ES2321375T3 - Proteinas insecticidas de bacillus thuringiensis. - Google Patents
Proteinas insecticidas de bacillus thuringiensis. Download PDFInfo
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Abstract
Un DNA que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos del fragmento insecticida de digestión con tripsina de la proteína codifica por el gen cry1Bf depositado en la BCCM-LMBP bajo el número de acceso LMBP 3986.
Description
Proteínas insecticidas de Bacillus
thuringiensis.
La presente invención se refiere a nuevas
secuencias de DNA que codifican proteínas insecticidas producidas
por cepas de Bacillus thuringiensis. Particularmente, se
proporcionan nuevas secuencias de DNA que codifican una proteína
designada como Cry1Bf que son útiles para proteger las plantas
contra el daño causado por los insectos. Se incluyen también en
esta memoria microorganismos y plantas transformados(as) con
el gen recién aislado de tal modo que los mismos son útiles para
conferir resistencia a los insectos por expresión de la proteína
insecticida.
Bt o Bacillus thuringiensis es bien
conocido por su toxicidad específica para las plagas de insectos, y
ha sido utilizado desde hace casi un siglo para reprimir plagas de
insectos en las plantas. En los últimos años, se han producido
plantas transgénicas que expresan proteínas de Bt que se
encontró reprimen con éxito el daño causado por los insectos en las
plantas (v.g., Vaeck et al., 1987).
A pesar del aislamiento de cierto número de
genes de proteínas cristalinas de Bt, continúa la búsqueda
de nuevos genes codificantes de proteínas insecticidas. De hecho, se
sabe que las proteínas cristalinas insecticidas de Bt tienen
una gama de insectos diana relativamente estrecha comparada con los
insecticidas químicos. Asimismo, la posesión de toxinas múltiples
activas sobre las mismas especies de insectos diana hace posible el
uso de proteínas que tengan modos de acción diferentes a fin de que
pueda evitarse o retardarse el desarrollo de resistencia de los
insectos.
Con anterioridad, se han identificado varios
tipos de proteínas Cry1B (véase Crickmore et al., 1998, que
se incorpora en esta memoria por referencia, para todos los
detalles).
La nueva proteína Cry1Bf tiene la identidad de
secuencia más estrecha con la proteína Cry1Be (Payne et al,
1998, patente U.S. 5.723.758), pero difiere todavía aproximadamente
en un 14 por ciento de la secuencia de aminoácidos de su fragmento
de proteína tóxica con el fragmento tóxico de la proteína
Cry1Be.
De acuerdo con esta invención, se proporciona
una secuencia de DNA que codifica una proteína que comprende la
secuencia de aminoácidos del fragmento insecticida de digestión con
tripsina de la proteína codificada por el gen cry1Bf
depositado en la BCCM-LMBP bajo el número de acceso
LMBP 3986.
De acuerdo con esta invención se prefiere
particularmente una secuencia de DNA que codifica una proteína que
comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento insecticida de
la proteína de SEQ ID No. 2; alternativamente, un DNA que codifica
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.
2; o una secuencia de DNA que comprende la secuencia de DNA de SEQ
ID No. 1.
Adicionalmente, de acuerdo con esta invención se
proporcionan secuencias de DNA que codifican al menos la porción
siguiente de la proteína recién aislada: la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID No. 2 desde el aminoácido de la posición 1 al aminoácido
de la posición 640.
Adicionalmente, de acuerdo con esta invención se
proporcionan las secuencias anteriores de DNA que comprenden una
secuencia artificial de DNA que tiene un uso de codones diferente
comparado con la secuencia de DNA existente naturalmente pero que
codifica la misma proteína o su fragmento insecticida.
Aún más, se proporciona de acuerdo con esta
invención una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos
del fragmento insecticida de digestión con tripsina de la proteína
codificada por el gen cry1Bf depositado en la
BCCM-LMBP bajo el número de acceso LMBP 3986.
En esta invención se prefiere particularmente
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo constituido por: la secuencia de aminoácidos de un
fragmento insecticida de la proteína de SEQ ID No. 2;
alternativamente, una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID No. 2 desde el aminoácido de la posición 1 al
aminoácido de la posición 640; o una proteína que comprende la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2.
Se proporcionan también en esta memoria genes
quiméricos que comprenden el DNA que se ha definido arriba bajo el
control de un promotor expresable en plantas, y células de plantas,
plantas o semillas transformadas que contienen dichos genes
quiméricos, particularmente células de plantas, plantas, o semillas
seleccionadas del grupo constituido por maíz, algodón, arroz, colza
oleaginosa, especies de Crucíferas, berenjena, soja, patata,
girasol, tomate, caña de azúcar, té, habichuelas, tabaco, fresa,
trébol, pepino, sandía, pimiento, avena, cebada, trigo, dalia,
gladiolo, crisantemo, remolacha azucarera, sorgo, alfalfa, y
cacahuete. De acuerdo con esta invención, el gen quimérico puede
estar integrado en el DNA nuclear o el DNA de los cloroplastos de
las células vegetales.
Adicionalmente, de acuerdo con esta invención se
proporcionan microorganismos transformados que contienen cualquiera
de las secuencias anteriores de DNA, particularmente los
seleccionados de los géneros Agrobacterium, Escherichia, o
Bacillus.
Se proporciona también en esta memoria un
proceso para reprimir insectos, que comprende expresar cualquiera
de las secuencias de DNA anteriores en una célula hospedadora,
particularmente células vegetales, y poner en contacto los insectos
con dichas células hospedadoras, y un proceso para conferir a una
planta resistencia a los insectos, que comprende transformar
células de plantas con cualquiera de las secuencias de DNA o genes
quiméricos anteriores, y regenerar plantas transformadas a partir de
dichas células que son resistentes a los insectos.
De acuerdo con esta invención, han sido aisladas
y caracterizadas secuencias de DNA que codifican una nueva toxina
de Bt. El nuevo gen se designó cry1Bf, y su proteína
codificada Cry1Bf.
De acuerdo con esta invención, "proteína
Cry1Bf" hace referencia a cualquier proteína que comprenda el
fragmento mínimo de proteína de la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID No. 2 que retiene actividad insecticida, particularmente
cualquier proteína que comprenda la secuencia de aminoácidos desde
el aminoácido de la posición 1 al aminoácido de la posición 640 en
SEQ ID No. 2, con inclusión, pero sin carácter limitante, de la
proteína completa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2.
Esto incluye híbridos o proteínas quiméricas que comprenden el
fragmento mínimo de la proteína tóxica, así como proteínas que
contienen al menos uno de los tres dominios funcionales del
fragmento tóxico de SEQ ID No. 2.
La expresión "DNA/proteína que comprende la
secuencia X", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a
un DNA o una proteína que incluye o contiene al menos la secuencia
X, de tal modo que otras secuencias de nucleótidos o aminoácidos
pueden incluirse en el extremo 5' (o terminal N) y/o 3' (o terminal
C), v.g. (la secuencia de nucleótidos de) una proteína marcadora
seleccionable como se describe en EP 0 193 259.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"cry1BfDNA" hace referencia a cualquier secuencia de DNA
que codifica la proteína Cry1Bf, respectivamente, como se ha
definido arriba. Esto incluye secuencias de DNA existentes
naturalmente, artificiales o sintéticas que codifican las proteínas
recién aisladas o sus fragmentos insecticidas como se han definido
arriba. Se incluyen también en esta memoria secuencias de DNA que
codifican proteínas insecticidas que son lo bastante similares a
las regiones codificantes de las secuencias de DNA genómico
depositadas o a las secuencias proporcionadas en el listado de
secuencias de tal manera que las mismas pueden (es decir, tienen la
capacidad de) hibridarse a estas secuencias de DNA en condiciones de
hibridación severas. La expresión condiciones de hibridación
severas, como se utiliza en esta memoria, se refiere particularmente
a las condiciones siguientes: inmovilización de las secuencias de
DNA genómico relevantes en un filtro, y prehibridación de los
filtros durante 1 a 2 horas en 50% formamida; 50% SSPE, 2x reactivo
de Denhardt y 0,1% SDS a 42ºC, o 1 a 2 horas en 6 x SSC, 2 x
reactivo de Denhardt y 0,1% SDS a 68ºC. La sonda desnaturalizada y
marcada se añade luego directamente al fluido de prehibridación y
se lleva a cabo incubación durante 16 a 24 horas a la temperatura
apropiada arriba mencionada. Después de la incubación, se lavan los
filtros durante 20 minutos a la temperatura ambiente en 1 x SSSC,
0,1% SDS, seguido por tres lavados de 20 minutos cada uno a 68ºC en
0,2 x SSC y 0,1% SDS. Se realiza una autorradiografía por
exposición de los filtros durante 24 a 48 horas a película de rayos
X (Kodak XAR-2 o equivalente) a -70ºC con un filtro
de intensificación. Por supuesto, en este proceso pueden utilizarse
condiciones y parámetros equivalentes con tal que todos ellos
retengan las condiciones deseadas de hibridación severa. Una de
tales condiciones equivalentes incluye: inmovilización de las
secuencias de DNA genómico relevantes en un filtro, y
prehibridación de los filtros durante 1 a 2 horas en 50% formamida,
5% SSPE, 2 x reactivo de Denhardt y 0,1% SDS a 42ºC o 1 a 2 horas en
6 x SSC, 2 x reactivo de Denhardt y 0,1% SDS a 68ºC. La sonda
desnaturalizada (DIG- o radio-) marcada se añade luego directamente
al fluido de prehibridación y se lleva a cabo incubación durante 16
a 24 horas a la temperatura apropiada arriba mencionada. Después de
la incubación, se lavan luego los filtros durante 30 minutos a la
temperatura ambiente en 2 x SSC, 0,1% SDS, seguido por dos lavados
de 30 minutos cada uno a 68ºC en 0,5 x SSC y 0,1% SDS. Se realiza
una autorradiografía por exposición de los filtros durante 24 a 48
horas a película de rayos X (Kodak XAR-2 o
equivalente) a -70ºC con un filtro intensificador.
"Actividad insecticida" de una proteína,
como se utiliza en esta memoria, significa la capacidad de una
proteína para matar los insectos cuando se proporciona dicha
proteína como alimento a los insectos, preferiblemente por
expresión en un hospedador recombinante tal como una planta.
"Cantidades represoras de los insectos" de una proteína, como
se utiliza en esta memoria, hace referencia a una cantidad de
proteína que es suficiente para limitar el daño causado a una
planta por los insectos que se alimentan de dicha planta hasta
niveles comercialmente aceptables, v.g. por matar los insectos o
por inhibir el desarrollo o crecimiento de los insectos de tal
manera que aquéllas aportan un menor daño a una planta y el
rendimiento de una planta no se ve afectado desfavorablemente en un
grado signifi-
cativo.
cativo.
De acuerdo con esta invención, los insectos
sensibles a las nuevas proteínas Cry de la invención se ponen en
contacto con esta proteína en cantidades represoras de los insectos,
preferiblemente cantidades insecticidas.
"Proteína Cry" o "proteína Cry de esta
invención", como se utiliza en esta memoria, hacen referencia a
la nueva proteína aislada de acuerdo con esta invención e
identificada en esta memoria como proteína Cry1Bf. Una proteína
Cry, como se utiliza en esta memoria, puede ser una proteína con el
tamaño de longitud total, denominada también una protoxina, o puede
encontrarse en una forma ligera o totalmente truncada (v.g.,
truncación en el terminal N y el terminal C) con tal que se retenga
la actividad insecticida, o puede ser una combinación de diferentes
proteínas o partes de proteínas en una proteína híbrida o de fusión.
Una "protoxina Cry" hace referencia a la proteína cristalina
de longitud total tal como es codificada por la secuencia de DNA de
Bt existente naturalmente; una "toxina Cry" hace
referencia a un fragmento insecticida de la misma, particularmente
el fragmento tóxico más pequeño de la misma, comprendido típicamente
en el intervalo de pesos moleculares de aproximadamente 60 a
aproximadamente 80 kD como se determina por electroforesis
SDS-PAGE. Un "gen cry" o "DNA
cry", como se utiliza en esta memoria, es una secuencia de
DNA que codifica una proteína Cry de acuerdo con esta invención,
haciendo referencia a cualquiera de las secuencias de DNA de
cry1Bf arriba definidas.
El "fragmento tóxico más pequeño" de una
proteína Cry como se utiliza en esta memoria, es aquel fragmento
que puede obtenerse por digestión con tripsina o quimotripsina de la
proteína cristalina solubilizada de longitud total que retiene la
toxicidad, o aquel fragmento tóxico de proteína codificado por los
fragmentos de DNA de la proteína Cry. Esta proteína tendrá en la
mayor parte de los casos una truncación corta en el terminal N y
una troncación larga en el terminal C comparada con la protoxina.
Aunque para la expresión recombinante, los fragmentos tóxicos que
comienzan en o alrededor de el aminoácido de la posición original 1
son una realización más preferida de acuerdo con esta invención,
debe indicarse que además de una truncación en el terminal C,
pueden estar delecionados también algunos aminoácidos del terminal N
con tal que se retenga el carácter insecticida de la proteína. El
extremo N-terminal del fragmento tóxico más pequeño
se determina convenientemente por determinación de la secuencia de
aminoácidos del terminal N de la proteína cristalina soluble tratada
con tripsina o quimotripsina por métodos disponibles rutinariamente
en la técnica.
El DNA codificante de las proteínas Cry de esta
invención puede aislarse de manera convencional a partir de las
cepas de E. coli, depositadas en 25 de noviembre de 1999 en
la BCCM-LMBP bajo los números de acceso LMBP 3983,
LMBP 3984, LMBP 3985 y LMBP 3986. Las proteínas Cry codificadas
pueden utilizarse para preparar anticuerpos específicos
monoclonales o policlonales de manera convencional (Hofte et
al., 1988). Las formas de toxina pueden obtenerse por digestión
con proteasa (v.g., tripsina) de las protoxinas Cry.
Las secuencias de DNA que codifican las
proteínas Cry pueden aislarse de manera convencional a partir de las
cepas respectivas o pueden sintetizarse sobre la base de la
secuencia de aminoácidos codificada.
Las secuencias de DNA que codifican las
proteínas Cry de la invención se identificaron por digestión de DNA
total procedente de cepas aisladas de Bt con enzimas de
restricción; fraccionamiento por tamaños de los fragmentos de DNA,
así producidos, en fracciones de DNA de 5 a 10 Kb; ligación de estas
fracciones a vectores de clonación; cribado del E. coli,
transformado con los vectores de clonación, con una sonda de DNA que
se construyó a partir de una región de genes de proteínas
cristalinas Bt conocidas o con una sonda de DNA basada en
fragmentos PCR específicos generados a partir de DNA de Bt
utilizando iniciadores correspondientes a los genes de las
proteínas cristalinas de Bt conocidas.
Asimismo, secuencias de DNA para uso en esta
invención pueden producirse por síntesis. De hecho, debido a la
degeneración del código genético, algunos codones de aminoácidos
pueden estar reemplazados con otros sin cambiar la secuencia de
aminoácidos de la proteína. Adicionalmente, algunos aminoácidos
pueden emplearse en sustitución de otros aminoácidos equivalentes
sin cambiar significativamente la actividad insecticida de la
proteína. Asimismo, cambios en la secuencia o composición de
aminoácidos en regiones de la molécula, diferentes de los
responsables de fijación y toxicidad (v.g. formación de poros)
tienen menos probabilidad de causar una diferencia en la actividad
insecticida de la proteína. Tales equivalentes del gen incluyen
secuencias de DNA que se hibridan a la secuencia de DNA de las
toxinas o protoxinas Cry de SEQ ID No. 2, 4, ó 6 en condiciones
severas y que codifican una proteína con las mismas características
insecticidas que la (pro)toxina de esta invención, o
secuencias de DNA que codifican proteínas con una identidad de
secuencia de aminoácidos de al menos 85%, preferiblemente al menos
90%, muy preferiblemente al menos 95%, con la forma de la toxina
proteínica (desde el término N hasta 2 aminoácidos más allá del
bloque 5 de la secuencia conservada como se define en Schnepf et
al., 1998) o con la forma de protoxina proteínica de la proteína
Cry1Bf de esta invención, como se determina utilizando el programa
GAP del paquete Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EE.UU.,
versión 10.0; se utilizaron los defectos de GCG en el programa GAP;
para las comparaciones de secuencia de aminoácidos, se utilizó la
matriz de registro blosum62).
Por supuesto, puede construirse cualquier otra
secuencia de DNA que difiera en su uso de codones pero que
codifique la misma proteína o una proteína similar que tenga
sustancialmente la misma actividad insecticida, dependiendo del
propósito particular. Se ha descrito, en sistemas de expresión
procariotas y eucariotas, que el cambio del uso de codones al de la
célula hospedadora es deseable para la expresión génica en
hospedadores extraños (Benneze & may, 1982; Itakura, 1977).
Adicionalmente, se sabe que los genes de la proteína cristalina de
Bt no presentan sesgo alguno hacia codones eucariotas, y son
muy ricos en AT (Adang et al., 1985, Schnepf et al.,
1985). En la bibliografía están disponibles tablas de uso de codones
(Wada et al., 1990; Murray et al., 1989) y en los
principales bancos de datos de secuencias de DNA (v.g. EMBL en
Heidelberg, Alemania). De acuerdo con ello, pueden construirse
secuencias de DNA sintético de tal manera que se produzcan las
mismas o sustancialmente las mismas proteínas. Es evidente que
pueden idearse varias secuencias de DNA una vez que se conoce la
secuencia de aminoácidos de la proteína Cry de esta invención. Tales
otras secuencias de DNA incluyen secuencias de DNA sintéticas o
semisintéticas que se han cambiado a fin de desactivar ciertos
sitios en el gen, v.g. por desactivación selectiva de ciertos
elementos crípticos reguladores o de procesamiento presentes en la
secuencia nativa como se describe en las publicaciones PCT WO
91/16432 y WO 93/09218, o por adaptación del uso global de codones
al de un organismo hospedador más afín, preferiblemente el del
organismo hospedador en el que se desea la expresión. Cuando se
producen dichos genes, la secuencia de aminoácidos codificada debe
retenerse en el mayor grado posible, aunque pueden hacerse
truncaciones o sustituciones o adiciones poco importantes de
aminoácidos con tal que no se vea afectada negativamente la
toxicidad de la proteína.
Modificaciones pequeñas en una secuencia de DNA
tal como la descrita arriba pueden realizarse rutinariamente por
mutagénesis mediada por PCR (Ho et al., 1989, White et
al., 1989).
Con la expresión "sustancialmente igual",
cuando se hace referencia a una proteína, se entiende la inclusión
de una proteína que difiere en algunos aminoácidos, o a la que se
han añadido algunos aminoácidos (v.g. una proteína de fusión, véase
Vaeck et al., 1987) o de la que se ha delecionado (v.g.
truncación N- o C-terminal), con tal que la
proteína no presente una diferencia fundamental en su actividad
insecticida.
La expresión "dominio funcional" de una
toxina Cry como se utiliza en esta memoria significa cualquier o
cualesquiera partes o dominios de la toxina con una estructura
específica que puede transferirse a otra proteína (Cry) para
proporcionar una nueva proteína híbrida que tanga al menos una
característica funcional (v.g., las características de fijación y/o
toxicidad) de la toxina Cry de la invención (Ge et al.,
1991). Dichas partes pueden formar una característica esencial de
la proteína hibrida Bt con las características de fijación
y/o toxicidad de la proteína Cry de esta invención. Una proteína
híbrida de este tipo puede tener una gama de hospedadores ampliada,
una toxicidad incrementada y/o puede utilizarse en una estrategia
para prevenir el desarrollo de resistencia a los insectos
(Publicación de Patente Europea ("EP") 408403; Visser et
al., 1993).
Los fragmentos de 5 a 10 Kb, preparados a partir
de DNA total de las cepas Bt de la invención, pueden ligarse
en vectores de expresión adecuados y transformarse en E.
coli, y los clones pueden cribarse luego por métodos
convencionales de inmunosondeo de colonias (French et al.,
1986) para expresión de la toxina con anticuerpos monoclonales o
policlonales generados contra la proteína Cry, o por hibridación con
sondas de DNA.
Asimismo, los fragmentos de 5 a 10 Kb,
preparados a partir de DNA total de las cepas Bt de la
invención o fragmentos del mismo clonados y/o subclonados en E.
coli, pueden ligarse en vectores lanzadera Bt adecuados
(Lereclus et al., 1992) y transformarse en un mutante
Bt cristal menos. Los clones se criban luego respecto a la
producción de cristales (detectada por microscopía) o proteínas
cristalinas (detectadas por SDS-PAGE).
El gen que codifica la proteína Cry de esta
invención puede secuenciarse de manera convencional (Maxam y
Gilbert, 1980; Sanger, 1977) para obtener la secuencia de DNA. Las
comparaciones de secuencia indican que los genes son diferentes de
genes descritos previamente que codifican protoxinas y toxinas con
actividad contra Lepidópteros (Höfte y Whiteley, 1989; Crickmore,
et al., 1998); y las actualizaciones de 15 de diciembre de
1999 y 16 de octubre de 2000 en el sitio de nomenclatura de
Bt en Internet correspondiente a la publicación de Crickmore
et al. (1998) que se encuentra en:
http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.
html
Una parte eficaz como insecticida de las
secuencias de DNA, que codifica una porción eficaz como insecticida
de la forma de protoxina de la proteína Cry recién identificada,
puede producirse de manera convencional después del análisis de la
secuencia del gen. En tales fragmentos, se prefiere que se retenga
al menos la secuencia hasta el extremo C-terminal
del bloque 5 de secuencia conservada de las proteínas Bt
(Höfte & Whiteley, 1989; Schnepf et al., 1998),
preferiblemente hasta dos amino-ácidos del terminal C del bloque 5
de la secuencia conservada. La secuencia de aminoácidos de la
proteína Cry puede determinarse a partir de la secuencia de DNA de
las secuencias de DNA aisladas. Por "una parte eficaz como
insecticida" de secuencias de DNA que codifican la proteína Cry,
a la que se hace referencia también en esta memoria como "gen
truncado" o "DNA truncado", se entiende una secuencia de
DNA que codifica un polipéptido que tiene menos aminoácidos que la
forma de protoxina de la proteína Cry, pero que es insecticida para
los insectos.
Con objeto de expresar la totalidad o una parte
eficaz como insecticida de la secuencia de DNA que codifica una
proteína Cry de esta invención en E. coli, en otras cepas de
Bt y en plantas, pueden introducirse sitios de restricción
adecuados, que flanquean la secuencia de DNA. Esto puede hacerse por
mutagénesis orientada, utilizando procedimientos bien conocidos
(Stanssens et al., 1989; White et al., 1989). Con
objeto de obtener una expresión mejorada en plantas, el uso de
codones del gen Cry o parte eficaz como insecticida del gen
Cry de esta invención puede modificarse para formar un gen o
parte de gen equivalente, modificado o artificial de acuerdo con
las publicaciones PCT WO 91/16432 y WO 93/09218; EP 0 358 962 y EP 0
359 472, o los genes o partes de genes Bt pueden insertarse
en el genoma del cloroplasto y expresarse en el mismo utilizando un
promotor activo en cloroplastos (v.g., McBride et al., 1995).
Para obtener expresión mejorada en plantas monocotiledóneas tales
como maíz, puede añadirse también un intrón de monocotiledónea al
gen quimérico, y la secuencia de DNA del gen cry o su parte
insecticida de esta invención puede cambiarse ulteriormente de una
manera neutra respecto a la traducción, a fin de modificar
secuencias de DNA posiblemente inhibidoras presentes en la parte
del gen por medio de inserción de intrones orientada y/o por la
introducción de cambios respecto al uso de codones, v.g.,
adaptación del uso de codones al más preferido por la planta
específica (Murrait et al., 1989) sin cambiar
significativamente la secuencia de aminoácidos codificada.
Adicionalmente, pueden evaluarse las propiedades
de fijación de la proteína Cry de la invención, utilizando métodos
conocidos en la técnica (Van Rie et al., 1990), a fin de
determinar si la proteína Cry de la invención se fija a sitios en
el intestino medio de los insectos que son diferentes de los
reconocidos por otras proteínas Cry u otras proteínas Bt
conocidas. Las toxinas Bt con sitios de fijación diferentes
en insectos sensibles relevantes son muy valiosas para reemplazar
toxinas Bt conocidas a las cuales pueden haber desarrollado
resistencia los insectos, o para ser utilizadas en combinación con
toxinas Bt que tengan un modo de acción diferente a fin de
impedir o retardar el desarrollo de resistencia por los insectos
frente a las toxinas Bt, particularmente cuando se expresan
en una planta. Debido a las características de la toxina Bt
recién aislada, es extremadamente útil para la transformación de
plantas, v.g. monocotiledóneas tales como maíz o arroz y hortalizas
tales como plantas de especies de Crucíferas, proteger estas
plantas contra el daño causado por los insectos.
La parte del gen cry eficaz como
insecticida o su equivalente, preferiblemente el gen Cry quimérico,
que codifica una porción eficaz como insecticida de la protoxina
Cry, puede insertarse establemente de manera convencional en el
genoma nuclear de una célula simple de la planta, y la célula así
transformada de la planta puede utilizarse de manera convencional
para producir una planta transformada que es resistente a los
insectos. A este respecto, un plásmido Ti desarmado, que contiene
la parte del gen cry eficaz como insecticida en
Agrobacterium tumefaciens, puede utilizarse a fin de
transformar la célula de la planta, y después de ello, puede
regenerarse una planta transformada a partir de la célula
transformada de la planta utilizando los procedimientos descritos,
por ejemplo, en EP 0 116 718, EP 0 270 822, en la publicación PCT WO
84/02913 y en la solicitud de Patente Europea publicada ("EP")
0 242 246, y en Gould et al. (1991). Vectores de plásmido Ti
preferidos contienen cada uno la parte del gen cry eficaz
como insecticida entre las secuencias de borde, o al menos
localizadas a la izquierda o a la derecha de la secuencia de borde,
del T-DNA del plásmido Ti. Por supuesto, pueden
utilizarse otros tipos de vectores para transformar la célula
vegetal, utilizando procedimientos tales como transferencia directa
de genes (como se describe, por ejemplo, en EP 0 233 247,
transformación mediada por polen (como se describe, por ejemplo, en
EP 0 270 356, publicación PCT WO 85/01856, y patente U.S.
4.684.611), transformación de plantas mediadas por virus de RNA
(como se describe, por ejemplo, en EP 0 067 553 y en la patente
U.S. 4.447.956), transformación mediada por liposomas (como se
describe, por ejemplo, en la patente U.S. 4.536.475), y otros
métodos tales como los métodos recién descritos para transformación
de ciertas líneas de maíz (Fromm et al., 1990;
Gordon-Kamm et al., 1990) y arroz (Shimamoto
et al., 1989; Datta et al., 1990) y el método recién
descrito para transformación de monocotiledóneas en general
(publicación PCT WO
92/09696).
92/09696).
La planta transformada resultante puede
utilizarse en un esquema convencional de mejora genética de plantas
para producir más plantas transformadas con las mismas
características o para introducir la parte del gen cry
eficaz como insecticida en otras variedades de la misma especie o de
especies de plantas afines. Las semillas que se obtienen a partir
de las plantas transformadas contienen la parte del gen cry
eficaz como insecticida como inserción genómica estable. Las
células de la planta transformada pueden cultivarse de manera
convencional para producir la porción eficaz como insecticida de la
protoxina Cry, preferiblemente la toxina Cry, que puede recuperarse
para uso en composiciones insecticidas convencionales contra
Lepidópteros (Patente U.S. 5.254.799). De acuerdo con esta
invención, pueden utilizarse plantas o semillas de la invención para
obtener resistencia a los insectos, v.g. por siembra o plantación
de dichas semillas o plantas en un campo en el que usualmente
existen insectos dañinos. Métodos para la obtención de resistencia a
los insectos y métodos para obtención de rendimiento mejorado o
deterioro reducido por los insectos se proporcionan por consiguiente
de acuerdo con la invención por plantación o siembra en un campo,
preferiblemente un campo en el cual existen habitualmente insectos
dañinos que se alimentan de dichas plantas, ocurren usualmente o
debe esperarse que ocurran a niveles que ocasionen daños económicos
a las plantas, de las plantas o semillas de la invención que
producen la proteína Cry de la invención.
La parte del gen cry eficaz como
insecticida, preferiblemente el gen cry truncado, se inserta
en el genoma de una célula vegetal de tal manera que el gen
insertado se encuentra aguas bajo (es decir, 3') de, y bajo el
control de, un promotor que puede dirigir la expresión de la parte
del gen en la célula vegetal. Esto se realiza preferiblemente por
inserción del gen quimérico cry en el genoma de la célula
vegetal, particularmente en el genoma nuclear o del cloroplasto.
Promotores preferidos incluyen: los promotores 35S constitutivos
fuertes (los "promotores 35S") del virus del mosaico de la
coliflor (CaMV) de aislados CM 1841 (Gardner et al., 1981),
CabbB-S (Franck et al., 1980) y
CabbB-JI (Hull y Howell, 1987); promotores de la
familia de la ubiquitina (v.g. el promotor ubiquitina del maíz de
Christensen et al., 1992, véase también Cornejo et
al., 1993), el promotor gos2 (de Pater et al., 1992), el
promotor emu (Last et al., 1990), los promotores actina del
arroz tales como el promotor descrito por Zhang et al.
(1991); y el promotor TR1' y el promotor TR2' (el "promotor
TR1'" y el "promotor TR2'", respectivamente), que dirigen la
expresión de los genes 1' y 2', respectivamente, del
T-DNA (Velten et al., 1984).
Alternativamente, puede utilizarse un promotor que no es
constitutivo pero que es más bien específico para uno o más tejidos
u órganos de la planta (v.g. hojas y/o raíces) con lo cual la parte
del gen cry insertada se expresa únicamente en células de los
tejidos u órganos específicos. Por ejemplo, la parte del gen
cry eficaz como insecticida podría expresarse selectivamente
en las hojas de una planta (v.g., maíz, algodón) por introducción de
la parte del gen eficaz como insecticida bajo el control de un
promotor inducible por la luz tal como el promotor del gen de la
subunidad pequeña de
ribulosa-1,5-bisfosfato-carboxilasa
de la planta propiamente dicha o de otra planta tal como un guisante
como se describe en la Patente U.S. 5.254.799. Otra alternativa
consiste en utilizar un promotor cuya expresión sea inducible
(v.g., por temperatura, lesión o factores químicos).
La parte del gen cry eficaz como
insecticida se inserta en el genoma de la planta de tal manera que
la parte insertada del gen se encuentra aguas arriba (es decir, 5')
respecto a señales adecuadas de regulación de la transcripción del
extremo 3' (es decir, formación de transcritos y señales de
poliadenilación). Esto se realiza preferiblemente por inserción del
gen cry quimérico en el genoma de la célula vegetal. Señales
preferidas de poliadenilación y formación de transcritos incluyen
las del gen de octopina-sintasa (Gielen et
al., 1984) y el gen 7 del T-DNA (Velten y
Schell, 1985), que actúan como secuencias de DNA 3' sin traducir en
las células vegetales transformadas.
La parte del gen cry eficaz como
insecticida puede insertarse opcionalmente en el genoma de la planta
como un gen híbrido (patente U.S. 5.254.799; Vaeck et al.,
1987) bajo el control del mismo promotor como un gen marcador
seleccionable, tal como el gen neo (EP 0 242 236) que
codifica resistencia a la kanamicina, con lo que la planta expresa
una proteína de fusión.
La totalidad o parte del gen cry que
codifica una proteína anti-lepidópteros puede
utilizarse también para transformar otras bacterias, tales como una
B. thuringiensis que tiene actividad insecticida contra
Lepidoptera o Coleoptera. De este modo, puede producirse una cepa de
Bt transformada que es útil para combatir un amplio espectro
de plagas de insectos lepidópteros y coleópteros o para combatir
plagas de insectos lepidópteros adicionales. La transformación de
bacterias, tales como bacterias del género Agrobacterium,
Bacillus o Escherichia, con la totalidad o parte del gen
cry de esta invención, incorporado en un vehículo de
clonación adecuado, puede llevarse a cabo de manera convencional,
utilizando preferiblemente técnicas convencionales de
electroporación como se describe en Mahillon et al. (1989) y
en la Publicación de Patente PCT WO 90/06999.
Cepas transformadas de especies de
Bacillus que contienen el gen cry de esta invención
pueden fermentarse por métodos convencionales (Dulmage, 1981;
Bernhard y Utz, 1993) para proporcionar rendimientos de células
altos. En condiciones apropiadas que son bien conocidas (Dulmage,
1981) todas estas cepas esporulan para producir proteínas
cristalinas que contienen la protoxina Cry con rendimientos
altos.
Una composición insecticida, particularmente
anti-lepidópteros, de esta invención puede
formularse de manera convencional utilizando los microorganismos
transformados con el gen cry, o preferiblemente su proteína
Cry respectiva o la protoxina, toxina o porción de protoxina Cry
eficaz como insecticida como ingrediente activo, junto con
vehículos, diluyentes, emulsionantes y/o dispersantes adecuados
(v.g. como se describe en Bernhard y Utz, 1993). Esta composición
insecticida puede formularse como un polvo humectable, pelets,
gránulos o polvo o como una formulación líquida con disolventes
acuosos o no acuosos formando una espuma, gel, suspensión,
concentrado, etc.
Un método para reprimir los insectos,
particularmente Lepidópteros de acuerdo con esta invención puede
comprender aplicar, v.g. (aplicar por pulverización), a un lugar
(área) a proteger, una cantidad insecticida de la proteína Cry o
células hospedadoras transformadas con el gen cry de esta
invención. El locus a proteger puede incluir, por ejemplo, el
hábitat de las plagas de insectos o el crecimiento de vegetación o
un área en la que va a cultivarse vegetación.
Para obtener la protoxina o toxina Cry, células
de los hospedadores recombinantes que expresan la proteína Cry
pueden cultivarse de manera convencional en un medio de cultivo
adecuado y lisarse luego utilizando medios convencionales tales
como degradación enzimática, detergentes o análogos. La protoxina
puede separarse luego y purificarse por técnicas estándar tales
como cromatografía, extracción, electroforesis, o análogos. La
toxina puede obtenerse luego por digestión con tripsina de la
protoxina.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención, y
no se aportan con carácter limitante de la invención o la
protección buscada. El listado de secuencias al que se hace
referencia en los ejemplos, las reivindicaciones y la descripción
es como sigue:
SEQ ID No. 1 - Secuencia de aminoácidos y DNA de
la proteína y el DNA Cry1Bf
SEQ ID No. 2 - Secuencia de aminoácidos de la
proteína Cry1Bf
SEQ ID No. 3 - Secuencia de DNA para el
iniciador Cry1B.fw.
SEQ ID No. 4 - Secuencia de DNA para el
iniciador B.R.
SEQ ID No. 5 - Secuencia de DNA para el
iniciador B.F.
A no ser que se indique otra cosa en los
ejemplos, todos los procedimientos para la producción y manipulación
de DNA recombinante se llevan a cabo por los procedimientos
estándar descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning - A
Laboratory Manual, Segunda Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
NY (1989), y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994)
Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE.UU.
Materiales y métodos estándar para trabajos de biología molecular
en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993)
por R.R.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific
Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications
(Reino Unido). Procedimientos para la tecnología PCR pueden
encontrarse en "PCR protocols: a guide to methods and
applications", recopilado por M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J.
Sninsky y T.J. White (Academic Press, Inc., 1990).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La cepa BtS02072BG se aisló a partir de una
muestra de polvo de cereales recogida en Santo Tomás la Unión,
Ilocos, Filipinas.
La cepa puede cultivarse en medios estándar
convencionales, preferiblemente medio T_{3} (triptona 3 g/l,
triptosa 2 g/l, extracto de levadura 1,5 g/l, 5 mg MnCl_{2},
Na_{2}HPO_{4}\cdot2H_{2}O 0,05 M,
NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O 0,05 M, pH 6,8 y 1,5% agar),
preferiblemente a 28ºC. Para almacenamiento a largo plazo, se
prefiere mezclar un volumen igual de una suspensión
esporas-cristales con un volumen igual de glicerol
al 50% y almacenarlo a -70ºC o liofilizar una suspensión
esporas-cristales. Para la esporulación, se prefiere
el cultivo en medio T_{3} durante 72 horas a 28ºC, seguido por
almacenamiento a 4ºC. Las proteínas cristalinas producidas por las
cepas durante la esporulación se empaquetan en cristales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se realizaron ensayos de toxicidad sobre larvas
recién nacidas de Helicoverpa zea, Heliothis virescens,
Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda y Sesamia
nonagrioides alimentadas con una dieta artificial estratificada
con mezclas esporas-cristales de BtS02072BG, a razón
de aproximadamente 10^{9} esporas-cristales por
ml.
La dieta artificial (Vanderzant, 1962), se
dosificó en los pocillos de placas Costar de 24 pocillos para los
tests en H. Zea, H. virescens y O. nubilalis. Se
aplicaron 50 microlitros de la mezcla
esporas-cristales en la superficie de la dieta y se
secaron en una corriente laminar de aire. Para los tests en H.
Zea y H. virescens, se puso una larva en cada pocillo y
se utilizaron 20 larvas por muestra. Para los tests con O.
nubilalis, se pusieron dos larvas en cada pocillo y se
utilizaron 24 larvas por muestra. La dieta artificial se dosificó
en los pocillos de placas Costar de 48 pocillos para los tests con
S. frugiperda y S. nonagrioides. Se aplicaron 25
microlitros de la mezcla esporas-cristales en la
superficie de la dieta y se secaron en una corriente laminar de
aire. Se puso una larva en cada pocillo y se utilizaron 18 larvas
por muestra. Se contaron las larvas muertas y supervivientes el
séptimo día. El porcentaje de larvas muertas se muestra a
continuación en la Tabla I.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El gen BtS02072BG se detectó como sigue. Se
realizó en primer lugar una PCR utilizando iniciadores génicos
degenerados de proteínas cristalinas en la cepa BtS02419J. El
producto de amplificación resultante se utilizó como molde en una
PCR secundaria utilizando iniciadores degenerados de proteínas
cristalinas.
El producto de amplificación resultante se
purificó utilizando el sistema de purificación Wizard PCR preps
(Promega), y se ligó al vector pGEM-T (Promega). La
mezcla de ligación se sometió a electroporación en E. coli
XL1 Blue. Se realizó una minipreparación de transformantes que
contenían al menos 40 inserciones, y se realizaron digestiones con
enzimas de restricción seleccionadas. Después de la electroforesis
del DNA de la minipreparación digerido, pudieron observarse
diferentes patrones de fragmentos de DNA. Para cada patrón se
seleccionó al menos una colonia. Se realizó una preparación de DNA
apropiada con objeto de determinar la secuencia de la inserción del
plásmido presente en cada colonia seleccionada.
A partir de los productos de amplificación
clonados de la cepa BtS02419J, se encontró una secuencia que era
idéntica al fragmento correspondiente de cry1Be1, excepto por
la diferencia de un solo nucleótido. En primer lugar, se
seleccionaron iniciadores para evaluar la presencia de una secuencia
cry similar a la del fragmento del gen cry
secuenciado a partir de BtS02419J en cierto número de cepas Bt, una
de las cuales era la cepa BtS02072BG. Estos iniciadores tenían la
secuencia siguiente (5' a 3'):
- \quad
- Iniciador directo: cry1B.fw: CAG TCC AAA CGG GTA TAA AC
- \quad
- Iniciador inverso: B.R: CTG CTT CGA AGG TTG CAG TA
La alineación de las secuencias determinadas a
partir de los productos de amplificación con secuencias cry
disponibles públicamente demuestra que la cepa BtS02072BG contiene
un nuevo gen de tipo cr1B.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Con objeto de aislar el gen de longitud total de
tipo cry1B a partir de BtS02072BG, se preparó el DNA total
de esta cepa y se digirió parcialmente con Sau3A. El DNA digerido se
fraccionó por tamaños en un gradiente de sacarosa y los fragmentos
que tenían una longitud de 5 Kb a 10 Kb se ligaron al vector de
clonación pUC10 digerido con BamH1 y tratado con TsAP (fosfatasa
alcalina termosensible) (Yannisch-Perron et
al, 1985). La mezcla de ligación se sometió a electroporación
en células E. coli XL1-Blue o E. coli
JM109. Los transformantes se extendieron en placas
LB-triacilina que contenían XgaI e IPTG y se
seleccionaron las colonias blancas para utilización en experimentos
de hibridación en filtro. Los clones recombinantes de E. coli
que contenían el vector se cribaron luego con las sondas apropiadas
marcadas con DIG. Estas sondas se prepararon como sigue. En primer
lugar, se realizó una PCR utilizando como molde células de un clon
recombinante de E. coli que contenían un plásmido que
albergaba el fragmento del gen cry particular, amplificado
previamente utilizando iniciadores apropiados que se muestran en la
Tabla II.
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\vskip1.000000\baselineskip
El producto de amplificación resultante se
purificó en gel y se utilizó como molde en una reacción PCR
secundaria utilizando dNTPs marcados con DIG. Una cantidad
apropiada de este producto de amplificación se utilizó en
reacciones de hibridación.
La hibridación de colonias para la cepa
BtS02072BG se realizó con la sonda de tipo cry1B. Después de
la identificación de una colonia positiva que contenía un plásmido
que albergaba el gen cry de longitud total, se determinó la
secuencia del gen cry utilizando el método de marcación con
terminador de tinte y un secuenciador de DNA Perkin Elmer ABI
Prism-377 para ambas cadenas. Después de la
secuenciación de DNA, el gen tipo cry1B de BtS02072BG se
designó cry1Bf. La secuencia genómica del gen cry1Bf
aislado, así como la proteína que codifica el mismo, se muestran en
el Listado de Secuencias incluido en esta solicitud. La comparación
de las secuencias con secuencias conocidas de DNA o proteína Cry
demostró que las secuencias son nuevas y difieren en un número
sustancial de nucleótidos o aminoácidos respecto de los genes y
proteínas Bt conocidos. La Tabla III proporciona una
revisión de la identidad de secuencia con respecto a las regiones
codificantes de la mayoría de los genes y proteínas similares
(formas tanto de protoxina como de toxina) como se determina
utilizando el programa GAP del paquete Wisconsin de GCG (Madison,
Wisconsin, EE.UU.), versión 10.0. Se utilizaron los defectos de GCG
con el programa GAP. Para comparación de secuencias de ácido
nucleico, se utilizó la matriz de registro nwsgapdna, y para la
comparación de secuencias de aminoácidos, la matriz de registro
blosum62. La forma de toxina, tal como se utiliza en la Tabla III,
hace referencia a la proteína que comienza en el primer aminoácido
y termina dos aminoácidos más allá del último aminoácido (usualmente
una prolina) del bloque 5 de la secuencia conservada, como se
define en Schnepf et al. (1998). La forma de protoxina hace
referencia a la proteína entera o la región codificante de la
proteína/gen Bt.
Clones genómicos del gen recién aislado han sido
depositados en la BCCM^{TM}-LMBP (Belgian
Coordinated Collections of Microorganisms - Laboratorium voor
Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie, Universidad
de Gante, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante,
Bélgica) bajo el número de acceso siguiente:
LMBP 3986 para E. coli
XL1-Blue que contiene el plásmido pUC2072BG/1BF1 que
comprende el gen cry1Bf, depositado el 25 de noviembre de
1999 (este gen puede aislarse de este plásmido en un fragmento de
DNA de aproximadamente 7 Kb por escisión con SacI y SalI).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La inserción que contenía el gen cry1Bf
se subclonó en un vector lanzadera adecuado y el plásmido resultante
pSL2072BG/1Bf se introdujo por procedimientos rutinarios en una
cepa Bt cristal-menos. La proteína cristalina
producida por un cultivo esporulado de esta cepa Bt
recombinante se testó sobre larvas de Sesamia nonagrioides,
Heliothis virescens, Helicoverpa zea y O. nubilalis, a
concentraciones diferentes. Se observó una mortalidad alta
significativa de la toxina Cry1Bf sobre H. virescens,
Ostrinia nubilalis y Sesamia nonagrioides, encontrándose
en cambio una menor toxicidad sobre Helicoverpa zea. Después
de tratamiento con la cepa de control
cristal-menos, sobrevivían todas las larvas.
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Ejemplo
6
Genes quiméricos que codifican las formas
truncadas de la proteína Cry1Bf se producen como se describe en EP
0 193 259 y la Solicitud de Patente PCT publicada WO 94/12264,
utilizando los promotores CaMV 35S (Hull y Howell, 1987) y
ubiquitina (Christensen et al., 1992). Preferiblemente, el
uso de codones del marco de lectura abierto se adapta al de la
planta hospedadora a fin de optimizar la eficiencia de expresión,
como se describe en la Solicitud de Patente PCT publicada WO
94/12264. Se transforman células de arroz, algodón y maíz con los
genes quiméricos resultantes.
Las células de maíz se transforman establemente
mediante transformación mediada por Agrobacterium (Ishida
et al., 1996, y Patente U.S. No. 5.591.616) o por
electroporación utilizando callo embriogénico lesionado y degradado
con enzimas, como se describe en WO 92/09696 o la patente US
5.641.664 (incorporada en esta memoria por referencia).
Las células de algodón se transforman
establemente mediante transformación mediada por
Agrobacterium (Umbeck et al., 1987, Bio/Technology 5,
263-266; patente U.S. No. 5.004.863, que se
incorpora en esta memoria por referencia).
Las células de arroz se transforman establemente
con el método descrito en la Solicitud de Patente PCT publicada WO
92/09696.
Las plantas transformadas y regeneradas de maíz,
algodón y arroz se seleccionan por ELISA, transferencia Northern y
Southern y efecto insecticida. Las plantas quiméricas de la progenie
que contienen el gen exhiben una resistencia incrementada frente a
los insectos en comparación con las plantas de control no
transformadas con segregación apropiada de resistencia a los
insectos y el fenotipo transformado. Las medidas de proteínas y RNA
demuestran que la resistencia incrementada a los insectos está
asociada con una mayor expresión de la nueva proteína Cry en las
plantas.
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Bacillus thuringiensis.
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<130> NEWBTSWO
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<140>
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<141>
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1999-12-28
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<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3687
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Bacillus thuringiensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3687)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 2
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<211> 1228
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<212> PRT
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<213> Bacillus thuringiensis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (23)
1. Un DNA que codifica una proteína que
comprende la secuencia de aminoácidos del fragmento insecticida de
digestión con tripsina de la proteína codifica por el gen
cry1Bf depositado en la BCCM-LMBP bajo el
número de acceso LMBP 3986.
2. Un DNA que codifica una proteína que
comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento insecticida
de la proteína de SEQ ID No. 2.
3. El DNA de la reivindicación 2, que codifica
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
No. 2 desde el aminoácido de la posición 1 al aminoácido de la
posición 640.
4. El DNA de la reivindicación 3, que codifica
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
No. 2.
5. El DNA de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende la secuencia de DNA de SEQ ID
No. 1.
6. El DNA de la reivindicación 5, que comprende
una secuencia artificial de DNA que tiene un uso de codones
diferente comparada con la secuencia de DNA existente naturalmente,
pero que codifica la misma proteína o su fragmento insecticida.
7. El DNA de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende una secuencia artificial de
DNA que tiene un uso de codones diferente comparada con la
secuencia de DNA existente naturalmente, pero que codifica la misma
proteína o el fragmento insecticida de la misma.
8. Una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos del fragmento insecticida de digestión con tripsina de
la proteína codificada por el gen cry1Bf depositado en la
BCCM-LMBP bajo el número de acceso LMBP 3986.
9. Una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos de un fragmento insecticida de la proteína de SEQ ID
No. 2.
10. La proteína de la reivindicación 9, que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2 desde el
aminoácido de la posición 1 al aminoácido de la posición 640.
11. La proteína de una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, que comprende la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID No. 2.
12. Un gen quimérico que comprende el DNA de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 bajo el control de un
promotor expresable en plantas.
13. Una célula vegetal transformada que contiene
el gen quimérico de la reivindicación 12.
14. Una planta o una semilla, que comprende el
gen quimérico de la reivindicación 12 integrado en sus células.
15. La planta o semilla, que comprende el gen
quimérico de la reivindicación 12 integrado en el DNA nuclear o de
los cloroplastos de sus células.
16. La planta o semilla de la reivindicación 14,
que se selecciona del grupo constituido por: maíz, algodón, arroz,
colza oleaginosa, especies de Crucíferas, berenjena, soja, patata,
girasol, tomate, caña de azúcar, té, habichuelas, tabaco, fresa,
trébol, pepino, sandía, pimiento, avena, cebada, trigo, dalia,
gladiolo, crisantemo, remolacha azucarera, sorgo, alfalfa, y
cacahuete.
17. Un microorganismo transformado que contiene
el DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
18. El microorganismo de la reivindicación 17,
que se selecciona del género Agrobacterium, Escherichia, o
Bacillus.
19. Un proceso para reprimir los insectos, que
comprende expresar el DNA de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7 en una célula hospedadora, y poner en contacto los insectos
con dichas células hospedadoras.
20. Un proceso para obtener una planta con
resistencia a los insectos, que comprende transformar células de la
planta con el DNA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o
con el gen quimérico de la reivindicación 12, y regenerar plantas
transformadas a partir de dichas células que son resistentes a los
insectos.
21. El proceso de la reivindicación 20, que
comprende adicionalmente obtener semillas a partir de dichas
plantas que comprenden dicho DNA.
22. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, en el cual dicho insecto se selecciona
de: Heliothis virescens, Helicoverpa zea, O.
nubilalis, o Sesamia nonagrioides.
23. El proceso de la reivindicación 22, en el
cual dicho insecto es Sesamia nonagrioides.
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