JP6977928B2 - トランス型ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、トランス型ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法、及びゴム製品の製造方法に関する。

現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培することで得られるが、このような天然ゴムは、イソプレン単位がシス型に結合したポリイソプレノイド（シス型の天然ゴム）である。他方、天然には、イソプレン単位がトランス型に結合したポリイソプレノイドであるトランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）も存在する。

トランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）は、天然には、中国原産の落葉高木であるトチュウ目トチュウ科のトチュウ（杜仲）などの少数の植物が産生することが知られており、トチュウの種や果皮組織などから抽出することで得られる。また、化学合成によって得ることも可能である。このようなトランスゴムは、シス型の天然ゴムとは異なる性質を持っており、ひびの入りにくいゴルフボールや、歯の治療痕に充填する素材などとして使用されている。

トチュウから抽出、精製されるトランス型ポリイソプレノイドは、直鎖の９９％以上がトランス型で結合した、重量平均分子量約１．８×１０^６のポリイソプレノイドであり、トチュウエラストマーとして利用されている。ただし、杜仲は健康食品や生薬として使用されることから、トチュウからトランス型ポリイソプレノイドを抽出、精製して工業的に用いようとすると、食品原料と競合する可能性が考えられる。

他方、化学合成されるトランス型ポリイソプレノイドは、トランス含有量が１００％ではなく、シス型の結合が１．２〜４％程度含まれている。また、分子量は２５万程度であり、１００万以上の超高分子量のものを合成することは大変困難である。そして、化学合成する際には、原料の供給が必要であり、石油由来の原料が必要となることから、エコフレンドリーな（環境に優しい）調達方法とは言い難い。

このように、トチュウから抽出、精製する場合であっても、化学合成する場合であっても、エネルギー問題や食糧と競合する可能性があり、トランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）を安定的に大量に調達する方法が望まれている。

トランスゴムは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）やファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）等の開始基質にイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）が付加重合して生合成される、トランス−１，４−ポリイソプレン構造を有するものであり、トランスゴムの生合成にはその構造からトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）が関係していると考えられている。

例えば、特許文献１には、トランス型プレニルトランスフェラーゼである長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクターにより植物を形質転換することによって、トランス−１，４−ポリイソプレンの含量が増大した植物が得られ、そのような植物を栽培することにより、トランス−１，４−ポリイソプレンを効率的に製造できることが記載されている。

特開２０１６−９３１８６号公報

上述のように、トランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）を安定的に大量に調達する方法が望まれているが、そのような研究開発の例は極めて少なく、トランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）を安定的に大量に調達する方法についてまだまだ多くの工夫の余地がある。
そのような中で、上記課題を解決するための一つのアプローチとしては、トランスゴムの生合成においてｔＰＴの活性の安定化、増強を図ることによりトランスゴムの増産を目指す方法が考えられる。

本発明は、前記課題を解決し、生体外で、トランスゴムの増産を可能にする、トランス型ポリイソプレノイドの製造方法を提供することを目的とする。

本発明はまた、前記課題を解決し、遺伝子組換え技術により植物体に導入することでトランス型ポリイソプレノイドの生産量を向上させることができるベクターを提供することを目的とする。また、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、該植物におけるトランス型イソプレノイド、トランス型ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法を提供することも目的とする。

本発明は、生体外で、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含むトランス型ポリイソプレノイドの製造方法に関する。以降、この発明を本発明の第１の発明とし、第１の本発明とも称する。

上記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける１８３位から１８７位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ａ１）：
ＤＤＸ_１Ｘ_２Ｄ （Ａ１）
（上記アミノ酸配列（Ａ１）中、Ｘ_１及びＸ_２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、以下のアミノ酸配列（Ａ２）：
ＤＤＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｄ （Ａ２）
（上記アミノ酸配列（Ａ２）中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、及びＸ_４は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）であり、かつ、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける３１０位から３１４位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ｂ）：
ＤＤＸ_１１Ｘ_１２Ｄ （Ｂ）
（上記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ_１１及びＸ_１２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）であることが好ましい。

上記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、植物由来であることが好ましい。

上記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、ゴム産生植物由来であることが好ましい。

上記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、パラゴムノキ由来であることが好ましい。

上記結合工程は、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に、ｔＰＴファミリー蛋白質を結合させる工程であることが好ましい。

上記無細胞蛋白合成溶液は、胚芽抽出物を含むことが好ましい。

上記胚芽抽出物は、小麦由来であることが好ましい。

上記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、５〜５０ｇ／Ｌであることが好ましい。

第１の本発明はまた、上記第１の本発明のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。

第１の本発明はまた、上記第１の本発明のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。

本発明はまた、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結されたトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターに関する。以降、この発明を本発明の第２の発明とし、第２の本発明とも称する。

上記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターは、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）をコードする遺伝子のプロモーター、及び、ＭＹＣ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）をコードする遺伝子のプロモーターからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。

第２の本発明はまた、上記いずれかのベクターが導入された形質転換植物に関する。

第２の本発明はまた、上記いずれかのベクターを植物に導入することにより、該植物におけるトランス型イソプレノイドの生産量を向上させる方法に関する。

第２の本発明はまた、上記いずれかのベクターを植物に導入することにより、該植物におけるトランス型ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法に関する。

第２の本発明はまた、上記いずれかのベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。

第２の本発明はまた、上記いずれかのベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。

第１の本発明によれば、生体外で、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含むトランス型ポリイソプレノイドの製造方法であるので、ゴム粒子にｔＰＴファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子中にトランスゴムを合成することができ、効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内でトランスゴムを生産することが可能となる。

第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、第１の本発明のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、ポリイソプレノイド製造時の製造効率が高い手法で得られたトランス型ポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して空気入りタイヤを製造することができる。

第１の本発明のゴム製品の製造方法は、第１の本発明のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、ポリイソプレノイド製造時の製造効率が高い手法で得られたトランス型ポリイソプレノイドからゴム製品を製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮してゴム製品を製造することができる。

第２の本発明のベクターは、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結されたトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターである。そして、該ベクターを植物に導入することにより、該ベクターに含まれる、トランス型ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物におけるトランス型イソプレノイド、トランス型ポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。

第２の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、トランス型ポリイソプレノイド生産量の向上した形質転換植物から得られるトランス型ポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して空気入りタイヤを製造することができる。

第２の本発明のゴム製品の製造方法は、第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、トランス型ポリイソプレノイド生産量の向上した形質転換植物から得られるトランス型ポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮してゴム製品を製造することができる。

ｔＰＴがゴム粒子上でゴム合成を行っている様子を示す推測図である。 トランス型ポリイソプレノイドの生合成経路の一部を示す模式図である。 実施例において透析法を行っている様子を示す概略図である。 実施例１、比較例２において合成された超長鎖ポリイソプレノイドの分子量分布の測定結果を表すグラフである。 種々の生物由来のｔＰＴファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行った様子を示す概略図である。

本明細書においては、第１の本発明と第２の本発明を合わせて本発明ともいう。まず、第１の本発明について説明し、続いて第２の本発明について説明する。
（第１の本発明）
第１の本発明のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法は、生体外で、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含む。
本発明者らは、生体外で、ゴム粒子にｔＰＴファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子中にトランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）を合成することができることを初めて見出した。ｔＰＴファミリー蛋白質は、図１に示すようにゴム粒子上に配置され、ゴム合成を行っているものと推測される。図１には、一例として、ｔＰＴファミリー蛋白質としてｔＰＴが描かれており、基質のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）がｔＰＴにより重合され、ゴム粒子中にトランスゴムが合成される様子が模式的に示されている。したがって、第１の本発明の製造方法のように、生体外で（例えば、反応槽（試験管、プラントなど）内で）、ゴム粒子にｔＰＴファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子中にトランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）を合成することができ、効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内でトランスゴムを生産することができる。
なお、第１の本発明の製造方法は、上記結合工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、また、各工程は１回行われてもよいし、複数回繰り返し行われてもよい。
また、第１の本発明において、ゴム粒子に結合するｔＰＴファミリー蛋白質の量は特に限定されない。

本明細書において、ゴム粒子にｔＰＴファミリー蛋白質が結合するとは、ｔＰＴファミリー蛋白質の全部又は一部がゴム粒子中に取り込まれる又はゴム粒子の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、ゴム粒子表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、ゴム粒子に結合している蛋白質とｔＰＴファミリー蛋白質が複合体を形成し、複合体としてゴム粒子上に存在する場合もゴム粒子に結合しているとの概念範囲に含まれる。

ここで、本発明について補足する。
まず、例えば、シス型の天然ゴムの生合成に深く関与していると考えられているシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させることでシス型の天然ゴムを合成できることが知られていたとしても、ｔＰＴファミリー蛋白質はＣＰＴファミリー蛋白質とは全く異なるタンパク質ファミリーに属し、両者のタンパク質構造は全く異なるものであることから、当業者であれば、上記ＣＰＴファミリー蛋白質での実験結果を受けて、単にＣＰＴファミリー蛋白質をｔＰＴファミリー蛋白質に変更しようとは思わないものである。
そして更には、ｔＰＴファミリー蛋白質は生体内（特に、シス型の天然ゴムを産生するゴム産生植物体内）でゴム粒子上には存在しないことから、当業者にはｔＰＴファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させようとする動機は存在せず、例え、ｔＰＴファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させようと考えたとしても、上述のことから、ｔＰＴファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させてゴムを合成することができるかは全く予測することができないといえる。
このような状況下、ゴム粒子にｔＰＴファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子中にトランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）を合成することができる、という結果は、当業者の予測することのできない驚くべき結果といえる。

上記ゴム粒子の由来は特に限定されず、例えば、パラゴムノキ、ロシアンタンポポ、グアユール、ノゲシ、インドゴムノキなどのゴム産生植物のラテックス由来であればよい。

また、上記ゴム粒子の粒子径も特に限定されず、所定の粒子径のものを分取して用いてもよいし、様々な粒子径のものが含まれた状態のものを使用してもよく、所定の粒子径のものを分取して用いる場合であっても、用いられるゴム粒子としては、粒子径の小さいＳｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＳＲＰ）を用いてもよいし、粒子径の大きいＬａｒｇｅ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＲＰ）を用いてもよい。

上記所定の粒子径のゴム粒子を分取する方法としては、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、遠心分離処理、より好ましくは多段階の遠心分離処理、を行う方法などが挙げられる。具体的には、５００〜１５００×ｇでの遠心分離処理、１７００〜２５００×ｇでの遠心分離処理、７０００〜９０００×ｇでの遠心分離処理、１５０００〜２５０００×ｇでの遠心分離処理、４００００〜６００００×ｇでの遠心分離処理を順に行う方法が挙げられる。なお、各遠心分離処理の処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。また、各遠心分離処理の処理温度としては、０〜１０℃が好ましく、２〜８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。

上記結合工程においては、生体外で、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質がゴム粒子に結合される。

上記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、その由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、ゴム産生植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることがより更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

上記植物としては、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ ｆ． ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｇｉｇａｎｔｅａ Ａｉｔ． ｖａｒ． ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｖｅｎｕｓｔｕｍ Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ａｍｐｅｌａｓ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｉｒｉｓａｎａ Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｓｅｐｔｉｃａ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ベンガルボダイジュ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。

なお、本明細書において、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質は、イソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒する酵素である。具体的には、例えば、植物では、図２に示すようなトランス型ポリイソプレノイド生合成経路によってトランス型ポリイソプレノイドが生合成されるが、当該経路のうち、ｔＰＴファミリー蛋白質は、図２中の点線の枠で囲まれた部分の反応を触媒する酵素と考えられている。ｔＰＴファミリー蛋白質の特徴としては、ｔｒａｎｓ ＩＰＰＳ ＨＴ ｄｏｍａｉｎ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ｃｄ００６８５）に含まれるアミノ酸配列を有することである。

本明細書において、イソプレノイド化合物とは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）を有する化合物を意味する。また、ｔｒａｎｓ型イソプレノイドは、イソプレン単位がトランス型に結合したイソプレノイド化合物を有する化合物であり（特に、全結合中のトランス型の結合の割合が、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上が更に好ましい。）、例えば、ファルネシル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、ヘキサプレニル二リン酸、ヘプタプレニル二リン酸、トランス−１，４−ポリイソプレン等のトランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）などが挙げられる。

ここで、種々の生物由来のｔＰＴファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行った様子を示す概略図を図５に示すが、Ａｎｄｒｅｗ Ｈ．−Ｊ． Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６９、３３３９−３３５４（２００２）等の文献から、図５中の囲みＡ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおいては、１８３位から１８７位に相当）、囲みＢ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおいては、３１０位から３１４位に相当）が種々の生物由来のｔＰＴファミリー蛋白質で保存性の高い保存領域の一部であり、保存領域とは、同様の配列（構造）を有する部位を意味し、蛋白質において同様の機能を有する部位であると推察される領域である。そして特に、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける１８３位から１８７位に相当する位置のアミノ酸配列、及び、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける３１０位から３１４位に相当する位置のアミノ酸配列が特定のモチーフとして保存されており、当該位置にこれらのモチーフを有する蛋白質であればｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられる。
なお、上記マルチプルシーケンスアライメントは、後述の実施例の方法により実施できる。

すなわち、上記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける１８３位から１８７位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ａ１）：
ＤＤＸ_１Ｘ_２Ｄ （Ａ１）
（上記アミノ酸配列（Ａ１）中、Ｘ_１及びＸ_２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、以下のアミノ酸配列（Ａ２）：
ＤＤＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｄ （Ａ２）
（上記アミノ酸配列（Ａ２）中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、及びＸ_４は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）であり、かつ、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける３１０位から３１４位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ｂ）：
ＤＤＸ_１１Ｘ_１２Ｄ （Ｂ）
（上記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ_１１及びＸ_１２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）であることが好ましい。上述したように、上記ｔＰＴファミリー蛋白質がこのような配列を有していれば、ｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられ、イソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒する酵素として機能することができ、ゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子中にトランスゴムを合成することが可能となる。

上記配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける１８３位から１８７位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列（Ａ１）：
ＤＤＸ_１Ｘ_２Ｄ （Ａ１）
（上記アミノ酸配列（Ａ１）中、Ｘ_１及びＸ_２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、以下のアミノ酸配列（Ａ２）：
ＤＤＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｄ （Ａ２）
（上記アミノ酸配列（Ａ２）中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、及びＸ_４は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）であることが好ましいが、より好ましくは、上記アミノ酸配列（Ａ１）及び（Ａ２）中、Ｘ_１がＭ、Ｉ、もしくはＶを表し、また、Ｘ_２がＭ、Ｉ、もしくはＬを表すことである。

上記配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける３１０位から３１４位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列は、以下のアミノ酸配列（Ｂ）：
ＤＤＸ_１１Ｘ_１２Ｄ （Ｂ）
（上記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ_１１及びＸ_１２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）であることが好ましいが、より好ましくは、上記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ_１１がＹ、Ｍ、Ｉ、もしくはＶを表し、また、Ｘ_１２がＬを表すことである。

具体的には、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおいて１８３位から１８７位に相当する保存領域は、例えば、配列番号３で示される酵母由来のＦＰＰＳでは１００位から１０４位に相当し、配列番号４で示されるトチュウ由来のＥｕＦＰＰＳでは９９位から１０３位に相当し、配列番号５で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＦＰＰＳでは９３位から９７位に相当し、配列番号６で示される酵母由来のＴＰＴでは９１位から９５位に相当し、配列番号７で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＳＤＳ１では１７１位から１７５位に相当し、配列番号８で示されるヒト由来のＨｓＴＰＴでは１４１位から１４５位に相当し、配列番号９で示されるマウス由来のＭｍＴＰＴでは１０１位から１０５位に相当する。

また、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおいて３１０位から３１４位に相当する保存領域は、例えば、配列番号３で示される酵母由来のＦＰＰＳでは２４０位から２４４位に相当し、配列番号４で示されるトチュウ由来のＥｕＦＰＰＳでは２３８位から２４２位に相当し、配列番号５で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＦＰＰＳでは２３２位から２３６位に相当し、配列番号６で示される酵母由来のＴＰＴでは２６２位から２６６位に相当し、配列番号７で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＳＤＳ１では２９８位から３０２位に相当し、配列番号８で示されるヒト由来のＨｓＴＰＴでは２６８位から２７２位に相当し、配列番号９で示されるマウス由来のＭｍＴＰＴでは２２８位から２３２位に相当する。

上記ｔＰＴファミリー蛋白質としては、酵母由来のｔＰＴ（ＦＰＰＳ〔Ｅｒｇ２０ｐ［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｒ１０３］〕、ＴＰＴ〔Ｃｏｑ１ｐ［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＪＭ１３４２］〕）、トチュウ由来のｔＰＴ（ＥｕＦＰＰＳ〔ｆａｒｎｅｓｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ［Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ］〕）、パラゴムノキ由来のｔＰＴ（ＨｂＦＰＰＳ〔ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ［Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ］〕、ＨｂＳＤＳ〔ｓｏｌａｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ［Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ］〕）、シロイヌナズナ由来のｔＰＴ（ＡｔＳＤＳ１〔ｓｏｌａｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ １［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ］〕）、ヒト由来のｔＰＴ（ＨｓＴＰＴ〔ｔｒａｎｓ−ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］〕）、マウス由来のｔＰＴ（ＭｍＴＰＴ〔ｔｒａｎｓ−ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］〕）などが挙げられる。

上記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、ゴムを産生するゴム産生植物の他、ゴム産生植物以外の植物、動物、微生物等も有しており、これら由来のｔＰＴファミリー蛋白質は当然、自然状態ではゴム合成に関与していない。にもかかわらず、本発明においては、ｔＰＴファミリー蛋白質であれば、その由来、種類等に関わらず、ゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子中にトランスゴムを合成することができる。すなわち、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子がゴムを産生する植物由来であるか、それ以外の生物由来であるか、または、自然状態でゴム合成に関与しているかなどに関わらず、本発明においては、ｔＰＴファミリー蛋白質でありさえすれば、ゴム粒子中にトランスゴムを合成することができる。このことは、本発明者らが既にＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０６９１７２において示唆しているメカニズム（シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質の由来や種類よりも、どのような宿主に導入したのか、すなわち、ＣＰＴファミリー蛋白質をどのような環境下に発現させたのかが、ゴム合成活性において重要である、ことを示すメカニズム）から、強く示唆される。

本発明において用いるｔＰＴファミリー蛋白質はゴム粒子との親和性を上げるためＮ末端側に膜貫通領域を持っていることが望ましく、野生型として持っていない場合はｔＰＴファミリー蛋白質のＮ末端側に人工的に膜貫通領域を融合させても良い。融合させる膜貫通領域のアミノ酸配列は特に限定されないが、自然界で本来ゴム粒子に結合している蛋白質が持つ膜貫通領域のアミノ酸配列であることが望ましい。

上記ｔＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［１］が挙げられる。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質

また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ｔＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［２］も挙げられる。
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質

なお、上記ｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１〜８３個のアミノ酸、更に好ましくは１〜６２個のアミノ酸、更により好ましくは１〜４１個のアミノ酸、特に好ましくは１〜２０個のアミノ酸、最も好ましくは１〜８個のアミノ酸、より最も好ましくは１〜４個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。

アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。

また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、上記ｔＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［３］も挙げられる。
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質

なお、上記ｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号２で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。

本明細書において、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。

上記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。

上記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードし、発現させてｔＰＴファミリー蛋白質を産出できるものであれば特に制限されないが、該遺伝子としては、具体的には、下記［１］又は［２］が挙げられる。
［１］配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｔｒａｎｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。

上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。

上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。

上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。

また、上記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、上記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、上記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。

なお、上記結合工程においては、生体外で、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質がゴム粒子に結合される限り、更にその他の蛋白質が結合されてもよい。

上記その他の蛋白質の由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、ゴム産生植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることがより更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

上記その他の蛋白質としては、何ら制限されずいかなる蛋白質であってもよいが、ゴム粒子のゴム合成能力の観点からは、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質であることが好ましい。なお、ゴム粒子上に存在する蛋白質は、大きくゴム粒子の膜表面に結合する蛋白質であってもよいし、ゴム粒子の膜に挿入されるように結合する蛋白質であってもよいし、上記膜に結合している蛋白質と複合体を形成して膜表面上に存在することになる蛋白質であってもよい。

上記ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質としては、例えば、Ｎｏｇｏ−Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）、β−１，３−グルカナーゼ、Ｈｅｖｅｉｎなどが挙げられる。

上記結合工程は、生体外で、ゴム粒子にｔＰＴファミリー蛋白質を結合させることができればその手段は特に制限されず、例えば、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子にｔＰＴファミリー蛋白質を結合させる方法などが挙げられる。

上記結合工程としては、中でも、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子にｔＰＴファミリー蛋白質を結合させる工程であることが好ましい。
すなわち、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて（より具体的には、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを混合して）蛋白質合成を行うことで、ｔＰＴファミリー蛋白質の結合したゴム粒子を得ることが好ましい。
なお、リポソームはリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から構成される脂質二重膜として人工的に製造されるため、製造されたリポソームの表面には蛋白質は結合していないのに対して、ゴム産生植物のラテックスから採取されるゴム粒子も脂質膜で覆われた粒子であるが、その膜は天然由来の膜であるため、その表面には植物体内で合成された蛋白質が既に結合している。このことから、蛋白質が結合していないリポソームなどに比べて、既に蛋白質が結合しており、蛋白質で覆われた状態にあるゴム粒子に更に蛋白質を結合させるのは困難であることが予想される。また、ゴム粒子に既に結合している蛋白質が無細胞蛋白合成を阻害することも懸念される。以上のような点から、ゴム粒子共存下での無細胞蛋白合成は実現が困難であると考えられてきた。このような状況下、本発明者らは、これまでに試みられていなかった、ｔＰＴファミリー蛋白質の無細胞蛋白合成をゴム粒子の共存下で行ったところ、ｔＰＴファミリー蛋白質の結合したゴム粒子を製造することができることを見出した。

上記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて行われる蛋白質合成は、いわゆる、無細胞蛋白合成法を用いたｔＰＴファミリー蛋白質の合成であり、生物学的機能を担持した（ｎａｔｉｖｅ状態の）ｔＰＴファミリー蛋白質を合成でき、当該無細胞蛋白合成法をゴム粒子の共存下で行うことにより、合成されるｔＰＴファミリー蛋白質をｎａｔｉｖｅ状態でゴム粒子に結合することが可能となる。

ここで、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下、蛋白質合成を行うことで、ゴム粒子にｔＰＴファミリー蛋白質が結合するとは、当該蛋白質合成により合成されたｔＰＴファミリー蛋白質の各蛋白質の全部又は一部がゴム粒子中に取り込まれる又はゴム粒子の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、ゴム粒子表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、上述のようにゴム粒子に結合している蛋白質と複合体を形成し、複合体としてゴム粒子上に存在する場合もゴム粒子に結合しているとの概念範囲に含まれる。

上記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡはそれぞれ、翻訳されてｔＰＴファミリー蛋白質を合成しうる翻訳鋳型である。
上記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡの由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、上述した植物由来であることがより好ましく、ゴム産生植物由来であることが更に好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが特に好ましく、最も好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

上記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡはそれぞれ、翻訳されてｔＰＴファミリー蛋白質を合成しうる翻訳鋳型であればその調製方法は特に制限されないが、例えば、ゴム産生植物のラテックスからホットフェノール法などによりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報を元に作製したプライマーを用いてｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片を取得して、該ＤＮＡ断片を元に通常行われるインビトロでの転写反応を行うことにより調製することができる。

上記無細胞蛋白合成溶液は、上記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む限り、その他の蛋白質をコードするｍＲＮＡを含んでいてもよい。
上記その他の蛋白質をコードするｍＲＮＡとしては、翻訳されてその他の蛋白質を発現することができるものを用いることができる。なお、その他の蛋白質としては、上述したものと同様のものを挙げることができる。

第１の本発明における結合工程においては、ゴム粒子の共存下でｔＰＴファミリー蛋白質の無細胞蛋白合成が行われることが好ましいが、当該無細胞蛋白合成は、上記無細胞蛋白合成溶液を用いて、従来と同様の方法で行うことができる。用いられる無細胞蛋白合成系としては、通常用いられる無細胞蛋白質合成手段を採用することができる。例えば、Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＲＴＳ５００（Ｒｏｓｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）やＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５５９−５６４（２０００）、特開２０００−２３６８９６号公報、特開２００２−１２５６９３号公報、特開２００２−２０４６８９号公報に従って調製された小麦胚芽抽出液及びその無細胞蛋白質合成系（特開２００２−２０４６８９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４６５２−１４６５７（２００２））を使用することができる。中でも、胚芽抽出物を用いる系が好ましい。すなわち、上記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含むこともまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。

上記胚芽抽出物の由来は特に限定されないが、翻訳効率の観点からは、植物の蛋白質を無細胞蛋白合成法で合成する場合には植物由来の胚芽抽出物を用いることが好ましい。特に好ましくは小麦由来の胚芽抽出物を用いることである。すなわち、上記胚芽抽出物が小麦由来であることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。

上記胚芽抽出物の調製方法としては特に制限されず、通常の胚芽抽出物調製方法を採用することができるが、例えば、特開２００５−２１８３５７号公報に記載された方法を採用すればよい。

上記無細胞蛋白合成溶液は、更にサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩（以降、単に「活性増強物質」とも称する。）を含むことが好ましい。該活性増強物質を含有することにより、蛋白質合成活性を更に増強させることができる。

上記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩としては、無細胞蛋白合成活性を増強しうるものであれば特に制限されず、例えば、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−３’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、８−ブロモアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸（ブロモｃＡＭＰ）及びその塩、８−（４−クロロフェニルチオ）アデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸（クロロフェニルチオｃＡＭＰ）及びその塩、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルべンジミダゾルアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸（ジクロロリボフラノシルべンジミダゾルｃＡＭＰ）及びその塩、アデノシン−２’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン−２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、アデノシン−２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−２’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン−２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、グアノシン−２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩等が挙げられる。

上記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体との塩を形成する塩基としては、生化学的に許容しうるもので、当該誘導体と塩を形成するものであれば特に制限されないが、中でも好ましいものとしては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属原子、トリスヒドロキシアミノメタン等の有機塩基が挙げられる。

上記活性増強物質としては、中でも、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸ナトリウムが特に好ましい。また、これら活性増強物質は、単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。

上記活性増強物質は、あらかじめ上記無細胞蛋白合成溶液に加えておいてもよいが、当該溶液中で不安定である場合には、無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成反応を行う際に加えるのが好ましい。

上記活性増強物質の添加量としては、上記無細胞蛋白合成溶液による蛋白質合成反応が活性化（増加）しうる濃度であれば特に制限されない。具体的には、反応系中の最終濃度として、通常０．１ミリモル／リットル以上であればよい。濃度の下限は、好ましくは０．２ミリモル／リットル、より好ましくは０．４ミリモル／リットル、特に好ましくは０．８ミリモル／リットルである。他方、濃度の上限は、好ましくは２４ミリモル／リットル、より好ましくは６．４ミリモル／リットル、特に好ましくは３．２ミリモル／リットルである。

上記活性増強物質を上記無細胞蛋白合成溶液に加える際の無細胞蛋白合成溶液の温度としては特に限定されないが、０〜３０℃が好ましく、１０〜２６℃がより好ましい。

上記無細胞蛋白合成溶液は、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ（翻訳鋳型）に加え、蛋白質合成に必須の成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオン等を含有し、更には必要に応じて活性増強物質を含むものであり、このような無細胞蛋白合成溶液を用いることにより無細胞蛋白合成反応系とすることができる。
なお、上記特開２００５−２１８３５７号公報に記載された方法で調製された胚芽抽出物には蛋白質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが含まれているため、当該方法により調製された胚芽抽出物を無細胞蛋白合成溶液に用いる場合には、別途調製したｔＲＮＡを追加することは必須要件ではない。すなわち、無細胞蛋白合成溶液には、必要に応じてｔＲＮＡを追加すればよい。

第１の本発明における結合工程は、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行うことが好ましいものであるが、具体的には蛋白質の合成前又は合成後の適当な時期に、好ましくは蛋白質合成前に、上記無細胞蛋白合成溶液にゴム粒子を加えることにより行うことができる。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、５〜５０ｇ／Ｌであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液１Ｌに対してゴム粒子を５〜５０ｇ共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５ｇ／Ｌ未満であると、合成されたｔＰＴファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成されたｔＰＴファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５０ｇ／Ｌを超えると、ゴム粒子同士が凝集し、合成されたｔＰＴファミリー蛋白質がうまくゴム粒子に結合できなくなるおそれがある。上記ゴム粒子の濃度としてより好ましくは１０〜４０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１５〜３５ｇ／Ｌ、特に好ましくは１５〜３０ｇ／Ｌである。

また、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下での蛋白質合成は、その反応の進展に伴い、適宜ゴム粒子を追加していってもよい。ゴム粒子を上記無細胞蛋白合成溶液に加えてから例えば３〜４８時間（好ましくは３〜３０時間、より好ましくは３〜２４時間）など無細胞蛋白合成系が活性な間、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とが共存するようにしておくことが好ましい。

上記ゴム粒子は、第１の本発明における結合工程に用いる前に（より好ましくは前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に）前処理等の特段の処理を行う必要はない。ただし、ゴム粒子上に存在する蛋白質のうち、第１の本発明の方法により結合させたいｔＰＴファミリー蛋白質の割合を高めるために、予め界面活性剤によりゴム粒子から蛋白質を除去してもよい。このように、第１の本発明において用いられるゴム粒子が、第１の本発明における結合工程に用いる前に（より好ましくは前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に）、界面活性剤で洗浄されたものであることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。

上記界面活性剤としては特に限定されず、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などが挙げられる。これらの中でも、膜上の蛋白質の変性作用が小さい点で、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が好適に用いられ、両性界面活性剤が特に好適に用いられる。すなわち、上記界面活性剤が、両性界面活性剤であることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。
これら界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

上記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンエーテル系、ポリオキシアルキレンエステル系、多価アルコール脂肪酸エステル系、糖脂肪酸エステル系、アルキルポリグリコシド系、ポリオキシアルキレンポリグルコシド系の非イオン性界面活性剤や、ポリオキシアルキレンアルキルアミン、アルキルアルカノールアミド等が挙げられる。
これらの中でも、ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤、多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が好ましい。

上記ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンポリオールアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンモノ、ジ、又はトリスチリルフェニルエーテル等が挙げられる。これらの中でも、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテルが好適に使用される。なお、前記ポリオールとしては、炭素数２〜１２の多価アルコールが好ましく、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、グルコース、スクロース、ペンタエリトリトール、ソルビタン等が挙げられる。

上記ポリオキシアルキレンエステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルロジン酸エステル等が挙げられる。
上記多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、炭素数２〜１２の多価アルコールの脂肪酸エステル又はポリオキシアルキレン多価アルコールの脂肪酸エステル等が挙げられる。より具体的には、例えば、ソルビトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル等が挙げられる。また、これらのポリアルキレンオキサイド付加物（例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル等）も使用可能である。これらの中でも、ソルビタン脂肪酸エステルが好適に使用される。
上記糖脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ショ糖、グルコース、マルトース、フルクトース、多糖類の脂肪酸エステル等が挙げられ、これらのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
上記アルキルポリグリコシド系の非イオン性界面活性剤としては、グリコシドとしてグルコース、マルトース、フルクトース、ショ糖などが挙げられ、例えば、アルキルグルコシド、アルキルポリグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルポリグルコシドなどが挙げられ、これらの脂肪酸エステル類も挙げられる。また、これらすべてのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。

これら非イオン性界面活性剤におけるアルキル基としては、例えば、炭素数４〜３０の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和のアルキル基が挙げられる。また、ポリオキシアルキレン基としては、炭素数２〜４のアルキレン基を有するものが挙げられ、例えば、酸化エチレンの付加モル数が１〜５０モル程度のものが挙げられる。また、前記脂肪酸としては、例えば、炭素数４〜３０の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和の脂肪酸が挙げられる。

上記非イオン性界面活性剤としては、中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で、かつ蛋白質の変性作用が小さい状態で、適度に膜結合蛋白質を除去できるという理由から、ポリオキシエチレンエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）が特に好ましい。

上記両性界面活性剤としては、例えば、四級アンモニウム塩基／スルホン酸基（−ＳＯ_３Ｈ）タイプ、四級アンモニウム塩基／リン酸酸基タイプ（水に可溶）、四級アンモニウム塩基／リン酸酸基タイプ（水に不溶）、四級アンモニウム塩基／カルボキシル基タイプなどの両性イオン界面活性剤が挙げられる。なお、前記の酸基は塩であってもよい。
特に、前記の両性イオン界面活性剤が一分子中に＋と−の両電荷を有することが好ましく、前記の酸基の酸解離定数（ｐＫａ）が、５以下であることが好ましく、４以下であることがより好ましく、３以下であることが更に好ましい。

上記両性界面活性剤としては、具体的には、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコナミドプロピル）−コラミド、ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸｛Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）−３−１４｝、ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸、ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホン酸等のアンモニウムスルホベタイン類、ｎ−オクチルホスホコリン、ｎ−ノニルホスホコリン、ｎ−デシルホスホコリン、ｎ−ドデシルホスホコリン、ｎ−テトラデシルホスホコリン、ｎ−ヘキサデシルホスホコリン等のホスホコリン類、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン類が挙げられる。これらの中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で適度に蛋白質を除去できるという理由から、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）が特に好ましい。

上記界面活性剤の処理濃度は、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の３倍以内であることが好ましい。臨界ミセル濃度の３倍を超える濃度の界面活性剤で処理するとゴム粒子の膜安定性が低下するおそれがある。より好ましくは２．５倍以内であり、更に好ましくは２．０倍以内である。また下限としては、０．０５倍以上であることが好ましく、０．１倍以上であることがより好ましく、０．３倍以上であることが更に好ましい。

上記無細胞蛋白合成における蛋白質合成のための反応システムまたは装置としては、バッチ（回分）法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。その他、蛋白質合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法等も用いることができる。

中でも、重層法は操作が簡便であるという利点はあるものの反応溶液中でゴム粒子が分散してしまい、合成されるｔＰＴファミリー蛋白質をゴム粒子に効率よく結合させることが困難であるのに対して、透析法では、合成されるｔＰＴファミリー蛋白質の原料となるアミノ酸は透析膜を透過できるがゴム粒子は透過しないため、ゴム粒子の分散を防ぐことができ、効率的にゴム粒子に合成されるｔＰＴファミリー蛋白質を結合させることができることから、透析法が好ましい。

なお、上記透析法とは、上記無細胞蛋白合成における蛋白質合成の合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、蛋白質合成を行う方法である。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製の透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製の１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、１０，０００ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。

上記透析外液としては、アミノ酸を含む緩衝液が用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、例えば、小麦由来の胚芽抽出物を用いた系においては、通常１０〜４０℃、好ましくは１８〜３０℃、より好ましくは２０〜２６℃で、１０分〜４８時間（好ましくは１０分〜３０時間、より好ましくは１０分〜２４時間）行うことができる。

また、上記無細胞蛋白合成溶液に含まれるｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡは、分解されやすいことから、上記蛋白質合成反応中に適宜当該ｍＲＮＡを追加することで、蛋白質の合成をより効率的に行うことができる。すなわち、上記蛋白質合成反応中に、上記ｔＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを更に加えることもまた、第１の本発明の好適な実施形態の１つである。
なお、上記ｍＲＮＡの添加時間、添加回数、添加量等は特に制限されず、適宜設定することができる。

第１の本発明の製造方法においては、生体外で、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を行った後、必要に応じてゴム粒子を回収する工程を行ってもよい。

上記ゴム粒子回収工程は、ゴム粒子を回収することができればその手法は特に制限されず、ゴム粒子を回収する通常行われる方法により行うことができる。具体的には、例えば、遠心分離により行う方法などが挙げられる。当該遠心分離によりゴム粒子を回収する場合、その遠心力や、遠心分離処理時間、遠心分離処理温度はゴム粒子を回収できるよう適宜設定することができるが、例えば、遠心分離処理の遠心力としては、１５０００×ｇ以上が好ましく、２００００×ｇ以上がより好ましく、２５０００×ｇ以上が更に好ましい。一方、遠心力は大きくしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心力の上限としては、５００００×ｇ以下が好ましく、４５０００×ｇ以下がより好ましい。遠心分離処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、遠心分離処理時間を長くしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心分離処理時間の上限としては、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。
また、遠心分離処理温度としては、ゴム粒子に結合したｔＰＴファミリー蛋白質のタンパク活性を維持するという観点から、０〜１０℃が好ましく、２〜８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。

例えば、上記無細胞蛋白合成を行った場合には、上記遠心分離処理を行うと、ゴム粒子が上層に、無細胞蛋白合成溶液が下層に分離される。その後、下層の無細胞蛋白合成溶液を除去することで、ｔＰＴファミリー蛋白質を結合させたゴム粒子を回収することができる。回収したゴム粒子はｐＨが中性の適当な緩衝液に再懸濁することで保存することができる。

なお、上記ゴム粒子回収工程を行った後に回収されたゴム粒子は更なる特別な処理を経ずに通常の天然ゴムと同様に用いることができる。

更に、第１の本発明のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドは、上記ゴム粒子を以下の固化工程に供することで回収することができる。

上記固化工程において、固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のトランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）を溶解しない溶媒にゴム粒子を添加する方法やゴム粒子に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ゴム粒子からゴムを固形分として回収できる。得られたゴムは、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。

このように、第１の本発明によれば、生体外で、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子中にトランスゴムを合成することができ、効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内でトランスゴム（トランス型ポリイソプレノイドの１種）を生産することが可能となる。
すなわち、トランス型ポリイソプレノイドを合成する方法であって、該方法は、生体外（例えば、反応槽（試験管、プラントなど）内）で、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質を、ゴム粒子に結合させる結合工程を含むトランス型ポリイソプレノイドを合成する方法もまた、第１の本発明の１つである。
なお、生体外で、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質を、ゴム粒子に結合させる結合工程については、上述したとおりである。

なお、本明細書において、トランス型ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）がトランス型に結合して構成された重合体の総称である（特に、全結合中のトランス型の結合の割合が、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上が更に好ましい。）。トランス型ポリイソプレノイドとしては、例えばトランス型セスタテルペン（Ｃ_２５）、トランス型トリテルペン（Ｃ_３０）、トランス型テトラテルペン（Ｃ_４０）、トランス−１，４−ポリイソプレン等のトランスゴムなどの重合体が挙げられる。また、本明細書において、イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ_５Ｈ_８）を有する化合物を意味し、ポリイソプレノイドをも含む概念である。

（ゴム製品の製造方法）
第１の本発明のゴム製品の製造方法は、上記第１の本発明のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。

ゴム製品としては、ゴム（好ましくは天然ゴム）を使用して製造できるゴム製品であれば特に限定されず、例えば、空気入りタイヤ、ゴムローラ、ゴム防舷材、手袋、医療用ゴムチューブ等が挙げられる。

ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、第１の本発明のゴム製品の製造方法が第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、上記生ゴム製品成形工程は、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、上記加硫工程は、上記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、第１の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、上記トランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。

＜混練工程＞
混練工程では、上記トランス型ポリイソプレノイドの製造方法により得られたトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。

添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、上記トランス型ポリイソプレノイド以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。

混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。

＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。

＜加硫工程＞
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。

（第２の本発明）
（ベクター）
第２の本発明のベクターは、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターである。このようなベクターを植物に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれる、トランス型ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物におけるトランス型イソプレノイド、トランス型ポリイソプレノイドの生産量を向上させることが可能となる。これは、乳液の生産性向上のために導入した外来遺伝子の発現が乳管以外の部位で促進されると、植物体の代謝や乳液の生産に負荷がかかり、悪影響を及ぼすためと推測される。

なお、本明細書において、プロモーターが乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するとは、所望の遺伝子を当該プロモーターと機能的に連結させて植物に導入した場合に、当該所望の遺伝子が乳管で特異的に発現されるように遺伝子発現を制御する活性を有することを意味する。ここで、乳管特異的に遺伝子が発現するとは、当該遺伝子が植物中、乳管以外の部位では全く又はほとんど発現せず、当該遺伝子が実質的に乳管でのみ専ら発現しているといえる状態を意味する。また、遺伝子をプロモーターと機能的に連結させるとは、当該プロモーターの制御を受けるように、当該プロモーターの下流に当該遺伝子配列を連結することを意味する。

第２の本発明のベクターは、一般的に植物の形質転換用ベクターとして知られているベクターに、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターの塩基配列、及び、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を従来公知の方法により挿入することで作製することができる。第２の本発明のベクターを作製するために使用することができるベクターとしては、例えば、ｐＢＩ系のベクターや、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧなどのバイナリーベクター、ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間系プラスミド、ＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳなどが挙げられる。

第２の本発明のベクターは、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターの塩基配列、及び、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を含む限り、その他の塩基配列を含んでいてもよい。通常、ベクターにはこれらの塩基配列に加えて、ベクター由来の配列が含まれており、更に、制限酵素認識配列、スペーサ―配列、マーカー遺伝子の配列、レポーター遺伝子の配列などが含まれる。

上記マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、上記レポーター遺伝子は、植物体中での発現部位を確認するために導入するものであり、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等が挙げられる。

上記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、その由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、上述した植物由来であることがより好ましく、ゴム産生植物由来であることが更に好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることがより更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることが特に好ましく、最も好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

なお、第２の本発明におけるトランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、ｔＰＴファミリー蛋白質については、上述の第１の本発明で述べたとおりである。

第２の本発明のベクターにおいては、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターの塩基配列、及び、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を含む限り、更にその他の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を含んでいてもよい。

上記その他の蛋白質をコードする遺伝子としては、第１の本発明において上述したものと同様のものが挙げられる。

上記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターとしては、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）をコードする遺伝子のプロモーター、及び、ＭＹＣ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）をコードする遺伝子のプロモーターからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。

なお、本明細書において、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことであり、ゴム粒子が安定化するのに寄与する。
Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことである。
Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物の乳管細胞に多く発現している蛋白質のことであり、ゴム粒子の凝集に関与し、抗真菌活性を有するものである。
また、ＭＹＣ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスで多く発現している、ジャスモン酸シグナルに関わる転写因子のことである。ここで、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（転写因子）とは、遺伝子の転写量を増加若しくは減少（好ましくは増加）させる活性を有する蛋白質を意味する。すなわち、本明細書において、ＭＹＣ１は、ジャスモン酸シグナルに関わる蛋白質のうち少なくとも１種の蛋白質をコードする遺伝子の転写量を増加若しくは減少（好ましくは増加）させる活性（転写因子活性）を有する蛋白質のことである。

（Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）をコードする遺伝子のプロモーター）
上記ＲＥＦをコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、ゴム産生植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることがより更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

上記ＲＥＦをコードする遺伝子のプロモーターは、下記［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれかで表されるＤＮＡであることが好ましい。
［Ａ１］配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ａ２］配列番号１０で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ａ３］配列番号１０で表される塩基配列と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのように、プロモーターの塩基配列は、元の塩基配列とある程度の配列同一性を有している場合には、同様にプロモーター活性を有する場合があることが知られている。プロモーター活性を維持するための、配列番号１０で表される塩基配列との配列同一性としては、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。

（ＳＲＰＰをコードする遺伝子のプロモーター）
上記ＳＲＰＰをコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、ゴム産生植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることがより更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

上記ＳＲＰＰをコードする遺伝子のプロモーターは、下記［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかで表されるＤＮＡであることが好ましい。
［Ｂ１］配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｂ２］配列番号１１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ｂ３］配列番号１１で表される塩基配列と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのように、プロモーターの塩基配列は、元の塩基配列とある程度の配列同一性を有している場合には、同様にプロモーター活性を有する場合があることが知られている。プロモーター活性を維持するための、配列番号１１で表される塩基配列との配列同一性としては、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。

（ＨＥＶ２．１をコードする遺伝子のプロモーター）
上記ＨＥＶ２．１をコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、ゴム産生植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることがより更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

上記ＨＥＶ２．１をコードする遺伝子のプロモーターは、下記［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれかで表されるＤＮＡであることが好ましい。
［Ｃ１］配列番号１２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｃ２］配列番号１２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ｃ３］配列番号１２で表される塩基配列と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのように、プロモーターの塩基配列は、元の塩基配列とある程度の配列同一性を有している場合には、同様にプロモーター活性を有する場合があることが知られている。プロモーター活性を維持するための、配列番号１２で表される塩基配列との配列同一性としては、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。

（ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーター）
上記ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、ゴム産生植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることがより更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。

上記ＭＹＣ１をコードする遺伝子のプロモーターは、下記［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれかで表されるＤＮＡであることが好ましい。
［Ｄ１］配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ２］配列番号１３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ
［Ｄ３］配列番号１３で表される塩基配列と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡ

ここでいう「ハイブリダイズする」とは、上述したのと同様である。また、上記ストリンジェントな条件についても、上述したのと同様である。

上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡのように、プロモーターの塩基配列は、元の塩基配列とある程度の配列同一性を有している場合には、同様にプロモーター活性を有する場合があることが知られている。プロモーター活性を維持するための、配列番号１３で表される塩基配列との配列同一性としては、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。

上記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、上記したＤＮＡと６０％以上の配列同一性を有するＤＮＡが、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するＤＮＡであることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法である、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、又はＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）等をレポーター遺伝子としたレポーターアッセイなどにより確認する方法が挙げられる。

また、上記プロモーターの塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌ Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）法によりゲノムＤＮＡを抽出する。次に上記プロモーターの既知の塩基配列を基に特異的なプライマーと、ランダムプライマーを設計し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＴＡＩＬ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ）−ＰＣＲ法を行って、上記プロモーターを含む遺伝子の増幅を行い、塩基配列を同定する。

第２の本発明のベクター（乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクター）を植物に導入することにより、トランス型ポリイソプレノイド生合成に関わる所定の蛋白質を乳管特異的に発現するように形質転換された形質転換植物が得られる。そして、当該形質転換植物では、トランス型ポリイソプレノイド生合成に関わる所定の蛋白質が乳管特異的に発現することにより、第２の本発明のベクターが導入された植物体内で新たに該蛋白質が有する所定の酵素活性等の機能が乳管内で増強されてトランス型ポリイソプレノイドの生合成経路の一部が増強され、結果的に植物体でのトランス型イソプレノイド、トランス型ポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。

次に、上記形質転換植物の作製方法について簡単に説明するが、このような形質転換植物は従来公知の方法により作製することができる。

上記形質転換植物を作出するために、第２の本発明のベクターが導入される植物としては、特に限定されないが、中でも、ポリイソプレノイドを生合成できる植物でｔＰＴファミリー蛋白質を発現させることにより、トランス型ポリイソプレノイドの生産性の向上、トランス型ポリイソプレノイドの製造量の増大が特に期待できることから、上記植物としては、ゴム産生植物が好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種のゴム産生植物であることがより好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキであることである。

第２の本発明のベクターを植物（カルスや、培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストといった植物細胞を含む）に導入する方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、国際公開第９４／００９７７号）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。中でも、アグロバクテリウムを用いる方法（アグロバクテリウム法）を用いて第２の本発明のベクターを植物に導入して形質転換植物（形質転換植物細胞）を作製するのが好ましい。
なお更には、第２の本発明のベクターを、上記ＤＮＡを導入する方法などにより、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、生物体、生物体の一部、器官、組織や培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストなどに導入することによって、トランス型イソプレノイド、トランス型ポリイソプレノイドを生産することも可能である。

以上の方法等により、上記形質転換植物（形質転換植物細胞）が得られる。なお、上記形質転換植物は、上述の方法で得られた形質転換植物細胞のみならず、その子孫又はクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物の全てを含む概念である。一旦、第２の本発明のベクターが導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該形質転換植物を量産することも可能である。

形質転換植物細胞から植物体（形質転換植物）を再生する方法としては、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１−１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５）， Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４−）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９）， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１−）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９）， Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９−）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２）， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７−）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。

再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的の蛋白質遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的の蛋白質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。

上記形質転換植物から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。

第２の本発明では、第２の本発明のベクターを植物に導入することにより、該ベクターに含まれるトランス型ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子（特に好ましくは、ｔＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子）が乳管特異的に発現し、当該植物におけるトランス型イソプレノイド、トランス型ポリイソプレノイドの生産量を向上させることができる。具体的には、上述の方法で得られた形質転換植物細胞、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物、該形質転換植物から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、トランス型イソプレノイド、トランス型ポリイソプレノイドを製造することができる。

このように、第２の本発明のベクターを植物に導入することにより、該植物におけるトランス型イソプレノイドの生産量を向上させる方法もまた、第２の本発明の１つである。また、第２の本発明のベクターを植物に導入することにより、該植物におけるトランス型ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法もまた、第２の本発明の１つである。

（ゴム製品の製造方法）
第２の本発明のゴム製品の製造方法は、上記第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。

ゴム製品としては、第１の本発明において上述したものと同様である。

ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、第２の本発明のゴム製品の製造方法が第２の本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、上記生ゴム製品成形工程は、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、上記加硫工程は、上記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、第２の本発明の空気入りタイヤの製造方法は、上記第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。

＜混練工程＞
混練工程では、上記第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるトランス型ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。

上記第２の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるトランス型ポリイソプレノイドは、上記形質転換植物からラテックスを採取し、採取したラテックスを以下の固化工程に供することにより得られる。
なお、上記形質転換植物からのラテックスの採取方法は特に制限されず、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、植物の幹を傷つけてにじみ出る乳液を回収したり（タッピング）、根など形質転換植物の一部を切断し、切断した部分からにじみ出る乳液を回収したり、切断した組織を粉砕し、有機溶媒を用いて抽出して採取したりすることができる。

＜固化工程＞
上記採取されたラテックスは、固化工程に供される。固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のトランス型ポリイソプレノイド（トランスゴム）を溶解しない溶媒にラテックスを添加する方法やラテックスに酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ラテックスからゴムを固形分として回収できる。得られたゴムは、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。

添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、上記ラテックスから得られたゴム以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。

混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。

＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、第１の本発明において上述した工程と同様である。

＜加硫工程＞
加硫工程は、第１の本発明において上述した工程と同様である。

実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

（実施例１）
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、さらに６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを沈殿させるために、−２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅの水で溶解させた。

〔Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒa）の説明書に従って行った。

〔ｃＤＮＡからｔＰＴ遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にｔＰＴ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ｔＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１：５’− ｃｔｇｔａｔｔｔｔｃａｇｇｇｃｇｇａｔａｔｇｔｔｔｃｔｔｃｇａｃｃａａｇｇｃｃ−３’
プライマー２：５’− ｃａａａａｃｔａｇｔｇｃｇｇｃｃｇｃｇｃｔａａｔｃａａｔｃｃｇｔｔｃｇａｇａｔｔｇ−３’
を使用した。

上述の方法により、ｔＰＴ遺伝子（ＨｂＳＤＳ）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を単離し、全長の塩基配列を同定した。ＨｂＳＤＳの塩基配列を配列番号１に示した。また、塩基配列から推定されるＨｂＳＤＳのアミノ酸配列を配列番号２に示した。

〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ−ＨｂＳＤＳを作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。

〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）を使用した。
回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。

〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ−ＨｂＳＤＳを制限酵素ＢｓｔＺ Ｉで処理したのち、ＨｂＳＤＳ断片を回収した。それをＥｃｏＲ ＩとＫｐｎ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２と混合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ相同組換え反応により連結することで、ｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＨｂＳＤＳを作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。

〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）を使用した。

〔ゴム粒子の調製〕
ゴム粒子は、５段階の遠心分離によってＨｅｖｅａラテックスから調製した。Ｈｅｖｅａラテックス９００ｍＬに、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、１０００×ｇ、２０００×ｇ、８０００×ｇ、２００００×ｇ、５００００×ｇの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも４℃、４５分で行った。５００００×ｇでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、３−[（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）を終濃度０．１〜２．０×ＣＭＣ（臨界ミセル濃度ＣＭＣの０．１〜２．０倍）になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。

〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
透析カップ（ＭＷＣＯ １２０００）（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｋ社製）中に、以下の量をそれぞれ添加した。ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って全量６０μＬで反応溶液を調整した。反応溶液にゴム粒子を１〜２ｍｇ添加した。さらに、ＰＰ容器Ｎｏ．２（マルエム容器）にＳＵＢ−ＡＭＩＸ ６５０μＬを添加した。
透析カップをＰＰ容器Ｎｏ．２にはめ、２６℃で蛋白合成反応を開始した。反応開始から２度のｍＲＮＡの追加と透析外液（ＳＵＢ−ＡＭＩＸ）の交換を行った。反応は２４時間行った。透析法を行っている様子の概略図を図３に示す。

〔反応後のゴム粒子の回収〕
透析カップの溶液を新しい１．５μＬチューブに移し、反応後のゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を以下の方法により測定した。
まず、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１５μＭ ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、１００μＭ １−１４Ｃイソペンテニル二リン酸（［１−１４Ｃ］ＩＰＰ）（比活性：５Ｃｉ／ｍｏｌ）、１０μＬ ゴム粒子溶液を混合した反応溶液（Ｔｏｔａｌ １００μＬ）を調製し、３０℃で１６時間反応させた。
反応後、飽和ＮａＣｌを２００μＬ加え、１ｍＬのジエチルエーテルでイソペンテノールなどを抽出した。次に、水相のポリプレニル二リン酸を１ｍＬの食塩水飽和ＢｕＯＨで抽出し、その後さらに、水相の超長鎖ポリイソプレノイド（トランス−１，４−ポリイソプレン）を１ｍＬのトルエン／ヘキサン（１：１）で抽出し、放射活性を計測した。各層の放射活性は液体シンチレーションカウンターで１４Ｃのカウントを計測した。放射活性（ｄｐｍ）が高いほど、超長鎖ポリイソプレノイド（トランス−１，４−ポリイソプレン）が多く生産されており、ゴム合成活性が高いことを示す。
結果を表１に示す。なお、表１には、後述するゴム粒子に何も結合させない形態である比較例１における放射活性からの差分を「ゴム合成活性差（ｄｐｍ）」として示している。

〔合成した超長鎖ポリイソプレノイドの分子量分布測定〕
上記合成した超長鎖ポリイソプレノイド（トランス−１，４−ポリイソプレン）の分子量分布を下記の条件でＲａｄｉｏ ＨＰＬＣにより測定した。結果を図４に示す。
ＨＰＬＣシステム：ＧＩＬＳＯＮ社製
カラム：ＴＯＳＯＨ社製のＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＭＰ（ＸＬ），ＴＳＫｇｅｌ Ｍｕｌｔｉｐｏｒｅ ＨＸＬ−Ｍ（２本）
カラム温度：４０℃
溶媒：Ｍｅｒｃｋ社製のＴＨＦ
流速：１ｍｌ／分
ＵＶ検出：２１５ｎｍ
ＲＩ検出：Ｒａｍｏｎａ Ｓｔａｒ（Ｒａｙｔｅｓｔ ＧｍｂＨ）

（比較例１）
〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。

〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。

〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
結果を表１に示す。

（比較例２）
〔ｃＤＮＡからＣＰＴ遺伝子の取得〕
実施例１の〔Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕で作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にＣＰＴ遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＣＰＴ遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー３：５’− ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ−３’
プライマー４：５’− ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ−３’
を使用した。

上述の方法により、ＣＰＴ遺伝子（ＨＲＴ１）が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。ＨＲＴ１の塩基配列を配列番号１８に示した。ＨＲＴ１のアミノ酸配列を配列番号１９に示した。

〔ベクターの構築〕
上記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ−ＨＲＴ１を作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。

〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。

〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したｐＧＥＭ−ＨＲＴ１を制限酵素Ｂａｍ ＨＩとＮｏｔ Ｉで処理したのち、同様にＢａｍ ＨＩとＮｏｔ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ−Ｅ０１−Ｈｉｓ−ＴＥＶ−ＭＣＳ−Ｎ２に挿入し、ｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＨＲＴ１を作製した。

〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて、実施例１と同様にして行った。

〔プラスミドの抽出〕
実施例１と同様にして行った。

〔ゴム粒子の調製〕
実施例１と同様にして行った。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターｐＥＵ−Ｈｉｓ−Ｎ２−ＨＲＴ１を鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。

〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。

〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
上記ｍＲＮＡを用いた以外は、実施例１と同様にして行った。

〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例１と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。

〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例１と同様にして測定した。
結果を表１に示す。

〔合成した超長鎖ポリイソプレノイドの分子量分布測定〕
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイドの分子量分布を、実施例１と同様にして測定した。結果を図４に示す。

表１より、ｔＰＴファミリー蛋白質をゴム粒子に結合させることにより（実施例１）、ゴム粒子に何も結合させなかった場合（比較例１）に比べて、ゴム粒子にシス型プレニルトランスフェラーゼファミリー蛋白質であるＨＲＴ１を結合させた場合（比較例２）と同様、超長鎖ポリイソプレノイドを合成できることが確認できた。

また、図４より、実施例１において合成される超長鎖ポリイソプレノイドは、重量平均分子量１００万程度のＧＰＣ溶出時間のところにピークトップを有する長鎖のゴムであることが分かる。また、比較例２において合成される超長鎖ポリイソプレノイドと分子量分布パターンとして同等といえる超長鎖ポリイソプレノイドが実施例１において合成されているといえる。なお、図４の結果は、サンプル間で規格化されていないため、ピークの高さで活性を比較することはできないものである。

＜ｉｎ ｓｉｌｉｃｏによるｔＰＴファミリー蛋白質の保存領域の推定＞
図５で示される種々の生物由来のｔＰＴファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行い、保存性の高い配列部分（保存領域）を検索した。保存領域周辺のアライメントの結果を図５に示す。
なお、マルチプルシーケンスアライメントは、Ｇｅｎｅｔｙｘ Ｖｅｒ．１１と呼ばれるソフトを用いて行った。

図５中、Ｅｒｇ２０ｐ（ＹｅａｓｔＴＰＴ（ＦＰＰＳ））は、配列番号３で示される酵母由来のＦＰＰＳの９１位から１５０位、及び、２２７位から２８５位を抜粋したものである。
ＥｕＦＰＰＳ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ ＴＰＴ）は、配列番号４で示されるトチュウ由来のＥｕＦＰＰＳの９０位から１４９位、及び、２２５位から２８３位を抜粋したものである。
ＨｂＦＰＰＳ（ＨｅｖｅａＴＰＴ）は、配列番号５で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＦＰＰＳの８４位から１４３位、及び、２１９位から２７７位を抜粋したものである。
Ｃｏｑ１ｐ（ＹｅａｓｔＴＰＴ）は、配列番号６で示される酵母由来のＴＰＴの８２位から１３５位、及び、２４９位から３０７位を抜粋したものである。
ＡｔＳＤＳ１（ＡｒａｂｉＴＰＴ）は、配列番号７で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＳＤＳ１の１６２位から２１５位、及び、２８５位から３４３位を抜粋したものである。
ＨｂＳＤＳ（ＨｅｖｅａＴＰＴ）は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳの１７４位から２２７位、及び、２９７位から３５５位を抜粋したものである。
ＨｓＴＰＴ（ＨｕｍａｎＴＰＴ）は、配列番号８で示されるヒト由来のＨｓＴＰＴの１３２位から１８５位、及び、２５５位から３１３位を抜粋したものである。
ＭｍＴＰＴ（ＭｏｕｓｅＴＰＴ）は、配列番号９で示されるマウス由来のＭｍＴＰＴの９２位から１４５位、及び、２１５位から２７３位を抜粋したものである。

Ａｎｄｒｅｗ Ｈ．−Ｊ． Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６９、３３３９−３３５４（２００２）等の文献から、図５中の囲みＡ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおいては、１８３位から１８７位に相当）、囲みＢ（配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおいては、３１０位から３１４位に相当）が種々の生物由来のｔＰＴファミリー蛋白質で保存性の高い保存領域の一部であり、特に、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける１８３位から１８７位に相当する位置のアミノ酸配列、及び、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける３１０位から３１４位に相当する位置のアミノ酸配列が特定のモチーフ（上記アミノ酸配列（Ａ１）又は（Ａ２）、（Ｂ））として保存されており、当該位置にこれらのモチーフを有する蛋白質であればｔＰＴファミリー蛋白質としての機能を有すると考えられる。

図５から、以下のことが分かる。
配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおいて１８３位から１８７位に相当する囲みＡの保存領域は、配列番号３で示される酵母由来のＦＰＰＳでは１００位から１０４位に相当し、
配列番号４で示されるトチュウ由来のＥｕＦＰＰＳでは９９位から１０３位に相当し、
配列番号５で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＦＰＰＳでは９３位から９７位に相当し、
配列番号６で示される酵母由来のＴＰＴでは９１位から９５位に相当し、
配列番号７で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＳＤＳ１では１７１位から１７５位に相当し、
配列番号８で示されるヒト由来のＨｓＴＰＴでは１４１位から１４５位に相当し、
配列番号９で示されるマウス由来のＭｍＴＰＴでは１０１位から１０５位に相当する。

配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおいて３１０位から３１４位に相当する囲みＢの保存領域は、配列番号３で示される酵母由来のＦＰＰＳでは２４０位から２４４位に相当し、
配列番号４で示されるトチュウ由来のＥｕＦＰＰＳでは２３８位から２４２位に相当し、
配列番号５で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＦＰＰＳでは２３２位から２３６位に相当し、
配列番号６で示される酵母由来のＴＰＴでは２６２位から２６６位に相当し、
配列番号７で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＳＤＳ１では２９８位から３０２位に相当し、
配列番号８で示されるヒト由来のＨｓＴＰＴでは２６８位から２７２位に相当し、
配列番号９で示されるマウス由来のＭｍＴＰＴでは２２８位から２３２位に相当する。

（配列表フリーテキスト）
配列番号１：パラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳのアミノ酸配列
配列番号３：酵母由来のＦＰＰＳのアミノ酸配列
配列番号４：トチュウ由来のＥｕＦＰＰＳのアミノ酸配列
配列番号５：パラゴムノキ由来のＨｂＦＰＰＳのアミノ酸配列
配列番号６：酵母由来のＴＰＴのアミノ酸配列
配列番号７：シロイヌナズナ由来のＡｔＳＤＳ１のアミノ酸配列
配列番号８：ヒト由来のＨｓＴＰＴのアミノ酸配列
配列番号９：マウス由来のＭｍＴＰＴのアミノ酸配列
配列番号１０：パラゴムノキ由来のＲｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号１１：パラゴムノキ由来のＳｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ ＰａｒｔｉｃｌｅＰｒｏｔｅｉｎをコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号１２：パラゴムノキ由来のＨｅｖｉｅｎ２．１をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号１３：パラゴムノキ由来のＭＹＣ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒをコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号１４：プライマー１
配列番号１５：プライマー２
配列番号１６：プライマー３
配列番号１７：プライマー４
配列番号１８：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１９：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列

Claims (10)

1. 生体外で、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含み、
   前記結合工程が、トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に、ｔＰＴファミリー蛋白質を結合させる工程であるトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
2. 前記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質は、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける１８３位から１８７位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ａ１）：
   ＤＤＸ_１Ｘ_２Ｄ （Ａ１）
   （上記アミノ酸配列（Ａ１）中、Ｘ_１及びＸ_２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）、又は、以下のアミノ酸配列（Ａ２）：
   ＤＤＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｄ （Ａ２）
   （上記アミノ酸配列（Ａ２）中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、及びＸ_４は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）であり、かつ、配列番号２で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＳＤＳにおける３１０位から３１４位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列（Ｂ）：
   ＤＤＸ_１１Ｘ_１２Ｄ （Ｂ）
   （上記アミノ酸配列（Ｂ）中、Ｘ_１１及びＸ_１２は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。）である請求項１記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
3. 前記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、植物由来である請求項１又は２記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
4. 前記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、ゴム産生植物由来である請求項３記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
5. 前記トランス型プレニルトランスフェラーゼ（ｔＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が、パラゴムノキ由来である請求項４記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
6. 前記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含む請求項１〜５のいずれかに記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
7. 前記胚芽抽出物が、小麦由来である請求項６記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
8. 前記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が、５〜５０ｇ／Ｌである請求項１〜７のいずれかに記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法。
9. 請求項１〜８のいずれかに記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により、トランス型ポリイソプレノイドを製造する工程と、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
10. 請求項１〜８のいずれかに記載のトランス型ポリイソプレノイドの製造方法により、トランス型ポリイソプレノイドを製造する工程と、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。

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