JPH07500966A - 修飾遺伝子及びそれらの植物細胞における発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　（”Ｂ　ｔ”）の 殺虫性結晶タンパク質じＩＣＰ”）の全部または殺虫有効部分をコードするＢｔ 遺伝子じ修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子”）のごとき修飾遺伝子を提供する。かかる修 飾遺伝子を用いて形質転換された植物は、コードされるタンパク質をより高いレ ベルで発現する。

発明の背景 植物遺伝子工学技術はここ１０年の間に著しく進歩した。

外来遺伝子を植物中に安定に導入することが可能になっている。これは、現代農 業に好機会を与えている。植物病原体Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆ ａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドの誘導体は、外来遺伝子を植物及び植物細胞中に 導入するのに有効で、しかも極めて多様性のあるビヒクルであることが立証され ている。更に、エレクトロボーレーシコン、マイクロインジェクション、花粉媒 介遺伝子移入及び粒子ガン法（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｇｕｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ）のごとき種々の遊離ＤＮＡ送達法が同じ目的で開発されている。

遺伝子工学による植物形質転換の主な目的は作物の改良である。初期の段階にお いては、耐虫性のような有効形質を植物中に作出することに研究の重点が置かれ ていた。この点では、Ｂｔ株由来のＩＣＰをコードする遺伝子を使用する（Ｖａ ｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７）ことにより、トランスジェニック植物に耐 虫性を作出することにおける進歩が遂げられた。

Ｂｔ株は、幼虫に対して特異的に毒性を示す結晶タンパク質からなるパラ胞子結 晶（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ　ｃｒｙｓｔａｌ）を生成する胞子形成ダラム陽性菌 である。Ｂｔ　ＩＣＰは特異的殺虫スペクトルを有し、他の動物及び人に対して は毒性を示さない（Ｇａｓｓｅｒ　ａｎｄ　Ｆｒａｌｅｙ、　１９８９）。従っ てＢｔ　ＩＣＰ遺伝子は、植物工作に極めて適している。

２０年以上にわたり、Ｂｔ結晶胞子調製物は生物学的殺虫剤として使用されてい る。しかしながら、製造コストが高いことと、現場で散布されたときに結晶タン パク質は不安定であることから、Ｂｔスプレーの商品的使用は制限されている（ Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７）。Ｂｔ株の異種性は文献に明記されて いる。鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）　（ＤｕｌＩＩｌａｇｅ　ｅｔ　ａｔ 、。

１９８１）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）　（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｍａｒ ｇａｌｉｔ、　１９７７）及び鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）　（Ｋｒｉｅｇ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３）に対して活性な株が記述されている。

Ｂｔ株は胞子形成の際に内在性結晶（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｃｒｙｓｔａｉｓ ）を生成する。該結晶は、幼虫に摂取されると、昆虫中部栄養管のアルカリ性環 境内で可溶化されて前毒素（ｐｒｏｔｏｘｉｎ）を生じ、次いで前毒素がタンパ ク質分解によって６０〜７ＱＫｄａの毒素コアフラグメント、即ち毒素に変換さ れる。

この毒素によって中部栄養管の上皮細胞の細胞溶解が惹起される。Ｂｔ　ＩＣＰ の特異性は、昆虫中部栄養管上皮に存在する高親和性結合部位との相互作用によ り決定され得る。

Ｂｔ　ＩＣＰの同定並びにＢｔ　ＩＣＰ遺伝子のクローニング及び配列決定はＨ Ｏｆｔｅ及び１ｌｈｉｔｅｌｅｙ　（１９８９）によって精査されている。Ｂｔ 　ＩＣＰ遺伝子は多数の共通特性を有する。それらは一般に、６０±１０ｋＤａ の毒素フラグントを含む１３０ｋＤａ　〜１４０ｋＤａまたは約７０ｋＤａの殺 虫性タンパク質をコードする（ＨＱｆｔｅａｎｄ　ｆｈｉｔｅｌｅｙ、　１９８ ９）。Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子は、構造類似性及び殺虫スペクトルに従って４つの主 要グループ、即ち、鱗翅目特異的（ＣｒｙＩ）、鱗翅目・双翅目特異的（Ｃｒｙ ＩＩ）、鞘翅目特異的（Ｃｒｙｌ［Ｉ）、及び双翅目特異的（ＣｒｙｌＶ）遺伝 子に分類されている（ＨＱｆｔｅ　ａｎｄ　ｆｈｉｔｅｌｅｙ、　１９８９）。

鱗翅目特異的遺伝子（ＣｒｙＩ）は全てが１３０〜１４０ｋＤａのタンパク質を コードする。かかるタンパク質は一般に前毒素として合成される。毒素ドメイン は、前毒素のＮ末端側半分にその所在が確認されている。幾つかのＣｒｙ　Ｉ遺 伝子の欠失分析により、前毒素の３゛部分は毒性に絶対に必要なわけではないこ とが確認されている（Ｓｃｈｎｅｐｆ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５）。Ｃｒｙ　 Ｉｆ遺伝子は６５ｋＤａのタンパク質をコードする（ｌｌｉｄｎｅｒ　ａｎｄ　 １ｌｈｉｔｅｌｅｙ、　１９８５）。Ｃｒｙ　ＩＩ＾タンパク質は鱗翅目及び双 翅目の両方に対して毒性であるが、ＣｒｙＩＩＢタンパク質は鱗翅目昆虫に対し てのみ毒性である。鞘翅目特異的遺伝子（ＣｒｙｌＩ［）は一般に分子量約７０ ｋＤａのタンパク質をコードする（ＨＯｆｔｅａｎｄ　ｆｈｉｔｅｌｅｙ、　１ ９８９）。Ｅ、ｃｏｌｉ中で発現したＣｒｙｍ＾遺伝子は、コロラドハムシに対 して毒性を示す７２ｋＤａタンパク質の合成を誘導する。この７２ｋＤａのタン パク質は、Ｎ末端側の最初の５７個のアミノ酸を除去する胞子共生細菌プロテア ーゼによって６６ｋＤａのタンパク質にプロセッシングされる（Ｍｃ　Ｐｈｅｒ ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）。欠失分析から、このタイプの遺伝子は、 毒性を欠損することなく３°末端を切除することはできないことが示されている （ＨＱｆｔｅ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｌｅｙ。

１９８９）。最近、１３ＱｋＤａのタンパク質を産生ずる抗鞘翅目株が記載され た（欧州特許出願（“ＥＰ＾”）　８９４００４２８．２号）。Ｃｒｙ■クラス の結晶タンパク質遺伝子は一群の異種双翅目特異的結晶タンパク質遺伝子からな る（ＨＱｆｔｅ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｌｅｙ。

１９８９）。

Ｂｔ　ＩＣＰを使用することにより耐虫性トランスジェニック作物を生成し得る 可能性が示されている（Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８７　；　Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７及びＢａｒｔｏｎ 　ｅｔ　ａｔ、、１９８７）。

トランスジェニック植物は重要な代替物であり、農業において、安全で、環境的 に有利で、しかもコスト効率のよい全く新たな昆虫防除方法を提供する。圃場条 件下で優れた昆虫防除が達成されている（Ｄｅｌａｎｎａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８９　；　Ｍｅｅｕｓｅｎ　ａｎｄ　Ｗａｒｒｅｎ、　１９８９）。

全てのケースで、植物中でキメラＢｔ　ＩＣＰ遺伝子を発現するために＾ｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介遺伝子移入が使用されている（Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９８７　；　Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７　；　Ｆｉｓｃ ｈｈｏｆｆｅｔ　ａｌ、、　１９８７）。Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子は、植物細胞中で 遺伝子発現を誘導し得る強力なプロモーターの制御下に置かれた。

しかしながら、植物細胞中での発現レベルは、末端切除遺伝子（ｔｒｕｎｃａｔ ｅｄ　ｇｅｎｅ）を使用したときにしか殺虫性レベルのＢｔ　ＩＣＰ遺伝子を得 るに十分に高くならないことは注目すべきである（Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８７；　Ｂａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７）。全長Ｂｔ　ＩＣＰ 遺伝子を含むトランスジェニック植物は、どれも殺虫活性を生成しなかった。更 にＢａｒｔｏｎら（１９８７）は、全Ｂｔ　ＩＣＰコーディング領域を用いて形 質転換したタバコＣａ１ｌｉが順環及び死滅したことを示した。かかる結果は、 Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子が、植物中で有意なレベルで発現するために解消すべき異例 の問題を与えることを示唆している。植物形質転換に末端切除Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝 子を使用した場合でさえ、トランスジェニック植物において得られるＢｔ　ＩＣ Ｐ　ｍＲＮ＾の定常状態レベルは、マーカーとして使用される隣接のＮＰＴ■遺 伝子及び他のキメラ遺伝子によって生成されるレベルと比較して極めて低い（Ｂ ａｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７　；　Ｖａｅｃｋ　ｅｔａｌ、、　１９ ８７）。更に、Ｂｔ　ＩＣＰのフルサイズのｍＲＮ＾をノーザンプロット分析に よって検出することはできない。同様のことがＦｉｓｃｈｈｏｆｆら（１９８７ ）によっても認められており、彼らは、Ｂｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮ＾のレベルはＣａ ＭＶ３５Ｓプロモーターから発現されるキメラ遺伝子に対して推定されるよりず っと低いと報告した。即ち、Ｂｔ　ｍＲＮ＾の細胞質蓄積、その結果生じる植物 細胞におけるＢｔ　ＩＣＰタンパク質の発現は極端に非効率的である。これに反 して、微生物においては、末端切除Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子は全長遺伝子より好まし くないことが示されており（＾ｄａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５）、このこ とは、非効率的な発現は植物中でのＢｔ　ＩＣＰ遺伝子の異種発現にのみ関連す ることを示唆している。

植物細胞において有意なりｔ　ＩＣＰ発現レベルを得るという問題は、野生型Ｂ ｔ　ＩＣＰ遺伝子に固有であると見られる。更に、植物中で得られる比較的低く て不十分な発現レベルは、全てのＢｔ　ＩＣＰ遺伝子に共通の現象であると考え られる。

真核細胞には遺伝子発現を制御し得る６つの段階があること知られている（　Ｄ ａｒｎｅｌｌ、　１９８２）　：１）転写制御； ２）ＲＮ＾プロセッシング制御； ３）ＲＮＡ輸送制御； ４）ｍＲＮ＾分解制御： ５）翻訳制御； ６）タンパク質活性制御。

全ての遺伝子において、転写制御は最も重要であると考えられている（Ｔｈｅ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ、　１９８９） 。

欧州特許公開じＥＰ”）　３８５．９６２号及び３５９．４７２号においては、 Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子のコドン用法を変更して該遺伝子の植物細胞中での発現を向 上する試みが報告されている。しかしながら、コドン用法の無差別（即ち非選択 的）な変更によって遺伝子内に隠れた調節シグナルが導入され、それによって遺 伝子発現の上述の６つの段階の１つ以上において問題が生じ、従って植物細胞中 の修飾外来遺伝子の転写及び／または翻訳を阻害または妨害し得る。例えば、コ ドン用法の変更によってｍＲＮ＾生成速度に差が生じ、このように生成されたｍ ＲＮＡに（例えばリポソームによって保護されていないＩＩＲＮ＾の領域が細胞 質酵素による攻撃及び分解に暴露されることにより）不安定性が生じ得る。コド ン用法の変更は更に、このように修飾された遺伝子の発現に不利に干渉し得る。

ＥＰ　３５９，４７２号は、植物コンセンサススプライス部位は、天然Ｂｔ　ｔ ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓコーディング領域内に存在するならば、潜在的に不利な配 列を除外するように修飾されることを示している。

ＰＣＴ特許出願国際公開Ｗ０９１／１６４３２号は、植物細胞中でのＢｔ　ＩＣ Ｐ遺伝子の発現レベルが比較的低い重要な原因として、Ｂｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡ の核内生成の速度及び／またはレベルの低さを記述している。特に、ＲＮＡポリ メラーゼ伸長は、該遺伝子の特定の領域において妨害されることが判った。

本発明によれば、遺伝子、好ましくはＢｔ　ＩＣＰ遺伝子、特にリス」−遺伝子 、なかでもｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ遺伝子を用いて形質転換された植物細胞中での発現 のレベル及び／または速度が、該遺伝子によってコードされる全長（即ちスプラ イシングされていない）　ｍＲＮＡの核内生成の速度及び／またはレベルによっ て制限される遺伝子を修飾する方法であって、前記遺伝子のコーディング領域に おいて、ｉ）植物細胞においてＲＮ＾ポリメラーゼ■開始複合体の一部または全 部の組立てにより特定部位転写開始を誘導し得る、センスまたはアンチセンスい ずれかの向きのクリプテイックプロモーター、例えば最小プロモーター、特に、 ＣＣＡＡＴまたはＴＡＴＡ配列のごとき少なくとも１つのＤＮＡ調節エレメント を含むクリプテイックプロモーター、またはｉｉ）　ＲＮ＾レベルでｍＲＮＡ前 駆体種を２プライシング経路に導入する不稔性イントロンをコードするＤＮＡで あって、ｍＲＮ＾前駆体種が、生じたｍＲＮＡ種が植物細胞の細胞質内に実質的 に蓄積しないようにプロセッシングされるＤＮＡのうち少なくとも一方のプロセ ッシング誘導配列エレメントを失活化、好ましくは破壊または除去するステップ を含んでおり、 前記プロセッシング誘導配列エレメントが、好ましくは、ａ）植物細胞中で効率 的にスプライシングされることが知られているイントロンをコードするＤＮＡを 導入すること、及び／または、 ｂ）アミノ酸コドンを、同じアミノ酸をコードする他のものに変更することによ り、翻訳上中立の修飾を遺伝子のコーディング領域内に導入すること により失活化される方法が提供される。

更に本発明によれば、植物細胞を形質転換するのに使用され本発明方法によって 修飾された遺伝子（“修飾遺伝子”）また本発明によれば、少な（とも１つの修 飾遺伝子を用いて植物細胞ゲノムを形質転換することにより植物の特性、例えば 耐虫性を向上する方法が提供される。

本発明は更に、植物細胞を形質転換するために使用され得るもので、下記の操作 的に結合されたＤＮＡフラグメントを同じ転写単位内に含むキメラ遺伝子にも係 わる：１）修飾遺伝子のコーディング領域： ２）植物細胞中で前記修飾遺伝子の転写を誘導するのに適したプロモーター； ３）植物細胞中で前記修飾遺伝子を発現するのに適した転写物３′末端形成及び ポリアデニル化シグナル。

本発明は更に、 −好ましくは安定に組込まれた、修飾遺伝子（特にキメラ遺伝子）を含むよう核 ゲノムが形質転換されている植物の細胞； 一前記植物細胞からなる細胞培養物； −ゲノムが修飾遺伝子、特にキメラ遺伝子を含み、向上された特性、例えば耐虫 性を示す形質転換植物細胞から再生された植物、またはこのように再生された植 物から産生された植物； 一前記植物の種子；及び 一植物細胞の核ゲノムを修飾遺伝子、特にキメラ遺伝子を用いて安定に形質転換 するためのベクターにも係わる。

発明の詳細 本明細書及び請求の範囲において使用される“遺伝子”とは、タンパク質、好ま しくはＢｔ　ＩＣＰをコードするＤＮＡ配列を意味する。これには、タンパク質 をコードする修飾または合成りＮＡ配列及び天然ＤＮＡ配列が含まれる。

本明細書及び請求の範囲において使用される“コーディング領域”とは、タンパ ク質のアミノ酸配列を特定する遺伝子の部分を意味する。一般にコーディング領 域は、完全にプロセッシングされたｍＲＮ＾の翻訳部分に対応する複数の翻訳コ ドンを含む。

本明細書及び請求の範囲において使用される“Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子”とは、Ｂ、 　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから直接または間接的に誘導されるＢｔ　ＩＣＰ をコードするＤＮＡ配列を意味する。これには、Ｂｔ　ＩＣＰをコードする修飾 、合成または天然ＤＮＡ配列が含まれる。

本明細書及び請求の範囲において使用される“末端切除Ｂｔ遺伝子（ｔｒｕｎｃ ａｔｅｄ　Ｂｔ　ｇｅｎｅ）　”　とは、少な（ともＢｔ　ＩＣＰの毒性部分、 好ましくは毒素をなおもコードする、全長Ｂｔ遺伝子のフラグメントであると理 解されたい。

本明細書及び請求の範囲において使用される“Ｂｔ　ＩＣＰ”とは、Ｂ、　ｔｈ ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓによって天然に産生され得る無傷のタンパク質、または かかるタンパク質の殺虫性を有する部分もしくは誘導体であると理解されたい。

Ｂｔ　ＩＣＰは前毒素でもあり得るし、前毒素の有効毒素または他の殺虫性末端 切除部分でもあり得、これらは結晶である必要はないし、天然タンパク質である 必要もない。Ｂｔ　ＩＣＰの例としては、Ｂｔ２殺虫性結晶タンパク質（ＩＴＭ ｔｅ　ｅｔ　ａＬ、　１９８６；　Ｂｔ２なる用語はＨＱｆｔｅ及びＷｈｉｔｅ ｌｅｙ　（１９８９）　−Ｃｒｙｌ＾ｂ”に従う）、及び好ましくは分子量６０ 〜８０ｋＤａを有する、そのトリプシン切断部位に対してＣ末端及び／またはＮ 末端で切除された殺虫性有効部分が挙げられる。Ｂｔ　ＩＣＰの他の例としては 、鱗翅目活性■ＣＰ、例えばＧｌｅａｖｅら（１９９２）に記載のＢｔ３、Ｗｏ 　９０／１５１３９号及び１０９０１０９４４５号、ｌｌＭｔｅ及びＷｈｉｔｅ ｌｅｙ　（１９８９）並びにＥＰ＾９０４０３７２４．９号に記載のＢ　ｔ１３ 、Ｂ　ｔ２１、ＢｔＩ２６０及びＢｔＩ１０９Ｐ、または、殺虫性を有する任意 の修飾もしくはハイブリッドＩＣＰが挙げられる。

本明細書及び請求の範囲に使用される“前毒素（ｐｒｏｔｏｘｉｎ）”とは、Ｂ ｔ　ＩＣＰをコードする全長遺伝子の一次翻訳産物であると理解されたい。

本明細書及び請求の範囲に使用される“毒素（ｔｏｘｉｎ）”または“有効毒素 ”または“毒素コア”とは、例えばプロテアーゼ（例えばトリプシン）切断によ って得られる、殺虫性を有する前毒素の一部分であると理解されたい。

本明細書及び請求の範囲に使用される“プロセッシング誘導配列エレメント”と は、不稔性イントロンをコードするＤＮＡであるか、または植物細胞の遺伝子の コーディング領域内に存在すると該遺伝子の全長ｍＲＮ＾への転写、全長ｍＲＮ ＾の核内蓄積、及び／または全長ｍＲＮＡの核外輸送を実質的に阻害または妨害 するクリプテイックプロモーターのいずれかである、シス遺伝子効果を有する（ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）調節エレメントである。かか る配列エレメントは、所与の植物細胞における公知の植物プロモーターまたは植 物イントロンとは異なり得る。プロセッシング誘導配列エレメントは、失活化さ れなければ植物細胞によって実際に認識され、それによって植物細胞中での遺伝 子発現を妨害する。本発明のシス遺伝子効果を有する調節エレメントは、発明の 背景に列挙したような遺伝子発現制御ステップに関与し及び／またはその作用を 担い、植物細胞中での遺伝子、特にＢｔ　ＩＣＰ遺伝子の発現を妨害すると考え られている。

本明細書及び請求の範囲において使用される“クリプテイックプロモーター（ｃ ｒｙｐｔｉｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）　”　、例え１ｉ“最小プロモーター”とは 、タンパク質コーディング遺伝子のコーディング領域内にセンスまたはアンチセ ンスいずれかの向きで配置されており、所与の植物細胞においてＲＮ＾ポリメラ ーゼ■開始複合体の一部または全部の組立てによって部位特定の転写開始を誘導 し得るＤＮＡ配列を意味する。

クリプテイックプロモーターは、核因子と特異的に相互作用するＣＣＡＡＴ及び ＴＡＴ＾配列のごときンス効果を有する、所謂“ＤＮＡ調節エレメント”が存在 することで活性となると考えられている。クリプテイックプロモーターは、核タ ンパク質と相互作用し、それによって該遺伝子を転写するＲＮ＾ポリメラーゼ■ に対する転写妨害を惹起するか、または転写上活性であり、それによって遺伝子 内でのその向きに応じてセンスもしくはアンチセンスＲＮ＾を特定し、センスも しくはアンチセンス遺伝子発現抑制を惹起することにより遺伝子発現を妨害する と見られる。

本明細書及び請求の範囲における“ＤＮＡ調節エレメント”とは、ｌ？Ｎ＾ポリ メラーゼ■開始複合体の一部または全部の組立てに関与するプロモーター領域内 にある配列である。

かかるＤＮＡ調節エレメントの公知の例としてはＴＡＴＡボックス及びＣＣＡＡ Ｔボックスが挙げられ（Ｈａ　ａｎｄ　Ａｎ、　１９８９　；　Ｐａｕｌｅｔ　 ａｌ、、　１９８７）、これらは多くの植物プロモーターにおいて約２０〜５０ ヌクレオチド離れており、ＴＡＴ＾ボックスは、転写開始部位から約３２±７ヌ クレオチド上流に位置している（Ｊｏｓｈｉ、　１９８７）。他の公知のＤＮＡ 調節エレメントとしては例えばＫａｔａｇｉｒｉ及びＣｈｕａ　（１９９２）に よって列挙されているものが挙げられる。

″ｍＲＮ＾ｍＲＮＡまたは“ブレａ＋ＲＮ＾“とは、植物細胞の核内でＤＮＡか ら転写されるタンパク質コーディングＲＮ＾を指す。

ブレｍＲＮ＾は、例えば植物イントロンを除去することにより更にプロセッシン グされ得、完全にプロセッシングされた、即ち成熟ｍＲＮ＾は、最終的に植物細 胞の細胞質内で翻訳される。本明細書及び請求の範囲において使用される“全長 １ＲＮＡ”、“完全にプロセッシングされたｍＲＮＡ”または“成熟ｍＲＮ＾” とは、細胞質内で翻訳され得る、遺伝子によってコードされているタンパク質を コードするｍＲＮＡである。

本明細書及び請求の範囲において使用される“不稔性スプライシング（ａｂｏｒ ｔｉｖｅ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ）″とは、ｍＲＮ＾前駆体前駆植種細胞のスプライ シング経路に進入し、プロセッシングされても、スプライシング後のｍＲＮＡが 植物細胞細胞質中に実質的に蓄積しないような過程であり、例えばｍＲＮＡは細 胞質に輸送される前に核内でスプライシングの間または後に崩壊するか、または 細胞質内で迅速に崩壊してしまう。

不稔性スプライシングにおいては、比較的少数のブレ■ＲＮＡだけが効果的にプ ロセッシングされる、即ちイントロンが除去された後エキソンが結合され、実際 にスプライシングされたａ＋ＲＮ＾は幾つかのまたは全ての細胞中で検出可能で あると思われる。不稔性スプライシングは部分活性スプライシング（ｐａｒｔｉ ａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ）と混同されるべきではなく、後者 においては、スプライシング経路に進入したブレｍＲＮＡの大部分は効果的にス プライシングされるが、実際にはブレｍＲＮＡは極めて低い頻度でしかスプライ シング経路に進入しない。

“不稔性インドｏ　ン（ａｂｏｒｔｉｖｅ　１ｎｔｒｏｎ）　”とは、ブレ鴎Ｒ Ｎ＾中に存在し、ブレｍＲＮＡが植物細胞中で不稔性スプライシングされるとき 除去されるＲＮＡ配列である。１つの遺伝子は２つ以上の不稔性イントロンをコ ードし得、その不稔性スプライシングは、植物細胞中で優性イントロンがまずス プライシングされ、より優性でないイントロンはあとでスプライシングされると いう順序プロセスの一部である。

本明細書及び請求の範囲において使用される“不稔性イントロンスプライス部位 ”とは、不稔性スプライシングされる任意のブレｍＲＮ＾においてスプライシン グが生じる、不稔性イントロンの５°及び３゛側にあるニック部位である。

本発明によれば、特定の遺伝子、好ましくはＢｔ　ＩＣＰ遺伝子のコーディング 領域内にあるクリプテイックプロモーターは以下の方法によって検出され得る。

第１ステツプにおいて、転写伸長が実質的に阻害される遺伝子内の領域（“転写 減衰領域（ｐａｕｓｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）”）を同定する。転写減衰とは、転 写において活性なＲＮ＾ポリメラーゼ■の伸長速度が低下する過程である。転写 減衰は転写終結とは異なり、ＲＮＡポリメラーゼ■は鋳型に随伴したままであっ て、ＲＮ＾合成を再開し得る。転写単位内の転写減衰領域は、遺伝子を転写する ＲＮＡポリメラーゼ■複合体の転写活性を測定し、次いで例えば、ＰＣＴ特許出 願国際公開Ｗ０９１／１６４３２号に記載のごとく、約３００ヌクレオチド、好 ましくは約２００ヌクレオチド、特に約１００ヌクレオチドの遺伝子の連続的な 一部重複領域をランオン（ｒｕｎ−ｏｎ）分析することにより決定し得る。転写 減衰領域は、特にランオンアッセイを長時間、即ち５〜１０分間実施したときに 、転写開始部位のすぐ下流の約３００ヌクレオチドの領域における活性と比較し て転写活性が低いような領域、好ましくは２０％以下、特に１０％以下、とりわ け５％以下の領域に対応する。ランオンアッセイに使用する核は、それぞれ染色 体外または染色体内に遺伝子を担う、一時的にまたは安定に形質転換された細胞 を使用する核精製方法によって得られる。適当な植物遺伝子調節配列の制御下に ある遺伝子を用いて核ゲノムが形質転換されているトランスジェニック植物が入 手可能であるならば、転写減衰領域は、例えば実施例に記載のごときＤＭＳフッ トプリント分析に支援された核ランオンアッセイ及び／またはＫＭｎＯ転写減衰 アッセイ（Ｍ。

ｒｒｅｔｔ　ａｎｄ　Ｂｕｃｋ、１９８９　；　Ｓａｓｓｅ−Ｄｗｉｇｈｔ　ａ ｎｄ　Ｇｒａｌｌａ、　１９８８；　Ｃａｎｎｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０ ）によって決定し得る。

一旦転写減衰領域が決定されたなら、その（一般には長さ約１００〜３００ヌク レオチドの領域の）一部または全部を適当な転写線始プローブベクター内に２つ の向きでクローニングし得る（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ　ａｎｄ　Ｖａｎｄｅｗ ｉｅｌｅ、　１９８９ａ）。かかるベクターは、例えば、転写減衰領域の一部ま たは全部を、植物プロモーターのエンハンサ−の下流で且つ、転写され得る上に その転写物が植物細胞中で固有に検出され得るＤＮＡ配列の上流に置くことによ り得られる。かかるエンハンサ−の好ましい例はＢｅｎｆｅｙら（１９９０）に よって記載されているエンハンサ−１即ち３５Ｓプロモーターの“Ｂ”領域であ るが、他の公知のエンハンサ−領域も使用し得る（例えばＴＲ２’プロモーター のエンハンサ−）。転写開始プローブベクターの転写可能領域の好ましい例とし ては細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ）ま たはｂａｓｔａ耐性遺伝子（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ　ａｎｄ　Ｖａｎｄｅｗｉ ｅｌｅ、　１９８９ａ）のコーディング領域と、これに続（適当な３゛末端形成 及びポリアデニル化配列が挙げられる。かかるベクターをタバコまたはトウモロ コシ原形質体のごとき植物細胞中に導入する場合、転写開始プローブベクターの 転写可能領域から誘導したプローブを用いてハイブリダイズすることにより、推 定上のクリプテイックプロモーターから開始した特定の転写物種の蓄積を検出し 得る。プライマー伸長分析または転写物の３１マツピングによって転写開始部位 を決定することができ、このことで更に、植物細胞によって認識されるＣＣＡＡ Ｔ及びＴＡＴＡボックスのごとき潜在的なりＮＡ調節エレメントの検出が容易に なる。適当に構成された植物細胞によって認識される既知のＤＮＡ調節エレメン ト（例えば約２０〜５０ヌクレオチド離れているＣＣＡＡＴボックスとＴＡＴ＾ ボックス）が配列内に認められたならば、これはクリプテイックプロモーターが 既に存在することを強力に示すものであり、またこのことは、かがるエレメント を含む領域を転写開始プローブベクター内に上述のごとく置くことで転写開始能 力を評価することにより確認し得る。一般には、エンハンサ−をクリプテイック プロモーターに関して５ｏヌクレオチド、好ましくは１００ヌクレオチド、より 好ましくは２００ヌクレオチド以下の短い距離だけ移動させても、転写開始部位 は維持される。

本発明によれば、特定の遺伝子、好ましくはＢｔ　ＩＣＰ遺伝子のコーディング 領域内の不稔性イントロンは以下の方法によって検出し得る。

該遺伝子のコーディング領域を、適当なベクター内の適当な植物調節配列の制御 下に置き、タバコまたはトウモロコン原形質体のごとき植物細胞中に導入する。

ＤＮＡ移入の約５〜７時間後、全ＲＮ＾を抽出する。慣用方法に従って植物細胞 中に存在するｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製する。次いで、導入した遺伝子から産 生されると推定されるフルサイズのａ＋ＲＮＡ前駆体の重複領域を、先に合成し たｃＤＮＡを基質として使用すると共に、転写開始部位と３゛末端形成部位との 間にある遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー対を使用し、ＰＣＨによっ て増幅する。一般に約５００〜７００ヌクレオチドの重複領域を増幅するが、こ れに加えて重複領域を次第に太き（して増幅することができ、例えば約１０００ ヌクレオチドの重複領域を増幅したあと約２０００ヌクレオチドの重複領域を増 幅することが一般にこれに適している。次いで増幅産物を分析し、フルサイズの 成熟ｍＲＮＡを基準にして推定されるよりもサイズが小さい産物を精製及び配列 決定する。かかるより短小の増幅産物の配列を、推定上フルサイズのｍＲＮＡ前 駆体の配列と比較することで、イントロンに対応する増幅産物のギャップを同定 し得る。このことで更に、推定上フルサイズのｍＲＮＡにおけるイントロンの５ ′及び３゛末端にある推定イントロンスプライス部位を同定し得る。５°スプラ イス部位を失活化し、遺伝子を植物細胞中に再導入することで、不稔性イントロ ンと一部活性イントロンとを区別し得る。イントロンが不稔性であるならば、ス プライス部位を失活化するとフルサイズｍＲＮＡレベルが著しく増加する結果と なり、一部活性イントロンを失活化すると、全長ｍＲＮ八レへルは僅かに増加す る結果となる。

上述のごときクリプテイックプロモーター及び不稔性イントロンの同定に使用さ れる常用系は一時的発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　ＴＥ Ｘ）細胞質系である。双子葉植物においてはタバコ細胞が活性プロセッシング誘 導配列エレメントの同定に好ましく、単子葉植物においてはトウモロコシまたは コメ細胞が好ましい実験系を与える。勿論、一時的または安定な形質転換に適し ているとして当分野において公知の任意の植物細胞を使用し得る。

本発明のクリプテイックプロモーター及び／または不稔性イントロンの同定及び 特性分析によって、比較的小さなりＮＡ配列エレメントじターゲット配列”）を 認識し、植物細胞においてかかるプロセッシング誘導配列エレメントの活性を破 壊するように修飾することが可能になる。かかる修飾は翻訳上は中立であるのが 好ましい。本明細書及び請求の範囲において使用される“翻訳上中立の修飾（ｔ ｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ　ｎｕｅｔｒａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ） 　”とは、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に影響しない 修飾である。このような翻訳上中立の修飾の好ましい例は、遺伝子内のヌクレオ チド置換によって、アミノ酸コドンを、同じアミノ酸をコードする他のコドンに 変更することである。このようなヌクレオチド置換によってヌクレオチドＡ及び ＴをヌクレオチドＣ及びＧに変更し得る（　ＰＣＴ特許出願国際公開１０９１／ １６４３２号）が、他の翻訳上中立の修飾においては、ヌクレオチドＣ及びＧを ヌクレオチドＡ及びＴに変更してもよい。翻訳上中立の修飾の別の好ましい例は 、植物細胞中で効率的にスプライシングされることが既知の少なくとも１つのイ ントロンを遺伝子中に導入し、導入されたイントロンのスプライシングによって タンパク質、好ましくはＢｔ　ＩＣＰをコードする成熟ｍＲＮ＾に効率的にプロ セッシングされるｍＲＮＡ前駆体に該遺伝子が転写されるようにすることである 。植物細胞中で効率的にスプライシングされることが公知のイントロンは、植物 細胞中でｍＲＮＡ前駆体から効率的にスプライシングされる任意のイントロンで ある。

植物、好ましくは双子葉植物において使用するのに適したイントロンは、ＰＣＴ 特許出願国際公開Ｔｏ　９２／１３９５７号に記載のごときＴＡ３６イントロン または任意の他の機能性植物イントロンである。ＴＡ３６イントロンまたは任意 の他の機能性植物イントロンの挿入に適した部位は、例えばＧｏｏｄａｌｌ及び Ｆｉｌｉｐｏｗｊｅｚ　（１９８９）並びにＨａｎｌｅｙ及び５ｃｈｕｌｅｒ　 （１９８８）に略述されているよ（知られた一般規則に従って決定される。

勿論、翻訳上中立のヌクレオチド置換は、かかるイントロンを植物中で発現すべ き外来遺伝子内に導入することと組合せ得る。

クリプテイックプロモーター中に存在するＣＣ＾＾Ｔ及び／またはＴＡＴＡボッ クスのごときＤＮＡ調節エレメントは修飾するに好ましいターゲット配列である 。即ち、かかるＤＮＡ調節エレメントの配列を、選択したヌクレオチドの翻訳上 中立のヌクレオチドに置換すること、及び／または適当な植物イントロンを該配 列中に挿入することにより変更し得る。

しかしながら、実験的に決定された転写開始部位の上流の２０〜９０、好ましく は約２０〜５０ヌクレオチドのゾーン全体に十分な翻訳上中立の変更を行なうこ とにより、クリプテイックプロモーターの植物細胞認識を低下または排除し得る 。

好ましくは、かかる十分な変更は、上記ゾーン内で最大可能数の翻訳上中立のヌ クレオチド置換を行なうことからなる。更に、上記ゾーン内の任意の適当な位置 に適当な植物イントロンを導入すると、クリプテイックプロモーターの活性を低 下させると考えられている。

不稔性イントロンに関しては、不稔性イントロンスプライス部位は、不稔性イン トロンを含むｍＲＮＡ前駆体を不稔性スプライシング経路に導くために特に重要 であると考えられている。不稔性イントロンは、遺伝子、好ましくはＢｔ　ＩＣ Ｐ遺伝子のコーディング領域内の、植物細胞中で遺伝子から転写されるｍＲＮＡ 前駆体の少なくとも５°側（即ち上流）不稔性スプライス部位を囲む配列に対応 する配列において、翻訳上中立の修飾によって失活化するのが好ましい。勿論か かる修飾は、３°側（即ち下流）不稔性スプライス部位及び／または分岐点（Ｂ ｒｏｗｎ、　１９８６）を囲むものに対応するコーディング領域の配列における 修飾によって補足または場合によっては代替され得る。好ましいターゲット配列 は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡ前駆体において、不稔性イントロンの５°及 び／または３゛側不稔性スプライス部位、好ましくは５’　Ｇ　Ｔ及び／または ３°ＡＧヌクレオチドに対応する部位の両側にある約１０ヌクレオチドの配列、 特に約５ヌクレオチドの配列、とりわけ約３ヌクレオチドの配列であると考えら れている。本発明の不稔性イントロンは、例えばＧ。

ｏｄａｌｌ及びＦｉｌｉｐｏｗｉｅｚ　（１９８９，１９９０）によって記載さ れているような植物イントロンの所定の必須特性を有する。更に、不稔性イント ロン修飾のターゲット配列の例は、Ｈａｎｌｅｙ及び５ｃｈｕｌｅｒ　（１９８ ８）によって記載されているような植物細胞におけるイントロンスプライシング （Ｐａｄｇｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６；＾ｅｂｉ　ａｎｄ　ｆｅｉｓｍ ａｎｎ、　１９８８）に不可欠なコンセンサスＲＮＡ配列中に見られ、例えば以 下のものが挙げられる（ここで゛はスプライス位置を指す）：双子葉植物のイン トロンの５′側境界においてはＮ＾／ＵＧ’ＧＵ＾＾Ｇ　Ｕ／Ａ　Ａ／Ｕ　Ｕ／ Ａ　Ｕ／＾、双子葉植物のイントロンの３′側境界においてはＵ／＾Ｕ／Ａ　Ｕ ／Ｎ　Ｕ／＾Ｕ／Ａ　Ｕ／Ａ　Ｕ／Ａ　Ａ／Ｕ　Ｕ／＾Ｕ／＾Ｕ　Ｇ／ＡＣ／Ｕ 　Ａ　Ｇ　’　、単子葉植物のイントロンの５°側境界においてはＡ／Ｃ／Ｇ　 Ａ　Ｇ　’　Ｇ　Ｕ　Ａ　Ａ／Ｕ　Ｇ　Ｕ／ＣＵ／＾Ｕ／ＣＵ／Ｎ、単子葉植物 のイントロンの３゛側境界においてはＵ／ＣＵ／ＣＵ／Ｇ　Ｕ／＾Ｕ／ＣＵ／Ｇ 　Ｕ／Ｎ　Ｕ／Ｎ　Ｕ　Ｇ／Ｎ　ＣＡ　Ｇ　’。驚くべきことに、多くの非植物 遺伝子、特にＢｔ　ＩＣＰ遺伝子が、Ｈａｎｌｅｙ及び５ｃｈｕｌｅｒ（１，９ ８８）のコンセンサスＲＮＡ配列のうち、植物細胞におけるイントロンスプライ シングに不可欠な以下の部分をコードすることが判明した二上流（即ち５′側） イントロンスプライス位置の下流（即ち３゛側）にあるＧＵＡＡＧまたはＧＵＡ ＵＧ。

特にＧＵＡＡＧ　、及び、下流側イントロンスプライス位置の上流にある八Ｇ０ 好ましくは特定のターゲット配列内にあるクリプテイックプロモーター及び／ま たは不稔性イントロンをコードするＤＮＡを、特に上述のごとく必須特性を除去 するかまたはコンセンサスＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを破壊することにより 修飾すると、翻訳されて遺伝子によってコードされるタンパク質を産生じ得るフ ルサイズのｍＲＮＡの量が増加する結果となる。

本明細書及び請求の範囲において使用される“修飾遺伝子”とは、コーディング 領域の少なくとも１つのプロセッシング誘導配列エレメントにおいて、少なくと も１つのコドンのヌクレオチド内容が、かかるプロセッシング誘導配列エレメン トの失活化をもたらす翻訳上中立の修飾によって変更されているＤＮＡ配列、好 ましくはＢｔ　ＩＣＰをコードするＤＮＡ配列であると理解されたい。Ｂｔ　Ｉ ＣＰ遺伝子のコーディング領域には僅かな修飾しか行なわれないのが好ましい。

特にこの修飾は、コーディング配列内の１０％未満、好ましくは３％未満、特に １％未満のヌクレオチドを変更することを含む。この点に関して言えば、遺伝子 のコーディング領域内の１０％未満、好ましくは３％未満、特に１％未満のヌク レオチドを、ヌクレオチドＡまたはＴからヌクレオチドＧまたはＣに変更する。

しかしながら、本発明のコーディング領域の修飾には、植物に好ましいコドンを 導入する必要はないし、ヌクレオチドＡ及びＴをヌクレオチドＧ及びＣに変更す るだけある必要もない。各プロセッシング誘導配列エレメントは、数個のヌクレ オチドだけを変更し、所与の植物細胞において該エレメントが失活化するが、ヌ クレオチドは同じアミノ酸をコードするように修飾するのが好ましい。しかしな がら、コードされるＢｔ　ＩＣＰが少な（とも実質的に同じ殺虫性を有するなら ば、場合によ、では幾つかのアミノ酸を変更し得る。

本発明は、所定の植物種中で発現するが、かかる植物種とは遠縁でしかない微生 物に由来する遺伝子に優先的に適用され、例えば、植物中で微生物もしくは動物 の遺伝子を、双子葉植物中で単子葉植物遺伝子を、または単子葉植物中で双子葉 植物遺伝子を発現させることに係わる。この点において本発明は、ＡとＴに富む 遺伝子、特に所定の領域にＡ及びＴを５０％以上含む遺伝子、例えばＢｔ　ＩＣ Ｐ遺伝子、特にｃｒｙ　（遺伝子、とりわけｃｒｙ　Ｉ＾ｂ遺伝子を修飾するの に特に有効である。

本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ または用遺伝子によって例証される。ｂｔ２、ｂｔ１４、ｂｔ１５及びｂｔ１８ のごときＢｔ　ＩＣＰ遺伝子の発現経路は、植物細胞においては特に核レベルで 阻害されることが既に示されている（　ＰＣＴ特許出願国際公開Ｔｏ　９１／１ ６４３２号、該特許出願は参照により本明細書の一部を構成するものとする）。

ｂｔ８８４構築物（Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７）を含むタバコ細胞 由来のＮ２６−２２０核における核ランオン分析によって、新生Ｂｔ　ＩＣＰ　 ｍＲＮＡの転写伸長が、転写開始部位の下流のヌクレオチド７００〜１０００の 間またはその近傍で損なわれることが示された。この領域に広がる標識ＢｔＤＮ ＾フラグメント及びタバコ核から調製されたタンパク質抽出物を使用したフィル ター結合アッセイからは、このＤＮＡ領域が核中に存在するタンパク質と特異的 な相互作用を行なうことが明らかとなっている（　ＰＣＴ公開ｔｏ　９１／１６ ４３２号）。

（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ　ａｎｄ　ｖａｎｄｅｗｉｅｌｅ、　１９８９ａ）は 、この領域がタバコにおいて最小プロモーターとして機能し、それだけで核転写 因子と相互作用することを明らかにした。かかる相互作用は、この領域における ＲＮＡポリメラーゼ■による転写伸長欠損を惹起する、またはこれに影響するも のの第一候補である。特異的タンパク質結合を不能化するようこの領域を修飾す ることにより、Ｂｔ　ＩＣＰ発現レベルは増加する。この領域はＣＣＡＡＴ−及 びＴＡＴＡ−配列を含むことが認められているが、これらの配列は、種々の資源 のプロモーター内に認められる保存モチーフ（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｍｏｔｉｆ ｓ）である（Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃ ｅ１ｌ、　１９８９）。

欠失分析は、Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子によって生成される転写物レベルの低さは、単 一因子によって制御されるものではないことを示唆した（　ＰＣＴ公開＋１１０ ９１／１６４３２号）。Ｎ２３−２２０におけるポリアデニル化ｂｔ８８４転写 物をｃＤＮＡ−ＰＣＲによって調査すると、少量のより短い転写物種が発生する ことが明らかとなった。このＰＣＴ産物の配列を分析すると、ｂｔ８８４コーデ ィング領域内に３つのクリプテイックイントロンが存在することが判った。ｂｔ ８８４が他の植物種において発現されるとき、不稔性スプライシングを含む更な る、または別のスプライシング事象が起こることは否定され得ない。欠失分析に よれば、この知見は、ｂｔ８８４コーディング領域内に複数の阻害性ゾーンが存 在することを示すものである。

しかしながら、ｂｔ８８４またはｃｒｙ　Ｉ＾ｂ６コーデイング領域を個々に修 飾しても、遺伝子によってコードされる全長ｌｌｌＲＮＡの植物細胞中での発現 の、転写物伸長、核内プロセッシング、核内蓄積及び核外輸送のレベルでの妨害 及び／または阻害を著しく減少し得る。修飾は、かかるｍＲＮＡの細胞質内調節 及び代謝並びにそれらの翻訳にも影響し得る。

更に、３つのクリプテイックイントロンの各々の５′スプライス部位に置換突然 変異を作出した。かかる突然変異は翻訳上中立であり、それだけで個々のイント ロンのスプライシングを不能化する。かかる修飾を担うｂｔ８８４または雪上入 り遺伝子は、野生型遺伝子と比較し、タバコ細胞において著しく高いレベルの全 長ｍＲＮＡ及びＩＣＰを誘導する。

ｂｔ８８４またはｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ６のごときＢｔ　ＩＣＰ遺伝子内の１つ以上 の阻害性ゾーンのコドン用法を変更する代わりに、かかるゾーンの各々の少なく とも１つのプロセッシング誘導配列エレメント、好ましくは各阻害性ゾーン内の かかる配列エレメントの各々を失活化する、好ましくは少なくとも１つのイント ロンをその内に与えることにより分割する。阻害性配列内に好ましく与えられた イントロンは、植物細胞中で効率的にスプライシングされるが、トウモロコシ細 胞中に一時的に導入された数種の遺伝子に報告（Ｃａｌｌｉｓ　ｅｔａｌ、、　 １９ｇ？）されているように、所謂“イントロン仲介遺伝子発現上昇”を与える ためのものではない。その代わり、該イントロンは、阻害性配列を２つに分割す ることにより該配列が機能することを破壊するためのものである。この修飾はＢ ｔ　ＩＣＰ遺伝子のコーディング領域を他の点では未変更のまま残すが、核及び ／または細胞質内の成熟ｍＲＮ＾の蓄積に先行するプロセスに関してはその調節 特性を変更する。

しかしながら、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング効率を最適化するためには、導 入したイントロンにフランキングするヌクレオチドを、多くとも２つの翻訳コド ンに広がる好ましくは多くとも３つのヌクレオチドを用いて変更し、最適な５° 及び３′スプライス境界を作出することが必要となり得る。

Ｂｒｏｗｎ　（１９８６）によれば、可能性のある６４のヌクレオチドトリプレ ットのうち３８が、植物の内在植物遺伝子中でイントロンにフランキングする５ °エキソン境界として作用し得、また、かかるイントロンにフランキングする３ ′エキソン境界には任意のヌクレオチドを使用し得る。Ｂｒｏｗｎ　（１９８６ ）によって記載されていないトリプレットも植物における５′エキソン境界とし て機能し得る。

例を挙げれば、ｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ５コーディング領域において、タバコ遺伝子Ｔ ＾３６のイントロン配列を導入することによりイントロン３の５′スプライス部 位が中断された。この修飾遺伝子は、タバコ細胞において全長ｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ ６　ｍＲＮ＾をより高いレベルで誘導する。

修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子において、植物細胞において活性の全てのプロセッシン グ誘導配列エレメントを、所望される発現レベルに応じて除去もしくは破壊する ことができ、また一部だけを除去もしくは破壊することもできる。

修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子のごとき修飾遺伝子は、植物ゲノム中の、植物細胞中で 該遺伝子の発現を誘導し得るプロモーターの下流に、しかもその制御下に挿入さ れるのが好ましい。

好ましいプロモーターとしては、限定的ではないが、カリフラワーモザイクウィ ルスの強力構成３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｔ、、１９８５）も しくは二重３５Ｓプロモーター（Ｘａｙｅｔ　ａｌ、、　１９８７）が挙げられ る。　３５Ｓプロモーターは種々の単離体から入手されている（Ｈｕｌｌ　ａｎ ｄ■ｏｗｅｌｌ、　１９８７）。他の好ましいプロモーターとしてはＴＲＩ’プ ロモーター及びＴＲ２′プロモーターが挙げられる（Ｖｅｌｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９８４）。或いは、構成的ではな（て、むしろ１つ以上の組織または器 官に特異的なプロモーターも使用し得る。修飾遺伝子は、例えば、ＥＰＡ　８６ ３００２９１．１号に記載のりブロース−１，５−ビホスフエートーカルボキシ ラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーターのごとき光読発性プロモーターの制 御下に遺伝子を置（ことにより植物の緑色組織内で選択的に発現し得る。或いは 、温度または化学的要因によって発現が誘導されるプロモーターを使用すること もできる。

修飾遺伝子、例えば修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子のコーディング領域は、カルコンシ ンターゼ遺伝子（Ｓｏｍｍｅｒ　ａｎｄ　５ａｅｄｌｅｒ。

１９８６）もしくはカリフラワーモザイクウィルス（Ｍｏｇｅｎ　ｅｔａｌ、、 　１９９０）、オクトビンシンターゼ遺伝子（Ｇｉｅｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８４）、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子７　（Ｖｅｌｔｅｎ　ａｎｄ　５ｃｈｅ１ １．１９８５）から誘導される適当な３゛転転写節シグナル（即ち転写物３′末 端形成及びポリアデニル化シグナル）の上流に挿入されるのが好ましい。

本発明によれば、本発明の修飾遺伝子、例えばＢｔ　ＩＣＰ遺伝子の全部または 一部を植物細胞の核ゲノム中に慣用方法で安定に挿入し得、このように形質転換 された植物細胞を使用し、修飾遺伝子の発現が向上されたトランスジエニツ除（ ｄｉｓａｒｍｅｄ）　Ｔ　ｉプラスミドを使用し、例えばＥＰ　１１６，７１８ 号及びＥＰ　２７０，８２２号、ＰＣＴ公開８４１０２９１３号、ＥＰＡ８７４ ００５４４゜０号並びにＧｏｕｌｄら（１９９１）　（これらの文献は参照によ り本明細書の一部を構成するものとする）に記載の方法を用い、植物細胞を形質 転換し得る。Ｔｉプラスミドベクターは、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界配 列の間、または少なくとも右側境界配列の左側に外来ＯＮ＾配列を含むのが好ま しい。

当然ながら、直接遺伝子移入（例えばＥＰ　２３３．２４７号に記載）、花粉媒 介形質転換（例えばＥＰ　２７０．３５６号、ＰＣＴ公開ＷＯ３５１０１８５６ 号及び米国特許第４．６８４．６１１号に記載）、植物ＲＮＡウィルス媒介形質 転換（例えばＥＰ　６７．５５３号及び米国特許第４゜４０７、９５６号に記載 ）、リポソーム媒介形質転換（例えば米国特許第４．５３６．４７５号に記載） 、並びに、ＰＣＴ特許出願国際公開？０９２１０９６９６号に記載のごとき、ト ウモロコシ、コメ、コムギ、オオムギ及びライムギを含む主要穀物のような単子 葉植物を形質転換する方法などの他の方法を使用し、他のタイプのベクターを使 用して植物細胞を形質転換し得る。

形質転換すべき植物がトウモロコシである場合、Ｆｒｏａ＋ｍら（１９９０）、 Ｇｏｒｄｏｎ−）ｆａｍｍら（１９９０）及びＧｏｕｌｄら（１９９１）により 所定のトウモロコシ系に対して記載された方法のような、最近開発された方法を 使用してもよい。形質転換すべき植物がコメである場合、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら ＜　１９８９）、Ｄａｔｔａら（１９９０）及びＨａｙａｓｈｉｍｏｔｏら（１ ９９０）により所定のコメ系に対して記載された方法のような、最近開発された 方法を使用してもよい。

得られる本発明の形質転換植物は修飾遺伝子、例えば修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子の 発現が向上しており、従って、該遺伝子によってコードされるタンパク質、例え ばＢｔ　ＩＣＰを高レベルで産生ずることを特徴とする。かかる植物は、同じ優 れた特性、例えば耐虫性を有する形質転換植物をより多く生産したり、修飾Ｂｔ 　ＩＣＰ遺伝子のごとき修飾遺伝子を、同じまたは近縁植物種の他の品種に導入 する常用品種改良スキームに使用し得る。かかる形質転換植物から得られる種子 は修飾遺伝子を安定なゲノム挿入物として含む。植物中での外来遺伝子の発現は 、本発明によれば、トウモロコシ、タイプ、脂肪種子アブラナ、コムギ、レタス 、トマト及びジャガイモといった任意の植物において向上し得る。しかしながら 、単子葉植物において発現させようとする遺伝子の修飾は、双子葉植物において 活性なものとは異なるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を有するプロセッシング誘導配列 エレメントの翻訳上中立の修飾を必要とし得る。

更に、２つの非競合的結合Ｂｔ　ＩＣＰをコードする少なくとも２つの修飾Ｂｔ 　ＩＣＰ遺伝子を植物発現ベクター中にクローニングすることもできる（ＥＰ＾ ８９４０１４９９．２号）。かかるベクターを用いて形質転換された植物は、少 なくとも２つの修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子の同時発現を特徴とする。得られるトラ ンスジェニック植物は、該植物上で摂食する昆虫のＢｔ　ＩＣＰに対する耐性の 発達を防止または遅延するのに特に有効である。

本発明は、外来遺伝子、特に細菌遺伝子、とりわけＢｔ　ＩＣＰ遺伝子がそのコ ーディング領域内に、シス遺伝子効果を有する調節エレメント、特に、植物細胞 環境において植物プロモーター及び３′非翻訳末端のごとき適当な植物調節配列 の制御下に導入されたときにかかる遺伝子の発現を著しく妨害するクリプテイッ クプロモーター及び不稔性イントロンを含むという発見に基づいている。このよ うな配列の発見によって、かかる遺伝子のコーディング配列中のターゲット配列 を特異的に且つ限定的に修飾すること力（可能となった。一般に、発現問題を実 質的に緩和するために１よ、コーディング領域内で約１０％未満、好ましくは約 ３％未満のヌクレオチドの修飾が必要である。比較的少数の修飾によって植物中 ての外来遺伝子の発現が実質的に増加する結果となるが故に、本発明に従って生 成された修飾遺伝子＋１、植物細胞環境における外来遺伝子の発現を、自身で妨 害する新規導入配列を含むことはないとみられる。

以下、実施例によって本発明を説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制 限するものではない。実施例において参照する図面及び配列は以下の通りである 。

の転写活性の比較。３２Ｐ　ＵＴＰの存在下に３０℃で２０分間、ＲＮＡ伸長反 応を実施した。核から抽出した放射性標識ＲＮ＾を、ナイロン膜上に固定したモ ル過剰量の変性±及び１μ３４　ＤＮＡにハイブリダイズさせた。Ｔ−ＤＮＡ上 でのＤＮＡ領域の位置及びサイズを示す。ＬＢ及びＲＢはそれぞれ左側及び右側 のＴ−ＤＮＡ境界を指す。〔及び竪遺伝子（Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ８７）の３°末端形成及びポリアデニル化領域も示す。ノ）イブリダイジした± （左側カラム）及びすμＵ（右側カラム）の相対存在度を、種々の露光時間のオ ートラジオグラフのシンチレーションカウント及びデンシトメーター走査によっ て測定した。値は、ハイブリダイズしたＲＮＡのＵＴＰ含有量に対して補正した ものである。

図２−ヌクレオチド６６８と８３４との間のｂｔ８８４コーディング領域の０Ｍ Ｓフットプリントの概略図。無修飾の（ｎａｋｅｄ）　ＤＮＡと比較してｉｎ　 ｖｉｖｏで高メチル化及び低メチル化されたヌクレオチドをそれぞれ下向き及び 上向きの矢印で示す。その量ついては図の右側に示したスケール参照。１５％以 上の維持及び１．２５倍以上の過敏性を示す。四角で囲んだＧ残基は、対応バン ドが放射性標識プライマーのダイマーと共に移動したので考慮しなかった。ＣＣ ＡＡＴボックスには下線を引いた。

図３ａ−ｂｔ８８４コーディング領域と実施例４の４つのＰＣＲプライマーセッ トとを示す概略図。ヌクレオチド番号は翻訳開始コドンに相対的なものである。

ＰＣＲプライマーの向きは矢印の通りであり、各プライマーの５゛末端ヌクレオ チドの位置を示す。

図３ｂ−プライマーＰＳ５８及びＰＳ５９を用いたＰＣＲ反応によって得られた ３つのＤＮＡフラグメント（工、■及び■）の概略図。番号は翻訳開始コドンに 相対的なものであり、ｂｔ８８４コーディング領域内のイントロンの５′及び３ ′ヌクレオチドを指す。３′及び５゛スプライス位の上流及び下流に位置する隣 接ヌクレオチドも示す。

配列表： 配列番号１：オリゴヌクレオチドＰＳ４８配列番号２　：オリゴヌクレオチドＰ Ｓ４３配列番号３：オリゴヌクレオチドＰ３３８配列番号４：オリゴヌクレオチ ドＰＳ３９配列番号５：オリゴヌクレオチドＰＳ４７配列番号６：オリゴヌクレ オチドＰＳ４４配列番号７：オリゴヌクレオチドＰＳ３８配列番号８：オリゴヌ クレオチドＰＳ４６配列番号９：オリゴヌクレオチドＰＳ４５配列番号ｌＯ：オ リゴヌクレオチドＰＳ５８配列番号１１：オリゴヌクレオチドＰＳ５９配列番号 １２：オリゴヌクレオチドＰＳ６１配列番号１３：オリゴヌクレオチドＰＳ６２ 配列番号１４：オリゴヌクレオチドＰＳ６３配列番号１５：オリゴヌクレオチド ＰＳ６４配列番号１６：オリゴヌクレオチドＰＳ６５配列番号１７：オリゴヌク レオチドＰＳ６６配列番号１８：オリゴヌクレオチドＰｖ＾−５８配列番号１９ ：オリゴヌクレオチドＰｖ＾−５ｂ配列番号２０：オリゴヌクレオチドＰＶＡ− ６８配列番号２１：オリゴヌクレオチドＰｖ＾−６ｂ配列番号２２ニブラスミド ｐＪＤ８８４配列番号２３ニブラスミドｐＰｓＯ２１２実施例に特に記載のない 限り、組換えＤＮＡを作製及び操作する全ての方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−＾１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ　（１９８９）に記載の標準化方法によって実施した 。

実施例に使用したいμＵ及びｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ６遺伝子内の特定のヌクレオチド は、それぞれ配列番号２２及び配列番号２３に与えたように遺伝子の配列に関し て同定した。配列番号２２にその全配列を示すプラスミドｐＪＤ３８４はｂｔ８ ８４遺伝子を含み、プラスミドｐＲＶ＾０２１４及びｐＰｓＯ２１２を構築する ために使用した。ここで、ｐＲｖ＾０２１４はｐＪＤ８８４と同一であるが、但 し、ヌクレオチド位置７６３０と１０５の間にあるＡＴＧ翻訳開始コドンを含む 配列が、配列番号２３の位置７５４６と６の間の対応配列で置き換えられており 、その結果、ｂｔ８８４遺伝子のＮ末端の２８アミノ酸が欠失し、Ｊｏｓｈｉ翻 訳開始コンセンサス配列が導ドｐＰｓＯ２１２は、ヌクレオチド１と３０の間と ヌクレオチド５９４と９０６の間とに位置する領域において幾つかの翻訳上中立 のヌクレオチド置換があることでｐＲＶＡＯ２１４とは異なる。

実施例１．クリプテイックプロモーター活性ＰＣＴ特許公開Ｗ０９１／１６４３ ２号に記載のトランスジェニックタバコＮ２３−２２０を用いて得られた核ラン オンデータは、全長ｂｔ８８４　ｍＲＮＡの核から細胞質への流出が少ないのは 、舛コーディング領域のＴＲ２°プロモーターにおける転写開始の妨害に起因す るのではないこと（図１）、及びＲＮ＾ポリメラーゼＨによる伸長は、ｂｔ８８ ４遺伝子の転写開始部位の下流のヌクレオチド７００と１０００の間またはその 近傍において阻害されることを示した。更に、ＤＮＡフットプリント分析からは 、ｉｎ　ｖｉｖｏ　ＤＮＡ結合タンパク質はｂｔ８８４　ＤＮ＾領域と、ヌクレ オチド６７０と１２０２の間で相互作用することが判った（ヌクレオチド位置は 翻訳開始コドンに相対的に測定した）。

この相互作用の結果、ＲＮＡポリメラーゼ■複合体は、この領域において転写物 を伸長する上で困難に遭遇し得る。該領域を精査すると多数のＣＣＡＡＴボック スの存在が明らかとドブリントを実施した。Ｎ２３−２２０の原形質体を０．５ ％ＤＭＳで３分間処理し、全ＤＮＡを調製した（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８３）。１μｍのＤＩＩＳを加えた２００μｌＴＥ　（１０ｄ　 Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，９゜１■Ｍ　ＥＤＴＡ）中のＮ２３−２２０の除タンパク質 ＤＮＡ３４μｇを用いてｐ）（７，９で並行反応を実施した。３分後、１００μ ｌ　３Ｍ　Ｔｒｉｓ。

ｐ）（ｓ、　Ｏを加えることによりインキュベーションを停止し、次いでフェノ ール−クロロホルム抽出を実施した。ＤＮＡ試料を、ピペリジンインキュベーシ ョンによってメチル化Ｇ残基）５゛側テニツクした（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１ １ｂｅｒｔ、１９８０）。川（ｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ）転写減衰領域近傍でニックさ れたＤＮＡ鎖を、Ｍｕｅｌｌｅｒ及びｆｏｌｄ　（１９８９）によって記載され ている連結媒介ＰＣＲ法（ｌｉｇａｔｉｏｎ−ＩＩｌｅｄｉａｔｅｄ　ＰＣＲｍ ｅｔｈｏｄｓ）に従い、両反応に対して３．５μｇ　ＤＮＡ試料を用いて増幅し た。第１ブライミング反応に使用したオリゴヌクレオチドは、コーディング鎖に 対しては配列番号１のオリゴヌクレオチド、非コーディング鎖に対しては配列番 号２のオリゴヌクレオチドであった。リンカ−として、配列番号３のオリゴヌク レオチド及び配列番号４のオリゴヌクレオチドを連結した。連結産物を、コーデ ィング鎖及び非コーディング鎖に対してそれぞれ配列番号５のオリゴヌクレオチ ド及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを配列番号７のリンカ−と共に使用し、 １９ＰＣＲサイクルで増幅した。コーディング鎖及び非コーディング鎮の最後の 増幅反応はそれぞれ、３２ｐで末端標識した配列番号８のオリゴヌクレオチド及 び配列番号９のオリゴヌクレオチドを用いて実施した。反応産物をシーケンシン グゲル（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｇｅｌ）上で分離し、オートラジオグラフィー によって可視化した。ＬＫＢ　Ｕｌｔｒａｓｃａｎ　２００２　（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄ ｅｎ）によってレーンを３回走査し、記録しておいた分布と照合することにより 比較した。ヌクレオチド位置を、ｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒ。

ＤＭＳフットプリントにおける種々の位置のＧ残基濃度値の比に対してプロット した。平均勾配からの偏差が２０％未満の点を使用し、反復計算によって線形回 帰を判定した。計算された相関に対してｉｎ　ｖｉｖｏシグナルの相対偏差を計 算することにより、高メチル化及び低メチル化レベルを決定した。ＤＭＳフット プリントの結果は図２に示す。より上流に離れて位置するＣＣ八へへボックスで はなくて、間隔の小さい２つのＣＣＡＡＴボックスは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏと比較 してｉｎ　ｖｉｖｏでＤＭＳに対する感受性が緩和されている。これは、これら のは高ＡＴ含有量を有するので、ＣＣＡＡＴボックスは機能性ＴＡＴ＾ボックス の近傍にあり得、従って最小プロモーターの一部であり得る。この仮説を試験す るため、４７４ヌクレオチにセンス向きで配置し、起こり得る転写開始事象をモ ニターした（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ　ａｎｄ　Ｖａｎｄｅｗｉｅｌｅ、１９８ ９ａ）。タバコ原形質体中に導入すると、３５Ｓエンハンサ−ＣＣ＾＾Ｔボック ス融３種類の５゛末端が同定された。５゛末端はおおよそ等モル比で存在し、ｂ ｔ８８４の翻訳開始部位に対してヌクレオチド７７４．７７５．７７７；ヌクレ オチド８３３．８３４．８３６；及びヌクレオチド８４１にマツピングされた。

この知見は、この領域が最小プロモーターエレメントとして機能し、それだけで 転写因子と相互作用し得ることを示している。この相互作用の結果、ＲＮ＾ポリ メラーゼＨの、この領域を効率的に転写する能力が不能になると考えられる。

実施例２　：　ｂｔ８８４　ｍＲＮ＾プロセッシングの検出ＰＣＴ特許公開Ｗ０ ９１／１６４３２号は、タバコにおいて細胞質い流出量が制限されていることに 起因することを示している。

ＰＣＴ公開ＷＯ旧／１６４３２号に記載の欠失分析と組み合わせたランオン分析 は、Ｎ２３−２２０におけるｃｒｙ　Ｉ＾ｂ転写物伸長は、転写開始部位の下流 のヌクレオチド７００と１０００の間またはその近傍で妨害されること、及びｃ ｒｙ　Ｉ　Ａｂココ−ィング領域の幾つかの領域がこれに関与すること、即ちク リプテイックプロモーターにおける転写減衰は、発現を妨害する唯一のプロセス ではないことを示している。　。

＾は、通常の全ＲＮ＾ノーザンプロット分析（Ｖａｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８７）の検出限度以下のレベルで蓄積した。従って、Ｎ２３−２２０によっ て発現されるｂｔ８８４　ｍＲＮＡは以下のように調査した。

Ｄｅｎｅｃｋｅら（１，９８９）によって記載されているようにＮ２３−２２０ の葉肉原形質体を調製した。Ｊｏｎｅｓら（１９８５）に従って全ＲＮＡを抽出 し、ＤＮＡプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を使用し、実質的にＫａｗａｓａｋ ｉ　（１９９０）によって記載されている用するＫａｗａｓａｋｉ　（１９９１ ）によって記載されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、第１鎖を 使用して特異的ＤＮＡフラグメントを増幅した； セットＡ　：　ＰＳ６６及びＰＳ６４　；セットＢ　：　ＰＳ６３及びＰＳ６５ 　；セットＣ：　ＰＳ５８及びＰＳ５９　；セットＤ　：　ＰＳ６１及びＩ）Ｓ ６２゜上記プライマーは下記の通りに配列表に示す：ＰＳ５８は配列番号１０、 ＰＳ５９は配列番号１１、ＰＳ６１は配列番号１２、ＰＳ６２は配列番号１３、 ＰＳ６３は配列番号１４、ＰＳ６４は配列番号１５、ＰＳ６５は配列番号１６、 及び、ＰＳ６６は配列番号１７゜増幅したＤＮＡ産物を非変性ポリアクリルアミ ドゲルにおいて試験したところ、プライマーセットＡ及びＢは推定サイズのＤＮ Ａフラグメントを与えた（図３８）。プライマーセットＣは、推定ＤＮＡフラグ メントに加えて、別の２種類のより小さいサイズのＤＮＡ種を与えた（図３ｂの ■及び■）。プライマーセットＣによって生成されたＤＮＡフラグメントの８４ 　ＤＮＡ配列■及び■にそれぞれ１つ及び２つの欠失が存在することを明らかに した。欠失部分の末端のヌクレオチド配列は、Ｈａｎｌｅｙ及び５ｃｈｕｌｅｒ 　（１９８９）の植物イントロン境界のコンセンサス部位の配列と一致しており 、即ち、各欠失部分の５゛末端ではＧＴ、及び各欠失部位の３′末端ではＡＧで あった（図３ｂ）。欠失のサイズはそれぞれ２０８及び１３９ヌクレオチドであ った。プライマーセットＤは、推定ＤＮＡ産物に加えて、４種類のより小さなＰ ＣＲ産物を与えた。かかるフラグメントの配列分析により、２ｏ８ヌクレオチド の欠失、プライマーセットＣを使用したときのｃＤＮ＾−ＰＣＲ分析に認められ た２０８及び１３９ヌクレオチドの欠失の併存、並びに、２０８ヌクレオチドの 欠失と新たな９２９ヌクレオチドの欠失の併存が確認された。この後者の欠失配 列の末端は、５゜及び３’　ＲＮ＾スプライス部位のコンセンサス部位と一致し た。

従ってこれらの欠失から、ｂｔ８８４　ｍＲＮＡ前駆体がスプライシングを受け ていることは明らかであり、２つのクリプテイックイントロンの正確な位置を図 ３ｂに示す。図３ｂにおいて、翻訳開始部位に対して位置１３３９〜１４７７及 び位置１５７９〜１７８６にあるイントロンをそれぞれ“イントロン１″及び“ イントロン２″と称した。位置５４９〜１４７７にあるイントロンは“イントロ ン３”と称した。

れかであった（ＨＯｆｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６　；　Ｖａｅｃｋ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８７）誘導され（ＨＭｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６）、該 フラグメント内の１０７のコドンうち６３に影響する、ヌクレオチド５９０　（ Ｘｂａ　Ｉ部位）と９１７　（ＥｃｏＲＩ部位）の間で（伸長効率を回復する目 的で）修飾されている。

同様に、（プラスミドｐＪＤ８８４の）県冬ムコーディング配列のヌクレオチド ７７２及び７８９にあるＣＣＡＡＴボックスを特異的に除去すると、かかるプロ セッシング誘導配列エレメントが、転写物伸長阻害に関与することが明らかとな った。

オリゴヌクレオチドＲＶ＾−５及びＲＶＡ−６はそれぞれ、７７４位にあるＡを Ｇに変更することにより近位のＣＣＡＡＴボックスを修飾するために、並びに、 ７９２位にあるＡをＧに変更するかまたは７９２位及び７９３位にあるＡ及びＴ をそれぞれＧ及びＣに変更することにより近位ＣＣ＾＾Ｔボックスを修飾するた めに使用した。７７４位及び７９２位を変更して得られた構築物をｐＲＶＡ０２ ０１″と称し、７７４．７９２及び７９３位を変更して得られた構築物を“ｐＲ ｖ八０へ０２”と称する。ＲＶＡ−５は配列番号１８及び配列番号１９のオリゴ ヌクレオチドの混合物であり、ＲＶＡ−６は配列番号２０及び２１のオリゴヌク レオチドの混合物であって、しかもＲＶＡ−５と相補的である。

Ｈｏら（１９８９）によって記載されているＰＣＲ仲介突然変異誘発法を使用し 、ＲＶＡ−５及びＲＶＡ−６フラグメントのヌクレオチド配列を展足Ｕの１０９ １ｂｐ　５ｐｅｌ−ＥｃｏＮＩフラグメント中に組込んで、ヌクレオチド７７２ 及び７８９にあるＣＣ＾＾Ｔボックスを変更した。次いで、発現評価のために、 ｐＲＶ＾０２０１及びｐＲＶ＾０２０２をタバコＳＲＩ原形質体中にエレクトロ ポーレーシコンによって導入した。遺伝子発現は著しく向上したことが判明した 。

翻訳開始部位に対して１３３９〜１４７７位（イントロン１）、１５７９〜１７ ８６位（イントロン２）及び５４９〜１４７７位（イントロの適当な位置に導入 することにより機能的に除去した。突グ領域に存在するクリプテイックイントロ ンスプライス部位が非機能性となるように選択した。特に、イントロン１の５° スプライス部位を＾ＧＴ：ＧＴＡＡＧＴからＴＣＴ　：　ＧＴＴＴＣＧに変更し 、イントロン２の５゛スプライス位をＣＧＧ：ＧＴＡＡＧ＾からＣＧＴ　：　Ｇ ＴＣＣＧＧに変更し、更にイントロン３の５°スプライス部位をＡ＾Ｇ　：　Ｇ ＴＧＧＧＧからＧＣＧ　：　ＣＴＧＧＧＧに変更した。ｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ２２遺 伝子を担うプラスミドｐＲｖ＾０２１４中に各々独立に修飾を導入した。

この遺伝子は、最初の２８コドンが欠失している上に、翻訳開始シグナルのあと にＧＣＵコドンを有するｂｔ８８４の誘導体である。更に、ｐＪＤ８８４　（配 列番号２２）から誘導されるプラスミドｐＲＶ＾０２１４は、一時的発現アッセ イにおいて実験的内部制御として作用するキメラ川レポーター遺伝子を担う（Ｄ ｅｎｅｃｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９）。次のステップにおいては、種々の ５°スプライス部位修飾を組合せ、イントロン１；イントロン１及び２；イント ロン１及び３：イントロン１．２及び３；イントロン２；イントロン２及び３； 並びにイントロン３の修飾５゛スプライス部位を有するｃｒｙ　Ｉ＾ｂ遺伝子を 担う一連のｐＲＶＡＯ２１４誘導体を得た。

プラスミドをＳＲ１葉肉原形質体中に導入し、移入７時間後、種々の修飾ｃｒｙ 遺伝子及びｃａｔ遺伝子の発現をｍＲＮＡ及びタンパク質レベルにおいて測定し た。このデータの概要を表１に与える。

かかるデータから、イントロン２の５°スプライス部位が修飾された遺伝子は最 高のＩＣＰ発現を与えることが判明した。イントロン１及び３の５°スプライス 部位の修飾を組合わせると、ＩＣＰ発現は更に向上する。

実質的にＤｅｎｅｃｋｅら（１９８９）によって記載されているように相対的Ｉ ＣＰ産生量を測定した（表２）。このことから、スプライス部位修飾は最終的に ＩＣＰ生産を大幅に向上することが明らかとなった。更に、イントロン２の修飾 ５゛スブパク質合成レベルにおいて比較した。表２に示したように、イントロン ２の５°スプライス部位の修飾はＲＮ＾レベルを増加させると共に、ＩＣＰ産生 レベルを太き（向上する結果となる。まとめると、かかるデータから、ｂｔ８８ ４のクリプテイックイントロン、特にイントロンＩ及び■、とりわけイントロン ■はｂｔ８８４　ｍＲＮ＾前駆体の不稔性スプライシングを惹起することが判る 。

実施例４．タバコ及びジャガイモ植物における修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子のクロー ニング及び発現 １９８６年１月２２日出願米国特許出願第８２１，５８２号、並びにＥＰＡ　８ ６３００２９１．１号、ＥＰＡ　８８４０２１１５．５号及びＥＰＡ　８９４０ ０４２８．２号に記載の方法を使用し、実施例３の修飾Ｂｔ　ＩＣＰ　（即ち川 ）遺伝子を中間Ｔ−ＤＮＡベクターｐＧｓＨ１１６０（Ｄｅｂｌａｅｒｅ　ｅｔ 　ａｌ、。

１９８９）のＴ−ＤＮＡ末端境界反復配列間に挿入した。

植物中で有意に発現させるため、実施例３の修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を３５３プ ロモーターまたはＴＲ２’プロモーター（ＰＴＲ２−Ｖｅｌｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９８４）の制御下に置き、カルコンシンターゼ遺伝子または〔遺伝子の ３°末端形成及びポリアデニル化シグナルに融合した。

更に、植物細胞における翻訳開始を最適化するため、翻訳開始コンチクストまた は部位をＪｏｓｈｉコンセンサス配列（Ｊｏｓｈｉ、　１９８７）に従って変更 した。このため、オリゴ二本鎖を導入し、配列番号２３の７５６１〜６位に示し た配列を翻訳開始部位に作出した。このようにして、アラニンをコードする追加 コドン（即ちＧＣＴ）を導入した。更に、ＡＴＧ翻訳開始コドンの上流にＫｐｎ 　Ｉ及びＢｓｔＸ１部位を作出した。

標準方法（Ｄｅｂｌａｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５）を使用し、修飾Ｂｔ ＩＣＰ遺伝子を含む中間植物発現ベクターを、武装解除Ｔｉブ２９１、１号）中 に移入した。スペクチノマイシン耐性について選択し、ｐＧＶ２２６０とそれぞ れ中間植物発現ベクターとかタバコ及びジャガイモ植物細胞中に含まれ且つ発現 されるた。

修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を含むトランスジェニックタバコ植物をＥＬＩＳＡアッ セイによって分析した。かかる植物は、非修していると特性分析された。

形質転換タバコ及びジャガイモ植物の葉における修飾ＢｔＩＣＰ　（ｂｔ２）遺 伝子の発現産物の殺虫性を、かかる２種の植物の葉上で摂食させたタバコイモム シ（Ｍａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａ）ｈｔｈｏｒｉｍａｅａ　ｏｐｅｒｃｕｅｌｌ ａ）の幼虫の成長速度及び致死率を記録することにより評価した。結果を、未修 飾、即ち親のＢｔ　ＩＣＰ　（ｂｔ２）遺伝子を用いて形質転換したタバコ及び ジャガイモ植物由来の葉及び未形質転換ジャガイモ及びタバコ植物由来の葉上で 摂食させた幼虫の成長速度と比較した。

ＥＰＡ　８８４０２１１５．５号及びＥＰＡ８６３００２９１．１号に記載のご とく毒性アッセイを実施した。

修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を含むトランスジェニックタバコ植物の殺虫性を、）Ｉ ｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの第二及び第三齢幼虫において評価した 。対照植物は形質転換しなかった。修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を含み且つそれを発 現した形質転換植物の葉上で摂食させた幼虫には著しく高い致死率が得られた。

修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を含むタバコ及びジャガイモ植物は、未修飾Ｂｔ　ＩＣ Ｐ遺伝子を含むタバコ及びジャガイモ植物と比較し、極めて高いＢｔ　ＩＣＰ発 現レベルを示した。

言うまでもなく、本発明は、修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を用いて形質転換されたタ バコ及びジャガイモ植物に制限されることはなく、修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を用 いて形質転換された任意の植物、例えばトマト、アルファルファ、ヒマワリ、ト ウモロコシ、綿、タイズ、サトウダイコン、菜種、アブラナ類及び他の植物も含 まれる。

また本発明は、修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を用いて植物細胞を形質転換するための Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｔｉプラスミドの使用 に制限されることもなく、リポソーム、エレクトロボーレーシコン、植物ウィル スもしくは花粉をベースとするベクター系など、他の公知の植物形質転換方法を 、かかる修飾Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を用いて単子葉植物及び双子葉植物植物を形質 転換するために使用し得る。この点に関して言えば、穀物、特にトウモロコシ及 びコメのような経済的に重要な作物を含む単子葉植物は、ＴＯ９２１０９６９６ 号に記載の方法を使用して効率的に形質転換し得る。ここでは、緻密胚形成カル ス（ｃｏｍｐａｃｔ　ｅ＋ｏｂｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｃａｌｌｕｓ）またはこのよ うなカルスを入手し得る無傷の組織を、切断及び／または酵素分解によって傷つ け、次いで例えば直鎖状ＤＮＡ分子のエレクトロポーレーシコンによって形質転 換する。

更に本発明はｂｔ２遺伝子に制限されることもなく　、Ｃｒｙ　Ｉ　５Ｃｒｙ　 ＩＩ、Ｃｒｙ　ｍ及びＣｒｙＩＶ　Ｂｔ　ＩＣＩ’遺伝子を全て包含する。実際 、クリプテイックプロモーター中に存在し得る配列、例えばＣＣ＾＾Ｔ配列は、 全てのＢｔ　ＩＣＰ遺伝子において両ＤＮ＾鎖（即ちコーディング及び非コーデ ィング鎖）上に認められ遺伝子、ｃｒｙ　Ｉ　Ｅ　（凹）遺伝子及びｃｒｙｍ　 Ｄ　（ｂｔ１０９Ｐ）遺伝子における種々の完全なＣＣＡＡＴ配列の位置を表３ に示す。

このようなＣＣＡＡＴ配列が正しい環境にあるならば、それらはクリプテイック プロモーターとして機能し、従って転写を妨害し得る。同様に、植物イントロン スプライス部位が多数のＢｔ　ＩＣＰのコーディング領域内に認められている。

本発明の特性を使用することにより、かかる遺伝子内で不稔性イントロンを同定 し得る。

表１ 一相対タンパク質レベルはＥＬＩＳ＾及びＣＡＴ活性アッセイによって測定した 。タンパク質値は絶対的なものでなく、一般的傾向を示している。遺伝子ｃｒｙ 　Ｉ＾ｂ２８、」、」、−２６、−２７、−２３及び−２５はｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ ２２遺伝子から誘導した。

表２ ■ＲＮＡレベルをプラスミド移入７時間後に測定し、実質的にＣｏｒｎｅｌｉｓ ｓｅｎ及びＶａｎｄｅｗｉｅｌｅ　（１９８９ｂ）に記載のごと（ｃａｔｍＲＮ Ａレベルに対して補正した。ΔＩＣＰ／時間は、ＣＡＴ蓄積量／時間に対して補 正した相対ＩＣＰ蓄積量／時間である（ＮＤ：測定せず）。

−ＩＣＰ／ＣＡＴ値は特許公開ＷＯ９１／１６４３２号に記載のごとく測定した 。プラスミド移入後０．３．５．７．１１及び２０時間後に試料を採取した。Ｒ ＮＡ及びタンパク質値は絶対的なものでなく、一般的傾向を示している。

表３ −　ＣＣＡＡＴ結合タンパク質と相互作用し得る他の阻害性配列の位置は表３に は記載していない。

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−Ｈａｙａｓｈｉｍｏｅｏ　ｅｔ　ａ二、ＦｌａｒＩｃ　ＰｈｙｓｉｏＬ、９３ ．　８５７　Ｈ９９０１。

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−Ｈ６ｆｔｅａｎｄシコｈｉｕｅｌｅｙ、ＭｉＣｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ、２４２−２５５（１９Ｂ９１゜−Ｈｕｌユ　ａｎｄ　Ｈｏｗｅｌ！、’！ｉ ｒＯＬｏｇｙ　社、４８２−４９３　＋１９８７１　。

−Ｊｏｎｅｓ　＠！＋：　ａｌ、ＥＭＢＯＪ、４，２４１！−２４１８＋１９８ ５１　。

−Ｊｏｓｈｉ、ＮｕｃＬ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５、６６４３−６６５３　＋ １９８７１゜−Ｋａｅａｇｌｒｚ　ａｎｄ　Ｃｈｕａ、Ｔｒｅｎａｓ　Ｇｅｎｅ Ｅ、８．　２２−２７　ｔ１！”３４）　。

−Ｋａｗａｓａｋｉ、ｉｎ：　ＰＣＲＰｒｏｅｏｃｏｌｓ：　ａ　ｇｕｉａｅ　 ｔ−ｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄａｐｐｌｉｃａｃｉｏｎｓ、ｅｄｉ：＠ｄ　ｂ ｙ　Ｍ、Ｉｎｎ１ｓ、Ｄ、Ｇｅ１ｆａｎｄ、Ｊ、５ｎｉｎｓｋｙａｎｄ　Ｔ、、 Ｗｈｉｔｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　工ｎｃ、、ｐｐ、２１−２７　＋ １９９０１゜−Ｋａｙ　ｅ仁　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６．　１２９９−１ ３０２　＋１９８７１゜−Ｋｒｉｅｇ　ｅｔ　ａｌ、Ｚ、　Ａｎｇ、　Ｅｎｔ、 ９６．　５００−５０８　＋１９８３１゜−Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒ ：、Ｍｅｃ？１ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ：＝ｙｍｏｌｏｇｙ　６５．　４９９−５６ ０（１９８０＋　。

−Ｍｃ　Ｐｈｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６．　６ １−６６　ｆ１９Ｂ８）　。

−Ｍｏｇｅｎ　ｅｃ　ａｌ、Ｔｈｅ　Ｐｌａｒ、ｃ　Ｃｅ１ｌ　２．　１２６１ −１２７：！　＋１９９０１　。

−Ｍｏｒｅｅｔ　ａｎｄ　Ｂｕｃｋ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、２１０．６５−７ ７　＋１９８９１゜−Ｍｅｅｕｓｅｎ　ａｎｄ　Ｗａｒｒｅｒｌ、Ａｎｎ、Ｒｅ ｖ、Ｅｎｈｏｍｏｉ、３４．　３７３−３８１　（１９Ｂ９１　。

−Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏ５　ｃ？＋ｅ　Ｃｅ１ｌ、 ５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ”、Ｅｄｓ。

Ａｌｂｅｒｅｓ　ｅｔ　ａｉ、Ｇａｒｌａｎｄ　ＰｕｂｌｌＳｌｌｌｎ（７Ｃｏ 、、Ｎ、Ｙ、ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎｆ１９８９１　。

−Ｍｕｅｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｗｏｌｄ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６，７８０−７８ ６　＋１９８９１　。

−０ｄｅｌｌ　ｅｅ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３１３，８１０−８１２　＋１９８ ５１゜−ｐａａｇｅｅｔ　ｅｅ　ａｌ、Ａｎｎｘ＝、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　５５．　１１１９−１１５０　＋１９８６１゜−Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａｌ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ二、Ａｃａｃｉ、Ｓ（ｌ　ＵＳＡ　８４，７９９−８０３　＋ １９８７１゜−Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅＣｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　−Ａ　１ａｂｏｒａ仁ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄＳｐｒ　ｌ　ｎ 　ｑ’　Ｈａ　ｒｂＯｒ　Ｌａ′ＤＯｒａ　ｃＯ町Ｐｒｅ　Ｓ　Ｓｒ　ＮＹ（１ ９Ｂ　９１　。

−Ｓａｓｓｅ−Ｄｗｉｇｈｔ　ａｎｄ　ＧｒａｌＬａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｅｌ、入 ｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５．　８９３４−８９３８　ｔ１９’８８１゜ −５ｃｈｎｅｐｆ　ｅｅ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０．６ ２６４−６２７２　（１９８５＋。

−Ｓｈｉｍａｍｏｅｏ　ｅｒ：、ａｌ、Ｎａｅｕｒｅ　３３Ｂ、２７４　＋１９ ８９１゜−５ｏｎｖｎｅｒ　ａｎｃｉ　５ａｅｄｌｅｒ、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅ ｎｅｅ、２０２，４２９−４３４　＋１９８６）。

−’、’ａｅＣｋ　ｅ’ｃ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３２７，３３−３７　１１９ ８７１　。

−Ｖｅｌｃｅｎ　ａｎｄ　５ｃｈｅ１１．　Ｎｕｃｌｅｘｃ　Ａｃ＝ａｓ　Ｒ＠ ５ｅａｒｃｈ　１３．　６９８ｉ−６９９８ｆ１９８５）。

−Ｖｅｌｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、ＥＭＢＯＪ　３．　２７２３−２７３０　＋１９ ８４１゜−ｔ゛Ｊｉｄｎ＝ｒ　ａｎｄ　Ｗｈｉ：ｅｉ＝ｙ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅ ｒｉａｌ　１７１．　９６５−９７４　ｆ！９８９＋　。

配列表 １、一般情報 ｉ　）　出１１人：　ＰＬＡＮＴ　ＧＥＮＥＴＩＣＳＹＳＴＥＭ　Ｎ、　Ｖ。

ｉｉ）発明の名称：修飾遺伝子及びそれらの植物中での発現１ｉｉ）配列の数＝ ２３ ｉｖ）連絡先住所： Ａ、宛て名　：　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ＮＪ。

Ｂ６番地　：　Ｐｌａｔｅａｕｓｔｒａａｔ　２２゜Ｃ９郵便番号及び都市：　 ９０００　Ｇｈｅｎｔ。

Ｄ・国名　：ベルキー ｖｉ）最新出願データ二人手不可能 ｖｉｉ）先行出願データ： １９９１年１０月３０日出願ＥＰ　９１４０２９２０．２号１９９２年３月２５ 日出願ＥＰ　９２４００８２０．４号２、配列の詳細：配列番号１ 配列の型；ヌクレオチド配列 配列の長さ：２６０を 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ４ｇと命名ＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＧＣ ＴＧＧＴＡＣＡＡ　ＴＡＣＧＧＧ　２６３、配列の詳細：配列番号２ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２９　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ４３と命名ＧＧＡＣＴＣＣＴ＾＾ＴＡ ＣＴＴＣＣＴＴＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧ　２９４、配列の詳細：配列番号３ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２４　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ３８と命名ＧＧＣＧＡＣＡＴＧＧ　Ｃ ＣＧＣＴＧＡＧ＾＾　ＴＣＴＧ　２４５、配列の詳細：配列番号４ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ＋１１ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ３９と命名ＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡ　Ｇ 　１１ ６、配列の詳細：配列番号５ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：２５０を 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ４７と命名ＧＣＴＧＧＴＡＣＡＡ　Ｔ ＡＣＧＧＧＡＴＴＡ　ＧＡＧＣＧ　２５７、配列の詳細：配列番号６ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２６　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ４４と命名ＣＣＴＴＣＴＡＴＧＣＣＣ ＴＧＡＧＣＣＧＡ　ＧＣＣＴＣＧ　２６８、配列の詳細：配列番号７ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　’１４　ｎｔ 鎖の数、−水銀 トポロジー・直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ３８と命名ＧＧＣＧＡＣＡＴＧＧ　Ｃ ＣＧＣＴＧＡＧ＾＾ＴＣＴＧ　２４９、配列の詳細、配列番号８ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２６　ｎｔ 鎖の数二一本膜 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ４６と命名ＴＡＣＧＧＧＡＴＴＡ　Ｇ ＡＧＣＧＴＧＴＡＴ　ＧＧＧＧＡＣ２６ＩＯ１配列の詳細二配列番号９ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２３　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ４５と命名ＧＣＣＧＡＧＣＣＴＣＧＡ ＾＾＾ＣＴＡＣＣＡＴＣ２３１１、配列の詳細：配列番号１０ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２９　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ５８と命名ＧＴＧＣＣＡＣＣＴＡ　Ｇ ＧＣＡＡＧＧＡＴＴ　ＴＡＧＴＣＡＴＣＧ　２９１２、配列の詳細：配列番号１ １ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２９　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ５９と命名ＴＡＧＣＴＣＡＴＣＧ　Ｇ ＧＧＧＡＴＣＴＧＣＴＡＧＡＧＣＣＧＧ　２９１３、配列の詳細：配列番号１２ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２９　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ６１と命名＾ＣＡＴ’ＴＧＣＣＧＴ　 ＡＧＡＴ’ＧＡＡＡＧＡ　ＣＴＧＡＧＴＧＣＧ　２９１４、配列の詳細：配列番 号１３ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２９　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ６２と命名ｃｃｃｃ＾＾ＴＣＧＡ　Ｔ ＡＴＴＴＣＣＴＴＧ　ＴＣＧＣＴ＾＾ＣＧ　２９１５、配列の詳細：配列番号１ ４ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２９　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ６３と命名ＴＴＧＧＡＣ＾＾ＡＧ　Ｇ ＴＧＧＧＧＡＴＴＴ　ＧＡＴＧＣＣＧＣＧ　２９１６、配列の詳細：配列番号１ ５ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２９　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ６４と命名ＡＴＣＣＧＧＴＣＣＣＣＡ ＴＡＣＡＣＧＣＴ　ＣＴＡＡＴＣＣＣＧ　２９１７、配列の詳細：配列番号１６ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２９　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ６５と命名ＡＴＧＧＣＴＴＡＡＴ　Ｃ ＧＡＴＧＡＣＴＡＡ　ＡＴＣＣＴＴＧＣＣ２９１８、配列の詳細：配列番号１７ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　２９　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＰＳ６６と命名ＣＣ＾＾＾ＴＣＧＡＴ　Ｇ ＧＡＴＣＣＣＧＡＴ＾＾ＣＡＡＴＣＣＧ　２９１９、配列の詳細：配列番号１８ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　３７　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＲＶＡ−５ａと命名＾ＣＧＴＡＴＣＣＧＡ 　ＴＴＣＧＡＡＣＡＧＴ　ＴＴＣＣＣＡＧＴＴＡ　ＡＣＡＡＧＡＧ　３７２０、 配列の詳細：配列番号１９ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　３７　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＲＶＡ−５ｂと命名ＡＣＧＴＡＴＣＣＧＡ 　ＴＴＣＧＡＡＣＡＧＴ　ＴＴＣＣＣＡＧＣＴ＾　ＡＣＡＡＧＡＧ　３７２１、 配列の詳細：配列番号２０ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　３７　ｎｔ 鎖の数−一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＲＶＡ−６８と命名ＣＴＣＴＴＧＴＴＡＡ 　ＣＴＧＧＧＡＡＡＣＴ　ＧＴＴＣＧＡＡＴＣＧ　ＧＡＴＡＣＧＴ　３７２２、 配列の詳細：配列番号２１ 配列の型：ヌクレオチド配列 配列の長さ：　３７　ｎｔ 鎖の数ニー水銀 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴヌクレオチド、　ＲＶＡ−６ｂと命名ＣＴＣＴＴＧＴＴＡＧ 　ＣＴＧＧＧＡＡＡＣＴ　ＧＴＴＣＧＡＡＴＣＧ　ＧＡＴＡＣＧＴ　３７２３、 配列の詳細：配列番号２２ 配列の型：ヌクレオチド配列及び対応アミノ酸配列配列の長さ：　７６３９　ｂ ｐ 鎖の数二二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類ニブラスミドＤＮＡ、　ｐＪ０８８４と命名配列の特徴ニ ー　１８７７〜２１１０　：　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔ−ＤＮ＾遺伝子 ７から誘導されるポリアデニル化部位を含む３゛調節配列−２４８０〜３００５ 　：カリフラワーモザイクウイルスから誘導される３５Ｓプロモ一ター配列 −３００６〜３６６５　：クロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ遺 伝子のコーディング配列３６６６〜４４９１　：　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ ＋　Ｔ−ＤＮＡオクトビンシンターゼ遺伝子から誘導されるポリアデニル化部位 を含む３°調節配列 −５６８４〜６５４１　：β−ラクタマーゼ遺伝子のコーディング配列と相補的 な配列 −７１５５〜７６３９　：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔ−ＤＮＡから誘導さ れるＴＲＩｏ及びＴＩ？２’プロモーター 他の情報：Ｅ、ｃｏｌｉ中で複製可能なブラスミド：、＝ｕ’＝ＡＴＹ’：（’ ：Ｍ７「ＣＣｒｋＣＣＣｋＣＧ　ＡＧＧＡＧＣＡＴＣＧ　ＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡ 　ＡＧＡＣＧＴＴＣＣＡ　２８Q９ ２４、配列の詳細；配列番号２３ 配列の型：ヌクレオチド配列及び対応アミノ酸配列配列の長さ：　７５６６　ｂ ｐ 鎖の数二二本鎖 トポロジー二環状 配列の種類ニブラスミドＤＮＡ、　ｐＰｓＯ２１２と命名配列の特徴： ＝　１〜１７８５　：　ｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ６遺伝子とも称される末端切除修飾ｂ ｔ２　（ｃｒｙ　Ｉ　Ａｂ）遺伝子のコーディング領域−１７９３〜２０２６　 ：　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔ−ＤＮＡ遺伝子７から誘導されるポリアデ ニル化部位を含む３゛調節配列−２３９６〜２９２１　：カリフラワーモザイク ウイルスから誘導される３５Ｓプロモ一ター配列 −２９２２〜３５８１　：クロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ遺 伝子のコーディング配列−３５８２−４４０７：　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　Ｔ−ＤＮＡオクトピンシンターゼ遺伝子から誘導されるポリアデニル化部位を 含む３°調節配列 −５６００〜６４５７　：β−ラクタマーゼ遺伝子のコーディング配列と相補的 な配列 −７０７１〜７５６６：　（配列番号２２のｐＪＩ１８８４の配列に関し他の情 報：Ｅ、ｃｏｌｉ中で複製可能なプラスミドＧＣＴ　ＡＧＧ　ＡＡＣＣＡＡ　Ｇ ＣＣＡＴＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴｒＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＣＴＡ　ＡＧＣ２３４ Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｇｉｎλｌａ　工１ｅ　５ｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ５ｒ＝ＰＰｔ＝７−１ｒｓｙｒｃｙｙｈムｉｒ” Ｆｃ＞＝ｈＣａ＝　゛「門℃ｘＴｃｃＣ’ｒ　ｃＴＧｄλＧＴＧＡＡ　３２４５ ユ〒ｒ＝ｒ：ｒ−ｑｒｈ〒　ｗｙ：ｒｗｒ＝、ｙＭｒＣＡＡＣＧＡ　ＴＣＡＡＧ ＧＣＣ；λＧＴｒ’ＡＣＡＴＧＡＴＣ５９９５Ｆｉａｕｒｅ　！ ＰＴＲ 一 不９ンすへ４７＋リダンジシ２゛シク’ｆル　：ｉ　３．５１灯転写」１ｌ−１ １１，８ １社−厚Ｌλ Ｆｉａｕｒ＝　３ａ Ｆｉｚ＊ｒ：　３ｂ ｒｓａ　謹　本　鶴　台 、　Ｎ＋　ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０２５４７フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３゜Ｄ Ｅ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ 、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ、　 ＵＳ（７２）発明者　スタム、マイケ オランダ国、エヌ・エル−１１８３・アー・エル・アムステルベーン、オニイレ ンステプ・８８−５７６ （７２）発明者　ドックス、ヤン ベルキー国、ベー−９０００・ヘント、テントーンステリンスラーン・１０７ （７２）発明者　ファン・アールゼン、ロールベルキー国、ベー−９０００・ヘ ント、ツビョナールドゼステーンベク・３５

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．遺伝子、好ましくはＢｔＩＣＰ遺伝子、特にｃｒｙＩ遺伝子またはｃｒｙＩ ＩＩ遺伝子、とりわけｃｒｙＩＡｂ遺伝子を、これらの遺伝子を用いて形質転換 した植物細胞中で発現させるべく修飾する方法であって、 前記遺伝子のコーディング領域において、プロセッシング誘導配列エレメント、 即ち ｉ）前記植物細胞においてＲＮＡポリメラーゼＩＩ開始複合体の一部または全部 の組立てによって部位特異的転写開始を誘導し得る、センスまたはアンチセンス いずれかの向きのクリブティックプロモーター、例えば最小プロモーターであっ て、好ましくはＤＮＡ調節エレメント、例えばＣＣＡＡＴ配列またはＴＡＴＡ配 列を含むクリブティックプロモーター、またはｉｉ）ＲＮＡレベルで、ｍＲＮＡ 前駆体種をスプライシング経路へ進入させる不稔性イントロンをコードするＤＮ Ａであって、生じたｍＲＮＡ種が前記植物細胞の細胞質内に実質的に蓄積しない ように前記植物細胞によってプロセッシングされるＤＮＡ のうち少なくとも一方を失活化、好ましくは破壊または除去するステップを含む 方法。
2. ２．翻訳上中立の修飾を前記遺伝子のコーディング領域内に導入すること、好ま しくは、 ａ）植物細胞中で効率的にスプライシングされる、イントロンをコードするＤＮ Ａを前記コーディング領域内に導入すること、及び／または ｂ）前記コーディング領域内のアミノ酸配列を、同じアミノ酸をコードする他の コドンに変更することにより、前記プロセッシング誘導配列エレメントを失活化 する請求項１に記載の方法。
3. ３．前記遺伝子が、好ましくはＣ末端及びＮ末端の両方で切除された、末端切除 Ｂｔ殺虫性結晶タンパク質をコードし、前記遺伝子が約６０〜８０ｋＤａの前記 タンパク質の一部分、特に前記タンパク質の毒素を好ましくはコードする請求項 １または２に記載の方法。
4. ４．前記遺伝子を更に、ＡＴＧ翻訳開始コンテクストを配列【配列があります】 で変換することにより修飾する請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. ５．前記遺伝子が、ｃｒｙＩ遺伝子、例えばｂｔ２、ｂｔ８８４、ｃｒｙＩＡｂ ６、ｃｒｙＩＡｂ２２、ｂｔ１４、ｂｔ１５もしくはｂｔ１８遺伝子、好ましく はｂｔ２、ｂｔ８８４、ｃｒｙＩＡｂ２２もしくはｃｒｙＩＡｂ６遺伝子、また は実質的にこれらに相同の配列を有する遺伝子である請求項１から４のいずれか 一項に記載の方法。
6. ６．前記遺伝子がｂｔ２、ｂｔ８８４、ｃｒｙＩＡｂ２２またはｃｒｙＩＡｂ２ ２であり、クリブティックプロモーターを、好ましくは、ｂｔ８８４遺伝子の７ ４２位と８１３位との間の領域に対応する領域おける翻訳上中立の修飾により、 失活化する請求項５に記載の方法。
7. ７．前記遺伝子が、ｂｔ２、ｂｔ８８４、ｃｒｙＩＡｂ２２またはｃｒｙＩＡｂ ６遺伝子であり、前記不稔性イントロンを、好ましくは、５′不稔性スプライス 部位の一部または全てにおける翻訳上中立の修飾、特に配列【配列があります】 及び【配列があります】少なくとも１つにおける翻訳上中立の修飾により、失活 化する請求項５または６に記載の方法。
8. ８．請求項１から７のいずれか一項に記載の方法によって得られる修飾遺伝子、 好ましくは修飾ＢｔＩＣＰ遺伝子、特に修飾ｃｒｙＩ遺伝子、とりわけｃｒｙＩ Ａｂ１４遺伝子。
9. ９．前記コーディング領域の１０％未満、好ましくは３％未満のヌクレオチドが 修飾されており、特に、前記コーディング領域の１０％未満、好ましくは３％未 満のヌクレオチドが、ヌクレオチドＡ及びＴからヌクレオチドＧまたはＣに変更 されている請求項８に記載の修飾遺伝子。
10. １０．植物の細胞を形質転換するためのキメラ遺伝子であって、操作的に連結さ れたＤＮＡ、即ち、ａ）請求項８または９に記載の修飾遺伝子のコーディング領 域； ｂ）前記植物細胞の前記修飾遺伝子の発現を誘導し得るプロモーター；及び ｃ）前記植物細胞中での前記修飾遺伝子の発現に適した転写物３′末端形成及び ポリアデニル化シグナル、特にカルコンシンターゼ遺伝子の前記シグナル を同じ転写単位内に含むキメラ遺伝子。
11. １１．前記修飾遺伝子が修飾ＢｔＩＣＰ遺伝子であり、前記プロモーターが３５ Ｓプロモーター、ＴＲ１′プロモーターまたはＴＲ２′プロモーターであり、前 記転写物３′末端形成及びポリアデニル化シグナルがカルコンシンターゼ遺伝子 に由来する請求項１０に記載のキメラ遺伝子。
12. １２．前記修飾遺伝子が、２８のＮ末端コドンが欠失された請求項６または７に 記載の修飾ｂｔ２であり、前記プロモーターが３５Ｓプロモーター、ＴＲ１′プ ロモーターまたはＴＲ２′プロモーターであり、前記転写物３′末端形成及びポ リアデニル化シグナルがカルコンシンターゼ遺伝子に由来する請求項１０に記載 のキメラ遺伝子。
13. １３．請求項１０から１２のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を用いて形質転 換された植物細胞。
14. １４．実質的に請求項１３に記載の植物細胞からなる植物、植物組織または植物 細胞培養物。
15. １５．請求項１４に記載の植物の種子。
16. １６．請求項１０から１２のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を含む、植物の 核ゲノムを安定に形質転換するためのベクター、好ましくはＴｉプラスミド。
17. １７．請求項１４に記載の植物を害虫から保護する方法であって、前記修飾遺伝 子がＢｔＩＣＰ遺伝子である場合、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の キメラ遺伝子を用いて該植物のゲノムを形質転換するステップを含む方法。