ES2552053T3 - Nuevos polipéptidos cristalinos de Bacillus thuringiensis, polinucleótidos, y composiciones de los mismos - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la SEQ ID NO: 133 o un complemento de la misma; o que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.

Description

Nuevos polipéptidos cristalinos de Bacillus thuringiensis, polinucleótidos, y composiciones de los mismos

1. Campo de lainvención

La presente invención se refiere en general al campo del control de plagas y proporciona polipéptidos insecticidas relacionados con polipéptidos Cry2 de Bacillus y los polinucleótidos que los codifican. La presente invención también se refiere a métodos y composiciones para alterar la resistencia de las plantas a la depredación por insectos incluyendo, pero no limitado a la producción de plantas transgénicas.

2. Antecedentes de la invención

Muchas plantas comercialmente valiosas, incluyendo cultivos agrícolas comunes, son susceptibles de ataque por plagas de insectos y nematodos. Estas plagas pueden producir reducciones sustanciales en el rendimiento y calidad del cultivo. Tradicionalmente, los agricultores se han basado en gran medida en plaguicidas químicos para combatir los daños por plagas. Sin embargo, el uso de plaguicidas químicos trae su propio conjunto de problemas, incluyendo el coste e inconveniencia de aplicar los plaguicidas. Además los residuos químicos dan lugar a problemas medioambientales y de salud. Por estas y otras razones, hay una demanda de agentes insecticidas alternativos.

Un procedimiento que no daña el medio ambiente para controlar plagas es el uso de proteínas cristalinas plaguicidas derivadas de la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis (“Bt”), denominada normalmente “proteínas Cry”. Muchas de estas proteínas son bastante tóxicas para insectos objetivo específicos, pero inofensivas para plantas y otros organismos a los que no van dirigidas. Algunas proteínas Cry se han expresado de forma recombinante en plantas de cultivos para proporcionar plantas transgénicas resistentes a plagas. Entre estas, se han cultivado ampliamente el algodón y maíz transgénicos Bt.

Se ha aislado un gran número de proteínas Cry, caracterizadas y clasificadas basándose en la homología de la secuencia de aminoácidos (Crickmore et al., 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62: 807-813). Este esquema de clasificación proporciona un mecanismo sistemático para nombrar y clasificar proteínas Cry recientemente descubiertas.

En general se ha encontrado que las proteínas Cry individuales tienen un espectro de actividad relativamente estrecho con la excepción de Cry2A. Cry2A es inusual en cuanto que este subconjunto de proteínas Cry tienen un intervalo de eficacia más amplio que incluye toxicidad tanto para el orden de insectos Lepidopetera como Diptera. Se descubrió que la proteína Cry2A era una toxina que mostraban una actividad dual contra Trichoplusia ni (falso medidor) y Aedes taeniorhynchus (mosquito) (Yamamoto y McLaughlin,1982, Biochem. Biophys. Res. Comm. 130: 414-421). La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína Cry2A (denominada Cry2Aa) se clonó y expresó en

B. megaterium y se encontró que era activa tanto contra insectos Lepidoptera como Diptera (Donovan et al. 1988, J. Bacteriol. 170: 4732-4738). Se clonó una secuencia codificante adicional homóloga a Cry2Aa (denominada Cry2Ab) y se encontró que era activa solo contra las larvas de Lepidoptera (Widner y Whiteley, 1989, J Bacteriol 171:2).

La segunda generación de cultivos transgénicas podría ser más resistente a insectos si son capaces de expresar múltiples y/o nuevos genes Bt. Por consiguiente, serían muy deseables nuevas proteínas insecticidas que tengan un amplio espectro de actividad.

3. Resumen dela invención

La presente invención describe un nuevo polipéptido Cry2, Cry2Ax (SEQ ID NO: 2), aislado de Bacillus thuringiensis y proporciona algunas variantes del mismo derivadas del polipéptido Cry2Ax, incluyendo fragmentos. También se describen métodos de producción de los polipéptidos de la invención, p. ej., por medios recombinantes. También están abarcadas las composiciones que comprenden uno o más polipéptidos de la invención.

La presente invención también se refiere a las moléculas de ácido nucleico de Cry2Ax (SEQ ID NO: 1) y proporciona algunas moléculas de ácido nucleico derivadas de Cry2Ax. Los polipéptidos de la invención tienen mayor potencia que Cry2Ax. También están abarcados los vectores que comprenden ácidos nucleicos de la invención. También están abarcadas las células o plantas que comprenden los vectores de la invención.

La presente invención también se refiere a plantas transgénicas que expresan un ácido nucleico y/o polipéptido de la invención. Las plantas transgénicas puede expresar el transgén de cualquier forma conocida en la técnica, incluyendo, pero no limitado a expresión constitutiva, expresión regulada evolutivamente, expresión específica de tejidos, etc. También está abarcada la semilla obtenida de una planta transgénica de la invención.

Por lo tanto, la invención proporciona:

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la SEQ ID NO: 133 o un complemento de la misma; o que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134. La molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido con actividad insecticida. Diptera o Lepidoptera pueden ser sensibles a la actividad insecticida del polipéptido.

Un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico. El vector puede ser un vector de expresión.

Una célula hospedante que comprende dicho vector en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en células vegetales, bacterianas y fúngicas.

Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 134.

Una planta transgénica que comprende un transgén que expresa dicho polipéptido o molécula de ácido nucleico. La planta transgénica se puede seleccionar del grupo que consiste en maíz, soja, patata y algodón.

Una composición que comprende uno o más polipéptidos de SEQ ID NO: 134 y un agente, en donde el agente se selecciona del grupo que consiste en adyuvantes esparcidores-adhesivos, agentes estabilizantes, agentes insecticidas, diluyentes, tensioactivos, emulsionantes y dispersantes. La composición puede comprender además células. Las células pueden ser enteras o lisadas, y estar en suspensión o sedimentadas. La composición puede comprender además un complejo de espora-cristal de Bacillus thuringiensis. Se puede purificar.

Semilla de una planta transgénica como se ha definido antes, en donde dicha semilla contiene dicho transgén.

4. Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la actividad insecticida de clones de ADN del segundo ciclo de barajado. Cada clon se expresó en hojas de N. benthamiana usando infiltración forzada. Cada disco de hoja se dio de alimento a una sola larva del tercer estadio de H. zea. Después de un periodo de incubación de 24 horas, se determinó la actividad de alimentación por observación visual y se expresó como una fracción aproximada del área de la hoja que quedaba. El eje y es el porcentaje del disco de hoja que queda después de exposición al insecto. El eje x es el clon expresado en el disco de hoja. Varios clones mostraron actividad insecticida aumentada tales como 7K (D_S01000779) (SEQ ID NO: 10), 15K (D_S00999080) (SEQ ID NO: 12), 16K (D_S01000269) (SEQ ID NO: 14), 16R (D_S01037143) (SEQ ID NO: 16), y 473R (D_S01037677) (SEQ ID NO: 18).

La figura 2 muestra la actividad insecticida del clon 44 (D_S00503970) del primer ciclo de barajado y del clon D_S01764701 del tercer ciclo de barajado. Cada clon se expresó en hojas de N. benthamiana usando infiltración forzada. Cada disco de hoja se dio de alimento a una larva del tercer estadio de H. zea. Después de un periodo de incubación de 24 horas, se determinó la actividad de alimentación mediante captura con vídeo del disco de la hoja. El eje y es el número de píxeles presentes en la imagen del disco de hoja capturada. El eje x es el clon expresado en el disco de la hoja. Los resultados se muestran para la media de tres experimentos. Para cada experimento se ensayaron al menos 8 discos de hojas para cada clon.

Las figuras 3A-3B muestran los resultados de eficacia para plantas de tabaco transgénicas que expresan el clon 44 del primer ciclo de barajado en el compartimento de plastidio (paneles de la izquierda) o en el citoplasma (panales de la derecha). La eficacia de inhibición de (A) H. zea o (B) S. exigua se determinó después de incubación de las hojas con gusanos durante 24 horas. La cantidad de la hoja que quedaba se observó con equipamiento de captura con vídeo para el cálculo real del área relativa de la hoja que quedaba (número de píxeles). Se tomaron de cada planta transgénica 6 discos de hoja para el análisis. Debido a que se hicieron 25 plantas transgénicas usando cada construcción de transgén, los números distinguen diferentes plantas usando una construcción particular.

Las figuras 4A-4B muestran niveles de expresión de transgenes en plantas transgénicas que expresan el clon 44 de primer ciclo de barajado. Este polipéptido derivado de Cry2 barajado se expresó en los compartimentos subcelulares

(A) de plastidio o (B) citoplasmáticos, por transformación con pMAXY5469 o pMAXY5471, respectivamente. Se llevó a cabo el análisis por transferencia Western en extractos de plantas transgénicas usando un anticuerpo policlonal dirigido contra la región de la toxina del polipéptido del clon 44 de primer ciclo de barajado. Los controles negativos eran extractos tomados de una planta no transformada. Los controles positivos eran 20 ng o 40 ng de toxina Cry2Ax purificada. El peso molecular del control positivo Cry2Ax difiere del polipéptido derivado de Cry2Ax en los extractos de plantas, porque el primero es activado por tripsina y el último es protoxina.

5. Descripción detallada

La presente invención proporciona polipéptidos insecticidas relacionados con polipéptidos Cry2 de Bacillus. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la invención. Están abarcados los métodos para usar los polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención para potenciar la resistencia de las plantas a la depredación por insectos.

5.1. Polipéptidos de la invención

La presente invención describe un nuevo polipéptido Cry2, Cry2Ax (SEQ ID NO: 2), aislado de Bacillus thuringiensis. Están abarcados en la presente invención polipéptidos derivados de Cry2Ax de (SEQ ID NO: 134) y polipéptidos codificados por la SEQ ID NO: 133 (véase la sección 5.2).

También se describen polipéptidos análogos. Los polipéptidos análogos pueden tener restos que se han modificado, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula a los polipéptidos Cry2Ax o derivados de Cry2Ax. Por

ejemplo, pero no a modo de limitación, un polipéptido análogo se puede modificar, p. ej. por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Un polipéptido análogo se puede modificar por modificaciones químicas usando técnicas conocidas para los expertos en la técnica, incluyendo, pero no limitado a la escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un análogo de un polipéptido de la invención puede contener uno o más aminoácidos clásicos.

Los métodos de producción de los polipéptidos de la invención, p. ej., por medios recombinantes, también se describen (véase la sección 5.6).

Las composiciones que comprenden uno o más polipéptidos de la invención también están abarcadas. Las composiciones de la invención pueden comprender además agentes adicionales incluyendo, pero no limitados a adyuvantes esparcidores-adhesivos, agentes estabilizantes, otros aditivos insecticidas, diluyentes, agentes que optimizan las propiedades reológicas o la estabilidad de la composición, tales como por ejemplo, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes y/o polímeros.

5.2. Ácidos nucleicos de la invención

La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico de Cry2Ax (SEQ ID NO: 1) y proporciona moléculas de ácido nucleico derivadas de Cry2Ax de SEQ ID NO: 133 y moléculas de ácido nucleico que codifican la SEQ ID NO: 134 (véase la sección 5.1).

Vectores que comprenden ácidos nucleicos de la invención también están abarcados. Células o plantas que comprenden los vectores de la invención también están abarcados.

Las expresiones “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” en la presente memoria se refiere a un polímero mono o bicatenario de bases desoxirribonucleótidas o ribonucleótidas leídas del extremo 5’ al 3’. Incluye ADN cromosómico, plásmidos de autorreplicación y ADN o ARN que realizan una función principalmente estructural. El término “codificante” se refiere a una secuencia de polinucleótido que codifica uno o más aminoácidos. El término no requiere un codón de inicio o de parada. Una secuencia de aminoácidos puede ser codificada en uno cualquiera de seis marcos de lectura diferentes proporcionados por una secuencia de polinucleótido y su complemento.

La tabla 1 describe secuencias de Cry2Ax y derivadas de Cry2Ax y el número de identificación de secuencia correspondiente.

5.3. Secuencias derivadas de Cry2Ax

Los polipéptidos y ácidos nucleicos derivados de Cry2Ax se puede crear introduciendo una o más sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de Cry2Ax o ácidos nucleicos relacionados, de modo que se introducen una o más sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. En general, las secuencias derivadas de Cry2Ax se crean con el fin de acentuar una característica deseable o reducir una característica indeseable de un polipéptido Cry2Ax. En una realización, los polipéptidos derivados de Cry2Ax tienen actividad insecticida mejorada frente a Cry2Ax, incluyendo, pero no limitado a mayor potencia y/o mayor espectro de plagas de insectos. En otra realización, los polipéptidos derivados de Cry2Ax son expresados mejor que Cry2Ax incluyendo, pero no limitado a, mayor semivida, menos susceptible a la degradación y/o transcripción o traducción más eficaces.

La molécula de ácido nucleico Cry2Ax (SEQ ID NO: 1) se puede usar como un molde para crear nucleótidos derivados de Cry2Ax. Por ejemplo, se usa un ácido nucleico relacionado con Cry2Ax como molde para crear nucleótidos derivados de Cry2Ax. En particular, se puede usar Cry2Ab* como un molde. Cry2Ab* tiene dos cambios de aminoácidos con respecto a Cry2Ab de tipo natural (de K a R en la posición 36 y de M a T en la posición 241, del número de acceso a GenBank M23724). En otra realización específica, se pueden usar clones aislados de un ciclo de alteración como molde para otros ciclos de alteración (p. ej., clones 38, 44 y 473R; véase las secciones 6.2 y 6.4).

Las alteraciones de secuencias se pueden introducir por técnicas convencionales tales como técnicas de evolución molecular dirigida, p. ej., métodos de barajado de ADN (véase, p. ej., Christians et al., 1999, Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri et al., 1998, Nature, 391:288-291; Crameri, et al., 1997, Nature Biotechnology 15:436-438; Crameri et al., 1996, Nature Biotechnology 14:315-319; Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; Stemmer et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:10747-10751; patentes de EE.UU. nº 5.605.793; 6.117.679; 6.132.970; 5.939.250; 5.965.408; 6.171.820; publicaciones internacionales nº WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; y WO 01/75767); mutagénesis dirigida (véase, p. ej., Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82:488492; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177-183); mutagénesis dirigida por oligonucleótido (véase, p. ej., Reidhaar-Olson et al., 1988, Science 241:53-57); mutagénesis química (véase, p. ej., Eckert et al., 1987, Mutat. Res. 178:1-10); PCR propensa a error (véase, p. ej., Caldwell y Joyce, 1992, PCR Methods Applic. 2:28-33); y mutagénesis de casete (véase, p. ej., Arkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89:7871-7815); (véase en general, p. ej., Arnold, 1993, Curr. Opinion Biotechnol. 4:450-455; Ling et al., 1997, Anal. Biochem., 254(2):157-78; Dale et al., 1996, Methods Mol. Biol. 57:369-74; Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein et al., 1985, Science, 229:1193-1201; Carter, 1986,

Biochem. J. 237:1-7; Kramer et al., 1984, Cell 38:879-887; Wells et al., 1985, Gene 34:315-323; Minshull et al., 1999, Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290).

El barajado de ADN se puede usar para crear nucleótidos derivados de Cry2Ax. El barajado de ADN se puede llevar a cabo in vitro, in vivo, in silico o una combinación de los mismos. Se pueden llevar a cabo métodos in silico de recombinación en los que se usan algoritmos genéticos en un ordenador para recombinar cadenas de secuencias que corresponden a ácidos nucleicos homólogos (o incluso no homólogos). Las cadenas de secuencias recombinadas resultantes se convierten opcionalmente en ácidos nucleicos por síntesis de ácidos nucleicos que corresponden a las secuencias recombinadas, p. ej., en concierto con técnicas de reensamblaje de genes por síntesis de oligonucleótidos. Este procedimiento puede generar alteraciones aleatorias, parcialmente aleatorias o diseñadas. Muchos detalles relacionados con la recombinación in silico, incluyendo el uso de algoritmos genéticos, operadores genéticos y similares en sistemas de ordenador, combinados con la generación de los correspondientes ácidos nucleicos así como combinaciones de ácidos nucleicos diseñados (p. ej., basados en selección de entrecruzamiento de sitios), así como métodos de recombinación diseñada, pseudoaleatoria o aleatoria, están descritos en la técnica (véase, p. ej., las publicaciones internacionales nº WO 00/42560 y WO 00/42559).

En otra realización, se usa la mutagénesis dirigida para crear nucleótidos derivados de Cry2Ax seleccionando secuencias de nucleótidos particulares o posiciones del Cry2Ax o ácido nucleico relacionado para la alteración. Dichas mutaciones dirigidas se pueden introducir en cualquier posición en el ácido nucleico. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en restos de aminoácidos “no esenciales” o “esenciales”. Un resto de aminoácido “no esencial” es un resto que se puede alterar respecto a la secuencia de tipo natural, sin alterar la actividad biológica, mientras que un resto de aminoácido “esencial” es necesario para al menos una actividad biológica del polipéptido. Por ejemplo, los restos de aminoácidos que no son conservados o son solo semiconservados entre homólogos de varias especies pueden ser no esenciales para la actividad. Alternativamente, los restos de aminoácidos que son conservados entre los homólogos de varias especies pueden ser esenciales para la actividad.

Dichas mutaciones dirigidas pueden ser conservativas o no conservativas. Una “sustitución de aminoácido no conservativa” es una en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral diferente. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. j., ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en ß (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Alternativamente o además de sustituciones de restos de aminoácidos no conservativas, dichas mutaciones dirigidas pueden ser conservativas. Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada de forma recombinante y se puede determinar la actividad de la proteína.

La mutagénesis aleatoria se usa para crear nucleótidos derivados de Cry2Ax. Se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante (p. ej., por mutagénesis de saturación). En algunas realizaciones, se pueden usar secuencias de nucleótidos que codifican otros polipéptidos relacionados que tienen dominios similares, patrones estructurales, sitios activos, o que se alinean con una parte del Cry2Ax con errores de apareamiento o apareamientos imperfectos, en el procedimiento de mutagénesis para generar diversidad de secuencias.

Debe entenderse que para cada etapa de mutagénesis en algunas de las técnicas mencionadas antes, se pueden llevar a cabo una serie de ciclos iterativos de cualquiera o de todas las etapas, para optimizar la diversidad de secuencias. Los métodos descritos antes se pueden usar en combinación en cualquier orden deseado. En muchos casos, los métodos producen un conjunto de secuencias de ácidos nucleicos alteradas o un conjunto de células hospedantes recombinantes que comprenden secuencias de ácido nucleico alteradas. Las secuencias de ácidos nucleicos alteradas o células hospedantes que expresan una secuencia de ácido nucleico alterada con las características deseadas, se puede identificar por cribado con uno o más ensayos conocidos en la técnica. Los ensayos se pueden llevar a cabo en condiciones que seleccionan los polipéptidos que tienen las características físicas o químicas deseadas. Las alteraciones en la secuencia de ácido nucleico se pueden determinar secuenciando la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido alterado en los clones.

Adicionalmente, se puede llevar a cabo la optimización de codones de moléculas de ácido nucleico de Cry2Ax y derivadas de Cry2Ax, sea totalmente o en parte. Debido a que cualquier aminoácido (excepto la metionina) es codificado por una serie de codones (tabla 2), la secuencia de la molécula de ácido nucleico se puede cambiar sin cambiar los aminoácidos codificados. La optimización de codones es cuando se alteran uno o más codones a nivel del ácido nucleico de modo que no se cambian los aminoácidos pero aumenta la expresión en un organismo hospedante particular. Los expertos en la técnica reconocerán que están disponibles en la técnica tablas y otras referencias que proporcionan información de preferencia para una amplia variedad de organismos.

5.4. Métodos de evaluación de la actividad insecticida

Como se usa en la presente memoria, la expresión “actividad insecticida” se refiere a la capacidad de un polipéptido para disminuir o inhibir la alimentación del insecto y/o aumentar la mortalidad del insecto tras la ingestión del polipéptido. Aunque puede afectar a cualquier insecto, preferiblemente afecta a insectos de las órdenes Lepidoptera y Diptera.

Se puede usar una variedad de ensayos para determinar si un polipéptido particular de la invención tiene actividad insecticida, y si la tiene, en qué grado. En general, se proporciona a una plaga de insectos un polipéptido de la invención en cualquier forma que pueda ser ingerida. Se observa la reacción de la plaga de insectos a la ingestión del polipéptido de la invención (p. ej., durante aproximadamente 1 a 3 días). Una disminución o inhibición de la alimentación y/o un aumento de la mortalidad de la plaga de insectos después de ingestión del polipéptido de la invención, son indicadores de actividad insecticida. Un polipéptido de la invención con actividad insecticida desconocida debe compararse con un control positivo y/o negativo para evaluar con más precisión el resultado del ensayo.

En un procedimiento, un polipéptido de la invención se purifica (sea en forma soluble o en forma cristalina) y se añade a la dieta del insecto.

En otro procedimiento, un polipéptido de la invención se expresa en un microbio recombinante (p. ej., E. coli). El microbio recombinante se alimenta directamente a las plagas de insectos (véase, Moellenbeck et al., 2001, Nat. Biotechnol. 19:668).

En otro procedimiento, el polipéptido de la invención se expresa en una planta y la planta se da de alimento a la plaga de insectos. Después del periodo de incubación, la actividad de alimentación de la plaga de insectos se puede determinar por observación visual (p. ej., de la fracción aproximada del área de hoja que queda), o mediante captura con vídeo (p. ej., número de píxeles en un área de hoja que queda) de las partes de la planta que normalmente se habría comido la plaga de insectos. La expresión del polipéptido de la invención en la planta puede ser transitoria. En dichos métodos, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención se clona en un vector de expresión de planta y se transfecta a Agrobacterium tumefaciens. La bacteria transformada se cocultiva con una hoja de N. benthamiana, y usando infiltración forzada, la hoja expresa el polipéptido de la invención. Sin embargo, la expresión del polipéptido es variable entre cocultivos de hojas. En otro método específico, la expresión del polipéptido de la invención en la planta es estable. En dichas realizaciones, se hace una planta transgénica que expresa un polipéptido de la invención.

En otro procedimiento, la actividad insecticida de un polipéptido de la invención se puede ensayar midiendo la muerte celular y/o el crecimiento celular usando células cultivadas. Dichos ensayos típicamente implican el uso de células de insecto cultivadas que son sensibles a la toxina particular que se está cribando, o células que expresan un receptor para la toxina particular, sea de forma natural o como resultado de la expresión de un gen heterólogo. Por lo tanto, además de las células de insecto, las células de mamífero, bacterianas y de levadura, están entre las células útiles en los ensayos in vitro. Están descritos en la técnica bioensayos in vitro que miden la toxicidad contra células cultivadas (p. ej., Johnson, 1994, J. Invertebr. Pathol. 63:123-129).

En otro procedimiento, se puede evaluar la actividad insecticida de un polipéptido de la invención midiendo la formación de poros en vesículas de membrana epitelial del intestino medio derivadas de insectos diana (Juttner y Ebel, 1998, Biochim. Biophys. Acta 1370:51-63; English et al., 1991, Insect Biochem. 21:177-184). Dicho ensayo puede constituir la liberación condicional de toxinas de un sustrato activado por ligando del lumen de las vesículas de membrana. Esto requiere que el ligando esté en el exterior de la vesícula. Alternativamente, también se puede usar el escenario inverso, de modo que el ligando está en el lumen de la vesícula y el sustrato listo para ser activado está situado fuera de la vesícula. Cuanto mayor es la actividad de la toxina mayor es el número o tamaño de poros formados.

5.5. Métodos de potenciación de la resistencia a insectos en plantas.

La presente invención se refiere a métodos de potenciación de la resistencia de plantas a plagas de insectos incluyendo, pero no limitado a miembros de Helicoverpa ssp. (p. ej., Helicoverpa Zea) y/o Spodoptera ssp. (p. ej., Spodopter exigua) mediante el uso de polipéptidos insecticidas relacionados con Cry2. Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para hacer que las plagas de insectos ingieran uno o más polipéptidos de la invención mientras se alimentan en la planta. Como tal, la plaga de insectos ingerirá cantidades insecticidas de uno

o más polipéptidos de la invención y pueden detener la alimentación en la planta. En algunas realizaciones, la plaga de insectos se mata mediante la ingestión de uno o más polipéptidos de la invención. En otras realizaciones, se inhibe o disuade a las plagas de insectos para que se alimenten en la planta sin matarlas.

En un método, las plantas transgénicas se pueden hacer para expresar uno o más polipéptidos de la invención (véase en general la sección 5.7 para los métodos de producción de plantas transgénicas). La planta transgénica puede expresar el uno o más polipéptidos de la invención en todos los tejidos (p. ej., expresión global). Alternativamente, el uno o más polipéptidos de la invención se pueden expresar en solo un subconjunto de tejidos

(p. ej., expresión específica de tejido), preferiblemente los tejidos consumidos por la plaga de insectos. Los

polipéptidos de la invención se pueden expresar de forma constitutiva en la planta o bajo el control de un promotor inducible.

En otro método, una composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención se puede aplicar externamente a una planta susceptible a las plagas de insectos. La aplicación externa de la composición incluye la aplicación directa a la planta, entera o en parte, y/o la aplicación indirecta, p. ej., al entorno que rodea la planta tal como el suelo. La composición se puede aplicar mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a pulverización, espolvoreo, aspersión, o similares. En general, la composición se puede aplicar en cualquier momento durante el crecimiento de la planta. Un experto en la técnica puede usar métodos conocidos en la técnica para determinar empíricamente el momento óptimo de administración de la composición. Los factores que afectan al momento óptimo de administración incluyen, pero no se limitan, al tipo de planta susceptible, al tipo de plaga de insectos, cual de uno o más polipéptidos de la invención se administran en la composición.

La composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención puede ser polipéptidos sustancialmente purificados, una suspensión celular, un sedimento celular, un líquido sobrenadante de células, un extracto celular, o un complejo de espora-cristal de células de Bacillus thuringiensis (véase en general la sección 5.6 para las técnicas de síntesis de polipéptidos recombinantes). La composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención puede estar en forma de una solución, una emulsión, una suspensión o un polvo. Las formulaciones líquidas pueden tener base acuosa o no acuosa y se pueden proporcionar en forma de espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables, o similares. Las formulaciones pueden incluir agentes además del uno o más polipéptidos de la invención. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender además adyuvantes esparcidores-adhesivos, agentes estabilizantes, otros aditivos insecticidas, diluyentes, agentes que optimizan las propiedades reológicas o la estabilidad de la composición, tales como, por ejemplo, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes o polímeros.

En otro método, los hospedantes recombinantes que expresan uno o más polipéptidos de la invención se aplican en

o cerca de una planta susceptible al ataque por una plaga de insectos. Los hospedantes recombinantes incluyen, pero no se limitan a hospedantes microbianos y virus de insectos que se han transformado con y expresan una o más moléculas de ácido nucleico (y por lo tanto polipéptidos) de la invención. En algunas realizaciones, el hospedante recombinante segrega el polipéptido de la invención en el entorno de su alrededor para así ponerse en contacto con la plaga de insectos. En otras realizaciones, los hospedantes recombinantes colonizan uno o más tejidos de plantas susceptibles a la infestación por insectos.

5.6. Expresión recombinante

Las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de la invención se pueden expresar de forma recombinante usando técnicas convencionales de ADN recombinante y clonación molecular, que son bien conocidas en la técnica (p. ej., Sambrook, Fritsch, y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989). Además, se pueden usar técnicas de ADN recombinante para crear construcciones de ácidos nucleicos adecuadas para usar para hacer plantas transgénicas (véase la sección 5.7).

Por consiguiente, un aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención, o una variante de la misma. Como se usa en la presente memoria, el término “vector” se refiere a un polinucleótidos capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se han introducido segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde se pueden introducir segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico.

Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedante en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales). Otros vectores (p. ej., vectores no episomales) son integrados en el genoma de una célula hospedante tras la introducción en la célula hospedantes, y de este modo son replicados junto con el genoma del hospedante. En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinantes a menudo están en forma de plásmidos (vectores). Sin embargo, la invención se pretende que incluya dichas otras formas de vectores de expresión tales como vectores víricos (p. ej., retrovirus de replicación defectuosa).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión de la molécula de ácido nucleico en una célula hospedante. Esto significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladores, seleccionadas basándose en las células hospedantes que se van a usar para la expresión, que están operativamente asociadas con el polinucleótido que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, “operativamente asociado” se pretende que signifique que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la o las secuencias reguladoras en una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedante cuando el vector se introduce en una célula hospedante). La expresión “secuencia reguladora” se pretende que incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras están descritas en la técnica (p. ej., Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 1990, Academic Press, San Diego, CA). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una

secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedantes y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en determinadas células hospedantes (p. ej., secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedante que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, la zona del organismo en la que se desea la expresión, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en célula hospedantes para así producir proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por moléculas de ácido nucleico como se describe en la presente memoria.

En algunas realizaciones, se pueden introducir ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o potenciadores, en la posición adecuada (en general corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de la presente invención, para así regular por aumento o por disminución la expresión de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, se pueden alterar promotores endógenos in vivo por mutación, eliminación y/o sustitución (véase, la patente de EE.UU. nº 5.565.350; solicitud de patente internacional PCT/US93/03868), o se pueden introducir promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y distancia adecuadas de un gen cognado de un polinucleótido de la presente invención, para así controlar la expresión del gen. La expresión de genes se puede modular en condiciones adecuadas para el crecimiento de la planta, para así alterar la concentración total y/o alterar la composición de los polipéptidos de la presente invención en la célula vegetal. Por lo tanto, la presente invención proporciona composiciones y métodos para hacer promotores y/o potenciadores heterólogos operativamente unidos a una forma endógena natural (es decir, no heteróloga) de un polinucleótido de la presente invención.

Si se desea la expresión del polipéptido, en general es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región codificante del polinucleótido. La región de poliadenilación se puede obtener del gen natural, de una variedad de otros genes de plantas, o de T-DNA. La secuencia del extremo 3’ a añadir se puede obtener, por ejemplo, de genes de la nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente de cualquier otro gen de planta, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariota.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión de un polipéptido de la invención en células procariotas (p. ej., Enterobacteriaceae, tales como Escherichia; Bacillaceae; Rhizoboceae, tales como Rhizobium y Rhizobacter, Spirillaceae, tales como photobacterium; Zymomonas; Serratia; Aeromonas; Vibrio; Desulfovibrio; Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae) o eucariotas (p. ej., células de insecto que usan vectores de expresión de baculovirus, células de levadura, células vegetales o células de mamíferos) (véase, Goeddel, véase antes, para una descripción de células hospedantes adecuadas). Alternativamente, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor de T7 y T7 polimerasa.

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo lo más a menudo en E. coli con vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o no fusión. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a una proteína codificada de los mismos, normalmente en el extremo amino de la proteína recombinante. Dichos vectores de fusión típicamente tienen tres fines: 1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y/o 3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen el Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusiona glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

En otra realización, el vector de expresión es un vector de expresión de levaduras. Los ejemplos de los vectores para la expresión en levaduras S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al., 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA), y pPicZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA).

Alternativamente, el vector de expresión es un vector de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (p. ej., células Sf 9) incluyen las series pAc series (Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y las series pVL (Lucklow y Summers, 1989, Virology 170:31-39).

En otra realización más, un ácido nucleico de la invención se expresa en células vegetales usando un vector de expresión de planta incluyendo, pero no limitado a vectores de expresión del virus del mosaico del tabaco y virus de la patata.

Otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al. 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Se puede usar una serie de promotores en la práctica de la invención. Los promotores se pueden seleccionar basándose en el resultado deseado. Los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, específicos de tejido, inducibles u otros, para la expresión en el organismo hospedante.

Un “promotor específico de tejido” puede dirigir la expresión de ácidos nucleicos de la presente invención en un tejido, órgano o tipo de célula específicos. Los promotores específicos de tejido pueden ser inducibles. Igualmente, los promotores específicos de tejido pueden promover solo la transcripción dentro de un determinado marco de tiempo o etapa del desarrollo dentro de ese tejido. Otros promotores específicos de tejido pueden ser activos a lo largo del ciclo de vida de un tejido particular. Un experto en la técnica reconocerá que un promotor específico de tejido puede dirigir la expresión de secuencias operativamente unidas en tejidos distintos del tejido diana. Por lo tanto, como se usa en la presente memoria, un promotor específico de tejido es uno que dirige la expresión con preferencia en el tejido o tipo de célula diana, pero puede conducir también a algo de expresión en otros tejidos también. Se puede usar una serie de promotores específicos de tejidos en la presente invención. Con el promotor adecuado, se puede dirigir a cualquier órgano, tal como órganos/estructuras vegetativas de vástago (p. ej., hoja, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (p. ej., brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embriones, endospermo y cubierta de la semilla) y fruto. Por ejemplo, los promotores que dirigen la expresión de ácidos nucleicos en hojas, raíces o flores, son útiles para potenciar la resistencia a plagas que infectan esos órganos. Para la expresión de un polinucleótido de la presente invención en los órganos vegetativos aéreos de una planta, se pueden usar promotores específicos de órganos fotosintéticos, tales como el promotor RBCS (Khoudi et al., Gene 197:343, 1997). La expresión específica de raíces de polinucleótidos de la presente invención se puede lograr bajo el control de un promotor específico de raíz, tal como, por ejemplo, el promotor del gen ANR1 (Zhang y Forde, Science, 279:407, 1998). Otros promotores de ejemplo incluyen el gen de la glutamina sintetasa específica de raíz de la soja (Hirel et al., 1992, Plant Molecular Biology 20:207-218) y el elemento de control específico de raíz en el gen GRP 1.8 de la judía francesa (Keller et al., 1991, The Plant Cell 3:1051-1061).

Un “promotor constitutivo” se define como un promotor que dirigirá la expresión de un gen en todos los tejidos y es activo bajo la mayoría de las condiciones ambientales y estadios de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de inicio de la transcripción del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, el promotor 1’-o 2’-derivado de T-DNA de Agrobacterium tumafaciens, y otras regiones de inicio de la transcripción de diferentes genes de plantas conocidos para los expertos en la técnica. Dichos genes incluyen, por ejemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang et al. 1996, Plant Mol. Biol. 33:125-139), Cat3 de Arabidopsis (nº de acceso en GenBank U43147, Zhong et al., 1996, Mol. Gen. Genet. 251:196-203), el gen que codifica la proteína desaturasa transportadora de estearoil-acilo de Brassica napus (nº de acceso en GenBank X74782, Solocombe et al. 1994, Plant Physiol. 104:1167-1176), GPc1 del maíz (nº de acceso en GenBank X15596, Martinez et al., 1989, J. Mol. Biol. 208:551-565), y Gpc2 del maíz (nº de acceso en GenBank U45855, Manjunath et al., 1997, Plant Mol. Biol. 33:97112). Se puede usar cualquier promotor constitutivo fuerte, tal como el promotor de CaMV 35S, para la expresión de polinucleótidos de la presente invención por toda la planta.

La expresión “promotor inducible” se refiere a un promotor que está bajo control medioambiental y de desarrollo preciso. Los ejemplos de condiciones medioambientales que afectan a la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias, temperatura elevada, la presencia de luz o pulverización con productos químicos/hormonas.

Los promotores constitutivos para usar en una célula hospedante vegetal incluyen, por ejemplo, el promotor del núcleo del promotor de Rsyn7 y otros promotores constitutivos relacionados (publicación internacional nº WO 99/43838 y patente de EE.UU. nº 6.072.050); el promotor del núcleo de CaMV 35S (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723-2730); promotor de ALS (patente de EE.UU. nº 5.659.026), y similares (p. ej., patentes de EE.UU. nº 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611).

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedantes en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Las expresiones “célula hospedante” y “célula hospedante recombinante” se usan de forma intercambiable en la presente memoria. Se entiende que dichos términos se refieren no solo a la célula objeto particular, sino a la progenie o potencial progenie de dicha célula. Puesto que pueden ocurrir varias modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias medioambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero todavía están incluidas dentro del alcance de la expresión usada en la presente memoria.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una célula hospedante que tiene un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de la invención, o una variante del mismo. Una célula hospedante puede ser cualquier célula procariota (p. ej., E. coli, Bacillus thuringiensis) o eucariota (p. ej., células de insecto, células de levadura o planta). La invención también proporciona un método para expresar un ácido nucleico de la invención, de modo que hacer el polipéptido codificado comprende las etapas de i) cultivar una célula que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención en condiciones que permiten la producción del polipéptido codificado; y ii) aislar el

polipéptido expresado.

El ADN vector se puede introducir en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usa en la presente memoria, los términos “transformación” y “transfección” se pretende que se refieran a una variedad de técnicas reconocidas en la materia para introducir moléculas de ácido nucleico extrañas en una célula hospedante, incluyendo la coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedantes se pueden encontrar en la técnica (p. ej., Sambrook et al., véase antes).

5.7. Producción de plantas transgénicas

Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para transformar una planta o célula vegetal con una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico se pueden incorporar en el ADN de la planta (p. ej., ADN genómico o ADN de cloroplasto) o mantener sin inserción en el ADN de la planta (p. ej., mediante el uso de cromosomas artificiales). Los métodos adecuados para introducir moléculas de ácido nucleico en las células vegetales incluyen microinyección (Crossway et al., 1986, Biotechniques 4:320-334); electroporación (Riggs et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:5602-5606; D’Halluin et al., 1992, Plant Cell 4:14951505); transformación mediada por Agrobacterium (patentes de EE.UU. nº 5.563.055 y 5.981.840, Osjoda et al., 1996, Nature Biotechnology 14:745-750; Horsch et al., 1984, Science 233:496-498, Fraley et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:4803, y Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed., Springer-Verlag, Berlin 1995); transferencia directa de genes (Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3:2717-2722); aceleración balística de partículas (patentes de EE.UU. nº 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244; 5.932.782; Tomes et al., 1995, "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips, Springer-Verlag, Berlin; y McCabe et al., 1988, Biotechnology 6:923-926); transformación mediada por virus (patentes de EE.UU. nº 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 y 5.316.931); transformación por polen (De Wet et al., 1985, en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al., Longman, New York, pág. 197209); transformación con Lec 1 (solicitud de patente de EE.UU. nº de Ser. 09/435.054; publicación internacional nº WO 00/28058); transformación mediada por whisker (Kaeppler et al., 1990, Plant Cell Reports 9:415-418; Kaeppler et al., 1992, Theor. Appl. Genet. 84:560-566); y tecnología de transformación con cloroplastos (Bogorad, 2000, Trends in Biotechnology 18: 257-263; Ramesh et al., 2004, Methods Mol Biol. 274:301-7; Hou et al., 2003, Transgenic Res. 12:111-4; Kindle et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:1721-5; Bateman y Purton, 2000, Mol Gen Genet. 263:404-10; Sidorov et al., 1999, Plant J. 19:209-216).

La elección de los protocolos de transformación usados para generar plantas y células de plantas transgénicas puede variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta, es decir monocotiledónea o dicotiledónea, prevista para la transformación. Los ejemplos de protocolos de transformación particularmente adecuados para un tipo de planta particular incluye aquellos para: patata (Tu et al., 1998, Plant Molecular Biology 37:829-838; Chong et al., 2000, Transgenic Research 9:71-78); soja (Christou et al., 1988, Plant Physiol. 87:671-674; McCabe et al., 1988, BioTechnology 6:923-926; Finer y McMullen, 1991, In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182; Singh et al., 1998, Theor. Appl. Genet. 96:319-324); maíz (Klein et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:4305-4309; Klein et al., 1988, Biotechnology 6:559-563; Klein et al., 1988, Plant Physiol. 91:440-444; Fromm et al., 1990, Biotechnology 8:833-839; Tomes et al., 1995, "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin)); cereales (Hooykaas-Van Slogteren et al., 1984, Nature 311:763-764; patente de EE.UU. nº 5.736.369).

En algunas realizaciones, se usa más de una construcción para la transformación en la generación de plantas y células vegetales transgénicas. Se pueden incluir múltiples construcciones en posiciones cis o trans. En realizaciones preferidas, cada construcción tiene un promotor y otras secuencias reguladoras.

Las células vegetales transformadas que derivan de cualquiera de las técnicas de transformación anteriores, se pueden cultivar para regenerar una planta entera que tiene el genotipo transformado y por lo tanto el fenotipo deseado. Dichas técnicas de regeneración se basan en la manipulación de determinadas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo tisular, típicamente basándose en un marcador biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. Se describe en la técnica la regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados (p. ej., Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pág. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pág. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985). La regeneración también se puede obtener a partir de callo de planta, explantes, órganos o partes de los mismos. Dichas técnicas de regeneración también están descritas en la técnica

(p. ej., Klee et al. 1987, Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486).

El término “planta” incluye plantas enteras, órganos/estructuras vegetativas de vástago (p. ej., hoja, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (p. ej., brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embriones, endospermo y cubierta de la semilla) y fruto (el ovario maduro), tejido vegetal (p. ej., tejido vascular, tejido fundamental, y similares), y células (p. ej., células oclusivas, ovocélulas, tricomas y similares) y progenie de los mismos. La clase de plantas que se pueden usar en métodos de la presente invención incluyen la clase de plantas superiores e inferiores que se pueden llevar a técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), gimnospermas, helechos y algas

multicelulares. También están incluidas plantas de una variedad de niveles ploidia, incluyendo aneuploidia, poliploidia, dipolidia, haploidia y plantas hemicigotas.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden usar para conferir los rasgos deseados esencialmente en cualquier planta. Por lo tanto, la invención tiene uso en una amplia variedad de plantas, incluyendo especies de los géneros Agrotis, Allium, Ananas, Anacardium, Apium, Arachis, Asparagus, Athamantha, Atropa, Avena, Bambusa, Beta, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Carica, Ceratonia. Cicer, Chenopodium, Chicorium, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Coix, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eliusine, Euphorbia, Festuca, Ficus, Fragaria, Geranium, Glycine, Graminae, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hibiscus, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lathyrus, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lupinus, Lycopersicon, Macadamia, Macrophylla, Malus, Mangifera, Manihot, Majorana, Medicago, Musa, Narcissus, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Olea, Olyreae, Oryza, Panicum, Panicum, Panieum, Pannisetum, Pennisetum, Petunia, Pelargonium, Persea, Pharoideae, Phaseolus, Phleum, Picea, Poa, Pinus, Pistachia, Pisum, Populus, Pseudotsuga, Pyrus, Prunus, Pseutotsuga, Psidium, Quercus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rhododendron, Rosa, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sequoia, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobromus, Trigonella, Trifolium, Trigonella, Tritium, Tsuga, Tulipa, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea.

En realizaciones específicas, las plantas transgénicas son plantas de maíz, patata, arroz, soja o algodón.

Las plantas transgénicas se pueden desarrollar y polinizar con la misma cepa transformada o diferentes cepas. Se pueden desarrollar dos o más generaciones de plantas para asegurar que la expresión de la molécula de ácido nucleico, polipéptido y/o característica fenotípica deseada se mantiene establemente y se hereda. Un experto en la técnica reconocerá que después de que la molécula de ácido nucleico de la presente invención es incorporada establemente en plantas transgénicas y se confirma que es operable, se puede introducir en otras plantas por cruce sexual. Se puede usar cualquiera de una serie de técnicas de reproducción convencionales, dependiendo de la especie que se va a cruzar.

5.8. Determinación de la expresión en plantas transgénicas

Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para determinar el nivel de expresión en una planta de una molécula de ácido nucleico de la invención o polipéptido codificado por la misma. Por ejemplo, el nivel de expresión en una planta de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de la invención, se puede determinar por inmunoensayo, electroforesis en gel cuantitativa, etc. Además, el nivel de expresión en una planta de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de la invención, se puede determinar por el grado con el que se altera el fenotipo de la planta. En una realización específica, la resistencia a insectos potenciada es el fenotipo a ensayar.

Como se usa en la presente memoria, “resistencia a insectos potenciada” se refiere a la mayor resistencia de una planta transgénica que expresa un polipéptido de la invención a ser consumida y/o infestada por una plaga de insectos, comparado con una planta que no expresa un polipéptido de la invención. La resistencia potenciada se puede medir de una serie de formas. En una realización, la resistencia potenciada se mide por el menor daño a una planta que expresa un polipéptido de la invención comparado con una planta que no expresa un polipéptido de la invención, después del mismo periodo de incubación con insecto. El daño por el insecto se puede evaluar visualmente. Por ejemplo en plantas de algodón, el daño después de infestación se puede medir mirando directamente en las cápsulas de la planta de algodón los signos de consumo por los insectos. En otra realización, la resistencia potenciada se mide por el mayor rendimiento de la cosecha de una planta que expresa un polipéptido de la invención comparado con una planta que no expresa un polipéptido de la invención después del mismo periodo de incubación con insecto. En realizaciones particulares, la plaga de insectos son del orden Lepidoptera y/o Diptera.

Se pueden hacer determinaciones usando las plantas enteras, tejidos de las mismas o cultivo de células vegetales.

6. Ejemplos

6.1. Ejemplo 1: Cribado de insectos primario

El cribado de insectos primario identificó cultivos Bt de una colección de biodiversidad que tenían actividad contra Helicoverpa spp. El cribado se llevó a cabo con muestras de complejo espora-cristal con una dosis alta contra larvas recién nacidas de Helicoverpa zea.

Se prepararon muestras de espora-cristal en placas de producción de pocillos profundos que contenían 1 ml de medio de esporulación CYS (Yamamoto, 1990, Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis 432:46-60). Las placas de producción se sembraron con 10 µl de cultivos de semillas que se habían mantenido congelados a -80ºC y se incubaron a 30ºC, 350 rpm durante 3 días hasta que la mayoría de los cultivos esporulaban y liberaban esporas libres y cristales. Las placas se centrifugaron a 4000 rpm, durante 40 min para precipitar esporas, cristales y células no lisadas. El complejo de espora-cristal precipitado se suspendió en 1,2 ml de acetato potásico 15 mM que contenía 100 µg de lisozima y se incubó a 30ºC, 250 rpm durante 16 h para asegurar la esporulación y lisis celular completas. Después de la incubación de 16 h, el complejo de espora-cristal se recogió por centrifugación y se

suspendió en acetato potásico 15 mM. La etapa del acetato potásico se repitió una vez. La suspensión de esporacristal final se hizo en 1 ml de acetato potásico 15 mM y se usó para cribar la actividad de H. zea.

El cribado de insectos se hizo en placas de 96 pocillos poco profundos que contenían 150 µl de dieta para insectos artificial en cada pocillo. Se pusieron 20 µl de suspensión de espora-cristal en la dieta para insectos. Se pusieron aproximadamente 5 larvas recién nacidas en cada pocillo. Las placas de ensayo con insectos se incubaron a 29ºC durante 3 días. Las respuestas de los insectos a los cristales Bt incluían inhibición de la alimentación y mortalidad. Aproximadamente 400 cultivos mostraron mortalidad sustancial y por lo tanto se identificaron como positivos. Cry2Ax estaba entre los positivos.

6.2. Ejemplo 2: Barajado de ADN para aislar polipéptidos derivados de Cry2Ax

Partiendo del polipéptido Cry2Ax (SEQ ID NO: 2) y el polipéptido Cry2Ab* (Cry2Ab* tiene 2 cambios de aminoácidos con respecto a Cry2Ab de tipo natural; de K a R en la posición 36 y de M a T en la posición 241 del nº de acceso en GenBank M23724), se crearon moldes de ADN sintético para el barajado de ADN. Usando una comparación filogenética de Cry2Ab (nº de acceso en GenBank M23724) y Cry2Ax (SEQ ID NO: 2) se creó una biblioteca que variaba las 40 posiciones de aminoácidos (véase la sección 5.1) que eran diferentes entre estas dos secuencias de polipéptidos. Las bibliotecas de ADN barajado se crearon usando barajado dirigido por oligonucleótido con el gen sintético que codifica Cry2Ax actuando como el molde de ADN original. Las bibliotecas de ADN por PCR se clonaron en pMAXY3219 sustituyendo el gen Cry2Ab*. Los clones de toxina se construyeron de modo que eran expresados como una fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP) de E. coli. El cribado de insectos primario identificó cultivos activos contra Helicoverpa spp. El cribado se llevó a cabo incorporando una pequeña cantidad de cultivo de

E. coli que expresaba la fusión de MBP::polipéptido derivado de Cry2Ax con una dosis baja en una dieta artificial seguido de infestación con larvas de H. zea. El cribado se hizo en placas de 96 pocillos poco profundos que contenían 150 µl de dieta para insecto artificial. Se incorporaron ∼0,5 ml de cultivo que expresa la fusión de MBP::polipéptido derivado de Cry2Ax en la dieta para insectos. Se pusieron aproximadamente 5 larvas recién nacidas de H. zea en cada pocillo. Las placas de ensayo con insectos se incubaron a 29ºC durante 4 días. Las respuestas de los insectos a las muestras de E. coli incluían inhibición de la alimentación y mortalidad. Las muestras que producían impedimento del desarrollo grave o muerte de las larvas se volvieron a ensayar para análisis posterior.

El cribado de esta biblioteca del primer ciclo condujo al descubrimiento de varios clones con actividad insecticida mejorada con respecto a Cry2Ax y Cry2Ab*. En particular, se encontró que los clones 38 (D_S00503480) (SEQ ID NO: 4) y 44 (D_S00503970) (SEQ ID NO: 6) eran muy activos cuando eran expresados (no se muestran los datos). Por lo tanto, estos clones se seleccionaron para un ciclo sucesivo de barajado de ADN.

Para el segundo ciclo de barajado, los moldes de ADN originales de los clones 38 (D_S00503480) (SEQ ID NO: 4) y 44 (D_S00503970) (SEQ ID NO: 6) se amplificaron por PCR en presencia de uracilo y después se fragmentaron con uracil N-glicosilasa. Después, los moldes fragmentados se mezclaron, reensamblaron antes de amplificar los moldes recombinantes por PCR. Se creó una biblioteca de estos moldes barajados en pMAXY3219 como se ha descrito antes. La secuencia de algunos de los clones aislados del primer y segundo ciclo de barajado se muestra en la tabla 3 que indica los restos de aminoácidos que estaban cambiados.

Con el fin de diversificar aún más uno de los aciertos del 2º ciclo de rendimiento superior, el clon 473R (D_S01037677) (SEQ ID NO: 18), los primeros 46 restos de aminoácidos en la región amino terminal del polipéptido se modificaron para contener restos encontrados en 8 secuencias del polipéptido Cry2 diferentes (es decir, Cry2Aa, Cry2Ab, Cry2Ac, Cry2Ad, Cry2Ae, Cry2Af, Cry2Ag, y Cry2Ax). Además, se sustituyeron dos restos, I13 y D15, por los restos conservativos valina y glutamato, respectivamente (véase la tabla 4). El clon modificado se denominó 473N (SEQ ID NO: 8).

6.3. Ejemplo 3: Actividad de polipéptidos derivados de Cry2Ax

El cribado de las actividades de los clones barajados se llevó a cabo en varias etapas. Inicialmente, se cribaron los clones de actividad insecticida alta proporcionando una pequeña cantidad de E. coli que expresaba una proteína de fusión del clon, en la dieta artificial para larvas del primer estadio de H. zea. Los clones que producían la muerte completa o el impedimento del desarrollo completo de las larvas se seleccionaron para el estudio posterior. Los clones que demostraban alta actividad insecticida después se usaron para crear una nueva biblioteca en un vector de expresión vegetal en Agrobacterium tumefaciens. La biblioteca se cribó mediante cocultivo de cada clon en 4 repeticiones con hojas de N. benthamiana (usando infiltración forzada de cada cultivo respectivo), y después alimentando con cada disco correspondiente a una sola larva del 3er estadio de H. zea. Después de un periodo de incubación de 24 horas, se determinó la actividad de alimentación mediante la observación visual y se expresó como una fracción aproximada del área de la hoja que quedaba.

Los clones que pasaron la repetición adicional de los ensayos de expresión en E. coli /incorporación en la dieta, se volvieron a clonar individualmente en el vector de expresión vegetal pMAXY4384 y se ensayó la eficacia en planta como se ha descrito antes. La evaluación de la actividad final en planta de los mejores aciertos del ensayo de varios niveles de expresión en E. coli y el procedimiento de biblioteca de plantas se muestra en la figura 1. A partir de este

análisis aparecieron varios clones que tenían actividad insecticida aumentada que incluían 7K (D_S01000779) (SEQ ID NO: 10), 15K (D_S00999080) (SEQ ID NO: 12), 16K (D_S01000269) (SEQ ID NO: 14), 16R (D_S01037143) (SEQ ID NO: 16), y 473R (D_S01037677) (SEQ ID NO: 18).

6.4. Ejemplo 4: Barajado de ADN para aislar polipéptidos derivados de Gry2Ax adicionales.

Los clones 44 (D_S00503970) (SEQ ID NO:6), 473R (D_S01037677) (SEQ ID NO: 18) que eran aciertos del 1er y 2º ciclo de barajado como se describe en la sección 6.2, y Cry2Ab* se usaron como moldes para el barajado posterior. Usando estos moldes y el barajado dirigido por oligonucleótido, se crearon polipéptidos derivados que tenían diversidad de aminoácidos respecto a los polipéptidos Cry2 de tipo natural (es decir, Cry2Ae y Cry2Ag) así como sustituciones de aminoácidos conservativas generadas aleatoriamente por ordenador y sustituciones aleatorias dentro de los segmentos de determinadas regiones de bucle estructurales. Las bibliotecas de ADN barajado se clonaron en pMAXY3219 sustituyendo el gen Cry2Ab*. Los clones de toxina se construyeron de modo que eran expresados como una fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP) de E. coli. Se muestra un resumen de las secuencias aisladas en las tablas 5-7.

6.5. Ejemplo 5: Actividad de polipéptidos derivados de Cry2Ax adicionales

Con el fin de evaluar la actividad de los polipéptidos derivados del barajado contra la plaga del algodón Helicoverpa zea, se llevó a cabo el cribado de alto rendimiento usando dieta artificial que contenía células enteras de E. coli que expresaban una proteína de fusión del clon, como se ha descrito antes. Se ensayó además en los clones que tenían un nivel alto de actividad, la actividad en la planta para confirmar que los cambios hechos a cada polipéptido derivado no tenían un impacto negativo en la expresión de genes o la acumulación de proteína en células vegetales. Para iniciar este procedimiento, se clonó cada polipéptido derivado de Cry2Ax en un vector de expresión vegetal basado en Agrobacterium tumefaciens, transformado en la cepa hospedante Agrobacterium y después dispuesto en matrices en placas de microvaloración. Después, los aciertos se cribaron cocultivando cada uno en 4 repeticiones con hojas de N. benthamiana (usando infiltración forzada de cada cultivo respectivo), seguido de alimentación con cada disco correspondiente a una sola larva del 3er estadio de H. zea. Después de un periodo de incubación de 24 horas, se determinó la actividad de alimentación en cada disco mediante la captura visual y el método de análisis descrito anteriormente. Algunos polipéptidos derivados de este procedimiento eran mejorados comparados con los clones originales. Uno de dichos clones es D_S01764701 (SEQ ID NO: 134) que mostró actividad mejorada frente al clon 44. Los resultados de los ensayos de alimentación se muestran para tres experimentos en la figura 2.

6.6. Ejemplo 6: Plantas transgénicas que expresan el clon 44

Se generaron plantas de tabaco transgénicas que expresaban el clon 44 (D_S00503970) mediante transformación mediada por Agrobacterium con selección con glifosato usando los vectores binarios pMAXY5469 y pMAXY5471. Estos vectores contienen un gen GAT dirigido por dSVBV y una molécula de ácido nucleico del clon 44 dirigido por dMMV (SEQ ID NO: 5). pMAXY5469 difiere de pMAXY5471 en cuanto que contiene señal directora de plastidio fusionada a la región codificante del clon 44, de modo que esta variante de toxina se acumulará en el compartimento de plastidio. Se generaron aproximadamente 25 transformantes para cada construcción. Se pusieron hojas de discos que expresaban el clon 44 en un lecho de agar en una bandeja de valoración de 48 pocillos y después se infestaron con larvas del 3er estadio de Helicoverpa zea, o larvas del 4º estadio de Spodoptera exigua. Las hojas se incubaron 24 horas con los gusanos y después se retiraron las larvas y se observó la hoja que quedaba con equipo de captura de vídeo, para el cálculo real del área relativa de la hoja que queda (número de píxeles). Los resultados usando los transformantes superiores para cada vector se muestran en la figura 3A para H. zea y figura 3B para S. exigua. Se tomaron para el análisis 6 discos de hojas de cada planta transgénica como se muestra.

La expresión del polipéptido del clon 44 en las plantas de tabaco transgénicas en el plastidio (figura 4A) o en el compartimento citoplasmático (figura 4B) se ensayó por transferencia Western usando un anticuerpo policlonal dirigido contra el polipéptido del clon 44. Los números de las bandas en la figura 4 corresponden a los números de planta en la figura 3.

El anticuerpo policlonal usado en la transferencia Western se preparó inmunizando pollos con polipéptido del clon 44 truncado con tripsina purificado y después purificando los anticuerpos específicos para Cry2 usando una columna de afinidad hecha con el polipéptido del clon 44 truncado con tripsina como el sustrato.

La diferencia más evidente entre los dos tipos de plantas transgénicas es que la inhibición de S. exigua es mucho mayor para la toxina acumulada en el plastidio (comparando los paneles derecho e izquierdo de la figura 3B). Estos datos junto con los datos de expresión (figura 4) muestran que las plantas que llevan el T-DNA derivado de 5469 (figura 4A) son capaces de producir mucha más toxina que las de 5471 (figura 4B).

Tabla 1: Secuencias de Cry2Ax y derivadas de Cry2Ax

Tabla 2: Tabla de codones

Aminoácidos

Codón

Alanina

Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína

Cys C UGC UGU

Ácido aspártico

Asp D GAC GAU

Ácido glutámico

Glu E GAA GAG

Fenilalanina

Phe F UUC UUU

Glicina

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina

His H CAC CAU

Isoleucina

Ile I AUA AUC AUU

Lisina

Lys K AAA AAG

Leucina

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Metionina

Met M AUG

Asparagina

Asn N AAC AAU

Prolina

Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina

Gln Q CAA CAG

Arginina

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina

Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina

Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina

Val V GUA GUC GUG GUU

Triptófano

Trp W UGG

Tirosina

Tyr Y UAC UAU

Tabla 4: Comparación de secuencias de polipéptidos Cry2 de tipo natural con el clon 473N

Tabla 5: Secuencias de clones de interés aisladas de barajado de ADN usando Cry2Ab* como original

Tabla 6: Cambios de las secuencias de aminoácidos de clones de interés aislados de barajado de ADN usando el clon 44 como original

Tabla 7: Cambios de las secuencias de aminoácidos de clones de interés aislados de barajado de ADN usando el clon 473R como original

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> BERMUDEZ, ERICKA EMIG, ROBIN MCBRIDE, KEVIN

5 YAMAMOTO, TAKASHI

<120> Nuevos polipéptidos cristalinos de Bacillus thuringiensis, polinucleótidos, y composiciones de los mismos

<130> 2119-4286US1

<140>

<141> 10 <150> 60/547.664

<151>

<160> 261

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1 15 <211> 1899

<212> ADN

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 1

20

<210> <211> <212> <213> 2 632 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

2

<210> <211> <212> <213>

3 1902 ADN Bacillus thuringiensis

5

<400> 3

10

<210> <211> <212> <213> 4 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

4

5

<210> <211> <212> <213> 5 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

5

5

<210> <211> <212> <213> 6 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

6

5

<210> <211> <212> <213> 7 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

7

5

<210> <211> <212> <213> 8 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

8

5

<210> <211> <212> <213> 9 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

9

10

<210> <211> <212> <213> 10 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

10

<210>

11

<211>

1902

5

<212> ADN

<213>

Bacillus thuringiensis

<400> 11

5

<210> <211> <212> <213> 12 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

12

5

<210> <211> <212> <213> 13 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

13

5

<210> <211> <212> <213> 14 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

14

5

<210> <211> <212> <213> 15 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

15

5

<210> <211> <212> <213> 16 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

16

5

<210> <211> <212> <213> 17 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

17

10

<210> <211> <212> <213> 18 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

18

5

<210> <211> <212> <213> 19 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

19

5

<210> <211> <212> <213> 20 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

20

5

<210> <211> <212> <213> 21 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

21

5

<210> <211> <212> <213> 22 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

22

5

<210> <211> <212> <213> 23 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

23

5

<210> <211> <212> <213> 24 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

24

5

<210> <211> <212> <213> 25 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

25

10

<210> <211> <212> <213> 26 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

26

5

<210> <211> <212> <213> 27 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

27

5

<210> <211> <212> <213> 28 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

28

5

<210> <211> <212> <213> 29 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

29

5

<210> <211> <212> <213> 30 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

30

5

<210> <211> <212> <213> 31 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

31

<210> 32

<211>

633

<212>

PRT

<213>

Bacillus thuringiensis

<400>

32

5

<210> <211> <212> <213> 33 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

33

10

<210> <211> <212> <213> 34 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

34

5

<210> <211> <212> <213> 35 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

35

5

<210> <211> <212> <213> 36 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

36

5

<210> <211> <212> <213> 37 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

37

5

<210> <211> <212> <213> 38 633 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

38

5

<210> <211> <212> <213> 39 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

39

<210>

40

10

<211> 634

<212>

PRT

<213>

Bacillus thuringiensis

<400> 40

<210> <211> <212> <213>

41 1905 ADN Bacillus thuringiensis

5

<400> 41

10

<210> <211> <212> <213> 42 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

42

5

<210> <211> <212> <213> 43 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

43

5

<210> <211> <212> <213> 44 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

44

5

<210> <211> <212> <213> 45 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

45

5

<210> <211> <212> <213> 46 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

46

5

<210> <211> <212> <213> 47 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

47

10

<210> <211> <212> <213> 48 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

48

5

<210> <211> <212> 49 1905 ADN

98

<213> Bacillus thuringiensis

<400>

49

<400>

57

5

<210> <211> <212> <213> 50 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

50

5

<210> <211> <212> <213> 51 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

51

5

<210> <211> <212> <213> 52 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

52

5

<210> <211> <212> <213> 53 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

53

5

<210> <211> <212> <213> 54 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

54

5

<210> <211> <212> <213> 55 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

55

10

<210> <211> <212> <213> 56 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

56

5

<210> <211> <212> <213> 57 1905 ADN Bacillus thuringiensis

109

5

<210> <211> <212> <213> 58 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

58

5

<210> <211> <212> <213> 59 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

59

5

<210> <211> <212> <213> 60 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

60

5

<210> <211> <212> <213> 61 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

61

5

<210> <211> <212> <213> 62 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

62

5

<210> <211> <212> <213> 63 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

63

10

<210> <211> <212> <213> 64 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

64

5

<210> <211> <212> <213> 65 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

65

5

<210> <211> <212> <213> 66 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

66

5

<210> <211> <212> <213> 67 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

67

5

<210> <211> <212> <213> 68 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

68

5

<210> <211> <212> <213> 69 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

69

<210> <211> <212> <213>

70 634 PRT Bacillus thuringiensis

5

<400> 70

5

<210> <211> <212> <213> 71 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

71

10

<210> <211> <212> <213> 72 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

72

5

<210> <211> <212> <213> 73 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

73

5

<210> <211> <212> <213> 74 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

74

5

<210> <211> <212> <213> 75 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

75

5

<210> <211> <212> <213> 76 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

76

5

<210> <211> <212> <213> 77 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

77

<210>

78

10

<211> 634

<212>

PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 78

5

<210> <211> <212> <213> 79 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

79

10

<210> <211> <212> <213> 80 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

80

5

<210> <211> <212> <213> 81 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

81

5

<210> <211> <212> <213> 82 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

82

5

<210> <211> <212> <213> 83 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

83

5

<210> <211> <212> <213> 84 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

84

5

<210> <211> <212> <213> 85 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

85

10

<210> <211> <212> <213> 86 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

86

<210> 87

<211>

1902

<212>

ADN

<213>

Bacillus thuringiensis

<400>

87

<210> <211> <212> <213>

88 634 PRT Bacillus thuringiensis

10

<400> 88

5

<210> <211> <212> <213> 89 1902 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

89

5

<210> <211> <212> <213> 90 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

90

5

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<400>

91

5

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<400>

92

5

<210> <211> <212> <213> 93 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

93

10

<210> <211> <212> <213> 94 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

94

5

<210> <211> <212> <213> 95 1905 ADN Bacillus thuringiensis

161

<400> 95

5

<210> <211> <212> <213> 96 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

96

5

<210> <211> <212> <213> 97 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

97

5

<210> <211> <212> <213> 98 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

98

5

<210> <211> <212> <213> 99 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

99

5

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<400>

100

5

<210> <211> <212> <213> 101 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

101

10

<210> <211> <212> <213> 102 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

102

5

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5

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<400>

104

5

<210> <211> <212> <213> 105 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

105

5

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<400>

106

5

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<400>

107

<210> 108

<211>

634

<212>

PRT

<213>

Bacillus thuringiensis

<400>

108

5

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<400>

109

10

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<400>

110

5

<210> <211> <212> <213> 111 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

111

5

<210> <211> <212> <213> 112 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

112

5

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<400>

113

5

<210> <211> <212> <213> 114 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

114

5

<210> <211> <212> <213> 115 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

115

<210>

116

10

<211> 634

<212>

PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 116

<210> <211> <212> <213>

117 1905 ADN Bacillus thuringiensis

5

<400> 117

10

<210> <211> <212> <213> 118 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

118

5

<210> <211> <212> <213> 119 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

119

5

<210> <211> <212> <213> 120 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

120

5

<210> <211> <212> <213> 121 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

121

5

<210> <211> <212> <213> 122 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

122

5

<210> <211> <212> <213> 123 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

123

10

<210> <211> <212> <213> 124 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

124

<210> 125

<211>

1905

<212>

ADN

<213>

Bacillus thuringiensis

<400>

125

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10

<400> 126

5

<210> <211> <212> <213> 127 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

127

5

<210> <211> <212> <213> 128 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

128

5

<210> <211> <212> <213> 129 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

129

5

<210> <211> <212> <213> 130 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

130

5

<210> <211> <212> <213> 131 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

131

10

<210> <211> <212> <213> 132 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

132

5

<210> <211> <212> <213> 133 1905 ADN Bacillus thuringiensis

213

<400> 133

5

<210> <211> <212> <213> 134 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

134

5

<210> <211> <212> <213> 135 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

135

5

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<400>

136

5

<210> <211> <212> <213> 137 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

137

5

<210> <211> <212> <213> 138 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

138

5

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<400>

139

10

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<400>

140

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<400>

141

5

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<400>

142

5

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<400>

143

5

<210> <211> <212> <213> 144 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

144

5

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<400>

145

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<400>

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5

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<400>

147

10

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<400>

148

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149

5

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<400>

150

5

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<400>

151

5

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<400>

152

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<900>

153

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PRT

<213>

Bacillus thuringiensis

<900>

154

5

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155

10

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<900>

156

5

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<400>

157

5

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<400>

158

5

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<400>

159

5

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<400>

160

5

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<400>

161

<210>

162

10

<211> 634

<212>

PRT

<213>

Bacillus thuringiensis

<900> 162

<210> <211> <212> <213>

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5

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10

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<400>

164

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<400>

165

5

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166

5

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<400>

167

5

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168

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169

10

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<400>

170

<210>

171

<211>

1905

265

<212>

ADN

<213>

Bacillus thuringiensis

<400>

171

5

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173

5

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<900>

174

5

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<400>

175

5

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<400>

176

5

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<900>

177

10

<210> <211> <212> <213> 178 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

178

5

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<400>

179

276

5

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<400>

180

5

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<400>

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<400>

182

5

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<400>

183

5

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<400>

184

5

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<400>

185

10

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<900>

186

5

<210> <211> <212> <213> 187 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

187

5

<210> <211> <212> <213> 188 634 PRT Bacillus thuringiensis

<900>

188

5

<210> <211> <212> <213> 189 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

189

5

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<400>

190

5

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<900>

191

<210> <211> <212> <213>

192 634 PRT Bacillus thuringiensis

5

<400> 192

5

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<400>

193

10

<210> <211> <212> <213> 194 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

194

5

<210> <211> <212> <213> 195 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

195

5

<210> <211> <212> <213> 196 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

196

5

<210> <211> <212> <213> 197 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

197

5

<210> <211> <212> <213> 198 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

198

5

<210> <211> <212> <213> 199 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

199

<210>

200

10

<211> 634

<212>

PRT

<213> Bacillus thuringiensis

<400> 200

5

<210> <211> <212> <213> 201 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

201

10

<210> <211> <212> <213> 202 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

202

5

<210> <211> <212> <213> 203 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

203

5

<210> <211> <212> <213> 204 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

204

5

<210> <211> <212> <213> 205 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

205

5

<210> <211> <212> <213> 206 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

206

5

<210> <211> <212> <213> 207 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

207

10

<210> <211> <212> <213> 208 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

208

<210>

209

<210>

217

<211>

1905

<212>

ADN

<213>

Bacillus thuringiensis

<210> <211> <212> <213>

210 634 PRT Bacillus thuringiensis

10

<400> 210

5

<210> <211> <212> <213> 211 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

211

5

<210> <211> <212> <213> 212 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

212

5

<210> <211> <212> <213> 213 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

213

5

<210> <211> <212> <213> 214 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

214

5

<210> <211> <212> <213> 215 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

215

10

<210> <211> <212> <213> 216 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

216

<211>

1905

<212>

ADN

<213>

Bacillus thuringiensis

<210> <211> <212> <213>

218 634 PRT Bacillus thuringiensis

10

<400> 218

5

<210> <211> <212> <213> 219 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

219

5

<210> <211> <212> <213> 220 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

220

5

<210> <211> <212> <213> 221 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

221

5

<210> <211> <212> <213> 222 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

222

5

<210> <211> <212> <213> 223 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

223

10

<210> <211> <212> <213> 224 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

224

5

<210> <211> <212> <213> 225 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

225

5

<210> <211> <212> <213> 226 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

226

5

<210> <211> <212> <213> 227 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

227

5

<210> <211> <212> <213> 228 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

228

5

<210> <211> <212> <213> 229 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

229

<210> <211> <212> <213>

230 634 PRT Bacillus thuringiensis

5

<400> 230

5

<210> <211> <212> <213> 231 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

231

10

<210> <211> <212> <213> 232 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

232

5

<210> <211> <212> <213> 233 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

233

5

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<400>

234

5

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<400>

235

5

<210> <211> <212> <213> 236 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

236

5

<210> <211> <212> <213> 237 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

237

<210>

238

10

<211> 634

<212>

PRT

<213>

Bacillus thuringiensis

<400> 238

<210> <211> <212> <213>

239 1905 ADN Bacillus thuringiensis

5

<400> 239

10

<210> <211> <212> <213> 240 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

240

5

<210> <211> <212> <213> 241 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

241

5

<210> <211> <212> <213> 242 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

242

5

<210> <211> <212> <213> 243 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

243

5

<210> <211> <212> <213> 244 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

244

5

<210> <211> <212> <213> 245 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

245

10

<210> <211> <212> <213> 246 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

246

<210> 247

<211>

1905

<212>

ADN

<213>

Bacillus thuringiensis

<210> <211> <212> <213>

248 634 PRT Bacillus thuringiensis

10

<400> 248

5

<210> <211> <212> <213> 249 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

249

5

<210> <211> <212> <213> 250 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

250

5

<210> <211> <212> <213> 251 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

251

5

<210> <211> <212> <213> 252 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

252

5

<210> <211> <212> <213> 253 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

253

10

<210> <211> <212> <213> 254 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

254

5

<210> <211> <212> <213> 255 1905 ADN Bacillus thuringiensis

380

<400> 255

5

<210> <211> <212> <213> 256 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

256

5

<210> <211> <212> <213> 257 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

257

5

<210> <211> <212> <213> 258 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

258

5

<210> <211> <212> <213> 259 1905 ADN Bacillus thuringiensis

<400>

259

5

<210> <211> <212> <213> 260 634 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

260

5

<210> <211> <212> <213> 261 632 PRT Bacillus thuringiensis

<400>

261

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la SEQ ID NO: 133 o un complemento de la misma; o

   que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. 2.-La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido con actividad insecticida.
2. 3.-El ácido nucleico aislado de la reivindicación 2, en donde Diptera o Lepidoptera son sensibles a la actividad insecticida del polipéptido. 4.-Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, 2 o 3.
3. 5.-Un vector de la reivindicación 4, que es un vector de expresión. 6.-Una célula hospedante que comprende el vector de la reivindicación 4 o 5, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en células vegetales, bacterianas y fúngicas.
4. 7.-Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 134. 8.-El polipéptido aislado de la reivindicación 7, en donde el polipéptido tiene una actividad insecticida. 9.-El polipéptido aislado de la reivindicación 8, en donde Diptera o Lepidoptera son sensibles a la actividad

   insecticida del polipéptido. 10.-Una planta transgénica que comprende un transgén que expresa

   (a)

   un polipéptido de la reivindicación 7; o

   (b)

   una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

5. 11.-La planta transgénica de la reivindicación 10, en donde la planta transgénica tiene una resistencia aumentada a una plaga de insectos comparado con una planta que no es transgénica. 12.-La planta transgénica de la reivindicación 11, en donde Diptera o Lepidoptera es la plaga de insectos. 13.-La planta transgénica de la reivindicación 10 u 11, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste en

   maíz, soja, patata y algodón. 14.-Una composición que comprende uno o más polipéptidos de SEQ ID NO: 134 y un agente, en donde el agente

   se selecciona del grupo que consiste en adyuvantes esparcidores-adhesivos, agentes estabilizantes, agentes insecticidas, diluyentes, tensioactivos, emulsionantes y dispersantes. 15.-La composición de la reivindicación 14, en donde la composición comprende además células. 16.-La composición de la reivindicación 15, en donde las células son enteras o lisadas. 17.-La composición de la reivindicación 16, en donde las células están en suspensión o sedimentadas. 18.-La composición de la reivindicación 14, en donde la composición además comprende un complejo de espora

   cristal de Bacillus thuringiensis; o en donde el polipéptido está purificado. 19.-Semilla de una planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde dicha semilla contiene dicho transgén.