JP2023040705A - トランス型ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換生物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本開示は、１０５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイド（トランス－１、４－ポリイソプレン）を酵素反応的に製造する方法を提供する。【解決手段】 本開示は、脂質膜非結合下で分子量１０４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質を、生体外で脂質膜に結合させる結合工程を含むトランス型ポリイソプレノイドの製造方法である。【選択図】なし

Description

本開示は、トランス型ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換生物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法に関する。

現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）やクワ科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培することで得られるが、このような天然ゴムは、イソプレン単位がシス型に結合したポリイソプレノイド（シス型の天然ゴム）である。他方、天然には、イソプレン単位がトランス型に結合したポリイソプレノイドであるトランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）も存在する。

トランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）は、天然には、中国原産の落葉高木であるトチュウ目トチュウ科のトチュウ（杜仲）などの少数の植物が産生することが知られており、トチュウの種や果皮組織などから抽出することで得られる。また、化学合成によって得ることも可能である。このようなトランスゴムは、シス型の天然ゴムとは異なる性質を持っており、ひびの入りにくいゴルフボールや、歯の治療痕に充填する素材などとして使用されている。

化学合成されるトランス型ポリイソプレノイドは、トランス含有量が１００％ではなく、シス型の結合が１．２～４％程度含まれている。また、分子量は２５万程度であり、１００万以上の超高分子量のものを合成することは大変困難である。そして、化学合成する際には、原料の供給が必要であり、石油由来の原料が必要となることから、環境に優しい調達方法とは言い難い。

他方で、植物であるトチュウから抽出、精製されるトランス型ポリイソプレノイドは、直鎖の９９％以上がトランス型で結合した、重量平均分子量約１．８×１０^６のポリイソプレノイドであり、トチュウエラストマーとして利用されている。

トランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）は、植物内でファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）やゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）等の開始基質にイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が付加重合して生合成される、トランス－１，４－ポリイソプレン構造を有するものであり、トランスゴムの生合成にはその構造からトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）が関係していると考えられている。

これまでに、特許文献１、２、３においてトチュウ由来のトランス型プレニルトランスフェラーゼである長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子が報告され、それら遺伝子を用いて形質転換した植物を栽培し、トランス－１、４－ポリイソプレンを回収する方法が報告されている。

しかしながら、報告されている形質転換タバコの実施例では１０^４～１０^５の報告しかされておらず、１０^５を超える高分子の生成には至っていない。

特許第６０９０７００号公報 特許第５８７０４６４号公報 特許第５６４５３６６号公報

本開示は、前記課題を解決し、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイド（トランス－１、４－ポリイソプレン）を酵素反応的に製造する方法を提供することを目的とする。

本開示はまた、前記課題を解決し、遺伝子組換え技術により生物体に導入することで１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを酵素反応的に製造することができるベクターを提供することを目的とする。また、該ベクターが導入された形質転換生物、並びに、該形質転換生物を用いて１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを酵素反応的に製造する方法を提供することも目的とする。

本開示者らは、前記課題を解決するために、トランス－１、４－ポリイソプレンを生合成する植物であるサポジラから、２種類のトランス型プレニルトランスフェラーゼの保存モチーフを有する２種類の遺伝子を単離した。

単離した２種類のトランス型プレニルトランスフェラーゼの内、１種類のトランス型プレニルトランスフェラーゼ（サポジラ由来のｔＰＴ１、塩基配列、アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１、２で表される）は脂質膜非結合下でも活性を有し、分子量１０^３程度の生成物を合成する能力を有することが分かった。もう一方のトランス型プレニルトランスフェラーゼ（サポジラ由来のｔＰＴ２、塩基配列、アミノ酸配列はそれぞれ配列番号３、４で表される）は全長配列では脂質膜非結合下では活性を示さなかったものの、膜結合ペプチド領域を欠損させる（膜結合ペプチド領域を欠損させたサポジラ由来のｔＰＴ２であるＭｚｔＰＴ２ΔＮの塩基配列は配列番号６で表される）ことにより、脂質膜非結合下でも分子量１０^４程度の生成物を合成する能力を示すことを発見した。

更なる研究により、分子量１０^４程度の生成物を合成する能力を有するトランス型プレニルトランスフェラーゼは、膜結合ペプチド領域を有する状態で脂質膜存在下で発現させると分子量１０^５を超える生成物を合成する能力を示すことを発見した。

一方で脂質膜非結合下でも活性を有し、分子量１０^３程度の生成物を合成する能力を有するトランス型プレニルトランスフェラーゼに膜結合ペプチドを融合させても脂質膜存在下でも分子量１０^３程度の生成物を合成するに留まることも発見した。

これらの結果から、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を合成する能力を有するトランス型プレニルトランスフェラーゼであれば、脂質膜と結合させ、生成物を膜内に蓄積させることで、生成物の分子量を高分子化させることが可能であることを見出して、本開示を完成させた。

すなわち、本開示は、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質を、生体外で脂質膜に結合させる結合工程を含むトランス型ポリイソプレノイドの製造方法に関する。

本開示によれば、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質を、生体外で脂質膜に結合させる結合工程を含むトランス型ポリイソプレノイドの製造方法であるので、脂質膜に前記ｔＰＴファミリー蛋白質を結合させることで、脂質膜中に１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを合成することができ、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを酵素反応的に製造する方法を提供することが可能となる。

本開示の空気入りタイヤの製造方法は、前記トランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを用いた空気入りタイヤを製造することができる。

本開示のゴム製品の製造方法は、前記トランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドからゴム製品を製造するため、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを用いたゴム製品を製造することができる。

本開示のベクターは、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターであるため、遺伝子組換え技術により生物体に導入することで、該生物体において、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを酵素反応的に製造することができる。よって、該ベクターが導入された形質転換生物は、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを酵素反応的に製造することができる。

本開示の空気入りタイヤの製造方法は、前記形質転換生物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを用いた空気入りタイヤを製造することができる。

本開示のゴム製品の製造方法は、前記形質転換生物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドからゴム製品を製造するため、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを用いたゴム製品を製造することができる。

ゴム粒子、油滴の構造を模式的に示す図である。 トランス型ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。 ＴＬＣの結果の一例を示す図である。 ＧＰＣの結果の一例を示す図である。 活性測定結果の一例を示す図である。 ＧＰＣの結果の一例を示す図である。 活性測定結果の一例を示す図である。 活性測定結果の一例を示す図である。 ＧＰＣの結果の一例を示す図である。

本開示のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法は、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質を、生体外で脂質膜に結合させる結合工程を含む。
脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なｔＰＴファミリー蛋白質を、生体外で（例えば、反応槽（試験管、プラントなど）内で）脂質膜に結合させることで、脂質膜中に１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを合成（酵素反応的に製造）することができる。
なお、本開示の製造方法は、前記結合工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、また、各工程は１回行われてもよいし、複数回繰り返し行われてもよい。
また、本開示において、脂質膜に結合するｔＰＴファミリー蛋白質の量は特に限定されない。

本開示では、例えば、脂質膜存在下で、無細胞蛋白発現系を用いて、ｔＰＴファミリー蛋白質を発現させて、ｔＰＴファミリー蛋白質を脂質膜に結合させることで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素学的に１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを製造することができる。

また、本開示のベクターは、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターであるため、遺伝子組換え技術により生物体に導入することで、該生物体において、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを酵素反応的に製造することができる。

脂質膜はどの生物も有することから、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を用いて生物を形質転換し、ｉｎ ｖｉｖｏで酵素学的に１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを製造することができる。

このように、本開示では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイド（トランス－１、４－ポリイソプレン）を酵素反応的に製造することができる。

本開示では、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なｔＰＴファミリー蛋白質を脂質膜に結合させることで、脂質膜内に生成物を蓄積させることで、生成物の分子量を高分子化することができ、脂質膜非結合下よりも大きい分子量である１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを合成（酵素反応的に製造）することができる。
一方、前記の通り、脂質膜非結合下で分子量１０^３程度の生成物しか生成できないｔＰＴファミリー蛋白質を脂質膜に結合させても、分子量１０^３程度の生成物を合成するに留まる。
この両者の相違は、明らかではないが、以下のように推測される。
分子量１０^４未満の生成物を合成するプレニルトランスフェラーゼでの、生成物鎖長は生成物伸長部位の空間的な大きさによって制御されている。例えば、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素（ＵＰＰＳ）において、生成物鎖長が炭素数５５のウンデカプレニル二リン酸（分子量約９２６）で反応が止まる理由は、生成物鎖長の空間（クレフト）の底にあたるアミノ酸にぶつかるためと考えられている。しかしながら、このメカニズムでの生成物の分子量の制御は、生成物の鎖長が酵素の大きさより小さい場合に限られる。そのため、トランス型イソプレンゴムのような酵素よりも大きい分子量の生成物を作る酵素においては、この生成物鎖長を決定づける底がなく、空間的に貫通することで酵素サイズよりも大きい生成物を合成できていると考えられている。
そして、生成物鎖長が酵素構造で制御されていない生成物の鎖長は、反応環境によって制御を受けていると考えられる。
反応環境的に生成物鎖長が制御されている場合、生成物の鎖長を決定づける因子の１つとして生成物の可溶性が考えられる。つまり、脂質膜非結合の状態で水溶液中で反応させた場合、生成物の伸長反応が進むにつれて、生成物は酵素外の水溶液中に露出することになる。一方で、生成物鎖長が延びるほど親水性が低くなり、水溶液中での安定性は低くなっていくと考えられる。そのため、ある程度の鎖長になると生成物伸長が停止すると考えられる。
トランス型ポリイソプレノイドの場合、実験結果からこの水溶液中において生成物伸長が停止する生成物の分子量が１０^４程度であると考えられた。そのため、水溶液中で分子量１０^４程度の生成物を合成する能力を有する酵素は反応環境的に制御する酵素であると考える。一方で、１０^４未満の生成物しか合成できない酵素は酵素構造的に生成物鎖長を制御する酵素であると考えられる。
反応環境的に制御する酵素の場合、反応環境を変更することで生成物の鎖長が変化することが予想され、今回脂質膜と結合させ、反応環境を変更させたことで生成物の分子量が高分子化し、酵素構造的に制御する酵素の場合、反応環境によらず、酵素構造的に同じ分子量の生成物を合成したと考えられる。

本明細書において、分子量とは、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）により測定される分子量であって、具体的には実施例に記載の方法により測定される。

本明細書において、脂質膜非結合下とは、系中に脂質膜が存在しない状況、特に当該蛋白質が脂質膜に結合していない状況を意味する。
また、本明細書において、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なｔＰＴファミリー蛋白質とは、例えば、脂質膜非結合下である大腸菌においてｔＰＴファミリー蛋白質を発現させ、該ｔＰＴファミリー蛋白質の酵素反応を行うことにより、より具体的には、該ｔＰＴファミリー蛋白質の酵素反応を、該ｔＰＴファミリー蛋白質が脂質膜に結合していない状況下で行うことにより、分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質を意味する。

本明細書において、脂質膜にｔＰＴファミリー蛋白質が結合するとは、ｔＰＴファミリー蛋白質の全部又は一部が脂質膜中に取り込まれる又は脂質膜の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、脂質膜表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、脂質膜に結合している蛋白質とｔＰＴファミリー蛋白質が複合体を形成し、複合体として脂質膜上に存在する場合も脂質膜に結合しているとの概念範囲に含まれる。

本明細書において、膜結合領域（膜結合ペプチド領域、膜結合ペプチドとも記載する）とは、膜輸送シグナル配列または膜に結合するために必要な必要な疎水性アミノ酸配列を意味し、膜貫通領域（膜貫通ペプチド領域、膜貫通ペプチドとも記載する）も含まれる概念である。ここで、本明細書において、膜貫通領域とは、脂質膜を貫通するための疎水性アミノ酸が外部に位置するようなαヘリックス構造を形成する領域など、膜貫通するための疎水性度の高いアミノ酸が多く含まれる領域のことを意味する。
また、本明細書において、可溶化状態にするとは、水溶液中に安定的に存在している状態にすることであり、遠心分離等によって沈殿化しない状態のことを意味し、例えば、膜蛋白質が水に可溶化しない場合に、膜蛋白質から膜結合領域を欠損させることにより可溶化することができる。

また、本明細書において、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質は、イソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒する酵素である。具体的には、例えば、植物では、図２に示すようなトランス型ポリイソプレノイド生合成経路によってトランス型ポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、ｔＰＴファミリー蛋白質は、図２中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素と考えられている。ｔＰＴファミリー蛋白質の特徴としては、ｔｒａｎｓ ＩＰＰＳ ＨＴ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｃｄ００６８５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。

本明細書において、トランス型ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）がトランス型に結合して構成された重合体の総称である（特に、全結合中のトランス型の結合の割合が、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上が更に好ましい。）。トランス型ポリイソプレノイドとしては、例えばトランス型セスタテルペン（Ｃ_２５）、トランス型トリテルペン（Ｃ_３０）、トランス型テトラテルペン（Ｃ_４０）、トランス－１，４－ポリイソプレン等のトランスゴムなどの重合体が挙げられる。また、本明細書において、イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）を有する化合物を意味し、ポリイソプレノイドをも含む概念である。

（トランス型ポリイソプレノイドの製造方法）
本開示は、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質を、生体外で脂質膜に結合させる結合工程を含むトランス型ポリイソプレノイドの製造方法に関する。

（（脂質膜））
脂質膜としては特に限定されず、例えば、油滴（オイルボディ、ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）、ゴム粒子、リポソーム、ナノディスク、オルガネラ、小胞体（ミクロソーム）等が挙げられる。また、脂質膜は、脂質一重膜でも、脂質二重膜でもよいが、脂質一重膜が好ましい。これらは、単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また、天然由来のものを使用しても人工的に合成したものを使用してもよい。なかでも、油滴、ゴム粒子、ナノディスク、小胞体（ミクロソーム）が好ましく、油滴、小胞体（ミクロソーム）がより好ましい。

本明細書において、油滴とは、図１に示すように、リン脂質と膜蛋白質（例えば、オレオシンやｌｉｐｉｄ－ｄｒｏｐｌｅｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＡＰ）／ｓｍａｌｌ ｒｕｂｂｅｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ｆａｍｉｌｙに属する蛋白質）により構成された膜構造を有し、内部にトリアシルグリセロールが貯蔵されている封入体又は細胞小器官であり、原核生物にも真核生物にも存在し、全ての植物において存在する。
また、油滴は、脂質滴、脂肪滴、油体（ｏｉｌ ｂｏｄｙ、ｏｉｌ ｂｏｄｉｅｓ）、ＬＤとも言う。

油滴の由来は特に限定されないが、微生物（藻類や微細藻類を含む）由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよい。

前記植物としては、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ ｆ． ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｇｉｇａｎｔｅａ Ａｉｔ． ｖａｒ． ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｖｅｎｕｓｔｕｍ Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ａｍｐｅｌａｓ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｉｒｉｓａｎａ Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｓｅｐｔｉｃａ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ベンガルボダイジュ；等のゴム産生植物が挙げられる。ゴム産生植物以外の植物としては、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）等のＰｅｒｓｅａ属に属する植物、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）等のＳｅｓａｍｕｍ属に属する植物、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）等のＢｒａｓｓｉｃａ属に属する植物、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）等のＣａｍｅｌｌｉａ属に属する植物等が挙げられる。

前記微生物としては、原核生物、真核生物のいずれであってもよく、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属の微生物、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物等が挙げられる。

前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属の藻類、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の藻類、ファエオダクティラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属の藻類がより好ましい。

油滴は、植物由来であることが好ましく、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｅｓａｍｕｍ属、Ｂｒａｓｓｉｃａ属、及びＣａｍｅｌｌｉａ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましく、Ｐｅｒｓｅａ属に属する植物由来であることが更に好ましく、アボカド由来であることが特に好ましい。

また、油滴は、微生物由来であることも好ましく、藻類、微細藻類由来であることがより好ましく、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属の藻類、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の藻類、ファエオダクティラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類由来であることが更に好ましく、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属の藻類由来であることが特に好ましい。

油滴の調製方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、植物片を緩衝液中で破砕し、ろ過、遠心分離を行い、脂肪体（Ｆａｔ ｐａｄ）を回収すればよい。また、必要に応じて脂肪体を洗浄してもよい。そして、脂肪体から遠心分離により油滴を分離すればよい。
遠心分離処理では、例えば、１５，０００～２０，０００×ｇ、１５分～６０分の処理を行えばよい。
また、遠心分離処理の処理温度としては、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
アボカド由来の油滴は、例えば、ＷＯ２０２１／０１０１０１号公報に記載の方法等により調製できる。

本明細書において、小胞体（ミクロソーム）とは、細胞内に存在する糸状や網目状の構造を有する細網ない膜系であり、細胞を破砕した際に小胞体がちぎれた膜小胞も含まれる。

小胞体（ミクロソーム）の由来は特に限定されないが、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよい。

小胞体（ミクロソーム）の調製方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、細胞を超音波破砕やフレンチプレスにより破砕した後、密度勾配遠心法などの遠心法などにより回収し、調製する方法などが挙げられる。

前記ゴム粒子の由来は特に限定されず、例えば、パラゴムノキ、ロシアンタンポポ、グアユール、ノゲシ、インドゴムノキなどのゴム産生植物のラテックス由来であればよい。

また、前記ゴム粒子の粒子径も特に限定されず、所定の粒子径のものを分取して用いてもよいし、様々な粒子径のものが含まれた状態のものを使用してもよく、所定の粒子径のものを分取して用いる場合であっても、用いられるゴム粒子としては、粒子径の小さいＳｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＳＲＰ）を用いてもよいし、粒子径の大きいＬａｒｇｅ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＲＰ）を用いてもよい。

前記所定の粒子径のゴム粒子を分取する方法としては、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、遠心分離処理、より好ましくは多段階の遠心分離処理、を行う方法などが挙げられる。具体的には、５００～１５００×ｇでの遠心分離処理、１７００～２５００×ｇでの遠心分離処理、７０００～９０００×ｇでの遠心分離処理、１５０００～２５０００×ｇでの遠心分離処理、４００００～６００００×ｇでの遠心分離処理を順に行う方法が挙げられる。なお、各遠心分離処理の処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。また、各遠心分離処理の処理温度としては、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。

（（脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質））
次に、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質について説明する。
脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質としては、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なｔＰＴファミリー蛋白質であれば特に限定されない。

脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なｔＰＴファミリー蛋白質の１態様としては、膜結合領域を有する蛋白質であって、可溶化状態にすることで脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質である。
膜結合領域を有する蛋白質（膜蛋白質）は、通常水層に可溶化しないが、例えば、膜蛋白質から膜結合領域を欠損させることにより可溶化することができる。そして、可溶化後の蛋白質が脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質であればよい。

脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なｔＰＴファミリー蛋白質の他の１態様としては、膜結合領域を有さず、脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質に膜結合ペプチドを融合させることで脂質膜への結合能力を付与した蛋白質である。
膜結合領域を有さない蛋白質が、脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な場合、膜結合領域を有さない蛋白質は、脂質膜への結合能力が無いため、「膜結合領域を有さず、脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質」に膜結合ペプチドを融合させることで、脂質膜への結合能力を付与できる。

以上の通り、本開示は、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質を使用することを特徴とする。該ｔＰＴファミリー蛋白質は、元来、膜結合ペプチドを有する蛋白質であることが望ましいが、元来、膜結合ペプチドを有さずに、遺伝子工学的に膜結合ペプチドと融合させた蛋白質を用いても良い。すなわち、ｔＰＴファミリー蛋白質は、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能で、かつ、先天的又は後天的に脂質膜への結合能力を有する限り特に限定されない。

脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なｔＰＴファミリー蛋白質、膜結合領域を有さず、脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質の由来は、特に限定されないが、トランスゴムを産出する植物由来であることが好ましい。
トランスゴムを産出する植物としては、特に限定されないが、例えば、サポジラ（Ｍａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ）等のＭａｎｉｌｋａｒａ属に属する植物、トチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）等のＥｕｃｏｍｍｉａ属に属する植物等が挙げられる。なかでも、Ｍａｎｉｌｋａｒａ属に属する植物が好ましく、Ｍａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）であることがより好ましい。

脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質の具体例としては、下記［１］が挙げられる。
［１］配列番号４で表されるアミノ酸配列（サポジラ由来のｔＰＴ２のアミノ酸配列）からなる蛋白質

また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ｔＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［２］も挙げられる。
［２］配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒し、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質

なお、前記ｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～９５個のアミノ酸、更に好ましくは１～７１個のアミノ酸、更により好ましくは１～４７個のアミノ酸、特に好ましくは１～２４個のアミノ酸、最も好ましくは１～９個のアミノ酸、より最も好ましくは１～５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。

アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。

また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ｔＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［３］も挙げられる。
［３］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒し、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質

なお、前記ｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。

本明細書において、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。

前記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、イソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒し、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能か否か判定する方法が挙げられる。

前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、ゴムを産生するゴム産生植物の他、ゴム産生植物以外の植物、動物、微生物等も有しており、これら由来のｔＰＴファミリー蛋白質は当然、自然状態ではゴム合成に関与していない。にもかかわらず、本開示においては、ｔＰＴファミリー蛋白質であれば、その由来、種類等に関わらず、脂質膜に結合させることで、脂質膜中にトランスゴムを合成することができる。すなわち、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子がゴムを産生する植物由来であるか、それ以外の生物由来であるか、又は、自然状態でゴム合成に関与しているかなどに関わらず、本開示においては、ｔＰＴファミリー蛋白質でありさえすれば、脂質膜中にトランスゴムを合成することができる。このことは、本開示者らが既にＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６９１７２において示唆しているメカニズム（シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質の由来や種類よりも、どのような宿主に導入したのか、すなわち、ＣＰＴファミリー蛋白質をどのような環境下に発現させたのかが、ゴム合成活性において重要である、ことを示すメカニズム）から、強く示唆される。

本開示において用いるｔＰＴファミリー蛋白質は脂質膜との親和性を上げるためＮ末端側に膜貫通領域を持っていることが望ましく、野生型として持っていない場合はｔＰＴファミリー蛋白質のＮ末端側に人工的に膜貫通領域を融合させても良い。融合させる膜貫通領域のアミノ酸配列は特に限定されないが、自然界で本来脂質膜に結合している蛋白質が持つ膜貫通領域のアミノ酸配列であることが望ましい。

前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードし、発現させて、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なｔＰＴファミリー蛋白質を産出できるものであれば特に制限されないが、該遺伝子としては、具体的には、下記［１］又は［２］が挙げられる。
［１］配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒し、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質をコードするＤＮＡ

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。従って、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。

前記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度及び温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、更に低いストリンジェントな条件としては、前記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。

前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。

前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号３で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。

前記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。

また、前記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。

（（（膜結合ペプチド）））
前記の通り、膜結合領域を有さない蛋白質が、脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な場合、膜結合領域を有さない蛋白質は、脂質膜への結合能力が無いため、「膜結合領域を有さず、脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質」に膜結合ペプチドを融合させることで、脂質膜への結合能力を付与できる。

膜結合ペプチドの由来は、好ましい態様も含めて前記脂質膜の由来と同様である。膜結合ペプチドは、植物由来であることが好ましく、Ｐｅｒｓｅａ属、Ｓｅｓａｍｕｍ属、Ｂｒａｓｓｉｃａ属、及びＣａｍｅｌｌｉａ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより好ましく、Ｐｅｒｓｅａ属に属する植物由来であることが更に好ましく、アボカド由来であることが特に好ましい。

また、膜結合ペプチドは、微生物由来であることも好ましく、藻類、微細藻類由来であることがより好ましく、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属の藻類、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の藻類、ファエオダクティラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類由来であることが更に好ましく、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属の藻類由来であることが特に好ましい。
また、使用する脂質膜の由来と、膜結合ペプチドの由来が同一であることが好ましい。これにより、膜結合ペプチドが融合された蛋白質が、好適に脂質膜への結合能力を有することとなる。

膜結合ペプチドとしては、脂質膜への結合能力を付与できるものであれば特に限定されないが、脂質膜に結合可能な蛋白質由来のペプチドであることが好ましく、脂質膜に結合可能な蛋白質かつ、ＣｌａｓｓＩＩに属する蛋白質由来のペプチドであることがより好ましい。ここで、脂質膜に結合可能な蛋白質由来のペプチドとしては、脂質膜への結合能を有していればよいため、脂質膜に結合可能な蛋白質のペプチドの全部であってもよく、一部であってもよい。なお、脂質膜に結合可能なペプチドは特に限定されないが、自然界で本来脂質膜に結合している蛋白質が持つ膜貫通領域のペプチドであることが望ましい。

ここで、ＣｌａｓｓＩＩに属する蛋白質とは、油滴結合能を有しながらも、細胞中に油滴非存在時はサイトゾルに局在する特徴を有する油滴結合蛋白質を意味する（Ｇｉｄｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ａｐｒｉｌ ２０１６， Ｖｏｌ． １７０， ｐｐ． ２０５２－２０７１参照）。ＣｌａｓｓＩに属する蛋白質は、油滴非存在時はＥＲ画分に局在する蛋白質であるのに対して、ＣｌａｓｓＩＩに属する蛋白質は、サイトゾルと油滴との移行が可能である。

油滴に結合可能な蛋白質かつ、ＣｌａｓｓＩＩに属する蛋白質としては、特に限定されないが、ｌｉｐｉｄ－ｄｒｏｐｌｅｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＡＰ）／ｓｍａｌｌ ｒｕｂｂｅｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ｆａｍｉｌｙに属する蛋白質等が挙げられる。なかでも、ｌｉｐｉｄ－ｄｒｏｐｌｅｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＤＡＰ）／ｓｍａｌｌ ｒｕｂｂｅｒ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）ｆａｍｉｌｙに属する蛋白質が好ましい。

膜結合ペプチドの他の例としては、例えば、ｍａｊｏｒ ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＬＤＰ）由来の膜結合領域等が挙げられる。

ＭＬＤＰ由来の膜結合領域をコードする遺伝子としては、具体的には、下記［１］又は［２］が挙げられる。
［１］配列番号５で表される塩基配列（クラミドモナス由来ＭＬＤＰの塩基配列）からなるＤＮＡ
［２］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂質膜への結合能力を有する蛋白質をコードするＤＮＡ

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。従って、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。

前記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度及び温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、更に低いストリンジェントな条件としては、前記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。

前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。

前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号５で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。

前記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無を確認する方法が挙げられる。

また、前記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができる。

（（結合工程））
前記結合工程においては、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質が、生体外で脂質膜に結合される限り、更にその他の蛋白質が結合されてもよい。

前記その他の蛋白質の由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、ゴム産生植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。なかでも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることがより更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

前記その他の蛋白質としては、何ら制限されずいかなる蛋白質であってもよいが、脂質膜のゴム合成能力の観点からは、ゴム産生植物体内でもともと脂質膜上に存在する蛋白質であることが好ましい。なお、脂質膜上に存在する蛋白質は、大きく脂質膜の膜表面に結合する蛋白質であってもよいし、脂質膜の膜に挿入されるように結合する蛋白質であってもよいし、前記膜に結合している蛋白質と複合体を形成して膜表面上に存在することになる蛋白質であってもよい。

前記ゴム産生植物体内でもともと脂質膜上に存在する蛋白質としては、例えば、Ｎｏｇｏ－Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）、β－１，３－グルカナーゼ、Ｈｅｖｅｉｎなどが挙げられる。

前記結合工程は、生体外で、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なｔＰＴファミリー蛋白質を、脂質膜に結合させることができればその手段は特に制限されず、例えば、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と脂質膜とを共存させて蛋白質合成を行い、脂質膜にｔＰＴファミリー蛋白質を結合させる方法などが挙げられる。

前記結合工程としては、なかでも、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と脂質膜とを共存させて蛋白質合成を行い、脂質膜にｔＰＴファミリー蛋白質を結合させる工程であることが好ましい。
すなわち、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と脂質膜とを共存させて（より具体的には、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と脂質膜とを混合して）蛋白質合成を行うことで、ｔＰＴファミリー蛋白質の結合した脂質膜を得ることが好ましい。

前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と脂質膜とを共存させて行われる蛋白質合成は、いわゆる、無細胞蛋白合成法を用いたｔＰＴファミリー蛋白質の合成であり、生物学的機能を担持した（ｎａｔｉｖｅ状態の）ｔＰＴファミリー蛋白質を合成でき、当該無細胞蛋白合成法を脂質膜の共存下で行うことにより、合成されるｔＰＴファミリー蛋白質をｎａｔｉｖｅ状態で脂質膜に結合することが可能となる。

ここで、前記無細胞蛋白合成溶液と脂質膜との共存下、蛋白質合成を行うことで、脂質膜にｔＰＴファミリー蛋白質が結合するとは、当該蛋白質合成により合成されたｔＰＴファミリー蛋白質の各蛋白質の全部又は一部が脂質膜中に取り込まれる又は脂質膜の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、脂質膜表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、上述のように脂質膜に結合している蛋白質と複合体を形成し、複合体として脂質膜上に存在する場合も脂質膜に結合しているとの概念範囲に含まれる。

前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡはそれぞれ、翻訳されてｔＰＴファミリー蛋白質を合成しうる翻訳鋳型である。

前記結合工程については、当業者であれば、適宜実施できる。例えば、ＷＯ２０２１／０１０１０１号公報、ＷＯ２０１８／１１６７２６号公報に記載の方法等により実施できる。

前記結合工程は、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と脂質膜とを共存させて蛋白質合成を行うことが好ましいものであるが、具体的には蛋白質の合成前又は合成後の適当な時期に、好ましくは蛋白質合成前に、前記無細胞蛋白合成溶液に脂質膜を加えることにより行うことができる。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させる脂質膜の濃度は、５～５０ｇ／Ｌであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液１Ｌに対して脂質膜を５～５０ｇ共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させる脂質膜の濃度が５ｇ／Ｌ未満であると、合成されたｔＰＴファミリー蛋白質が結合した脂質膜を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成されたｔＰＴファミリー蛋白質が結合した脂質膜を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させる脂質膜の濃度が５０ｇ／Ｌを超えると、脂質膜同士が凝集し、合成されたｔＰＴファミリー蛋白質がうまく脂質膜に結合できなくなるおそれがある。前記脂質膜の濃度としてより好ましくは１０～４０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１５～３５ｇ／Ｌ、特に好ましくは１５～３０ｇ／Ｌである。

また、前記無細胞蛋白合成溶液と脂質膜との共存下での蛋白質合成は、その反応の進展に伴い、適宜脂質膜を追加していってもよい。脂質膜を前記無細胞蛋白合成溶液に加えてから例えば３～４８時間（好ましくは３～３０時間、より好ましくは３～２４時間）など無細胞蛋白合成系が活性な間、前記無細胞蛋白合成溶液と脂質膜とが共存するようにしておくことが好ましい。

前記無細胞蛋白合成における蛋白質合成のための反応システム又は装置としては、バッチ（回分）法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９－２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２－１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。その他、蛋白質合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法等も用いることができる。

なかでも、重層法は操作が簡便であるという利点はあるものの反応溶液中で脂質膜が分散してしまい、合成されるｔＰＴファミリー蛋白質を脂質膜に効率よく結合させることが困難であるのに対して、透析法では、合成されるｔＰＴファミリー蛋白質の原料となるアミノ酸は透析膜を透過できるが脂質膜は透過しないため、脂質膜の分散を防ぐことができ、効率的に脂質膜に合成されるｔＰＴファミリー蛋白質を結合させることができることから、透析法が好ましい。

なお、前記透析法とは、前記無細胞蛋白合成における蛋白質合成の合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、蛋白質合成を行う方法である。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた前記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製の透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製の１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、１０，０００ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。

前記透析外液としては、アミノ酸を含む緩衝液が用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、例えば、小麦由来の胚芽抽出物を用いた系においては、通常１０～４０℃、好ましくは１８～３０℃、より好ましくは２０～２６℃で、１０分～４８時間（好ましくは１０分～３０時間、より好ましくは１０分～２４時間）行うことができる。

また、前記無細胞蛋白合成溶液に含まれるｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡは、分解されやすいことから、前記蛋白質合成反応中に適宜当該ｍＲＮＡを追加することで、蛋白質の合成をより効率的に行うことができる。すなわち、前記蛋白質合成反応中に、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを更に加えることもまた、本開示の好適な実施形態の１つである。
なお、前記ｍＲＮＡの添加時間、添加回数、添加量等は特に制限されず、適宜設定することができる。

本開示の製造方法においては、結合工程を行った後、必要に応じて脂質膜を回収する工程を行ってもよい。

前記脂質膜回収工程は、脂質膜を回収することができればその手法は特に制限されず、脂質膜を回収する通常行われる方法により行うことができる。具体的には、例えば、遠心分離により行う方法などが挙げられる。当該遠心分離により脂質膜を回収する場合、その遠心力や、遠心分離処理時間、遠心分離処理温度は脂質膜を回収できるよう適宜設定することができるが、例えば、遠心分離処理の遠心力としては、１５０００×ｇ以上が好ましく、２００００×ｇ以上がより好ましく、２５０００×ｇ以上が更に好ましい。一方、遠心力は大きくしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心力の上限としては、５００００×ｇ以下が好ましく、４５０００×ｇ以下がより好ましい。遠心分離処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、遠心分離処理時間を長くしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心分離処理時間の上限としては、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。
また、遠心分離処理温度としては、脂質膜に結合したｔＰＴファミリー蛋白質のタンパク活性を維持するという観点から、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。

例えば、前記無細胞蛋白合成を行った場合には、前記遠心分離処理を行うと、脂質膜が上層に、無細胞蛋白合成溶液が下層に分離される。その後、下層の無細胞蛋白合成溶液を除去することで、ｔＰＴファミリー蛋白質を結合させた脂質膜を回収することができる。回収した脂質膜はｐＨが中性の適当な緩衝液に再懸濁することで保存することができる。

なお、前記脂質膜回収工程を行った後に回収された脂質膜は更なる特別な処理を経ずにトランス型ポリイソプレノイドの製造に用いることができる。

更に、前記トランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドは、前記脂質膜を以下の固化工程に供することで回収することができる。

前記固化工程において、固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のトランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）を溶解しない溶媒に脂質膜を添加する方法や脂質膜に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、脂質膜からゴムを固形分として回収できる。得られたゴムは、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。

（ゴム製品の製造方法）
本開示のゴム製品の製造方法は、前記本開示のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。

ゴム製品としては、ゴム（好ましくは天然ゴム）を使用して製造できるゴム製品であれば特に限定されず、例えば、空気入りタイヤ、ゴムローラ、ゴム防舷材、手袋、医療用ゴムチューブ等が挙げられる。

ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、本開示のゴム製品の製造方法が本開示の空気入りタイヤの製造方法の場合、前記生ゴム製品成形工程は、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、前記加硫工程は、前記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、本開示の空気入りタイヤの製造方法は、前記トランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。

＜混練工程＞
混練工程では、前記トランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。

添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、前記トランス型ポリイソプレノイド以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。

混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。

＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。

＜加硫工程＞
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。

（ベクター）
本開示のベクターは、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターである。このようなベクターを生物に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれる、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子が発現し、当該生物において、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを酵素反応的に製造することが可能となる。

本開示のベクターは、一般的に形質転換用ベクターとして知られているベクターに、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列（好ましくはプロモーターの塩基配列、及び、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列）を従来公知の方法により挿入することで作製することができる。

本開示のベクターを作製するために使用することができるベクターとしては、例えば、ｐＢＩ系のベクターや、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧなどのバイナリーベクター、ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間系プラスミド、ＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳなどが挙げられる。

本開示のベクターを作製するために使用することができるプロモーターとしては、例えば、 ＣａＭＶ３５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＮＯＳ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の遺伝子組み換えに係る分野において汎用されているプロモーターなどが挙げられる。

本開示のベクターは、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を含む限り、その他の塩基配列を含んでいてもよい。通常、ベクターにはこれらの塩基配列に加えて、ベクター由来の配列が含まれており、更に、制限酵素認識配列、スペーサ―配列、マーカー遺伝子の配列、レポーター遺伝子の配列などが含まれる。
また、本開示のベクターは、必要に応じて、補助酵素をコードする遺伝子の塩基配列を含んでいてもよい。

前記マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、前記レポーター遺伝子は、植物体中での発現部位を確認するために導入するものであり、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）、ＲＦＰ（赤色蛍光蛋白質）等が挙げられる。

（形質転換生物、該形質転換生物を使用したトランス型ポリイソプレノイドの製造方法）
例えば、本開示のベクターを植物等の細胞に導入することにより、前記ｔＰＴファミリー蛋白質を発現するように形質転換された形質転換生物（形質転換細胞）が得られる。すなわち、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換生物が得られる。そして、当該形質転換生物では、前記ｔＰＴファミリー蛋白質が発現することにより、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを酵素反応的に製造することができる。そして、合成されたトランス型ポリイソプレノイドは細胞内の脂質膜内に蓄積する。

前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子が導入される宿主としては脂質膜を有する生物であれば特に限定されないが、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物、動物等が挙げられる。なかでも、宿主は微生物又は植物であることが好ましく、微生物であることがより好ましく、微細藻類であることが更に好ましい。
一般的に生物を用いたトランス型ポリイソプレノイドの合成は困難であるが、前記宿主に前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を導入することにより、容易にトランス型ポリイソプレノイドの合成を行うことができるようになる。

前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物やバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属の微生物、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、赤色酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、又はモルチエレラ・エスピー（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐ．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。

前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属の藻類、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属の藻類、ファエオダクティラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、ナンノクロロプシス・サリナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓａｌｉｎａ）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｅａｎｉｃａ）、ナンノクロロプシス・アトムス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ａｔｏｍｕｓ）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｍａｃｕｌａｔａ）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇｒａｎｕｌａｔａ）、ナンノクロロプシス・エスピー（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．）等が挙げられる。なかでも、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。

前記植物としては、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、西洋アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パーム（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、クフェア、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、クスノキ（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｃａｍｐｈｏｒａ）、又はヤトロファ（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。

次に、前記形質転換生物の作製方法について簡単に説明するが、このような形質転換生物は従来公知の方法により作製することができる。

本開示のベクターを植物（カルスや、培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストといった植物細胞を含む）に導入する方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９－１４０８８５号公報、特開昭６０－７００８０号公報、国際公開第９４／００９７７号）、エレクトロポレーション法（特開昭６０－２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。
なお更には、本開示のベクターを、前記ＤＮＡを導入する方法などにより、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、生物体、生物体の一部、器官、組織や培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストなどに導入することによって、形質転換生物を調製することも可能である。

以上の方法等により、前記形質転換生物が得られる。ここで、前記形質転換生物は、形質転換された細胞を含む限りその形態は限定されず、細胞単独でもよく、細胞が合わさった組織や形質転換体であってもよい。なお、前記形質転換生物は、上述の方法で得られた形質転換生物のみならず、その子孫又はクローン、更にそれらを継代させて得られる子孫生物の全てを含む概念である。

例えば、一旦、本開示のベクターが導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該形質転換植物を量産することも可能である。

形質転換植物細胞から植物体（形質転換植物）を再生する方法としては、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１－１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５）， Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４－）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９）， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１－）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９）， Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９－）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２）， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７－）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。

再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的の蛋白質遺伝子の発現を確認することができる。例えば、目的の蛋白質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。

前記形質転換植物から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。

本開示では、本開示のベクターを植物等の細胞に導入することにより、該ベクターに含まれる前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子が発現し、当該細胞において１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを酵素反応的に製造することができる。具体的には、上述の方法で得られた形質転換生物、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物、該形質転換植物から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドを製造することができる。

（ゴム製品の製造方法）
本開示のゴム製品の製造方法は、前記形質転換生物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。

ゴム製品としては、上述したものと同様である。

ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、本開示のゴム製品の製造方法が本開示の空気入りタイヤの製造方法の場合、前記生ゴム製品成形工程は、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、前記加硫工程は、前記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、本開示の空気入りタイヤの製造方法は、前記形質転換生物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。

＜混練工程＞
混練工程では、前記形質転換生物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。

前記形質転換生物から得られるトランス型ポリイソプレノイドは、前記形質転換生物から脂質膜を採取し、採取した脂質膜を以下の固化工程に供することにより得られる。
なお、前記形質転換生物からの脂質膜の採取方法は特に制限されず、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、形質転換細胞の一部を切断し、切断した組織を粉砕し、有機溶媒を用いて抽出して採取したりすることができる。

＜固化工程＞
前記採取された脂質膜は、固化工程に供される。固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のトランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）を溶解しない溶媒に脂質膜を添加する方法や脂質膜に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、脂質膜からゴムを固形分として回収できる。得られたゴムは、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。

添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、前記ラテックスから得られたゴム以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。

混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。

＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、上述した工程と同様である。

＜加硫工程＞
加硫工程は、上述した工程と同様である。

実施例に基づいて、本開示を具体的に説明するが、本開示はこれらのみに限定されるものではない。

（サポジラ由来トランス型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の取得）
高分子トランス－１、４－ポリイソプレンを合成するトランス型プレニルトランスフェラーゼの遺伝子を取得するため、高分子トランス－１、４－ポリイソプレンを合成するサポジラのトランスクリプトームデータに対してｄｅ ｎｏｖｏアセンブリを行うことでｃｏｎｔｉｇ配列を作製し、そこからシロイヌナズナ由来のトランス型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子と類似する遺伝子を探索し、２種類の遺伝子（ＭｚｔＰＴ１［配列番号１］、ＭｚｔＰＴ２［配列番号３］）を発見した。
ＭｚｔＰＴ１およびＭｚｔＰＴ２のｃＤＮＡを単離するため、サポジラの各種組織を採取し、液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて粉末状になるまで破砕したのち、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡは、ＤＥＰＣ水５０μＬに溶解させた。
ＭｚｔＰＴ１のｃＤＮＡを取得するため、サポジラの葉柄から調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）を用いて逆転写し、それにより得られた１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーセット（３７６９ Ｆｗ：５’－ＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣ－３’（配列番号７）、および３７６９ Ｒｖ：５’－ＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＴＧ－３’（配列番号８））を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的バンドを含むアガロースゲルを切り出して回収したのち、Ｆａｓｔ Ｇｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）を用いて精製した（以降、この操作をゲル回収と記載する）。
また、ＭｚｔＰＴ２に対応するｃｏｎｔｉｇ配列は、５’末端側がアセンブルされていなかったため、サポジラの葉から調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型として、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成し、それを鋳型として、プライマーセット（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５’ Ｐｒｉｍｅｒ： ５’－ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ－３’（配列番号９）、および４０３３ Ｒｖ ＧＳＰ Ｒａｃｅ：５’－ＣＴＴＧＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＣＴＧＡＣ－３’（配列番号１０））を使用してＰＣＲを行うことで、５’側未知領域を増幅した。これを鋳型としてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うことで、目的配列をより特異的に増幅した。その際に使用したプライマーは、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ ５′Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ－３’（配列番号１１））および４０３３ Ｒｖ ＧＳＰ ｎｅｓｔｅｄ Ｒａｃｅ（５’－ＣＴＧＣＣＴＣＡＣＴＡＧＣＣＣＣＴＣＣＡＡＣＴＡＴＧＧ－３’（配列番号１２））である。増幅された５’側未知領域の配列を決定後、その配列情報をもとにデザインしたプライマーセット（Ｒ４０３３ ＳＬｉ ＸｈｏＩ Ｆｗ：５’－ＴＣＡＧＧＧＣＧＧＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣ－３’（配列番号１３）、およびＲ４０３３ ＳＬｉ ＫｐｎＩ Ｒｖ：５’－ＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＣＧＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＡＡＴＧ－３’（配列番号１４））を使用し、葉の１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことで、全長のＭｚｔＰＴ２のコード配列を増幅し、これをゲル回収した。
全長ＭｚｔＰＴ１およびＭｚｔＰＴ２のコード配列を含むＰＣＲ産物に対し１０×Ａ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｄＡ付加を行い、それぞれｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングすることで、ｐＧＥＭ－ＭｚｔＰＴ１、ｐＧＥＭ－ＭｚｔＰＴ２が作製された。
ＭｚｔＰＴ１は、色素体移行配列予想アルゴリズムＣｈｌｏｒｏＰ１．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣｈｌｏｒｏＰ／）によってＮ末端側のアミノ酸１－７５位が色素体移行配列と予測されたため、その領域を欠損させた変異酵素ＭｚｔＰＴ１ΔＮをコードする遺伝子配列をＰＣＲによって増幅した。その際に使用した鋳型はｐＧＥＭ－ＭｚｔＰＴ１であり、プライマーセットは、ＭｚｔＰＴ１ＤＮ ＮｄｅｐＣｏｌｄＩＳＬｉ Ｆｗ（５’－ＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＡＧＧＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＡＴＣ－３’（配列番号１５））、ｐＣｏｌｄ ３７６９ ＫｐｎＳＬｉ Ｒｖ（５’－ＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＴＧ－３’（配列番号１６））である。増幅された遺伝子をゲル回収し、ｄＡ付加を行い、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクターにサブクローニングすることで、ｐＧＥＭ－ＭｚｔＰＴ１ΔＮを作製した。
ＭｚｔＰＴ２については、大腸菌のコドン頻度に合わせて最適化した配列（ＭｚｔＰＴ２ｏｐｔ）を化学合成した。また、ＭｚｔＰＴ２は、Ｎ末端側に膜結合に関わるアミノ酸配列が見られたため、Ｎ末端側のアミノ酸１－１５８位を欠損させた変異体ＭｚｔＰＴ２ΔＮをコードする遺伝子配列（配列番号６）をＰＣＲにて増幅した。その際に使用した鋳型はＭｚｔＰＴ２ｏｐｔであり、プライマーセットは、ｔＰＴ２ｏｐｔ １５９ ＮｄｅＳＬｉ Ｆｗ（５’－ＣＡＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＡＧＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＧＣＡＣＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＣ－３’（配列番号１７））、ｔＰＴ２ｏｐｔ １５９ ＫｐｎＳＬｉ Ｒｖ（５’－ＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＧＣＧＧＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧ－３’（配列番号１８））である。増幅された遺伝子をゲル回収し、ｄＡ付加を行い、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクターにサブクローニングすることで、ｐＧＥＭ－ＭｚｔＰＴ２ΔＮを作製した。

（大腸菌発現用コンストラクトの作製）
大腸菌発現用プラスミドｐＣｏｌｄ ＩのＮｄｅＩーＫｐｎＩサイトにそれぞれの遺伝子（ＭｚｔＰＴ１、ＭｚｔＰＴ２）をクローニングするため、ＰＣＲによって各遺伝子配列を増幅した。その際の鋳型は、各遺伝子が導入されたｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクターである。ＭｚｔＰＴ１を増幅するプライマーセットは、ｐＣｏｌｄ ３７６９ ＮｄｅＳＬｉ Ｆｗ（５’－ＣＡＴＡＴＣＧＡＡＧＧＴＡＧＧＣＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣ－３’（配列番号１９））およびｐＣｏｌｄ ３７６９ ＫｐｎＳＬｉ Ｒｖ（５’－ＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＴＧ－３’（配列番号２０））である。ＭｚｔＰＴ２を増幅するプライマーセットは、４０３３ ＮｄｅＩ Ｆｗ（５’－ＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣ －３’（配列番号２１））およびＲ４０３３ ＳＬｉ ＫｐｎＩ Ｒｖ（５’－ＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＣＧＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＡＡＴＧ －３’（配列番号２２））である。各ＰＣＲ産物、およびｐＧＥＭ－ＭｚｔＰＴ１ΔＮ、ｐＧＥＭ－ＭｚｔＰＴ２ΔＮを制限酵素ＮｄｅＩ、ＫｐｎＩで消化し、各タンパク質コード配列を含む遺伝子断片をゲル回収した。ｐＣｏｌｄ Ｉベクターも同様にＮｄｅＩ、ＫｐｎＩで消化し、ゲル回収したのちに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用してそれぞれのコード配列断片と連結することで、ｐＣｏｌｄ Ｉ－ＭｚｔＰＴ１、ｐＣｏｌｄ Ｉ－ＭｚｔＰＴ２、ｐＣｏｌｄ Ｉ－ＭｚｔＰＴ１ΔＮ、ｐＣｏｌｄ Ｉ－ＭｚｔＰＴ２ΔＮを作製した。

（大腸菌での発現・精製）
作製したコンストラクト（ｐＣｏｌｄ Ｉ－ＭｚｔＰＴ１、ｐＣｏｌｄ Ｉ－ＭｚｔＰＴ２、ｐＣｏｌｄ Ｉ－ＭｚｔＰＴ１ΔＮ、ｐＣｏｌｄ Ｉ－ＭｚｔＰＴ２ΔＮ）それぞれを用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。形質転換した大腸菌を培養し、ＩＰＴＧ添加により酵素発現誘導を行った。遠心分離により菌体を回収した後、超音波破砕により、菌体を破砕後、４℃、１００００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、可溶性画分と不溶性画分それぞれを回収した。
可溶性タンパク質として得られたＭｚｔＰＴ１ΔＮとＭｚｔＰＴ２ΔＮは、ＨｉｓＴｒａｐＨＰ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用したＮｉ^２＋－アフィニティークロマトグラフィーにより可溶性画分から精製された。目的タンパク質を含む溶出画分は、遠心式限外ろ過フィルターＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｅｒｃｋ）によってイミダゾールを含まないバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ （ｐＨ７．５），２ｍＭ ＤＴＴ）に置換され、濃縮された。

精製ＭｚｔＰＴ１ΔＮは、以下の反応溶液を用いて、活性測定を行った。３０℃で２時間反応させた後、生成物をブタノールで抽出した後、トルエン／ヘキサン抽出を行った。

精製ＭｚｔＰＴ２ΔＮは、以下の反応溶液を用いて、活性測定を行った。３０℃で１６時間反応させた後、生成物をブタノールで抽出した後、トルエン／ヘキサン抽出を行った。

反応後、飽和食塩水を２００μＬ添加し撹拌することで、反応を停止した。飽和食塩水飽和ｎ－ブタノールを１ｍＬ加え、１分間ボルテックスにより撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心後に上層のブタノール層を回収することで、一般的な生物が普遍的に有する重合度のポリイソプレノイド［Ｃ_１２０（分子量１．８１×１０^３）程度］を抽出した。この抽出操作では、分子量３×１０^３程度のまでのポリイソプレノイドが抽出可能である。その後、水層にトルエン／ヘキサン（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を５００μＬ加え、ボルテックスで５分間撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心後に上層（トルエン／ヘキサン層）を回収することで、さらに高分子量のポリイソプレノイド生成物を抽出した。このトルエン／ヘキサン抽出を２回行い、計１ｍＬのトルエン／ヘキサン層を抽出した。両抽出液５０μＬをクリアゾル３ｍＬに加え、液体シンチレーションカウンター（ＬＤ ６５００、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）で放射活性を測定した。測定した値からバックグラウンドの値を引き、１ｍＬのうち５０μＬを測定したため２０倍することで全体のカウント数を計算した。

（生成物の分子量確認）
ブタノール抽出液に含まれる反応物（ポリプレニル二リン酸）の重合度を逆相ＴＬＣにより解析するため、酸性ホスファターゼ処理によりポリプレニルアルコールに変換した。ブタノール抽出液に超純水を５００μＬを加え、１５，０００ｒｐｍ、室温、１分間遠心後に上層のブタノール層を別のチューブに回収した。遠心エバポレーターを用いてブタノールを留去し、反応生成物を２００μＬまで濃縮した。濃縮した反応生成物は、酸性ホスファターゼ（Ｐｏｔａｔｏ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｓｉｇｍａ）を含む以下に示す反応組成で、３７℃、１８時間反応させた。

反応後、反応溶液に５Ｍ ＮａＯＨを１２０μＬ加え、３７℃で３０分間保温した。生じたポリプレニルアルコールを抽出するため、ペンタンを７００μＬ加えてボルテックスにより撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、室温、１分間遠心後に上層のペンタン層を回収した。５００μＬの飽和食塩水でペンタン層を洗浄し、ペンタン層を回収後、５００μＬの超純水でペンタン層を洗浄しペンタン層を回収した。遠心エバポレーターでペンタンを完全に留去したのち、５０μＬのペンタンに再溶解し、ＴＬＣプレート（ＨＰＴＬＣ シリカゲル６０、ＲＰ－１８、ＭＥＲＣＫ）で展開した。展開溶媒はアセトン：水＝３９：１（ｖ／ｖ）とした。その際に、炭素数５５、６０、８５、９０のポリプレニルアルコール標品も同時に展開した。展開後、ヨウ素呈色により標品の位置を可視化したのちに、^１４Ｃ標識放射性物質を含むインクでその位置をマークした。プラスチックフィルムで覆ったＴＬＣプレートとイメージングプレートを接触させて感光させたのちに、フルオロ・イメージングアナライザーＦＬＡ２０００（Ｆｕｊｉ ｆｉｌｍ）により、シグナル検出を行った。
トルエン／ヘキサンで抽出した生成物は、ＧＰＣにより分子量を確認した。なお、ＧＰＣの測定条件は後述の条件にて行った。

（活性測定結果）
大腸菌で発現させたＭｚｔＰＴ１の大部分は不溶性画分に分画されたため、その画分を用いた活性測定の結果、ＭｚｔＰＴ１はブタノール抽出層に生成物が抽出され、逆相ＴＬＣの結果、Ｃ_５５－Ｃ_６０（分子量 約７００～８００）の生成物であることが確認できた。また、精製ＭｚｔＰＴ１ΔＮにおいても同様に、ブタノール抽出層に生成物が抽出され、図３に示す通り、逆相ＴＬＣの結果、Ｃ_５５－Ｃ_６０（分子量 約７００～８００）の生成物であることが確認できた。
一方で、ＭｚｔＰＴ２は活性が確認されてなかった。また、精製ＭｚｔＰＴ２ΔＮでは、図４に示す通り、トルエン／ヘキサン抽出層に生成物が抽出され、ＧＰＣ解析の結果、生成物の分子量は１０^４程度であり、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なことが分かった。なお、ＧＰＣの測定条件は後述の条件にて行った。

これらの結果から、ＭｚｔＰＴ１は脂質膜非結合下では分子量１０^４未満の生成物を、ＭｚｔＰＴ２は脂質膜非結合下では活性を示さず、ＭｚｔＰＴ２ΔＮは脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を合成することが分かった。

（実施例１）
（ＭＬＤＰ膜結合ペプチドをコードした遺伝子の取得）
ＭｚｔＰＴ２ΔＮに膜結合ペプチドを融合させるために、ｍａｊｏｒ ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＬＤＰ）由来の膜結合領域の取得を行った。

（クラミドモナス由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの取得）
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより入手した、クラミドモナスｓｔａ６株（ＣＣ－４３４８、ｓｔａ６－１ ｍｔ＋）からＲＮＡｉｓｏ（ＴａＫａＲａ ＢＩＯ）を用いてＲＮＡ抽出を行った。－８０℃で保存してあったクラミドモナス細胞に、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓを１ｍＬ加えて５分間ボルテックスし、４℃、１２，０００×ｇで３分間遠心分離した。上清を回収後、クロロホルムを２００μＬ加えてボルテックスにより混合させた。室温で５分静置後、４℃、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上層の水層を回収し、イソプロパノールを５００μＬ加えてボルテックスにより混合させた。室温で１０分静置後、４℃、１２，０００×ｇで１５分遠心分離し、ＲＮＡを沈殿させて上層を捨てた。７５％エタノールを７５０μＬ加えてペレットを洗浄し、４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心分離して上層を除去した後、室温５分間静置し乾燥させた。最後にＤＥＰＣ処理水５０μＬに溶解した。
抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡから混入したゲノムＤＮＡを除去するため、ＤＮａｓｅ処理を行った。ＤＮａｓｅ処理にはＤＮａｓｅ Ｉ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、以下の反応液を調製し、３７℃で３０分間インキュベートした。
反応後にＤＥＰＣ処理水を３５０μＬとフェノールと４００μＬ加え混合し、室温１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上層を回収し、３Ｍ ＮａＯＡｃを３０μＬ、エタノールを６６０μＬ加え混合し、－３０℃で１時間静置した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ＲＮＡを沈殿させて上層を捨てた。７０％エタノールを７００μＬ加えてペレットを洗浄し、４℃、１２，０００×ｇで５分間遠心分離して上層を除去した後、室温５分間静置し乾燥させた。得られた沈殿を５０μＬのＤＥＰＣ処理水に溶解した。

（クラミドモナス由来ＭＬＤＰ ｃＤＮＡの取得）
クラミドモナスのＭＬＤＰ（Ａｃｃｅｔｉｏｎ ｎｏ．ＰＮＷ７９１９１．１）のｃＤＮＡは、クラミドモナスのｔｏｔａｌ ＲＮＡをＦａｓｔ Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＥＵＲＯＰＥ）を使用して合成したｃＤＮＡを鋳型としてＭＬＤＰ １ ＥｃｏＲＶ Ｆｗ（５’―ＡＧＴＣＡＧＡＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧ－３’（配列番号２３））とＭＬＤＰ ｎｏｅｎｄ ７６５ ＢａｍＨＩ Ｒｖ（５’－ＴＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＴＴＧＣＡＣ－３’（配列番号２４））のプライマーを使用し、ＰＣＲによって増幅した。得られたクラミドモナス由来ＭＬＤＰの塩基配列を配列番号５に示す。増幅された遺伝子をゲル回収し、ｄＡ付加を行い、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクターにサブクローニングすることで、ｐＧＥＭ－ＭＬＤＰを作製した。

（ＭＬＤＰとリンカー配列を融合させた遺伝子が導入されたベクターの構築）
無細胞翻訳系でＭＬＤＰとＭｚｔＰＴ２ΔＮを２４アミノ酸からなるリンカー配列（Ｎ末端－ＴＧＮＳＡＤＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＴＱＧ－Ｃ末端（配列番号２５））により連結させた融合タンパク質を発現させるため、まず、ＭＬＤＰとリンカー配列を融合させた遺伝子をｐＥＵ－Ｅ０１－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－ＭＣＳ－Ｎ２（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｔｓｕｙａｍａ、Ｊａｐａｎ）（以降、ｐＥＵ－Ｎ２と記載する）の制限酵素サイトに導入した。
ｐＧＥＭ―ＭＬＤＰを鋳型として、プライマーセット（ＭＬＤＰ－ｌｉｎｋｅｒ ＥｃｏＲＶ １ Ｆｗ：５’－ＡＧＴＣＡＧＡＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧ－３’（配列番号２６）、およびＭＬＤＰ＋Ｌｉｎｋｅｒ ＭＬＤＰ ７６５ Ｒｖ：５’－ＣＣＧＴＣＡＧＣＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＧＴＧＧＧＧＣＣＧＧＧＴＴＧＣＡＣＧ－３’（配列番号２７））を使用したＰＣＲでＭＬＤＰ配列を増幅した。次に、リンカー配列を含むｐＧＦＰ－Ｌ４ＨＰＢを鋳型として、プライマーセット（ＭＬＤＰ＋Ｌｉｎｋｅｒ Ｌｉｎｋｅｒ １ Ｆｗ：５’－ＣＧＴＧＣＡＡＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣＣＧＧＴＡＡＴＴＣＣＧＣＴＧＡＣＧＧ－３’（配列番号２８）、およびＭＬＤＰ－ｌｉｎｋｅｒ ８３７ ＢａｍＨＩ Ｒｖ：５’－ＴＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＣＧＡＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号２９））を使用したＰＣＲでリンカー配列を増幅した。これら２つのＰＣＲ産物を混合した溶液を鋳型として、プライマーセット（ＭＬＤＰ－ｌｉｎｋｅｒ ＥｃｏＲＶ １ Ｆｗ：５’－ＡＧＴＣＡＧＡＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧ－３’（配列番号３０）、およびＭＬＤＰ－ｌｉｎｋｅｒ ８３７ ＢａｍＨＩ Ｒｖ：５’－ＴＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＣＧＡＴＣＣＴＣＣ－３’（配列番号３１））を使用したＰＣＲを行うことで、ＭＬＤＰとリンカーのコード配列を融合させた遺伝子を作製した。この融合遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化しゲル回収した断片を、同制限酵素のセットで消化しゲル回収したｐＥＵ－Ｎ２と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを使用して連結することで、ｐＥＵ－Ｎ２―ＭＬＤＰ－ｌｉｎｋｅｒを作製した。

（ＭＬＤＰ融合型ＭｚｔＰＴ２ΔＮが導入されたベクターの構築）
Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ＭＬＤＰ、リンカー、ＭｚｔＰＴ２ΔＮの順で融合させたタンパク質（ＭＬＤＰ－ＭｚｔＰＴ２ΔＮ）をコードする遺伝子をｐＥＵ－Ｎ２に導入するため、ｐＧＥＭ－Ｍｚｔｐｔ２ΔＮを鋳型として、プライマーセット（ＭｚｔＰＴ２ １５９ ＳｍａＩ Ｆｗ：５’－ＡＧＴＣＡＣＣＣＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧ－３’（配列番号３２）、およびＭｚｔＰＴ２ １４２２ ＮｏｔＩ Ｒｖ：５’－ＴＧＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＣＧＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧ－３’（配列番号３３））を使用したＰＣＲでＭｚｔｐｔ２ΔＮ遺伝子を増幅した。これを精製したのち、制限酵素ＳｍａＩおよびＮｏｔＩで消化しゲル回収した断片を、同制限酵素のセットで消化しゲル回収したｐＥＵ－Ｎ２―ＭＬＤＰ－ｌｉｎｋｅｒと混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを使用して連結することで、ｐＥＵ－Ｎ２―ＭＬＤＰ－ＭｚｔＰＴ２ΔＮを作製した。

（クラミドモナス由来油滴の獲得）
（クラミドモナスの培養）
クラミドモナスｓｔａ６株（ＣＣ－４３４８、ｓｔａ６－１ ｍｔ＋）、及びその親株であるｃｗ１５株（ＣＣ－４３４９、ｃｗ１５ ｍｔ＋）は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより入手した。クラミドモナスの液体培養は、２２℃、光量子束密度１００μｍｏｌ ｍ^－２ ｓ^―１の連続光照射下で、１２０ｒｐｍの旋回培養で行なった。培地はＴＡＰ液体培地を用い、１週間ごとに継代を行った。
無細胞翻訳系で使用する油滴（ＬＤ）を精製するためには、窒素欠乏状態で生育する必要がある。その場合は、前記の液体培地で７日間液体培養した培養液５ｍＬを以下のＨＳＭ液体培地９５ｍＬに添加し、光量子束密度３０μｍｏｌ ｍ^－２ ｓ^―１、１２０ｒｐｍ、２２℃で培養を行った。２、３日後に、サンプル２μＬを血球計算盤（サンリード硝子）に乗せ、顕微鏡ＢＸ４０（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて観察することで、細胞密度を算出した。密度が２．６（±１．２）×１０^６個／ｍＬになった時点で、２，０００×ｇ、５分間遠心分離することで、クラミドモナス細胞を回収した。続いて、ＨＳＭ（Ｎーｆｒｅｅ）培地１００ｍＬで再懸濁し、再度培養を行った。その２日後に、１．５ＭのＫＯＡｃを１．３ｍＬ添加し、更に２日間培養した。その培養液を回収し、２，０００×ｇ、５分間の遠心分離によって、培地を除去し、液体窒素で瞬間冷凍したのちに－８０℃で保存した。

（クラミドモナス由来の油滴の調製）
以下に示すＢｕｆｆｅｒ Ａ ５ｍＬで培養したクラミドモナス細胞を懸濁し、５分間静置した。その後、３０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ｂを加え、２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。最上層のＬＤ（油滴）を含む層をピペットで回収し、３ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ｂを加えて懸濁し、１，０００×ｇ、４℃で１０分遠心分離した後、シリンジを用いて下層の溶液を回収することで、主に壊れたＬＤに由来する中性脂質層を分離除去した。回収した下層の懸濁液を２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離し、下層の水相を除去したのち、チューブに残されたＬＤ層にＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ［０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＤＴＴ］を６０μＬ添加し再懸濁した、無細胞発現系へ添加するＬＤの量の指標とするため、吸光マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ＡＢＳ Ｐｌｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法にてＬＤ懸濁液のタンパク質濃度を測定した。また、回収されたＬＤを確認するため、蛍光顕微鏡ＢＸ４０（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて、観察した。

（無細胞発現）
（無細胞発現に用いるｍＲＮＡ合成及び抽出）
ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｔｓｕｙａｍａ， Ｊａｐａｎ）を用いて、作製したコンストラクトからｍＲＮＡを合成した。以下の組成で３７℃、３時間反応させた。反応後、エタノール沈殿を行い、得られたペレットを２５μＬの１×ＤＢ Ｂｕｆｆｅｒで溶解させた。回収したｍＲＮＡは－８０℃で保存した。

（無細胞翻訳系による油滴上への蛋白質の導入）
無細胞翻訳系にて翻訳・フォールディングと共役させながらＬＤへ外来タンパク質を導入するため、コムギ胚芽由来無細胞タンパク質発現キットＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＦｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて翻訳反応を行った。
７．５μＬの作製したｍＲＮＡに１５μＬの１×ＤＢ Ｂｕｆｆｅｒを加え、ｍＲＮＡ Ｐｒｅｍｉｘを調製した。その後、以下の組成で翻訳反応溶液を調製した。

プラスチックチューブ（ＰＰ容器、４．５ ｍＬ、５－０９４－０２、アズワン）に滅菌超純水を６５０μＬ加え、その中に透析用カップ（ＭＷＣＯ１２０００、コスモ・バイオ株式会社）を透析膜に空気が入り込まないように入れ、１０分以上静置した。その後、チューブ内の滅菌超純水を捨て、外液として１×ＤＢ Ｂｕｆｆｅｒを６５０μＬ、内液として透析カップ内に調製した翻訳反応用液を５０μＬ加え、透析膜に空気が入り込まないように透析カップをプラスチックチューブに入れ、パラフィルムでカップを覆い、２６℃で５時間反応させた。反応後、外液を新たな１×ＤＢ Ｂｕｆｆｅｒに入れ替え、内液に５μＬのｍＲＮＡ Ｐｒｅｍｉｘを追加し、更に１３時間反応を行った。反応終了後、反応溶液を回収し、そのうち５０μＬを１．５ｍＬ用チューブに移し、ＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ（＋グリセロール２０％（ｗ／ｖ））を５０μＬを加え、２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。これにより得られたＬＤ画分、可溶性画分、沈殿画分のうち、ＬＤ画分を可溶性画分と一緒に新たなチューブに移し、更に２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。遠心分離溶液のうち、水層を注射器（注射針、ＮＮ－２７１９Ｓ；１ｍＬツベルクリン用シリンジ、ＳＳ－０１Ｔ、Ｔｅｒｕｍｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｑｐｎａ）で抜き取り別のチューブに回収し（可溶性画分とする）、チューブ内に残されたＬＤ層にＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ（＋グリセロール１０％（ｗ／ｖ））１００μＬを加え、更に２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した（ｗａｓｈ作業）。注射器で水層を抜き取り、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｒｏｃｈｅ）入りのＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁し、これを精製ＬＤ画分とした。また、はじめにＬＤ層と水層を抜いたチューブ（沈殿画分が残されている）にＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬを加え再懸濁し、これを沈殿画分とした。

（酵素活性測定）
無細胞翻訳系で外来タンパク質が導入され精製されたＬＤの懸濁液のプレニルトランスフェラーゼの活性を測定するため、以下に示す反応組成で３０℃、１８時間浴槽内にて振とうした。ただし、アッセイに持ち込む精製ＬＤの量をそろえるため、２μｇのタンパク質を含む量のＬＤ懸濁液を反応系に添加するようにした。また、プレニルトランスフェラーゼ活性のバックグランドを測定するために精製ＬＤ溶液の代わりに超純水を加えたサンプルも調製し、同様に振とうした。

反応後、飽和食塩水を２００μＬ添加し撹拌することで、反応を停止した。飽和食塩水飽和ｎ－ブタノールを１ｍＬ加え、１分間ボルテックスにより撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心後に上層のブタノール層を回収することで、一般的な生物が普遍的に有する重合度のポリイソプレノイド［Ｃ_１２０（分子量１．８１×１０^３）程度］を抽出した。この抽出操作では、分子量３×１０^３程度のまでのポリイソプレノイドが抽出可能である。その後、水層にトルエン／ヘキサン（１：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）を５００μＬ加え、ボルテックスで５分間撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心後に上層（トルエン／ヘキサン層）を回収することで、さらに高分子量のポリイソプレノイド生成物を抽出した。このトルエン／ヘキサン抽出を２回行い、計１ｍＬのトルエン／ヘキサン層を抽出した。両抽出液５０μＬをクリアゾル３ｍＬに加え、液体シンチレーションカウンター（ＬＤ ６５００、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）で放射活性を測定した。測定した値からバックグラウンドの値を引き、１ｍＬのうち５０μＬを測定したため２０倍することで、抽出物全体のカウント数を計算した。

（ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）による生成物鎖長確認）
抽出したトルエン／ヘキサン抽出物をエバポレーターにより溶媒を留去し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を１９０μＬ加えた。シリンジに接続したフィルターユニット（ＭＳ ＰＴＦＥ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ、Ｐｏｒｅ Ｓｉｚｅ：０．４５μｍ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に通し、遮光瓶に移すことで凝集物等を除去した。このうち、５０μＬをＧＰＣ－８０２０（ＴＯＳＯＨ）で分離、解析を行った。分析条件は以下の通りである。
カラム構成 ： ガードカラム ＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＭＰ （ＸＬ）（ＴＯＳＯＨ社製）
溶媒カラム ＴＳＫｇｅｌ Ｍｕｌｔｉｐｏｒｅ ＨＸＬ－Ｍ （ＴＯＳＯＨ社製）（２本連結）
測定温度 ： ４０℃
溶出溶媒 ： ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）
流速 ： ０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出 ： 示差屈折計
分子量標準 ： 標準ポリスチレン
インジェクトしてから１２～３０分の間、カラムから流出したＴＨＦを３０秒ごとに回収し、それぞれにクリアゾル３ｍＬ加えた後、液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定した。

（比較例１）
比較例１では無細胞発現用ベクターにＭｚｔＰＴ２ΔＮ遺伝子をそのまま導入し、ＭＬＤＰと融合しないで発現するベクターを作製した以外は、実施例１と同様に行った。
ｐＧＥＭ－ＭｚｔＰＴ２を鋳型として、プライマーセット（ＭｚｔＰＴ２ １５９ ＳｍａＩ Ｆｗ：５’－ＡＧＴＣＡＣＣＣＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧ－３’（配列番号３４）およびＭｚｔＰＴ２ １４２２ ＮｏｔＩ Ｒｖ：５’－ＴＧＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＣＧＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧ－３’（配列番号３５））を使用したＰＣＲで増幅した。これを精製したのち、ＳｍａＩおよびＮｏｔＩで消化しゲル回収した断片を、同制限酵素のセットで消化しゲル回収したｐＥＵ－Ｎ２と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを使用して連結することで、ｐＥＵ－Ｎ２―ＭｚｔＰＴ２ΔＮを作製した。
ｐＥＵ－Ｎ２にＭＬＤＰのみを導入した構築については、前記（クラミドモナス由来ＭＬＤＰ ｃＤＮＡの取得）で増幅した配列をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ゲル回収したのち、同制限酵素のセットで消化しゲル回収したｐＥＵ－Ｎ２と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを使用して連結することで、ｐＥＵ－Ｎ２―ＭＬＤＰを作製した。

（活性測定結果）
活性測定の結果、比較例１ではブタノール抽出層、トルエン／ヘキサン層のいずれも生成物が抽出されなかった一方で、実施例１ではトルエン／ヘキサン層に生成物由来のカウントが確認出た。
このトルエン／ヘキサン層に抽出された生成物の分子量を測定した結果、実施例１では、図６に示す通り、１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドの生成が確認できた。比較例１（図５の３）ではＭｚｔＰＴ２ΔＮは膜結合能を有さないことから、ＬＤ上に酵素が結合せず、活性が見られなかったと考えられる。実施例１（図５の４）では、ＭｚｔＰＴ２ΔＮにＭＬＤＰ膜結合ペプチドを融合させたことで膜結合能を有するようになり、酵素がＬＤ上に結合するようになったと考えられる。更に、膜に結合することで脂質膜非結合下よりも高分子量の生成物を合成することが分かった。

（比較例２）
比較例２ではＭＬＤＰの膜結合ペプチドと融合させるタンパクをＭｚｔＰＴΔ２からＭｚｔＰＴ１に変更した以外は、実施例１と同様に行った。
ｐＧＥＭ－Ｍｚｔｐｔ１を鋳型として、プライマーセット（ＭｚｔＰＴ１ １ ＳｍａＩ Ｆｗ：５’－ＡＧＴＣＡＣＣＣＧＧＧＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＧＡＴＴＴＴＣＴＣＧＧ－３’（配列番号３６）、およびＭｚｔＰＴ１ １２６３ ＮｏｔＩ Ｒｖ：５’－ＴＧＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＴＧ－３’（配列番号３７））を使用したＰＣＲでＭｚＴＰＴ１遺伝子を増幅した。これを精製したのち、制限酵素ＳｍａＩおよびＮｏｔＩで消化しゲル回収した断片を、同制限酵素のセットで消化しゲル回収したｐＥＵ－Ｎ２―ＭＬＤＰ－ｌｉｎｋｅｒと混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを使用して連結することで、ｐＥＵ－Ｎ２―ＭＬＤＰ－ＭｚｔＰＴ１を作製した。

（実施例２）
実施例２では全長のＭｚｔＰＴ２を無細胞発現ベクターにクローニングすることで、ＭｚｔＰＴ２がもともと有する膜結合ペプチドを有する状態で酵素を発現させ、ＬＤに酵素を結合させた。
ｐＧＥＭ－ＭｚｔＰＴ２を鋳型として、プライマーセット（ＭｚｔＰＴ２ １ ＳｍａＩ Ｆｗ：５’－ＡＧＴＣＡＣＣＣＧＧＧＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＣＴＴＴＴＴＣ－３’（配列番号３８）およびＭｚｔＰＴ２ １４２２ ＮｏｔＩ Ｒｖ：５’－ＴＧＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＣＧＧＴＴＡＴＴＡＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧ－３’（配列番号３９））を使用したＰＣＲで増幅した。これを精製したのち、ＳｍａＩおよびＮｏｔＩで消化しゲル回収した断片を、同制限酵素のセットで消化しゲル回収したｐＥＵ－Ｎ２と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを使用して連結することで、ｐＥＵ－Ｎ２―ＭｚｔＰＴ２を作製した。

（結果）
比較例２（図７の３）ではＭＬＤＰ－ＭｚｔＰＴ１ではＬＤと結合させても、ブタノール層にしか活性は出ず、トルエン／ヘキサン層には活性が得られなかった。一方で、ＭｚｔＰＴ２の全長（実施例２、図８の３）では、ＭｚｔＰＴ２ΔＮ－ＭＬＤＰと同様にトルエン／ヘキサン層に活性が得られた。このことから、脂質膜非結合下で１０^４未満の生成物しか生成できないｔＰＴを膜に結合させても生成物は高分子化せず、膜に結合させ生成物を高分子化するためには脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成するｔＰＴを膜に結合する必要があることが分かった。また、ＭｚｔＰＴ２のもともとの膜結合領域でもＭＬＤＰ由来の膜結合ペプチドを融合した時と同様の結果が得られたことから、膜結合ペプチドのアミノ酸配列は膜結合能を有していればいずれでも良いことが分かった。

（実施例３）
実施例３では実施例１の脂質膜をクラミドモナス由来ＬＤからコムギ胚芽由来の無細胞発現溶液中に含まれるミクロソームに脂質膜を変更した点以外は同様に行った。
コムギ胚芽由来無細胞タンパク質発現系では、反応溶液中にコムギ胚芽抽出液に由来するミクロソーム（小胞体をはじめとするオルガネラ膜に由来する膜小胞）が含まれる。対象タンパク質が膜結合性のドメインを有している場合や、疎水性が高いドメインを有している場合は、無細胞翻訳系で発現したのちに反応系内のミクロソーム膜に結合する場合がある。そこで、反応系にＬＤを添加しないこと以外はＬＤへのタンパク質導入系と同様の手順により、コムギ胚芽由来無細胞タンパク質発現キットでＭＬＤＰ－ＭｚｔＰＴ２ΔＮを発現させた。翻訳反応後に反応溶液を回収し、そのうち５０μＬを１．５ｍＬ用チューブに移し、ＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ（＋グリセロール２０％（ｗ／ｖ））を５０μＬを加え、２０，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。これにより得られた可溶性画分、沈殿画分のうち、可溶性画分を新たなチューブに移し、更に１００，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した。遠心分離溶液のうち、水層を別のチューブに回収し（可溶性画分とする）、チューブ内に残された沈殿画分にＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ（＋グリセロール１０％（ｗ／ｖ））１００μＬを加え懸濁し、１００，０００×ｇ、４℃で３０分遠心分離した（ｗａｓｈ作業）。水層を除去し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｒｏｃｈｅ）入りのＴＤ Ｂｕｆｆｅｒ１００μＬで懸濁し、これをミクロソーム画分とした。

（結果）
図９に示す通り、実施例３では脂質膜をクラミドモナス由来のＬＤからミクロソームに脂質膜を変更したが、それでも１０^５を超える分子量を有するトランス型ポリイソプレノイドの生成が確認できた。

本開示（１）は、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質を、生体外で脂質膜に結合させる結合工程を含むトランス型ポリイソプレノイドの製造方法に関する。

本開示（２）は、前記ｔＰＴファミリー蛋白質が、膜結合領域を有する蛋白質であって、可溶化状態にすることで脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質である本開示（１）に記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法である。

本開示（３）は、前記ｔＰＴファミリー蛋白質が、トランスゴムを産出する植物由来である本開示（１）又は（２）に記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法である。

本開示（４）は、前記ｔＰＴファミリー蛋白質が、Ｍａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）由来である本開示（１）又は（２）に記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法である。

本開示（５）は、前記ｔＰＴファミリー蛋白質が、膜結合領域を有さず、脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質に膜結合ペプチドを融合させることで脂質膜への結合能力を付与した蛋白質である本開示（１）に記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法である。

本開示（６）は、膜結合領域を有さず、脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質が、トランスゴムを産出する植物由来である本開示（５）に記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法である。

本開示（７）は、前記結合工程が、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と脂質膜とを共存させて蛋白質合成を行い、脂質膜に、ｔＰＴファミリー蛋白質を結合させる工程である本開示（１）～（６）のいずれかに記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法である。

本開示（８）はまた、本開示（１）～（７）のいずれかに記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。

本開示（９）はまた、本開示（１）～（７）のいずれかに記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。

本開示（１０）はまた、脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターに関する。

本開示（１１）はまた、本開示（１０）に記載のベクターが導入された形質転換生物に関する。

本開示（１２）はまた、本開示（１１）に記載の形質転換生物を用いてトランス型ポリイソプレノイドを製造するトランス型ポリイソプレノイドの製造方法に関する。

本開示（１３）はまた、本開示（１１）に記載の形質転換生物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。

本開示（１４）はまた、本開示（１１）に記載の形質転換生物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。

（配列表フリーテキスト）
配列番号１：サポジラ由来のｔＰＴ１（ＭｚｔＰＴ１）をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：サポジラ由来のｔＰＴ１（ＭｚｔＰＴ１）のアミノ酸配列
配列番号３：サポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号４：サポジラ由来のｔＰＴ２（ＭｚｔＰＴ２）のアミノ酸配列
配列番号５：クラミドモナス由来ＭＬＤＰをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号６：膜結合ペプチド領域を欠損させたサポジラ由来のｔＰＴ２であるＭｚｔＰＴ２ΔＮの塩基配列
配列番号７：プライマー１
配列番号８：プライマー２
配列番号９：プライマー３
配列番号１０：プライマー４
配列番号１１：プライマー５
配列番号１２：プライマー６
配列番号１３：プライマー７
配列番号１４：プライマー８
配列番号１５：プライマー９
配列番号１６：プライマー１０
配列番号１７：プライマー１１
配列番号１８：プライマー１２
配列番号１９：プライマー１３
配列番号２０：プライマー１４
配列番号２１：プライマー１５
配列番号２２：プライマー１６
配列番号２３：プライマー１７
配列番号２４：プライマー１８
配列番号２５：プライマー１９
配列番号２６：プライマー２０
配列番号２７：プライマー２１
配列番号２８：プライマー２２
配列番号２９：プライマー２３
配列番号３０：プライマー２４
配列番号３１：プライマー２５
配列番号３２：プライマー２６
配列番号３３：プライマー２７
配列番号３４：プライマー２８
配列番号３５：プライマー２９
配列番号３６：プライマー３０
配列番号３７：プライマー３１
配列番号３８：プライマー３２
配列番号３９：プライマー３３

Claims (14)

1. 脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質を、生体外で脂質膜に結合させる結合工程を含むトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
2. 前記ｔＰＴファミリー蛋白質が、膜結合領域を有する蛋白質であって、可溶化状態にすることで脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質である請求項１記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
3. 前記ｔＰＴファミリー蛋白質が、トランスゴムを産出する植物由来である請求項１又は２記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
4. 前記ｔＰＴファミリー蛋白質が、Ｍａｎｉｌｋａｒａ ｚａｐｏｔａ（サポジラ）由来である請求項１又は２記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
5. 前記ｔＰＴファミリー蛋白質が、膜結合領域を有さず、脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質に膜結合ペプチドを融合させることで脂質膜への結合能力を付与した蛋白質である請求項１記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
6. 膜結合領域を有さず、脂質膜非結合下の水層で分子量１０^４以上の生成物を生成可能な蛋白質が、トランスゴムを産出する植物由来である請求項５記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
7. 前記結合工程が、前記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液と脂質膜とを共存させて蛋白質合成を行い、脂質膜に、ｔＰＴファミリー蛋白質を結合させる工程である請求項１～６のいずれかに記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
8. 請求項１～７のいずれかに記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
9. 請求項１～７のいずれかに記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。
10. 脂質膜非結合下で分子量１０^４以上の生成物を生成可能なトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター。
11. 請求項１０記載のベクターが導入された形質転換生物。
12. 請求項１１記載の形質転換生物を用いてトランス型ポリイソプレノイドを製造するトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
13. 請求項１１記載の形質転換生物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
14. 請求項１１記載の形質転換生物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。

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