JP6778372B2 - ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 - Google Patents
ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6778372B2 JP6778372B2 JP2016563140A JP2016563140A JP6778372B2 JP 6778372 B2 JP6778372 B2 JP 6778372B2 JP 2016563140 A JP2016563140 A JP 2016563140A JP 2016563140 A JP2016563140 A JP 2016563140A JP 6778372 B2 JP6778372 B2 JP 6778372B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rubber
- derived
- seq
- protein
- family protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
- C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B60—VEHICLES IN GENERAL
- B60C—VEHICLE TYRES; TYRE INFLATION; TYRE CHANGING; CONNECTING VALVES TO INFLATABLE ELASTIC BODIES IN GENERAL; DEVICES OR ARRANGEMENTS RELATED TO TYRES
- B60C1/00—Tyres characterised by the chemical composition or the physical arrangement or mixture of the composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F136/00—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, at least one having two or more carbon-to-carbon double bonds
- C08F136/02—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, at least one having two or more carbon-to-carbon double bonds the radical having only two carbon-to-carbon double bonds
- C08F136/04—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, at least one having two or more carbon-to-carbon double bonds the radical having only two carbon-to-carbon double bonds conjugated
- C08F136/08—Isoprene
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
- C08L47/00—Compositions of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, at least one having two or more carbon-to-carbon double bonds; Compositions of derivatives of such polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F2810/00—Chemical modification of a polymer
- C08F2810/20—Chemical modification of a polymer leading to a crosslinking, either explicitly or inherently
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
- C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
Description
他方、ヒトCPTにおけるドリコール生合成において、Nogo−B receptor(NgBR)が関与していることが示唆されている(例えば、非特許文献6参照。)。
DGNX1RX2AKK (A)
(上記アミノ酸配列(A)中、X1及びX2は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。)、又は、該アミノ酸配列(A)と、X1及びX2を除く7アミノ酸残基のうちの5アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列であることが好ましい。
TX11X12AFSX13X14NX15X16RX17X18X19EV (B)
(上記アミノ酸配列(B)中、X11〜X19は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。)、又は、該アミノ酸配列(B)と、X11〜X19を除く8アミノ酸残基のうちの5アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列であることが好ましい。
(第1の本発明)
第1の本発明のポリイソプレノイドの製造方法は、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びNogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含む。
本発明者らは、生体外で、ゴム粒子にCPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子のゴム合成が活性化することを初めて見出した。なお、CPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質の組み合わせが直接的にゴム合成に関与していることは本発明者らが今回初めて見出したことである。CPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質は、図1に示すようにゴム粒子上に配置され、ゴム合成を行っているものと推測される。図1には、一例として、CPTファミリー蛋白質としてCPTが、NgBRファミリー蛋白質としてNgBRが描かれており、基質のイソペンテニル二リン酸(IPP)がCPTにより重合され、ゴム粒子中に天然ゴムが合成される様子が模式的に示されている。
したがって、第1の本発明の製造方法のように、生体外で(例えば、反応槽(試験管、プラントなど)内で)、ゴム粒子にCPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質を結合させることで、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、より効率的に反応槽(試験管、プラントなど)内でゴムを生産することができる。
なお、第1の本発明の製造方法は、上記結合工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、また、各工程は1回行われてもよいし、複数回繰り返し行われてもよい。
また、第1の本発明において、ゴム粒子に結合するCPTファミリー蛋白質、NgBRファミリー蛋白質の量は特に限定されない。
なお、上記マルチプルシーケンスアライメントは、後述の実施例の方法により実施できる。
DGNX1RX2AKK (A)
(上記アミノ酸配列(A)中、X1及びX2は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。)、又は、該アミノ酸配列(A)と、X1及びX2を除く7アミノ酸残基のうちの5アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列であることがより好ましい。更に好ましくは、上記アミノ酸配列(A)中、X1がH、GもしくはRを表し、また、X2がW、F、もしくはYを表すことである。
TX11X12AFSX13X14NX15X16RX17X18X19EV (B)
(上記アミノ酸配列(B)中、X11〜X19は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。)、又は、該アミノ酸配列(B)と、X11〜X19を除く8アミノ酸残基のうちの5アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列であることがより好ましい。
更に好ましくは、上記アミノ酸配列(B)中、X11がL、V、A、もしくはIを表し、また、X12がY、F、もしくはHを表し、また、X13がS、T、I、M、もしくはLを表し、また、X14がE、D、もしくはHを表し、また、X15がWもしくはFを表し、また、X16がN、S、K、G、もしくはRを表し、また、X17がP、S、H、G、R、K、もしくはQを表し、また、X18がA、K、S、もしくはPを表し、また、X19がQ、D、R、I、E、H、もしくはSを表すことである。
すなわち、CPTファミリー蛋白質をコードする遺伝子がゴムを産生する植物由来であるか、それ以外の生物由来であるか、または、自然状態でゴム合成に関与しているかなどに関わらず、本発明においては、CPTファミリー蛋白質でありさえすれば、ゴム粒子のゴム合成能力を増強させることができ、ゴム粒子中に天然ゴムを合成することができる。これは驚くべきことであるが、本発明者らは、CPTファミリー蛋白質の由来や種類よりも、どのような宿主に導入したのか、すなわち、CPTファミリー蛋白質をどのような環境下に発現させたのかが、ゴム合成活性においては重要である、と考えている。
すなわち、CPTファミリー蛋白質が合成する生成物が蓄積される場の、疎水度及びスペース(空間的広さ)が、合成される生成物の鎖長を決定している、と考えている。
[1]配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[3]配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[11]配列番号32、36、41、22、14、43、47、又は50で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[12]配列番号32、36、41、22、14、43、47、又は50で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
[4]配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[5]配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む配列からなり、かつN末端側に有する1つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、C末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
[6]配列番号4で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつN末端側に有する1つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、C末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
[14]配列番号24、又は16で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[15]配列番号24、又は16で表されるアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつN末端側に有する1つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、C末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質
[1]配列番号1で表される塩基配列からなるDNA
[2]配列番号1で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[11]配列番号31、35、40、21、13、42、63、又は64で表される塩基配列からなるDNA
[12]配列番号31、35、40、21、13、42、63、又は64で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をcis型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするDNA
[3]配列番号3で表される塩基配列からなるDNA
[4]配列番号3で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつN末端側に有する1つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、C末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質をコードするDNA
[13]配列番号23、又は15で表される塩基配列からなるDNA
[14]配列番号23、又は15で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつN末端側に有する1つ又は複数の膜貫通領域で膜に結合し、C末端側で他の蛋白質と相互作用する機能を有する蛋白質をコードするDNA
なお、縮重プライマーは、上記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、上記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したcDNAを鋳型にしてRT−PCRを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
すなわち、CPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて(より具体的には、CPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを混合して)蛋白質合成を行うことで、CPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質の結合したゴム粒子を得ることが好ましい。
なお、リポソームはリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から構成される脂質二重膜として人工的に製造されるため、製造されたリポソームの表面には蛋白質は結合していないのに対して、ゴム産生植物のラテックスから採取されるゴム粒子も脂質膜で覆われた粒子であるが、その膜は天然由来の膜であるため、その表面には植物体内で合成された蛋白質が既に結合している。このことから、蛋白質が結合していないリポソームなどに比べて、既に蛋白質が結合しており、蛋白質で覆われた状態にあるゴム粒子に更に蛋白質を結合させるのは困難であることが予想される。また、ゴム粒子に既に結合している蛋白質が無細胞蛋白合成を阻害することも懸念される。以上のような点から、ゴム粒子共存下での無細胞蛋白合成は実現が困難であると考えられてきた。このような状況下、本発明者らは、これまでに試みられていなかった、CPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質の無細胞蛋白合成をゴム粒子の共存下で行ったところ、CPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質の結合したゴム粒子を製造することができることを見出した。
上記CPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質をコードするmRNAの由来は特に制限されず、微生物由来であっても、動物由来であっても、植物由来であってもよいが、植物由来であることが好ましく、上述した植物由来であることがより好ましく、Hevea属、Sonchus属、Taraxacum属、及びParthenium属からなる群より選択される少なくとも1種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも1種の植物由来であることが特に好ましく、最も好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。また、上記CPTファミリー蛋白質をコードするmRNA、及び、NgBRファミリー蛋白質をコードするmRNAの由来が同じ種であることも好適な形態の1つである。
上記その他の蛋白質をコードするmRNAとしては、翻訳されてその他の蛋白質を発現することができるものを用いることができる。なお、その他の蛋白質としては、上述したものと同様のものを挙げることができる。
なお、上記特開2005−218357号公報に記載された方法で調製された胚芽抽出物には蛋白質合成反応に必要とされる量のtRNAが含まれているため、当該方法により調製された胚芽抽出物を無細胞蛋白合成溶液に用いる場合には、別途調製したtRNAを追加することは必須要件ではない。すなわち、無細胞蛋白合成溶液には、必要に応じてtRNAを追加すればよい。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、5〜50g/Lであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液1Lに対してゴム粒子を5〜50g共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が5g/L未満であると、合成されたCPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成されたCPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が50g/Lを超えると、ゴム粒子同士が凝集し、合成されたCPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質がうまくゴム粒子に結合できなくなるおそれがある。上記ゴム粒子の濃度としてより好ましくは10〜40g/L、更に好ましくは15〜35g/L、特に好ましくは15〜30g/Lである。
これら界面活性剤は、単独で用いてもよいし、2種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤、多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が好ましい。
上記多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、炭素数2〜12の多価アルコールの脂肪酸エステル又はポリオキシアルキレン多価アルコールの脂肪酸エステル等が挙げられる。より具体的には、例えば、ソルビトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル等が挙げられる。また、これらのポリアルキレンオキサイド付加物(例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル等)も使用可能である。これらの中でも、ソルビタン脂肪酸エステルが好適に使用される。
上記糖脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ショ糖、グルコース、マルトース、フルクトース、多糖類の脂肪酸エステル等が挙げられ、これらのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
上記アルキルポリグリコシド系の非イオン性界面活性剤としては、グリコシドとしてグルコース、マルトース、フルクトース、ショ糖などが挙げられ、例えば、アルキルグルコシド、アルキルポリグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルポリグルコシドなどが挙げられ、これらの脂肪酸エステル類も挙げられる。また、これらすべてのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
特に、前記の両性イオン界面活性剤が一分子中に+と−の両電荷を有することが好ましく、前記の酸基の酸解離定数(pKa)が、5以下であることが好ましく、4以下であることがより好ましく、3以下であることが更に好ましい。
なお、上記mRNAの添加時間、添加回数、添加量等は特に制限されず、適宜設定することができる。
また、遠心分離処理温度としては、ゴム粒子に結合したCPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質のタンパク活性を維持するという観点から、0〜10℃が好ましく、2〜8℃がより好ましく、4℃が特に好ましい。
すなわち、ポリイソプレノイドを合成する方法であって、該方法は、生体外(例えば、反応槽(試験管、プラントなど)内)で、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びNogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質を、ゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドを合成する方法もまた、第1の本発明の1つである。
なお、生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びNogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質を、ゴム粒子に結合させる結合工程については、上述したとおりである。
第1の本発明のゴム製品の製造方法は、上記第1の本発明のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
混練工程では、上記ポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品(タイヤの場合は生タイヤ)を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ(未加硫タイヤ)を成形すればよい。
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ(未加硫タイヤ)を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。
(ベクター)
第2の本発明のベクターは、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、Nogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、又は、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びNogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターである。このようなベクターを植物に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれる、ポリイソプレノイド生合成に関わる蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物におけるシス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドの生産量を向上させることが可能となる。これは、乳液の生産性向上のために導入した外来遺伝子の発現が乳管以外の部位で促進されると、植物体の代謝や乳液の生産に負荷がかかり、悪影響を及ぼすためと推測される。
Small Rubber Particle Protein(SRPP)は、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)等のゴム産生植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことである。
Hevein2.1(HEV2.1)は、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)等のゴム産生植物の乳管細胞に多く発現している蛋白質のことであり、ゴム粒子の凝集に関与し、抗真菌活性を有するものである。
また、MYC1 transcription factor(MYC1)は、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)等のゴム産生植物のラテックスで多く発現している、ジャスモン酸シグナルに関わる転写因子のことである。ここで、transcription factor(転写因子)とは、遺伝子の転写量を増加若しくは減少(好ましくは増加)させる活性を有する蛋白質を意味する。すなわち、本明細書において、MYC1は、ジャスモン酸シグナルに関わる蛋白質のうち少なくとも1種の蛋白質をコードする遺伝子の転写量を増加若しくは減少(好ましくは増加)させる活性(転写因子活性)を有する蛋白質のことである。
上記REFをコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Hevea属、Sonchus属、Taraxacum属、及びParthenium属からなる群より選択される少なくとも1種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも1種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
[A1]配列番号9で表される塩基配列からなるDNA
[A2]配列番号9で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
[A3]配列番号9で表される塩基配列と60%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
上記SRPPをコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Hevea属、Sonchus属、Taraxacum属、及びParthenium属からなる群より選択される少なくとも1種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも1種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
[B1]配列番号10で表される塩基配列からなるDNA
[B2]配列番号10で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
[B3]配列番号10で表される塩基配列と60%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
上記HEV2.1をコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Hevea属、Sonchus属、Taraxacum属、及びParthenium属からなる群より選択される少なくとも1種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも1種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
[C1]配列番号11で表される塩基配列からなるDNA
[C2]配列番号11で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
[C3]配列番号11で表される塩基配列と60%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
上記MYC1をコードする遺伝子のプロモーターは、その由来は特に制限されないが、上述した植物由来であることが好ましく、Hevea属、Sonchus属、Taraxacum属、及びParthenium属からなる群より選択される少なくとも1種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも1種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
[D1]配列番号12で表される塩基配列からなるDNA
[D2]配列番号12で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
[D3]配列番号12で表される塩基配列と60%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するDNA
したがって、上記形質転換植物を、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、Nogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターを植物に導入することにより作出する場合には、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターを併用することが好ましい。これにより、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びNogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターを植物に導入することで得られる形質転換植物、及び、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、Nogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターと、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターとを植物に導入することで得られる形質転換植物いずれにおいても、CPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質が共発現することとなるため、CPTファミリー蛋白質の活性が安定化、増強されると予想される。その結果、CPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質を共発現させた形質転換植物は、ゴム合成活性が継続的に増強し、該形質転換植物を用いて、ポリイソプレノイドの製造を行うことで、ポリイソプレノイドの製造量をより好適に増大できるものと期待される。
なお、上記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターに、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を機能的に連結させた塩基配列を含むベクターとは、上記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターの制御を受けるように、当該プロモーターの下流に上記シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を連結したものを意味し、第2の本発明のベクターと同様の方法で得られる。
なお更には、第2の本発明のベクターを、上記DNAを導入する方法などにより、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、生物体、生物体の一部、器官、組織や培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストなどに導入することによって、シス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドを生産することも可能である。
第2の本発明のゴム製品の製造方法は、上記第2の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
混練工程では、上記第2の本発明のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。
なお、上記形質転換植物からのラテックスの採取方法は特に制限されず、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、植物の幹を傷つけてにじみ出る乳液を回収したり(タッピング)、根など形質転換植物の一部を切断し、切断した部分からにじみ出る乳液を回収したり、切断した組織を粉砕し、有機溶媒を用いて抽出して採取したりすることができる。
上記採取されたラテックスは、固化工程に供される。固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイド(天然ゴム)を溶解しない溶媒にラテックスを添加する方法やラテックスに酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ラテックスからゴム(天然ゴム)を固形分として回収できる。得られたゴム(天然ゴム)は、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
生ゴム製品成形工程では、第1の本発明において上述した工程と同様である。
加硫工程は、第1の本発明において上述した工程と同様である。
〔HeveaラテックスからのTotal RNA抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Total RNAを抽出した。ラテックス6mLに100mM酢酸ナトリウム緩衝液6mL、10%SDS溶液1mLを添加し、さらに65℃で予温しておいた水飽和フェノールを12mL添加した。65℃で5分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、7000rpmで10分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール:クロロホルム(1:1)溶液12mLを添加し、2分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、7000rpmで10分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)溶液12mLを添加し、2分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、7000rpmで10分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、3M酢酸ナトリウム溶液1.2mLとイソプロパノール13mLを添加し、ボルテックスで撹拌した。Total RNAを沈殿させるために、−20℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、4℃、15000rpmで10分間遠心し、上清を取除くことでTotal RNAの沈殿を回収した。回収したTotal RNAは70%エタノールで2度洗浄したのち、RNase freeの水で溶解させた。
回収したTotal RNAをもとに、cDNAを合成した。cDNAの合成はPrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara)の説明書に従って行った。
作製した1st strand cDNAを鋳型にCPT、及びNgBR遺伝子の取得を行った。PCRはKOD−plus−Neo(TOYOBO社製)を使用し、説明書に従って行った。PCRは、98℃で10秒、58℃で30秒、68℃で1分を1サイクルとして、35サイクル行った。
CPT遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー1:5’− tttggatccgatggaattatacaacggtgagagg−3’
プライマー2:5’− tttgcggccgcttattttaagtattccttatgtttctcc−3’
を使用した。
NgBR遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー3:5’− tttctcgagatggatttgaaacctggagctg −3’
プライマー4:5’− tttctcgagtcatgtaccataattttgctgcac −3’
を使用した。
上記取得したDNA断片にdA付加を行った後、pGEM−T Easy Vector System(Promega)を利用してpGEM−T Easy Vectorに挿入し、pGEM−HRT1、及びpGEM−HRTBPを作製した。
上記作製したVectorを用いて大腸菌DH5αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとX−galを含むLB寒天培地上で培養し、青/白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、LB液体培地上で37℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はFast Geneプラスミドミニキット(日本ジェネティクス社製)を使用した。
回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpGEM−HRT1を制限酵素Bam HIとNot Iで処理したのち、同様にBam HIとNot Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−His−TEV−MCS―N2に挿入し、pEU−His−N2−HRT1を作製した。
同様に、pGEM−HRTBPを制限酵素Xho Iで処理したのち、同様にXho Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−MCS−TEV−His−C1に挿入し、pEU−C1−HRTBPを作製した。
上記作製したVectorを用いて大腸菌DH5αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとX−galを含むLB寒天培地上で培養し、コロニーPCRによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、LB液体培地上で37℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はFast Geneプラスミドミニキット(日本ジェネティクス社製)を使用した。
ゴム粒子は、5段階の遠心分離によってHeveaラテックスから調製した。Heveaラテックス900mLに、20mMのジチオスレイトール(DTT)を含む1M Tris緩衝液(pH7.5)100mLを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、1000×g、2000×g、8000×g、20000×g、50000×gの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも4℃、45分で行った。50000×gでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアミノ]−プロパンスルホン酸(CHAPS)を終濃度0.1〜2.0×CMC(臨界ミセル濃度CMCの0.1〜2.0倍)になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離(40000×g、4℃、45分)によって回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
透析カップ(MWCO 12000)(Bio−Teck社製)中に、以下の量をそれぞれ添加した。WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って全量60μLで反応溶液を調整した。反応溶液にゴム粒子を1〜2mg添加した。さらに、PP容器No.2(マルエム容器)にSUB−AMIX 650μLを添加した。
透析カップをPP容器No.2にはめ、26℃で蛋白合成反応を開始した。反応開始から2度のmRNAの追加と透析外液(SUB−AMIX)の交換を行った。反応は24時間行った。透析法を行っている様子の概略図を図3に示す。
透析カップの溶液を新しい1.5μLチューブに移し、反応後のゴム粒子を超遠心分離(40000×g、4℃、45分)によって回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を以下の方法により測定した。
まず、50mM Tris−HCl(pH7.5)、2mM DTT、5mM MgCl2、15μM ファルネシル二リン酸(FPP)、100μM 1−14Cイソペンテニル二リン酸([1−14C]IPP)(比活性:5Ci/mol)、10μL ゴム粒子溶液を混合した反応溶液(Total 100μL)を調製し、30℃で16時間反応させた。
反応後、飽和NaClを200μL加え、1mLのジエチルエーテルでイソペンテノールなどを抽出した。次に、水相のポリプレニル二リン酸を1mLの食塩水飽和BuOHで抽出し、その後さらに、水相の超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)を1mLのトルエン/ヘキサン(1:1)で抽出し、放射活性を計測した。各層の放射活性は液体シンチレーションカウンターで14Cのカウントを計測した。放射活性(dpm)が高いほど、天然ゴムが多く生産されており、ゴム合成活性が高いことを示す。
結果を表1に示す。
上記合成した超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)の分子量分布を下記の条件でRadio HPLCにより測定した。結果を図4の(a)に示す。
HPLCシステム:GILSON社製
カラム:TOSOH社製のTSKguardcolumn MP(XL),TSKgel Multipore HXL−M(2本)
カラム温度:40℃
溶媒:Merck社製のTHF
流速:1ml/分
UV検出:215nm
RI検出:Ramona Star(Raytest GmbH)
〔ゴム粒子の調製〕
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。無細胞発現用ベクターpEU−E01−His−TEV−MCS−N2を鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。
結果を表1に示す。
無細胞蛋白合成において、実施例1の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したpEU−C1−HRTBPを鋳型に用いた以外は実施例1と同様にして行い、回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。
結果を表1に示す。
〔レタス(Lactuca sativa)CPT、及びNgBR遺伝子の合成〕
レタス(Lactuca sativa)CPT遺伝子(LsCPT3)、及びNgBR遺伝子(LsCPTL2)はBLASTに公開されている情報をもとに、開始コドンから終始コドンまでの領域をジェンスクリプトジャパン株式会社の遺伝子合成サービスをもとに合成して作成した。後述する無細胞蛋白合成法用ベクターにクローニングするため、LsCPT3の5′末端側にはXho Iサイトを3′末端側にはKpn Iサイトを付加し、また、LsCPTL2の5′末端側にはEcoRVサイトを3′末端側にはXho Iサイトを付加した。
上記取得したDNA断片は、pUC57に挿入し、pUC57−LsCPT3及びpUC57−LsCPTL2を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpUC57−LsCPT3を制限酵素Xho IとKpn Iで処理したのち、同様にXho IとKpn Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−His−TEV−MCS―N2に挿入し、pEU−His−N2−LsCPT3を作製した。
同様に、pUC57−LsCPTL2を制限酵素EcoRVとXho Iで処理したのち、同様にEcoRVとXho Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−MCS−TEV−His−C1に挿入し、pEU−C1−LsCPTL2を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。結果を表1に示す。
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)の分子量分布を、実施例1と同様にして測定した。結果を図4の(a)に示す。
〔シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)からのTotal RNA抽出〕
シロイヌナズナからホットフェノール法により、Total RNAを抽出した。実生を液体窒素で凍結後、乳鉢で破砕した後、80℃の水飽和フェノール、80℃のRNA抽出バッファー(100mM LiCl、100mM Tris−HCl(pH8.0)、10mM EDTA、1%SDS)をそれぞれ400μLずつ加え30秒間ボルテックスした。さらにクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を400μL加え30秒間ボルテックスした。4℃、15,000rpmで15分間遠心分離し、上層を回収した。4M LiClを500μL加え混合し、−80℃で1時間静置した。4℃、15,000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を400μLのDEPC処理水に溶解した。エタノールを880μL、3M NaOAcを40μL加え混合した。4℃、15,000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を300μLの70%エタノールで洗浄した。4℃、15,000rpmで5分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を30μLのDEPC処理水に溶解した。抽出したTotal RNAから混入したゲノムDNAを除去するため、DNase処理を行った。DNase処理にはDNase I(TaKaRa社製)もしくはDNase I recombinant,RNase−free(Roche社製)を使用した。いずれの場合もメーカー推奨の条件に従い50μLの反応溶液を調製し、37℃で30分間インキュベートした。反応後にDEPC処理水を350μLとフェノールを400μL加え混合し、室温、15,000rpmで15分間遠心分離した。上層を回収し、エタノールを880μL、3M NaOAcを40μL加え混合した。4℃、15,000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を300μLの70%エタノールで洗浄した。4℃、15,000rpmで遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を50μLのDEPC処理水に溶解した。
実施例1と同様にして行った。
作製した1st strand cDNAを鋳型にCPT、及びNgBR遺伝子の取得を行った。PCRはKOD−plus−Neo(TOYOBO社製)を使用し、説明書に従って行った。PCRは、98℃で10秒、55〜60℃で15秒、68℃で30秒を1サイクルとして、35サイクル行った。
CPT遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー5:5’− ctaggatccgagatgaataccctagaag −3’
プライマー6:5’− aacggatccaactatctaatcgagc −3’
NgBR遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー7:5’− cgggatccatggattcgaatcaatcgatgcggctcctc −3’
プライマー8:5’− gcggatccaattgggaacagtagtggctgcactgactc −3’
を使用した。
上述の方法により、CPT遺伝子(AtCPT8)、及びNgBR遺伝子(AtLEW1)が得られた。得られた遺伝子について、制限酵素BamH Iで処理したのち、同様にBamH Iで制限酵素処理したpBluescript IISK(−)に挿入し、pBS−AtCPT8及びpBS−AtLEW1を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
CPT遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー23:5’− tatcccgggatgaatacc −3’
プライマー24:5’− tgaactagtctaatcgagctttttc −3’
を使用した。
NgBR遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー25:5’− acccgggatggattcg −3’
プライマー26:5’− cgcggactagtttaagttccatag −3’
を使用した。
上述の方法により得られた遺伝子について、制限酵素Xma IとSpe Iで処理したのち、同様にXma IとSpe Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−His−TEV−MCS―N2に挿入し、pEU−His−N2−AtCPT8、pEU−His−N2−AtLEW1を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。結果を表1に示す。
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)の分子量分布を、実施例1と同様にして測定した。結果を図4の(a)に示す。
〔cDNAからREF遺伝子の取得〕
実施例1の〔Total RNAからcDNAの合成〕で作製した1st strand cDNAを鋳型にREF遺伝子の取得を行った。PCRはKOD−plus−Neo(TOYOBO社製)を使用し、説明書に従って行った。PCRは、98℃で10秒、58℃で30秒、68℃で1分を1サイクルとして、35サイクル行った。
REF遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー9:5’− tttctcgagatggctgaagacgaagac −3’
プライマー10:5’− tttggatcctcaattctctccataaaac −3’
を使用した。
上記取得したDNA断片にdA付加を行った後、pGEM−T Easy Vector System(Promega)を利用してpGEM−T Easy Vectorに挿入し、pGEM−REFを作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpGEM−REFを制限酵素Xho IとBam HIで処理したのち、同様にXho IとBam HIで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−MCS−TEV−His−C1に挿入し、pEU−C1−REFを作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−C1−REF、並びに、実施例1の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−His−N2−HRT1及びpEU−C1−HRTBPを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
〔cDNAからCPT遺伝子の取得〕
実施例1の〔Total RNAからcDNAの合成〕で作製した1st strand cDNAを鋳型にCPT遺伝子の取得を行った。PCRはKOD−plus−Neo(TOYOBO社製)を使用し、説明書に従って行った。PCRは、98℃で10秒、58℃で30秒、68℃で1分を1サイクルとして、35サイクル行った。
CPT遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー11:5’− tttggatccgatggaattatacaacggtgagagg−3’
プライマー12:5’− tttgcggccgcttattttaagtattccttatgtttctcc−3’
を使用した。
上記取得したDNA断片にdA付加を行った後、pGEM−T Easy Vector System(Promega)を利用してpGEM−T Easy Vectorに挿入し、pGEM−HRT2を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpGEM−HRT2を制限酵素Bam HIとNot Iで処理したのち、同様にBam HIとNot Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−His−TEV−MCS−N2に挿入し、pEU−His−N2−HRT2を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−His−N2−HRT2、実施例1の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−C1−HRTBP、及び、実施例4の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−C1−REFを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
〔cDNAからCPT遺伝子の取得〕
実施例1の〔Total RNAからcDNAの合成〕で作製した1st strand cDNAを鋳型にCPT遺伝子の取得を行った。PCRはKOD−plus−Neo(TOYOBO社製)を使用し、説明書に従って行った。PCRは、98℃で10秒、58℃で30秒、68℃で1分を1サイクルとして、35サイクル行った。
CPT遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー13:5’− atacccgggatggaaatatatac −3’
プライマー14:5’− actcccgggttattttaaatattc −3’
を使用した。
上記取得したDNA断片にdA付加を行った後、pGEM−T Easy Vector System(Promega)を利用してpGEM−T Easy Vectorに挿入し、pGEM−CPT3を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpGEM−CPT3を制限酵素Xma Iで処理したのち、同様にXma Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−His−TEV−MCS−N2に挿入し、pEU−His−N2−CPT3を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−His−N2−CPT3、実施例1の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−C1−HRTBP、及び、実施例4の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−C1−REFを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
〔cDNAからCPT遺伝子の取得〕
実施例1の〔Total RNAからcDNAの合成〕で作製した1st strand cDNAを鋳型にCPT遺伝子の取得を行った。PCRはKOD−plus−Neo(TOYOBO社製)を使用し、説明書に従って行った。PCRは、98℃で10秒、58℃で30秒、68℃で1分を1サイクルとして、35サイクル行った。
CPT遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー15:5’− tatcccgggatggaaata −3’
プライマー16:5’− atacccgggttacaactgc −3’
を使用した。
上記取得したDNA断片にdA付加を行った後、pGEM−T Easy Vector System(Promega)を利用してpGEM−T Easy Vectorに挿入し、pGEM−CPT5を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpGEM−CPT5を制限酵素Xma Iで処理したのち、同様にXma Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−His−TEV−MCS−N2に挿入し、pEU−His−N2−CPT5を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−His−N2−CPT5、実施例1の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−C1−HRTBP、及び、実施例4の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−C1−REFを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
〔Taraxacum brevicorniculatum CPT遺伝子の合成〕
Taraxacum brevicorniculatum CPT遺伝子(TbCPT1)はBLASTに公開されている情報をもとに、開始コドンから終始コドンまでの領域をジェンスクリプトジャパン株式会社の遺伝子合成サービスをもとに合成して作成した。後述する無細胞蛋白合成法用ベクターにクローニングするため、TbCPT1の5′末端側にはXho Iサイトを3′末端側にはKpn Iサイトを付加した。
上記取得したDNA断片は、pUC57に挿入し、pUC57−TbCPT1を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpUC57−TbCPT1を制限酵素Xho IとKpn Iで処理したのち、同様にXho IとKpn Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−His−TEV−MCS―N2に挿入し、pEU−His−N2−TbCPT1を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)の分子量分布を、実施例1と同様にして測定した。結果を図4の(b)に示す。図4の(b)より、参考例1において合成される天然ゴムは、実施例1〜3において合成される天然ゴムと同程度のGPC溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。実施例5の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−His−N2−HRT2を鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)の分子量分布を、実施例1と同様にして測定した。結果を図4の(b)に示す。図4の(b)より、参考例2において合成される天然ゴムは、実施例1〜3において合成される天然ゴムと同程度のGPC溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
この結果から、更にNgBRファミリー蛋白質及びREFをゴム粒子に結合させた実施例5においても、分子量分布パターンとして同等の天然ゴムが合成されていることが強く示唆される。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。実施例6の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−His−N2−CPT3を鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)の分子量分布を、実施例1と同様にして測定した。結果を図4の(b)に示す。図4の(b)より、参考例3において合成される天然ゴムは、実施例1〜3において合成される天然ゴムと同程度のGPC溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
この結果から、更にNgBRファミリー蛋白質及びREFをゴム粒子に結合させた実施例6においても、分子量分布パターンとして同等の天然ゴムが合成されていることが強く示唆される。
〔ゴム粒子の調製〕
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。実施例7の〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターpEU−His−N2−CPT5を鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。
測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)の分子量分布を、実施例1と同様にして測定した。結果を図4の(b)に示す。図4の(b)より、参考例4において合成される天然ゴムは、実施例1〜3において合成される天然ゴムと同程度のGPC溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
この結果から、更にNgBRファミリー蛋白質及びREFをゴム粒子に結合させた実施例7においても、分子量分布パターンとして同等の天然ゴムが合成されていることが強く示唆される。
〔ヒト(Homo sapiens)CPT遺伝子の合成〕
ヒト(Homo sapiens)CPT遺伝子(HDS)はBLASTに公開されている情報をもとに、開始コドンから終始コドンまでの領域をジェンスクリプトジャパン株式会社の遺伝子合成サービスをもとに合成して作成した。後述する無細胞蛋白合成法用ベクターにクローニングするため、HDSの5′末端側にはXmaIサイトを3′末端側にはSpeIサイトを付加した。
上記取得したDNA断片は、pUC57に挿入し、pUC57−HDSを作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpUC57−HDSを制限酵素XmaIとSpeIで処理したのち、同様にXmaIとSpeIで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−His−TEV−MCS―N2に挿入し、pEU−His−N2−HDSを作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。ただし、反応時間を16時間から4時間に変更した。測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)の分子量分布を、実施例1と同様にして測定した。結果を図4の(c)に示す。図4の(c)より、参考例5において合成される天然ゴムは、実施例1〜3において合成される天然ゴムと同程度のGPC溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
〔酵母(Saccharomyces cerevisiae)CPT遺伝子の合成〕
酵母(Saccharomyces cerevisiae)CPT遺伝子(SRT1)はBLASTに公開されている情報をもとに、開始コドンから終始コドンまでの領域をジェンスクリプトジャパン株式会社の遺伝子合成サービスをもとに合成して作成した。後述する無細胞蛋白合成法用ベクターにクローニングするため、SRT1の5′末端側にはXmaIサイトを3′末端側にはSpeIサイトを付加した。
上記取得したDNA断片は、pUC57に挿入し、pUC57−SRT1を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpUC57−SRT1を制限酵素XmaIとSpeIで処理したのち、同様にXmaIとSpeIで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU−E01−His−TEV−MCS―N2に挿入し、pEU−His−N2−SRT1を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を、実施例1と同様にして測定した。ただし、反応時間を16時間から4時間に変更した。測定の結果、天然ゴムが合成されており、回収した反応後のゴム粒子がゴム合成活性を有していることが確認された。
上記〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕で合成した超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)の分子量分布を、実施例1と同様にして測定した。結果を図4の(c)に示す。図4の(c)より、参考例6において合成される天然ゴムは、実施例1〜3において合成される天然ゴムと同程度のGPC溶出時間のところにピークトップがきており、分子量分布パターンとして同等といえる天然ゴムが合成されているといえる。
(参考例7)
〔酵母発現用遺伝子の取得〕
実施例1、5で得たpGEM−HRT1、pGEM−HRT2を鋳型に以下のプライマーを用いてPCRを行い、酵母発現用ベクターpJR1133にクローニングできるよう、5′末端側、3′末端側の制限酵素を共にBam HIとした、HRT1、HRT2遺伝子を得た。
HRT1及びHRT2用のプライマーとしては、
プライマー17:5’− ttaggatccatggaattatacaacgg−3’
プライマー18:5’− aacggatccttttaagtattccttatg−3’
を使用した。
HRTBP用のプライマーとしては、
プライマー19:5’− tttctcgagatggatttgaaacctggagctg−3’
プライマー20:5’− tttctcgagtcatgtaccataattttgctgcac−3’
を使用した。
AtLEW1用のプライマーとしては、
プライマー21:5’− gtcgacatggattcgaatcaatcg −3’
プライマー22:5’− ggatccttaagttccatagttttgg −3’
を使用した。
上記取得したDNA断片にdA付加を行った後、pGEM−T Easy Vector System(Promega)を利用してpGEM−T Easy Vectorに挿入し、pGEM−HRT1(pJR1133用)、pGEM−HRT2(pJR1133用)、pGEM−AtCPT8(pJR1133用)、pGEM−HRTBP(pGK425用)、pGEM−AtLEW1(pGK425用)を作製した。
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
実施例1と同様にして行った。
上記〔ベクターの構築〕で獲得した各pGEM−CPTシリーズを制限酵素Bam HIで処理したのち、同様にBam HIで制限酵素処理した酵母発現用ベクターpJR1133に挿入し、pJR1133−HRT1、pJR1133−HRT2、pJR1133−AtCPT8を作製した。
上記作製したVectorを用いて、大腸菌DH5αを形質転換し、共にAmpを含むLB培地で培養した。
実施例1と同様にして行った。
上記で得たプラスミドを用いて、以下の組合せで酵母SNH23−7D(MAT−α rer2−2 mf−1::ADE2 mf−2::TRP1 bar1::HIS3 ade2 trp1 his3 leu2 ura3 lys2)に形質転換した。
(1)pJR1133−HRT1&pGK425−HRTBP
(2)pJR1133−HRT2&pGK425−HRTBP
(3)pJR1133−AtCPT8&pGK425−AtLEW1
形質転換した酵母はウラシル(pJR1133セレクション用)とロイシン(pGK425セレクション用)を抜いたSD寒天培地で培養し、形質転換体を得た。
上記形質転換で得られた各酵母を50mLのSC(+Lys)培地に加え、23℃、180rpmで振盪培養した。OD546=0.8に達したところで、45mLの菌液を50mLサンプリングチューブに回収した。5000×gで10分遠心後、上清を捨て、−80℃で冷凍保存した。
なお、SC(+Lys)培地の組成は以下のとおりである。
硫安:5.0g
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids:1.7g
Lysine HCl:30mg
Glucose:20g
滅菌水:1Lまで
冷凍保存していたサンプルを氷上で溶かし、100μLのZymolyase bufferに懸濁し、23℃で15分静置した。遠心して上清を除去し、Zymolyase 100Tを2mg/mLで加えたZymolyase bufferを300μL加え、30℃、40分酵素反応させスフェロプラスト化した。遠心して上清を除去し、300μLのZymolyase bufferに懸濁した。遠心して上清を除去し、菌体をBreakage Bufferに懸濁した後、0.5mm Glass Beadsを用いて、30秒ボルテックス→30秒氷上のサイクルを3回繰り返し、細胞を破砕した。300×g、5分で遠心し未破砕細胞を除き、上清を回収した。この上清を17400×gで遠心することで、上清とペレットに分けた。ペレットをBreakage Bufferで懸濁したものを不溶性画分の粗酵素溶液とした。Zymolyase buffer、Breakage Bufferの組成は以下のとおりである。
Tris−HCl(pH 7.5) 50mM
MgCl2 10mM
ソルビトール 1M
DTT 1x
Tris−HCl(pH 8.0) 100mM
NaCl 150mM
DTT 1mM
Protease Inhibitor Cocktail(nacalai tesque) 1x
回収した粗酵素溶液中のゴム合成活性を以下の方法により測定した。
まず、Potassium Phosphate Buffer(pH 7.5)25mM、β−メルカプトエタノール 25mM、KF 20mM、MgCl2 4mM、ファルネシル二リン酸(FPP) 10μM、1−14Cイソペンテニル二リン酸([1−14C]IPP)(比活性:60Ci/mol)50μM、粗酵素溶液 50μgを混合した反応溶液(Total 100μL)を調製し、30℃で20時間反応させた。
反応組成(Total 100mL):
Acetate buffer(pH 5.6) 40mM
Triton X−100 0.1%(v/v)
メタノール 40%(v/v)
ブタノール層(反応生成物) 20%(v/v)
Potato acid phosphatase(Roche) 10U
結果、上記(1)〜(3)のいずれのプラスミドを用いた場合にも、炭素数90程度のイソプレン重合体が合成されていることが確認された。
(参考例8)
〔大腸菌の形質転換〕
実施例1、3、5で得たpGEM−HRT1、pBS−AtCPT8、pGEM−HRT2、及び、実施例1、3で得たpGEM−HRTBP、pBS−AtLEW1を用いて当該各遺伝子をpCOLADuet1ベクターにそれぞれ導入し、それらベクターを用いて以下の組み合わせとなるよう大腸菌BL21(DE3)の形質転換を行った。
(1)HRT1−HRTBP
(2)HRT2−HRTBP
(3)AtCPT8−AtLEW1
上記〔大腸菌の形質転換〕で得た形質転換された大腸菌を用いて、参考例7と同様にして、ゴム合成活性の測定を行った。結果、上記(1)〜(3)のいずれのプラスミドを用いた場合にも、反応生成物が少なく、検出することができなかった。
すなわち、CPTファミリー蛋白質が合成する生成物が蓄積される場の、疎水度及びスペース(空間的広さ)が、合成される生成物の鎖長を決定している、と考えている。
図5で示される種々の生物由来のCPTファミリー蛋白質のマルチプルシーケンスアライメントを行い、保存性の高い配列部分(保存領域)を検索した。保存領域周辺のアライメントの結果を図5に示す。
なお、マルチプルシーケンスアライメントは、Genetyx Ver.11と呼ばれるソフトを用いて行った。
UDP(Micrococcus luteus B−P 26 CPT)は、配列番号46で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)の11位から129位を抜粋したものである。
SRT1(Yeast CPT)は、配列番号47で示される酵母由来のSRT1の57位から175位を抜粋したものである。
AtCPT5(Arabidopsis thaliana CPT5)は、配列番号44で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT5の61位から179位を抜粋したものである。
AtCPT8(Arabidopsis thaliana CPT8)は、配列番号22で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT8の25位から142位を抜粋したものである。
DDPS(Nicotiana sylvestris CPT)は、配列番号48で示されるタバコ由来のDDPSの24位から140位を抜粋したものである。
HbCPT1(Hevea brasiliensis CPT)は、配列番号2で示されるパラゴムノキ由来のHRT1の23位から139位を抜粋したものである。
HbCPT2(Hevea brasiliensis CPT)は、配列番号32で示されるパラゴムノキ由来のHRT2の23位から139位を抜粋したものである。
HbCPT3(Hevea brasiliensis CPT)は、配列番号36で示されるパラゴムノキ由来のCPT3の23位から139位を抜粋したものである。
HbCPT4(Hevea brasiliensis CPT)は、配列番号37で示されるパラゴムノキ由来のCPT4の24位から140位を抜粋したものである。
HbCPT5(Hevea brasiliensis CPT)は、配列番号41で示されるパラゴムノキ由来のCPT5の23位から139位を抜粋したものである。
LsCPT3(Lactuca sativa CPT)は、配列番号14で示されるレタス由来のLsCPT3の40位から156位を抜粋したものである。
TbCPT1(Taraxacum brevicorniculatum CPT)は、配列番号43で示されるTaraxacum brevicorniculatum由来のTbCPT1の40位から154位を抜粋したものである。
DDPS(Mouse CPT)は、配列番号49で示されるマウス由来のDDPSの16位から132位を抜粋したものである。
HDS(Human CPT)は、配列番号50で示されるヒト由来のHDSの16位から132位を抜粋したものである。
配列番号2で示されるパラゴムノキ由来のHRT1において41位から49位に相当する囲みAの保存領域は、配列番号45で示される大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素(UPPS)では25位から33位に相当し、
配列番号46で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)では29位から37位に相当し、
配列番号47で示される酵母由来SRT1では75位から83位に相当し、
配列番号44で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT5では79位から87位に相当し、
配列番号22で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT8では43位から51位に相当し、
配列番号48で示されるタバコ由来のDDPSでは42位から50位に相当し、
配列番号32で示されるパラゴムノキ由来のHRT2では41位から49位に相当し、
配列番号36で示されるパラゴムノキ由来のCPT3では41位から49位に相当し、
配列番号37で示されるパラゴムノキ由来のCPT4では42位から50位に相当し、
配列番号41で示されるパラゴムノキ由来のCPT5では41位から49位に相当し、
配列番号14で示されるレタス由来のLsCPT3では58位から66位に相当し、
配列番号43で示されるTaraxacum brevicorniculatum由来のTbCPT1では58位から66位に相当し、
配列番号49で示されるマウス由来のDDPSでは34位から42位に相当し、
配列番号50で示されるヒト由来のHDSでは34位から42位に相当する。
配列番号46で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)では69位から85位に相当し、
配列番号47で示される酵母由来SRT1では115位から131位に相当し、
配列番号44で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT5では119位から135位に相当し、
配列番号22で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT8では84位から100位に相当し、
配列番号48で示されるタバコ由来のDDPSでは82位から98位に相当し、
配列番号32で示されるパラゴムノキ由来のHRT2では81位から97位に相当し、
配列番号36で示されるパラゴムノキ由来のCPT3では81位から97位に相当し、
配列番号37で示されるパラゴムノキ由来のCPT4では82位から98位に相当し、
配列番号41で示されるパラゴムノキ由来のCPT5では81位から97位に相当し、
配列番号14で示されるレタス由来のLsCPT3では98位から114位に相当し、
配列番号43で示されるTaraxacum brevicorniculatum由来のTbCPT1では98位から114位に相当し、
配列番号49で示されるマウス由来のDDPSでは74位から90位に相当し、
配列番号50で示されるヒト由来のHDSでは74位から90位に相当する。
配列番号46で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)では29位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号47で示される酵母由来のSRT1では75位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号44で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT5では79位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号22で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT8では43位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号48で示されるタバコ由来のDDPSでは42位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号32で示されるパラゴムノキ由来のHRT2では41位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号36で示されるパラゴムノキ由来のCPT3では41位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号37で示されるパラゴムノキ由来のCPT4では42位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号41で示されるパラゴムノキ由来のCPT5では41位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号14で示されるレタス由来のLsCPT3では58位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号43で示されるTaraxacum brevicorniculatum由来のTbCPT1では58位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号49で示されるマウス由来のDDPSでは34位のアスパラギン酸残基に相当し、
配列番号50で示されるヒト由来のHDSでは34位のアスパラギン酸残基に相当する。
配列番号46で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)では30位のグリシン残基に相当し、
配列番号47で示される酵母由来のSRT1では76位のグリシン残基に相当し、
配列番号44で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT5では80位のグリシン残基に相当し、
配列番号22で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT8では44位のグリシン残基に相当し、
配列番号48で示されるタバコ由来のDDPSでは43位のグリシン残基に相当し、
配列番号32で示されるパラゴムノキ由来のHRT2では42位のグリシン残基に相当し、
配列番号36で示されるパラゴムノキ由来のCPT3では42位のグリシン残基に相当し、
配列番号37で示されるパラゴムノキ由来のCPT4では43位のグリシン残基に相当し、
配列番号41で示されるパラゴムノキ由来のCPT5では42位のグリシン残基に相当し、
配列番号14で示されるレタス由来のLsCPT3では59位のグリシン残基に相当し、
配列番号43で示されるTaraxacum brevicorniculatum由来のTbCPT1では59位のグリシン残基に相当し、
配列番号49で示されるマウス由来のDDPSでは35位のグリシン残基に相当し、
配列番号50で示されるヒト由来のHDSでは35位のグリシン残基に相当する。
配列番号46で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)では33位のアルギニン残基に相当し、
配列番号47で示される酵母由来のSRT1では79位のアルギニン残基に相当し、
配列番号44で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT5では83位のアルギニン残基に相当し、
配列番号22で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT8では47位のアルギニン残基に相当し、
配列番号48で示されるタバコ由来のDDPSでは46位のアルギニン残基に相当し、
配列番号32で示されるパラゴムノキ由来のHRT2では45位のアルギニン残基に相当し、
配列番号36で示されるパラゴムノキ由来のCPT3では45位のアルギニン残基に相当し、
配列番号37で示されるパラゴムノキ由来のCPT4では46位のアルギニン残基に相当し、
配列番号41で示されるパラゴムノキ由来のCPT5では45位のアルギニン残基に相当し、
配列番号14で示されるレタス由来のLsCPT3では62位のアルギニン残基に相当し、
配列番号43で示されるTaraxacum brevicorniculatum由来のTbCPT1では62位のアルギニン残基に相当し、
配列番号49で示されるマウス由来のDDPSでは38位のアルギニン残基に相当し、
配列番号50で示されるヒト由来のHDSでは38位のアルギニン残基に相当する。
配列番号46で示されるマイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)では77位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号47で示される酵母由来のSRT1では123位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号44で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT5では127位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号22で示されるシロイヌナズナ由来のAtCPT8では92位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号48で示されるタバコ由来のDDPSでは90位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号32で示されるパラゴムノキ由来のHRT2では89位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号36で示されるパラゴムノキ由来のCPT3では89位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号37で示されるパラゴムノキ由来のCPT4では90位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号41で示されるパラゴムノキ由来のCPT5では89位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号14で示されるレタス由来のLsCPT3では106位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号43で示されるTaraxacum brevicorniculatum由来のTbCPT1では106位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号49で示されるマウス由来のDDPSでは82位のアスパラギン残基に相当し、
配列番号50で示されるヒト由来のHDSでは82位のアスパラギン残基に相当する。
配列番号1:パラゴムノキ由来のHRT1をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号2:パラゴムノキ由来のHRT1のアミノ酸配列
配列番号3:パラゴムノキ由来のHRTBPをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号4:パラゴムノキ由来のHRTBPのアミノ酸配列
配列番号5:プライマー1
配列番号6:プライマー2
配列番号7:プライマー3
配列番号8:プライマー4
配列番号9:パラゴムノキ由来のRubber Elongation Factorをコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号10:パラゴムノキ由来のSmall Rubber ParticleProteinをコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号11:パラゴムノキ由来のHevien2.1をコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号12:パラゴムノキ由来のMYC1 transcription factorをコードする遺伝子のプロモーターの塩基配列
配列番号13:レタス由来のLsCPT3をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号14:レタス由来のLsCPT3のアミノ酸配列
配列番号15:レタス由来のLsCPTL2をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号16:レタス由来のLsCPTL2のアミノ酸配列
配列番号17:プライマー5
配列番号18:プライマー6
配列番号19:プライマー7
配列番号20:プライマー8
配列番号21:シロイヌナズナ由来のAtCPT8をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号22:シロイヌナズナ由来のAtCPT8のアミノ酸配列
配列番号23:シロイヌナズナ由来のAtLEW1をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号24:シロイヌナズナ由来のAtLEW1のアミノ酸配列
配列番号25:プライマー9
配列番号26:プライマー10
配列番号27:パラゴムノキ由来のREFをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号28:パラゴムノキ由来のREFのアミノ酸配列
配列番号29:プライマー11
配列番号30:プライマー12
配列番号31:パラゴムノキ由来のHRT2をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号32:パラゴムノキ由来のHRT2のアミノ酸配列
配列番号33:プライマー13
配列番号34:プライマー14
配列番号35:パラゴムノキ由来のCPT3をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号36:パラゴムノキ由来のCPT3のアミノ酸配列
配列番号37:パラゴムノキ由来のCPT4のアミノ酸配列
配列番号38:プライマー15
配列番号39:プライマー16
配列番号40:パラゴムノキ由来のCPT5をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号41:パラゴムノキ由来のCPT5のアミノ酸配列
配列番号42:Taraxacum brevicorniculatum由来のTbCPT1をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号43:Taraxacum brevicorniculatum由来のTbCPT1のアミノ酸配列
配列番号44:シロイヌナズナ由来のAtCPT5のアミノ酸配列
配列番号45:大腸菌由来のウンデカプレニルリン酸合成酵素(UPPS)のアミノ酸配列
配列番号46:マイクロコッカス属菌由来のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)のアミノ酸配列
配列番号47:酵母由来のSRT1のアミノ酸配列
配列番号48:タバコ由来のDDPSのアミノ酸配列
配列番号49:マウス由来のDDPSのアミノ酸配列
配列番号50:ヒト由来のHDSのアミノ酸配列
配列番号51:パラゴムノキ由来のHRT1における41位から49位のアミノ酸配列
配列番号52:パラゴムノキ由来のHRT1における81位から97位のアミノ酸配列
配列番号53:プライマー17
配列番号54:プライマー18
配列番号55:プライマー19
配列番号56:プライマー20
配列番号57:プライマー21
配列番号58:プライマー22
配列番号59:プライマー23
配列番号60:プライマー24
配列番号61:プライマー25
配列番号62:プライマー26
配列番号63:酵母由来のSRT1をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号64:ヒト由来のHDSをコードする遺伝子の塩基配列
Claims (18)
- 生体外で、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質、及びNogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を含むポリイソプレノイドの製造方法。
- 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質が、配列番号2で示されるパラゴムノキ由来のHRT1における41位、及びこれに相当する位置にアスパラギン酸残基を、配列番号2で示されるパラゴムノキ由来のHRT1における42位、及びこれに相当する位置にグリシン残基を、配列番号2で示されるパラゴムノキ由来のHRT1における45位、及びこれに相当する位置にアルギニン残基を、並びに、配列番号2で示されるパラゴムノキ由来のHRT1における89位、及びこれに相当する位置にアスパラギン残基を、有するものである請求項1記載のポリイソプレノイドの製造方法。
- 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質は、配列番号2で示されるパラゴムノキ由来のHRT1における41位から49位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列(A):
DGNX1RX2AKK (A)
(上記アミノ酸配列(A)中、X1及びX2は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。)、又は、該アミノ酸配列(A)と、X1及びX2を除く7アミノ酸残基のうちの5アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列である請求項1又は2記載のポリイソプレノイドの製造方法。 - 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質は、配列番号2で示されるパラゴムノキ由来のHRT1における81位から97位、及びこれに相当する位置のアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列(B):
TX11X12AFSX13X14NX15X16RX17X18X19EV (B)
(上記アミノ酸配列(B)中、X11〜X19は同一又は異なって任意のアミノ酸残基を表す。)、又は、該アミノ酸配列(B)と、X11〜X19を除く8アミノ酸残基のうちの5アミノ酸残基以上が同一である配列同一性を有するアミノ酸配列である請求項1〜3のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。 - 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びNogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種が、植物由来である請求項1〜4のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
- 前記シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子、及びNogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種が、パラゴムノキ由来である請求項5記載のポリイソプレノイドの製造方法。
- 前記結合工程が、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードするmRNA、及びNogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子にCPTファミリー蛋白質、及びNgBRファミリー蛋白質を結合させる工程である請求項1〜6のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
- 前記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含む請求項7記載のポリイソプレノイドの製造方法。
- 前記胚芽抽出物が、小麦由来である請求項8記載のポリイソプレノイドの製造方法。
- 前記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が、5〜50g/Lである請求項7〜9のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程、前記ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程、前記ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。
- 乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、並びに、該プロモーターに機能的に連結されたシス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子及びNogo−B receptor(NgBR)ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター。
- 前記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターが、Rubber Elongation Factor(REF)をコードする遺伝子のプロモーター、Small Rubber Particle Protein(SRPP)をコードする遺伝子のプロモーター、Hevein2.1(HEV2.1)をコードする遺伝子のプロモーター、及び、MYC1 transcription factor(MYC1)をコードする遺伝子のプロモーターからなる群より選択される少なくとも1種である請求項13記載のベクター。
- 請求項13又は14に記載のベクターが導入された形質転換ゴム産生植物。
- 請求項13又は14に記載のベクターをゴム産生植物に導入することにより、該植物におけるポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法。
- 請求項13又は14に記載のベクターをゴム産生植物に導入して形質転換植物を製造する工程、該形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、該ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
- 請求項13又は14に記載のベクターをゴム産生植物に導入して形質転換植物を製造する工程、該形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、該ポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015131024 | 2015-06-30 | ||
JP2015131024 | 2015-06-30 | ||
JP2016054541 | 2016-03-17 | ||
JP2016054541 | 2016-03-17 | ||
PCT/JP2016/069172 WO2017002818A1 (ja) | 2015-06-30 | 2016-06-28 | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017002818A1 JPWO2017002818A1 (ja) | 2018-04-19 |
JP6778372B2 true JP6778372B2 (ja) | 2020-11-04 |
Family
ID=57608441
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016563140A Active JP6778372B2 (ja) | 2015-06-30 | 2016-06-28 | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10907179B2 (ja) |
EP (1) | EP3309257B1 (ja) |
JP (1) | JP6778372B2 (ja) |
CN (1) | CN107709565B (ja) |
WO (1) | WO2017002818A1 (ja) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6586693B2 (ja) | 2015-06-30 | 2019-10-09 | 住友ゴム工業株式会社 | ポリイソプレノイドの製造方法、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP6706813B2 (ja) | 2015-06-30 | 2020-06-10 | 住友ゴム工業株式会社 | 膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP6778372B2 (ja) * | 2015-06-30 | 2020-11-04 | 住友ゴム工業株式会社 | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP7168955B2 (ja) * | 2018-09-05 | 2022-11-10 | 住友ゴム工業株式会社 | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
EP3650542A1 (en) * | 2018-11-08 | 2020-05-13 | Fraunhofer Gesellschaft zur Förderung der Angewand | Method to obtain low triterpene/triterpenoid-containing natural rubber latex |
JP2020195326A (ja) * | 2019-06-03 | 2020-12-10 | 住友ゴム工業株式会社 | 天然ゴムの製造方法、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP6923166B2 (ja) * | 2019-07-16 | 2021-08-18 | 住友ゴム工業株式会社 | 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP2021080204A (ja) | 2019-11-19 | 2021-05-27 | 住友ゴム工業株式会社 | 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
WO2021177074A1 (ja) * | 2020-03-05 | 2021-09-10 | 住友ゴム工業株式会社 | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP2022073233A (ja) * | 2020-10-30 | 2022-05-17 | 住友理工株式会社 | イソプレン重合活性を有するタンパク質組成物及びその用途 |
JP2023127868A (ja) * | 2022-03-02 | 2023-09-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ(cpt)ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP2023127870A (ja) * | 2022-03-02 | 2023-09-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ(cpt)ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP2023127869A (ja) * | 2022-03-02 | 2023-09-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 変異シス型プレニルトランスフェラーゼ(cpt)ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
CN116426536B (zh) * | 2023-03-07 | 2024-03-08 | 贵州大学 | 橡胶延长因子HbREF258基因、蛋白及应用 |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4838957B2 (ja) | 2001-05-02 | 2011-12-14 | 独立行政法人理化学研究所 | 無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の製造方法 |
US6998471B2 (en) | 2001-07-25 | 2006-02-14 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Polynucleotides encoding an acetyl-CoA acetyltransferase from Hevea brasiliensis, related products, and methods |
JP2003310295A (ja) | 2002-04-30 | 2003-11-05 | Invitrotech Co Ltd | 蛋白質の製造方法 |
JP2005225796A (ja) | 2004-02-12 | 2005-08-25 | Wakenyaku Kk | リポソームを用いたタンパク質の製造方法 |
JP2005312436A (ja) | 2004-03-29 | 2005-11-10 | Shimadzu Corp | 無細胞タンパク質合成方法 |
JP2005308412A (ja) | 2004-04-16 | 2005-11-04 | Olympus Corp | 無細胞タンパク質合成系で作られた蛍光を利用した効率的なタンパク質の機能解析スクリーニングの方法 |
JP5035871B2 (ja) | 2005-09-16 | 2012-09-26 | 株式会社ブリヂストン | パラゴムノキのプレニルトランスフェラーゼの遺伝子群 |
AU2006308854B2 (en) | 2005-10-31 | 2011-10-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cell-free synthesis of membrane bound polypeptides |
JP5554897B2 (ja) * | 2008-03-14 | 2014-07-23 | 日立造船株式会社 | トチュウ由来のバイオポリマー |
JP2010119373A (ja) | 2008-11-21 | 2010-06-03 | Bridgestone Corp | プロモーターの乳管特異性評価方法 |
JP2010132594A (ja) | 2008-12-04 | 2010-06-17 | Tokyo Institute Of Technology | 膜タンパク質の固定化方法 |
JP2011052146A (ja) * | 2009-09-03 | 2011-03-17 | Sumitomo Rubber Ind Ltd | タイヤ用ゴム組成物及び空気入りタイヤ |
JP2011188776A (ja) | 2010-03-12 | 2011-09-29 | Takuya Ueda | invitro再構成タンパク質合成系による膜タンパク質合成方法 |
JP5827601B2 (ja) | 2012-07-04 | 2015-12-02 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定の蛋白質の発現を光応答転写因子により調整する方法、光応答転写因子をコードする遺伝子が導入されたイソプレノイド産生植物、及び該イソプレノイド産生植物を用いたポリイソプレノイドの製造方法 |
JP5536840B2 (ja) | 2012-09-07 | 2014-07-02 | 住友ゴム工業株式会社 | タイヤ用ゴム組成物、タイヤ部材、及び空気入りタイヤ |
JP5650796B2 (ja) * | 2013-05-23 | 2015-01-07 | 住友ゴム工業株式会社 | スタッドレスタイヤ用ゴム組成物及びスタッドレスタイヤ |
JP6448194B2 (ja) * | 2014-01-20 | 2019-01-09 | 住友ゴム工業株式会社 | シス型プレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び、NogoBreceptorをコードする遺伝子を宿主に導入することにより、該宿主において、シス型プレニルトランスフェラーゼ及びNogoBreceptorを発現させた形質転換体、並びに該形質転換体を用いたポリイソプレノイドの製造方法 |
JP6440520B2 (ja) | 2015-02-17 | 2018-12-19 | 住友ゴム工業株式会社 | ラテックスの採取方法、キク科に属する植物の栽培方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP6557990B2 (ja) | 2015-02-23 | 2019-08-14 | 住友ゴム工業株式会社 | 特定のプロモーター及び特定の蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターが導入された形質転換植物、並びに、該ベクターを植物に導入することにより、ポリイソプレノイドの生産量を向上させる方法 |
JP6778372B2 (ja) * | 2015-06-30 | 2020-11-04 | 住友ゴム工業株式会社 | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP6586693B2 (ja) * | 2015-06-30 | 2019-10-09 | 住友ゴム工業株式会社 | ポリイソプレノイドの製造方法、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 |
JP6090700B2 (ja) | 2015-12-25 | 2017-03-08 | 日立造船株式会社 | 長鎖トランス型プレニル二リン酸合成酵素遺伝子 |
-
2016
- 2016-06-28 JP JP2016563140A patent/JP6778372B2/ja active Active
- 2016-06-28 WO PCT/JP2016/069172 patent/WO2017002818A1/ja active Application Filing
- 2016-06-28 CN CN201680035245.5A patent/CN107709565B/zh active Active
- 2016-06-28 US US15/579,434 patent/US10907179B2/en active Active
- 2016-06-28 EP EP16817926.5A patent/EP3309257B1/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107709565B (zh) | 2021-09-14 |
EP3309257A1 (en) | 2018-04-18 |
US10907179B2 (en) | 2021-02-02 |
US20180171364A1 (en) | 2018-06-21 |
EP3309257A4 (en) | 2018-10-31 |
JPWO2017002818A1 (ja) | 2018-04-19 |
WO2017002818A1 (ja) | 2017-01-05 |
EP3309257B1 (en) | 2020-08-05 |
CN107709565A (zh) | 2018-02-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6778372B2 (ja) | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 | |
US11236365B2 (en) | Method for producing polyisoprenoid, transformed plant, method for producing pneumatic tire and method for producing rubber product | |
US20210395785A1 (en) | Method for producing trans-polyisoprenoid, vector, transgenic plant, method for producing pneumatic tire and method for producing rubber product | |
RU2682047C2 (ru) | Трансформант для экспрессии цис-пренилтрансферазы и рецептора Nogo-B | |
WO2021010101A1 (ja) | 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 | |
WO2021100419A1 (ja) | 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 | |
JP7168955B2 (ja) | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 | |
US10059780B2 (en) | Method for producing rubber particles with reduced coagulation tendency, method for producing pneumatic tire, and method for producing rubber product | |
WO2021177074A1 (ja) | ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法 | |
US20230279369A1 (en) | Mutant cis-prenyltransferase (cpt) family protein, method for producing polyisoprenoid, vector, transgenic plant, method for producing pneumatic tire, and method for producing rubber product | |
US20230279371A1 (en) | Mutant cis-prenyltransferase (cpt) family protein, method for producing polyisoprenoid, vector, transgenic plant, method for producing pneumatic tire, and method for producing rubber product | |
US20230279370A1 (en) | Mutant cis-prenyltransferase (cpt) family protein, method for producing polyisoprenoid, vector, transgenic plant, method for producing pneumatic tire, and method for producing rubber product |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A527 Effective date: 20161017 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190205 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20190205 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200121 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200317 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200825 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200911 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6778372 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |