JP4818252B2 - ＢａｃｉｌｌｕｓＴｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの新規な結晶ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組成物 - Google Patents

Description

（１：発明の分野）
本発明は、一般的に、防除の分野に関し、そしてＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃｒｙ２ポリペプチドに関連する殺虫性ポリペプチドおよびその殺虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチドを提供する。本発明はまた、昆虫による捕食に対する植物の抵抗性を変化させるための方法および組成物に関し、それとしては、トランスジェニック植物の産生が挙げられるが、これに限定されない。

（２：発明の背景）
一般的な農作物を含む多くの商業的に有益な植物は、昆虫および線虫である害虫による攻撃に影響されやすい。これらの害虫は、作物の収量および品質の実質的な低下を引き起こし得る。伝統的に、農業従事者は、害虫による損害と戦うために、化学的農薬に大きく依存してきた。しかし、化学的農薬の使用は、それ自体、農薬を適用する費用および不都合を含む一連の問題を引き起こす。さらに、化学的残留物は、環境的および健康的な不安を生じる。これらの理由および他の理由に起因して、代替的な殺虫剤に対する需要が存在する。

害虫を制御する環境的に優しいアプローチは、土壌細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（「Ｂｔ」）に由来する殺害虫性（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ）結晶タンパク質の使用であり、このタンパク質は、一般的に「Ｃｒｙタンパク質」といわれる。これらのタンパク質の多くは、特定の標的昆虫に対して非常に有毒であるが、植物および他の標的とされない生物に対しては無害である。いくつかのＣｒｙタンパク質は、作物植物中で組換え的（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ）に発現されて、害虫抵抗性トランスジェニック植物を提供してきた。とりわけ、Ｂｔ−トランスジェニック綿およびＢｔ−トランスジェニックトウモロコシは、幅広く栽培されてきた。

非常に多くのＣｒｙタンパク質が、単離され、特徴付けされ、そしてアミノ酸配列の相同性に基づいて分類されてきた（非特許文献１）。この分類スキームは、新規に見出されたＣｒｙタンパク質を命名および類別するための系統的な機構を提供する。

個々のＣｒｙタンパク質は、Ｃｒｙ２Ａを除いて、比較的に狭い活性スペクトルを有することが、一般的に見出されてきた。Ｃｒｙ２Ａは、Ｃｒｙタンパク質のこのサブセットが鱗翅目の昆虫および双翅目の昆虫の両方に対する毒性を含む広い有効範囲を有する点で特異である。Ｃｒｙ２Ａタンパク質は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ウワバの幼虫（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ））およびＡｅｄｅｓ ｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ（蚊）に対する二重の活性を示す毒素であることが見出された（非特許文献２）。Ｃｒｙ２Ａタンパク質をコードする核酸分子（Ｃｒｙ２Ａａと称される）は、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍにおいてクローニングされ、かつ発現され、そして鱗翅目の昆虫および双翅目の昆虫の両方に対して活性であることが見出された（非特許文献３）。Ｃｒｙ２Ａａと相同的なさらなるコード配列（Ｃｒｙ２Ａｂと称される）が、クローニングされ、そして鱗翅目の幼生のみに対して活性であることが見出された（非特許文献４）。

第２世代のトランスジェニック作物は、複数および／または新規のＢｔ遺伝子を発現し得る場合、昆虫に対してさらに抵抗性であり得る。したがって、広い活性スペクトルを有する新しい殺虫性タンパク質は、非常に望ましい。
Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅら、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．」、１９９８年、第６２巻、８０７〜８１３ページ ＹａｍａｍｏｔｏおよびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．」、１９８２年、第１３０巻、４１４〜４２１ページ Ｄｏｎｏｖａｎら、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」、１９８８年、第１７０巻、４７３２〜４７３８ページ ＷｉｄｎｅｒおよびＷｈｉｔｅｌｅｙ、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」、１９８９年、第１７１巻、２ページ

（３：発明の要旨）
本発明は、新規なＣｒｙ２ポリペプチド（Ｃｒｙ２Ａｘ）（配列番号２）に関し、これは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから単離される。Ｃｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチド（配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０）もまた本発明によって包含される。Ｃｒｙ２ＡｘおよびＣｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドのポリペプチド配列に加えて、本発明のポリペプチドはまた、それらの改変体を包含し、その改変体としては、任意のフラグメント、アナログ、ホモログ、天然に存在するアレル、またはそれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されないことが理解される。本発明のポリペプチドはまた、任意の本発明のＣｒｙ２ＡｘまたはＣｒｙ２Ａｘ由来の核酸によってコードされるポリペプチドを包含する。１つの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＣｒｙ２Ａｘの機能的活性（例えば、殺虫活性）を有し、そして配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０またはそれらの改変体のいずれかのポリペプチド配列に、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である。別の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのＣｒｙ２Ａｘの機能的活性（例えば、殺虫活性）を有し、少なくとも２５アミノ酸長、５０アミノ酸長、７５アミノ酸長、１００アミノ酸長、１２５アミノ酸長、１５０アミノ酸長、１７５アミノ酸長、２００アミノ酸長、２２５アミノ酸長、２５０アミノ酸長、２７５アミノ酸長、３００アミノ酸長、３２５アミノ酸長、３５０アミノ酸長、３７５アミノ酸長、４００アミノ酸長、４２５アミノ酸長、４５０アミノ酸長、４７５アミノ酸長、５００アミノ酸長、５２５アミノ酸長、５５０アミノ酸長、５７５アミノ酸長、６００アミノ酸長または６２５アミノ酸長の連続したアミノ酸であり、そしてストリンジェントな条件下で、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０、またはそれらの改変体のいずれかをコードする核酸とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドを産生する方法（例えば、組換え手段による）もまた、提供される。本発明の１種以上のポリペプチドを含有する組成物もまた、包含される。

本発明はまた、Ｃｒｙ２Ａｘ（配列番号１）の核酸分子およびＣｒｙ２Ａｘ由来の核酸分子（配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９）に関する。少なくとも部分的に、機能的に活性であるポリペプチド（すなわち、そのポリペプチドが、野生型Ｃｒｙ２Ａｘポリペプチドに関する１つ以上の公知である機能的活性を示し得る）をコードするフラグメントおよびアナログもまた、本発明によって包含される。１つの実施形態において、本発明は、以下：ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列；ｉｉ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９またはそれらの相補体のいずれかのヌクレオチド配列からなる核酸プローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列；および／あるいはｉｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むヌクレオチド配列、を含む単離された核酸配列を包含する。本発明の核酸を含むベクターもまた、包含される。本発明のベクターを含有する細胞または植物もまた、包含される。

本発明はまた、本発明の核酸および／またはポリペプチドを発現するトランスジェニック植物に関する。このトランスジェニック植物は、当該分野において公知である任意の方法で導入遺伝子を発現し得、この方法としては、構成的発現、発生的に制御された発現、組織特異的な発現などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のトランスジェニック植物から得られる種子もまた、本発明に包含される。

（５：詳細な説明）
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｒｙ２ポリペプチドに関連する殺虫性ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子もまた、提供される。昆虫による捕食に対する植物の抵抗性を向上させる本発明のポリペプチドおよび核酸を使用するための方法が、包含される。

（５．１：本発明のポリペプチド）
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓから単離された新規のＣｒｙ２ポリペプチド、Ｃｒｙ２Ａｘ（配列番号２）に関する。Ｃｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチド（配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０）もまた、本発明に包含される。本発明のポリペプチドはまた、本発明の任意のＣｒｙ２ＡｘまたはＣｒｙ２Ａｘ由来の核酸によってコードされるポリペプチドを包含する（節５．２を参照のこと）。

Ｃｒｙ２ＡｘおよびＣｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドのポリペプチド配列に加えて、本発明のポリペプチドはまた、その改変体を包含し、それらとしては、任意の実質的に同様の配列、任意のフラグメント、アナログ、ホモログ、天然に存在するアレル、またはそれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されないことが理解される。本発明に包含される改変体は、少なくとも部分的に、機能上活性であるポリペプチド、すなわち、野生型Ｃｒｙ２Ａｘポリペプチドに関する１つ以上の公知である機能的活性を示し得るポリペプチドである。このような機能的活性としては、生物学的活性（例えば、殺虫活性；抗原性（すなわち、抗Ｃｒｙ２Ａｘ抗体への結合に関してＣｒｙ２Ａｘと結合または競合する能力）；免疫原性（すなわち、Ｃｒｙ２Ａｘポリペプチドに結合する抗体を産生する能力））が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、この改変体は、その親ポリペプチドと実質的に同様である少なくとも１つの機能的活性を有する（例えば、Ｃｒｙ２Ａｘの改変体は、Ｃｒｙ２Ａｘと実質的に同様である少なくとも１つの機能的活性を有する）。本明細書中で使用される場合、上記改変体の機能的活性は、それが親の１標準偏差内である場合、その親ポリペプチドと「実質的に同様」と見なされる。

１つの実施形態において、少なくとも１つのＣｒｙ２Ａｘの機能的活性（例えば、殺虫活性）を有し、かつ配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０のいずれかのポリペプチド配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドが、本発明に包含される。本発明のこのようなポリペプチドは、Ｈ_２、Ｓ_７、Ｑ_２７、Ｑ_３５、Ｅ_３６、Ｋ_４３、Ｄ_４４、Ｎ_４５、Ｄ_５１、Ａ_５８、Ｖ_６９、Ｒ_７８、Ｎ_７９、Ｋ_９９、Ｔ_１１８、Ｖ_１２４、Ｅ_１２５、Ｒ_１２９、Ｎ_１３８、Ｒ_１３９、Ａ_１４１、Ｔ_１６２、Ｑ_１６５、Ｍ_１６６、Ｌ_１８３、Ｉ_１９２、Ｈ_２１１、Ｒ_２１３、Ｒ_２１７、Ｄ_２１８、Ｖ_３２４、Ｉ_３８６、Ｔ_３９９、Ｓ_４０５、Ｑ_４４５、Ｉ_５５１、Ｓ_５８７、Ｉ_５９１、Ｌ_６１０、およびＬ_６３１からなる群に由来する少なくとも１つのアミノ酸残基、少なくとも５つのアミノ酸残基、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも３０個のアミノ酸残基、または全４０個のアミノ酸残基を含む。この下付きの数字は、そのポリペプチド配列と配列番号２との最適なアラインメントにおける、配列番号２の位置に対応するアミノ酸残基の位置を示す。参照配列と最適に整列されるアミノ酸配列に関して、アミノ酸は、その残基が、そのアラインメントにおいて対となる参照配列中の位置に「対応する」。

本明細書中で使用される場合、配列が参照配列と「少なくともＸ％同一」であると定義される場合（例えば、「配列番号２と少なくとも９５％同一であるポリペプチド」）、特に明記されない限り、「Ｘ％同一」とは、同一性の絶対的な％をいう。用語「同一性の絶対的な％」とは、ミスマッチのアミノ酸またはミスマッチの核酸の類似度に関わらず、同一のアミノ酸または核酸を１、および任意の置換を０としてスコアリングすることによって決定された配列同一性の百分率をいう。代表的な配列アラインメントにおいて、２つの配列の「同一性の絶対的な％」は、アミノ酸または核酸の「同一性」の百分率として表される。２つの配列の最適なアラインメントが、その配列の一方または両方におけるギャップの挿入を必要とする場合において、一方の配列中のギャップと整列する他方の配列中のアミノ酸残基は、同一性の％を決定する目的のためのミスマッチとして数えられる。ギャップは、内部または外部（すなわち、切断）であり得る。同一性の絶対的な％は、例えば、初期設定のパラメーターを使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム，バージョン１．８，１９９９年６月を使用して容易に決定され得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３−４６８０）。

別の実施形態において、Ｃｒｙ２ＡｘおよびＣｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドのフラグメントは、本発明に包含される。ポリペプチドには、少なくとも１つのＣｒｙ２Ａｘの機能的活性（例えば、殺虫活性）を有し、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０のいずれかの、少なくとも２５個、５０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個、５２５個、５５０個、５７５個、６００個、または６２５個の連続したアミノ酸長であり、そしてストリンジェントな条件下で、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０のいずれかをコードする核酸とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるものが包含される。本発明のフラグメントが、配列番号２のアミノ酸残基２、７、２７、３５、３６、４３、４４、４５、５１、５８、６９、７８、７９、９９、１１８、１２４、１２５、１２９、１３８、１３９、１４１、１６１、１６５、１６６、１８３、１９２、２１１、２１３、２１７、２１８、３２４、３８６、３９９、４０５、４４５、５５１、５８７、５９１、６１０、６３１に対応するアミノ酸残基のいずれかを含む場合の実施形態において、本発明のこのようなポリペプチドは、Ｈ_２、Ｓ_７、Ｑ_２７、Ｑ_３５、Ｅ_３６、Ｋ_４３、Ｄ_４４、Ｎ_４５、Ｄ_５１、Ａ_５８、Ｖ_６９、Ｒ_７８、Ｎ_７９、Ｋ_９９、Ｔ_１１８、Ｖ_１２４、Ｅ_１２５、Ｒ_１２９、Ｎ_１３８、Ｒ_１３９、Ａ_１４１、Ｔ_１６２、Ｑ_１６５、Ｍ_１６６、Ｌ_１８３、Ｉ_１９２、Ｈ_２１１、Ｒ_２１３、Ｒ_２１７、Ｄ_２１８、Ｖ_３２４、Ｉ_３８６、Ｔ_３９９、Ｓ_４０５、Ｑ_４４５、Ｉ_５５１、Ｓ_５８７、Ｉ_５９１、Ｌ_６１０、およびＬ_６３１からなる群に由来する少なくとも１アミノ酸残基、少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、または全４０アミノ酸残基を含む。

特定の実施形態において、本発明のフラグメントは、プロセシングされたプロ毒素（ｐｒｏ−ｔｏｘｉｎ）の長さに対応する。全長プロ毒素Ｃｒｙ２とプロセシングされたＣｒｙ２毒素との間の分子量に、５〜６ｋＤａの差が存在する。これは、プロ毒素Ｃｒｙ２ポリペプチドから、約４０個のアミノ酸が切断された結果である（Ｒｕｋｍｉｎｉら、２０００、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８２：１０９−１１６；Ａｒｏｎｓｏｎら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：４８９−４９６；Ｍｏｒｓｅら、２００１、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９：４０９−１７）。このプロセシングされたＣｒｙ２フラグメントに対応するポリペプチドは、本発明の方法においてプロ毒素のプロセシングに対する必要性を回避するために、直接的に提供され得る。

別の特定の実施形態において、本発明のフラグメントは、Ｃｒｙ２ドメインに対応する。Ｃｒｙ２ポリペプチドは、以下を含む３つのドメインを有する：ｉ）昆虫の頂端中腸膜への挿入に関係し、そしてイオンチャネルの機能に影響を与えるドメインＩ；ｉｉ）昆虫中腸の上皮細胞膜上のレセプター結合に関係するドメインＩＩ；およびｉｉｉ）イオンチャネルの機能、レセプター結合、および膜への挿入に関係するドメインＩＩＩ（Ｄｅａｎら、１９９６、Ｇｅｎｅ １７９：１１１−１１７；Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９９８、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：７７５−８０６）。

別の実施形態において、アナログポリペプチドは、本発明に包含される。アナログポリペプチドは、改変（すなわち、Ｃｒｙ２ＡｘポリペプチドまたはＣｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドに対する任意の型の分子の共有結合によって）された残基を有し得る。例えば、本発明のアナログポリペプチドは、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解性の切断、細胞のリガンドまたは他のタンパク質に対する連結などによって改変され得るが、これらに限定されない。本発明のアナログポリペプチドは、当業者に公知である技術を使用する化学的改変をによって改変され、この技術としては、特定の化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明のポリペプチドアナログは、１種以上の非古典的なアミノ酸を含む。

本発明のポリペプチドを産生する方法（例えば、組換え技術による）もまた、提供される（節５．６を参照のこと）。

１つ以上の本発明のポリペプチドを含有する組成物もまた、包含される。本発明の組成物は、さらなる薬剤をさらに含有し得、この薬剤としては、拡散−固着補助剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤、希釈剤、例えば、界面活性剤、乳化剤、分散剤、および／またはポリマーのようなこの組成物のレオロジー特性または安定性を最適化する薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。

（５．２：本発明の核酸）
本発明はまた、Ｃｒｙ２Ａｘの核酸分子（配列番号１）およびＣｒｙ２Ａｘ由来の核酸分子（配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９）に関する。本発明の核酸分子はまた、本発明の任意のＣｒｙ２ＡｘまたはＣｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドをコードする核酸分子を包含する（節５．１を参照のこと）。

Ｃｒｙ２Ａｘの核酸分子およびＣｒｙ２Ａｘ由来の核酸分子に加えて、本発明の核酸はまた、それらの改変体を含み、この改変体としては、実質的に類似する任意の配列、任意のフラグメント、ホモログ、天然に存在するアレル、またはそれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されないことが理解される。本発明に包含される改変体核酸分子は、少なくとも部分的に、機能的に活性であるポリペプチド（すなわち、それらは野生型Ｃｒｙ２Ａｘポリペプチドに関する１つ以上の公知の機能的活性を示し得る）をコードする。このような機能的活性としては、生物学的活性（例えば、殺虫活性；抗原性（すなわち、抗Ｃｒｙ２Ａｘ抗体への結合に関してＣｒｙ２Ａｘと結合または競合する能力）；免疫原性（すなわち、Ｃｒｙ２Ａｘポリペプチドに結合する抗体を産生する能力））が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、この改変体は、その親核酸分子と実質的に同様である少なくとも１つの機能的活性を有する（例えば、Ｃｒｙ２Ａｘ核酸分子の改変体は、Ｃｒｙ２Ａｘ核酸分子によってコードされるポリペプチドの機能的活性と実質的に同様である少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドをコードする）。本明細書中で使用される場合、上記改変体の機能的活性は、それが親の１標準偏差内である場合、その親ポリペプチドと「実質的に同様」と見なされる。

１つの実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９の核酸分子のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一である核酸分子が、本発明に包含される。本発明のこのような核酸分子は、Ｈ_２、Ｓ_７、Ｑ_２７、Ｑ_３５、Ｅ_３６、Ｋ_４３、Ｄ_４４、Ｎ_４５、Ｄ_５１、Ａ_５８、Ｖ_６９、Ｒ_７８、Ｎ_７９、Ｋ_９９、Ｔ_１１８、Ｖ_１２４、Ｅ_１２５、Ｒ_１２９、Ｎ_１３８、Ｒ_１３９、Ａ_１４１、Ｔ_１６２、Ｑ_１６５、Ｍ_１６６、Ｌ_１８３、Ｉ_１９２、Ｈ_２１１、Ｒ_２１３、Ｒ_２１７、Ｄ_２１８、Ｖ_３２４、Ｉ_３８６、Ｔ_３９９、Ｓ_４０５、Ｑ_４４５、Ｉ_５５１、Ｓ_５８７、Ｉ_５９１、Ｌ_６１０、およびＬ_６３１からなる群に由来する少なくとも１アミノ酸残基、少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、または全４０アミノ酸残基を含むポリペプチドをコードする。

２つの核酸分子の同一性の％を決定するために、その配列は、最適な比較を目的として整列される（例えば、ギャップが、第２の核酸分子の配列または核酸分子との最適なアラインメントのために第１の核酸分子の配列中に導入され得る）。その後、対応するヌクレオチドの位置におけるヌクレオチドが、比較される。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められる場合、その分子は、その位置において同一である。その２つの配列の間の同一性の％は、その配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性の％＝同一の重複する位置の数／位置の総数×１００％）である。１つの実施形態において、その２つの配列は、同じ長さである。

２つの配列の間の同一性の％の決定はまた、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズムである（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５８７３〜５８７７において改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２２６４〜２２６８）。このようなアルゴリズムは、ＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、公に利用可能（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して）である。このアルゴリズムは、クエリー配列における長さＷの短いワード（ｗｏｒｄ）を同定することによって、最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する工程を備え、データベースの配列中の同じ長さのワードと整列した場合に、いくつかの正の数の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たす。Ｔは、その最初の近傍ワードのスコア閾値といわれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の近傍ワードヒット（ｗｏｒｄ ｈｉｔ）は、検索を開始して、近傍ワードを含む、より長いＨＳＰを見出すためのシードとして働く。その後このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る範囲まで、各々の配列に沿って両方向に伸ばされる。累積スコアは、ヌクレオチド配列に対して、パラメータＭ（一致する残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）およびパラメータＮ（一致しない残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算され得る。アミノ酸配列に関して、得点マトリックスが使用されて、累積スコアが計算される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、量Ｘによってその最大到達スコアから減少する場合；累積スコアが、１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して０以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、そのアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に対して）は、初期設定として、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝⁻４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２得点マトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９８９、ＰＮＡＳ、８９：１０９１５を参照のこと）を使用する。

Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ方法のアラインメントもまた、同一性の％を決定するために使用され（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３）、そしてＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム中に見出され得る（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。「初期設定のパラメータ」は、プログラムの製造者によって予め設定されたパラメータのプリセットであり、そしてそれらは、複数の配列に関して、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に該当する一方で、対をなすアラインメントに関して、ＫＴＵＰＬＥ １、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用する配列のアラインメント後、同じプログラムにおける「配列距離」の表を見ることによって「同一性の％」を得ることが可能である。

２つの配列の間の同一性の％は、ギャップを許容してか、またはギャップを許容せずに、上記されるものと同様の技術を使用して決定され得る。同一性の％計算において、代表的に、正確な一致のみが、数えられる。

別の実施形態において、Ｃｒｙ２Ａｘの核酸分子およびＣｒｙ２Ａｘ由来の核酸分子のフラグメントが、本発明に包含される。核酸分子には、少なくとも１つのＣｒｙ２Ａｘの機能的活性（例えば、殺虫活性）を有し、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９のいずれかの少なくとも１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、１５００個、または１８００個の連続したヌクレオチド長であり、そして／またはストリンジェントな条件下で、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０のいずれかをコードする核酸分子とハイブリダイズするものが包含される。本発明の核酸フラグメントが、配列番号２のアミノ酸残基２、７、２７、３５、３６、４３、４４、４５、５１、５８、６９、７８、７９、９９、１１８、１２４、１２５、１２９、１３８、１３９、１４１、１６１、１６５、１６６、１８３、１９２、２１１、２１３、２１７、２１８、３２４、３８６、３９９、４０５、４４５、５５１、５８７、５９１、６１０、６３１に対応するアミノ酸残基のいずれかを含むポリペプチドをコードする場合の実施形態において、本発明のこのような核酸分子は、Ｈ_２、Ｓ_７、Ｑ_２７、Ｑ_３５、Ｅ_３６、Ｋ_４３、Ｄ_４４、Ｎ_４５、Ｄ_５１、Ａ_５８、Ｖ_６９、Ｒ_７８、Ｎ_７９、Ｋ_９９、Ｔ_１１８、Ｖ_１２４、Ｅ_１２５、Ｒ_１２９、Ｎ_１３８、Ｒ_１３９、Ａ_１４１、Ｔ_１６２、Ｑ_１６５、Ｍ_１６６、Ｌ_１８３、Ｉ_１９２、Ｈ_２１１、Ｒ_２１３、Ｒ_２１７、Ｄ_２１８、Ｖ_３２４、Ｉ_３８６、Ｔ_３９９、Ｓ_４０５、Ｑ_４４５、Ｉ_５５１、Ｓ_５８７、Ｉ_５９１、Ｌ_６１０、およびＬ_６３１からなる群に由来する少なくとも１アミノ酸残基、少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、または全４０アミノ酸残基に対するコード配列を含む。

特定の実施形態において、本発明のフラグメントは、プロセシングされたプロ毒素をコードする核酸の長さに対応する。全長プロ毒素Ｃｒｙ２とプロセシングされたＣｒｙ２毒素との間の分子量に、５〜６ｋＤａの差が存在する。これは、プロ毒素Ｃｒｙ２ポリペプチドから、約４０個のアミノ酸が切断された結果である（Ｒｕｋｍｉｎｉら、２０００、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ８２：１０９−１１６；Ａｒｏｎｓｏｎら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：４８９−４９６；Ｍｏｒｓｅら、２００１、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９：４０９−１７）。

別の特定の実施形態において、本発明のフラグメントは、Ｃｒｙ２ドメインに対応するポリペプチドをコードする。

別の実施例において、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９、配列番号２０１、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２１７、配列番号２１９、配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３５、配列番号２３７、配列番号２３９、配列番号２４１、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９のいずれか１つとハイブリダイズする核酸分子が、本発明に包含される。本発明のこのような核酸分子は、Ｈ_２、Ｓ_７、Ｑ_２７、Ｑ_３５、Ｅ_３６、Ｋ_４３、Ｄ_４４、Ｎ_４５、Ｄ_５１、Ａ_５８、Ｖ_６９、Ｒ_７８、Ｎ_７９、Ｋ_９９、Ｔ_１１８、Ｖ_１２４、Ｅ_１２５、Ｒ_１２９、Ｎ_１３８、Ｒ_１３９、Ａ_１４１、Ｔ_１６２、Ｑ_１６５、Ｍ_１６６、Ｌ_１８３、Ｉ_１９２、Ｈ_２１１、Ｒ_２１３、Ｒ_２１７、Ｄ_２１８、Ｖ_３２４、Ｉ_３８６、Ｔ_３９９、Ｓ_４０５、Ｑ_４４５、Ｉ_５５１、Ｓ_５８７、Ｉ_５９１、Ｌ_６１０、およびＬ_６３１からなる群に由来する少なくとも１アミノ酸残基、少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、または全４０アミノ酸残基を含むポリペプチドをコードする。

語句「ストリンジェントな条件」とは、代表的に、核酸の複雑な混合物において、核酸がその標的核酸にハイブリダイズするが、本質的に他の核酸にはハイブリダイズしないハイブリダイゼーション条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境において異なる。より長い核酸は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての多くの指針は、当該分野において見出され得る（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３））。一般的に、非常にストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度であるｐＨにおける、特定の核酸についての熱融点（Ｔ_ｍ）より約５〜１０℃低く選択される。低ストリンジェンシー条件は、一般的に、Ｔ_ｍを約１５〜３０℃下回って選択される。Ｔ_ｍは、標的と相補的なプローブの５０％が、平衡状態においてその標的核酸とハイブリダイズする（その標的核酸が、Ｔ_ｍにおいて過剰に存在し、そのプローブの５０％が、平衡状態において占有されるような）温度（定義されたイオン強度（ｐＨ）および核酸濃度下における）である。ハイブリダイゼーション条件は、代表的に、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン未満（代表的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度）（または他の塩）の条件であり、そしてその温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）に対しては少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、安定化剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションに関して、正のシグナルは、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドの少なくとも２倍であり、そして好ましくはハイブリダイゼーションのバックグラウンドの１０倍である。１つの実施形態において、ストリンジェントな条件は、少なくとも約５０℃（通常は約５５℃、またはときとして、６０℃もしくは６５℃）の温度で２０分間の０．２×ＳＳＣ中、または実質的に等価な条件における、少なくとも１回（通常は２回）の洗浄を含む。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１２、配列番号２１４、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３２、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２６０のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、５５℃で２０分間の０．２×ＳＳＣにおける少なくとも１回の洗浄後に、特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、ストリンジェントな条件は、約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続いて、５０〜６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳにおける１回以上の洗浄によるハイブリダイゼーションを包含する。

語句「特異的にハイブリダイズする」とは、その配列が複雑な混合物（例えば、全細胞もしくはライブラリーのＤＮＡまたはＲＮＡ）中にある場合の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、特定のヌクレオチド配列のみに対する分子の結合、二重鎖形成（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）、またはハイブリダイズをいう。

本発明の核酸を含有するベクターもまた、包含される。本発明のベクターを含有する細胞または植物もまた、包含される。

用語「核酸」または「核酸分子」とは、本明細書中において、５’末端から３’末端に読み取られる、デオキシヌクレオチド塩基もしくはリボヌクレオチド塩基の１本鎖ポリマーまたは２本鎖ポリマーをいう。それとしては、染色体ＤＮＡ、自己複製プラスミドおよび一次構造の役割を果たすＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。用語「コード配列（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」とは、１つ以上のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、開始コドンまたは停止コドンを要求しない。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列およびその相補体によって与えられる６つの異なるリーディングフレームのいずれか１つにコードされ得る。

表１は、Ｃｒｙ２Ａｘの配列およびＣｒｙ２Ａｘ由来の配列ならびに対応する配列同一性の番号を開示する。

（５．３：Ｃｒｙ２Ａｘ由来の配列）
本発明のＣｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドおよび核酸は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加および／または削除がコードされるタンパク質に導入されるように、Ｃｒｙ２Ａｘまたは関連する核酸のヌクレオチド配列中へ１つ以上のヌクレオチドの、置換、付加および／または削除を導入することによって形成され得る。一般的に、Ｃｒｙ２Ａｘ由来の配列は、Ｃｒｙ２Ａｘポリペプチドの望ましい特徴を際立たせるかまたは望ましくない特徴を低減させるために形成される。１つの実施形態において、Ｃｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドは、Ｃｒｙ２Ａｘに対して改良された殺虫活性を有し、この活性としては、より強い効力および／または増加した害虫の範囲が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、Ｃｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドは、Ｃｒｙ２Ａｘより良好に発現し、このこととしては、上昇した半減期、分解に対する感受性の減少、および／またはより効率的な転写もしくは翻訳が挙げられるが、これらに限定されない。

１つの実施形態において、Ｃｒｙ２Ａｘ（配列番号１）の核酸分子が、Ｃｒｙ２Ａｘ由来のヌクレオチドを形成するための鋳型として使用される。別の実施例において、Ｃｒｙ２Ａｘに関連した核酸が、Ｃｒｙ２Ａｘ由来のヌクレオチドを形成するための鋳型として使用される。特定の実施形態において、Ｃｒｙ２Ａｂ^＊が、鋳型として使用される。Ｃｒｙ２Ａｂ^＊は、野生型Ｃｒｙ２Ａｂに対して、２つのアミノ酸の変化を有する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２３７２４の、位置３６におけるＫからＲ、および位置２４１のＭからＴ）。別の特定の実施形態において、１回目の改変から単離されたクローンが、さらなる改変のための鋳型として使用され得る（例えば、クローン３８、４４、および４７３Ｒ；節６．２および節６．４を参照のこと。

配列の改変は、定方向の分子的進化技術のような標準的な技術（例えば、ＤＮＡシャッフリング法（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４３６−４３８；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３１５−３１９；Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９１：１０７４７−１０７５１；米国特許第５，６０５，７９３号；同第６，１１７，６７９号；同第６，１３２，９７０号；同第５，９３９，２５０号；同第５，９６５，４０８号；同第６，１７１，８２０号；国際公開番号ＷＯ ９５／２２６２５；同ＷＯ ９７／００７８；同ＷＯ ９７／３５９６６；同ＷＯ ９８／２７２３０；同ＷＯ ００／４２６５１；およびＷＯ ０１／７５７６７を参照のこと）；部位特異的変異（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８２：４８８−４９２；Ｏｌｉｐｈａｎｔら、１９８６、Ｇｅｎｅ ４４：１７７−１８３を参照のこと）；オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７を参照のこと）；化学的変異誘発（例えば、Ｅｃｋｅｒｔら、１９８７、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．１７８：１−１０を参照のこと）；誤差的（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ ＆ Ｊｏｙｃｅ、１９９２、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３を参照のこと）；およびカセット変異誘発（例えば、Ａｒｋｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、８９：７８７１−７８１５を参照のこと）；（一般的には、例えば、Ａｒｎｏｌｄ、１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：４５０−４５５；Ｌｉｎｇら、１９９７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４（２）：１５７−７８；Ｄａｌｅら、１９９６、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−７４；Ｓｍｉｔｈ、１９８５、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；Ｋｒａｍｅｒら、１９８４、Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８８７；Ｗｅｌｌｓら、１９８５、Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、１９９９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：２８４−２９０を参照のこと）。

１つの実施形態において、ＤＮＡシャッフリングが、Ｃｒｙ２Ａｘ由来のヌクレオチドを形成するために使用される。ＤＮＡシャッフリングは、インビトロ、インビボ、インシリコ、またはそれらの組み合わせにおいて達成される。組換えのインシリコ方法は、遺伝的アルゴリズムが相同的（または非相同的でさえ）な核酸に対応する配列の文字列を組換えるためにコンピューターにおいて使用されて成立し得る。得られる組換えられた配列の文字列は、必要に応じて、例えば、オリゴヌクレオチド合成遺伝子の再構築技術と協力して、組換えられた配列に対応する核酸の合成によって核酸に変換される。このアプローチは、ランダム（ｒａｎｄｏｍ）（特に、ランダムな改変または設計された改変）を生成し得る。対応する核酸の生成および設計された核酸の組み合わせ（例えば、交差部位の選定に基づく）ならびに設計された、仮性ランダム（ｐｓｅｕｄｏ−ｒａｎｄｏｍ）組換え方法またはランダム組換え方法と相まった、コンピューターシステムにおける遺伝的アルゴリズム、遺伝的演算子などの使用を含むインシリコ組換えに関する多くの詳細は、当該分野において記載される（例えば、国際公開番号ＷＯ ００／４２５６０および同ＷＯ ００／４２５５９）。

別の実施形態において、標的化変異誘発が使用されて、改変のための特定のヌクレオチド配列またはＣｒｙ２Ａｘの核酸もしくは関連した核酸の位置を選択することによってＣｒｙ２Ａｘ由来のヌクレオチドを形成する。このような標的化された変異誘発は、核酸中の任意の位置に導入され得る。例えば、標的化変異誘発は、「必須でない」または「必須な」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を生じるヌクレオチド置換をなし得る。「必須でない」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させずに野生型の配列から変更され得る残基であるが、「必須な」アミノ酸残基は、このポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性に必要とされる。例えば、さまざまな種のホモログの間で保存されないかまたは半分しか保存されないアミノ酸残基は、活性にとって必須でないかもしれない。あるいは、さまざまな種のホモログの間で保存されるアミノ酸残基は、活性にとって必須であり得る。

このような標的化変異誘発は、保存的または非保存的であり得る。「非保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン）、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。

非保存的アミノ酸残基置換に代えてか、またはこれに加えて、このような標的化変異誘発は、保存的であり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。変異誘発後、コードされたタンパク質は、組換え的に発現され得、そしてタンパク質の活性が、決定され得る。

別の実施例において、ランダム変異誘発が使用されて、Ｃｒｙ２Ａｘ由来のヌクレオチドを形成する。突然変異は、そのコード配列の全てまたは一部にそってランダムに導入され得る（例えば、飽和変異誘発によって）。特定の実施形態において、同様のドメイン、構成的モチーフ、活性部位を有するか、またはミスマッチもしくは不完全なミスマッチを伴って本発明のＣｒｙ２Ａｘの一部との整列する他の関連したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列の多様性を生じるために変異誘発プロセスにおいて使用され得る。

上記の技術のいくつかにおけるそれぞれの変異誘発工程について、その工程のいずれかまたは全てに関する多くの反復性の周期が、配列の多様性を最適化するために行われ得ることが理解されるべきである。上記の方法は、任意の所望の順序で組み合わせて使用され得る。多くの場合において、この方法は、変更された核酸配列のプールまたは変更された核酸配列を含む組換え宿主細胞のプールを生じる。所望の特性を有する、変更された核酸配列または変更された核酸配列を発現する宿主細胞は、当該分野において公知である１種以上のアッセイを用いるスクリーニングによって同定され得る。このアッセイは、所望の物理的特性または化学的特性を有するポリペプチドを選択する条件下において実施され得る。この核酸配列における変更は、そのクローンにおいて変更されたポリペプチドをコードする核酸分子を配列決定することによって決定され得る。

さらに、Ｃｒｙ２Ａｘの核酸分子およびＣｒｙ２Ａｘ由来の核酸分子は、完全にまたは部分的に、最適化されたコドンであり得る。任意の１種のアミノ酸（メチオニンを除く）は、多くのコドンによってコードされる（表２）ので、その核酸分子の配列は、コードされるアミノ酸を変えずに変化され得る。コドンの最適化は、アミノ酸は変えられないが、特定の宿主生物における発現が増加するように、１つ以上のコドンが核酸レベルで変更される場合である。当業者は、広範な生物についての優先性の情報を提供する表および他の参考文献が当該分野において利用可能であることを認識する。

（５．４：殺虫活性をアッセイする方法）
本明細書中で使用される場合、用語「殺虫活性」とは、ポリペプチドを摂取した際に、昆虫の摂食を減少もしくは阻害しそして／または昆虫の死亡率を増加させるそのポリペプチドの能力をいう。任意の昆虫に作用するが、好ましくは鱗翅目および双翅目の昆虫が影響を受ける。

種々のアッセイが使用されて、本発明の特定のポリペプチドが殺虫活性を有するか否かを決定され得、そして殺虫活性を有する場合、どの程度であるかが決定され得る。一般的に、昆虫の害虫は、摂取され得る任意の形態で本発明のポリペプチドを与えられる。本発明のポリペプチドの摂取に対する昆虫の害虫の反応が、観察される（例えば、約１日間〜３日間）。本発明のポリペプチドを摂取した後の摂食の減少もしくは阻害および／または昆虫の害虫の死亡率の増加が、殺虫活性の指標である。非公知である殺虫活性を有する本発明のポリペプチドは、正および／または負のコントロールと比較されて、より正確にアッセイの結果を評価されるべきである。

１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、精製（可溶化形態および結晶形態のいずれか）され、そして昆虫の食餌に添加される。

別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、組換え微生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される。この組換え微生物は、上記昆虫の害虫に直接摂食される（Ｍｏｅｌｌｅｎｂｅｃｋら、２００１、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６６８を参照のこと）。

別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、植物中で発現され、そしてこの植物は、上記昆虫の害虫に摂食される。潜伏期間の後、この昆虫の害虫の摂食活性は、通常は昆虫の害虫によって食べられる植物の部分の目視観察（例えば、残った葉の面積のおおよその割合の）またはビデオキャプチャー（ｖｉｄｅｏ ｃａｐｔｕｒｅ）（例えば、残った葉の面積の画素の数）によって決定され得る。特定の実施形態において、植物中での本発明のポリペプチドの発現は、一時的である。このような実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、植物発現ベクター中にクローニングされ、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中にトランスフェクトされる。この形質転換された細菌は、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａから得た葉と共に培養され、そして強制的な浸潤を使用して、この葉は本発明のポリペプチドを発現する。しかし、このポリペプチドの発現は、葉の共培養物の間で可変である。別の特定の実施形態において、植物中での本発明のポリペプチドの発現は、安定である。このような実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物が、作製される。

別の実施形態において、本発明のポリペプチドの殺虫活性は、培養細胞を使用して細胞死および／または細胞増殖を測定することによってアッセイされ得る。このようなアッセイは、代表的にはスクリーニングされる特定の毒素に感受性である培養昆虫細胞、または天然にかもしくは異種遺伝子の発現の結果としてのいずれかによって特定の細胞に対するレセプターを発現する細胞の使用を包含する。したがって、昆虫細胞に加えて、哺乳動物細胞、細菌細胞、および酵母細胞は、とりわけインビトロのアッセイに有用な細胞である。培養細胞に対する毒性を測定するインビトロのバイオアッセイは、当該分野において記載される（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９４、Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．Ｐａｔｈｏｌ．６３：１２３−１２９）。

別の実施形態において、本発明のポリペプチドの殺虫活性は、標的とする昆虫由来の中腸上皮膜小胞における細孔形成を測定することによってアッセイされ得る（ＪｕｔｔｎｅｒおよびＥｂｅｌ、１９９８、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３７０：５１−６３．；Ｅｎｇｌｉｓｈら、１９９１、Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１：１７７−１８４）。このようなアッセイは、膜小胞の内腔からの、リガンドが活性化する基質の毒素制御性の放出によって構成され得る。このことは、このリガンドがこの小胞の外側にあることを必要とする。あるいは、逆のシナリオが利用され得る。このシナリオによって、そのリガンドは小胞の内腔にあり、活性化される用意をされた基質がその小胞の外側に位置する。毒素活性がより高ければ、より大きい数またサイズの細孔が形成される。

（５．５：植物の虫害抵抗性を増強する方法）
本発明は、Ｃｒｙ２に関連する殺虫性ポリペプチドの使用によって昆虫の害虫に対する植物の抵抗性を増強する方法を提供し、この害虫としては、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ Ｚｅａ）および／またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ種（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ ｅｘｉｇｕａ）のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。当該分野において公知である任意の方法が使用されて、植物を摂食する過程の間に、昆虫の害虫に本発明の１種以上のポリペプチドを摂取させ得る。このようにして、昆虫の害虫は、殺虫性の量の１種以上の本発明のポリペプチドを摂取し、そして植物の摂食をやめ得る。いくつかの実施形態において、この昆虫の害虫は、１種以上の本発明のポリペプチドの摂取によって殺傷される。他の実施形態において、この昆虫の害虫は、殺傷されることなく植物の摂食を阻害されるか、またはやめされられる。

１つの実施形態において、トランスジェニック植物は、１種以上の本発明のポリペプチドを発現するように作製され得る（一般的に、トランスジェニック植物産生の方法に関する節５．７を参照のこと）。このトランスジェニック植物は、全ての組織中で１種以上の本発明のポリペプチドを発現し得る（例えば、全体的発現（ｇｌｏｂａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））。あるいは、１種以上の本発明のポリペプチドは、組織の小集団においてのみ発現（例えば、組織特異的発現）され得、好ましくは昆虫の害虫によって食べられる組織において発現され得る。本発明のポリペプチドは、植物中で構成的に発現され得るか、または誘導性プロモーターの制御下にあり得る。

別の実施形態において、１種以上の本発明のポリペプチドを含有する組成物が、上記昆虫の害虫の影響を受けやすい植物の外側に塗布され得る。この組成物の外面塗布としては、この植物の全体もしくは一部のいずれかに対する直接の塗布、および／または間接的な塗布（例えば、土壌のような植物を取り巻く環境に対する）が挙げられる。この組成物は、当該分野において公知である任意の方法によって塗布され得、この方法としては、噴霧、散布、散水などが挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、この組成物は、植物の成長の間にいつでも塗布され得る。当業者は、当該分野において公知である方法を使用して、この組成物の投与に最適な時期を実験的に決定し得る。最適な投与時期に影響する因子としては、影響を受けやすい植物の型、昆虫の害虫の型、本発明の１種以上のポリペプチドのどれがその組成物において投与されるかが挙げられるが、これらに限定されない。

１種以上の本発明のポリペプチドを含有する組成物は、実質的に精製されたポリペプチド、細胞懸濁物、細胞ペレット、細胞上清、細胞抽出物、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞の胞子−結晶複合体であり得る（一般的に、組変えポリペプチド合成技術に関する節５．６を参照のこと）。１種以上の本発明のポリペプチドを含有する組成物は、溶液の形態、エマルジョンの形態、懸濁物の形態、または粉末の形態であり得る。液体処方物は、水性ベースでも非水性ベースでもよく、そして発泡体、ゲル、懸濁物、乳剤などとして提供されてもよい。この処方物は、１種以上の本発明のポリペプチドに加えて薬剤を含み得る。例えば、組成物は、拡散−固着補助剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤、希釈剤、この組成物のレオロジー特性または安定性を最適化する薬剤（例えば、界面活性剤、乳化剤、分散剤、またはポリマー）をさらに含有し得る。

別の実施形態において、１種以上の本発明のポリペプチドを発現する組換え宿主は、昆虫の害虫による攻撃に影響を受けやすい植物に適用されるか、または近づけられる。この組換え宿主としては、細菌宿主、および１種以上の本発明の核酸分子によって形質転換され、そして１種以上の本発明の核酸分子（従って、ポリペプチド）を発現する昆虫ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、この組換え宿主は、本発明のポリペプチドを、昆虫の害虫と接触するように宿主の周囲の環境に分泌する。他の実施形態において、この組換え宿主は、昆虫の蔓延に影響を受けやすい１つ以上の植物組織に定着する。

（５．６：組換え体の発現）
本発明の核酸分子およびポリペプチドは、当該分野において周知である標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術を使用して組換え的に発現され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）。さらに、組換えＤＮＡ技術が使用されて、トランスジェニック植物の作製に使用するのに適した核酸構築物が生成され得る（節５．７を参照のこと）。

したがって、本発明のある局面は、本発明の核酸分子を含むベクター（好ましくは発現ベクター）またはその改変体に関連する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、そのベクターに連結された別の核酸を運び得るポリヌクレオチドをいう。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、プラスミドとは、さらなるＤＮＡセグメントが導入され得る環状二本鎖ＤＮＡの環をいう。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム中に導入され得る。

特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自立的に複製可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソームベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームベクター）は、宿主細胞中への導入の際にその宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主のゲノムにしたがって複製される。一般的に、多くの場合、組換えＤＮＡ技術に利用される発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態である。しかし、本発明は、このような発現ベクターの他の形態（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス））を包含することを意図される。

本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸分子の発現に適した形態である本発明の核酸分子を含む。このことは、その組換え発現ベクターが、１つ以上の制御配列を含み、この配列は、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され、この配列は、発現されるポリヌクレオチドと作動可能に結合されることを意味する。組換え発現ベクターに関して、「作動可能に結合される」は、目的のヌクレオチド配列がこのヌクレオチド配列の発現を可能（例えば、インビトロ転写／翻訳システムまたはベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞において）にする様式で制御配列に連結されることを意味することを意図される。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図される。このような制御配列は、当該分野において記載される（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。制御配列としては、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を導く配列、および特定の宿主細胞においてのみこのヌクレオチド配列の発現を導く配列が挙げられる（例えば、組織特異的制御配列）。発現ベクター設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル、発現が望まれる生物の領域などのような要因に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されて、それによってタンパク質またはペプチドを産生し得、このタンパク質およびペプチドとしては、本明細書に記載されるような核酸分子によってコードされる融合タンパク質または融合ペプチドが挙げられる。

いくつかの実施形態において、プロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントとして働く単離された核酸は、本発明のポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするために、本発明のポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置（一般的には上流）に導入され得る。例えば、内在性プロモーターは、変異、欠失、および／または置換によってインビボで変えられ得るか（米国特許第５，５６５，３５０号；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８を参照のこと）、または単離されたプロモーターは、遺伝子の発現を制御するために、本発明のポリヌクレオチドの同起源の遺伝子から適切な方向および適切な距離で植物細胞に導入され得る。遺伝子の発現は、植物細胞中の本発明のポリペプチドの総濃度および／または組成を変えるために、植物の成長に適した条件下で調節され得る。従って、本発明は、ネイティブな内因性（すなわち、非異種）の形態の本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターおよび／または異種エンハンサーを作製するための組成物、および方法を提供する。

ポリペプチドの発現が望まれる場合、ポリヌクレオチドコード領域の３’末端にポリアデニル化領域を含むことが、一般的には望ましい。このポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、種々の他の植物の遺伝子、またはＴ−ＤＮＡに由来し得る。付加される３’末端の配列は、例えば、ノパリンシンターゼ遺伝子またはオクトピンシンターゼ遺伝子に由来し得るか、または代替的に別の植物の遺伝子に由来し得るか、またはあまり好ましくないが任意の他の真核生物の遺伝子に由来し得る。

本発明の組換え発現ベクターは、原核生物（例えば、腸内細菌科（例えば大腸菌属；バシラス属）；根粒菌科（Ｒｈｉｚｏｂｏｃｅａｅ）（例えば、根粒菌属および根圏細菌）；スピリリウム科（例えば、フォトバクテリウム属；ザイモモナス属；セラチア属；エアロモナス族；ビブリオ属；デスルフォビブリオ属；スピリルム属）； 乳酸桿菌科；シュードモナス科（例えば、シュードモナス属および酢酸菌属）；アゾトバクター科およびニトロバクター科）、または真核細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞）における本発明のポリペプチドの発現のために設計され得る（Ｇｏｅｄｄｅｌ、前出の、適切な宿主細胞についての議論を参照のこと）。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してインビトロで転写および翻訳され得る。

原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを含むベクターを有するＥ．ｃｏｌｉで実施される。融合ベクターは、そこにコードされたタンパク質に多くのアミノ酸を付加し、通常はこの組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、代表的に、以下の少なくとも３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増加すること；２）組換えタンパク質の可溶性を増加すること；および／または３）アフィニティー精製のリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助すること。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性の切断部位が、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接続部分に導入される。このような酵素、およびこれらの同起源の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が挙げられ、これらは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを標的組換えタンパク質に、それぞれ融合させる。

別の実施形態において、上記発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２、Ｃｅｌｌ ３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７、Ｇｅｎｅ ５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。

あるいは、上記発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に使用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１〜３９）が挙げられる。

なお別の実施形態において、本発明の核酸は、植物発現ベクターを使用して植物細胞において発現され、このベクターとしては、タバコモザイクウイルス発現ベクターおよびジャガイモウイルス発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

原核細胞および真核細胞の両方に対する他の適切な発現系は、当該分野において公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら １９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹの第１６章および第１７章を参照のこと）。

多くのプロモーターが、本発明の実施に使用され得る。このプロモーターは、所望の結果に基づいて選択され得る。上記核酸は、宿主生物における発現のために、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導プロモーター、または他のプロモーターと結合され得る。

「組織特異的プロモーター」は、特異的な組織の型、生物の型または細胞の型において、本発明の核酸の発現を導き得る。組織特異的プロモーターは、誘導性であり得る。同様に、組織特異的プロモーターは、特定の時間枠またはその組織の発達段階内で転写を促進するのみであり得る。他の組織特異的プロモーターは、特定の組織の生活環にわたって活性であり得る。当業者は、組織特異的プロモーターが、標的組織以外の組織において作動可能に連結した配列の発現を駆動し得ることを認識する。従って、本明細書中で使用される場合、組織特異的プロモーターは、標的とする組織の型または細胞の型において優先的に発現を駆動するが、他の組織においても同様に、ある程度の発現を引き起こし得るプロモーターである。多くの組織特異的プロモーターが、本発明において使用され得る。適切なプロモーターによって、任意の器官（例えば、苗条栄養器官／構造体（例えば、葉、茎および塊茎）、根、花および花の器官／構造体（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄ずい、心皮、葯および珠柄）、種子（胚、胚乳、および種皮を含む）および果実）が、標的化され得る。例えば、葉、根、または花において核酸の発現を導くプロモーターは、これらの器官に影響を及ぼす害虫に対する抵抗性を増強するために有用である。植物の地上（ａｅｒｉａｌ）の栄養器官における本発明のポリヌクレオチドの発現に関して、光合成組織特異的プロモーター（例えば、ＲＢＣＳプロモーター（Ｋｈｏｕｄｉら、Ｇｅｎｅ １９７：３４３、１９９７））が、使用され得る。本発明のポリヌクレオチドの根に特異的な発現は、根特異的プロモーター（例えば、ＡＮＲ１遺伝子由来のプロモーター（ＺｈａｎｇおよびＦｏｒｄｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９：４０７、１９９８）の制御下で達成され得る。他の例示的なプロモーターとしては、大豆由来の根特異的グルタミンシンテターゼ遺伝子（Ｈｉｒｅｌら、１９９２、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：２０７−２１８）およびサヤインゲンのＧＲＰ １．８遺伝子における根特異的制御エレメント（Ｋｅｌｌｅｒら、１９９１、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１０５１−１０６１）が挙げられる。

「構成的プロモーター」は、全組織において遺伝子の発現を導き、そして大部分の環境条件および発育の段階または細胞の分化の下で活性であるプロモーターとして定義される。構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ転写開始領域、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍａｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡに由来する１’−プロモーターまたは ２’−プロモーター、および当業者に公知である種々の植物の遺伝子由来の他の転写開始領域が挙げられる。このような遺伝子としては、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＡＣＴ１１（Ｈｕａｎｇら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：１２５−１３９）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４３１４７、Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：１９６−２０３）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来のステアロイル−アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ７４７８２、Ｓｏｌｏｃｏｍｂｅら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１１６７−１１７６）、トウモロコシ由来のＧＰｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１５５９６、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９８９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：５５１−５６５）、およびトウモロコシ由来のＧｐｃ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４５８５５、Ｍａｎｊｕｎａｔｈら、１９９７、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：９７−１１２）が挙げられる。任意の強力な構成的プロモーター（例えば、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）が、植物全体での本発明のポリヌクレオチドの発現のために使用され得る。

用語「誘導プロモーター」とは、的確な環境制御または発育制御下にあるプロモーターをいう。誘導プロモーターによって転写を達成し得る環境条件の例としては、嫌気性条件、高温、光の存在、または化学物質／ホルモンの噴霧が挙げられる。

植物の宿主細胞における使用のための適切な構成的プロモーターとしては、例えば、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターおよび他の関連した構成的プロモーター（国際公開番号ＷＯ ９９／４３８３８および米国特許第６，０７２，０５０号）；コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）；イネのアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９８９、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９２、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら、１９９１、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら、１９８４、ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）、など（例えば、米国特許第５，６０８，１４９号；同第５，６０８，１４４号；同第５，６０４，１２１号；同第５，５６９，５９７号；同第５，４６６，７８５号；同第５，３９９，６８０号；同第５，２６８，４６３号；同第５，６０８，１４２号；および同第６，１７７，６１１号）が挙げられる。

本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関連する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に使用される。このような用語が特定の被検体細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。特定の改変が、突然変異または環境的影響のいずれかに起因してその後の世代に生じ得るので、実際に、このような子孫は、親細胞と同一ではあり得ないが、本明細書中で使用される場合は、その用語の範囲内になお含まれる。

したがって、本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクター、またはその改変体を有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）または真核細胞（例えば、昆虫細胞、酵母細胞または植物細胞）であり得る。本発明はまた、以下の工程を包含する、本発明の核酸を発現しそれによってコードされたポリペプチドを作製するための方法を提供する：ｉ）コードされたポリペプチドの産生を可能にする条件下で本発明の核酸分子を含む細胞を培養する工程；およびｉｉ）発現したポリペプチドを単離する工程。

ベクターＤＮＡは、慣習的な形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主細胞に外来の核酸分子を導入するための種々のその分野で認識された技術をいうことを意図され、この技術としては、リン酸カルシウム共沈殿もしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、当該分野において見出され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。

（５．７：トランスジェニック植物の産生）
当該分野において公知である任意の方法が、本発明の核酸分子によって植物または植物細胞を形質転換するために使用され得る。核酸分子は、植物のＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはクロロプラストＤＮＡ）中に組み込まれても植物のＤＮＡ中への挿入を伴わずに維持（例えば、人工染色体の使用によって）されてもよい。植物細胞に核酸分子を導入する適切な方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙら、１９８６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０−３３４）；エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：５６０２−５６０６；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら、１９９２、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１４９５−１５０５）；アグロバクテリウム媒介性形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号および同第５，９８１，８４０号、Ｏｓｊｏｄａら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０；Ｈｏｒｓｃｈら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４９６−４９８、Ｆｒａｌｅｙら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：４８０３、ならびにＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ １９９５）；遺伝子直接導入（ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、１９８４、ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７〜２７２２）；弾道粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，８７９，９１８号；同第５，８８６，２４４号；同第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓら、１９９５、「Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ，ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ編、ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ；ならびにＭｃＣａｂｅら、１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３〜９２６）；ウイルス媒介性形質転換（米国特許第５，８８９，１９１号、同第５，８８９，１９０号、同第５，８６６，７８５号、同第５，５８９，３６７号および同第５，３１６，９３１号）；花粉の形質転換（ｐｏｌｌｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｕｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ編のＤｅ Ｗｅｔら、１９８５、Ｃｈａｐｍａｎら、Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１９７−２０９）；Ｌｅｃ １形質転換（米国特許出願番号０９／４３５，０５４；国際公開番号ＷＯ ００／２８０５８）；ウィスカー媒介性形質転換（Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：４１５−４１８；Ｋａｅｐｐｌｅｒら、１９９２、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６）；およびクロロプラスト形質転換技術（Ｂｏｇｏｒａｄ、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：２５７−２６３；Ｒａｍｅｓｈら、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２７４：３０１−７；Ｈｏｕら、２００３、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．１２：１１１−４；Ｋｉｎｄｌｅら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１７２１−５；ＢａｔｅｍａｎおよびＰｕｒｔｏｎ、２０００、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２６３：４０４−１０；Ｓｉｄｏｒｏｖら、１９９９、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９：２０９−２１６）が挙げられる。

トランスジェニック植物およびトランスジェニック植物細胞を産生するために使用される形質転換プロトコルの選択は、形質転換の標的される植物または植物細胞の型（すなわち、単子葉植物または双子葉植物）に依存して変わり得る。特定の植物の型に特に適した形質転換プロトコルの例としては：ジャガイモ（Ｔｕら、１９９８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３７：８２９−８３８；Ｃｈｏｎｇら、２０００、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９：７１−７８）；大豆（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１〜６７４；ＭｃＣａｂｅら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３〜９２６；ＦｉｎｅｒおよびＭｃＭｕｌｌｅｎ、１９９１、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２；Ｓｉｎｇｈら、１９９８、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４）；トウモロコシ（Ｋｌｅｉｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：４３０５〜４３０９；Ｋｌｅｉｎら、１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：５５９〜５６３；Ｋｌｅｉｎら、１９８８、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４４０〜４４４；Ｆｒｏｍｍら、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３〜８３９；Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ ＣｕｌｔｕｒｅのＴｏｍｅｓら、１９９５、「Ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｉｎｔａｃｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ，」：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ編、Ｇａｍｂｏｒｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ））；穀類（Ｈｏｏｙｋａａｓ−Ｖａｎ Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１１：７６３−７６４；米国特許第５，７３６，３６９）についてのプロトコルが挙げられる。

いくつかの実施形態において、１つより多い構築物が、トランスジェニック植物およびトランスジェニック植物細胞の産生における形質転換のために使用される。複数の構築物は、シス位またはトランス位に含まれ得る。好ましい実施形態において、各構築物は、プロモーターおよび他の制御配列を有する。

上記の形質転換技術のいずれかによって誘導される形質転換植物細胞が培養されて、植物全体が再生され、この植物は、形質転換された遺伝子型を有し、したがって所望の表現型を有する。このような再生技術は、組織培養物の増殖培地中の特定の植物ホルモンの操作に依存し、代表的には所望のヌクレオチド配列と一緒に導入される殺虫マーカーおよび／または除草マーカーに依存する。培養されたプロトプラストからの植物の再生は、当該分野において記載される（例えば、Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、ｐｐ．１２４−１７６、ＭａｃＭｉｌｌｉｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３；およびＢｉｎｄｉｎｇ、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、ｐｐ．２１−７３、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９８５）。再生はまた、植物のカルス、外植片、器官、またはそれらの一部から得られ得る。このような再生技術もまた、当該分野において記載される（例えば、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．３８：４６７−４８６のＫｌｅｅら、１９８７、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．）。

用語「植物」は、植物全体、苗条の栄養器官／構造体（例えば、葉、茎および塊茎）、根、花および花の器官／構造体（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄ずい、心皮、葯および珠柄）、種子（胚、胚乳、および種皮を含む）および果実（成熟した子房）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）および細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、毛状突起など）、ならびにそれらの子孫を含む。本発明の方法に使用され得る植物の分類は、形質転換技術を受け入れやすい高等植物および下等植物の分類を含み、この分類としては、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ類、および多細胞性の藻類が挙げられる。種々の倍数性レベル（異数体の植物、倍数体の植物、二倍体の植物、半数体の植物および半接合体の植物が挙げられる）の植物もまた、含まれる。

本発明の核酸分子が使用されて、本質的に任意の植物に対して所望の形質が与えられる。したがって、本発明は、広範な植物に対する用途を有し、これらの植物としては、ヌカボ属（Ａｇｒｏｔｉｓ）、ネギ属、パイナップル属、カシューナッツ属、セロリ属、ラッカセイ属、アスパラガス属、Ａｔｈａｍａｎｔｈａ属、ベラドンナ属、カラスコムギ属、ホウライチク属、ベタ属、アブラナ属、イヌムギ属、Ｂｒｏｗａａｌｉａ属、ツバキ属、アサ属、パパイヤ属、イナゴマメ属、ヒヨコマメ属、アカザ属、キコリウム属、ミカン属、スイカ属、トウガラシ属、ベニバナ属、ココヤシ属、コーヒー属、ハトムギ属、キュウリ属、カボチャ属、ギョウギシバ属、カモガヤ属、チョウセンアサガオ属、ニンジン属、カワラナデシコ属、ジギタリス属、ヤマノイモ属、アブラヤシ属、Ｅｌｉｕｓｉｎｅ属、トウダイグサ属、ウシノケグサ属、イチジク属、オランダイチゴ属、ゲンノショウコ属、ダイズ属、イネ科（Ｇｒａｍｉｎａｅ）、ワタ属、ヒマワリ属、Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ属、パラゴムノキ属、フヨウ属、オオムギ属、ヒヨス属、サツマイモ属、アキノノゲシ属、スイートピー属、ヒラマメ属、ユリ属、アマ属、ドクムギ属、ミヤコグサ属、ルピナス属、トマト属、マカダミア属、アジサイ属（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、リンゴ属、マンゴー属、キャッサバ属、オリガヌム属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、ウマゴヤシ属、バショウ属、スイセン属、ネメシア属、タバコ属、オノブリキス属、オリーブ属、Ｏｌｙｒｅａｅ属、イネ属、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、Ｐａｎｉｅｕｍ属、Ｐａｎｎｉｓｅｔｕｍ属、キカラシバ属、ペチュニア属、ペラルゴニウム属、アボガド属、Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ属、インゲンマメ属、アワガエリ属、トウヒ属、イチゴツナギ属、マツ属、トリバハゼノキ属（Ｐｉｓｔａｃｈｉａ）、エンドウ属、ドロノキ属、トガサワラ属、ナシ属、サクラ属、Ｐｓｅｕｔｏｔｓｕｇａ属、バンジロウ属、カシ属、キンポウゲ属、ダイコン属、スグリ属、ヒマ属、ツツジ属、バラ属、サトウキビ属、サルメンバナ属、ライムギ属、キオン属、セタリア属、コウヤマキ属、カラシ属、ナス属、モロコシ属、イヌシバ属、カカオノキ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍｕｓ）、レイリョウコウ属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、クローバー属、レイリョウコウ属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、パンコムギ属、ツガ属、チューリップ属、ソラマメ属、ブドウ属、アズキ属、およびトウモロコシ属由来の種が挙げられる。

特定の実施形態において、トランスジェニック植物は、トウモロコシ植物、ジャガイモ植物、米植物、大豆植物または綿植物である。

トランスジェニック植物は、育てられ得、そして同じ形質転換株または異なる株のいずれかによって受粉され得る。この植物の２つ以上の世代が育てられて、所望の核酸分子、ポリペプチドおよび／または表現型の特性の発現が安定に維持され、そして遺伝されることが確実にされ得る。当業者は、本発明の核酸分子が安定にトランスジェニック植物に組み込まれ、そして作動可能である確認された後、この核酸分子が雌雄の交雑によって他の植物に導入され得ることを認識する。多くの標準的な育種技術のいずれかが使用され得、交雑される種に依存する。

（５．８：トランスジェニック植物中の発現の決定）
当該分野において公知である任意の方法が、本発明の核酸分子またはそれにコードされるポリペプチドの植物中の発現のレベルを決定するために使用され得る。例えば、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドの植物中の発現レベルは、イムノアッセイ、定量的なゲル電気泳動などによって決定され得る。さらに、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドの植物中の発現レベルは、この植物の表現型が変化する程度によって決定され得る。特定の実施形態において、増強された昆虫抵抗性は、アッセイされるべき表現型である。

本明細書中で使用される場合、「増強した昆虫抵抗性」とは、本発明のポリペプチドを発現しない植物と比較して、害虫による消費および／または蔓延に対する本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物の上昇した抵抗性をいう。増強した抵抗性は、多くの手段で測定され得る。１つの実施形態において、増強した抵抗性は、同じ期間の昆虫の潜伏期間後に、本発明のポリペプチドを発現しない植物と比較して、本発明のポリペプチドを発現する植物に対する減少した損傷によって測定される。昆虫による損傷は、視覚的に評価され得る。例えば、綿植物において、蔓延後の損傷は、昆虫による消費の跡について綿植物のボウルを直接見ることによって測定され得る。別の実施形態において、増強した抵抗性は、同じ期間の昆虫の潜伏期間後に、本発明のポリペプチドを発現しない植物と比較して、本発明のポリペプチドを発現する植物から得られる増加した作物の収量によって測定される。特定の実施形態において、昆虫の害虫は、鱗翅目および／または双翅目に由来する。

決定は、全植物、全植物の組織、または植物細胞培養物を使用して行われ得る。

０．９７ＭＢであり、そして２００５年２月２４日に作成され、そして一緒に提出された配列表は、その全体が参考として援用される。

本明細書中に列挙される全ての刊行された文献、書籍、リファレンスマニュアルおよび抄録の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用され、これらは、本発明が関連する分野の状態をより完全に記載する。

種々の変更が、本発明の範囲および精神から逸脱せずに上記の内容においてなされ得る場合、上記の記載に含まれ、そして／または添付の特許請求の範囲に定義される全ての内容は、本発明の説明および例示として解釈されるべきことが意図される。本発明の改変およびバリエーションが、上述の教示を考慮して可能である。

（６．１：実施例１：第一次昆虫スクリーニング）
第一次昆虫スクリーニングは、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種に対する活性を有する多様な生物の収集物からＢｔ培養物を同定した。このスクリーニングを、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａの生まれたばかりの幼生に対して１回の高用量で、胞子−結晶複合体サンプルによって行った。

胞子−結晶複合体サンプルを、１ｍｌのＣＹＳ胞子形成培地（Ｙａｍａｍｏｔｏ、１９９０、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ４３２：４６−６０）を含む深いウェルの生成プレートにおいて調製した。この生成プレートを、１０μｌの種培養物で播種した。この種培養物は、−８０℃にて凍結を維持し、そして３０℃でインキュベートし、ほとんどの培養物が胞子形成し、そして遊離の胞子および結晶を放出するまで３５０ｒｐｍで３日間インキュベートしていた。このプレートを、４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離して、胞子、結晶および溶解していない細胞を沈殿させた。この沈殿した胞子−結晶複合体を、１００μｇのリソチームを含む１．２ｍｌの１５ｍＭ酢酸カリウムに懸濁し、そして３０℃、２５０ｒｐｍで１６時間インキュベートして完全な胞子形成および細胞の溶解を確実にした。１６時間のインキュベーションの後、胞子−結晶複合体を、遠心分離によって回収し、そして１５ｍＭの酢酸カリウムに懸濁した。この酢酸カリウム工程を、１回繰り返した。最終的な胞子−結晶懸濁物を、１ｍｌの１５ｍＭ酢酸カリウム中に作製し、そしてＨ．ｚｅａ活性についてのスクリーニングに使用した。

昆虫スクリーニングを、各ウェルに１５０μｌの人工の昆虫用食餌を含む浅い９６ウェルプレートにおいて行った。２０μｌの胞子−結晶懸濁物を、この昆虫用食餌上においた。約５匹の生まれたばかりの幼生を、各ウェル中においた。この昆虫アッセイプレートを２９℃で３日間インキュベートした。Ｂｔ結晶に応答する昆虫としては、摂食の阻害および死亡が挙げられた。約４００個の培養物は、実質的な死亡を示し、そしてこれによって陽性として同定した。Ｃｒｙ２Ａｘは、とりわけ陽性であった。

（６．２：実施例２：Ｃｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドを単離するためのＤＮＡシャッフリング）
Ｃｒｙ２Ａｘポリペプチド（配列番号２）およびＣｒｙ２Ａｂ＊ポリペプチド（Ｃｒｙ２Ａｂ^＊は、野生型Ｃｒｙ２Ａｂに対して２つのアミノ酸の変化を有する；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２３７２４の位置３６におけるＫからＲおよび位置２４１におけるＭからＴ）を初めとして、合成ＤＮＡの鋳型を、ＤＮＡシャッフリングのために生成した。Ｃｒｙ２Ａｂ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２３７２４）およびＣｒｙ２Ａｘ（配列番号２）の系統的な比較を使用して、ライブラリーを作製し、このライブラリーは４０個のアミノ酸の位置を変化させ（節５．１を参照のこと）、これらは、これらの２つのポリペプチド配列の間で異なっていた。シャッフリングしたＤＮＡライブラリーを、親ＤＮＡの鋳型として作用するＣｒｙ２Ａｘをコードする合成遺伝子とのシャッフリングを導いたオリゴヌクレオチドを使用して作製した。ＰＣＲ ＤＮＡライブラリーを、Ｃｒｙ２Ａｂ^＊遺伝子を置換することによってｐＭＡＸＹ３２１９にクローニングした。この毒素のクローンを、これらがＥ．ｃｏｌｉマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）への融合として発現されるように構築した。第一次昆虫スクリーニングは、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種に対して活性な培養物を同定した。このスクリーニングを、人工食餌中の１つの低用量にて、ＭＢＰ：：Ｃｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチド融合体を発現する少量のＥ．ｃｏｌｉ培養物を組み込み、次いでＨ．ｚｅａの幼生を蔓延させることによって行った。スクリーニングは、各ウェル中に人工の昆虫用食餌を含む１５０μｌの浅い９６ウェルプレートにおいて行った。約０．５μｌのＭＢＰ：：Ｃｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチド融合体を発現する培養物を、昆虫用食餌に組み込んだ。約５匹のＨ．ｚｅａの生まれたばかりの幼生を、各ウェル中においた。この昆虫アッセイプレートを、２９℃で４日間インキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉサンプルへの昆虫の応答としては、摂食の阻害および死亡が挙げられた。この幼生に深刻な発育阻止または死を引き起こすサンプルを、さらなる分析のために再び配列した。

この第１回のライブラリーのスクリーニングは、Ｃｒｙ２ＡｘおよびＣｒｙ２Ａｂ^＊に対して改良された殺虫活性を有する数種のクローンの発見を生じた。特に、クローン３８（Ｄ＿Ｓ００５０３４８０）（配列番号４）およびクローン４４（Ｄ＿Ｓ００５０３９７０）（配列番号６）が、発現した場合に非常に活性であることが見出された（データは示さず）。したがって、これらのクローンを、次の回のＤＮＡシャッフリングのために選択した。

第２回のシャッフリングのために、クローン３８（Ｄ＿Ｓ００５０３４８０）（配列番号４）およびクローン４４（Ｄ＿Ｓ００５０３９７０）（配列番号６）に由来する親ＤＮＡの鋳型を、ウラシルの存在下においてＰＣＲで増幅し、次いでウラシルＮ−グリコシラーゼによってフラグメント化した。次いでこのフラグメント化した鋳型を、混合し、組換え鋳型をＰＣＲによって増幅する前に再び集めた。これらのシャッフリングした鋳型のライブラリーを、上記に記載したように、ｐＭＡＸＹ３２１９において作製した。第１回および第２回のシャッフリングから単離したクローンのいくつかの配列を表３に示し、変化したアミノ酸残基を示した。

第２回のシャッフリングでヒットした最も活性を有するものの１つ（クローン４７３Ｒ（Ｄ＿Ｓ０１０３７６７７）（配列番号１８））をさらに多様化するために、ポリペプチドのアミノ末端領域における最初の４６個のアミノ酸残基を改変して、８個のＣｒｙ２ポリペプチド配列（すなわち、Ｃｒｙ２Ａａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｃ、Ｃｒｙ２Ａｄ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２Ａｆ、Ｃｒｙ２Ａｇ、およびＣｒｙ２Ａｘ）中に見出される残基を含ませた。さらに、２個の残基（Ｉ１３およびＤ１５）を、保存的残基であるバリンおよびグルタミン酸でそれぞれ置換した（表４を参照のこと）。この改変したクローンを、クローン４７３Ｎ（配列番号８）と称した。

（６．３：実施例３：Ｃｒｙ２Ａｘ由来ポリペプチドの活性）
シャッフリングしたクローンの活性のスクリーニングを、数種の段階において実施した。最初に、このクローンを、一齢のＨ．ｚｅａの幼生に対する人工食餌にクローンの融合タンパク質を発現する少量のＥ．ｃｏｌｉを提供することによって、高い殺虫活性についてスクリーニングした。この幼生の完全な死または完全な発育阻止のいずれかを引き起こすクローンを、さらなる研究のために選択した。次いで高い殺虫活性を実証したクローンを使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中の植物発現ベクターにおける新しいライブラリーを作製した。このライブラリーを、４つの複製物における各クローンをＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの幼生と一緒に培養し（それぞれの培養物の強制的な浸潤を使用する）、次いで単一の三齢のＨ．ｚｅａの幼生にそれぞれ対応する花盤（ｄｉｓｋ）を供給することによってスクリーニングした。２４時間のインキュベーション期間の後、この摂食活性を、目視観察によって決定し、そして残った葉の面積のおおよその割合として示した。

Ｅ．ｃｏｌｉ発現／食餌組み込みアッセイのさらなる繰り返しを通過したクローンを、植物発現ベクターｐＭＡＸＹ４３８４に個々に再びクローニングし、そして上記のように、インプランタ（ｉｎ ｐｌａｎｔａ）での効力について試験した。Ｅ．ｃｏｌｉ発現重層アッセイおよび植物ライブラリーアプローチから得た最良のヒットの最終的なインプランタ活性の評価を、図１に示す。この分析から、数種のクローン（７Ｋ（Ｄ＿Ｓ０１０００７７９）（配列番号１０）、１５Ｋ（Ｄ＿Ｓ００９９９０８０）（配列番号１２）、１６Ｋ（Ｄ＿Ｓ０１０００２６９）（配列番号１４）、１６Ｒ（Ｄ＿Ｓ０１０３７１４３）（配列番号１６）、および４７３Ｒ（Ｄ＿Ｓ０１０３７６７７）（配列番号１８）が挙げられる）は、増加した殺虫活性を有するようであった。

（６．４：実施例４：さらなるＣｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドを単離するためのＤＮＡシャッフリング）
節６．２に記載される通り、第１回および第２回のシャッフリングで的中したものであるクローン４４（Ｄ＿Ｓ００５０３９７０）（配列番号６）、４７３Ｒ（Ｄ＿Ｓ０１０３７６７７）（配列番号１８）およびＣｒｙ２Ａｂ＊を、さらなるシャッフリングのための鋳型として使用した。これらの鋳型およびシャッフリングを導いたオリゴヌクレオチドを使用して、野生型Ｃｒｙ２ポリペプチド（すなわち、Ｃｒｙ２ＡｅおよびＣｒｙ２Ａｇ）からのアミノ酸多様性を有する誘導されたポリペプチドを産生し、そしてコンピューターにより、特定の構造的ループ領域のセグメント内にランダムな保存的アミノ酸置換およびランダムな置換を生成した。シャッフリングしたＤＮＡライブラリーを、Ｃｒｙ２Ａｂ＊遺伝子を置換することによってｐＭＡＸＹ３２１９にクローニングした。この毒素のクローンを、これらのクローンがＥ．ｃｏｌｉマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と融合して発現されるように構築した。単離した配列の概要を、表５〜７に示す。

（６．５：実施例５：さらなるＣｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドの活性）
綿の害虫Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａに対するシャッフリングされた誘導ポリペプチドの活性を評価するするために、クローン融合タンパク質を発現する全Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を含む人工食餌を使用するハイスループットスクリーニングを、上記のように実施した。高レベルの活性を有するクローンを、インプランタ活性についてさらに試験して、それぞれの誘導したポリペプチドに伴う変化が、植物細胞中の遺伝子発現またはタンパク質の蓄積に負の影響を与えないことを確認した。このプロセスを開始するために、各Ｃｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベースの植物発現ベクターにクローニングし、宿主Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を形質転換し、次いでマイクロタイターディッシュに並べた。次いで上記のヒットしたクローンを、４つの複製物の各々についてＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの幼生と一緒に培養し（それぞれの培養物の強制的な浸潤を使用する）、次いで単一の三齢のＨ．ｚｅａの幼生にそれぞれ対応する花盤（ｄｉｓｋ）を供給することによってスクリーニングした。２４時間のインキュベーション期間の後、各花盤に対する摂食活性を、映像取り込みおよび上記のような分析方法によって決定した。このプロセスから得たいくつかの誘導したポリペプチドは、親のクローンに比べて改良されていた。このようなクローンの１つは、Ｄ＿Ｓ０１７６４７０１（配列番号１３４）であり、これは、クローン４４を超える改良された活性を示した。摂食アッセイの結果を、３つの実験について図２に示した。

（６．６：実施例６：クローン４４を発現するトランスジェニック植物）
クローン４４（Ｄ＿Ｓ００５０３９７０）を発現するトランスジェニックタバコ植物を、バイナリーベクターｐＭＡＸＹ５４６９およびｐＭＡＸＹ５４７１を使用してグリフォサート選択で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換によって産生した。これらのベクターは、ｄＳＶＢＶ駆動性ＧＡＴ遺伝子およびｄＭＭＶ駆動性クローン４４核酸分子のクローン４４（配列番号５）を含む。ｐＭＡＸＹ５４６９は、ｐＭＡＸＹ５４６９が、この毒素改変体がプラスミドの区画に蓄積するように、クローン４４のコード領域に融合されたシグナルを標的とするプラスチドを含む点で、ｐＭＡＸＹ５４７１とは異なる。約２５個の形質転換体を、各構築物について産生した。クローン４４を発現する葉の花盤（ｌｅａｆ ｄｉｓｋ）を、４８ウェルタイタートレイ中の寒天の床上におき、次いで三齢のＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａの幼生または四齢のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａの幼生いずれかを蔓延させた。これらの葉を、上記の虫と共に２４時間インキュベートし、次いで後で取り除かれる幼生およびこれらの葉の残りを、相対的な残りの葉の面積（画素数）を正確に計算するためのビデオキャプチャー装置によって観察した。各ベクターに対する最高の形質転換体を使用した結果を、Ｈ．ｚｅａに関しては図３Ａに示し、そしてＳ．ｅｘｉｇｕａに関しては図３Ｂに示す。各トランスジェニック植物は、示される通り、分析のために採取された６個の葉の花盤を有する。

プラスチド（図４Ａ）または細胞質区画（図４Ｂ）におけるトランスジェニックタバコ植物中のその後のクローン４４ポリペプチドの発現を、クローン４４ポリペプチドを指向するポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングによってアッセイした。図４におけるレーンの番号は、図３における植物の番号に対応する。

ウェスタンブロッティングにおいて使用されるポリクローナル抗体を、トリプシンで短縮した精製クローン４４ポリペプチドによってニワトリを免疫し、次いで基質としてトリプシンで短縮したクローン４４ポリペプチドを用いて作製したアフィニティーカラムを使用してＣｒｙ２特異的抗体を精製することによって調製した。

２つの型のトランスジェニック植物の間の最も明らかな違いは、Ｓ．ｅｘｉｇｕａの阻害は、プラスチドに蓄積した毒素のほうが非常に大きい点である（図３Ｂの右および左のパネルを比較する）。発現のデータ（図４）と組み合わせたこれらのデータは、５４６９に由来するＴ−ＤＮＡを有する植物（図４Ａ）が、５４７１の植物（図４Ｂ）よりずっと多く毒素を産生し得ることを示す。

図１は、第２回のシャッフリングから得たＤＮＡクローンの殺虫活性を示す。各クローンは、強制的な浸潤を使用してＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉において発現された。各葉の花盤は、単一の三齢のＨ．ｚｅａの幼生に供給された。２４時間のインキュベーション期間の後、摂食活性は、目視観察によって決定され、そして残った葉の面積のおおよその割合として示された。ｙ軸は、昆虫に対する曝露後に残った葉の花盤の％である。ｘ軸は、この葉の花盤中に発現したクローンである。数種のクローン（例えば、７Ｋ（Ｄ＿Ｓ０１０００７７９）（配列番号１０）、１５Ｋ（Ｄ＿Ｓ００９９９０８０）（配列番号１２）、１６Ｋ（Ｄ＿Ｓ０１０００２６９）（配列番号１４）、１６Ｒ（Ｄ＿Ｓ０１０３７１４３）（配列番号１６）、および４７３Ｒ（Ｄ＿Ｓ０１０３７６７７） （配列番号１８））は、増加した殺虫活性を示した（ｓｈｏｅｄ）。 図２は、第１回にシャッフリングされたクローン４４（Ｄ＿Ｓ００５０３９７０）の殺虫活性および第３回にシャッフリングされたクローンＤ＿Ｓ０１７６４７０１の殺虫活性を示す。各クローンは、強制的な浸潤を使用してＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉において発現された。各葉の花盤は、単一の三齢のＨ．ｚｅａの幼生に供給された。２４時間のインキュベーション期間の後、摂食活性は、この葉の花盤のビデオキャプチャーによって決定された。ｙ軸は、取り込まれた葉の花盤の画像の画素の％の数である。ｘ軸は、この葉の花盤中に発現したクローンである。結果は、３つの実験の平均について示される。それぞれの実験に対して、少なくとも８個の葉の花盤が、各クローンについて試験された。 図３Ａ〜３Ｂは、第１回にシャッフリングされたクローン４４をプラスチド区画（左のパネル）または細胞質（右のパネル）に発現する、トランスジェニックタバコ植物についての効力の結果を示す。（Ａ）Ｈ．ｚｅａ阻害または（Ｂ）Ｓ．ｅｘｉｇｕａ阻害の効力は、これらの虫と一緒に葉を２４時間インキュベーションした後に決定された。残った葉の量を、相対的な残りの葉の面積（画素の数）を正確に計算するためのビデオキャプチャー装置によって観察した。各トランスジェニック植物、分析のために採取された６個の葉の花盤を有した。２５個のトランスジェニック植物は、それぞれの導入遺伝子構築物を使用して作製されたので、この番号は、特定の構築物を使用する異なる植物を区別する。 図４Ａ〜４Ｂは、第１回にシャッフリングされたクローン４４を発現するトランスジェニック植物中の導入遺伝子の発現レベルを示す。このシャッフリングされたＣｒｙ２由来のポリペプチドは、ｐＭＡＸＹ５４６９またはｐＭＡＸＹ５４７１を用いる形質転換によって、（Ａ）プラスチドの細胞内区画または（Ｂ）細胞質の細胞内区画にそれぞれ発現した。ウェスタンブロット分析は、第１回にシャッフリングされたクローン４４ポリペプチドの毒素領域を指向するポリクローナル抗体を使用して、トランスジェニック植物抽出物に対して行われた。ネガティブコントロールは、非形質転換植物から採取された抽出物であった。ポジティブコントロールは、２０ｎｇまたは４０ｎｇのいずれかの、精製したＣｒｙ２Ａｘ毒素であった。ポジティブコントロールＣｒｙ２Ａｘの分子量は、この植物抽出物中のＣｒｙ２Ａｘ由来のポリペプチドの分子量とは異なる（なぜなら前者はトリプシンによって活性化され、そして後者はプロ毒素であるからである）。

Claims (26)

1. 配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１３３、またはそれらの相補体のいずれかを含む単離された核酸分子。
2. 単離された核酸分子であって、以下：
   ａ）配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１３３、またはそれらの相補体のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
   ｂ）配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１３４のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
   からなる群より選択される、単離された核酸分子であって、該核酸分子は、Ｃｒｙ２Ａｘ（配列番号２）よりも強い殺虫活性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子。
3. 前記核酸分子が、Ｈ_２、Ｓ_７、Ｑ_２７、Ｑ_３５、Ｅ_３６、Ｋ_４３、Ｄ_４４、Ｎ_４５、Ｄ_５１、Ａ_５８、Ｖ_６９、Ｒ_７８、Ｎ_７９、Ｋ_９９、Ｔ_１１８、Ｖ_１２４、Ｅ_１２５、Ｒ_１２９、Ｎ_１３８、Ｒ_１３９、Ａ_１４１、Ｔ_１６２、Ｑ_１６５、Ｍ_１６６、Ｌ_１８３、Ｉ_１９２、Ｈ_２１１、Ｒ_２１３、Ｒ_２１７、Ｄ_２１８、Ｖ_３２４、Ｉ_３８６、Ｔ_３９９、Ｓ_４０５、Ｑ_４４５、Ｉ_５５１、Ｓ_５８７、Ｉ_５９１、Ｌ_６１０、およびＬ_６３１からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記載の単離された核酸分子。
4. 双翅目または鱗翅目が、前記ポリペプチドの前記殺虫活性に感受性である、請求項１または２に記載の単離された核酸分子。
5. 請求項１または２に記載の核酸分子を含有するベクター。
6. 発現ベクターである、請求項５に記載のベクター。
7. 請求項５に記載のベクターを含有する宿主細胞。
8. 前記細胞が、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞からなる群より選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
9. 配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１３４のいずれか１つを含む単離されたポリペプチド。
10. 単離されたポリペプチドであって、以下：
    ａ）配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１３４のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるポリペプチド；
    ｂ）配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１３３、またはそれらの相補体のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチド；
    からなる群より選択され、Ｃｒｙ２Ａｘ（配列番号２）よりも強い殺虫活性を有する、単離されたポリペプチド。
11. 前記ポリペプチドが、Ｈ_２、Ｓ_７、Ｑ_２７、Ｑ_３５、Ｅ_３６、Ｋ_４３、Ｄ_４４、Ｎ_４５、Ｄ_５１、Ａ_５８、Ｖ_６９、Ｒ_７８、Ｎ_７９、Ｋ_９９、Ｔ_１１８、Ｖ_１２４、Ｅ_１２５、Ｒ_１２９、Ｎ_１３８、Ｒ_１３９、Ａ_１４１、Ｔ_１６２、Ｑ_１６５、Ｍ_１６６、Ｌ_１８３、Ｉ_１９２、Ｈ_２１１、Ｒ_２１３、Ｒ_２１７、Ｄ_２１８、Ｖ_３２４、Ｉ_３８６、Ｔ_３９９、Ｓ_４０５、Ｑ_４４５、Ｉ_５５１、Ｓ_５８７、Ｉ_５９１、Ｌ_６１０、およびＬ_６３１からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
12. 双翅目または鱗翅目が、前記ポリペプチドの前記殺虫活性に感受性である、請求項９または１０に記載の単離されたポリペプチド。
13. トランスジェニック植物であって、以下：
    （ａ）配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１３４のいずれかのポリペプチド；または
    （ｂ）配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１３３のいずれか１つの核酸分子、
    を発現する導入遺伝子を含む、トランスジェニック植物。
14. 前記植物が、トウモロコシ、大豆、ジャガイモ、および綿からなる群より選択される、請求項１３に記載のトランスジェニック植物。
15. 前記トランスジェニック植物が、遺伝子組換えではない植物に比べて、害虫に対する増加した抵抗性を有する、請求項１３に記載のトランスジェニック植物。
16. 双翅目または鱗翅目が、前記害虫である、請求項１５に記載のトランスジェニック植物。
17. トランスジェニック植物であって、以下：
    （ａ）請求項１０に記載のポリペプチド、または
    （ｂ）請求項２に記載の核酸分子、
    を発現する導入遺伝子を含む、トランスジェニック植物。
18. 前記植物が、トウモロコシ、大豆、ジャガイモ、および綿からなる群より選択される、請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
19. 前記トランスジェニック植物が、遺伝子組換えではない植物に比べて、害虫に対する増加した抵抗性を有する、請求項１７に記載のトランスジェニック植物。
20. 双翅目または鱗翅目が、前記害虫である、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
21. 配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１３４の１つ以上のポリペプチド、および薬剤を含有する、殺虫剤としての使用のための組成物であって、該薬剤が、拡散−固着補助剤、安定化剤、殺虫剤、希釈剤、界面活性剤、乳化剤、および分散剤からなる群より選択される、組成物。
22. 前記組成物が、細胞をさらに含有する、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記細胞が、完全な細胞または溶解した細胞である、請求項２２に記載の組成物。
24. 前記細胞が、懸濁物またはペレットである、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記組成物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの胞子−結晶複合体をさらに含有する、請求項２１に記載の組成物。
26. 前記ポリペプチドが、精製される、請求項２１に記載の組成物。

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