎｄｌＩ［で消化し、そのうち大きな断片
を単離し、これをＣａＭｖ３５ ｓ断片と結合してｐ
ＣＭＣ１０２２を生成した。プラスミドｐ ＣＭＣ１０
２２において、ＡＰＨ３’ ＩＩ由来のコード配列は調
節性ＣａＭｖ３５ ｓおよびＮｏｓ ｐＡ配列と側面を
接している。
ロモータおよび酵素アミノグリコシド−３−ホスホトラ
ンスフェラーゼｎ（ＡＰＩ３′■）のコード領域を側面
に有するツバリンシンターゼ ポリアデニル化配列を含
む。ＡＰＩ３’ｌｌはカナマイシンなどのアミノグリコ
シド抗生物質に対する耐性を決定する。エレクトロポレ
ーション実験はＣａＭｖ３５ ｓプロモータがＮｏｓ
Ｐｒよりもトウモロコシについてより一層有効であるこ
とを明らかにしたので、ＣａＭν３５ｓプロモータをｐ
ｃＭｃ１０２１に１多すことを決定した。第３図に示す
ようにｐｃＭｃ１２０８由来のＣａＭｖ３５ ｓ断片は
Ｘｈｏ Ｉおよび１ｌｉｎｄｎ［で消化し、電気泳動で
単離した。また、プラスミドｐｃＭｃ１０２１をＸｈｏ
Ｉおよび旧ｎｄｌＩ［で消化し、そのうち大きな断片
を単離し、これをＣａＭｖ３５ ｓ断片と結合してｐ
ＣＭＣ１０２２を生成した。プラスミドｐ ＣＭＣ１０
２２において、ＡＰＨ３’ ＩＩ由来のコード配列は調
節性ＣａＭｖ３５ ｓおよびＮｏｓ ｐＡ配列と側面を
接している。
エレクトロボーレーション形質転換および蛋白アッセイ
により、プラスミドｐｃＭｃ１２０８およびｐｃＭｃ１
０２２は両者ともに、タバコ、綿、大豆およびコーンの
個々の細胞中での形質転換および表現につき活性である
ことが立証された。
により、プラスミドｐｃＭｃ１２０８およびｐｃＭｃ１
０２２は両者ともに、タバコ、綿、大豆およびコーンの
個々の細胞中での形質転換および表現につき活性である
ことが立証された。
Ｂ、胚乳染色マーカー
ｐＭＢｚＲＩと称するプラスミドが得られ、これはトウ
モロコシゲノムＤＮＡの約９．９ｋｂのＥｃｏ ＲＩ断
片を含み、該ゲノムＤＮＡは、コーン中でアントシアニ
ン顔料を合成するのに必要とされる酵素、ＵＤＰグルコ
ース−フレーパート グルコシル トランスフェラーゼ
をコードする完全な遺伝子を含んでいる。このゲノム断
片は長い５′・および３′の側面に位置するＤＮＡ両者
を含み、従って該遺伝子をトウモロコシ中で表現するの
に有効な適当な調節配列を含むものと期待される。この
クローニングした遺伝子は正常な機能性のトウモロコシ
遺伝子の全長に亘るコピーであるので、このクローン化
遺伝子は完全に活性で、しかもトウモロコシ細胞中で適
切に機能するであろう。
モロコシゲノムＤＮＡの約９．９ｋｂのＥｃｏ ＲＩ断
片を含み、該ゲノムＤＮＡは、コーン中でアントシアニ
ン顔料を合成するのに必要とされる酵素、ＵＤＰグルコ
ース−フレーパート グルコシル トランスフェラーゼ
をコードする完全な遺伝子を含んでいる。このゲノム断
片は長い５′・および３′の側面に位置するＤＮＡ両者
を含み、従って該遺伝子をトウモロコシ中で表現するの
に有効な適当な調節配列を含むものと期待される。この
クローニングした遺伝子は正常な機能性のトウモロコシ
遺伝子の全長に亘るコピーであるので、このクローン化
遺伝子は完全に活性で、しかもトウモロコシ細胞中で適
切に機能するであろう。
酵素、ＵＤＰグルコース−フラボノール グルコシル
トランス フェラーゼ自体はトウモロコシの遺伝的形質
転換用の選別マーカーとして有用である。というのは、
外因性遺伝子を不活化する劣性変異体を含むトウモロコ
シ系が得られるからである。この酵素は植物の生長並び
に分化に対して必須ではないので、変異系の植物が、野
生型または非−変異型トウモロコシの種々の組織中で生
成されるはずの赤色アントシアニン顔料に乏しいこと以
外は正常である。ホモ接合変異系に野生型の遺伝子を導
入すると、この酵素を生成し、かくして後にアントシア
ニンを産生じ、従って形質転換植物はその特徴的な色に
よって容易に識別できる。かくして、プラスミドｐＭＢ
ｚＲＩは、何の変更もなしに、トウモロコシにおけるモ
デル的表現ベクタとして適しており、また他の興味ある
遺伝子に結合した場合には便利なスクリーニング可能な
形質転換マーカーとして使用できる。これは有用な非キ
メラ遺伝子の一例である。
トランス フェラーゼ自体はトウモロコシの遺伝的形質
転換用の選別マーカーとして有用である。というのは、
外因性遺伝子を不活化する劣性変異体を含むトウモロコ
シ系が得られるからである。この酵素は植物の生長並び
に分化に対して必須ではないので、変異系の植物が、野
生型または非−変異型トウモロコシの種々の組織中で生
成されるはずの赤色アントシアニン顔料に乏しいこと以
外は正常である。ホモ接合変異系に野生型の遺伝子を導
入すると、この酵素を生成し、かくして後にアントシア
ニンを産生じ、従って形質転換植物はその特徴的な色に
よって容易に識別できる。かくして、プラスミドｐＭＢ
ｚＲＩは、何の変更もなしに、トウモロコシにおけるモ
デル的表現ベクタとして適しており、また他の興味ある
遺伝子に結合した場合には便利なスクリーニング可能な
形質転換マーカーとして使用できる。これは有用な非キ
メラ遺伝子の一例である。
２５） ｐｃＭｃ１０２２を用いるトウモロコシの形
質転換 担体粒子として用いる径１〜３μｍの球状金ビーズを、
０．０２％ポリリジン中ですすぎ、風乾することにより
、ポリリジンで予め被覆した。
質転換 担体粒子として用いる径１〜３μｍの球状金ビーズを、
０．０２％ポリリジン中ですすぎ、風乾することにより
、ポリリジンで予め被覆した。
１（１１）μｇのｐｃＭｃ１０２２ＤＮＡを含む水性溶
液を３３■の被覆ビーズに添加し、次いで５μｌのｌ
ＯｍＭ ＮａｚＨＰ ０４および５μβの１０ ｍＭ
ＣａＣ１ｚを添加した。溶液がＮ２気流中で乾燥（蒸発
）されるにつれて微細な沈殿が生成した。
液を３３■の被覆ビーズに添加し、次いで５μｌのｌ
ＯｍＭ ＮａｚＨＰ ０４および５μβの１０ ｍＭ
ＣａＣ１ｚを添加した。溶液がＮ２気流中で乾燥（蒸発
）されるにつれて微細な沈殿が生成した。
乾燥した、沈殿で被覆されたビードを、次に１（１１）
ｍＡのエタノールに再懸濁し、次いで約１（ＪＸＬＣｌ
ｌの厚さ２．０ミルのプラスチック被覆し、アルミメッ
キしたマイラーシート上に析出させた。この被覆ビード
は最終密度０．１■／ ｃａｔとなるようにマイラー担
持シート上に塗布した。
ｍＡのエタノールに再懸濁し、次いで約１（ＪＸＬＣｌ
ｌの厚さ２．０ミルのプラスチック被覆し、アルミメッ
キしたマイラーシート上に析出させた。この被覆ビード
は最終密度０．１■／ ｃａｔとなるようにマイラー担
持シート上に塗布した。
上部に被覆ビードをもつ担持シートを第１図に示した装
置のスペーサ１６の頂部に取付けた。
置のスペーサ１６の頂部に取付けた。
花粉を手でアーリーサンーグロ甘味種トウモロコシ（Ｅ
ａｒｌｙ ５ｕｎ−Ｇｌｏ ｓｗｅｅｔ ｃｏｒｎ）か
ら集めた。
ａｒｌｙ ５ｕｎ−Ｇｌｏ ｓｗｅｅｔ ｃｏｒｎ）か
ら集めた。
６０鶴のベトリ皿の底部を鉱油でわずかに覆い、集めた
花粉をその上に振りまいた。このペトリ皿を逆転させて
過剰の花粉を除き、単層とした。
花粉をその上に振りまいた。このペトリ皿を逆転させて
過剰の花粉を除き、単層とした。
このペトリ皿を第１図の装置のターゲット表面２２とし
て用いた。
て用いた。
５５〜６０ｍｍＨＨの真空を第１図の組立てられた装置
に印加した。ｌμＦのキャパシタからの１５ＫＶ放電を
電極１４を介して発生させて、ターゲット表面２２上の
花粉に、該被覆粒子を加速した。
に印加した。ｌμＦのキャパシタからの１５ＫＶ放電を
電極１４を介して発生させて、ターゲット表面２２上の
花粉に、該被覆粒子を加速した。
ビーズの調製および花粉の調製工程および第１図の装置
の始動工程を、十分な量の処理花粉が得られるまで数回
繰返した。処理した花粉をベトリ皿の底部からブラシで
払い落とし、手作業でカルテンバーブ（Ｋａｌｔｅｎｂ
ｅｒｇ） ３９０とＣＦＳ５５０４とのハイブリッドの
雌性植物の毛に授粉した。これらの毛を他の花粉から物
理的に隔離した。
の始動工程を、十分な量の処理花粉が得られるまで数回
繰返した。処理した花粉をベトリ皿の底部からブラシで
払い落とし、手作業でカルテンバーブ（Ｋａｌｔｅｎｂ
ｅｒｇ） ３９０とＣＦＳ５５０４とのハイブリッドの
雌性植物の毛に授粉した。これらの毛を他の花粉から物
理的に隔離した。
このようにして授粉したトウモロコシの実から５２個の
穀粒を得た。授粉後１４日口の実から未成熟胚を切取り
、５０ｐｐｍのカナマイシンを含むコーン胚組織培養培
地上で培養した。この培地で生育した苗木につき直接Ａ
ＰＨ３’ ｎ活性をアッセイしたところ、３つの苗木が
正であった。このことはＡＰＨ３’ ｎ酵素が該苗木の
ｍｍ中で表現されていることを示しており、かくしてこ
れら植物の首尾良い形質転換が起こったことを示してい
る。
穀粒を得た。授粉後１４日口の実から未成熟胚を切取り
、５０ｐｐｍのカナマイシンを含むコーン胚組織培養培
地上で培養した。この培地で生育した苗木につき直接Ａ
ＰＨ３’ ｎ活性をアッセイしたところ、３つの苗木が
正であった。このことはＡＰＨ３’ ｎ酵素が該苗木の
ｍｍ中で表現されていることを示しており、かくしてこ
れら植物の首尾良い形質転換が起こったことを示してい
る。
これら植物の一つを非選択培地に入れ、温室に移して更
に生長させた。葉の組織を連続＾ｐＨ３′■活性につき
分析したが、正であった。
に生長させた。葉の組織を連続＾ｐＨ３′■活性につき
分析したが、正であった。
この植物および上記アッセイにおいて正ではなかった１
種の植物から単離したＤＮＡ中のｐｃＭｃ１０２２配列
の存在を、サザンハイプリダイゼーション法で確認した
〔 サザン（Ｓａｕｔｈｅｒｎ） ＋ ジャーナル オ
プ モレキュラーバイオロジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉ
ｏ、） 、 １９７５゜１１．５０３−５７７参照〕
。コントロールおよびテストコーンの葉のサンプルから
、テーラ−およびポーエル（Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｐｏｗ
ｅｌｌ ）のセチル−トリメチルアンモニウムプロミド
のマイクロモディフィケーション（ｍｉｃｒｏｎ＋ｏｄ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法〔フォーカス（Ｆｏｃｕｓ）、
１９ Ｂ ２． ４． ４−６〕によってＤＮＡを
単離した。１０Ｐｇの各ＤＮＡサンプルを制限酵素Ａｖ
ａ Ｉおよび旧ｎｄＩ［Ｉで消化し、アガロースゲル
中での電気泳動によって分割し、ナイロン膜に移し、Ａ
ＰＲＩＩコード領域の非コード鎖に対応する３２Ｐ−標
識したプローブとハイブリッド化した。フィルタを洗浄
した後、ハイブリッドＤＮＡ断片をオートラジオグラフ
ィーで可視化した。
種の植物から単離したＤＮＡ中のｐｃＭｃ１０２２配列
の存在を、サザンハイプリダイゼーション法で確認した
〔 サザン（Ｓａｕｔｈｅｒｎ） ＋ ジャーナル オ
プ モレキュラーバイオロジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉ
ｏ、） 、 １９７５゜１１．５０３−５７７参照〕
。コントロールおよびテストコーンの葉のサンプルから
、テーラ−およびポーエル（Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｐｏｗ
ｅｌｌ ）のセチル−トリメチルアンモニウムプロミド
のマイクロモディフィケーション（ｍｉｃｒｏｎ＋ｏｄ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法〔フォーカス（Ｆｏｃｕｓ）、
１９ Ｂ ２． ４． ４−６〕によってＤＮＡを
単離した。１０Ｐｇの各ＤＮＡサンプルを制限酵素Ａｖ
ａ Ｉおよび旧ｎｄＩ［Ｉで消化し、アガロースゲル
中での電気泳動によって分割し、ナイロン膜に移し、Ａ
ＰＲＩＩコード領域の非コード鎖に対応する３２Ｐ−標
識したプローブとハイブリッド化した。フィルタを洗浄
した後、ハイブリッドＤＮＡ断片をオートラジオグラフ
ィーで可視化した。
予想されたｌｋｂの断片はいずれの植物にも見出されな
かった。しかし、各植物は、ＡＰ）Ｉ−３’ＩＩプロー
ブとハイブリッド化され、かつコントロールとしての形
質転換されていないトウモロコシＤＮＡのサンプルのい
ずれにも見出されなかった、約４ｋｂの断片の存在を示
した。２種の植物の一方（ＡＰＨＩＩにつき正のもの）
も３、７ ｋｂの特異的にハイブリッド化されている断
片の存在を示した。観測された断片が予想したサイズを
もっていないという事実はそれ程驚く程のことではない
。というのは複雑な制限パターンぼ、一般に植物および
動物細胞中にトランスフェクションされたＤＮＡについ
て観察されるからである。これについては、ペルチョ（
Ｐｅｒｕｃｈｏ）等の、セル（Ｃｅｌｌ） 、 １９
８０゜２２．３０９−３１７；キエンズ（Ｋｉｅｎｓ）
等、プラント モレキュラー バイオロジー（Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、 １９８５． ５． ２
２３−２２４；バラコースキー（ｐａｓｚｋｏｗｓｋ
ｉ）等。
かった。しかし、各植物は、ＡＰ）Ｉ−３’ＩＩプロー
ブとハイブリッド化され、かつコントロールとしての形
質転換されていないトウモロコシＤＮＡのサンプルのい
ずれにも見出されなかった、約４ｋｂの断片の存在を示
した。２種の植物の一方（ＡＰＨＩＩにつき正のもの）
も３、７ ｋｂの特異的にハイブリッド化されている断
片の存在を示した。観測された断片が予想したサイズを
もっていないという事実はそれ程驚く程のことではない
。というのは複雑な制限パターンぼ、一般に植物および
動物細胞中にトランスフェクションされたＤＮＡについ
て観察されるからである。これについては、ペルチョ（
Ｐｅｒｕｃｈｏ）等の、セル（Ｃｅｌｌ） 、 １９
８０゜２２．３０９−３１７；キエンズ（Ｋｉｅｎｓ）
等、プラント モレキュラー バイオロジー（Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、 １９８５． ５． ２
２３−２２４；バラコースキー（ｐａｓｚｋｏｗｓｋ
ｉ）等。
イーエムビーオージャーナル（ＥＭＢＯＪ、）。
１９８４．３．２７１７−２７２２；リッグス＆ベム７
（Ｒｉｇｇｓ ａｎｄ Ｒａｔｅｓ）、プロシーデ
インダス オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サ
イエンス ニーニスニー（Ｐｒｏｃ。
（Ｒｉｇｇｓ ａｎｄ Ｒａｔｅｓ）、プロシーデ
インダス オブ ザ ナショナル アカデミーオブ サ
イエンス ニーニスニー（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、 １９８６
゜１ユ、５６０２−５６０６を参照のこと。更に、真核
細胞においてＤＮＡは、例えばメチル化により、その予
想される制限消化パターンを変えるように変性し得る〔
チャンドラ−＆ウオルボット （Ｃｈａｎｄｌｅｒａｎ
ｄ Ｗａｌｂｏｔ） 、 プロシーディンゲス オブ
ザ ナショナル アカデミ−オブ サイエンス ニー
ｘスｘ −（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
゜１ユ、５６０２−５６０６を参照のこと。更に、真核
細胞においてＤＮＡは、例えばメチル化により、その予
想される制限消化パターンを変えるように変性し得る〔
チャンドラ−＆ウオルボット （Ｃｈａｎｄｌｅｒａｎ
ｄ Ｗａｌｂｏｔ） 、 プロシーディンゲス オブ
ザ ナショナル アカデミ−オブ サイエンス ニー
ｘスｘ −（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ） 、 １
９ ８ ６． ８ ３゜１７６７−１７７１〕。本例
で用いた制限エンドヌクレアーゼ、Ａｖａ■および旧ｎ
ｄｌＩＩの両者はその認識配列内で特異的メチル化によ
り阻害されていることが知られている〔マックレランド
＆ネルソン（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ ａｎｄ Ｎｅ１ｓ
ｏｎ ）、 ヌクレイツク アシッド リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）、１９８５．１３．
ｒ２（１０）−ｒ２０７１゜４ｋｂ断片の長さはｐｃＭ
ｃ１０２２プラスミドのプラスミド単位長に等しく、こ
れら植物がタンデム状に複製された該プラスミドのコピ
ーを含むことを示唆している。これら酵素の一方のみに
よる消化は、従って観測されたプラスミド−長さの断片
を生成するであろう。３．７ｋｂの断片は、たぶん本来
のトウモロコシＤＮＡとの接合部における、該プラスミ
ドの再配列の結果であると思われる。
９ ８ ６． ８ ３゜１７６７−１７７１〕。本例
で用いた制限エンドヌクレアーゼ、Ａｖａ■および旧ｎ
ｄｌＩＩの両者はその認識配列内で特異的メチル化によ
り阻害されていることが知られている〔マックレランド
＆ネルソン（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ ａｎｄ Ｎｅ１ｓ
ｏｎ ）、 ヌクレイツク アシッド リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）、１９８５．１３．
ｒ２（１０）−ｒ２０７１゜４ｋｂ断片の長さはｐｃＭ
ｃ１０２２プラスミドのプラスミド単位長に等しく、こ
れら植物がタンデム状に複製された該プラスミドのコピ
ーを含むことを示唆している。これら酵素の一方のみに
よる消化は、従って観測されたプラスミド−長さの断片
を生成するであろう。３．７ｋｂの断片は、たぶん本来
のトウモロコシＤＮＡとの接合部における、該プラスミ
ドの再配列の結果であると思われる。
２度の付随的複製を、ＣＦＳ５５０４植物の毛に授粉さ
れるＣＦＳ５５０４植物からの花粉を用いて、上記のよ
うな手順に従って行った。
れるＣＦＳ５５０４植物からの花粉を用いて、上記のよ
うな手順に従って行った。
この手順で得られた２つの植物を、生成した植物から無
作為に選択し、ＡＰＨ３’ｌＩにつきアッセイし、サザ
ンブロソト法で分析した。両植物ともＡＰＨ３’ｎ活性
を示さなかったが、そのゲノム中には４．０ ｋｂのハ
イブリッド断片が存在することが明らかとなった。
作為に選択し、ＡＰＨ３’ｌＩにつきアッセイし、サザ
ンブロソト法で分析した。両植物ともＡＰＨ３’ｎ活性
を示さなかったが、そのゲノム中には４．０ ｋｂのハ
イブリッド断片が存在することが明らかとなった。
Ａ１８８およびフリンＩ・（Ｆｌｉｎｔ）母系植物の花
粉を用いて同様に実施したもう一つの複製実験でも、そ
の子孫から無作為に一つの植物を選択して分析した。こ
の植物の葉はＡＰＨ３’ｌｌ活性の点で正であり、かつ
サザンプロット分析において４．Ｏｋｂの断片が存在す
ることが明らかとなった。
粉を用いて同様に実施したもう一つの複製実験でも、そ
の子孫から無作為に一つの植物を選択して分析した。こ
の植物の葉はＡＰＨ３’ｌｌ活性の点で正であり、かつ
サザンプロット分析において４．Ｏｋｂの断片が存在す
ることが明らかとなった。
３、 ｐｃＭｃ１０２２と他の遺伝子との併用トウモ
ロコシまたは他の植物中に興味ある他の遺伝子を形質転
換するために、プラスミドｐｃＭｃ１０２２を数通りの
方法のいずれかで使用することができる。ＡＰＨ３’
Ｉｆコード配列は、ｐ ＣＭＣ１０２２をＨｉｎｄｌＩ
［およびＢａｎ ＩＩで消化することにより除去でき、
かつ適当な末端をもつように調製された興味ある他の遺
伝子配列をその位置に接合できる。興味ある遺伝子を適
切に選択できれば、上記プラスミドを直接形質転換に使
用できる。この対象とする遺伝子が適当な調節配列とは
別々に調製される場合、かつ選別可能なマーカーが必要
とされる場合には、調節配列をもつ対象とする遺伝子を
、ｐｃＦＩｃ１０２２中のＣａＭｖ３５ ｓ配列の上流
側のポリリンカー内の任意のサイトに挿入できる。ｐ
ＣＭＣ１０２２の選別可能なマーカーを利用するもう一
つの方法は、対象とする遺伝子をｐ ＣＭＣ１０２２ま
たは他の任意の植物表現ベクタ中で調製し、ｐ ＣＭＣ
１０２２および該遺伝子表現ベクタを一緒に、植物細胞
中に形質転換するために上記したようにして、担体粒子
上に被覆することである。
ロコシまたは他の植物中に興味ある他の遺伝子を形質転
換するために、プラスミドｐｃＭｃ１０２２を数通りの
方法のいずれかで使用することができる。ＡＰＨ３’
Ｉｆコード配列は、ｐ ＣＭＣ１０２２をＨｉｎｄｌＩ
［およびＢａｎ ＩＩで消化することにより除去でき、
かつ適当な末端をもつように調製された興味ある他の遺
伝子配列をその位置に接合できる。興味ある遺伝子を適
切に選択できれば、上記プラスミドを直接形質転換に使
用できる。この対象とする遺伝子が適当な調節配列とは
別々に調製される場合、かつ選別可能なマーカーが必要
とされる場合には、調節配列をもつ対象とする遺伝子を
、ｐｃＦＩｃ１０２２中のＣａＭｖ３５ ｓ配列の上流
側のポリリンカー内の任意のサイトに挿入できる。ｐ
ＣＭＣ１０２２の選別可能なマーカーを利用するもう一
つの方法は、対象とする遺伝子をｐ ＣＭＣ１０２２ま
たは他の任意の植物表現ベクタ中で調製し、ｐ ＣＭＣ
１０２２および該遺伝子表現ベクタを一緒に、植物細胞
中に形質転換するために上記したようにして、担体粒子
上に被覆することである。
プラスミドｐｃＭｃ１０２２は、アメリカンタイプ カ
ルチャー コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ） （米国、メ
リーランド州、ロックピノペパークローンドライブ１２
３（１０） ）に１９８６年１１月１４日イ寸で、ＡＴ
ＣＣ承認番号第 として寄託されている。
ルチャー コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ） （米国、メ
リーランド州、ロックピノペパークローンドライブ１２
３（１０） ）に１９８６年１１月１４日イ寸で、ＡＴ
ＣＣ承認番号第 として寄託されている。
上記寄託はＡＴＣＣと本発明の譲受人のパートナ−であ
るセタス社（Ｃｅｔｕｓ Ｃａｒｐ、）との間の契約に
従ってなされた。このＡＴＣＣとの契約は、いずれが先
にしろ、この寄託を記載する並びにこれに関係する米国
特許の発行もしくはあらゆる米国もしくは外国特許出願
の公開または公告に際して、公に対してこれらセルライ
ンの子孫の永久的人手性を約定し、かつ３５ＵＳＣ１２
２章およびこれに閲る委員会規則（３７ＣＦＲ，１，１
４章、特に８８６ ［１，Ｇ、６３８を含む）に従っ
て権限の与えられた米国特許商標局長室により定められ
た者に対するこれらのセルラインの子孫の入手性を規定
している。本出願の譲受人はこの寄託に関るセルライン
が、適当な条件の下で培養した際に死滅しもしくは失わ
れもしくは破壊された場合には、通知があり次第、即座
に同一のセルラインの生存培養体と交換することに同意
している。
るセタス社（Ｃｅｔｕｓ Ｃａｒｐ、）との間の契約に
従ってなされた。このＡＴＣＣとの契約は、いずれが先
にしろ、この寄託を記載する並びにこれに関係する米国
特許の発行もしくはあらゆる米国もしくは外国特許出願
の公開または公告に際して、公に対してこれらセルライ
ンの子孫の永久的人手性を約定し、かつ３５ＵＳＣ１２
２章およびこれに閲る委員会規則（３７ＣＦＲ，１，１
４章、特に８８６ ［１，Ｇ、６３８を含む）に従っ
て権限の与えられた米国特許商標局長室により定められ
た者に対するこれらのセルラインの子孫の入手性を規定
している。本出願の譲受人はこの寄託に関るセルライン
が、適当な条件の下で培養した際に死滅しもしくは失わ
れもしくは破壊された場合には、通知があり次第、即座
に同一のセルラインの生存培養体と交換することに同意
している。
本発明は寄託された微生物で規定される範囲に制限され
ない。というのは、寄託した態様は本発明の局面の一つ
を単に例示するものであり、機能的に同等なあらゆる微
生物が本発明の範囲に属するからである。事実、本明細
書に図示しかつ記載したものに加えて、本発明の種々の
変更が、上記記載から当業者には明らかであり、かつこ
れらは上記特許請求の範囲にはいる。
ない。というのは、寄託した態様は本発明の局面の一つ
を単に例示するものであり、機能的に同等なあらゆる微
生物が本発明の範囲に属するからである。事実、本明細
書に図示しかつ記載したものに加えて、本発明の種々の
変更が、上記記載から当業者には明らかであり、かつこ
れらは上記特許請求の範囲にはいる。
また、ヌクレオチドに対して与えられたすべての塩基対
のサイズはおよその値であり、しかも記載の目的でのみ
使用されたものにすぎないことも理解すべきである。
のサイズはおよその値であり、しかも記載の目的でのみ
使用されたものにすぎないことも理解すべきである。
第１図は、本発明の方法を実施するために組立てられた
装置の分解斜視図であり、 第２図は、プラスミドｐｃＭｃ１２０８の製造工程中の
プラスミド処理操作を模式的に示す図であり、および 第３図は、プラスミドｐｃＭｃ１０２２の製造工程にお
けるプラスミド処理操作を模式的に示す図である。 （主な参照番号） １０・・・・・・加速器、 １２・・・・・・スパーク放電室、 １４・・・・・・電 極、 １６・・・・・・スペーサリング、 １８・・・・・・担体シート、 ２０・・・・・・支持スクリーン、 ２２・・・・・・ターゲット表面、 ２４・・・・・・液 滴。
装置の分解斜視図であり、 第２図は、プラスミドｐｃＭｃ１２０８の製造工程中の
プラスミド処理操作を模式的に示す図であり、および 第３図は、プラスミドｐｃＭｃ１０２２の製造工程にお
けるプラスミド処理操作を模式的に示す図である。 （主な参照番号） １０・・・・・・加速器、 １２・・・・・・スパーク放電室、 １４・・・・・・電 極、 １６・・・・・・スペーサリング、 １８・・・・・・担体シート、 ２０・・・・・・支持スクリーン、 ２２・・・・・・ターゲット表面、 ２４・・・・・・液 滴。
Claims (36)
- （１）コード領域および植物細胞内で該コード領域を表
現するのに有効な側面に位置する調節配列を含む外来遺
伝子のコピーを調製し、 該外来遺伝子のコピーを生物学的に不活性な担体粒子に
結合し、 該植物の花粉に、キメラ遺伝子コピーを有する上記粒子
を物理的に加速して、いくつかの該粒子を該花粉のいく
つかの内部に侵入させ、該植物の雌性器官に上記のよう
に処理した花粉を授粉し、および 該授粉された子孫から、形質転換された子孫をスクリー
ニングする、 ことを特徴とする遺伝的に形質転換された植物系の作製
方法。 - （２）上記生物的に不活性な粒子が金属粒子であること
を特徴とする特許請求の範囲第（１）項に記載の方法。 - （３）上記金属粒子が金粒子であることを特徴とする特
許請求の範囲第（２）項記載の方法。 - （４）更に、キメラ遺伝子コピーを上記金属粒子に結合
する前に該金属粒子を封止剤で被覆する工程を含むこと
を特徴とする特許請求の範囲第（２）項記載の方法。 - （５）上記封止剤がポリリジンであることを特徴とする
特許請求の範囲第（４）項記載の方法。 - （６）上記外来遺伝子コピーを上記金属粒子に結合する
工程が該粒子上に該遺伝子コピーの溶液を乾燥すること
を含む特許請求の範囲第（４）項記載の方法。 - （７）上記遺伝子コピーの溶液が、上記金属粒子上に該
遺伝子コピーと共に沈殿するＣａＨＰＯ＿４を含むこと
を特徴とする特許請求の範囲第（６）項記載の方法。 - （８）上記の粒子を物理的に加速する工程が、平坦な担
体シート上に該粒子を層状にならし、該担体シートに衝
撃波を照射して、該担体シートを加速し、かつ該担体シ
ートを束縛して、担体粒子の運動量により該担体粒子が
該シートから失われないようにすることを特徴とする特
許請求の範囲第（１）項記載の方法。 - （９）上記担体シートに衝撃を与えるべく発生される衝
撃波が、水滴で橋絡されたスパークギャップを通して高
圧放電することにより発生されることを特徴とする特許
請求の範囲第（８）項記載の方法。 - （１０）上記植物花粉に粒子を加速する工程が、ターゲ
ット表面上に花粉の単層を設け、かつ上記担体粒子の加
速路内に該ターゲット表面を配置する工程を含むことを
特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 - （１１）上記の花粉を上記ターゲット表面に配置する工
程が、該ターゲット表面に鉱油の層を塗布し、その上に
花粉を振りかけ、そこから過剰の花粉を除去することに
より達成されることを特徴とする特許請求の範囲第（１
０）項記載の方法。 - （１２）上記植物の雌性器官を授粉する工程を、内部に
粒子が加速注入されている花粉を上記ターゲット表面か
らブラシで払い落とし、 該花粉を選ばれた雌性親植物の雌性器官に振りまくこと
により達成されることを特徴とする特許請求の範囲第（
１１）項記載の方法。 - （１３）生化学的アッセイをもとに上記子孫からのスク
リーニングを行うことを特徴とする特許請求の範囲第（
１）項記載の方法。 - （１４）該アッセイが抗生物質耐性に対するアッセイで
あることを特徴とする特許請求の範囲第（１３）項記載
の方法。 - （１５）上記子孫のスクリーニングを、植物の形態的特
徴をもとにして行うことを特徴とする特許請求の範囲第
（１）項記載の方法。 - （１６）上記植物がトウモロコシである特許請求の範囲
第（１）項記載の方法。 - （１７）特許請求の範囲第（１）項記載の方法により遺
伝的に形質転換された植物。 - （１８）特許請求の範囲第（１）項記載の方法により遺
伝的に形質転換されたトウモロコシ。 - （１９）コード領域および適当な調節配列を含む外来遺
伝子を雄性親植物からのトウモロコシ花粉に物理的に注
入し、 該花粉を、雌性親植物の成熟トウモロコシの毛に手で授
粉し、かつ該毛を他の花粉源から隔離し、 該授粉された雌性親植物から得られる子孫を生長させる
、各工程を含むことを特徴とする遺伝的に形質転換され
たトウモロコシの製法。 - （２０）上記物理的注入工程が、該外来遺伝子を担体粒
子に結合し、該粒子をトウモロコシ花粉に加速注入する
工程を含むことを特徴とする特許請求の範囲第（１９）
項記載の方法。 - （２１）上記担体粒子が封止剤で被覆された金ビーズで
あることを特徴とする特許請求の範囲第（２０）項記載
の方法。 - （２２）上記封止剤がポリリジンであることを特徴とす
る特許請求の範囲第（２１）項記載の方法。 - （２３）上記粒子をトウモロコシ花粉に加速する工程が
、ターゲット表面に上記花粉を固定するために、該ター
ゲット表面に鉱油を塗布し、該ターゲット表面上に該花
粉を振りまく工程を含むことを特徴とする特許請求の範
囲第（１９）項記載の方法。 - （２４）上記外来遺伝子が乾燥により上記担体粒子に被
覆されることを特徴とする特許請求の範囲第（１９）項
記載の方法。 - （２５）特許請求の範囲第（１９）項記載の方法により
得られるトウモロコシ。 - （２６）親トウモロコシ花粉に物理的に注入することに
より、外来遺伝子が該植物内に導入されたことを特徴と
する、ゲノム中に該外来遺伝子を含むトウモロコシ。 - （２７）上記物理的注入が、上記花粉に加速される上記
担体粒子上に上記外来遺伝子を塗布することにより連成
されることを特徴とする特許請求の範囲第（２６）項記
載のトウモロコシ。 - （２８）上記外来遺伝子が、上記植物内でコード配列が
表現されるように、該コード配列および適当な側面に位
置する調節配列を含むことを特徴とする特許請求の範囲
第（２６）項記載のトウモロコシ。 - （２９）特許請求の範囲第（２６）項に記載の親植物を
有するトウモロコシ。 - （３０）外来キメラ遺伝子および該外来遺伝子を花粉内
に物理的にもち込む少なくとも一つの担体粒子とを内部
に含むことを特徴とするトウモロコシ花粉。 - （３１）上記外来遺伝子がコード配列と適当な側面に配
置された調節配列を含み、該コード配列が上記花粉の子
孫において表現されることを特徴とする特許請求の範囲
第（３０）項記載のトウモロコシ花粉。 - （３２）生細胞中にＤＮＡ担持担体粒子を注入するため
の装置であって、 スパーク放電室、 該スパーク放電室内に伸び、かつスパークギャップによ
り分離されている２つの電極、ここでこれら電極は外部
の高電圧放電源に接続されるようになっている、 上記スパーク放電室上方において垂直方向に移動し得る
ように間隔をおいて支持された担体シート、この担体シ
ートはその上に担体粒子を受けとる、 上記担体シート上方の所定位置に固定された支持スクリ
ーン、および 該支持スクリーン上方に間隔をおいて支持され、上記生
細胞を担持しているターゲット表面、ここで該ターゲッ
ト表面は上記放電室で衝撃波を発生するスパーク放電が
上記担体シートを上記支持スクリーンに加速して、上記
担体粒子を上記ターゲット表面上の細胞内に加速注入す
るように細胞を支持している、 を含むことを特徴とする上記装置。 - （３３）更に、上記電極間を橋絡する水滴を含むことを
特徴とする特許請求の範囲第（３２）項記載の装置。 - （３４）更に、該装置を包囲する真空室を含んでいて、
該装置が部分真空条件下で運転できることを特徴とする
特許請求の範囲第（３２）項記載の装置。 - （３５）上記電極間のスパークギャップが約１〜１．５
ｍｍであることを特徴とする特許請求の範囲第（３２）
項記載の装置。 - （３６）更に、上記スパーク放電室の上方かつ上記担体
シートの下方に配置された、頂部に少なくとも部分的に
開放された部分を有するスペーサリングを含む特許請求
の範囲第（３２）項記載の装置。
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