ES2315360T3 - Proteinas insecticidas de bacillus thuringiensis. - Google Patents
Proteinas insecticidas de bacillus thuringiensis. Download PDFInfo
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Abstract
Una secuencia codificante de ácido nucleico que codifica una proteína insecticida Cry2Ae constituida por la secuencia de aminoácidos de la proteína de SEQ ID No. 2 desde la posición del aminoácido 1 a una posición de aminoácido situada entre las posiciones de los aminoácidos 624 y 632 de SEQ ID No. 2.
Description
Proteínas insecticidas de Bacillus
thuringiensis.
La presente invención se refiere a nuevas
secuencias de ácido nucleico, particularmente secuencias de DNA,
que codifican proteínas insecticidas producidas por cepas de
Bacillus thuringiensis. Particularmente, se proporcionan
nuevas secuencias de ácido nucleico, particularmente secuencias de
DNA que codifican proteínas designadas como Cry2Ae, que son útiles
para proteger las plantas contra el daño causado por los insectos.
Se incluyen también en esta memoria microorganismos y plantas
transformados con una secuencia de ácido nucleico, particularmente
una secuencia de DNA, que codifica al menos una de las proteínas
Cry2A recientemente aisladas.
Bacillus thuringiensis (abreviado en esta
memoria como "Bt") es bien conocido por su toxicidad específica
para plagas de insectos, y ha sido utilizado desde hace casi un
siglo para reprimir plagas de insectos en las plantas. En los
últimos años, se han producido plantas transgénicas que expresan
proteínas Bt que se ha encontrado reprimen con éxito el
deterioro causado por los insectos en las plantas (v.g., Vaeck et
al., 1987, Jansens et al., 1997).
A pesar del aislamiento de bastantes genes
insecticidas de Bt, la investigación de nuevos genes que
codifiquen proteínas insecticidas continúa. De hecho, se sabe que
las proteínas insecticidas Bt tienen una gama de insectos
diana relativamente estrecha comparadas con los insecticidas
químicos. Asimismo, la posesión de toxinas múltiples para la misma
especie de insecto diana permite el uso de proteínas que tengan
diferentes modos de acción de tal manera que pueda evitarse o
retardarse el desarrollo de resistencia por los insectos. Además,
las proteínas Bt insecticidas con secuencias de aminoácidos
diferentes tienen niveles diferentes de eficacia insecticida contra
insectos específicos, lo que hace deseable tener a disposición
varias proteínas insecticidas diferentes a fin de poder reprimir
las plagas de insectos relevantes de diferentes plantas de
cosecha.
Previamente, se identificaron varios tipos de
proteínas Cry2A (véase Crickmore et al., 1988).
La nueva proteína Cry2Ae de esta invención tiene
la identidad máxima de secuencia de aminoácidos con la proteína
Cry2Aa1 (Donovan et al., número de acceso a GenBank M31738),
pero difiere todavía en aproximadamente 9% de su secuencia de
aminoácidos. La identidad de secuencia más estrecha con la proteína
Cry2Af se encontró en la proteína Cry2Ab1 (Widner y Whiteley,
número de acceso a GenBank M23724), pero ambas proteínas difieren
todavía aproximadamente en un 5% de su secuencia de aminoácidos. La
identidad de secuencia más estrecha con la proteína Cry2Ag se
encontró en la proteína Cry2Ac1 (Wu et al., número de acceso
a GenBank X57252), pero ambas proteínas difieren todavía en
aproximadamente 20% de su secuencia de aminoácidos. Proteínas Cry2A
adicionales conocidas incluyen la proteína Cry2Ad1 (Choi et
al., 1999) y otras proteínas Cry2Aa, Cry2Ab, y Cry2Ac (Crickmore
et al., 1998). Proteínas afines a Cry2A y secuencias de DNA
que codifican las mismas se muestran también en la Patente U.S.
5.338.544, en la Solicitud de Patente PCT publicada WO 00/26371 y en
la solicitud de Patente PCT publicada WO 98/40490. La expresión de
proteínas de tipo Cry2A en plantas ha sido descrita, v.g., en Kota
et al. (1999) y en la Solicitud de Patente PCT publicada WO
00/26371.
Widner y Whiteley (1989, J. Bacteriol. 171,
965-974) describen los genes cryB1 y cryB2, que
codifican proteínas que se conocen ahora como Cry2Aa y Cry2Ab,
respectivamente (véase, Crickmore et al., 1998).
La Solicitud de Patente PCT publicada WO
01/19859 (que forma parte del estado de la técnica de acuerdo con
Art54(3)(4)EPC) describe un gen y una proteína Cry2Ae
en SEQ ID No. 1 y 2, respectivamente.
De acuerdo con esta invención, se proporciona
una secuencia de ácido nucleico, particularmente una secuencia de
DNA, que codifica una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos del fragmento tóxico más pequeño de la proteína
codificada por el gen cry2Ae depositado en la
BCCM-LMBP bajo el número de acceso LMBP 4248.
De acuerdo con esta invención, se prefiere
particularmente una secuencia de ácido nucleico, particularmente
una secuencia de DNA, que codifica una proteína que comprende la
secuencia de aminoácidos de un fragmento insecticida de la proteína
de SEQ ID No. 2.
Adicionalmente, de acuerdo con esta invención se
proporcionan secuencias de ácido nucleico, particularmente
secuencias de DNA, que codifican una proteína que comprende la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2 de la posición del
aminoácido 1 a la posición del aminoácido 632.
Adicionalmente, de acuerdo con esta invención se
proporcionan las secuencias de ácido nucleico anteriores,
particularmente secuencias de DNA, que comprenden una secuencia
artificial, que tiene un uso de codones diferente comparada con la
secuencia existente naturalmente, pero que codifica la misma
proteína o su fragmento insecticida, asemejándose preferiblemente
dicho uso de codones al de las plantas, particularmente la planta
hospedadora en la cual debe transformarse la secuencia de ácido
nucleico, particularmente el DNA.
Aún más, de acuerdo con esta invención se
proporciona una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos
del fragmento tóxico más pequeño de la proteína codificada por el
gen cry2Ae depositado en la BCCM-LMBP bajo
el número de acceso LMBP 4248.
Se prefiere particularmente en esta memoria una
proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de un fragmento
insecticida de la proteína de SEQ ID No. 2.
Se proporcionan también en esta memoria genes
quiméricos que comprenden el DNA como se define arriba bajo el
control de un promotor expresable en plantas, y células de plantas,
plantas o semillas transformadas que contienen dichos genes
quiméricos, en particular células de plantas, plantas o semillas
seleccionadas del grupo constituido por: maíz, algodón, arroz,
tabaco, colza oleaginosa, especies de Brassica, berenjena,
soja, patata, girasol, tomate, caña de azúcar, té, judías, tabaco,
fresa, trébol, pepino, sandía, pimiento, avena, cebada, trigo,
dalia, gladiolo, crisantemo, remolacha azucarera, sorgo, alfalfa,
manzana, pera, fresa, y cacahuete. De acuerdo con esta invención,
el gen quimérico puede estar integrado en el DNA nuclear, plasmídico
o mitocondrial de las células de las plantas, o puede contener
también un DNA codificante de un péptido de direccionamiento o de
tránsito eficaz para direccionamiento a la vacuola, el cloroplasto,
la mitocondria, el plástido, o para secreción.
Adicionalmente de acuerdo con esta invención se
proporcionan microorganismos transformados que contienen cualquiera
de las secuencias de DNA anteriores, particularmente las
seleccionadas del género Pseudomonas, Agrobacterium,
Escherichia, o Bacillus.
Se proporciona también en esta memoria un
proceso para reprimir insectos, que comprende expresar cualquiera
de las secuencias de ácido nucleico anteriores, particularmente
secuencias de DNA, en una célula hospedadora, en particular células
de plantas, y poner en contacto los insectos con dichas células
hospedadoras, y un proceso para hacer una planta resistente a los
insectos, que comprende transformar células de plantas con
cualquiera de las secuencias de DNA o genes quiméricos anteriores,
y regenerar plantas transformadas a partir de tales células que son
resistentes a los insectos.
Esta invención se refiere también a un método
para reprimir insectos lepidópteros, particularmente plagas de
insectos lepidópteros del algodón, el maíz o la soja, método que
comprende aplicar a un área o planta a proteger, una proteína
Cry2Ae como se define en esta memoria (es decir, por plantación de
una planta transformada con un gen cry2Ae de esta invención,
o por pulverización de una composición que contiene una proteína
Cry2Ae de esta invención). La invención se refiere también al uso de
la proteína Cry2Ae, contra plagas de insectos lepidópteros para
minimizar el deterioro de las plantas de soja.
Esta invención se refiere adicionalmente a un
método para reprimir plagas de insectos lepidópteros del arroz,
particularmente Lepidópteros perforadores del tallo del arroz,
saltones del arroz, noctuidas del arroz, larvas de esciara del
arroz, orugas-caja del arroz o dobladores de las
hojas del arroz, preferiblemente un insecto seleccionado del grupo
constituido por: Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga
incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia
patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, Scirpophaga
innotata, método que comprende aplicar a un área o planta a
proteger una proteína Cry2Ae como se define en esta memoria (es
decir, por plantación de una planta de arroz transformada con un gen
cry2Ae de esta invención, o pulverización de una composición
que contiene una proteína Cry2Ae de esta invención). La invención se
refiere también al uso de la proteína Cry2Ae, contra plagas de
insectos Lepidópteros del arroz para minimizar el deterioro de las
plantas de arroz.
De acuerdo con esta invención, una "secuencia
de ácido nucleico" hace referencia a una molécula de DNA o RNA
en forma monocatenaria o bicatenaria, preferiblemente un DNA o RNA,
particularmente un DNA, que codifica cualquiera de las proteínas
Cry2A de esta invención. Una "secuencia de ácido nucleico
aislada", como se utiliza en esta memoria, se refiere a una
secuencia de ácido nucleico que no existe ya en el ambiente natural
en el que fue aislada, v.g., la secuencia de ácido nucleico en otro
hospedador bacteriano o en el genoma nuclear de una planta.
De acuerdo con esta invención, los términos
"proteína" o "polipéptido" se utilizan intercambiablemente
para hacer referencia a una secuencia de aminoácidos, sin
referencia a funcionalidad, tamaño, estructuras tridimensionales u
origen alguno. Por consiguiente, un fragmento o porción de una
proteína Cry2A de la invención se designa todavía en esta memoria
como una "proteína".
De acuerdo con esta invención, se han aislado y
caracterizado secuencias de ácido nucleico, particularmente
secuencias de DNA, que codifican nuevas toxinas Bt Cry. El
nuevo gen fue designado cry2Ae y sus proteínas codificadas
Cry2Ae.
De acuerdo con esta invención, el término
"proteína Cry2Ae" hace referencia a cualquier proteína que
comprenda el fragmento más pequeño de la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID No. 2 que retiene actividad insecticida (al que se hace
referencia en lo sucesivo en esta memoria como "fragmento tóxico
más pequeño"), particularmente cualquier proteína que comprenda
la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido de la posición 1 al
aminoácido de la posición 625, en particular al aminoácido en la
posición 632 en SEQ ID No. 2. Esto incluye híbridos o proteínas
quiméricas que comprenden el fragmento de proteína tóxica más
pequeño, así como proteínas que contienen al menos uno de los tres
dominios de la proteína de SEQ ID No. 2. Se incluyen también en esta
definición variantes de la secuencia de aminoácidos en SEQ ID No.
2, tales como proteínas que tienen una identidad de secuencia de al
menos 92%, particularmente al menos 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% al
nivel de la secuencia de aminoácidos, como se determina utilizando
alineamientos apareados utilizando el programa GAP del paquete
Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EE.UU., versión 10.0;
utilícense los valores por defecto GCG comprendidos en el programa
GAP; para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, utilícese
la matriz de registro blosum62), preferiblemente proteínas que
tienen algunos, preferiblemente 5-10,
particularmente menos de 5, aminoácidos añadidos, reemplazados o
delecionados sin cambiar de modo significativo, preferiblemente sin
cambiar, la actividad insecticida de la proteína, v.g., la proteína
Cry2Ae de SEQ ID No. 4.
El término "DNA/proteína que comprende la
secuencia X", como se utiliza en esta memoria, hace referencia a
un DNA o una proteína que incluye o contiene al menos la secuencia
X, de tal modo que otras secuencias de nucleótidos o aminoácidos
pueden estar incluidas en el extremo 5' (o
N-terminal) y/o 3' (o C-terminal),
v.g. (la secuencia de nucleótidos de) una proteína marcadora
seleccionable como se describe en EP 0193259, (la secuencia de
nucleótidos de) un péptido de tránsito, y/o una secuencia conductora
5' o 3'.
El "fragmento tóxico más pequeño" de una
proteína Cry de la invención, como se utiliza en esta memoria, es
el fragmento o porción más pequeño(a) de una proteína Cry que
retiene actividad insecticida que puede obtenerse por digestión
enzimática, preferiblemente con tripsina o quimotripsina, de la
proteína Cry de longitud total, o el fragmento o porción más
pequeño(a) de una proteína Cry que retiene actividad
insecticida que puede obtenerse por realización de deleciones de
nucleótidos en el DNA que codifica una proteína Cry. Los extremos de
la secuencia de aminoácidos de los terminales N y C del fragmento
tóxico más pequeño se determinan convenientemente por determinación
de la secuencia de aminoácidos de los fragmentos anteriores por
métodos disponibles rutinariamente en la técnica. Para los
fragmentos de proteína Cry2A que retienen actividad insecticida de
esta invención, pueden construirse típicamente deleciones en el
terminal N mientras que en su extremo terminal C cabe poca
deleción. Para las proteínas Cry2Ae de la invención, se espera que
pueden construirse deleciones hasta la posición del aminoácido 825
en el término C (es decir, el aminoácido C-terminal
sería el aminoácido de la posición 625) conservándose la actividad
insecticida. Se espera que deleciones del terminal N hasta
aproximadamente la posición del aminoácido 50, preferiblemente
deleciones N-terminales hasta la posición del
aminoácido 50 (es decir, el aminoácido N-terminal
sería la posición 50 de las secuencias que se muestran en el Listado
de Secuencias) en la secuencia de aminoácidos de las tres proteínas
Cry2A de esta invención, retengan la mayor parte de su actividad
insecticida contra insectos
Lepidópteros.
Lepidópteros.
Como se utiliza en esta memoria, el término
"DNA de cry2Ae" hace referencia a cualquier secuencia de
DNA que codifique la proteína Cry2Ae, respectivamente, como se ha
definido arriba. Esto incluye secuencias de DNA existentes
naturalmente, artificiales o sintéticas que codifican las proteínas
de SEQ ID Nos. 2 o sus fragmentos o variantes insecticidas como se
han definido arriba. Se incluyen también en esta memoria secuencias
de DNA que codifican proteínas insecticidas que son suficientemente
similares a las regiones codificantes de las secuencias de DNA
genómico depositadas o las secuencias proporcionadas en el listado
de secuencias de tal manera que aquéllas pueden (es decir, tienen
la capacidad para) hibridarse a estas secuencias de DNA en
condiciones de hibridación estrictas. Condiciones de hibridación
estrictas, como se utilizan en esta memoria, hacen referencia
particularmente a las condiciones siguientes: inmovilización de las
secuencias de DNA genómico relevantes sobre un filtro, y
prehibridación de los filtros durante 1 a 2 horas en formamida al
60%, SSPE al 5%, 2 x reactivo de Denhardt y SDS al 0,1% a 42ºC o 1
a 2 horas en 6 x SSC, 2 x reactivo de Denhardt y SDS al
0-1% a 68ºC. La sonda desnaturalizada (dig- o
radio-)marcada se añade luego directamente al fluido de
prehibridación y se lleva a cabo una incubación durante 16 a 24
horas a la temperatura apropiada arriba mencionada. Después de la
incubación, los filtros se lavan luego durante 30 minutos a la
temperatura ambiente en 2x SSC, 0,1% SDS, seguido por 2 lavados de
30 minutos cada uno a 68ºC en 0,5 x SSC y 0,1% SDS. Se realiza una
autorradiografía por exposición de los filtros durante 24 a 48 horas
a película de rayos X (Kodak XAR-2 o equivalente) a
-70ºC con un filtro intensificador. Por supuesto, pueden utilizarse
condiciones y parámetros equivalentes en este proceso en tanto que
se retienen todavía las condiciones de hibridación estrictas
deseadas. Variantes preferidas del DNA de cry2Ae de esta
invención son un DNA que codifica las variantes de la proteína
insecticida Cry2Ae arriba descritas, o una secuencia de DNA que
codifica una proteína insecticida con al menos 92%, preferiblemente
al menos 93 a 97%, particularmente al menos 98% o al menos 99%, de
identidad de secuencia con la secuencia codificante de SEQ ID No.
1. Particularmente, tales secuencias de DNA se hibridan también en
condiciones de hibridación estrictas a la secuencia codificante
cry2Ae depositada en la BCCM-LMBP bajo el
número de acceso LMBP 4248, o a la secuencia codificante de SEQ ID
No. 1.
Las identidades de secuencia a que se ha hecho
referencia arriba se calcularon utilizando el programa GAP del
paquete Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EE.UU.) versión 10.0
(se utilizan los valores por defecto en GCG, para estas
comparaciones de secuencias de DNA, se emplea la matriz de registro
"nwsgapdna"), siendo las condiciones estrictas de hibridación
como se han definido arriba.
La "actividad insecticida" de una proteína,
tal como se utiliza en esta memoria, significa la capacidad de una
proteína para destruir insectos cuando dicha proteína se da como
alimento a los insectos, preferiblemente por expresión en un
hospedador recombinante tal como una planta. "Cantidades
represoras de insectos" de una proteína, como se utiliza en esta
memoria, hace referencia a una cantidad de la proteína que es
suficiente para limitar el deterioro en una planta por los insectos
que se alimentan de dicha planta a niveles comercialmente
aceptables, v.g. por destrucción de los insectos o por inhibición
del desarrollo, la fertilidad o el crecimiento de los insectos de
tal manera que aquéllos producen menos deterioro a una planta y el
rendimiento de la planta no se ve afectado desfavorablemente en un
grado significativo. De acuerdo con esta invención, los insectos
sensibles a las nuevas proteínas Cry de la invención se ponen en
contacto con esta proteína en cantidades represoras de insectos,
preferiblemente cantidades insecticidas. Insectos diana preferidos
para las proteínas de esta invención son plagas de insectos
económicamente dañinas de las plantas de maíz, algodón, arroz y
soja, particularmente en comarcas de América del Norte y del Sur.
Insectos diana particularmente preferidos para las proteínas Cry2A
de esta invención, en particular la proteína Cry2Ae, son insectos de
las especies Heliothis spp., Helicoverpa spp.,
Spodoptera spp., Sesamia spp., Anticarsia spp.,
Ostrinia spp., Chilo spp., Sesamia (sic) spp.,
Marasmia spp., Scirpophaga spp. y
Cnaphalocrocis spp., y muy preferiblemente Heliothis
virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Anticarsia
gemmatallis y Ostrinia nubilalis.
Los términos "proteína Cry2A", "proteína
Cry2A de esta invención", "proteína Cry", o "proteína Cry
de esta invención", como se utilizan en esta memoria, hacen
referencia a una cualquiera de las nuevas proteínas aisladas de
acuerdo con esta invención e identificadas y definidas en esta
memoria como proteína Cry2Ae. Una proteína Cry, como se utiliza en
esta memoria, puede ser una proteína con el tamaño de longitud
total, denominada también una protoxina, o pueden encontrarse en
una forma truncada con tal que se retenga la actividad insecticida,
o puede ser una combinación de diferentes proteínas en una proteína
híbrida o de fusión. Una "protoxina Cry" hace referencia a la
proteína cristalina de longitud total como es codificada por la
secuencia BtDNA existente naturalmente, una "toxina
Cry" hace referencia a un fragmento insecticida de la misma,
particularmente el fragmento tóxico más pequeño de la misma,
típicamente en el intervalo de pesos moleculares de aproximadamente
50-65 kD, en particular aproximadamente 60 kD, como
se determina por electroforesis en SDS-PAGE. Un
"gen cry", "gen cry2A", "DNA cry" o
"DNA cry2A", como se utiliza en esta memoria, es una
secuencia de DNA que codifica una proteína Cry de acuerdo con esta
invención, haciendo referencia a las secuencias de DNA Cry2Ae
definidas anteriormente.
La secuencia de ácido nucleico, particularmente
secuencia de DNA, que codifica las proteínas Cry de esta invención
puede aislarse de manera convencional a partir de las cepas
recombinantes de E. coli, depositadas de acuerdo con el
Tratado de Budapest el 6 de octubre de 2000 en el Vakgroep voor
Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie,
Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000
Gante, Bélgica (abreviado en lo sucesivo en esta memoria como
"BCCM-LMBP") bajo los números de acceso
siguientes: BCCM-LMBP 4248 para la cepa XL1Azul:
pUC1099E/cy2clon7, que codifica la proteína Cry2Ae. Las secuencias
de DNA que codifican las proteínas Cry de la invención pueden
aislarse de estas cepas depositadas utilizando técnicas de rutina, y
pueden insertarse en vectores de expresión para producir cantidades
elevadas de proteínas Cry. Las proteínas Cry pueden utilizarse para
preparar anticuerpos monoclonales específicos o policlonales de
manera convencional (Höfte et al., 1988).
Asimismo, pueden producirse sintéticamente
secuencias de DNA para uso en esta invención. De hecho, debido a la
degeneración del código genético, algunos codones de aminoácidos
pueden estar reemplazados por otros sin cambiar la secuencia de
aminoácidos de la proteína. Adicionalmente, algunos aminoácidos
pueden sustituirse por otros aminoácidos equivalentes sin cambiar
significativamente, preferiblemente sin cambio alguno, la actividad
insecticida de la proteína. Asimismo, cambios en la secuencia de
aminoácidos o composición en regiones de la molécula, diferentes de
los responsables para la fijación o formación de poros tienen menos
probabilidad de causar una diferencia en la actividad insecticida
de la proteína. Equivalentes de las secuencias de DNA de la
invención incluyen secuencias de DNA que se hibridan a la secuencia
de DNA de las proteínas Cry de SEQ ID No. 1 en condiciones de
hibridación estrictas y que codifican una proteína con las mismas
características insecticidas de la proteína de esta invención, o
secuencias de DNA que tienen un uso de codones diferente comparado
con los genes cry2A nativos de esta invención, pero que
codifican una proteína que tiene la misma actividad insecticida y
sustancialmente la misma, preferiblemente la misma, secuencia de
aminoácidos. Ejemplos de secuencias de DNA optimizadas en codones
para la proteína Cry2Ae de esta invención se encuentran en SEQ ID
Núms. 3 y 5. Estas secuencias de DNA se optimizaron por adaptación
del uso de codones al más preferido en los genes de las plantas,
particularmente a genes nativos para el género de plantas o especies
de interés (Bennetzen & Hall, 1982; Itakura et al.,
1977) utilizando tablas de uso de codones disponibles (SEQ ID No. 3
se adaptaba mejor a la expresión en el algodón, y SEQ ID No. 5 más
hacia el maíz), así como para eliminar tramos de nucleótidos AT o
GC mayores que 5 ó 6, preferiblemente mayores que 5 nucleótidos, así
como para insertar sitios de restricción adecuados.
Asimismo, el término N de una proteína Cry puede
modificarse para obtener un contexto de iniciación de la traducción
óptimo, añadiendo o delecionando con ello uno o más aminoácidos en
el extremo del terminal N de la proteína. En la mayoría de los
casos, se prefiere que las proteínas de la invención se expresen en
células de plantas comenzando con un dipéptido
Met-Asp o Met-Ala para iniciación
óptima de la traducción, lo que requiere la inserción en el DNA de
Cry2A de un codón que codifica un aminoácido Asp o Ala aguas
abajo del codón de comienzo como nuevo segundo codón.
Por supuesto, cualquier secuencia de DNA que
difiera en su uso de codones pero que codifique la misma proteína o
una proteína similar que tenga sustancialmente la misma actividad
insecticida, puede construirse, dependiendo del propósito
particular. Se ha descrito en sistemas de expresión procariotas y
eucariotas que un cambio en el uso de codones respecto al de la
célula hospedadora es deseado para la expresión de genes en
hospedadores extraños (Bennetzen & Hall, 1982: Itakura et
al., 1977). Adicionalmente, se sabe que los genes de las
proteínas cristalinas de Bt no tienen preferencia alguna
hacia codones eucariotas, y son muy ricos en AT (Adang et
al., 1985, Schnepf et al., 1985). Tablas de usos de
codones están disponibles en la bibliografía (Wada et al.,
1990; Murray et al., 1989) y en las bases de datos de
secuencias de DNA principales (v.g. EMBL en Heidelberg, Alemania).
De acuerdo con ello, pueden construirse secuencias sintéticas de DNA
de tal modo que se produzcan las mismas o sustancialmente las
mismas proteínas, siendo evidente que pueden producirse varias
secuencias de DNA una vez que se conoce la secuencia de aminoácidos
de las proteínas Cry de esta invención. Tales otras secuencias de
DNA incluyen secuencias de DNA sintéticas o semisintéticas que se
han cambiado de orden a fin de desactivar ciertos sitios en el gen,
v.g. por desactivación selectiva de ciertos elementos crípticos de
regulación o procesamiento presentes en la secuencia nativa como se
describe en las publicaciones PCT WO 91/16432 y WO 93/09218, o por
adaptación del uso global de codones al de un organismo hospedador
más afín, preferiblemente el del organismo hospedador en el que se
desea la expresión. En la literatura de patentes y científica
pueden encontrarse varias técnicas de modificación del uso de
codones al preferido por las células hospedadoras. El método exacto
de modificación del uso de codones no es crítico para esta invención
con tal que la mayoría o la totalidad de las secuencias reguladoras
crípticas o elementos de procesamiento hayan sido reemplazados por
otras secuencias. Ejemplos de secuencias de DNA optimizadas para
expresión en plantas se muestran en las SEQ ID Núms. 3 y 5
adjuntas.
Pequeñas modificaciones para una secuencia de
DNA tal como la arriba descrita pueden construirse rutinariamente,
es decir, por mutagénesis mediada por PCR (Ho et al., 1989,
White et al., 1989).
Modificaciones más profundas para una secuencia
de DNA pueden construirse rutinariamente por nueva síntesis de DNA
de una región codificante deseada utilizando técnicas
disponibles.
Con el término "sustancialmente la misma",
cuando se hace referencia a la secuencia de aminoácidos de una
proteína Cry, se entiende incluir una secuencia de aminoácidos que
difiere en no más de 5%, preferiblemente no más de 2%, de la
secuencia de aminoácidos de la proteína de comparación; y cuando se
hace referencia a la toxicidad de una proteína Cry, se entiende
incluir una proteína cuyo valor CL_{50} obtenido en las mismas
condiciones de bioensayo difiere no más de 10%, preferiblemente no
más de 5%, del valor CL_{50} obtenido para la proteína de
comparación.
El término "dominio" de una toxina Cry como
se utiliza en esta memoria significa una o más partes o dominios
cualesquiera de la toxina con una estructura específica que puede
transferirse a otra proteína (Cry) proporcionando una nueva
proteína híbrida con al menos una característica funcional (v.g.,
las características de fijación y/o toxicidad) de la proteína Cry
de la invención (Ge et al., 1991). Dichas partes pueden
formar una característica esencial de la proteína híbrida Bt con
las características de fijación y/o toxicidad de la proteína Cry de
esta invención. Una proteína híbrida de este tipo puede tener una
gama de hospedadores ampliada, una toxicidad mejorada y/o puede ser
utilizada en una estrategia para prevenir el desarrollo de
resistencia a los insectos (Publicación de Patente Europea
("EP") 408403; Visser et al., 1993).
Las secuencias de DNA cry de la invención,
preparadas a partir de DNA total, pueden ligarse a vectores de
expresión adecuados y transformarse en E. coli, y los clones
pueden escrutarse luego por métodos convencionales de inmunosondeo
de colonias (French et al., 1986) para la expresión de la
toxina con anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra
las proteínas Cry.
Asimismo, el DNA cry de la invención
puede ligarse en vectores lanzadera Bt adecuados (Lereclus
et al., 1992) y transformarse en un mutante Bt
cristal menos. Los clones pueden cribarse luego para producción de
cristales (detectados por microscopía) o proteínas cristalinas
(detectadas por SDS-PAGE), o pueden testarse
respecto a su actividad insecticida comparados con la cepa
cristal-menos de control.
Los genes que codifican las proteínas Cry de
esta invención pueden secuenciarse de manera convencional (Maxam y
Gilbert, 1980; Sanger, 1977) para obtener la secuencia de DNA.
Comparaciones de secuencias indicaron que los genes son diferentes
de los genes previamente descritos que codifican protoxinas y
toxinas con actividad contra Lepidópteros (véase, v.g. Höfte y
Whiteley, 1989; Crickmore et al., 1998; y la actualización de
fecha 16 de octubre de 2000 en el sitio Bt de nomenclatura
de Internet correspondiente a la publicación de Crickmore et
al. (1998), encontrada en
http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil
Crickmore/Bt/-index.html). Asimismo, las proteínas Cry2A de la
invención son nuevas con respecto a cualquiera de las secuencias de
proteínas cristalinas de Bacillus thuringiensis en la
actualización de 13 de diciembre de 2001 de este sitio de
nomenclatura Bt en Internet.
Una parte eficaz como insecticida de las
secuencias de DNA, que codifican una porción eficaz como insecticida
de las formas de protoxina de proteínas Cry recientemente
identificadas, puede construirse de una manera convencional después
del análisis de la secuencia del gen. En tales fragmentos, se
prefiere que al menos la secuencia homóloga al bloque 5 de
secuencias conservadas de proteínas cristalinas Bt (Hofte y
Whiteley, 1989; Schnepf et al., 1998) se incluya en dicha
proteína, preferiblemente hasta dos aminoácidos después de esta
región homóloga. Para las proteínas Cry2Ae, esta región homóloga
termina en la posición del aminoácido 625 en SEQ ID Núms. 2. La
secuencia de aminoácidos de las proteínas Cry puede determinarse a
partir de la secuencia de DNA de la secuencia de DNA aislada. Por
"una parte (o porción o fragmento) eficaz como insecticida" de
las secuencias de DNA que codifican la proteína Cry, a la que se
hace también referencia en esta memoria como "gen truncado" o
"DNA truncado", se entiende una secuencia de DNA que codifica
un polipéptido que tiene menos aminoácidos que la forma de
protoxina de la proteína Cry, pero que es insecticida.
Con objeto de expresar la totalidad o una parte
eficaz como insecticida de la secuencia de DNA que codifica una
proteína Cry de esta invención en E. coli, en otras cepas de
Bt y en plantas, pueden introducirse sitios de restricción
adecuados, flanqueando la secuencia de DNA. Esto puede hacerse por
mutagénesis orientada, utilizando procedimientos bien conocidos
(Stanssens et al., 1989; White et al., 1989). Con
objeto de obtener una expresión mejorada en plantas, puede
modificarse el uso de codones del gen cry o parte eficaz como
insecticida del gen cry de esta invención para formar un gen
o parte de gen equivalente, modificado o artificial de acuerdo con
las publicaciones PCT WO 91/16432 y WO 93/09218; EP 0 358 962 y EP 0
359 472, o pueden insertarse los genes o partes de genes Bt
en el genoma plastídico, mitocondrial o de los cloroplastos y
expresarse en el mismo utilizando un promotor adecuado (v.g.,
McBride et al., 1995; Patente U.S. 5693507). Para obtener
expresión mejorada en plantas monocotiledóneas tales como el maíz,
puede añadirse también al gen quimérico un intrón, preferiblemente
un intrón de monocotiledónea, y la secuencia de DNA del gen
cry o su parte insecticida puede cambiarse ulteriormente de
una manera neutra respecto a la traducción, para modificar
secuencias posiblemente inhibidoras del DNA presentes en la parte
del gen por medio de inserción orientada de intrones y/o por
introducción de cambios en el uso de codones, v.g., adaptando el uso
de codones al más preferido por las plantas, preferiblemente el
género de plantas específico relevante (Murray et al., 1989)
sin cambiar significativamente, preferiblemente sin cambiar en
absoluto, la secuencia de aminoácidos codificada.
De acuerdo con una realización de esta
invención, se prefiere que las proteínas estén direccionadas a
orgánulos intracelulares tales como plástidos, preferiblemente
cloroplastos, mitocondrias, o sean secretadas por la célula,
optimizando potencialmente la estabilidad y/o expresión de las
proteínas. Para este propósito, los genes quiméricos de la
invención comprenden una región codificante que codifica un péptido
de señal o diana, enlazado a la región codificante de la proteína
Cry de la invención. Péptidos particularmente preferidos que se
incluyen en las proteínas de esta invención son los péptidos de
tránsito para cloroplastos u otro direccionamiento plastídico,
especialmente las regiones peptídicas de tránsito duplicadas de
genes de plantas cuyo producto génico está direccionado a los
plástidos, el péptido de tránsito optimizado de Capellades et
al. (Patente U.S. 5.635.618), el péptido de tránsito de la
ferredoxin-NADP^{+} oxidorreductasa de la espinaca
(Oelmuller et al., 1993), el péptido de tránsito descrito en
Wong et al. (1992) y los péptidos de direccionamiento en la
solicitud de Patente PCT publicada WO 00/26371. Se prefieren también
péptidos de señalización de la secreción de una proteína enlazada a
dicho péptido fuera de la célula, tal como la señal de secreción del
inhibidor II de la proteinasa de patata (Keil et al., 1986),
la señal de secreción del gen 3 de alfa-amilasa del
arroz (Sutliff et al., 1991) y la señal de secreción de la
proteína PR1 del tabaco (Cornelissen et al., 1986).
Péptidos de señal particularmente útiles de
acuerdo con la invención incluyen el péptido de transición de los
cloroplastos (v.g., Van den Broeck et al., 1985), el péptido
de tránsito optimizado de los cloroplastos de la Patente US
5.510.471 y la Patente U.S. 5.635.618 que causan el transporte de la
proteína a los cloroplastos, un péptido señal secretorio o un
péptido de direccionamiento de la proteína a otros plásmidos,
mitocondrias, el ER, u otro orgánulo. Secuencias señal para
direccionamiento a orgánulos intracelulares o para secreción fuera
de la célula de la planta o a la pared de la célula se encuentran en
proteínas direccionadas naturalmente o secretadas, preferiblemente
las descritas por Klösgen et al. (1989), Klösgen y Weil
(1991), Neuhaus & Rogers (1998), Bih et al. (1999),
Morris et al. (1999), Hesse et al. (1989), Tavladoraki
et al. (1998), Terashima et al. (1999), Park et
al. (1997), Shcherban et al. (1995), particularmente las
secuencias de péptidos señal de proteínas direccionadas o
secretadas de maíz, algodón, arroz o soja.
Adicionalmente, las propiedades de fijación de
las proteínas Cry de la invención pueden evaluarse, utilizando
métodos conocidos en la técnica (v.g. Van Rie et al., 1990),
para determinar si las proteínas Cry de la invención se fijan a
sitios del intestino medio del insecto que no son reconocidos (o no
son objeto de competencia) por otras proteínas conocidas Cry o
proteínas Bt. Las toxinas Bt con sitios de fijación
diferentes para los cuales existe una fijación no competitiva en
insectos susceptibles relevantes son muy valiosas para reemplazar
toxinas Bt conocidas para las cuales pueden haber
desarrollado resistencia los insectos, o para uso en combinación
con toxinas Bt que tengan un modo de acción diferente para
evitar o retardar el desarrollo de resistencia por los insectos
contra toxinas Bt, en particular cuando se expresan en una
planta. Debido a las características de las toxinas Bt
nuevamente aisladas, las mismas son extremadamente útiles para
transformación de plantas, v.g. monocotiledóneas tales como maíz o
arroz y dicotiledóneas tales como algodón, soja y plantas de
especies Brassica, a fin de proteger estas plantas contra el
daño causado por los insectos. Se ha descrito que en Helicoverpa
zea, la proteína Cry2Aa no comparte sitios de fijación con la
proteína Cry1Ac (English et al., 1994). Análogamente, se
espera que las propiedades de fijación de las proteínas Cry2A de la
presente invención serán diferentes comparadas con las de las
toxinas Cry1 o Cry9 utilizadas actualmente en plantas transgénicas
en las plagas de insectos relevantes. Tales propiedades de fijación
diferentes pueden medirse por ensayos de fijación de rutina como se
ha descrito arriba. Especialmente, para propósitos de gestión de la
resistencia a los insectos para una plaga de insectos específica, se
prefiere combinar una proteína Cry2Ae de esta invención con otra
proteína de represión de insectos, particularmente una proteína
cristalina Bt, que no reconoce al menos un sitio de fijación
reconocido por dicha proteína Cry2Ae. Proteínas preferidas de
represión de insectos para combinar con la proteína Cry2Ae, en
particular para expresión simultánea en plantas, preferiblemente
plantas de algodón, incluyen la proteína Cry1F o híbridos derivados
de una proteína Cry1F (v.g., las proteínas híbridas
Cry1A-Cry1F descritas en las Patentes US 6.326.169;
6.282.016; 6.218.188, o fragmentos tóxicos de las mismas), las
proteínas de tipo Cry1A o fragmentos tóxicos de las mismas,
preferiblemente la proteína Cry1Ac o híbridos derivados de la
proteína Cry1Ac (v.g., la proteína híbrida
Cry1Ab-Cry1Ac descrita en la Patente U.S.
5.880.275), la proteína VIP3aAa o un fragmento tóxico de la misma
como se describe en Estruch et al., 1996 y la Patente U.S.
6.291.156, proteínas insecticidas de cepas de especies de
Xhenorhabdus, Serratia o Photorhabdus (v.g.,
Waterfield et al., 2001; French-Constant and
Bowen, 2000). En una realización, dicha
co-expresión se obtiene fácilmente por
transformación de una planta que expresa ya una proteína de
represión de insectos con una Cry2Ae de esta invención, o por
cruzamiento de plantas transformadas con la proteína de represión
de insectos y plantas transformadas con la proteína Cry2Ae de esta
invención. En el caso de plantas de algodón, se utiliza
preferiblemente la proteína Cry2Ae como primera proteína de
represión de insectos, y como segunda proteína de represión de
insectos se utilizan las proteínas Cry1Ac o VIP3Aa o derivados de
las mismas. Métodos para obtención de la expresión de proteínas
insecticidas Bt diferentes (o análogamente para otras
proteínas de represión de insectos) en la misma planta en un
esfuerzo para minimizar o prevenir el desarrollo de resistencia a
plantas transgénicas resistentes a los insectos (sic) se describen
en la Patente EP 0408403.
Las proteínas Cry2Ae de esta invención pueden
utilizarse también convenientemente para la represión de insectos
en el caso de que se desarrolle resistencia de los insectos contra
las proteínas de represión de insectos, tales como las proteínas
Cry1 Bt, que están actualmente ya comercializadas en plantas
transgénicas.
Preferiblemente, para propósitos de selección,
pero también para aumentar las opciones de represión de las
malezas, las plantas transgénicas de la invención se transforman
también con un DNA que codifica una proteína que confiere
resistencia a un herbicida de amplio espectro, v.g., herbicidas
basados en glufosinato o glifosato.
La parte del gen cry eficaz como
insecticida o su equivalente, preferiblemente el gen quimérico
cry, que codifica una porción eficaz como insecticida de la
protoxina Cry, puede insertarse establemente de manera convencional
en el genoma nuclear de una célula simple de la planta, y la célula
de la planta así transformada puede utilizarse de manera
convencional para producir una planta transformada que es resistente
a los insectos. A este respecto, puede utilizarse un plásmido Ti
desactivado, que contiene la parte del gen cry eficaz como
insecticida, en Agrobacterium tumefaciens para transformar la
célula de la planta, y después de ello, puede regenerarse una
planta transformada a partir de la célula de la planta transformada
utilizando los procedimientos descritos, por ejemplo, en EP 0 116
718, EP 0 270 822, publicación PCT WO 84/02913 y la Solicitud de
Patente Europea Publicada ("EP") 0 242 246 y en Gould et
al. (1991). Los vectores de plásmido Ti preferidos contienen
cada uno la parte del gen cry eficaz como insecticida entre
las secuencias de borde, o localizada al menos a la izquierda de la
secuencia del borde derecho, del T-DNA del plásmido
Ti. Por supuesto, pueden utilizarse otros tipos de vectores para
transformar la célula de la planta, utilizando procedimientos tales
como transferencia directa de genes (como se describe, por ejemplo,
en EP 0 233 247), transformación mediada por polen (como se
describe, por ejemplo, en EP 0 270 358, publicación PCT WO 85/01856,
y Patente U.S. 4.684.611), transformación mediada por virus de RNA
de plantas (como se describe, por ejemplo, en EP 0067553 y la
Patente U.S. 4.407.956), transformación mediada por liposomas (como
se describe, por ejemplo, en la Patente U.S. 4.536.475), y otros
métodos tales como los métodos recientemente descritos para
transformar ciertas líneas de maíz (v.g., patente U.S. 6.140.663;
Fromm et al., 1990; Gordon-Kamm et
al., 1990) y arroz (Shimamoto et al., 1989; Datta et
al., 1990) y el método para transformación de monocotiledóneas
generalmente (publicación PCT WO 92/09696). Para la transformación
del algodón, se prefiere especialmente el método descrito en la
Publicación de Patente PCT WO 00/71733. Para la transformación de
la soja, se hace referencia a métodos conocidos en la técnica, v.g.,
Hinchee et al. (1988) y Christou et al. (1990) o el
método de WO 00/42207.
Asimismo, además de la transformación del genoma
nuclear, se incluye también en la invención la transformación del
genoma plastídico, preferiblemente genoma de cloroplastos. Kota
et al. (1999) han descrito un método para
sobre-expresar una proteína Cry2Aa en cloroplastos
de tabaco.
La planta transformada resultante puede
utilizarse en un esquema de reproducción convencional de plantas
para producir más plantas transformadas con las mismas
características o para introducir la parte del gen cry
eficaz como insecticida en otras variedades de la misma especie o
especies de plantas afines. Las semillas, que se obtienen de las
plantas transformadas, contienen la parte del gen cry eficaz
como insecticida como una inserción genómica estable. Pueden
cultivarse de manera convencional células de la planta transformada
para producir la porción eficaz como insecticida de la protoxina
Cry, preferiblemente la toxina Cry, que puede recuperarse para uso
en composiciones insecticidas convencionales contra Lepidópteros
(Patente U.S. 5.254.799).
La parte del gen cry eficaz como
insecticida, preferiblemente el gen cry truncado, se inserta en un
genoma de célula vegetal de tal manera que el gen insertado se
encuentra aguas abajo (es decir, 3') de, y bajo el control de, un
promotor que puede dirigir la expresión de la parte del gen en la
célula vegetal. Esto se realiza preferiblemente por inserción del
gen quimérico cry en el genoma de la célula vegetal,
particularmente en el genoma nuclear o plastídico (v.g., del
cloroplasto). Promotores preferidos incluyen: los promotores
constitutivos fuertes 35S (los "promotores 35S") del virus del
mosaico de la coliflor (CaMV) de aislados CM1841 (Gardner et
al., 1981), CabbB-S (Franck et al., 1980)
y CabbB-JI (Hull y Howell, 1987); el promotor 35S
descrito por Odell et al. (1985), promotores de la familia
de la ubiquitina (v.g., el promotor ubiquitina del maíz de
Christensen et al., 1992, véase también Cornejo et
al., 1993), el promotor gos2 (de Pater et al., 1992), el
promotor emu (Last et al., 1990), promotores actina de
Arabidopsis tales como el promotor descrito por An et al.
(1996), promotores actina del arroz tales como el promotor descrito
por Zhang et al. (1991); promotores del virus del mosaico de
los nervios de la mandioca (WO 97/48819, Verdaguer et al.
(1998)), la serie de promotores pPLEX de promotores del virus
subterráneo de la atrofia del trébol (WO 96/06932, particularmente
el promotor S7), un promotor de
alcohol-deshidrogenasa, v.g., pAdh1S (números de
acceso a GenBank X04049, X00581), y el promotor TR1' y el promotor
TR2' (el "promotor TR1'" y "promotor TR2'",
respectivamente) que dirigen la expresión de los genes 1' y 2',
respectivamente, del T-DNA (Velten et al.,
1984). Alternativamente, puede utilizarse un promotor que no es
constitutivo pero que en lugar de ello es específico para uno o más
tejidos u órganos de la planta (v.g., hojas y/o raíces) por lo cual
la parte del gen cry insertada se expresa únicamente en células del
o de los tejidos u órganos específicos. Por ejemplo, la parte del
gen cry eficaz como insecticida podría expresarse selectivamente en
las hojas de una planta (v.g., maíz, algodón) poniendo la parte del
gen eficaz como insecticida bajo el control de un promotor
fotoinducible tal como el promotor del gen de la subunidad pequeña
de
ribulosa-1,5-bisfosfato-carboxilasa
de la planta propiamente dicha o de otra planta tal como el
guisante como se describe en la Patente U.S. 5.254.799. Otra
alternativa consiste en utilizar un promotor cuya expresión es
inducible, preferiblemente por lesión tal como utilización como
comida por los insectos, v.g., el promotor MPI descrito por Cordera
et al. (1994), o por factores químicos.
La parte del gen cry eficaz como insecticida se
inserta en el genoma de la planta de tal manera que la parte
insertada del gen está situada aguas arriba (es decir, 5') respecto
a señales de regulación de la transcripción adecuadas en el extremo
3' (es decir, señales de formación del transcrito y
poliadenilación). Esto se realiza preferiblemente por inserción del
gen quimérico cry en el genoma de la célula de la planta.
Señales de poliadenilación y formación del transcrito preferidas
incluyen las del gen de la nopalina-sintasa
(Depicker et al., 1982), el gen de la
octopina-sintasa (Gielen et al., 1984) y el
gen 7 de T-DNA (Velten y Schell, 1985), que actúan
como secuencias de DNA no traducidas en 3' en células de plantas
transformadas.
La parte del gen cry eficaz como
insecticida puede insertarse opcionalmente en el genoma de la planta
como un gen híbrido (Patente U.S. 5.254.789; Vaeck et al.,
1987) bajo el control del mismo promotor como un gen marcador
seleccionable o registrable, tal como el gen neo (EP 0 242
236) que codifica resistencia a la kanamicina, de tal modo que la
planta expresa una proteína de fusión que es fácilmente
detectable.
La transformación de células de plantas puede
utilizarse también para producir las proteínas de la invención en
grandes cantidades en cultivos de células vegetales, v.g., para
producir una proteína Cry2A que puede aplicarse luego a las
cosechas después de una formulación apropiada. Cuando se hace
referencia en esta memoria a una célula de planta transgénica, esto
se refiere a una célula vegetal (o incluso un protoplasto de la
planta) como tal en forma aislada o en cultivo de tejidos, o a una
célula vegetal (o protoplasto) contenida(o) en una planta o
en un órgano o tejido diferenciado, y ambas posibilidades se
incluyen específicamente en esta memoria. Por consiguiente, una
referencia a una célula vegetal en la descripción o las
reivindicaciones no debe entenderse que se refiere únicamente a
células aisladas en cultivo, sino que se refiere a cualquier célula
vegetal, dondequiera que pueda estar localizada o en cualquier tipo
de tejido u órgano de la planta que pueda estar presente.
La totalidad o una parte del gen cry, que
codifica una proteína anti-lepidópteros, puede
utilizarse también para transformar otras bacterias, tales como una
B. thuringiensis que tiene actividad insecticida contra
Lepidópteros o Coleópteros. De este modo, puede producirse una cepa
Bt transformada que es útil para combatir un amplio espectro
de plagas de insectos lepidópteros y coleópteros o para combatir
plagas de insectos Lepidópteros adicionales. La transformación de
bacterias, tales como bacterias de los géneros Pseudomonas,
Agrobacterium, Bacillus o Escherichia, con la totalidad
o parte del gen cry de esta invención, incorporado en un
vehículo de clonación adecuado, puede llevarse a cabo de manera
convencional, utilizando preferiblemente técnicas convencionales de
electroporación como se describen en Mahillon et al. (1989) y
en la Publicación de Patente PCT WO 90/06999).
Cepas de especies de Bacillus transformadas que
contienen el gen cry de esta invención pueden fermentarse por
métodos convencionales (Dulmage, 1981; Bernhard y Utz, 1993) para
proporcionar rendimientos de células elevados. En condiciones
apropiadas que son bien conocidas (Dulmage, 1981), todas estas cepas
sufren esporulación para producir proteínas cristalinas que
contienen la protoxina Cry con rendimientos elevados.
Una composición insecticida, particularmente
anti-lepidópteros, de esta invención puede
formularse de manera convencional utilizando los microorganismos
transformados con el gen cry, o preferiblemente sus proteínas
Cry respectivas o la protoxina Cry, toxina o porción de protoxina
eficaz como insecticida como ingrediente activo, junto con
vehículos, diluyentes, emulsionantes y/o dispersantes adecuados
(v.g., como se describe por Bernhard y Utz, 1993). Esta composición
insecticida puede formularse como un polvo humectable, pélets,
gránulos o polvo fino o como una formulación líquida con disolventes
acuosos o no acuosos, tal como una espuma, gel, suspensión,
concentrado, etc.
Un método para la represión de insectos,
particularmente Lepidópteros, de acuerdo con esta invención puede
comprender aplicar (v.g., por pulverización), a un locus (área) a
proteger, una cantidad insecticida de las proteínas Cry o células
hospedadoras transformadas con el gen cry de esta invención.
El locus a proteger puede incluir, por ejemplo, el hábitat de las
plagas de insectos o la vegetación en crecimiento o un área en la
cual debe cultivarse vegetación.
Esta invención se refiere adicionalmente a un
método para reprimir plagas de insectos lepidópteros de la soja,
particularmente Lepidópteros perforadores de los tallos del arroz,
saltones del arroz, noctuidas del arroz, larvas de esciara del
arroz, orugas-caja del arroz o dobladores de las
hojas del arroz, preferiblemente un insecto seleccionado del grupo
constituido por: Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga
incertulas, Sesamia inferens, Cnaphatocrocis medinalis, Marasmia
patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, Scirpophaga
innotata, método que comprende aplicar a un área o planta a
proteger, una proteína Cry2Ae como se define en esta memoria (a
saber, por plantación de una planta de arroz transformada con un gen
cry2Ae de esta invención, o pulverización de una composición
que contiene una proteína Cry2Ae de esta invención). La invención se
refiere también al uso de la proteína Cry2Ae contra plagas de
insectos Lepidópteros del arroz a fin de minimizar el daño causado
a las plantas de arroz.
Esta invención se refiere adicionalmente a un
método para reprimir plagas de insectos lepidópteros del algodón,
método que comprende aplicar a un área o planta a proteger, una
proteína Cry2Ae como se define en esta memoria (a saber, por
plantación de una planta de arroz transformada con un gen cry2Ae de
esta invención, o por pulverización de una composición que contiene
una proteína Cry2Ae de esta invención). La invención se refiere
también al uso de la proteína Cry2Ae, contra plagas de insectos
Lepidópteros del arroz a fin de minimizar el daño causado a las
plantas de arroz.
Esta invención se refiere también a un método
para reprimir plagas de insectos Lepidópteros del arroz,
particularmente Lepidópteros perforadores de los tallos del arroz,
saltones del arroz, noctuidas del arroz, larvas de esciara del
arroz, orugas-caja del arroz o dobladores de las
hojas del arroz, preferiblemente un insecto seleccionado del grupo
constituido por: Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga
incertulas, Sesamia inferens, Cnaphatocrocis medinalis, Marasmia
patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, Scirpophaga
innotata, método que comprende aplicar a un área o a la planta
a proteger, una proteína Cry2Ae como se define en esta memoria (es
decir, por plantación de una planta de arroz transformada con un gen
cry2Ae de esta invención, o por pulverización de una
composición que contiene una proteína Cry2Ae de esta invención). La
invención se refiere también al uso de la proteína Cry2Ae, contra
plagas de insectos Lepidópteros del arroz a fin de minimizar el
daño causado a las plantas de
arroz.
arroz.
Para obtener la protoxina o toxina Cry, células
de los hospedadores recombinantes que expresan la proteína Cry
pueden cultivarse de manera convencional en un medio de cultivo
adecuado y lisarse luego utilizando medios convencionales tales
como degradación enzimática o detergentes o análogos. La protoxina
puede separarse luego y purificarse por técnicas estándar tales
como cromatografía, extracción, electroforesis, o análogas. La
toxina puede obtenerse luego por digestión de la protoxina con
tripsina.
Estas y otras realizaciones de esta invención se
reflejan en la redacción de las reivindicaciones, que forman parte
de la descripción de la invención.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención y
no se proporcionan para limitar la invención o la protección
solicitada. El listado de secuencias a que se hace referencia en los
ejemplos, las reivindicaciones y la descripción es como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID No. 1 - Secuencias de aminoácidos y DNA
de la proteína Cry2Ae y DNA
SEQ ID No. 2 - Secuencia de aminoácidos de la
proteína Cry2Ae
SEQ ID No. 3 - Secuencia artificial de DNA de
cry2Ae para expresión en el algodón.
SEQ ID No. 4 - Secuencia de aminoácidos de la
proteína Cry2Ae codificada por el DNA de SEQ ID No. 3.
SEQ ID No. 5 - Secuencia artificial de DNA de
Cry2Ae para expresión en el maíz.
A no ser que se indique otra cosa en los
Ejemplos, todos los procedimientos para producción y manipulación
de DNA recombinante se llevan a cabo por los procedimientos estándar
descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning - A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
NY (1989) y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994)
Current Protocols in Molecular Biology. Current Protocols, EE.UU.
Materiales y métodos estándar para trabajos de biología molecular
de plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993)
por R.R.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific
Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications (UK).
Procedimientos para tecnología PCR pueden encontrarse en "PCR
protocols: a guide to methods and applications". Recopilado por
M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky y T.J. White (Academic
Press. Inc.,
1990).
1990).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las cepas BTS02761A y BTS01099E se aislaron de
polvo fino de cereales recogido en las Filipinas (South Tagalog) y
Bélgica (Deerlijk), respectivamente.
Cada cepa puede cultivarse en medios estándar
convencionales, preferiblemente medio T_{3} (triptona 3 g/l,
triptosa 2 g/l, extracto de levadura 1,5 g/l, MnCl_{2} 5 mg,
Na_{2}HPO_{4} 0,05M, NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O 0,05M, pH
6,8 y agar al 1,5%), preferiblemente a 28ºC. Para almacenamiento de
larga duración, se prefiere mezclar un volumen igual de una
suspensión esporas-cristales con un volumen igual de
glicerol al 50% y almacenar la mezcla a -70ºC, o liofilizar una
suspensión esporas-cristales. Para la esporulación,
se prefiere crecimiento en medio T_{3} durante 72 horas a 28ºC,
seguido por almacenamiento a 4ºC. Las proteínas cristalinas
producidas por las cepas durante la esporulación se empaquetan en
cristales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se realizaron ensayos de toxicidad sobre larvas
neonatas de Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera,
Heliothis virescens, Ostrinia nubilalis, Spodoptera
frugiperda, y Sesamia nonagrioides alimentadas con una
dieta artificial estratificada con extracto alcalino sin diluir (pH
12) de mezclas esporas-cristales de BTS01099E o
BTS02761A.
La dieta artificial (Vanderzant, 1962) se
dispensó en los pocillos de placas Costar de 48 pocillos, a razón
de 25 microlitros del extracto en la superficie de la dieta y se
secó en una corriente de aire laminar. Se puso una larva en cada
pocillo y se utilizaron 18 larvas por muestra. Se contaron las
larvas muertas y vivas el día séptimo. Los porcentajes de larvas
muertas se muestran en la Tabla I a continuación.
Mezclas de esporas/cristales de cada una de las
cepas BTS02761A y BTS01099E se testaron en bioensayos y dieron los
resultados siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Utilizando iniciadores apropiados, se
amplificaron una porción de los genes cry2A de las cepas
BTS02761A y BTS01099E; subsiguientemente, estos productos de
amplificación se digirieron con enzimas de restricción. El patrón
obtenido se comparó luego con el patrón que se obtiene cuando tales
digestiones se realizan sobre productos de amplificación derivados
de cepas que contienen genes cry2A conocidos. Basándose en el
patrón de digestión por restricción, los genes cry2A de las
cepas BTS02761A y BTS01099E parecían ser nuevos. Por esta razón, se
secuenció el producto de amplificación. Esto confirmó que los
fragmentos amplificados se derivaban de nuevos genes cry2A:
la cepa BTS02761A contenía un nuevo gen cry2A, mientras que
la cepa BTS1099E contenía dos genes nuevos semejantes a cry2A.
El DNA total de las cepas BTS02761A y BTS01099E
se trató con Sau3A, se fraccionó por tamaños y se ligaron
fragmentos de 7 a 10 kb a pUC19I (un derivado de pUC19), se cortaron
con BamHI y se trataron con TsAP (fosfatasa alcalina termoestable).
Esta mezcla de ligación se sometió a electroporación en E.
coli XL1 Azul.
\newpage
La hibridación de colonias, utilizando los
fragmentos PCR marcados con DIG como sondas, identificó clones
positivos. Las cepas de E. coli recombinantes se depositaron
en fecha 6 de octubre de 2000 en el Vakgroep voor Moleculaire
Biologie-Plasmidencollectie, Universiteit Gent, K.L.
Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante, Bélgica
(abreviado en lo sucesivo como "BCCM-LMBP")
bajo los números de acceso siguientes: BCCM-LMBP
4247 para la cepa XL1 Azul:pUC1099E/cry2clone1, que codifica una
proteína designada Cry2Af; BCCM-LMBP 4248 para la
cepa XL1 Azul:pUC1099E/cry2clone7, que codifica una proteína
designada Cry2Ae; y BCCM-LMBP 4249 para la cepa
XL1Azul:pUC2761A/cry2clone141, que codifica una proteína designada
Cry2Ag. Los genes pueden aislarse de estos clones depositados por
una digestión con NotI-FSeI. La inserción de estos
clones se subclonó en el vector lanzadera pSL40I. El plásmido
resultante se transformó primeramente en E. coli GM2163. Una
preparación de plásmido de esta cepa se sometió luego a
electroporación en una cepa cristal-menos de la cepa
de B. thuringiensis variedad Berliner 1715.
Un extracto alcalino preparado a partir de una
mezcla esporas/cristales de las cepas Bt recombinantes se utilizó
luego en bioensayos para evaluar la toxicidad de las nuevas
proteínas Cry2A. Este extracto se testó en el ensayo que se ha
descrito arriba en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la
Tabla II:
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Asimismo, el clon recombinante que expresa la
proteína Cry2Af muestra una mortalidad significativa cuando se
testa sobre insectos Lepidópteros seleccionados.
Se realizó también un análisis para determinar
los valores CL50 y CL90 para la proteína Cry2Ae producida
recombinantemente, en comparación con las proteínas conocidas
Cry2Aa y Cry2Ab. Para este ensayo, se dispensó una dieta artificial
específica para insectos en pocillos de placas Costar de 24
pocillos. 50 microlitros de extracto alcalino (pH 12) de mezclas
esporas-cristales de la cepa recombinante de Bt que
contenía el gen cry2Ae originario de XL1 azul: pUC1099E clon 7; Se
aplicaron sobre la superficie de la dieta y se secaron en una
corriente de aire laminar. La dieta para S. frugiperda y
O. nubilalis contenía: agua 1000 ml; agar: 20 g; harina de
maíz: 112 g; germen de trigo: 28 g; levadura: 30 g; ácido
ascórbico: 4,8 g; ácido benzoico: 1,2 g; nipagina: 1 g;
aureomicina: 0,06 g; nistatina: 0,03 g. La dieta para H.
virescens y H. zea contenía: 1000 ml de agua; agar: 20
g; harina de soja: 81 g; germen de trigo: 36 g; sacarosa: 14,7 g;
aceite de maíz: 5 ml; mezcla de sales Wesson: 10 g; mezcla de
vitaminas Vanderzant: 9,5 g; ácido sórbico: 1,1 g; nipagina: 1 g;
aureomicina: 0,34 g; nistatina: 0,06 g. Se testaron concentraciones
diferentes de proteínas a fin de que pudiera determinarse un valor
CL50. Para los tests sobre H. zea, H. virescens y
S. frugiperda, se puso una larva en cada pocillo y se
utilizaron 20 larvas por muestra. Para los tests sobre O.
nubilalis, se pusieron dos larvas en cada pocillo y se
utilizaron 24 larvas por muestra. Se contaron las larvas muertas y
vivas el día séptimo (el día sexto en el caso de S.
frugiperda, y el día quinto en el caso de O. nubilalis).
Los valores CL50 y CL90 se calcularon con análisis probit (Programa
POLO, software LeOra, 1987, POLO-PC. A user's guide
to probit or logic analysis. Berkeley, California). Los resultados
se muestran a continuación en la Tabla III.
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Utilizando la misma disposición experimental que
en el caso anterior para Ostrinia nubilalis, pero empleando
proteína Cry2Ae purificada contra la oruga de la judía
aterciopelada, Anticarsia gemmatalis (testando 20 pocillos
con una larva por concentración) se encontró una actividad alta de
esta proteína contra esta plaga importante de insecto de la soja.
Se encontró que el valor CL_{50} para la proteína Cry2Ae
purificada para este insecto era 0,44 ng/cm^{2} (para el nivel de
confianza 95%; este valor CL_{50} es el valor medio de dos
ensayos de bio-lotes diferentes de proteína
purificada), se encontró que el valor CL_{90} era 7,79
mg/cm^{2} (al nivel de confianza del 95%; este valor CL_{90} es
el valor medio de dos bio-ensayos de lotes
diferentes de proteína purificada). Utilizando la misma disposición
experimental que anteriormente para Ostrinia con la proteína
Cry2Ae purificada, se confirmó la significativa toxicidad de esta
proteína para Helicoverpa zea y Ostrinia nubilalis
(se encontró que los valores CL_{50} para estos insectos eran
145,1 y 48,31 ng/cm^{2}, respectivamente (para el nivel de
confianza 95%, estos valores CL_{50} son los valores medios de 2
bioensayos de lotes diferentes de proteína purificada para cada
insecto respectivo)).
Estos resultados demuestran que las nuevas
proteínas Cry de la invención, y particularmente la proteína Cry2Ae,
son proteínas útiles con actividad elevada frente a plagas
relevantes de insectos Lepidópteros, particularmente frente a
Heliothis zea, Ostrinia nubilalis, Anticarsia gemmatalis, y
Helicoverpa zea, que son larvas de insectos comercialmente
dañinas para plantas tales como soja, algodón y maíz.
Las secuencias determinadas para los genes
cry2A aislados de la invención, y la secuencia de aminoácidos
determinada, se muestran en el Listado de Secuencias adjunto. Las
alineaciones por parejas utilizando el programa GAP en el paquete
Wisconsin de GCG indicaron los niveles de identidad de secuencia con
otras secuencias Cry2A (para las secuencias de las proteínas Cry2A
y DNAs conocidas, véase Crickmore et al. (1998) y el sitio de
la red de Internet citado anteriormente), como se muestra en las
Tablas IVA y IVB (los valores por defecto en GCG se utilizaron en
el programa GAP; para las comparaciones de secuencia de aminoácidos,
se utilizó la matriz de registro Blosum62, y para las comparaciones
de secuencias de DNA, se utilizó la matriz de registro
nwsgapdna).
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Ejemplo
4
Se producen genes quiméricos, cada uno de los
cuales codifica las proteínas Cry2Ae, Cry2Af y Cry2Ag utilizando
procedimientos bien conocidos, empleando promotores tales como los
promotores CaMV 35S (Hull y Howell, 1987) y ubiquitina (Christensen
et al., 1992). Preferiblemente, el uso de codones del marco
de lectura abierto se adapta al de la planta hospedadora a fin de
optimizar la eficiencia de expresión, como se describe en la
Solicitud de Patente PCT publicada WO 94/12264. Asimismo, en
algunos genes quiméricos se incluyen secuencias de DNA que
codifican un péptido de tránsito (como se describe en la
descripción) para direccionar la proteína Cry2A de la invención a
los cloroplastos de las plantas.
Para la transformación de maíz y algodón con un
gen quimérico que codifica la proteína Cry2Ae, se insertaron varios
constructos quiméricos de genes en plásmidos de cepas de
Agrobacterium. Estos constructos incluían: los constructos
pACS9 y pacts11 en donde la secuencia codificante de Cry2Ae
de SEQ ID No. 3 estaba enlazada funcionalmente al promotor 35S2 del
Virus del Mosaico de la Coliflor (Odell et al., 1985), una
secuencia conductora del gen de la proteína de fijación de
clorofila a/b de Petunia (Harpster et al., 1988), y una
región de terminación del transcrito 3' y poliadenilación del gen
35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (Sanfacon et al.,
1991), y constructos pACS12 y pACS13 con las mismas regiones
reguladoras y la misma región codificante de Cry2Ae, excepto
que se insertó también una secuencia de DNA que codificaba el
péptido de tránsito TpssuAt que permitía el direccionamiento a los
cloroplastos (Krebbers et al., 1988) en el extremo 5' de la
región codificante de Cry2Ae, de tal modo que se produce una
proteína de fusión con el péptido de tránsito. Estos constructos
incluían también una secuencia de DNA que codificaba una proteína de
resistencia al herbicida glifosato (descrita en la Solicitud de
Patente PCT publicada WO 97/04103, enlazada a un péptido de tránsito
optimizado (Patente U.S. 5.635.618)) o una secuencia de DNA que
codificaba una proteína de resistencia al herbicida glufosinato
(Thompson et al., 1987) como marcador seleccionable bajo el
control del promotor cSVMV del Virus del Mosaico de los Nervios de
la mandioca (Verdaguer et al., 1996, 1998) y la región de
terminación del transcrito 3' y poliadenilación del gen de la
nopalina-sintasa (Depicker et al., 1982).
Se transformaron establemente células de maíz
con los constructos pACS9, pACS11, pACS12 y pACS13 por
transformación mediada por Agrobacterium como se describe en la
Patente U.S. 6.140.553. Se transformaron establemente células de
algodón con los constructos pACS9, pACS11, pACS12 y pACS13
utilizando el método de transformación descrito en la Publicación
de Patente PCT WO 00/71733. Se transforman de manera estable células
de arroz con el método descrito en la Solicitud de Patente
publicada PCT WO 92/09696. Se transformaron de manera establemente
células de tabaco con los constructos pACS11 y pACS12 utilizando
transformación mediada por Agrobacterium, esencialmente como
se describe en la Patente EP 0 116 718 o en Deblaere et al.
(1987).
Las células transformadas y las plántulas
regeneradas a partir de ellas se cultivan en medios que contienen
los agentes selectivos fosfinotricina o glifosato, con lo cual se
transformarán la mayoría, si no la totalidad, de las plantas
regeneradas.
Las plantas regeneradas y transformadas de
tabaco, maíz, algodón y arroz se seleccionan por ELISA de Cry2A,
transferencia Northern y Southern y de acuerdo con la eficacia
insecticida y las características agronómicas. Las plantas
quiméricas de la progenie que contienen el gen cry2A exhiben
una resistencia mejorada frente a los insectos, comparadas con
plantas de control sin transformar con una segregación apropiada de
las resistencias a los insectos y el fenotipo transformado. Las
medidas de proteínas y RNA demuestran que las plantas con
resistencia incrementada a los insectos tienen una expresión mayor
de la nueva proteína Cry2A en sus células.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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2001-01-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patent In, Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1899
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus thuringiensins
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (1896)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,4cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,6cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 632
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus thuringiensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,5cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,7cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1910
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial de DNA cry2Ae
para expresión en algodón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(1901)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,3cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,4cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 633
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,4cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,5cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1910
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia artificial de DNA cry2Ae
para expresión en maíz
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,3cm
\hskip0,8cm
Claims (36)
1. Una secuencia codificante de ácido nucleico
que codifica una proteína insecticida Cry2Ae constituida por la
secuencia de aminoácidos de la proteína de SEQ ID No. 2 desde la
posición del aminoácido 1 a una posición de aminoácido situada
entre las posiciones de los aminoácidos 624 y 632 de SEQ ID No.
2.
2. Una secuencia codificante de ácido nucleico
que codifica una proteína insecticida Cry2Ae constituida por la
secuencia de aminoácidos de la proteína de SEQ ID No. 2 desde una
posición de aminoácido que comprende desde las posiciones de los
aminoácidos 1 y 51 hasta una posición de aminoácido entre las
posiciones de los aminoácidos 624 y 632 en SEQ ID No. 2.
3. Una secuencia codificante de ácido nucleico
que codifica una proteína insecticida Cry2Ae constituida por la
secuencia de aminoácidos de la proteína de SEQ ID No. 2 desde una
posición de aminoácido que comprende desde las posiciones de los
aminoácidos 1 y 51 hasta la posición del aminoácido 632 en SEQ ID
No. 2.
4. La secuencia de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha secuencia
de ácido nucleico es DNA.
5. La secuencia de ácido nucleico de la
reivindicación 4, que comprende una secuencia artificial de DNA que
tiene un uso de codones diferente comparada con la secuencia de DNA
existente naturalmente, pero que codifica la misma proteína.
6. Una secuencia codificante de DNA que codifica
una proteína insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos
de la proteína de SEQ ID No. 2 desde una posición de aminoácido
entre la posición del aminoácido 1 y la posición del aminoácido 51
hasta una posición de aminoácido entre la posición del aminoácido
624 y la posición del aminoácido 632, en donde dicha secuencia
codificante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o
SEQ ID NO: 5 desde la posición del nucleótido 153 a la posición del
nucleótido 1880.
7. Una secuencia codificante de DNA que codifica
una proteína insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos
de la proteína de SEQ ID No. 2 desde una posición de aminoácido
entre la posición del aminoácido 1 y la posición del aminoácido 51
hasta la posición del aminoácido 632, en donde dicha secuencia
codificante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o
SEQ ID NO: 5 desde la posición del nucleótido 153 a la posición del
nucleótido 1880.
8. Una secuencia codificante de DNA que codifica
una proteína insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos
de la proteína de SEQ ID No. 2 desde la posición del aminoácido 1
hasta una posición de aminoácido entre las posiciones de los
aminoácidos 624 y 632, en donde dicha secuencia codificante
comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:
5 desde la posición del nucleótido 153 a la posición del nucleótido
1880.
9. Un DNA que comprende la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID No. 3 ó 5.
10. La secuencia de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una secuencia de ácido
nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO. 2 o una porción
insecticida de la misma, en donde la proteína codificada comienza
con un dipéptido Met-Asp o Met-Ala
para iniciación óptima de la traducción, por la inserción de un
codón que codifica un aminoácido Asp o Ala aguas abajo del codón de
inicio como un nuevo segundo
codón.
codón.
11. La secuencia de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que contiene también un
DNA que codifica un péptido de direccionamiento o de tránsito para
direccionamiento a la vacuola, el cloroplasto, la mitocondria, el
plástido, o para secreción.
12. La secuencia de ácido nucleico de la
reivindicación 11 que comprende adicionalmente un DNA que codifica
un péptido de tránsito al cloroplasto.
13. Una proteína insecticida, constituida por la
secuencia de aminoácidos de la proteína de SEQ ID No. 2 desde la
posición del aminoácido 1 a una posición de aminoácido entre las
posiciones de aminoácidos 624 y 632 de SEQ ID No. 2.
14. Una proteína insecticida constituida por la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID no. 2 desde una posición de
aminoácido entre las posiciones de los aminoácidos 1 y 51 hasta una
posición de aminoácido entre las posiciones de los aminoácidos 624
y 632 en SEQ ID No. 2.
15. Una proteína insecticida constituida por la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID no. 2 desde una posición de
aminoácido entre las posiciones de los aminoácidos 1 y 51 hasta la
posición del aminoácido 632 en SEQ ID No. 2.
16. Una proteína insecticida que comprende la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4.
17. La proteína de una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, o una proteína insecticida que comprende
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2, o una proteína
insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.
2 desde la posición del aminoácido 50 a la posición del aminoácido
625, que está modificada para comenzar con un dipéptido
Met-Asp o Met-Ala, por adición de un
aminoácido Asp o Ala aguas abajo del aminoácido Met de inicio.
18. La proteína de la reivindicación 17, que
comprende adicionalmente un péptido de tránsito al cloroplasto.
19. Un gen quimérico constituido por una
secuencia codificante y un promotor expresable en plantas, en donde
dicha secuencia codificante es la secuencia de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y en donde dicha
secuencia codificante está bajo el control de dicho promotor
expresable en plantas.
20. Un gen quimérico que comprende los
siguientes elementos enlazados operativamente:
- a)
- un promotor 35S derivado del Virus del Mosaico de la Coliflor;
- b)
- una secuencia conductora del gen de la proteína de fijación de clorofila a/b de Petunia;
- c)
- la secuencia codificante de DNA de SEQ ID No: 3; y
- d)
- una región de terminación de la transcripción en 3' y poliadenilación del gen 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor.
21. El gen quimérico de la reivindicación 20, en
donde dicho gen quimérico comprende también un DNA que codifica el
péptido de tránsito TpssuAt que permite el direccionamiento al
cloroplasto insertado en el extremo 5' de la secuencia codificante
cry2Ae.
22. Células de plantas, plantas o semillas
transformadas que comprenden el gen quimérico de una cualquiera de
las reivindicaciones 19 a 21.
23. Una planta, célula de planta o semilla que
comprende como primer gen quimérico:
- a)
- el gen quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, o
- b)
- un gen quimérico que comprende un DNA que codifica la proteína de SEQ ID No: 2 bajo el control de un promotor expresable en plantas, o
- c)
- un gen quimérico que comprende un DNA que codifica una proteína insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 desde la posición del aminoácido 50 a la posición del aminoácido 625, bajo el control de un promotor expresable en plantas; y
como segundo gen quimérico, un gen
quimérico que comprende un DNA que codifica una proteína insecticida
seleccionada de: una proteína Cry1F o un fragmento tóxico de la
misma; una proteína híbrida derivada de una proteína Cry1F, una
proteína híbrida Cry1A-Cry1F; una proteína de tipo
Cry1A o un fragmento tóxico de la misma, una proteína Cry1Ac o una
proteína híbrida Cry1Ab-Cry1Ac; una proteína VIP3Aa
o un fragmento tóxico de la misma, o proteínas insecticidas de
cepas de especies de Xhenorhabdus, Serratia o
Photorhabdus.
24. Una planta transgénica de algodón que
comprende una proteína insecticida que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID No: 2, o que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 2 desde la posición del aminoácido 50 a
la posición del aminoácido 625, como primera proteína de control de
insectos y la proteína Cry1Ac o VIP3Aa como segunda proteína de
control de insectos.
25. Las células de plantas, plantas o semillas
de la reivindicación 22 ó 23 que se seleccionan del grupo
constituido por: maíz, constituido por: maíz, algodón, arroz,
tabaco, colza oleaginosa, especies de Brassica, berenjena,
soja, patata, girasol, tomate, caña de azúcar, té, judías, tabaco,
fresa, trébol, pepino, sandía, pimiento, avena, cebada, trigo,
dalia, gladiolo, crisantemo, remolacha azucarera, sorgo, alfalfa, y
cacahuete.
26. Un microorganismo transformado que comprende
la secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12.
27. Un proceso para hacer una planta resistente
a un insecto, que comprende transformar células de la planta con el
gen quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, y
regenerar plantas transformadas a partir de tales células que son
resistentes a los insectos.
28. El proceso de la reivindicación 27, en donde
dicho insecto se selecciona del grupo constituido por: Heliothis
virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Anticarsia
gemmatalis y Ostrinia nubilalis, Chilo suppressalis, Chilo
partellus, Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis
medinalis, Marasmia patnalis, Marasmia exigua, Marasmia
ruralis, y Scirpophaga innotata.
29. Uso de la proteína de una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 18 para reprimir insectos seleccionados del
grupo constituido por: Heliothis virescens, Helicoverpa zea,
Helicoverpa armigera, Anticarsia gemmatalis, Ostrinia nubilalis,
Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Sesamia
inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia patnalis, Marasmia
exigua, Marasmia ruralis, y Scirpophaga innotata.
30. Uso de la proteína de una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 18, o una proteína insecticida que comprende
la secuencia de SEQ ID No: 2, o que comprende la secuencia de SEQ ID
No: 2 desde la posición del aminoácido 50 a la posición del
aminoácido 625, para reprimir un insecto seleccionado del grupo
constituido por: Helicoverpa armigera, Anticarsia gemmatalis
o Sesamia nonagrioides.
31. Uso de la proteína de una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 18, o una proteína insecticida que comprende
la secuencia de SEQ ID No: 2, o que comprende la secuencia de SEQ ID
No: 2 desde la posición del aminoácido 50 a la posición del
aminoácido 625, para reprimir un insecto seleccionado del grupo
constituido por: Chilo suppressalis, Chilo partellus,
Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis,
Marasmia patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, y
Scirpophaga innotata.
32. Un proceso para hacer las plantas
resistentes a Helicoverpa armigera, Anticarsia gemmatalis o
Sesamia nonagrioides, que comprende transformar células de
plantas con el gen quimérico de una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, o un gen quimérico que comprende:
a) un DNA que codifica una proteína insecticida
que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 bajo el
control de un promotor expresable en plantas, o b) un DNA que
codifica una proteína insecticida que comprende la secuencia de SEQ
ID No: 2 desde la posición del aminoácido 50 a la posición del
aminoácido 625 bajo el control de un promotor expresable en
plantas, y regenerar plantas transformadas a partir de tales
células.
33. Un proceso para hacer plantas resistentes a
Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas,
Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia patnalis,
Marasmia exigua, Marasmia ruralis, o Scirpophaga
innotata, que comprende transformar células de plantas con el
gen quimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, o
un gen quimérico que comprende: a) una secuencia de DNA que codifica
una proteína insecticida que comprende la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID No: 2 bajo el control de un promotor expresable en
plantas, o b) un DNA que codifica una proteína insecticida que
comprende la secuencia de SEQ ID No: 2 desde la posición del
aminoácido 50 a la posición del aminoácido 625 bajo el control de un
promotor expresable en plantas, y regenerar plantas transformadas a
partir de tales células.
34. Un método para reprimir insectos, que
comprende expresar en células de plantas transformadas una cantidad
eficaz como insecticida de la proteína de una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 18, para reprimir: Heliothis virescens,
Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Anticarsia gemmatalis,
Ostrinia nubilalis, Chilo suppressalis, Chilo partellus,
Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis,
Marasmia patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis, o
Scirpophaga innotata.
35. Uso de la proteína de una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 18 o una proteína insecticida que comprende
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 ó 4, o que comprende la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 desde la posición del
aminoácido 50 a la posición del aminoácido 625, con otra proteína de
represión de insectos, que no reconoce al menos un sitio de
fijación reconocido por una proteína Cry2Ae.
36. Una planta transgénica que comprende un DNA
que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones
13 a 18, o una proteína insecticida que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID No: 2 ó 3, o que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID No: 2 desde la posición del aminoácido 50 a la
posición del aminoácido 625, que ha sido transformada también con
un DNA que codifica una proteína que confiere resistencia a un
herbicida basado en glufosinato o glifosato.
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