BRPI0508068B1

BRPI0508068B1 - Molecule of nucleic acid isolated, vector understanding, polyepeptide isolated, composition understanding the same and methods of transgenic plant production and increased insect resistance in transgenic plants

Info

Publication number: BRPI0508068B1
Application number: BRPI0508068-1A
Authority: BR
Inventors: Bermudez Ericka; Emig Robin; Mcbride Kevin; Yamamoto Takashi
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
Priority date: 2004-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2017-11-28
Also published as: WO2005082077A2; ZA200607222B; AU2005216528A1; KR20120035233A; US20070204369A1; JP4818252B2; EP1718751A2; US7208474B2; CN1942582A; US7943737B2; AR048744A1; CN101671680B; US7943735B2; CN101671681B; US7943736B2; JP2007526773A; CA2799245C; AU2009202561A1; EP1718751B1; US20100210549A1

Abstract

moléculas de ácido nucléico isoladas, vetor compreendendo as mesmas, polipeptídeos isolados e composições compreendendo os mesmos a presente invenção refere-se a polipeptídeos inseticidas relacionados com polipeptídeos cry2 de bacillus. a presente invenção refere-se a ácidos nucléicos que codficam os polipeptídeos da invenção. além disso, são ainda objetos da presente invenção métodos de utilização dos polipeptídeos e ácidos nucléicos da invenção, para aumentar a resistência das plantas à predação por insetos.

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR COMPREENDENDO A MESMA, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO OS MESMOS E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE PLANTA TRANSGÊNICA E AUMENTO DA RESISTÊNCIA A INSETOS EM PLANTAS TRANSGÊNICAS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere, em geral, ao campo de controle de pragas e provê polipeptídeos inseticidas relacionados com os polipeptídeos de Cry2 de Bacillus e os polinucleotídeos que os codificam. A presente invenção também se refere a métodos e composições para alterar a resistência de plantas com relação a predação por insetos, incluindo, mas não estando limitada a, produção de planta transgênica.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Numerosas plantas comercialmente valiosas, incluindo culturas agrícolas comuns, são susceptíveis ao ataque por pragas de inseto e de nematódeos. Essas pragas podem causar substancial redução na produtividade e qualidade da lavoura. Tradicionalmente, os agricultores têm confiado fortemente nos pesticidas químicos para combater os danos da praga. Entretanto, o uso de pesticidas químicos suscita seu próprio conjunto de problemas, incluindo o custo e a inconveniência da aplicação de pesticidas. Além disso, os resíduos químicos dão origem a preocupações com o meio ambiente e a saúde. Por essas e outras razões existe uma demanda por agentes inseticidas alternativos.

Uma abordagem amigável, sob o ponto de vista ambiental, para controlar pragas é o uso de proteínas de cristal pesticidas derivadas da bactéria presente no solo Bacillus thuringiensis ("Bt"), comumente referidas como "proteínas Cry". Muitas dessas proteínas são bastante tóxicas para insetos alvo específicos, mas inofensivas para plantas e outros organismos não-alvos. Algumas proteínas Cry têm sido recombinantemente expressadas em plantas de cultivo para prover plantas transgênicas resistentes a pragas. Entre essas, estão o algodão Bt-transgênico e o milho que têm sido amplamente cultivados.

Um grande número de proteínas Cry tem sido isolado, caracterizado e classificado com base em homologia de seqüências de aminoácidos (Crickmore et al., 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62: 807-813). Esse esquema de classificação provê um mecanismo sistemático de nomear e categorizar proteínas Cry recentemente descobertas.

Tem sido, em geral, descoberto que proteínas Cry individuais possuem espectro de atividade relativamente estreito com a exceção da Cry2A. A Cry2A é não-usual no aspecto em que este subconjunto de proteínas Cry possue uma ampla faixa eficaz que inclui toxicidade para ambas as ordens de insetos Lepidoptera e Diptera. A proteína Cry2A foi descoberta como uma toxina que apresenta uma dupla atividade contra Trichoplusia ni {lagarta-mede-palmos de repolho) e Aedes taeniorhynchus (mosquito) (Yamamoto e McLaughlin, 1982, Biochem. Biophys. Res. Comm. 130: 414— 421) . A molécula de ác. nucléico codificante da proteína Cry2A (denominada Cry2Aa) foi clonada e expressada em B. megaterium, e foi verificado que ela é ativa contra insetos de ambos Lepidópteros e Dípteros (Donovan et al. 1988, J. Bacteriol. 170: 4732-4738). Uma adicional seqüência codificante homóloga à Cry2Aa foi clonada (denominada Cry2Ab) e foi verificado que ela é ativa somente contra larvas de Lepidoptera {Widner e Whiteley, 1989, J Bacteriol 171:2) .

As culturas transgênicas de segunda geração podem ser mais resistentes a insetos se elas forem capazes de expressar múltiplos e/ou novos genes de Bt. Conseqüentemente, seria altamente desejável obter novas proteínas inseticidas tendo amplo espectro de atividade. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere a um novo polipeptídeo de Cry2, o Cry2Ax (SEQ ID No:2), isolado a partir de Bacillus thuringiensis. São também englobados pela presente invenção os polipeptídeos Cry2Ax-derivados (SEQ ID Nos:4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260). Em adição à seqüência de polipeptídeo dos polipeptídeos Cry2Ax e Cry2Ax-derivados, será considerado que os polipeptídeos da invenção também englobam variantes dos mesmos, incluindo, mas não estando limitados a, qualquer fragmento, análogo, homólogo, alelo de ocorrência natural ou mutante dos mesmos. Os polipeptídeos da invenção também englobam aqueles polipeptídeos que são codificados por qualquer ác. nucléico Cry2Ax ou Cry2Ax-derivado da invenção. Em uma concretização, os polipeptideos que possuem pelo menos uma atividade funcional de Cry2Ax (por exemplo, atividade inseticida) e são pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% idênticos à seqüência de polipeptideo de qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, ou variantes das mesmas. Em uma outra concretização, os polipeptideos que são englobados e que possuem pelo menos uma atividade funcional de Cry2Ax (por exemplo, atividade inseticida), são aqueles com comprimento de pelo menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, ou 625 aminoácidos contíguos, e são codificados por um polinucleotideo que hibridiza sob condições estringentes com o ác. nucléico que codifica qualquer uma dentre as SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, ou uma variante das mesmas. São também providos os métodos de produção dos polipeptideos da invenção, por exemplo, por meios recombinantes. As composições compreendendo um ou mais polipeptideos da invenção também estão englobados. A presente invenção também se refere às moléculas de ác. nucléico de Cry2Ax (SEQ ID No:l) e às moléculas de ác. nucléico de Cry2Ax-derivadas (SEQ ID Nos: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259). Também estão englobados pela presente invenção os fragmentos e análogos que codificam polipeptideos que são, pelo menos em parte, funcionalmente ativos, ou seja, eles são capazes de apresentar uma ou mais atividades funcionais conhecidas associadas com um polipeptídeo Cry2Ax do tipo selvagem. Em uma concretização, a invenção engloba uma molécula de ác. nucléico isolada que compreende uma seqüência de nucleotídeos: (i) a qual é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à seqüência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259; (ii) que hibridiza com uma sonda de ác. nucléico consistindo da seqüência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, ou um complemento das mesmas sob condições estringentes; e/ou (iii) que compreende uma molécula de ác. nucléico que codifica um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260. Estão também englobados os vetores compreendendo os ácidos nucléicos da invenção. As células ou plantas compreendendo os vetores da invenção também estão englobadas.

Além disso, são ainda objetos da presente invenção métodos de utilização dos polipeptídeos e ácidos nucléicos da invenção, para produzir plantas transgênicas e aumentar a resistência das plantas à predação por insetos. A presente invenção também se refere a plantas transgênicas que expressam um ác. nucléico e/ou polipeptídeo da invenção. As plantas transgênicas podem expressar o transgene por qualquer modo conhecido no estado da técnica, incluindo, mas não estando limitada a, expressão constitutiva, expressão regulada pelo modo de desenvolvimento, expressão especifica de tecido, etc. A semente obtida de uma planta transgênica da invenção também está englobada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a atividade inseticida de clones de DNA da segunda rodada de combinação aleatória (shuffling).

Cada clone foi expressado em folhas de N. benthamiana usando infiltração forçada. Cada disco de folha foi alimentado a uma única larva de H. zea de 3o instar. Em seguida a um período de incubação de 24 horas, a atividade de alimentação foi determinada por observação visual e expressada como uma fração aproximada da área remanescente da folha. 0 eixo dos Y é a percentagem do disco de folha remanescente após a exposição ao inseto. 0 eixo dos X é o clone expressado no disco de folha. Diversos clones apresentaram atividade inseticida aumentada tais como 7K (D_S01000779) (SEQ ID No:10), 15K (D_S00999080) (SEQ ID No:12), 16K (D_S01000269) (SEQ ID No:14), 16R (D_S01037143) (SEQ ID No:16), e 473R (D_S01037677) (SEQ ID No:18). A Figura 2 mostra a atividade inseticida da primeira rodada de combinação aleatória do clone 44 (D_S00503970) e terceira rodada do clone D_S01764701 combinado aleatoriamente (shuffled). Cada clone foi expressado em folhas de N. benthamiana usando infiltração forçada. Cada disco de folha foi alimentado a uma única larva de H. zea de 3o instar. Em seguida a um período de incubação de 24 horas, foi determinada a atividade de alimentação por captura de vídeo do disco de folha. 0 eixo dos Y é o número de pixels presente na imagem capturada de disco de folha. 0 eixo dos X é o clone expressado no disco de folha. Os resultados são mostrados para a média de três experimentos, Para cada experimento, pelo menos oito discos de folha foram testados para cada clone.

As Figuras 3A-3B mostram os resultados de eficácia para plantas transgênicas de tabaco expressando o clone 44 aleatoriamente combinado da primeira rodada no compartimento de plastídeo (painéis da esquerda) ou no citoplasma (painéis da direita). A eficácia de inibição de (A) H. zea ou (B) S. exigua foi determinada após a incubação das folhas com os vermes por 24 horas. A quantidade de folha remanescente foi observada com o equipamento de captura de vídeo com referência ao cálculo real de área relativa de folha remanescente (número de pixels). De cada planta transgênica foram tomados seis discos de folha para análise. Como as vinte e cinco plantas transgênicas foram feitas usando cada constructo de transgene, os números distinguem diferentes plantas usando um constructo particular.

As Figuras 4A-4B mostram os níveis de expressão de transgene nas plantas transgênicas que expressam o clone 44 aleatoriamente combinado da primeira rodada. Este polipeptídeo Cry2-derivado aleatoriamente combinado foi expressado nos compartimentos sub-celulares de (A) plastídeo ou (B) citoplasma por transformação com o pMAXY5469 ou o pMAXY5471, respectivamente. A análise por Western blot foi realizada em extratos de planta transgênica usando um anticorpo policlonal dirigido para a região de toxina do polipeptídeo do clone 44 aleatoriamente combinado da primeira rodada. Os controles negativos foram extratos tomados de uma planta não-transformada. Os controles positivos foram tanto de 20 ng ou de 40 ng de toxina Cry2Ax purificada. O peso molecular do controle positivo Cry2Ax difere daquele do polipeptídeo Cry2Ax-derivado nos extratos de planta porque o primeiro é ativado por tripsina e o último ativado por pró-toxina. DESCRIÇÃO detalhada da invenção A presente invenção provê polipeptideos inseticidas relacionados com polipeptideos Cry2 de Bacillus. As moléculas de ác. nucléico codificantes dos polipeptideos da invenção também são providas. Estão englobados os métodos para usar os polipeptideos e ácidos nucléicos da invenção para melhorar a resistência de plantas a predação por insetos.

POLIPEPTIDEOS DA INVENÇÃO A presente invenção de refere a um novo polipeptídeo Cry2, o Cry2Ax (SEQ ID No:2), isolado a partir de Bacillus thuringiensis. Também estão englobados pela presente invenção os polipeptideos Cry2Ax-derivados (SEQ ID Nos: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260). Os polipeptideos da invenção também englobam aqueles polipeptideos que são codificados por qualquer um dos ácidos nucléicos Cry2Ax ou Cry2Ax-derivados da invenção (ver Seção: Ácidos Nucléicos da Invenção).

Em adição à seqüência de polipeptídeo dos polipeptideos Cry2Ax e Cry2Ax-derivado, será considerado que os polipeptideos da invenção também englobam as variantes dos mesmos, incluindo, mas não estando limtadas a, qualquer seqüência substancialmente semelhante, qualquer fragmento, análogo, homólogo, alelo de ocorrência natural ou mutante do mesmo. As variantes englobadas pela invenção são polipeptideos que são pelo menos em parte ativos funcionalmente, ou seja, eles são capazes de apresentar uma ou mais atividades funcionais conhecidas associadas com um polipetídeo Cry2Ax do tipo selvagem. Essas atividades funcionais incluem, mas não estão limitadas a, atividades tais como atividade inseticida; antigenicidade, ou seja, uma capacidade de se ligar a ou competir com a Cry2Ax para se ligar a um anticorpo anti-Cry2Ax; imunogenicidade, ou seja, uma capacidade de gerar anticorpo que se ligue a um polipeptideo de Cry2Ax. Em algumas concretizações, as variantes possuem pelo menos uma atividade funcional que é substancialmente semelhante a seu polipeptideo parental (por exemplo, uma variante de Cry2Ax terá pelo menos uma atividade funcional que é substancialmente semelhante ao Cry2Ax). Como aqui usada, a atividade funcional da variante será considerada "substancialmente semelhante" a seu polipeptideo parental se ele estiver dentro de um desvio padrão do parental.

Em uma concretização, os polipeptideos que têm pelo menos uma atividade funcional de Cry2Ax (por exemplo, atividade inseticida) e são pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% idênticos à seqüência de polipeptideo de qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260 estão englobados pela invenção. Tais polipeptídeos da invenção contêm pelo menos 1, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, ou todos os 40 resíduos de aminoácido do grupo consistindo de H2, S7, Q27, Cbsf £3$, K43, D44, N45, D51, A58, Ve9, R78/ N79, K99, Tua, V124, Ei25/ Rl29f ^39, Rl39r AlU, Ti62, QlÉ5, Mi66f Ll83, 1192/ H21I, R213r ^217^ D218í V324r l386f T399, S405f Qí45í 1551 / S587, I591/ Leio, e L63i · O subscrito indica a posição do resíduo de aminoácido correspondente à posição na SEQ 1D No:2 sob alinhamento ótimo da sequência do polipeptídeo com a SEQ ID N0:2. Com relação à seqüência de aminoácidos que fica alinhada de modo ótimo com uma seqüência de referência, o aminoácido "corresponde" à posição na seqüência de referência com a qual o resíduo é emparelhado no alinhamento.

Como aqui usada, quando uma seqüência é definida como sendo "pelo menos X% idêntica" a uma seqüência de referência, por exemplo, "um polipeptídeo pelo menos 95% idêntico à SEQ ID No: 2", deve ser entendido que o "X% idêntico" se refere à identidade percentual absoluta, a menos que de outra forma seja indicado. O termo "identidade percentual absoluta" se refere a uma percentagem de identidade de seqiiência determinada pela contabilização de escore de aminoácidos idênticos, tanto quanto uma ou qualquer uma substituição seja zero, independente da similaridade de aminoácidos ou ácidos nucléicos de emparelhamento desigual. Em um alinhamento de seqüência típico a "identidade percentual absoluta" de duas seqüências é apresentada como uma percentagem de "identidades" de aminoácidos ou ác. nucléicos. Nos casos em que um alinhamento ótimo de duas seqüências requer a inserção de um gap em uma ou ambas as seqüências, um resíduo de aminoácido em uma seqüência que se alinha com um gap na outra seqüência é contado como um emparelhamento desigual para propósitos de determinação de identidade percentual. Os gaps podem ser internos ou externos, ou seja, uma truncagem. A identidade percentual absoluta pode ser prontamente determinada usando, por exemplo, o programa Clustal W, versão 1.8, junho de 1999, usando parâmetros de default {Thompson et al., 1994, Ác. nucléicos Research 22: 4673-4680).

Em uma outra concretização, os fragmentos dos polipeptídeos Cry2Ax e Cry2Ax-derivado são englobados pela invenção. São englobados os polipeptídeos que possuem pelo menos uma atividade funcional de Cry2Ax (por exemplo, atividade inseticida), são pelo menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, ou 625 aminoácidos contíguos no comprimento de qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, e são codificados por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um ác. nucléico que codifica qualquer uma das SEQ ID Nos:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260. Em concretizações em que o fragmento da invenção engloba qualquer um dos resíduos de aminoácido que corresponde aos resíduos de aminoácido 2, 7, 27, 35, 36, 43, 44, 45, 51, 58, 69, 78, 79, 99, 118, 124, 125, 129, 138, 139, 141, 161, 165, 166, 183, 192, 211, 213, 217, 218, 324, 386, 399, 405, 445, 551, 587, 591, 610, 631 da SEQ ID No:2, tais polipeptídeos da invenção contêm pelo menos 1, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, ou todos os 40 resíduos de aminoácido do grupo consistindo de H2, S7, Qzi, Q35, E36, K43, D44, N45, D5i, A58, V69, R79/ N79, K99, Tiie, Vi24, E125, Rl29, Ni38, Rl39, A141, Ti62, Ql65, Ml66/ Í>183/ 1192 , Η211, R213f R217, D218í V324 r ^386 / T399, S405, Q445, I551/ Ss87/ Ϊ591/ Leio, e Le3i· Em uma concretização específica, um fragmento da invenção corresponde ao comprimento da pró-toxina processada. Há uma diferença de 5-6 kDa no peso molecular entre a pró-toxina Cry2 de comprimento total e a toxina Cry2 processada. Esse é o resultado de ~40 aminoácidos que estão sendo clivados a partir do polipeptídeo da pró-toxina Cry2 (Rukmini et al., 2000, Biochimie 82:109-116; Aronson et al., 1993, Mol. Microbiol. 7:489-496; Morse et al., 2001, Structure 9:409-17). Os polipeptídeos que correspondem a este fragmento de Cry2 processado podem ser providos nos métodos da presente invenção para evitar diretamente a necessidade de processamento da pró-toxina.

Em uma outra concretização específica, um fragmento da invenção corresponde a um domínio de Cry2. Os polipeptídeos de Cry2 possuem três domínios, incluindo (i) domínio I, o qual está envolvido com a inserção na membrana apical do intestino médio do inseto e afeta a função de canal de íon, (ii) domínio II, o qual está envolvido na ligação a receptor na membrana celular epitelial do intestino médio do inseto, e (iii) domínio III, o qual está envolvido com a função de canal de íon, ligação a receptor e inserção na membrana (Dean et al., 1996, Gene 179:111-117; Schnepf et al., 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:775-806).

Em uma outra concretização, os polipeptídeos análogos são englobados pela invenção. Os polipeptídeos análogos podem possuir resíduos que tenham sido modificados, por exemplo, pela união covalente de qualquer tipo de molécula aos polipeptídeos Cry2Ax ou Cry2Ax-derivados. Por exemplo, mas não ficando limitado a, um polipeptídeo análogo da invenção pode ser modificado, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupamentos de proteção/bloqueio conhecidos, divagem proteolitica, união com um ligante celular ou com outra proteína, etc. Um polipeptídeo análogo da invenção pode ser modificado por meio de modificações químicas usando técnicas conhecidas daqueles especialistas na técnica, incluindo, mas não ficando limitada a divagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, um análogo de um polipeptídeo da invenção pode conter um ou mais aminoácidos não-clássicos. São também providos métodos de produção de polipeptídeos da invenção, por exemplo, por meios recombinantes (ver Seção: Expressão Recombinante).

As composições compreendendo um ou mais polipeptídeos da invenção também estão englobadas. As composições da invenção podem ainda compreender agentes adicionais incluindo, mas não estando limitados a, adjuvantes de espalhador-adesivo, agentes estabilizantes, outros aditivos inseticidas, diluentes, agentes que otimizam as propriedades reológicas ou a estabilidade da composição, tais como, por exemplo, tensoativos, emulsificantes, dispersantes e/ou polímeros. Ácidos Nucléicos da Invenção A presente invenção também se refere às moléculas de ác. nucléico de Cry2Ax (SEQ ID No:l) e às moléculas de ác. nucléico Cry2Ax-derivadas (SEQ ID Nos: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259) . As moléculas de ác. nucléico da invenção também englobam aquelas moléculas de ác. nucléico que codificam qualquer um polipeptídeo de Cry2Ax ou Cry2Ax-derivado da invenção (ver Seção: Polipeptídeos da Invenção).

Em adição à molécula de ác. nucléico de Cry2Ax e de moléculas de ác. nucléico Cry2Ax-derivadas, será considerado que os ácidos nucléicos da invenção também englobam variantes das mesmas, incluindo, mas não estando limitadas a, qualquer seqiiência substancialmente semelhante, qualquer fragmento, homólogo, alelo de ocorrência natural, ou mutante do mesmo. As moléculas variantes de ác. nucléico englobadas pela presente invenção codificam polipeptídeos que são, pelo menos em parte, funcionalmente ativos, ou seja, eles são capazes de apresentar uma ou mais atividades funcionais conhecidas associadas com um polipeptídeo Cry2Ax do tipo selvagem. Tais atividades funcionais incluem, mas não estão limitadas a, atividades biológicas, tal como atividade inseticida; antigenicidade, ou seja, uma capacidade para se ligar a ou competir com Cry2Ax para se ligar a um anticorpo anti-Cry2Ax; imunogenicidade, ou seja, uma capacidade para gerar anticorpo que se ligue a um polipeptídeo de Cry2Ax. Em algumas concretizações, as variantes possuem pelo menos uma atividade funcional que é substancialmente semelhante à da sua molécula de ác. nucléico parental (por exemplo, uma variante de uma molécula de ác. nucléico de Cry2Ax codificará um polipeptídeo que tem pelo menos uma atividade funcional que é substancialmente semelhante à do polipeptídeo codificado por moléculas de ác. nucléico de Cry2Ax). Como aqui usado, a atividade funcional da variante será considerada "substancialmente semelhante" com relação ao seu polipeptídeo parental, se ele estiver dentro de um desvio padrão do parental.

Em uma concretização, as moléculas de ác. nucléico que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% idênticas a quaisquer moléculas de ác. nucléico de SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259 estão englobadas pela invenção. Tais moléculas de ác. nucléico da invenção codificam polipeptideos que contêm pelo menos um, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, ou todos os 40 resíduos de aminoácido do grupo consistindo de H2, S7, Q27, Q35, E36, K43, D44, N45, D51, A58, Vê9 , R78, N-79, K99, T118, Vi24, Ei25í Rl29f Ni38, R139, Ai4i, Ti621 Ql65 r Ml66í Li83, I192, H211, R213r R217, D218, V324, l386f T399, S405 í Qí45r I55I/ S587, I59I, Egio, e Lê31 · Para determinar a identidade percentual de duas moléculas de ác. nucléico, as seqüências são alinhadas para finalidade de comparação ótima (por exemplo, gaps podem ser introduzidos na sequência de uma primeira molécula de ác. nucléico para o alinhamento ótimo com uma segunda molécula de ác. nucléico). Os nucleotideos em correspondentes posições de nucleotídeo são depois comparados. Quando uma posição na primeira seqüência estiver ocupada pelo mesmo nucleotídeo que o da posição correspondente na segunda seqüência, então as moléculas são idênticas naquela posição. A identidade percentual entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (ou seja, % de identidade = número de posições que se sobrepõem/total de número de posições x 100%) . Em uma concretização, as duas seqüências são de mesmo comprimento. A determinação da identidade percentual entre duas seqüências também pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Um exemplo não-limitante de um algoritmo matemático utilizado na comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin e Altschul (Karlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. 90:5873-5877). Um tal algoritmo está incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403 e Altschul et al., 1997, Ac. nucléico Res. 25:3389-3402). O software para realizar a análise BLAST está disponível ao público, por exemplo, através do National Center for Biotechnolgy Information. Este algoritmo envolve primeiramente identificar pares de seqüência com alto escore (high scoring sequence pairs (HSPs)) pela identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência pergunta (query), a qual ou se iguala ou satisfaz algum escore T limiar positivo-avaliado quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência da base de dados. T é referido como o limiar de escore de palavra da vizinhança (Altschul et al., acima mencionado). Esses iniciais acertos de palavra da vizinhança atuam como sementes para inicializar as buscas para encontrar os mais longos HSPs contendo os mesmos. Os acertos de palavra são depois estendidos, em ambas as direções, ao longo de cada seqüência para tão longe quanto o escore de alinhamento cumulativo possa ser aumentado. Os escores cumulativos são calculados usando, para seqüências de nucleotídeos, os parâmetros M (escore de recompensa para um par de resíduos de emparelhamento; sempre >0) e N (escore de penalidade para resíduos de emparelhamento desigual; sempre < 0) . Para seqüências de aminoácidos, uma matriz de contabilização de escore é usada para calcular o escore cumulativo. A extensão dos acertos de palavra em cada direção é detida quando: o escore de alinhamento cumulativo diminui por uma quantidade X a partir do valor máximo encontrado; o escore cumulativo chega até zero ou abaixo de zero, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de escore-negativo; ou o final de qualquer das seqüências é alcançado. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeos) usa como defaults um comprimento-de-palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um cutoff de 100, M = 5, N = -4, e uma comparação de ambas as fitas. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como defaults um comprimento-de-palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de contabilização de escore BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, 1989, PNAS, 89:10915) .

0 método de alinhamento Clustal V também pode ser usado para determinar a identidade percentual (Higgins e Sharp,1989, CABIOS. 5:151-153) e é encontrado no programa Megalign do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) . Os "parâmetros de default" são os parâmetros pré-fixados pelo fabricante do programa e, para alinhamentos múltiplos, eles correspondem à PENALIDADE DE GAP=10 e PENALIDADE DE COMPRIMENTO DE GAP=10, enquanto que para alinhamentos aos pares eles são KTUPLE 1, PENALIDADE DE GAP=3, JANELA=5 e DIAGONAIS SALVAS=5. Após o alinhamento de seqüências, usando o programa Clustal V, é possível obter uma "identidade percentual" pela observação da tabela de "distâncias de seqüência" no mesmo programa. A identidade percentual entre duas seqüências pode ser determinada usando técnicas semelhantes àquelas descritas acima, com ou sem permissão de gaps. No cálculo da identidade percentual, tipicamente, somente emparelhamentos exatos são contados.

Em uma outra concretização, os fragmentos de moléculas de ác. nucléico de Cry2Ax e de Cry2Ax-derivadas são englobadas pela invenção. As moléculas de ác. nucléico que são englobadas possuem pelo menos uma atividade funcional de Cry2Ax (por exemplo, atividade inseticida), têm um comprimento de pelo menos 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, ou 1800 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, e/ou hibridizam sob condições estringentes com a molécula de ác. nucléico que codifica qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260.

Em concretizações onde o fragmento de ác. nucléico da invenção codifica um polipeptideo que engloba qualquer um dos resíduos de aminoácido que correspondem aos resíduos de aminoácido 2, 7, 27, 35, 36, 43, 44, 45, 51, 58, 69, 78, 79, 99, 118, 124, 125, 129, 138, 139, 141, 161, 165, 166, 183, 192, 211, 213, 217, 218, 324, 386, 399, 405, 445, 551, 587, 591, 610, 631 da SEQ ID No:2, tais moléculas de ácidos nucléicos da invenção contêm seqüências codificantes de pelo menos 1, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, ou todos os 40 resíduos de aminoácido do grupo consistindo de H2, S7, Q27, Q35r E36, K43, D44, N4s, D51, A58, Ve9, R78, N79, K99, Tjie, Vj.24, El25/ Rl29/ Nl38, Rl39f A141, Ti62/ Ql65/ Mi 56, Lib3, Il92/ H21I/ ^213/ ^217/ D2I8# ^324 r l3B6f ^399^ S405/ Q445/ Ι551Λ S 587 / 1591 f LêlOí e í<631· Em uma concretização específica, um fragmento da invenção corresponde ao comprimento do ác. nucléico que codifica a pró-toxina processada. Há uma diferença de 5-6 kDa no peso molecular entre a pró-toxina de Cry2 de comprimento completo e a toxina de Cry2 processada. Isto é 0 resultado do fato de que aproximadamente 40 aminoácidos são clivados a partir do polipeptídeo da pró-toxina de Cry2 (Rukmini et al., 2000, Biochimie 82:109-116; Aronson et al., 1993, Mol. Microbiol. 7 : 489-496; Morse et al., 2001, Structure 9:409-17).

Em uma outra concretização especifica, um fragmento da invenção codifica um polipeptídeo que corresponde a um domínio de Cry2.

Em uma outra concretização, é englobada pela invenção uma molécula de ácido nuccléico que hibridiza sob condições estringentes com qualquer uma das SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259. Tais moléculas de ác. nucléico da invenção codificam polipeptídeos que contêm pelo menos 1, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, ou todos os 40 resíduos de aminoácido do grupo consistindo de H2, S7, Q27, Q35, E36, K43, D44, N45, D51, A58, V6g, R78/ N79 f K99, Tii8f V124, E125, Rl29/ N138, R139, Am, T162 f Ql651 Ml66f Lib3, Il92 r H 2n, R213, R217, D218/ V324, 1 386, T399, S405/ Q445 1 1 551 f S587, I591, LeiOf e Ij 6 31 · A frase "condições estringentes" se refere a condições de hibridização sob as quais um ác. nucléico hibridizará com seu ác. nucléico alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucléicos, mas essencialmente com nenhum outro ác. nucléico. As condições estringentes são seqüência-dependente e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Ácidos nucléicos mais longos hibridizam especificamente a altas temperaturas. Guias extensos para a hibridização de ácidos nucléicos podem ser encontrados no estado da técnica (por exemplo, Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "OverView of principies of hybridization and the strategy of ác. nucléico assays" (1993)). Em geral, condições altamente estringentes são selecionadas para serem cerca de 5-10°C mais baixas do que o ponto de fusão térmica (Tm) para o ác. nucléico especifico em um definido pH de força iônica. Condições de baixa estringência são, em geral, selecionadas para serem cerca de 15-30°C abaixo da Tm. A Tm é a temperatura {sob definida força iônica, pH e concentração de ác. nucléico) na qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam com o ác. nucléico alvo no equilíbrio (como os ácidos nucléicos estão presentes em excesso, na Tm, 50% das sondas estão ocupadas no equilíbrio). As condições de hibridização são tipicamente aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,0 M de íon sódio, tipicamente, concentração de íon sódio de cerca de 0,01 a 1,0 M (ou outros sais) no pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotideos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, tal como formamida. Para hibridizaçâo seletiva ou específica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes o background, e preferencialmente 10 vezes a hibridizaçâo com o background. Em uma concretização, condições estringentes incluem pelo menos uma lavagem (usualmente 2) em 0,2X SSC a uma temperatura de pelo menos cerca de 50°C, usualmente cerca de 55°C, ou algumas vezes 60°C ou 65°C, por 20 minutos, ou condições substancialmente equivalentes. Em uma concretização específica, a molécula de ác. nucléico da invenção especificamente hibridiza, em seguida a pelo menos uma lavagem em 0,2X SSC a 55°C por 20 minutos, com um polinucleotídeo codificante de um polipeptídeo de qualquer uma das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260. Em uma outra concretização, as condições estringentes incluem a hibridizaçâo em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45° C seguida por uma ou mais lavagens em 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 50-65°C. A frase "hibridiza especificamente" se refere à ligação, duplicação ou hibridização de uma molécula somente com uma seqüência de nucleotideos particular sob condições estringentes de hibridização quando aquela seqüência está presente em uma mistura complexa (por exemplo, celular total ou biblioteca de DNA ou RNA). São também englobados os vetores compreendendo os ácidos nucléicos da invenção. As células ou plantas compreendendo os vetores da invenção também estão englobadas. O termo "ác. nucléico" ou "molécula de ác. nucléico" aqui se refere a um polímero de simples ou dupla-fita de bases de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotideo lidas a partir da extremidade 5' para a 3'. Ele inclui DNA cromossômico, plasmídeos auto-replicantes e DNA ou RNA que desempenham um papel principalmente estrutural. O termo "codificante" se refere a uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um ou mais aminoácidos. O termo não requer um códon de partida ou de parada. Uma seqüência de aminoácidos pode ser codificada em qualquer um dos seis diferentes quadros de leitura providos por uma seqüência de polinucleotídeo e seu complemento. A Tabela 1 revela as seqüências de Cry2Ax e de Cry2Ax-derivadas e o correspondente número de identidade de seqüência.

Seqüências de Cry2Ax-Derivadas Os polinucleotídeos de Cry2Ax-derivados e ácidos nucléicos da invenção podem ser criados pela introdução de uma ou mais substituições, adições e/ou deleções de nucleotideo na seqüência de nucleotideos de Cry2Ax ou ácidos nucléicos relacionados, de modo que substituições, adições e/ou deleções de um ou mais aminoácidos são introduzidas na proteina codificada. Em geral, as seqüências Cry2Ax-derivadas são criadas de forma a acentuar uma desejável característica ou reduzir uma característica indesejável de um polipeptídeo de Cry2Ax. Em uma concretização, os polipeptídeos Cry2Ax-derivados possuem melhorada atividade inseticida com relação à Cry2Ax, incluindo, mas não estando limitada a, maior potência e/ou faixa aumentada de praga de inseto. Em uma outra concretização, os polipeptídeos Cry2Ax-derivados são expressados melhor do que a Cry2Ax, incluindo, mas naão estando limitado a, meia vida aumentada, menos susceptibilidade à degradação, e/ou transcrição ou tradução mais eficiente.

Em uma concretização, uma molécula de ác. nucléico de Cry2Ax (SEQ ID No:l) é usada como um template para criar nucleotideos Cry2Ax-derivados. Em uma outra concretização, um ác. nucléico relacionado a Cry2Ax é usado como um template para criar nucleotideos Cry2Ax-derivados. Em uma concretização específica, Cry2Ab* é usada como um template. Cry2Ab* possui duas mudanças de aminoácido com relação à Cry2Ab do tipo selvagem (K para R na posição 36 e M para T na posição 241 do No. de Acesso no GenBank M23724). Em uma outra concretização especifica, os clones isolados de uma rodada de alteração podem ser usados como template para posteriores rodadas de alteração (por exemplo, clones 38, 44, e 473R; ver Seções Exemplo 2: Combinação aleatória de DNA para isolar polipeptideos Cry2Ax-derivados e Exemplo 4: Combinação aleatória de DNA para isolar adicionais polipeptideos Cry2Ax-derivados).

As alterações de seqüência podem ser introduzidas por técnicas padrão, tais como técnicas de evolução molecular dirigida, por exemplo, métodos de combinação aleatória de DNA (ver, por exemplo, Christians et al., 1999, Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri et al., 1998, Nature, 391:288-291; Crameri, et al., 1997, Nature Biotechnology 15:436-438; Crameri et al., 1996, Nature Biotechnology 14:315-319; Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; Stemmer et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei., 91:10747-10751; patentes US 5.605.793; US 6.117.679; US 6.132.970; US 5.939.250; US 5.965.408; US 6.171.820; Pedidos de Patente Internacional publicados WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; e WO 01/75767); mutagênese sitio dirigida (ver, por exemplo, Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sei., 82:488-492; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177-183); mutagênese oligonucleotídeo-dirigida (ver, por exemplo, Reidhaar-Olson et al., 1988, Science 241:53-57); mutagênese química (ver, por exemplo, Eckert et al., 1987, Mutat. Res. 178:1-10); PCR de Reparo sujeito a erro (error prone PCR) (ver, por exemplo, Caldwell & Joyce, 1992, PCR Methods Applic. 2:28-33); e mutagênese de cassette (ver, por exemplo, Arkin et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1992, 89:7871-7815); (ver, em geral, por exemplo, Arnold, 1993, Curr. Opinion Biotechnol. 4:450-455; Ling et al., 1997, Anal. Biochem., 254(2):157-78; Dale et al., 1996, Methods Mol. Biol. 57:369-74; Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein et al., 1985, Science, 229:1193-1201; Carter, 1986, Biochem. J. 237:1-7; Kramer et al., 1984, Cell 38:879-887; Wells et al., 1985, Gene 34:315-323; Minshull et al., 1999, Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290) .

Em uma concretização, a combinação aleatória de DNA é usada para criar nucleotideos Cry2Ax-derivados. A cobinação aleatória de DNA pode ser realizada in vitro, in vivo, in silico, ou uma combinação dos mesmos. Podem ser efetuados métodos in silico de recombinação nos quais os algoritmos genéticos são usados em um computador para recombinar cadeias de seqüência {sequence strings) que correspondem a ácidos nucléicos homólogos (ou mesmo não-homólogos). As cadeias de seqüência recombinadas resultantes são opcionalmente convertidas em ácidos nucléicos por sintese de ácidos nucléicos que correspondem às seqüências recombinadas, por exemplo, em harmonia com as técnicas de remontagem de gene por sintese de oligonucleotideos. Esta abordagem pode gerar alterações aleatórias, parcialmente aleatórias ou designadas. Muitos detalhes com respeito à recombinação in silico, incluindo o uso de algoritmos genéticos, operadores genéticos e semelhantes em sistemas de computador, combinados com a geração de correspondentes ácidos nucléicos, assim como as combinações de ácidos nucléicos designados (por exemplo, baseado na seleção de sitio cruzado (cross-over site selection) , bem como os métodos de recombinação designada, pseudo-aleatória ou aleatória estão descritos no estado da técnica (ver, por exemplo, Pedidos de Patente Internacional publicados WO 00/42560 e WO 00/42559).

Em uma outra concretização, a mutagênese com alvo é usada para criar nucleotideos Cry2Ax-derivados por escolha, para alteração, de seqüências de nucleotideo particulares ou posições do Cry2Ax ou de ácidos nucléicos relacionados. Tais mutações por alvo podem ser introduzidas em qualquer posição no ác. nucléico. Por exemplo, pode-se fazer substituições de nucleotideo que levam a substituições de aminoácido em resíduos de aminoácido "não-essencial" ou "essencial". Um resíduo de aminoácido "não-essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da seqüência do tipo selvagem sem alterar a atividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido "essencial" é requerido para pelo menos uma atividade biológica do polipeptídeo. Por exemplo, os resíduos de aminoácido que não são conservados ou são somente semi-conservados entre homólogos de várias espécies pode ser não-essencial para a atividade. Alternativamente, resíduos de aminoácido que são conservados entre os homólogos de várias espécies pode ser essencial para a atividade.

Tais mutações com alvo podem ser conservativas ou não-conservativas. Uma "substituição de aminoácido não-conservativa" é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral não-semelhante. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais semelhantes têm sido definidas no estado da técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagina, glutamina), cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais β-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

Alternativamente ou em adiçào às substituições de resíduo de aminoácido não-conservativas, tais mutações com alvo podem ser conservativas. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. Em seguida à mutagênese, a proteína codificada pode ser expressada recombinantemente e a atividade da proteína pode ser determinada.

Em uma outra concretização, a mutagênese aleatória é usada para criar nucleotídeos Cry2Ax-derivados. As mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo do todo ou de parte da seqüência codificante (por exemplo, por mutagênese de saturação). Em certas concretizações, as seqüências de nucleotídeos codificantes de outros polipeptídeos relacionados que possuam domínios semelhantes, motifs estruturais, sítios ativos, ou que se alinhem com uma porção da Cry2Ax da invenção com emparelhamentos desiguais ou emparelhamentos imperfeitos, podem ser usadas no processo de mutagênese para gerar diversidade de seqüências.

Deve ser entendido que para cada etapa de mutagênese, em alguma das técnicas mencionadas acima, podem ser realizados inúmeros ciclos iterativos de qualquer uma ou de todas as etapas para otimizar a diversidade de seqüências. Os métodos acima descritos podem ser usados em combinação em qualquer ordem desejada. Em muitos casos, os métodos resultam em um conjunto de seqüências de ác. nucléico alteradas ou em um conjunto de células hospedeiras recombinantes compreendendo as seqüências de ác. nucléico alteradas. As seqüências de ác. nucléico alteradas ou células hospedeiras, expressando uma seqüência de ác. nucléico alterada com as características desejadas, podem ser identificadas por meio de screening com um ou mais ensaios conhecidos do estado da técnica. Os ensaios podem ser realizados sob condições que selecionam os polipeptídeos possuindo as características físicas ou químicas desejadas. As alterações na seqüência de ác. nucléico podem ser determinadas por seqüenciamento da molécula de ác. nucléico codificante do polipeptídeo alterado nos clones.

Adicionalmente, as moléculas de ác. nucléico de Cry2Ax e Cry2Ax-derivadas podem ser otimizadas com relação a códon, tanto completamente como em parte. Devido ao fato de que qualquer um aminoácido (exceto para metionina) é codificando por inúmeros códons (Tabea 2), a seqüência do ác. nucléico pode ser mudada sem mudar o aminoácido codificado. A otimização com relação a códon é quando um ou mais códons são alterados no nível de ác. nucléico, de modo que os aminoácidos não são mudados, mas a expressão em um organismo particular é aumentada. Aqueles tendo conhecimento ordinário na técnica reconhecerão que as tabelas e outras referências fornecendo informação de preferência para uma ampla gama de organismos estão disponíveis no estado da técnica. Métodos para Realizar Ensaio de Atividade Inseticida Como aqui usado, o termo "atividade inseticida" se refere à capacidade de um polipeptídeo diminuir ou inibir a alimentação de inseto e/ou aumentar a mortalidade de inseto após a ingestão do polipeptídeo. Apesar de que qualquer inseto pode ser afetado, preferencialmente insetos das ordens de insetos Lepidoptera e Diptera são afetados.

Uma diversidade de ensaios podem ser usados para determinar se um polipeptídeo particular da invenção possui atividade inseticida e, se assim for, a que grau isso acontece. Em geral, para uma praga de inseto é provido um polipeptídeo da invenção em qualquer forma que possa ser ingerido. A reação da praga de inseto à ingestão do polipeptídeo da invenção é observada (por exemplo, por cerca de um a três dias) . Uma diminuição ou inibição de alimentação e/ou aumento na mortalidade da praga de inseto, após a ingestão do polipeptídeo da invenção, são indicadores da atividade inseticida. Ura polipeptídeo da invenção, com atividade inseticida desconhecida, deve ser comparado com um controle positivo e/ou negativo para avaliar mais precisamente o resultado do ensaio.

Em uma concretização, um polipeptídeo da invenção é purificado (tanto em forma solúvel como em forma de cristal) e é adicionado ao regime alimentar do inseto.

Em uma outra concretização, um polipeptídeo da invenção é expressado em um micróbio recombinante (por exemplo, E. coli). 0 micróbio recombinante é alimentado diretamente às pragas de inseto (ver Moellenbeck et al.t 2001, Nat. Biotechnol. 19:668).

Em uma outra concretização, o polipeptídeo da invenção é expressado em uma planta e a planta é alimentada à praga de inseto. Em seguida ao período de incubação, a atividade de alimentação da praga de inseto pode ser determinada por observação visual (por exemplo, da fração aproximada de área de folha remanescente) ou captura por vídeo (por exemplo, número de pixels de uma área de folha remanescente) das partes da planta que normalmente teriam sido comidas pela praga de inseto. Em uma concretização específica, a expressão do polipeptídeo da invenção na planta é transiente. Em tal concretizaçâos, um ác. nucléico codificante de um polipeptídeo da invenção é clonado em um vetor de expressão em planta e transfectado em Agrobacterium tumefaciens. A bactéria transformada é co-cultivada com uma folha de N. benthamiana e, usando infiltração forçada, a folha expressa o polipeptídeo da invenção. Entretanto, a expressão do polipeptídeo é variável entre as co-culturas de folha. Em uma outra concretização específica, a expressão do polipeptídoe da invenção na planta é estável. Em tal concretização, uma planta transgênica é feita para expressar um polipeptídeo da invenção.

Em uma outra concretização, a atividade inseticida de um polipeptídeo da invenção pode ser submetida a ensaio por meio da medição de morte celular e/ou crescimento celular usando células cultivadas. Tais ensaios tipicamente envolvem o uso de células de inseto cultivadas que são susceptíveis à toxina particular que está sendo submetida a screening, ou células que expressam um receptor com relação à toxina particular, tanto naturalmente ou como um resultado de expressão de um gene heterólogo. Assim, em adição às células de inseto, células de mamífero, bacterianas e células de levedura estão entre aquelas células utilizáveis nos ensaios in vitro. Os bioensaios in vitro que medem a toxicidade contra células cultivadas estão descritos no estado da técnica (por exemplo, Johnson, 1994, J. Invertebr. Pathol. 63:123-129).

Em uma outra concretização, a atividade inseticida de um polipeptídeo da invenção pode ser submetida a ensaio por meio da medição da formação de poro em vesículas de membrana epitelial do intestino médio do inseto derivado alvo (Juttner and Ebel, 1998, Biochim. Biophys. Acta 1370:51-63; English et al., 1991, Tnsect Biochem. 21:177-184). Um tal ensaio pode constituir a liberação condicional da toxina de um substrato de ligante ativado a partir do lúmen das vesículas de membrana. Isto requer que o ligante esteja no lado de fora da vesícula. Alternativamente, o cenário inverso pode ser utilizado no caso em que o ligante está no lúmen da vesícula e o substrato pronto para ser ativado está localizado no lado de fora da vesícula. Quanto maior for a atividade da toxina, maior será o número ou tamanho de poros formados. Métodos para Melhorar a Resistência a Inseto em Plantas A presente invenção provê métodos para melhorar a resistência de planta a pragas de inseto, incluindo, mas não estando limitadas a, membros da Helicoverpa ssp. (por exemplo, Helicoverpa Zea) e/ou Spodoptera ssp. (por exemplo, Spodopter exigua) através do uso de polipeptídeos relacionados a Cry2. Qualquer método conhecido no estado da técnica pode ser usado para fazer com que as pragas de inseto ingiram um ou mais polipeptídeos da invenção durante o curso de alimentação na planta. Como tal, a praga de inseto ingerirá quantidades inseticidas de um ou mais polipeptídeos da invenção e podem descontinuar a alimentação na planta. Em algumas concretizações, a praga de inseto é morta pela ingestão de um ou mais polipeptídeos da invenção. Em outras concretizações, as pragas de inseto ficam inibidas ou desencorajadas a se alimentar na planta sem serem mortas.

Em uma concretização, as plantas transgênicas podem ser feitas para expressar um ou mais polipeptídeos da invenção (ver, em geral, Seção Produção de Plantas Transgênicas para os métodos de produção de plantas transgênicas). A planta transgênica pode expressar um ou mais polipeptídeos da invenção em todos os tecidos (por exemplo, expressão global). Alternativamente, um ou mais polipeptídeos da invenção pode ser expressado em somente um subconjunto de tecidos (por exemplo, expressão tecido- especifica), preferencialmente aqueles tecidos consumidos pela praga de inseto. Os polipeptideos da invenção podem ser expressados constitutivamente na planta ou ser expressados sob o controle de um promotor induzivel.

Em uma outra concretização, a composição compreendendo um ou mais polipeptideos da invenção pode ser aplicada externamente à planta susceptível às pragas de inseto. A aplicação externa da composição inclui a aplicação direta à planta, tanto no todo ou em parte, e/ou aplicação indireta, por exemplo, ao meio ambiente que circunda a planta, tal como o solo. A composição pode ser aplicada por qualquer método conhecido do estado da técnica, incluindo, mas não estando limitado a, borrifamento, espalhamento de pó, aspersão ou semelhantes. Em geral, a composição pode ser aplicada em qualquer época durante o crescimento da planta. Aqueles especialistas na técnica podem usar métodos conhecidos no estado da técnica para determinar empiricamente o momento ótimo de administração da composição. Fatores que podem afetar o momento ótimo de administração incluem, mas não estão limitados a, tipo de planta susceptível, tipo de praga de inseto, qual dentre um ou mais polipeptideos da invenção é ou são administrado(s) na composição. A composição compreendendo um ou mais polipeptideos da invenção pode ser polipeptideos substancialmente purificados, uma suspensão de células, um pellet de células, um sobrenadante de células, um extrato de células, ou um complexo de esporo-cristal de células de Bacillus thuringiensis (ver, em geral, Seção Expressão Recombinante para técnicas de síntese de polipeptídeos recombinantes). A composição compreendendo um ou mais polipeptídeos da invenção pode estar na forma de uma solução, de uma emulsão, de ums suspensão ou de um pó. As formulações líquidas podem ser de base aquosa ou não-aquosa e podem ser providas como espumas, géis, suspensões, concentrados emulsificáveis ou semelhantes. As formulações podem incluir agentes em adição ao um ou mais polipeptídeos da invenção. Por exemplo, as composições podem ainda compreender adjuvantes espalhantes-adesivos, agentes de estabilização, outros aditivos de inseticidas, diluentes, agentes que otimizam as propriedades reológicas ou a estabilidade da composição, tais como, tensoativos, emulsificantes, dispersantes ou polímeros.

Em uma outra concretização, os hospedeiros recombinantes que expressam um ou mais polipeptídeos da invenção são aplicados em ou perto de uma planta susceptível de ataque por uma praga de inseto. Os hospedeiros recombinantes incluem, mas não estão limitados a, hospedeiros microbianos e vírus de inseto que tenham sido transformados com e expressam uma ou mais moléculas de ác. nucléico (e, portanto, polipeptídeos) da invenção. Em algumas concretizações, o hospedeiro recombinante secreta o polipeptídeo da invenção em seu meio ambiente circunvizinho de modo a contatar uma praga de inseto. Em outras concretizações, os hospedeiros recombinantes colonizam um ou mais tecidos de planta susceptíveis a infestação por inseto.

Expressão Recombinante As moléculas de ác. nucléico e os polipeptídeos da invenção podem ser expressados recombinantemente usando DNA recombinante padrão e técnicas de clonagem molecular que são bem conhecidas no estado da técnica (por exemplo, Sambrook, Fritsch, e Maniatis, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989). Adicionalmente, as técnicas de DNA recombinante podem ser usadas para criar constructos de ác. nucléico apropriados para uso na produção de plantas transgênicas (ver Seção Produção de Plantas Transqênicas) .

Em consequência, um aspecto da invenção diz respeito a vetores, preferencialmente vetores de expressão, compreendendo uma molécula de ácido nculéico da invenção, ou uma variante da mesma. Como aqui usado, o termo "vetor" se refere a um polinuleotídeo capaz de transportar um outro ác. nucléico ao qual ele tenha sido ligado. Um tipo de vetor é um "plasmideo", o qual se refere a um loop de DNA de dupla-fita circular no qual segmentos adicionais de DNA podem ser introduzidos. Um outro tipo de vetor é um vetor viral em que os segmentos de DNA adicionais podem ser introduzidos no genoma viral.

Certos vetores são capazes de replicaçâo autônoma na célula hospedeira na qual eles foram introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicaçâo e vetores epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores não-epissômicos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira por sua introdução na célula hospedeira, e, por esse meio, são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão, com freqüência, na forma de plasmideos (vetores). Entretanto, a invenção tem a intenção de incluir outras tormas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovirus de replicação defectiva).

Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem uma molécula de ác. nucléico da invenção em uma forma apropriada para a expressão da molécula de ácido nucléico em uma célula hospedeira. Isto significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências de regulação, selecionada com base nas células hospedeiras para serem usadas na expressão, a qual está operacionalmente associada com o polinucleotideo a ser expressado. Dentro de um vetor de expressão recombinante, o termo "operacionalmente associado" tem a intenção de significar o fato de que a seqüência de nucleotideos de interesse está ligada a seqüência(s) de regulação de uma maneira que permite a expressão da seqüência de nucleotideos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo "seqüência de regulação" tem a intenção de incluir promotores, enhancers, e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Tais seqüências de regulação estão descritas no estado da técnica (por exemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymoloqy, 1990, Academic Press, San Diego, CA). As seqüências de regulação incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotideos em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que dirigem a expressão direta de seqüência de nucleotideos somente em certas células hospedeiras (por exemplo, seqüências de regulação tecido-específicas). Será considerado por aqueles especialistas na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores tais como: a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão da proteína desejada, a área do organismo no qual a expressão é desejada, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos nas células hospedeiras para, por esse meio, produzir proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados por moléculas de ác. nucléico como aqui descritas.

Em algumas concretizações, os ácidos nucléicos isolados, que servem como elementos de promotor ou de enhancer, podem ser introduzidos na posição apropriada (geralmente a montante) de uma forma não-heteróloga de um polinucleotídeo da presente invenção de modo a regular, a montante ou a jusante, a expressão de um polinucleotídeo da invenção. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados por mutação, deleção e/ou substituição in vivo (ver, patente US 5.565.350; Pedido de Patente Internacional No. PCT/US93/03868), ou promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula de planta na orientação e distância própria a partir de um gene cognato de um polinucleotídeo da presente invenção de modo a controlar a expressão do gene. A expressão de gene pode ser modulada sob condições apropriadas para o crescimento da planta de modo a alterar a composição dos polipeptideos da presente invenção na célula de planta. Assim, a presente invenção provê composições e métodos para produzir promotores e/ou enhancers heterólogos operacionalmente ligados a uma forma natural endógena (ou seja, não-heteróloga) de um polinucleotideo da presente invenção.

Se for desejada a expressão do polipeptideo, em geral, é desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade-3' de uma região codificante de polinucleotideo. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes de planta, ou do T-DNA. A seqüência da extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada de, por exemplo, genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de um outro gene de planta, ou menos preferencialmente de outro gene eucariótico.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser desenhados para expressão de um polipeptideo da invenção em células procarióticas (por exemplo, Enterobacteriaceae, tal como Escherichia; Bacillaceae; Rhizoboceae, tal como Rhizobium e Rhizobacter; Spirillaceae, tal como fotobactéria; Zymomonas; Serratia; Aeromonas; Vibrio; Desulfovibrio; Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tal como Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraceae e Nitrobacteraceae) ou células eucarióticas (por exemplo, células de inseto usando vetores de expressão em baculovirus, células de levedura, células de planta, ou células de mamífero) (ver Goeddel, acima mencionado, para uma discussão sobre células de hospedeiro apropriadas). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo, usando as seqüências de regulação do promotor T7 e polimerase de T7. A expressão de proteínas em procariotes é mais freqüentemente realizada em E. coli com vetores compreendendo promotores constitutivos ou induzíveis que dirigem a expressão tanto de proteínas de fusão como de proteínas de não-fusão. Os vetores de fusão adicionam uma quantidade de aminoácidos à proteína codificada neles, usualmente no terminal amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão tipicamente servem para pelo menos três propósitos: 1) para aumentar a expressão da proteína recombinante; 2) para aumentar a solubilidade da proteína recombinante; e/ou 3) para ajudar na purificação da proteína recombinante para atuar como um ligante em purificação de afinidade. Freqüentemente, em vetores de expressão de fusão, é introduzido um sítio de divagem proteolítica na junção do componente de fusão com a proteína recombinante para possibilitar a separação da proteína recombinante do componente de fusão, subsequentemente à purificação da proteína de fusão. Tais enzimas, e suas seqüências de reconhecimento de cognato, incluem o Fator Xa, a trombina e a enteroquinase. Vetores típicos de expressão de fusão incluem pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith e Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ) os quais fundem glutationa S-transferase (GST), proteína de ligação a maltose E, ou proteína A, respectivamente, à proteína recombinante alvo.

Em uma outra concretização, o vetor de expressão é um vetor de expressão em levadura. Exemplos de vetores de expressão em levedura S. cerevisiae incluem pYepSecl (Baldari et al., 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA), e pPicZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA).

Alternativamente, o vetor de expressão é um vetor de expressão em baculovirus. Vetores de baculovirus disponíveis para expressão de proteínas em células de inseto cultivadas {por exemplo, células Sf 9) incluem a série pAc (Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e a série pVL (Lucklow and Summers, 1989, Virology 170:31-39).

Ainda em outra concretização, um ác. nucléico da invenção é expressado em células de planta usando um vetor de expressão em planta, incluindo, mas não estando limitado a, vetores de expressão de vírus de mosaico de tabaco e de vírus de batata.

Outros sistemas de expressão apropriados tanto para células procarióticas quanto para células eucarióticas são conhecidos do estado da técnica (ver, por exemplo, capítulos 16 e 17 de Sambrook et al. 1990, Molecular Cloninq, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) .

Inúmeros promotores podem ser usados na prática da invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucléicos podem ser combinados com promotores constitutivos, tecido-específicos, induzíveis ou outros promotores para a expressão no organismo hospedeiro.

Um "promotor tecido-específico" pode dirigir a expressão de ácidos nucléicos da presente invenção em um tecido, órgão ou tipo especifico de célula. Os promotores tecido-específicos podem ser induzíveis. Semelhantemente, os promotores tecido-específicos podem somente promover a transcrição dentro de quadro de tempo ou estágio de desenvolvimento dentro daquele tecido. Outros promotores específicos de tecido podem ser ativados através do ciclo de vida de um tecido particular. Aqueles especialistas na técnica saberão reconhecer que um promotor tecido- específico pode dirigir a expressão de seqüências operacionalmente ligadas em tecidos diferentes do tecido alvo. Assim, como aqui usado, um promotor tecido-específico é aquele que dirige a expressão preferencialmente no tecido ou tipo de célula alvo, mas pode também levar igualmente a alguma expressão em outros tecidos. Inúmeros promotores tecido-específicos podem ser usados na presente invenção. Com o promotor apropriado, qualquer órgão pode ser o alvo, tal como órgãos/estruturas vegetativas de brotação (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raízes, flores e órgãos/estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteras e óvulos), sementes (incluindo embrião, endosperma e capa de semente) e fruto. Por exemplo, promotores que dirigem a expressão de ácidos nucléicos em folhas, raizes ou flores são utilizáveis no melhoramento de resistência a pragas que infectam esses órgãos. Para a expressão de um polinucleotideo da presente invenção nos órgãos vegetativos aéreos de uma planta, podem ser usados promotores órgão-especificos fotossintéticos, tais como RBCS (Khoudi et al., Gene 197 :343, 1997). A expressão raiz-específica de polinucleotídeos da presente invenção pode ser alcançada sob o controle de um promotor raiz-especifico, tal como, por exemplo, o promotor do gene ANR1 (Zhang e Forde, Science, 279:407, 1998). Outros promotores exemplificativos incluem o gene da glutamina sintetase raiz-especifico oriundo de soja {Hirel et al., 1992, Plant Molecular Biology 20:207-218) e o elemento de controle raiz-especifico no gene GRP 1.8 de feijão francês (Keller et al., 1991, The Plant Cell 3:1051-1061).

Um "promotor constitutivo" é definido como um promotor que dirigirá a expressão de um gene em todos os tecidos e é ativo sob a maioria das condições e estados ambientais de desenvolvimento ou de diferenciação de células. Exemplos de promotores constitutivos incluem a região de iniciação de transcrição do 35S do vírus de mosaico de couve-flor (CaMV), o promotor 1'- ou 2' -derivado de T-DNA de Agrobacterium tumafaciens, e outras regiões de iniciação de transcrição de vários genes de planta conhecidos daqueles especialistas na técnica. Alguns genes incluem, por exemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang et al. 1996, Plant Mol. Biol. 33:125-139), Cat3 de Arabidopsis (No. De Acesso no GenBank U43147, Zhong et al., 1996, Mol. Gen. Genet. 251:196-203), o gene codificante da desaturase da proteína veiculo de estearoil-acila de Brassica napus (No. de Acesso no Genbank X74782, Solocombe et ai. 1994, Plant Physiol. 104:1167-1176), GPcl de milho {No. de Acesso no GenBank X15596, Martinez et al., 1989, J. Mol. Biol. 208:551-565), e Gpc2 de milho {No. De Acesso no GenBank U45855, Manjunath et al., 1997, Plant Mol. Biol. 33:97-112). Qualquer promotor constitutivo forte, tal como o promotor 35S do CaMV, pode ser usado para a expressão de polinucleotideos da presente invenção em toda a planta. O termo "promotor induzível" se refere a um promotor que está sob o controle preciso do meio ambiente ou do desenvolvimento. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induziveis incluem as condições anaeróbias, temperatura elevada, presença de luz ou aspersão com produtos quimicos/hormônios.

Promotores constitutivos apropriados para uso em uma célula hospedeira de planta, por exemplo, o promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos relacionados (Pedido de Patente Internacional publicado WO 99/43838 e patente US 6.072.050); o promotor 35S de núcleo do CaMV (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812); actina da arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723- 2730); promotor ALS (patnete US 5.659.026) e semelhantes (por exemplo, patentes US 5.608.149; US 5.608.144; US 5.604.121; US 5.569.597; US 5.466.785; US 5.399.680; US 5.268.463; US 5.608.142; e US 6.177.611).

Um outro aspecto da invenção diz respeito a células hospedeiras dentro das quais um vetor de expressão recombinante da invenção tenha sido introduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são aqui usados intercambiavelmente. É entendido que tais termos se referem não somente à célula objeto particular, mas também à progênie ou à potencial progênie de uma tal célula. Em razão de certas modificações poderem ocorrer em gerações que se sucedem, devido tanto a mutações como a influências do meio ambiente, tais progênies podem, de fato, não ser idênticas à célula parental, mas ainda estão incluídas no escopo do termo como aqui usado.

Conseqüentemente, a presente invenção provê uma célula hospedeira tendo um vetor de expressão que compreende um ác. nucléico da invenção, ou uma variante do mesmo. Uma célula hospedeira pode ser qualquer uma célula procariótica (por exemplo, E. coli, Bacillus thuringiensis) ou célula eucariótica (por exemplo, células de inseto, células de levedura ou de planta). A invenção também provê um método para expressar um ác. nucléico da invenção, produzindo, assim, o polipeptídeo codificado, compreendendo as etapas de: i) cultivo de uma célula compreendendo uma molécula de ác. nucléico da invenção sob condições que permitam a produção do polipeptídeo codificado; e ii) isolamento do polipeptídeo expressado. 0 DNA do vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas via transformação convencional ou técnicas de transfecção. Como aqui usado, os termos "transformação" e "transfecção" têm a intenção de se referir a uma diversidade de técnicas reconhecidas no estado da arte para introduzir moléculas de ác. nucléico estrangeiro em uma célula hospedeira, incluindo, co-precipitaçào com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção DEAE-dextrana-mediada, lipofecção, ou electroporação. Os métodos apropriados para transformar ou transfectar células hospedeiras podem ser encontradas no estado da técnica (por exemplo, Sambrook, et al. acima mencionado).

Produção de Plantas Transqênicas Qualquer método conhecido no estado da técnica pode ser usado para transformar uma planta ou célula de planta com uma molécula de ác. nucléico da presente invenção. As moléculas de ác. nucléico podem ser incorporadas no DNA de planta (por exemplo, DNA genômico ou DNA de cloroplasto) ou serem mantidas sem inserção no DNA de planta (por exemplo, através do uso de cromossomos artificiais). Métodos apropriados para introduzir moléculas de ác. nucléico em células de planta incluem microinjeção (Crossway et al., 1986, Biotechniques 4:320-334); electroporação (Riggs et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. 83:5602-5606; D'Halluin et al., 1992, Plant Cell 4:1495-1505); transformação Agrobacterium-mediada (patentes US 5.563.055 e US 5.981.840, Osjoda et al., 1996, Na ture Biotechnology 14:745-750; Horsch et al., 1984, Science 233:496-498, Fraley et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. 80:4803, e Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed., Springer-Verlag, Berlin 1995); transferência direta de gene (Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3:2717-2722); aceleração balística de partícula (patentes US 4.945.050; US 5.879.918; US 5.886.244; US 5.932.782; Tomes et al., 1995, "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips, Springer-Verlag, Berlin; e McCabe et al., 1988, Biotechnology 6:923-926); transformação vírus-mediada (patentes US 5.889.191, US 5.889.190, US 5.866.785, US 5.589.367 e US 5.316.931); transformação por pólen (De Wet et al., 1985, em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al., Longman, New York, pp. 197-209); transformação por Lee 1 (Pedido de Patente US Ser. No. 09/435.054; Pedido de Patente Internacional publicado WO 00/28058); transformação mediada por sonda (whisker-mediated transformation) (Kaeppler et al., 1990, Plant Cell Reports 9:415-418; Kaeppler et al., 1992, Theor. Appl. Genet. 84:560-566); e tecnologia de transformação de cloroplasto (Bogorad, 2000, Trends In Biotechnology 18: 257-263; Ramesh et al., 2004, Methods Mol Biol. 274:301-7; Hou et al., 2003, Transgenic Res. 12:111-4; Kindle et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. 88:1721-5; Bateman e Purton, 2000, Mol Gen Genet. 263:404-10; Sidorov et al., 1999, Plant J. 19:209-216). A escolha dos protocolos de transformação usados para gerar plantas e células de planta transgênicas pode variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, ou seja, monocotiledônea ou dicotiledônea, alvo para a transformação. Exemplos de protocolos de transformação particularmente apropriados para um tipo de planta particular incluem aqueles para: batata (Tu et al., 1998, Plant Molecular Biology 37:829-838; Chong et al., 2000, Transgenic Research 9:71-78); soja (Christou et al., 1988, Plant Physiol. 87:671-674; McCabe et al., 1988, BioTechnology 6:923-926; Finer e McMullen, 1991, In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182; Singh et al., 1998, Theor. Appl. Genet. 96:319-324); milho (Klein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. 85:4305-4309; Klein et al., 1988, Biotechnology 6:559-563; Klein et al., 1988, Plant Physiol. 91:440-444; Fromm et al., 1990, Biotechnology 8:833-839; Tomes et al., 1995, "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," em Plant Cell, Tissue, and Orqan Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin)); cereais (Hooykaas-Van Slogteren et al., 1984, Nature 311:763-764; patente US 5.736.369) .

Em algumas concretizações, mais do que um constructo é usado para transformação na geração de plantas ou células de planta transgênicas. Constructos múltiplos podem estar incluídos em posições cis ou trans. Em concretizações preferidas, cada constructo possui um promotor e outras seqüências de regulação.

As células de planta transformadas que são derivadas por qualquer uma das técnicas de transformação acima mencionadas podem ser cultivadas para regenerar uma planta completa que possua o genótipo transformado e, assim, o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente contam com um marcador de biocida e/ou herbicida que tenha sido introduzido juntamente com as seqüências de nucleotideos desejadas. A regeneração de planta a partir de protoplastos cultivados está descrita no estado da técnica (por exemplo, Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985). A regeneração também pode ser obtida a partir de calo, explantes, órgãos de planta ou partes dos mesmos. Tais técnicas de regeneração também estão descritas no estado da técnica (por exemplo, Klee et al. 1987, Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486). 0 termo "planta" inclui plantas completas, órgãos/estruturas vegetativos de brotação (por exemplo, folhas, caules e tubérculos), raizes, flores, e órgãos/estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteras e óvulos), sementes (incluindo embrião, endosperma, e capa de semente) e fruto (o ovário maduro), tecido de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido de solo, e semelhantes) e células (por exemplo, células guarda, células ovo, tricomas e semelhantes), e progênie das mesmas. A classe de plantas que pode ser usada nos métodos da presente invenção inclui a classe de plantas superiores e inferiores receptivas a técnicas de transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, fetos, e algas multicelulares. As plantas de uma diversidade de niveis de plóides, incluindo aneuplóides, poliplóides, diplóides, haplóides e plantas hemizigotas também estão incluídas.

As moléculas de ác. nucléico da invenção podem ser usadas para conferir caracteres desejados essencialmente em qualquer planta. Assim, a invenção tem uso em uma ampla gama de plantas, incluindo espécies dos gêneros Agrotis, Allium, Ananas, Anacardium, Apium, Arachis, Asparagus, Athamantha, Atropa, Avena, Bambusa, Beta, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Carica, Ceratonia. Cicer, Chenopodium, Chicorium, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Coix, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eliusine, Euphorbia, Festuca, Ficus, Fragaria, Geranium, Glycine, Graminae, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hibiscus, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lathyrus, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lupinus, Lycopersicon, Macadamia, Macrophylla, Malus, Mangifera, Manihot, Majorana, Medicago, Musa, Narcissus, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Olea, Olyreae, Oryza, Panicum, Panicum, Panieum, Pannisetum, Pennisetum, Petunia, Pelargonium, Persea, Pharoideae, Phaseolus, Phleum, Picea, Poa, Pinus, Pistachia, Pisum, Populus, Pseudotsuga, Pyrus, Prunus, Pseutotsuga, Psidium, Quercus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricirtus, Rhododendron, Rosa, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sequoia, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobromus, Trigonella, Trifolium, Trigonella, Triticum, Tsuga, Tulipa, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea.

Em concretizações especificas, as plantas transgênicas são plantas de milho, batata, arroz, soja ou algodão.

As plantas transgênicas podem ser crescidas e polinizadas tanto com a mesma linhagem da planta transformada como com linhagens diferentes. Duas ou mais gerações de plantas podem ser crescidas para assegurar que a expressão da molécula de ác. nucléico desejada, polipeptideos e/ou características fenotípicas sejam estavelmente mantidas e herdadas. Aqueles especialistas na técnica saberão reconhecer que após a molécula de ác. nucléico da presente invenção ser estavelmente incorporada em plantas transgênicas, e ser confirmado que ela é operável, ela pode ser introduzida em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer uma de inúmeras técnicas de melhoramento padrão pode ser usada, dependendo da espécie a ser cruzada.

Determinação de Expressão em Plantas Transgênicas Qualquer método conhecido no estado da técnica pode ser usado para determinar, em uma planta, o nível de expressão de uma molécula de ác. nucléico da invenção ou polipeptídeo codificado por ela. Por exemplo, o nível de expressão em uma planta de um polipeptídeo codificado por uma molécula de ác. nucléico da invenção pode ser determinado por imunoensaio, eletroforese em gel quantitativa, etc. Adicionalmente, o nível de expressão em uma planta de um polipeptídeo codificado por uma molécula de ác. nucléico da invenção pode ser determinado pelo grau até o qual o fenótipo de planta é alterado. Em uma concretização específica, a resistência a inseto melhorada é o fenótipo a ser buscado pelo ensaio.

Como aqui usado, o termo "resistência a inseto melhorada" se refere à resistência melhorada de uma planta transgênica expressando um polipeptídeo da invenção com relação ao consumo e/ou infestação por uma praga de inseto em comparação com uma planta que não expressa um polipeptídeo da invenção. Resistência melhorada pode ser medida por inúmeras maneiras. Em uma concretização, a resistência melhorada é medida pela diminuição do dano a uma planta que expressa um polipeptídeo da invenção em comparação com uma planta que não expressa um polipeptídeo da invenção. 0 dano pelo inseto pode ser avaliado visualmente. Por exemplo, em plantas de algodão, o dano após infestação pode ser medido pelo exame direto das cápsulas da planta de algodão para os sinais de consumo pelos insetos. Em uma outra concretização, a resistência melhorada é medida pela produtividade aumentada da cultura oriunda de uma planta que expressa um polipeptídeo da invenção em comparação com uma planta que não expressa um polipeptídeo da invenção após o mesmo período de incubação de inseto. Em concretizações particulares, as pragas de inseto são das ordens Lepidoptera e/ou Diptera.

As determinações podem ser feitas usando plantas completas, tecidos das mesmas ou cultura de célula de planta. A Listagem de Seqüências, que é de 0,97 MB e foi criada em 24 de fevereiro de 2005, tendo sido submetida às autoridades do PCT na Fase Internacional, é aqui incorporada a titulo de referência em sua totalidade.

Os teores de todos os artigos publicados, livros, manuais de referência e resumos aqui citados são, por esse meio, incorporados a título de referência em sua totalidade para descrever mais completamente o estado da técnica ao qual a invenção diz respeito.

Como podem ser feitas várias mudanças na matéria objeto acima descrita, sem se afastar do escopo e espírito da presente invenção, tem-se a intenção de que toda matéria objeto contida na descrição acima, e/ou definida nas reivindicações que acompanham esta descrição, seja interpretada como descritiva e ilustrativa da presente invenção. Modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos providos acima.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Screening Primário de Inseto 0 screening primário de inseto identificou culturas de Bt a partir de uma coleção de biodiversidade tendo atividade contra Helicoverpa spp. 0 screening foi conduzido com amostras complexas de esporo-cristal em uma alta dosagem contra larvas neonatas de Helicoverpa zea.

As amostras complexas de esporo-cristal foram preparadas em placas de produção de poço-profundo contendo 1 ml de meio de esporulação CYS (Yamamoto, 1990, Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis 432:46-60). As placas de produção foram incoculadas com 10 pl de culturas de semente que haviam sido mantidas congeladas a -80°C e incubadas a 30°C, 350 rpm por 3 dias até que a maioria das culturas esporulasse e liberasse esporos e cristais livres. As placas foram centrifugadas a 4000 rpm, por 40 minutos para precipitar os esporos, cristais e células não-lisadas. O complexo esporo-cristal precipitado foi suspenso em 1,2 ml de acetato de potássio 15 mM contendo 100 pg de lisozima e incubado a 30°C, 250 rpm por 16 h para assegurar completa esporulação e lise de células. Após as 16 horas de incubação, o complexo esporo-cristal foi coletado por centrifugação e suspenso em acetato de potássio 15 mM. Esta etapa de acetato de potássio foi repetida uma vez. A suspensão final de esporo-cristal foi feita em 1 ml de acetato de potássio 15 mM e usada para realizar o screening com relação à atividade de H. zea. 0 screening de inseto foi feito em placas rasas de 96 poços contendo 150 μΐ de dieta artificial de inseto em cada poço. Foram colocados 20 μΐ de suspensão de esporo-cristal na comida do inseto. Cerca de 5 larvas neonatas foram colocadas em cada poço. As placas de ensaio de inseto foram incubadas a 29°C por 3 dias. As respostas dos insetos aos cristais de Bt incluiram inibição de alimentação e mortalidade. Cerca de 400 culturas mostraram substancial mortalidade e foram, portanto, identificadas como positivas. O Cry2Ax estava entre os positivos.

Exemplo 2: Combinação Aleatória de DNA para Isolar Polipeptídeos Cry2Ax-derivados Começando com o polipeptideo Cry2Ax (SEQ ID No:2) e com o polipeptideo Cry2Ab* (Cry2Ab* tem 2 mudanças com relação ao tipo selvagem Cry2Ab; K para R na posição 36 e M para T na posição 241 do No. de Acesso no GenBank M23724), foram criados templates sintéticos de DNA para a combinação aleatória de DNA. Usando uma comparação filogenética de Cry2Ab (No. de Acesso no GenBank M23724) e de Cry2Ax (SEQ ID No:2) foi criada uma biblioteca que variou as 40 posições de aminoácido (ver Seção Polipeptídeos da Invenção) que fossem diferentes entre essas seqüências de polipeptideo. As bibliotecas de DNA combinadas aleatoriamente foram criadas usando combinação aleatória dirigida por oligonucleotideo com o gene sintético codificante de Cry2Ax atuando como um template de DNA parental. As bibliotecas de DNA por PCR foram clonadas no pMAXY3219 pela substituição do gene de Cry2Ab*. Os clones de toxina foram construídos de modo que eles fossem expressados como uma fusão com a proteína de ligação a maltose de E. coli (MBP) . O screening primário de inseto identificou culturas ativas contra Helicoverpa spp. O screening foi conduzido pela incorporação de uma pequena quantidade de cultura de E. coli expressando a fusão do polipeptideo MBP::Cry2Ax-derivado em uma baixa dosagem na comida artificial seguido pela infestação com larvas de H. zea. O screening foi feito em placas de 96-poços profundos contendo 150 μΐ de comida artificial de inseto em cada poço. Foi incorporado ~0,5 μΐ de cultura expressando a fusão de polipeptideo MBP::Cry2Ax-derivado à comida do inseto. Cerca de 5 larvas neonatas de H. zea foram colocadas em cada poço. As placas de ensaio de inseto foram incubadas a 29°C por 4 dias. As respostas do inseto às amostras de E, coli incluiram inibição de alimentação e mortalidade. Aquelas amostras que causaram grave interrupção de crescimento ou morte das larvas foram re-arranjadas para posterior análise. 0 screening desta biblioteca de primeira rodada levou à descoberta de diversos clones com atividade inseticida melhorada com relação a Cry2Ax e Cry2Ab*. Em particular, foi descoberto que os clones 38 (D_S00503480) (SEQ ID No:4) e 44 (D_S00503970) (SEQ ID No:6) são altamente ativos quando expressados (dados não mostrados). Esses clones foram, portanto, escolhidos para uma subseqüente rodada de combinação aleatória de DNA.

Para a combinação aleatória da segunda rodada, os templates de DNA parental oriundos dos clones 38 (D_S 00503480) (SEQ ID No:4) e 44 (D_S00503970) (SEQ ID No: 6) foram amplificados por PCR na presença de uracil e depois fragmentados com uracil N-glicosilase. Os templates fragmentados foram depois misturados e remontados antes que os templates recombinantes fossem amplificados por PCR. Uma biblioteca desses templates aleatoriamente combinados foi criada em pMAXY3219 como descrito acima. A seqüência de alguns dos clones isolados da primeira e segunda rodadas de combinação aleatória é mostrada na Tabela 3 indicando os resíduos de aminoácido que foram mudados.

De modo a diversificar posteriormente um dos acertos de topo da realização da 2a Rodada, o clone 473R (D_S01037677) (SEQ ID No:18), os primeiros 46 resíduos de aminoácido na região amino-terminal do polipeptídeo foi modificada para conter resíduos encontrados nas oito diferentes seqiiências de polipeptideo de Cry2 (ou seja, Cry2Aa, Cry2Ab, Cry2Ac, Cry2Ad, Cry2Ae, Cry2Af, Cry2Ag, e Cry2Ax) . Adicionalmente, dois resíduos, 113 e D15, foram substituídos pelos resíduos conservativos valina e glutamato, respectivamente (ver Tabela 4) . 0 clone modificado foi denominado clone 473N (SEQ ID No:8).

Exemplo 3: Atividade dos polipeptldeos Cry2Ax-derivados 0 screening das atividades dos clones aleatoriamente combinados foi realizado em diversos estágios. Inicialmente os clones foram submetidos a screening com relação à alta atividade inseticida pelo provimento de uma pequena quantidade de E. coli expressando uma proteína de fusão do clone na comida artificial para as larvas de H. zea de primeiro instar. Foram escolhidos os clones que causam tanto a morte completa como a interrupção completa de crescimento das lavas para posterior estudo. Aqueles clones que demonstraram alta atividade inseticida foram depois usados para criar uma nova biblioteca em um vetor de expressão em Agrobacterium tumefaciens. A biblioteca foi submetida a screening por co-cultivo de cada clone em quatro replicados com folhas de N. benthamiana (usando infiltração forçada de cada respectiva cultura), e depois a alimentação de cada disco correspondente a uma única larva de H. zea de 3o instar. Em seguida a um periodo de 24 horas de incubação, a atividade de alimentação foi determinada por observação visual e expressa como uma fração aproximada de área de folha remanescente.

Os clones que passaram por uma adicional repetição dos ensaios de expressão em E. coli/incorporação à dieta foram re-clonados individualmente no vetor de expressão de planta pMAXY4384 e testado com relação à eficácia in planta como descrito acima. Uma avaliação final da atividade in planta dos melhores acertos oriundos do ensaio multi-enfileirado de expressão em E. coli e a abordagem da biblioteca de planta é mostrada na Figura 1. A partir desta análise, diversos clones pareceram ter atividade inseticida aumentada incluindo ο 7K (D_S01000779) (SEQ ID No:10), 15K (D_S 00999080) (SEQ ID No:12), 16K (D_S01000269) (SEQ ID No: 14} , 16R (D_S01037143) (SEQ ID No:16), e 473R (D_S01037677) (SEQ ID No:18).

Exemplo 4: Combinação Aleatória de DNA para Isolar Adicionais Polipeptídeos Cry2Ax-derivados Os clones 44 (D_S 00503970} (SEQ ID No:6), 473R (D_S01037 677) (SEQ ID No: 18) os quais foram os acertos da combinação aleatória da Ia e 2a rodadas, como descrito na Seção "Combinação Aleatória de DNA para Isolar Polipeptídeos Cry2Ax-derivados", e Cry2Ab* foram usados como templates para adicional combinação aleatória. Usando esses templates e combinação aleatória dirigida por oligonucleotídeo, foram criados polipeptídeos derivados tendo diversidade de aminoácidos a partir dos polipeptídeos Cry2 do tipo selvagem (ou seja, Cry2Ae e Cry2Ag) assim como as substituições de aminoácido conservativas aleatórias geradas por computador e substituições aleatórias dentro dos segmentos de certas regiões de loop estrutural. As bibliotecas de DNA aleatoriamente combinadas foram clonadas em pMAXY3219 por substituição do gene Cry2Ab*. Os clones de toxina foram construídos de maneira que eles fossem expressados como uma fusão à proteína de ligação de maltose (MBP) de E. coli. Um resumo das seqüências isoladas é mostrado nas Tabelas 5-7.

Exemplo 5: Atividade de Polipeptídeos Adicionais Cry2Ax-derivados De modo a avaliar a atividade dos polipeptídeos derivados de combinações aleatórias contra a praga de algodão Helicoverpa zea, foi realizado screening de alta produção (high throughput screening) usando regime alimentar artificial contendo células completas de E. coli expressando uma proteína de fusão de clone como descrito acima. Os clones tendo um alto nível de atividade foram posteriormente testados com relação à atividade in planta para confirmar que as mudanças feitas em cada polipeptídeo derivado não acarretaram impacto negativo na expressão do gene ou acumulação de proteínas em células de planta. Para iniciar esse processo, cada polipeptídeo foi clonado em um vetor de expressão em planta baseado em Agrobacterium tumefaciens, transformado na cepa do hospedeiro Agrobacterium e então disposto em placas de microtitulação. Os acertos foram depois submetidos a screening por meio de co-cultivo de cada um em quatro replicados com folhas de N. benthamiana (usando infiltração forçada de cada respectiva cultura), seguida pela alimentação de cada placa correspondente a uma única larva de H. zea de 3o instar. Em seguida a um período de incubação de 24 horas, a atividade de alimentação em cada placa foi determinada por captura visual e método de análise como descrito acima. Alguns polipeptídeos derivados deste processo eram melhorados em comparação com os clones parentais. Um tal clone é o D_S01764701 (SEQ ID No:134) que mostrou atividade melhorada com relação ao clone 44. Os resultados do ensaio de alimentação estão mostrados para três experimentos na Figura 2.

Exemplo 6: Plantas Transgênicas Expressando o Clone 44 Plantas de tabaco transgênicas expressando o clone 44 (D_S00503970) foram geradas por transformação Agrrojbacterium-mediada com seleção por glifosato usando os vetores binários pMAXY5469 e pMAXY5471. Esses vetores contêm um gene GAT dirigido por dSVBV e um clone 4 4 da molécula de ác. nucléico do clone 44 dirigido por dMMV (SEQ ID No:5). 0 pMAXY5469 difere do pMAXY5471 pelo fato de que ele contém um sinal de alvo de plastídeo fundido à região codificante do clone 44 de modo que esta variante de toxina será acumulada no compartimento de plastídeo. Aproximadamente 25 transformantes foram gerados para cada constructo. Os discos de folha expressando o clone 44 foram colocados em um leito de agar em uma bandeja de titulação de 48 poços e depois infestados com larvas de Helicoverpa zea de 3 o instar ou larvas de Spodoptera exígua de 4 o instar. As folhas foram incubadas por 24 horas com os vermes e então as larvas que foram posteriormente removidas, e a folha remanescente foi observada com equipamento de captura de vídeo para o cálculo real da área relativa de folha remanescente (número de pixels). Os resultados usando os transformantes de topo para cada vetor são mostrados na Figura 3A para a H. zea e Figura 3B para a S. exígua. Cada planta transgênica tinha 6 discos de folha tomados para análise, como mostrado. A expressão do então polipeptideo do clone 44 em plantas de tabaco transgênicas no plastídeo (Figura 4A) ou no compartimento citoplásmico (Figura 4B) foi avaliada por western blot usando um anticorpo policlonal dirigido para o polipeptideo do clone 44. Os números dos canais na Figura 4 correspondem aos números de planta na Figura 3. 0 anticorpo policlonal usado no western blot foi preparado pela imunização de galinhas com o polipeptideo do clone 44 truncado de tripsina purificado e depois pela purificação dos anticorpos específicos de Cry2 usando uma coluna de afinidade feita com o polipeptideo do clone 44 truncado de tripsina como substrato. A diferença mais óbvia entre os dois tipos de plantas transgênicas é que a inibição de S. exígua é muito maior para a toxina de plastídeo-acumulada (comparar os painéis da direita e da esquerda da Figura 3B) . Esses dados em conjugação com os dados de expressão (Figura 4), mostrando que as plantas que abrigam o T-DNA derivado de 5469 (Figura 4A), são capazes de produzir muito mais toxina do que aquelas do 5471 (Figura 4B) .

Tabela 1: Seqüências de Cry2Ax e de Cry2Ax-derivadas Tabela 2: Tabela de Códon Tabela 3: Seqüência de Clones de Interesse Isolados de Combinação Aleatória de DNA

Tabela 4: Comparação de Seqüências de Polipeptídeos de Cry2 do tipo selvagem com o clone 473N

Tabela 5: Seqüência de clones de interesse isolada de combinação aleatória de DNA usando Cry2Ab* como parental REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de que consiste da SEQ ID NO: 7.

2. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1.

3. Vetor de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é um vetor de expressão.

4. Polipeptideo isolado, caracterizado pelo fato de que consiste da SEQ ID NO: 8.

5. Polipeptideo isolado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo tem atividade inseticida.

6. Polipeptideo isolado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que Lepidoptera é suscetível à atividade inseticida do polipeptideo.

7. Método de produção de planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) introduzir, em uma célula de planta, um transgênie que expressa: i) um polipeptideo da SEQ ID NO: 8; ou ii) uma molécula de ácido nucléico da SEQ ID NO: 7; b) cultivar a célula de planta transgênica sob condições de crescimento de planta; e c) regenerar a planta transgênica a partir da referida célula de planta transgênica.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de gue a planta é selecionada do grupo consistindo de milho, soja, batata e algodão.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de gue a planta transgênica apresenta resistência aumentada a uma peste de insetos, quando comparada a uma planta que não é transgênica.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que Lepidoptera é a peste de insetos.

11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptideo da SEQ ID NO: 8 e um agente, em que o agente é selecionado do grupo consistindo de adjuvantes de espalhamento e aderência, agentes de estabilização, agentes inseticidas, diluentes, tensoativos, emulsificantes e dispersantes.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a composição compreende ainda células procarióticas.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que as células encontram-se integrais ou lisadas.

14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizada pelo fato de que as células encontram-se em suspensão ou dispersas.

15. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o polipeptideo é purificado.

16. Método para o aumento da resistência a insetos em plantas transgênicas, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir, na referida planta, um transgênie que expressa (a) um polipeptideo como definido na reivindicação 4, ou (b) uma molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 1.